PT98972B - Metodos analiticos electroliticos melhorados - Google Patents

Description

THE VITORIA WIVEPSITY OF KANCH3STSR

MÉTODOS ANALÍTICOS ELECTROLÍTICOS MELHORA Γ03

A presente invenção refere-se a aperfeiçoamentos em me todos analíticos electrolíticos e, mais particulsrmente, a aperfeiçoamentos úteis em métodos electrolíticos para a deter mir.s-0o de peróxido de hidrogénio produzido por oxidação de glucose catalisada por via enzímátícanos eléctrodos de enzima”. A presente invenção ó especie.laente útil como base de aperfeiçoa mento pa ra análise da glucose nos líquidos corporais.

E conhecida a aplicação de métodos electrolíticos para detectar e medir a concentração da glucose em líquidos e um destes ó o chamado eléctrodos de enzimas em que ume enzima (glucose oxidase) é imobilizada e utilizada para promove^ a oxi dação da glucose na presença de oxigénio, .de tal modo que o per óxido de hidrógénio sssim formado (como subproduto quando a glu cose e oxidada em acido glucónico), pode depois ser medido por smperometria num electrodo, habitualmente de platina.

Para utilização num líquido corporal, tal como no san gue, apresenta-se o problema da interferência de muitos outros componentes presentes, por exemplo, compostos de peso molecular elevado, e outros compostos oxidantes ou oxidáveis e o ambiente é hostil ao sensor. Este problema pode ultrspasss.r-se em certa extensão protegendo o electrodo com uma membrana que seja permeável selectivamente e que detenha os componentes interferentes mas que permita ainda a passagem do peróxido de hidroge nio, Para esta finalidade tsnsido propostas as membranas de acetato de celulose.

Contudo, tem-se deparado com.dificuldadessem conseguir uma. boa relação proporcional entre a concentração de glu cose e o sinal de resposta do eléctrodo num intervalo suficien temente largo e a saída da coerente tende a atingir um limite, como se o eléctrodo efectivamente ficasse saturado (usualmen te s. uma concentração de cerca de a penas f mmole s por litro), o que limita ds forma acentuada a utilidade do método, dado que não permite suficiente flexibilidade e aplicabilidade. Isto, é especialmente relevante na aplicação clínica onde é importante estar apto s. medir concentrações até Cf mmoles por litro, ou mesmo superiores quando se trata de doentes diabéti cos que sofrem de hiper-glicémia (altas concentrações de glucose no sangue).

3xiste, portanto, a necessidade de um dispositivo e de um método que permita a resposta exacta s fácil, especialmente uma resposta substancialmente linear, num largo irterva. lo de concentrações de glucose. Se for suficientemente eficaz num intervalo suficientemer.te largo, pode ser mais facilmente utilizado para controlar a situação e o tratamento de um doente, mesmo in vivo.

Ve^ificou-se que este problema pode ser eliminado mediante modificação do eléctrodo, de forma a que a enzima não seja sé imobilizada, mas também esteja encerrada nos liposomas.

efeito desta modificação é que o intervalo cas concentrações de glucose que podem ser satisfatoriamente determina a / das e grandemente expendido e a linearidade da resposta, (isto é, a corrente de resposta no eléctrodo relativamente à concentração de glucose) é substancialmente linear, ao longo de uro intervalo muito maior. 0 modo de acção não está elaramente compreendido, mas considera-se que os lípidos servem para controlar o acesso da glucose à enzima sem impedir o acesso do oxigénio necessário para a acção enzimática nem a migração do peroxido durante a oxidação da glucose, para o eléctrodo, em que deve ser detectado e medido.

Sste efeito parece ser devido ao facto de a enzima (por exemplo, glucose oxidase) encapsulada nos liposomas ,poder ainda actuar em qualquer substrato qpe a alcance, mas a parede lipídios do liposoma proporciona (ou actua como) uma membrana que limita a difusão. Ssta também proporciona uma fa se biocompatível, o que é de particular importância e valor quando se mede a glucose no sangue.

Deste modo, de acordo com a presente invenção proporcionsm-se eléctrodos de enzima aperfeiçoados em que a enzima permanece encerrada em liposomas.

De acordo com esta invenção também se proporciona um método aperfeiçoado para a electro-snálise de soluções conten do substâncias que utilizam uma enzima, isto é, que inter-actuam com uma enzima, estando a enzima encerrada em liposomas.

Sspecialmente, a presente invenção refere-se a procedi mentos em que um ou mais compostos de substrato, geram, por inter-acção com oxigénio na presença de uma enzima, peroxido de hidrogénio e este é medido por via electrolítica. Ssta medição realiza-se de forma mais conveniente de modo conhecido,

4usualments por métodos amperomét ricos. 5Í especialmente útil para o sistema glucose oxidase/glucose, mas a presente invenção pode, contudo, também ser utilizada relativamer.te a outros sistemas enzimáticos, se apropriado, por exemplo, sistemas de álcool oxidase e outras técnicas electrolíticas, por exemplo as que se utilizem para avaliação potenciométrica de potenciais iénicos.

eléctrodo da enzima, útil para aplicação na determinação da glucose, contém glucose oxidase aprisionada num gran de liposoma unilamslar. A glucose difunde-se através da pare de do liposoma, gerando, deste modo peróxido de hidrogénio por eata^lise enzimática e este peróxido de hidrogénio é subsequentemente detectsdo na superfície do eléctrodo.

Também se proporciona membranas que contem enzima úteis para a incorporação nos eléctrodos aperfeiçoados desta invenção e para aplicação em métodos analíticos melhorados, desta invenção, em que s enzima se encontra encerrada em liposoma s.

Além disso, também se proporciona uma célula electro-analítica que incorpora um eléctrodo de enzima, uma membrana que contém a enzima ou um liposoma que contém enzima, como definido mais detalhadamente aqui.

Também se proporcionam novos produtos aplicáveis para a produção de eléctrodos e de memebranas desta invenção, que consiste em uma enzima encerrada em liposomas.

Os liposomas são vesículas pequenas, (partículas ou go tas) que apresentam uma superfície exterior composta por uma camada muito fina de um lípido que rodeia um volume de solução c

X aquosa, que na presente invenção contém a enzima. Portanto, têm um dado volume de um meio aquoso encerrado por uma parede” ou membrana composta por moléculas lipídicas. 0 lí pido é de um modo geral um lípido bipolar, especialmente um fosfolípido. A parede lipídica do liposoma em seguida pa rece servir para regular a difusão da glucose no interior da zona aquosa sem impedir a difusão do oxigénio ou do peroxido de hidrogénio.

Os liposomas podem ser preparados por mistura íntima de um lípido com um meio aquoso que contém enzima. De um modo geral formam-se espontaneamente quando se dispersam lípidos a temperaturas superiores às temperaturas de fusão, através de um processo geral conhecido. Como resultado da mistura vigoro sa destes componentes, a mistura pode atravessar diversos passos em que a fase lipídica é dispersa e os componentes são pro gressivamente dispersos até se formarem, eventualmente, liposo mas e se dah uma mudança de fase na mistura que vai tornar uma suspensão de liposomas, (cada um contendo a fase aquosa) suspensos na maior parte da fase aquosa.

De preferência, o lípido é uai lípido bipolar, (por exemplo um fosfolípido) de forma a que as suas moléculas se con greguem com a formação de uma bifase, - duas fases cada uma com as suas partes polares no exterior da bifase e as suas partes não polares conjuntamente no interior da bifase. Esta bifase forma uma parede que rodeia, que encerra o meio aquoso que contém a enzima.

Podem ser utilizados diversos lípidos, (iDdividualmente ou em misturas) para formar liposomas e ume vantagem desta in6 venção é o lípido poder ser escolhido de forme que materiais lipídicos naturais possam ser utilizados, os quais estão em relação muito íntima com os materiais que se encontram nas ce lulas naturais e assim são menos susceptíveis de provocarem problemas de bio-incompetitilidade.

A. mistura e a formação de liposomas podem ser assisti das pela presença de um auxiliar de encapsulação, usualmente na fase aquosa. Nestes casos, a relação entre o lípido e o auxiliar de encapsulação situa-se entre 5 e 20 partes do lípi do para 1 parte de auxiliar de encapsulação..

A enzima pode ser qualquer enzima que catalise um processo oxidativo, especialmente em que o peróxido de hidrogénio e geralmente um co-produto. Estas enzimas sao habitualmente conhecidas como oxidase ou algumas vezes como desidrogenases quando a sua função principal é remover o hidrogénio dum composto substrato sem se formar, necessariamente, peróxido de hi drogenio. Preferem-se as oxidases. Esta descrição é feita principalmente em referência ? glucose oxidase, que é a enzima mais comum e mais útil deste tipo, e esta invenção é principal mente aplicável a sistemas que utilizam esta enzima. Contudo, a presente invenção não e necessariamente restringida a esta enzima ou à medição e detecção de apenas glucose podendo ser utilizadas outras enzimas e outros substratos apropriados, por exemplo a álcool oxidase. Estas enzimas são, em geral, conhecidas e usualmente solúveis ou facilmente dispersáveis em meio aquoso.

encerramento da enzima nos liposomas pode ser conseguido por métodos convencionais, para a formação de liposomas utilizando-se um lípido e um meio aquoso contendo a enzima.

método, de um modo geral, compreende a mistura vigorosa e ín tima do lípido com a fase aquosa, eventualmente na presença de um agente que facilite a formação de liposomas. Estas técnicas são convencionais e incluem, por exemplo, as técnicas conhecidas como evaporação de fase inversa. A relação entre o lípido e o auxiliar para a formação de liposomas (auxiliar de encap> sulação), pode variar dentro de um intervalo considerável que depende dos componentes, das condiçoes utilizadas e podem, convenientemente, ser determinados através de um ensaio simples. As proporções convenientes situam-se entre 5 e 20 partes do lí pido para 1 parte do auxiliar de encapsulação mas podem ser utilizadas, se apropriado, proporções maiores ou menores.

Os exemplos de lípidos incluem a dimiristoil-fosfatidilcolina, dipalmitoil-fosfatidilcolina, diestearoil-fosfatidilcolina e suas misturas. Pode também incluir-se fosfatidil-inositol na mistura utilizada para a formação de liposomas.

A presente invenção não deve ser considerada como limitada a estes lípidos podendo-se utilizar, quando apropriado, outros.

tamanho dos liposomas pode variar, mas vantajosamente deve situar-se entre 25 e 1 000 nm e, especialmente, entre 100 e 200 nm.

Quando é necessário o conhecimento da permeabilidade dos diferentes liposomas, pode determinar-se esta forma conveniente utilizando liposomas marcados com glucose radioactiva, [^^C]-glucose, aprisionada no seu interior e medindo a extensão em que se difunde dos liposomas para o meio aquoso circundante seguindo a radioactividade.

De acordo com outro aspecto desta invenção, proporcionam-se eléctrodos de enzima em que os liposomas, nos quais a en zima está encerrada, são incorporados sobre ou num veículo de δ

.w suporte, especialmente sobre ou numa membrana.

Os liposomas podem ser utilizados mediante a sua imobi lização sobre um veículo, especialmente uma membrana, de forma a poderem ser localizados em posição conveniente e interpostos entre o líquido principal s ensaiar ou s analisar como composto substrato oxidável (por exemplo, a glucose) e o electrodo sensor utilizado na medição. A membrana em que estes são imobilizados pode ser, por exemplo, um derivado de celulose, espe cialmente um éster de celulose, por exemplo, acetato de celulo se ou nitrato de celulose (nitro-celulose), podendo-se utilizar outros polímeros naturais ou sintéticos, quando apropriado, por exemplo, policarbonato.

Se õ material da membrana for suficientemente absorveu te relativamente aos liposomas, então estes podem ser incorporados de forma conveniente, por contacto, e este contacto pode ser favorecido por meio de, por exemplo, pressão, que pode for çar a introdução dos liposomas. Por exemplo, a pressão diferencial exercida por sucção pode ser utilizada para incorporar a suspensão aquosa dos liposomas no material da membrana de forma a que os liposomas se depositem e aí se mantenham e o meio aquoso passe. Qunsdo o material da membrana por si mesmo não é suficientemente rsceptivo aos liposomas, então o material, da membrana deve ser tratado física e/ou quimicamente para se tornar mais receptivo, por exemplo, tornando-o microporoso de modo a que os poros possam aprisionar os liposomas. Se apropriado, os liposomas, uma vez em posição sobre ou no material da membrana podem ser mantidos mais fortemente ali, mediante um tratamento com um agente de fixação que torne os liposomas menos

moveis mas sem os destruir nem destruir a enzima neles encer rada. Um exemplo deste tratamento é a aplicação de glutaraldeído.

As quantidades e proporções dos componentes de liposo mas podem variar. Uma proporção conveniente é a que se situa entre 0,1 e O.p mmole da enzima para ceda mole do lípido, mas podem ser utilizadas, quando apropriado, proporções maiores ou menores.

A Requerente descobriu ainda que os liposomas podem ser utilizados a diversas temperaturas mas que são especialmen te eficazes à temperatura de transição da fase do lípido. Surpreendentemente, a temperatura de transição de fase, o esta do do lípido parece ser excepcionalmente adequado a permitir uma detecção miais sensível.

E, portanto, preferível operar em qualquer célula, ou processo que utilizem membranas de liposomas da presente inven qão a uma temperatura próxima da temperatura de transição de fase do lípido do liposoma, isto é, do lípido que forma a pele ou '‘parede” dos liposomas que encerram a enzima. Portanto, é preferível que a temperatura de operação a utilizar deva situar-se especialmente entre + 10°C ds temperatura de transição de fase. T? conveniente e útil considerar que a actividade da própria enzima pode também variar com p temperatu ra, de modo que é desejável operar a temperaturas de trabalho óptimas (ou pelo menos satisfatórias) da enzima e liposomas, de forma a que a temperatura de transição de fase do lípido esteja razoavelmente próxima daquela à qual a enzima apresenta boa actividade. No caso dos liposomas preparados por .jima mistura de dois lípidos de dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) e fosfatidil-inositol (PI”) esta temperatura de transição de fase é 35°C.

Esta aplicação e efeito dos liposomas descritos podem ainda ser utilizados para medir a temperatura da transição do lípido do qual o liposoma deriva, por meio de uma determinação emperométrica utilizando o componente enzima/liposoma. Este método pode ser realizado, por exemplo, medindo a resposta da corrente em relação à temperatura, enquanto se mantém constante a concentração de glucose e observando o valor máximo que a corrente atinge, o qual indica a temperatura de transição. 0 processo mostra que a resposta da corrente em relação à tempe ratura tem a forma de uma curva em que, quando as medições são feitas a temperaturas sucessivas, mantendo constante a concentração de glucose, a corrente aumenta com a temperatura, até um máximo à temperatura de transição e em seguida diminui, al cançando eventualmente um mínimo que depois parece ser substsncialmente independente de qualquer outro aumento de temperatura posterior.

sistema para aplicação de liposomas contendo enzimas pode variar por formas diversas, como os técnicos podem deter minar. Assim, por exemplo, podem realizar-se variações na con centração e na quantidade de enzima encerrado e/ou na concentração ou densidade dos liposomas no suporte ou veículo utilizado, por exemplo, ume membrana; ambos os fàctores podem aumen tar a sensibilidade do eléct^odo de enzima para o substrato no qual a enzima actua (por exemplo, glucose). Estas variações aodem ser utilizadas para optimização dos sistemas (isto

é, o eléctrodo e o seu comportamento), para circunstancias ou utilizações particulares. 0 âmbito da optimização pode também incluir variações ns escolha das associações dos componen tes liposémicos e o suporte ou material de veículo em que os liposomas são utilizados, assim como qualquer grau de inter-relação entre estes durante a utilização. A forma o'ptima de qualquer sistema ou circunstâncias particulares (por exemplo um meio em que o eléctrodo é utilizado),pode ser determinada por um ensaio simples.

Os elementos activos do eléctrodo a utilizar na rea lização desta invenção podem ser elementos convencionais, espe cialmente para analise amperométrica. De forma mais convenien te são constituídos por um ânodo de platina e uma forma conveniente é o chamado par ânodo/cátodo de Clark , que é constituído por um ânodo de platina rodeado por um cátodo de prata. Para a presente invenção , este par de eléctrodos pode ser uti lizado em um conjunto que contém uma ou mais membranas. Estas podem ser utilizadas para excluir células de sangue e materiais de peso molecular elevado. De forma mais conveniente, são uti lizadas duas membranas;

(a) uma que é permeável ao peroxido de hidrogénio, mas não aos componentes que podem interferir com as determinações aos potenciais utilizados e destinada a proporcionar uma maior pro tecçso dos eléctrodos eontra.;os componentes de peso'moíecular ©levado do BSíigUe¹, e possivelmente também eontra o dano meeani co, e (b) outra membrana que transporta a enzima imobilizada do modo descrito antes mais pormenorizadamente. Todavia, o número

* de membranas necessárias não está limitado a duas e podem ser utilizadas várias, quando se considerar apropriado para a cons trução ou aplicação de electrodos específicos.

A ordem preferida em que estas membranas se situam re lativamente às próprias superfícies do electrodo activo (isto é, o ânodo e o cátodo), consiste em situar a membrana separado ra próximo dos electrodos e situar a membrana transportadora da enzima por trás desta, mais afastada dos electrodos. No entanto, esta disposição não é obrigatória, podendo utilizar-se quando apropriado, outras disposições das membranas.

As membranas devem também ser fixadas aos electrodos de um modo estanque, de forma a que os líquidos utilizados não pos sam facilmente atravessá-las. Realiza-se isto de um modo conveniente fazendo o corpo do electrodo da. enzima ou do sistema sensor apresentar a forma de um contentor composto por cuas : partes que se prendem fortemente, uma a outra, de forma a segurar a membrana ou membranas no seu lugar. De forma mais con veniente, as partes do corpo estão seguras por uma secção que as liga como aparafusadas uma a outra.

Este conjunto pode ser utilizado fazendo-o contactar com a amostra de sangue ou de outro líquido a analisar, de modo a que as soluções se difundam através das membranas e alcan cem os electrodos. Ali, a medição (e mais correntemente a medição amperométrica) pode realizar-se de forma convencional uti lizando equipamento convencional. As /medições da voltagem aplicada e da corrente obtida podem registar-se e/ou apresenta rem-se de uma forma usual, por exemplo, num registador gráfico.

processo e as membranas da presente invenção podem ser utilizados para diversos fins, mas especialmente em rela ção com determinação dos níveis de glucose no sangue ou noutros líguidos corporais, como por exemplo, o soro. Podem, evidentemente também ser utilizados para determinação do teor de glucose noutros líquidos, incluindo os que podem não ter um efeito altamente hostil ou danificador dos eléctrodos e membranas, por exemplo, a urina, e a presente Invenção nao se restringe à sua. utilização no sangue.

A presente invenção tem a vantagem da avaliação do peróxido de hidrogénio (e, portanto, da glucose que o origina) ser muito auxiliada. Em particular, a interferência de proteínas, (por exemplo, o fibrinogénio) e de outros compostos oxidáveis (por exsmplo ácido ascórbico, ácido úrico e cis teína), que correntemente se encontram no sangue, é substancialmente reduzida até um grau que permite que a escala linear do eléctrodo seja ampliada dez vezes (até cerca de 3θ les, por litro) e com tempos de resposta em velocidade conveniente (da ordem de 30 a 90 segundos). Isto permite que a utilização de eléctrodos de enzimas seja suficientemente ampliada para os tomar aplicáveis à medição de concentrações de glucose desconhecidas nos doentes diabéticos (especialmente hiperglicémieos).

A possibilidade apresentada pela presente invenção pa ra a medição de níveis sanguíneos de açúcar fácil e rapidamen te, sem necessidade de determinar primeiro se o nível de açú7 car se situa ou nao no intervalo no qual a medição é fiável,' e que possivelmente necessita de diluição da amostra, tem gran de vantagem e conduz a aplicações em que a ligação entre os %

ί resultados da determinação do açúcar no sangue e a acçao a ser tomada em consequência destes (por exemplo, tratamento ou admi nistração a um doente de farmacos, especialmente insulina) pode ser feita de forma mais directa e imediata do que a anteriormente praticável, mesmo por processos automatizados.

A presente invenção permite, por exemplo, a determinação em um doente que necessita de insulina, em tempo real em vez do sistema usual de doses padrão e tempos pré-determinados que não permitem qualquer modificação nao prevista no esquema de comportamento, a qual deveria alterar a necessidade do doente de insulina. Também permite a administração da dosagem a uma taxa contínua e continuamente ajustada, mesmo automaticamente.

A presente invenção é ilustrada mas não limitada pelos exemplos que seguem:

Exemplo 1

Prepararam-se liposomas pela técnica de evaporação de i

fase inversa, a partir de 9 partes de dipalmitoíl-fosfatidilcolina (DPPC) e 1 parte de fosfatidil-inositol (PI), com uma solução aquosa da. enzima glucose oxidase.

Os liposomas foram incorporados numa membrana por absorção em um filtro composto por uma película de nitrocelulose auxiliada por sucção para introduzir os liposomas na nitrocelu lose.

Um procedimento alternativo foi a incorporação dos li posomas numa membrana de microporos oblíqua de um polímero de policarbonato e, em seguida, quando os liposomas estavam depositados nos poros, fixá-los pelo tratamento com glutaraldeído.

A membrana resultante que continha os liposomas foi de pois fixada de um modo estanque sobre a superfície do eléctro do de um par de electrodos de Clark , constituído por um ano do de platina circundado por um cátodo de prata. Este conjun to foi- depois coberto por uma outra membrana constituída por uma película de acetato de celulose. 0 conjunto total foi de pois imerso numa solução aquosa de glucose, e aplicada uma voltagem de polarização através dos electrodos. Deste modo, o ânodo de platina ficou positivo com o valor habitual para determinação amperometricas, por exemplo, aproximadamente 650 milivolts. 0 aparelho foi ligado a um registador que mediu e registou o debito da corrente.

A glucose difunde-se através da parede de liposomas, gerando, portanto, peróxido de hidrogénio por catálise enzimá tica. Subsequentemente, o peróxido de hidrogénio migra para a superfície do eléctrodo de platina e é detectado e ali medi do.

Os resultados observados demonstraram que 0 intervalo no qual existe relação entre a corrente de resposta e a concentração de glucose foram, ampliados dez vezes quando comparado com os sistemas de electrodos convencionais (ate 30 mmoles por litro ou mais) devido ao uso de enzimas encerradas em liposomas. Os tempos de resposta foram de 30 a 90 segundos. Isto é praticável para medições de concentrações desconhecidas de glu cose nos grandes intervalos exigidos para doentes diabéticos.

A resposta (débito da corrente) foi também substancial mente linear ao longo de um intervalo semelhante de concentra ções de glucose, a temperaturas compreendidas entre 29 e K6°8, a melhor situou-se a 35°6 (a temperatura de transição de fase do lípido). A corrente de resposta também foi medida num intervalo de temperaturas para a mesma concentração de glucose (15 mmoles por litro) verificando-se que aumenta até um valor máximo de aproximadamente 8,7 nA a 29°C e até um máximo de quase 9>5 nA ~a· 35°C (a temperatura de transição de fase do lípido), diminuindo em seguida de forma estacionária até 7,5 nA a 42°C e permanecendo então substancialmente constante quando a temperatura foi posteriormente aumentada.

Isto permite comparar o comportamento do sensor acima e abaixo da temperatura de transição de fase do lípido particu lar de que os liposomas derivam (35°C) e mostra que a resposta da corrente mais alta se obtém·., à temperatura, de transição.

Exemplo 2

Preparação de liposomas (Vesículas por evaporação de fase inversa, REV).

Prepararam-se liposomas por meio de uma modificação do método descrito F. Szoka e D. Papadjopoulos Proa Natl. Acad, Sei., 75 (1973)} 4194 - 4198,7, e utilizaram-se primeiramente devido ao seu grande volume encapsulado, para encerrar glucose oxidase. Incluiu-se uma proporção do lípido marcado com trício com o objectivo de permitir o estudo material, o que não é necessário para a aplicação dos liposom_3s vresuíbarites em um

1Ζ

eléctrodo de enzima e, portanto, para fins práticos, pode ser omitido.

Adicionaram-se 9 mg do lípido, dimiristoíl-fosfatidilcolina (DMPC) a 1 mg de fosfatidil-inositol (PI) e 100 ul de

mistura de clorofórmio destilado/metanol a 4-:1. Verificou-se a pureza dos lípidos por cromatografia em camada fina de placas de gel de sílica e destilaram-se os dissolventes para remover quaisquer vestígios de peróxidos. A mistura foi evaporada rotativamente à temperatura de 60°C para se obter uma película lipídica fina. Esta foi depois redispersa em 6 ml de clorofórmio/metanol a 4-:1 e 3 ml de solução de cloreto de sódio tamponado com fosfato a 1:10 saturado com azoto (PBS, I = 0,15 mole/1) contendo 10 mg de glucose oxldase. A mistura foi agitada num vórtex seguida de sonicação durante 4- minutos num sonicador do tipo banho (Decon FS 100, Decon Ultrasonics Ltd., Sussex, Inglaterra) sob atmosfera de azoto. Manteve-se a temperatura do banho em 30°C, isto e, acima da temperatura de tran sição de fase do lípido. A emulsão homogenea resultante foi evaporada rotativamente a uma temperatura superior à temperatu ra de transição de fase do lípido. Em seguida, apresentou-se uma fase de gel viscoso, inversão de gel, com a formação de uma suspensão aquosa. Esta, foi purgada com azoto durante mais 15 minutos a uma temperatura superior a temperatura de transição de fase do lípido para eliminar vestígios de dissolvente orgânico e para tratar quaisquer defeitos dos liposomas.

processo anterior foi repetido utilizando DPPC em substituição de DMPC e a temperatura do banho foi mantida em

50°C_} utilizando-se também DSPC em substituição do DMPC e mantendo-se a temperatura do banho em 60°C, isto é, acima da temperatura de transição de fase dos lípidos correspondentes.

Para separar a glucose oxidase encapsulada de enzima não encapsulada fez-se passar a preparação através de uma coluna Sepharose 4b (30 x 1,5 cm) eluindo com PBS, pH 7,3, com um caudal de 0,2 ml/minuto e recolheram-se fracções de 2 ml utilizando um aparelho LKB Redirac Fraction Collector (Bromma, Suécia). Antes da aplicação da suspensão de liposomas tratou-se a coluna com uma dispersão de liposomas para impedir a absorção dos liposomas na matriz de gel fC. H. Huang, Biochemistry, 8 (1969), 13^ - 13 5^ J

Imobilização dos Liposomas na Membrana

Imobilizaram-se liposomas numa membrana por filtração de um volume previamente determinado (Iml) da suspensão, sob vácuo em uma membrana de nitrocelulose Millipore (1 cm2) com Q,k5 jvn de poro (Millipore Ltd. The Boulevard,, Watford, Hertfordshire, Inglaterra) seguida de lavagem da membrana com um tampão PBS a pH 7,3.

Determinou-se a radioactividade -das membranas Millipore por contagem da cintilação adicionando ml de líqui do de cintilação às membranas e as contagens foram depois utilizadas para avaliar a densidade dos liposomas em cada membrana. Relacionando o DPM para a membrana com o DPM/mole de lí pido, foi possível calcular o número de moles de lípido na mem brana e, portanto, saber o número de moles de proteína por mole de lípido e determinar 0 número de moles de proteína ligada.

Isto foi efectuado após terem sido testadas as respostas de glu cose de membranas apropriadas.

EXPERIÊNCIA:

Utilizou-se um sistema de eléctrodos de oxigénio básico de Clark (Rank Brothers, Bottiáiam, Cambridge, Inglaterra).

eléctrodo foi polarizado a +Ó50 mV para detecção de peróxido de hidrogénio e ligado a um registador gráfico. 0 eléctrodo era constituído por um eléctrodo de trabalho em platina, central, com o diâmetro de 2 mm, e por um anel de prata, exterior com 0 diâmetro de 12 mm, como pseudo-referência.

PROCEDIMENTO PARA DETERMINAÇÃO_DA GLUCOSE:

Utilizou-se um tampão de PBS isotónico com amostras aquosas. A superfície do sensor de peróxido de hidrogénio foi humidificada com solução tampão para permitir o contacto eléctrico entre os eléctrodos de trabalho e de pseudo-referência.

Em seguida, colocou-se a membrana Millipore apropriada transportando os liposomas, contendo a enzima imobilizada, sobre o eléctrodo e manteve-se no lugar através de um parafuso no topo ligado ao corpo do eléctrodo.

Adicionaram-se alíquotas de solução de reserva de D-glu cose 1M a um volume apropriado de tampão na câmara de amostragem e agitou-se o meio até 9 obtenção da homogeneidade. Em se guida registaram-se as correntes estacionárias. Egte processo foi repetido para uma gama de membranas de liposomas (DMPC/PI, DLPC/PI e DSPC/PI), todas com uma relação em peso de 9;1·

Além disso, mediram-se as respostas de glucose num intervalo de temperaturas utilizando uma célula de reacção termoestati zada. Não se observaram durante o aquecimento ou arrefecimen to efeitos de histerese da resposta do eléctrodo.

Para se assegurar que as determinações eram fiáveis, realizaram-se medições de controlo utilizando a mesma enzima suportada pela superfície de uma membrana Millipore, mas não na forma de liposoma, e avaliaram-se as respostas de glucose num intervalo de temperaturas semelhante e de um modo análogo, utilizando concentrações de enzima comparáveis às das membranas de liposoma.

Comparou-se o comportamento do sensor, a temperaturas superiores e a temperaturas inferiores à temperatura de transição de fase de moléculas de lípidos liposómicos como componentes, de dipalmitoíl-fosfatidilcolina. Acima de 42°C regis, taram-se sinais de glucose aumentados que se correlacionaram com uma maior permeabilidade da membrana lipídica bifásica.

Verificou-se que a resposta dos eléctrodos abrangia o intervalo necessário de concentrações de glucose e, além disso, utilizando liposomas preparados com diferentes lípidos, constatou-se que a resposta do eléctrodo dependia das permeabilidades da bifase em relação com as temperaturas de transição da fase lipídica e, como uma consequência, os intervalos lineares foram devidamente alterados.

Os resultados demonstraram que a encapsulação da enzi ma ou a sua imobilização com liposomas aumenta o intervalo li near da resposta do eléctrodo e que a actividade da enzima é parcialmente imposta pela permeabilidade da bicamada liposómi ca. Esta capacidade para controlar a afinidade da enzima para o substrato e para prolongar o seu intervalo util para concentrações de glucose mais elevadas mediante a utilização liposomas com menos permeabilidade tem um valor considerável para utilizações nas quais seja necessaia a medição de níveis altos de glucose, por exemplo, na avaliação da diabetes e nos proces, sos de fermentação.

ANALISE DA DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHOS DAS VESÍCULAS POR ESPECTROSCQPIA DE CORRELAÇÃO FOTÓNICA (PCS)_____________________ tamanho das vesículas foi determinado por uma técni ca de varrimento por luz dinâmica utilizando um Malvern Auto sizer (Model NS 66l43> Malvern Instruments, Malvern, Inglaterra). Determinou-se o diâmetro hidrodinâmico com base nas flutuações da intensidade da luz de varrimento com o tempo.

autoanalisador forneceu uma distribuição ponderai, normal equivalente dos diâmetros das partículas, a partir da qual se obteve o diâmetro médio ponderai dos liposomas (d_w). A veri ficacao da exactidão dos valores de d foi realizada utilizando pérolas de látex monodispersas comi diâmetros nominais de 50 nm, 150 nm e 244 nm. As medições foram realizadas sobre liposomas dispersos em PBS, pH 7,3.

Os liposomas preparados a partir de lípidos diferentes tem permeabilidades diferentes e este efeito pode ser utilizado de forma a controlar a sua permeabilidade, escolhendo-a através de uma selecção apropriada do componente lipídico.

Por exemplo, quando os liposomas utilizados são preparados com tres compostos, dimiristoílo, dipalmitoílo e diesteraroíl-fosfatidilcolina, como componente lípido, verifica-se que o pri22

meiro destes três (o derivado do dimiristoílo) e o mais permeável à glucose e o último (o derivado de diestearoílo), é o menos permeável à glucose. Isto atribuiu-se às diferenças nas propriedades de transição de fase dos lípidos.

Alem disso, verificou-se que este efeito de lípido sobre as propriedades do liposoma, com fins de inclusão num eléç trodo de enzima afecta o intervalo linear da resposta do eléctrodo -verificou-se que os liposomas derivados de lípidos menos permeáveis (dos três mencionados anteriormente, o derivado de diestearoílo) têm um intervalo linear maior (pelo menos 50 niM) e que os liposomas mais permeáveis (dos três mencionados anteriormente, o derivado de dimiristoílo) apresentam um intervalo linear menor (10 mM). Neste sentido, a presente invenção proporciona um meio pelo qual é possível controlar o intervalo linear mediante variação da natureza do lípido utilizado. Tam bem, permite a obtenção dos eléctrodos de enzima sob uma forma que se pode utilizar facilmente quando e necessário medir níveis relstivamente altos de glucose, 35} por exemplo, em recipientes de fermentação.

Para liposomas preparados com os três lípidos menciona dos anteriormente (dimiristoílo, dipalmitoílo e diestearoílo-fosfatidilcolina 1, existe um aumento acentuado na permeabilidade da glucose à temperatura de transição de fase do lípido respectivo, indicado por um aumento acentuado na resposta do electrodo.

TÉCNICAS PB DOSEAMSRT0^

Dosearam-se fracções de 2 ml por cromatografia sobre

2J

gel para determinação da proteína, de acordo com a técnica des. crita por Lowry et al., (J. Biol. Chem., 191. 265 - 275, utilizando um padrão de glucose oxidase (0-200 . A fim

de dispersar a glucose oxidase liposómica, adicionaram-se 100 pl de SDS a 1 % (p/v) a cada fracção liposómica e aos padrões de proteína. 0 SDS nesta concentração demonstrou não inibir ou desnaturar a glucose oxidase em meio neutro. As fracções foram analisadas para determinação do lípido por contagens de /^¾ _7-BPPC obtidas por contagem da cintilação (Beckman LS 9θ00 USA). Estes parâmetros foram depois utilizados para expressar a concentração de glucose oxidase encapsulada em yjg de glucose oxidase ¹ ” “pido.

DPPC (radioactividade específica

80Ci/mmole, code TRh 673) à Amersham International PLG, Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra e utilizou-se lípidos de cintilação Ecosinct A, fornecidos por National Diagnostics, Manville, New Jersey, Estados Unidos da América.

Na descrição anterior, utilizaram-se as abreviaturas seguintes e os produtos utilizados na investigação foram obti dos na Sigma Chemical Company, Poole, Dorset, Inglaterra:

- DPPC refere dipalmitoíl-fosfatidilcolina;

(L-alfa-dipalmitoíl-fosfatidilcolina, produto

N2 P-O7Ó3)

- DMPC refere dimiristoíl-fosfatidilcolina;

(L-alfa-dimiristoíl-fosfatidilcolina, produto N2 P-0888).

- DSPC refere diestearoíl^fosfatidilcolina:

(L-alfa-estearoíl-f&.sfatidilcolina, produto

- PI

N² P-II38) refere fosfatidil-inositol (grau 1, Produto NQ P-976).

Rei-

Claims (27)

1. - Electrodos de enzimas, caracterizados pelo facto da enzima se encontrar encerrada em lipossomas.

2. - Electrodos de enzimas de acordo com a reivindica ção 1, caracterizados pelo facto dos lipossomas, no interior dos quais a enzima está encerrada, estarem unidos a ou incorporados em um veículo de suporte, especialmente sobre ou no interior de uma membrana.

3. - Electrodos de enzimas de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizados pelo facto dos lipossomas estarem imobilizados sobre um veículo de suporte.

NOVAS REIVINDICAÇÕES 4 A 27

4.- Processo para a preparação de eléctrodos de enzimas de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de se submeterem os lipossomas a uma agitação enérgica e mistura perfeita do lípido e de uma fase aquosa que contém a enzima e de se promover a sua incorporação no eléctrodo.

5. - Processo de acordo com a reivindicação

4, caracterizado pelo facto de a mistura do lípido e da fase aquosa que contém a enzima se realizar na presença de um auxiliar de encapsulação.

6. - Processo de acordo com a reivindicação

5, caracterizado pelo facto de se incorporarem, o lípido e o auxiliar de encapsulação em uma proporção de 5 a 20 partes do lípido para 1 parte do auxiliar de encapsulação.

7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo facto de como lípi do se utilizar o fosfatidil-inisitol, a dimiristoil-fosfati dil-colina, a dipalmitoil-fosfatidil-colina ou a distearoil2 ,

Λ

-fosfatidil-colina.

8. - Eléctrodos de enzimas de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizados pelo facto de os lipossomas apresentarem dimensões compreendidas en tre 25 e 1000 nm, especialmente entre 100 e 200 nm.

9. - Processo para a preparação de eléctrodos de enzimas de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo facto de se imobilizarem os lipossomas sobre uma membrana constituída por um derivado de celulose, especialmente um éster de celulose, por exemplo, acetato de celulose ou nitrato de celulose (nitrocelulose) ou policarbonato.

10. - Eléctrodos de enzimas de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizados pelo facto de os lipossomas se incorporarem no material da membrana por contacto, eventualraente com o auxílio de meios (por exemplo pressão) que obrigam à introdução forçada dos mesmos nesse material,

11. - Eléctrodos de enzimas de acordo com a reivindicação 10, caracterizados pelo facto de a pressão di^ ferencial exercida por sucção ser utilizada para arrastar uma suspensão aquosa de lipossomas para o interior do mate3 rial da membrana de tal modo que os lipossomas são aí depositados e conservados e o meio aquoso passa.

12. - Eléctrodos de enzimas de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 11, caracterizados pelo facto de o material da membrana ser tratado, sob o ponto de vista físico e/ou químico, para o tornar mais receptivo aos liposs£ mas, por exemplo, tornando-o microporoso de tal modo que os poros possam reter os lipossomas.

13. - Eléctrodos de enzimas de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizados pelo facto de os lipossomas, uma vez colocados sobre ou no interior do material da membrana, serem conservados mais energicamente no local mediante tratamento com um agente de fixação que os tor na menos movíveis embora sem destruir esses lipossomas ou a enzima neles encerrada.

14. - Processo para a preparação de eléctrodos de enzimas de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo facto de se incorporar nos lipossomas entre 0,1 e 0,5 mmole, da enzima relativamente a cada mole do lípido.

15. - Processo para a preparação de eléctrodos de enzimas de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo facto de se incorporar ainda um ânodo de platina, especialmente como o designado por par ânodo/cátodo de Clark, constituído por um ânodo de platina rodeado por um cátodo de prata.

16. - Electrodos de enzimas de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 15, caracterizados pelo fa£ to de incluírem um par de electrodos num conjunto constituí do por uma ou mais membranas que excluem materiais de peso molecular elevado.

17. - Electrodos de enzimas de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 16, caracterizados pelo fa£ to de compreenderem duas membranas - (a) uma permeável ao peróxido de hidrogénio mas não aos componentes que podem in terferir com as medições realizadas nos potenciais utilizados, e destinada a proporcionar maior separação de materiais indesejáveis (por exemplo, componentes do sangue de elevado peso molecular) dos electrodos e também, possivelmente, a evitar avarias mecânicas, e (b) uma outra, que transporta os lipossomas imobilizados contendo as enzimas, definidas antes mais detalhadamente.

18. - Electrodos de enzimas de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 17, caracterizados pelo facto membrana separadora estar próxima dos eléctrodós e da membrana que transporta a enzima estar localizada atrás da primeira, mais afastada dos eléctrodos.

19. - Eléctrodos de enzimas de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 18, caracterizados pelo facto das membranas estarem presas aos eléctrodos mediante uma ligação selada, de tal modo que os líquidos utilizados não podem atravessá-las facilmente.

20. - Método para electro-análise de soluções contendo substâncias que reagem com uma enz’ima, caracterizado pelo facto de se utilizar um electrodo de enzimas comportando uma enzima encerrada em lipossomas como definido em uma qualquer das reivindicações 1 a 19.

21. - Método para electro-análise de soluções de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de se realizar a uma temperatura operacional próxima da temperatura de transição de fase do lípido do lipossoma.

22. - Método para electro-análise de soluções de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fac. to de se realizar a uma temperatura operacional compreendida entre Í10°C da temperatura de transição de fase do lípido.

Ί

23.- Método para electro-análise de soluções de acordo com uma qualquer das reivindicações 20 a 22, caracterizado pelo facto de se utilizar um eléctrodo de enzimas para me dir a temperatura de transição do lípido de que deriva o lipos. soma, mediante determinação da resposta da corrente em relação à temperatura mantendo a concentração da glucose constante e anotando o máximo que a corrente atinge, o que indica a temperatura de transição.

24. - Método para electro-análise de soluções de acordo com uma qualquer das reivindicaçõ.es 20 a 22, caracterizado pelo facto de se determinarem as concentrações de glucose no sangue ou em outros fluidos corporais como, por exemplo, o soro.

25. - Membranas que contêm enzimas, úteis para incorporar em eléctrodos de enzimas melhorados como definidos em uma qualquer das reivindicações 1 a 19 e/ou para utilizar em métodos melhorados para electro-análise como definidos em uma qualquer das reivindicações 20 a 24, caracterizadas pelo facto da enzima se encontrar encerrada em lipossomas.

26. - Lipossomas que contem enzimas como descritos em uma qualquer das reivindicações 2 a 19, caracterizados pe lo facto de se utilizarem na produção de eléctrodos de enzimas como definidos em uma qualquer das reivindicações 1 a 19 e/ou de membranas como definidas na reivindicação 25.

27.- Célula electro-analítica, caracterizada pe_ lo facto de incorporar um eléctrodo de enzimas, uma membrana que contém enzimas ou um lipossoma que contém enzimas como definidas em uma qualquer das reivindicações 1 a 26.

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