PT98935A - Process for preparation of polypeptide analogues from the active site of interleukin-8, antibody for detection of the presence of IL-8, and therapeutic compositions - Google Patents

Abstract

The present invention relates to the process for preparation of polypeptide analogues from the active site of interleukin-8 (IL-8), and of antibodies for the active site, which involves the sequential addition of amino acid residues to the growing peptide chain, the amino terminal or the carboxyl terminal being protected with a suitable selectively removable protecting group until the desired polypeptide analogue has been prepared. The invention also relates to the process for the detection of the presence of IL-8 in a body fluid, which involves: (a) mixing an aliquot of body fluid with an antibody composition which immunoreacts with a segment of the carboxy terminal of IL-8 or with an antibody which immunoreacts with a segment of the amino terminal of IL-8, (b) keeping said immunoreaction mixture under biological assay conditions for a sufficient period of time to form an immunoreaction product; and (c) detecting the presence of said immunoreaction product and thus the presence of IL-8. The invention also relates to the process for preparation of therapeutic compositions from the polypeptide analogues prepared.

Description

73 116 SCRF Case 217.1POR -2-73 116 SCRF Case 217.1

MEMORIA DESCRITIVADESCRIPTIVE MEMORY

Campo Técnico o presente invento refere-se a citoguinas e ao seu papel em reacções inflamatórias. Mais especificamente, o presente invento refere-se ao processo de preparação de um análogo de polipéptido do local activo de IL-8 de anticorpos para o local activo e a métodos adequados para inibir inflamação por neutralização do local de interacção de receptor de IL-8.Technical Field The present invention relates to cytokines and their role in inflammatory reactions. More specifically, the present invention relates to the process of preparing an active site IL-8 polypeptide analogue of antibodies to the active site and to methods suitable for inhibiting inflammation by neutralizing the IL-8 receptor site interaction site .

Arte AnteriorPrevious Art

As células imuno-competentes e o endotélio vascular interac-tuam produzindo hemostase bem como reacções inflamatórias e imunitárias. Os mediadores destas interacções bidireccionais intricadas entre os leucócitos e as células vasculares são as citoqui-nas que são produzidas e actuam nas células endoteliais (Immunol. Today. 10:370-375 (1989). As citoquinas exercem a sua influência nas células endoteliais fazendo com que estas libertem quimioa-tractores que induzem a quimiotaxia e a extravasão de células po-limorfonucleares e de monócitos. [Broudy et al.# J. Immunol.. 139:464-468 (1987)? Sieff et al., Blood. 72:1316-1323 (1988)]. Este recrutamento e activação de leucócitos quebra gravemente a arquitectura das paredes dos vasos e dos tecidos subjacentes, provocando a lesão.Immuno-competent cells and vascular endothelium interact to produce hemostasis as well as inflammatory and immune reactions. The mediators of these intricate bidirectional interactions between leukocytes and vascular cells are those cytokines that are produced and act on endothelial cells (Immunol, Today 10: 370-375 (1989). with which they release chemo-tracers that induce chemotaxis and extravasation of po-limorphonuclear cells and monocytes [Broudy et al., J. Immunol., 139: 464-468 (1987)], Sieff et al., Blood. 72: 1316-1323 (1988)] This recruitment and activation of leukocytes severely breaks down the architecture of vessel walls and underlying tissues, causing injury.

Pertencendo a uma família crescente de citoquinas de péptido monomérico induzidas por lipopolissacáridos (LPS), pelo factor de necrose de tumor (TNF) ou por outras citoquinas, a IL-8 é um mediador putativo de lesões de tecidos no choque séptico, a síndroma da dificuldade respiratória aguda (ARDS) e, geralmente, durante doenças ou condições inflamatórias associadas com a produção aumentada de TNF. A IL-8 tem sido detectada, recentemente, em fluido de lavagem broncoalveolar de pacientes com ARDS prematuro. A nomenclatura para o novo grupo de citoquinas compreendendo IL-8 não foi estabelecida. A IL-8 intacta parece ser idêntica ao factor guimiotático de neutrófilo derivado de monócito (MDNCF)Belonging to a growing family of lipopolysaccharide (LPS) -induced monomeric peptide cytokines, tumor necrosis factor (TNF), or other cytokines, IL-8 is a putative mediator of tissue injury in septic shock, acute respiratory distress syndrome (ARDS) and, generally, during diseases or inflammatory conditions associated with increased TNF production. IL-8 has been recently detected in bronchoalveolar lavage fluid from patients with premature ARDS. Nomenclature for the new group of cytokines comprising IL-8 has not been established. The intact IL-8 appears to be identical to the monocyte derived neutrophil guanacota factor (MDNCF)

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SCRF Case 217.1P0RSCRF Case 217.1P0R

[Matsushima et al., J. Exo. Med.. 167:1883-1893 (1988)], ao fac-tor activador de neutrófilo (ΝΑΓ) [Lindley et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 85:9199-9203 (1988); PCT N» WO 89/04836] e ao factor quimiotático de neutrófilo (ncf) (pct Na wo 89/10962). O bloqueamento da quimiotaxia e da activação de neutrófilos durante uma doença inflamatória é um objectivo terapêutico principal. É necessária a intervenção terapêutica em vários pontos da cascata inflamatória para evitar a lesão dos tecidos. A indução da produção de IL-1 e de TNF ocorre em 30 minutos após a exposição, por exemplo, a LPS. Os anticorpos contra o local acti-vo de interaeção de receptor do TNF, são intervenientes eficazes em vários modelos animais, por exemplo, num modelo de porco para o choque séptico. Contudo, para serem eficazes, os anticorpos an-ti-TNF têm de ser administrados muito cedo no decurso da doença.[Matsushima et al., J. Ex. Med., 167: 1883-1893 (1988)], to the neutrophil activating factor (ΝΑΓ) [Lindley et al., Proc. Natl. Acad. Know. USA. 85: 9199-9203 (1988); PCT N, WO 89/04836] and neutrophil chemotactic factor (ncf) (pct Nao 89/10962). Blocking chemotaxis and neutrophil activation during an inflammatory disease is a major therapeutic goal. Therapeutic intervention is necessary at various points in the inflammatory cascade to prevent tissue damage. Induction of IL-1 and TNF production occurs within 30 minutes after exposure, for example, to LPS. Antibodies to the active site of TNF receptor interaction are effective intervenients in various animal models, for example, in a porcine model for septic shock. However, to be effective, the anti-TNF antibodies have to be administered very early in the course of the disease.

Deste modo, o que é necessário é um anticorpo bloqueador dirigido contra uma proteína inflamatória de actuação tardia. Isto permitiria a intervenção ao nível secundário da resposta, subsequente à produção de TNF, resultando num quadro alargado para diagnóstico e preparação para o tratamento. Adicionalmente, uma abordagem terapêutica em tandém, utilizando anticorpos anti-IL-8 conjuntamente com anticorpos anti-TNF, aumentaria a eficácia nos casos em que as pequenas quantidades de TNF, que se escapam à ligação anti-TNF, seriam secundariamente neutralizadas.Thus, what is needed is a blocking antibody directed against a late acting inflammatory protein. This would allow intervention at the secondary level of the response, subsequent to the production of TNF, resulting in a broad framework for diagnosis and preparation for treatment. In addition, a tandem therapeutic approach using anti-IL-8 antibodies in conjunction with anti-TNF antibodies would increase efficacy in cases where small amounts of TNF, which escape the anti-TNF binding, would be secondarily neutralized.

Breve Sumário do InventoBRIEF SUMMARY OF THE INVENTION

Verificou-se agora que o local activo de interaeção de receptor da IL-8 nativa humana, intacta, se localiza num segmento de 18 resíduos de aminoácido no terminal carboxilo da proteína madura de 72 resíduos de aminoácido.It has now been found that the intact, native human IL-8 receptor interaction site is located on a segment of 18 amino acid residues at the carboxyl terminus of the 72 amino acid residue mature protein.

Um aspecto contemplado no presente invento é um análogo de polipéptido do local de interaeção de receptor de IL-8, possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondente à fórmula: Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg-Val-Val-Glu-Lys-Phe-Leu-Lys, designado por p 50-67.One aspect contemplated in the present invention is a polypeptide analogue of the IL-8 receptor interaction site, having an amino acid residue sequence corresponding to the formula: Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val -Glu-Arg-Val-Val-Glu-Lys-Phe-Leu-Lys, designated p50-67.

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SCRF Case 217.1POR -4- O presente invento contempla também um polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondentes à fórmula: (3-20), designado por p 3-20.The present invention also contemplates a polypeptide having an amino acid residue sequence corresponding to the formula: (3-20), designated p3-20.

Outro aspecto do presente invento é um anticorpo que imuno--reage (a) com o local de interacção de receptor de IL-8 e (b) com um análogo de polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondente à fórmula para o p 50-67.Another aspect of the present invention is an antibody which immunoreacts (a) the IL-8 receptor interaction site and (b) with a polypeptide analogue having an amino acid residue sequence corresponding to the formula for 67.

Uma concretização preferida do presente invento é um anticorpo monoclonal que imuno-reage com o local de interacção de receptor de IL-8 e como análogo de polipéptido, anteriormente descrito, designado por p 50-67.A preferred embodiment of the present invention is a monoclonal antibody that immunoreacts with the IL-8 receptor site of interaction and as the polypeptide analog, described above, designated p50-67.

Um aspecto relacionado do presente invento é um anticorpo que imuno-reage (a) com IL-8 e (b) com um polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondente à fórmula: (3-20), designado por p 3-20.A related aspect of the present invention is an antibody that immunoreacts (a) with IL-8 and (b) with a polypeptide having an amino acid residue sequence corresponding to the formula: (3-20), designated p3-20 .

Uma concretização preferida deste aspecto é um anticorpo monoclonal que imuno-reage com IL-8 e com o polipéptido p 3-20.A preferred embodiment of this aspect is a monoclonal antibody that immunoreacts with IL-8 and the β 3-20 polypeptide.

Um processo, para detectar a presença de IL-8 em fluídos corporais, é outro aspecto contemplado pelo presente invento. Este processo compreende a mistura de uma alíquota de fluido corporal com uma composição de anticorpo compreendendo uma molécula de anticorpo que imuno-reage com um segmento do terminal carboxilo de IL-8 possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondente à fórmula:One process, for detecting the presence of IL-8 in body fluids, is another aspect contemplated by the present invention. This process comprises mixing an aliquot of body fluid with an antibody composition comprising an antibody molecule that immunoreacts with a carboxyl terminus segment of IL-8 having an amino acid residue sequence corresponding to the formula:

Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg-Val-Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg-Val-

Val-Glu-Lys-Phe-Leu-Lys. 0 contacto do fluido corporal com a composição de anticorpo é mantido durante um tempo suficiente para que se forme um produto de imuno-reacção. 0 produto de imuno-reacção formado, contendo IL-8, é depois detectado.Val-Glu-Lys-Phe-Leu-Lys. Contact of the body fluid with the antibody composition is maintained for a time sufficient to form an immune reaction product. The formed immunoreaction product, containing IL-8, is then detected.

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Um aspecto relacionado contempla um processo para detectar a presença de IL-8 em fluídos corporais compreendendo a mistura de uma alíquota de fluido corporal com uma composição de anticorpos compreendendo moléculas de anticorpo que imuno-reagem com um segmento do terminal amino de IL-8 possuindo uma sequência de resíduos aminoácido correspondente à fórmula: (3-20). O contacto do fluido corporal com a composição de anticorpos é mantido como anteriormente e o produto de imuno-reacção formado, contendo IL-8, é depois detectado. O presente invento contempla ainda um sistema de diagnóstico na forma de um conjunto de diagnóstico. O sistema compreende uma embalagem contendo, numa quantidade suficiente para realizar pelo menos um ensaio, uma composição de anticorpos contendo uma população de moléculas de anticorpos que imuno-reage com um determinante antigénico numa molécula de IL-8. Esta composição de anticorpos pode estar numa solução líquida ou pode estar ligada a uma matriz de fase sólida. 0 sistema contém também um marcador para indicar a presença de moléculas de anticorpos no produto de imuno-reacção formado.A related aspect contemplates a method for detecting the presence of IL-8 in body fluids comprising mixing an aliquot of body fluid with an antibody composition comprising antibody molecules that immunoreact with an amino-terminal segment of IL-8 having an amino acid residue sequence corresponding to the formula: (3-20). Contact of the body fluid with the antibody composition is maintained as above and the formed immune reaction product, containing IL-8, is then detected. The present invention further contemplates a diagnostic system in the form of a diagnostic set. The system comprises a package containing, in an amount sufficient to carry out at least one assay, an antibody composition containing a population of antibody molecules that immunoreacts with an antigenic determinant on an IL-8 molecule. This antibody composition may be in a liquid solution or may be attached to a solid phase matrix. The system also contains a marker for indicating the presence of antibody molecules in the formed immuno-reaction product.

Numa concretização preferida, a composição de anticorpos contém um anticorpo monoclonal.In a preferred embodiment, the antibody composition contains a monoclonal antibody.

No presente invento é também contemplada uma composição terapêutica que é adequada para evitar inflamações. Uma tal composição compreende um anticorpo que imuno-reage (a) com o local de interacção de receptor da IL-8 e (b) com um análogo de poli-péptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondentes à fórmula:In the present invention there is also contemplated a therapeutic composition which is suitable for preventing inflammation. Such a composition comprises an antibody that immunoreacts (a) with the IL-8 receptor site of interaction and (b) with a polypeptide analogue having a sequence of amino acid residues corresponding to the formula:

Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg-Val-Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg-Val-

Val-Glu-Lys-Phe-Leu-Lys, ou com seus equivalentes biológicos num excipiente farmaceutica-mente aceitável.Val-Glu-Lys-Phe-Leu-Lys, or with their biological equivalents in a pharmaceutically acceptable excipient.

Uma composição terapêutica relacionada contemplada pelo pre-A related therapeutic composition contemplated by the pre-

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SCRF Case 217.1POR -6-sente invento compreende um anticorpo que imuno-reage (a) com IL--8 e (b) com um polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondente à fórmula: (3-20), ou com os seus equivalentes biológicos, num excipiente farmaceu-ticamente aceitável.The present invention comprises an antibody which immunoreacts with IL-8 and (b) with a polypeptide having an amino acid residue sequence corresponding to the formula: (3-20), or their biological equivalents, in a pharmaceutically acceptable excipient.

Adicionalmente, é contemplado um método para evitar inflamações num paciente. Este método compreende a administração ao indivíduo de uma composição contendo um anticorpo que imuno-reage com IL-8 e com os polipéptidos anteriormente descritos designados por p 50-67 ou por p 3-20, ou com seus equivalentes biológicos, num excipiente farmaceuticamente aceitável. O presente invento tem certas vantagens, nomeadamente, a) a intervenção a um nível secundário na cascata inflamatória é agora possível, permitindo um tempo adicional para diagnóstico e preparação para tratamento e b) uma intervenção mais completa e eficaz é possível combinando o método anteriormente conhecido, utilizando anticorpos anti-TNF, e o método do presente invento para neutralizar secundariamente as moléculas de TNF que escapam à ligação de anticorpos anti-TNF.Additionally, a method of preventing inflammation in a patient is contemplated. This method comprises administering to the subject a composition containing an antibody which immunoreacts with IL-8 and the above-described polypeptides designated p50-67 or p3-20, or their biological equivalents, in a pharmaceutically acceptable excipient . The present invention has certain advantages, namely, a) intervention at a secondary level in the inflammatory cascade is now possible, allowing additional time for diagnosis and preparation for treatment, and b) more complete and effective intervention is possible by combining the previously known method, using anti-TNF antibodies, and the method of the present invention to secondarily neutralize the TNF molecules that escape the binding of anti-TNF antibodies.

Ainda outras concretizações e vantagens do invento tornar--se-ão evidentes para os peritos na arte após a leitura de todas as revelações aqui contidas.Still further embodiments and advantages of the invention will become apparent to those skilled in the art upon reading all disclosures contained herein.

Breve Descrição dos DesenhosBrief Description of Drawings

Nos desenhos que constituem parte do presente invento: A Figura 1 ilustra os efeitos da IL-8 ou dos polipéptidos sintéticos, correspondentes à sequência de resíduos de aminoácido 50-67 e 57-72 da IL-8, na activação de neutrófilos tal como são medidos por mobilização de cálcio. A razão F, que é igual ao valor do cálcio intracelular, é representada no eixo dos Y em função do tempo, em segundo após o tratamento com IL-8 ou com péptido representado no eixo dos X. A IL-8 e o polipéptido sintético 50-67, também designado por Pep-1, induzem a mobilização de cálcio em neutrófilos, enquanto que o polipéptidoIn the drawings which form part of the present invention: Figure 1 illustrates the effects of IL-8 or synthetic polypeptides, corresponding to the sequence of amino acid residues 50-67 and 57-72 of IL-8, in the activation of neutrophils as they are measured by calcium mobilization. The ratio F, which is equal to the value of intracellular calcium, is plotted on the Y-axis as a function of time, second after treatment with IL-8 or with peptide represented on the X-axis. IL-8 and the synthetic polypeptide 50-67, also referred to as Pep-1, induce calcium mobilization in neutrophils, whereas the polypeptide

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SCRF Case 217.1POR -7 sintético 57-72, também designado por Pep-2, não o faz. A mobilização de cálcio, induzida pelo tratamento de neutrófilos com Pep-1, é inibida por anticorpos policlonais anti-Pep-l. A Figura 2 ilustra a curva de ligação não saturável de concentrações crescentes de IL-8 iodada a neutrófilos. A ligação específica é calculada na presença de um excesso molar de 100 vezes de IL-8 não marcada e é subtraída à ligação total para calcular a ligação específica representada por quadrados a cheio. Cada ponto é a média ± o erro padrão da média (EPM) de três experiências independentes. A ligação de IL-8 é inibida por anticorpos dirigidos contra o polipéptido sintético 50-67, Pep-1, (ilustrado pelos triângulos a cheio) relacionado com a IL-8. Os fragmentos FAB do ^ anticorpo anti-Pep-1 são mais eficazes do que os anticorpos in- tactos na inibição da ligação de IL-8 aos neutrófilos (ilustrados pelos quadrados a branco). A Figura 3 é um gráfico de barras que ilustra os efeitos de composições de anticorpos, anti-IL-8, anti-Pep-l (anti-50-67) e anti-Pep-3 (anti-3-20), imunoespecíficos para as regiões de poli-péptidos definidas da IL-8, na ligação de IL-8 iodada (125-I-IL--8) a neutrófilos (PMN), tal como se descreve no Exemplo 5A (2). O anticorpo anti-11-29, serviu como um controlo na experiência uma vez que não consegue evitar a inibição da ligação de 125I-IL-8 a PMN, quando comparado com a inibição observada com os anticorpos específicos de IL-8. >SCRF Case 217.1 POR-7 Synthetic 57-72, also referred to as Pep-2, does not. Calcium mobilization, induced by the treatment of neutrophils with Pep-1, is inhibited by anti-Pep-1 polyclonal antibodies. Figure 2 illustrates the non-saturable binding curve of increasing concentrations of iodinated IL-8 to neutrophils. The specific binding is calculated in the presence of a 100-fold molar excess of unlabeled IL-8 and is subtracted from the total binding to calculate the specific binding represented by filled squares. Each point is the mean ± standard error of the mean (EPM) of three independent experiments. IL-8 binding is inhibited by antibodies directed against synthetic polypeptide 50-67, Pep-1, (shown by solid triangles) related to IL-8. FAB fragments of the anti-Pep-1 antibody are more effective than the intact antibodies in inhibiting the binding of IL-8 to neutrophils (shown by blank squares). Figure 3 is a bar graph illustrating the effects of anti-IL-8, anti-Pep-1 (anti-50-67) and anti-Pep-3 (anti-3-20), immunospecific for the defined polypeptide regions of IL-8, on the binding of iodinated IL-8 (125-I-IL-8) to neutrophils (PMN), as described in Example 5A (2). The anti-11-29 antibody served as a control in the experiment since it can not prevent the inhibition of 125 I-IL-8 binding to PMN as compared to the inhibition seen with the IL-8 specific antibodies. >

Descrição Detalhada A. Definição de TermosDetailed Description A. Definition of Terms

Aminoácido: todos os resíduos de aminoácido aqui identificados estão na configuração natural L. Mantendo a nomenclatura padrão dos polipéptidos, J. Biol. Chem.. 243:3557-59, (1969), as abreviaturas para os resíduos de aminoácido são as que se mostram na Tabela de Correspondência seguinte:Amino acid: all amino acid residues identified herein are in the natural configuration L. By maintaining the standard nomenclature of the polypeptides, J. Biol. Chem., 243: 3557-59, (1969), abbreviations for amino acid residues are as shown in the following Corresponding Table:

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SCRF Case 217.1POR -8-SCRF Case 217.1ENG -8-

TABELA DE CORRESPONDÊNCIA Símbolo Aminoácido 1 letra 3 letras Y Tyr L-tirosina G Gly L-glicina F Phe L-fenilalanina M Met L-metionina A Ala L-alanina S Ser L-serina I Ile L-isoleucina L Leu L-leucina T Thr L-treonina V Vai L-valina P Pro L-prolina K Lys L-lisina H His L-histidina Q Gin L-glutamina E GlU ácido L-glutâmico W Trp L-triptofano R Arg L-arginina D Asp ácido L-aspártico N Asn L-asparagina C Cys L-cisteínaTABLE OF CORRESPONDENCE Symbol Amino acid 1 letter 3 letters Y Tyr L-tyrosine G Gly L-glycine F Phe L-phenylalanine M Met L-methionine A Ala L-alanine S Ser L-serine I Ile L-isoleucine L Leu L-leucine T Thr L-threonine V Go L-valine P Pro L-proline K Lys L-lysine H His L-histidine Q Gin L-glutamine E GlU L-glutamic acid W Trp L-tryptophan R Arg L-arginine D Asp L- Aspartic acid N Asn L-asparagine C Cys L-cysteine

Será de notar que todas as sequências de resíduos de aminoácido são aqui representadas por fórmulas cuja orientação da esquerda para a direita está no sentido convencional, do terminal amino para o terminal carboxilo. Adicionalmente, será de notar que um traço no princípio ou no fim de uma sequência de resíduos de aminoácido indica uma ligação a um radical tal como H e OH (hidrogénio e hidroxilo), no terminal amino e carboxilo, respectivamente, ou uma sequência adicional de um ou mais resíduos de aminoácido, até um total de cerca de cinquenta resíduos na cadeia de polipéptido.It will be appreciated that all sequences of amino acid residues are represented herein by formulas whose orientation from left to right is in the conventional sense from the amino terminus to the carboxyl terminus. In addition, it will be appreciated that a trace at the beginning or the end of an amino acid residue sequence indicates a bond to a radical such as H and OH (hydrogen and hydroxyl) at the amino and carboxyl terminus, respectively, or an additional sequence of one or more amino acid residues, up to a total of about fifty residues in the polypeptide chain.

Polinéntido e Péptido; Polipéptido e péptido são termos aqui -9 73 116 SCRF Case 217.1POR usados intermutavelmente para uma sequência de massa molecular relativamente baixa, i.e., de cerca de 210 dalton a cerca de 10 kD, e designam uma série linear de não mais do que cerca de 50 resíduos de aminoácido ligados uns aos outros por ligações peptídicas entre os grupos alfa-amino e carboxilo de resíduos adj acentes.Polynentide and Peptide; Polypeptide and peptide are terms herein which are used interchangeably to a relatively low molecular weight sequence, ie, from about 210 daltons to about 10 kD, and denote a linear series of no more than about 50 amino acid residues linked to each other by peptide bonds between the alpha-amino and carboxyl groups of adjuvants residues.

Proteína; Proteína é um termo aqui usado para designar uma série linear de mais do que 50 resíduos de aminoácido ligados uns aos outros tal como num polipéptido.Protein; Protein is a term herein used to denote a linear series of more than 50 amino acid residues linked to each other such as in a polypeptide.

Farmaceuticamente aceitável refere-se a entidades moleculares e a composições que não produzem uma reacção alérgica ou indesejável similar, tal como perturbações gástricas, tonturas e similares, quando administradas a um humano. B. Análoao de PolipéptidoPharmaceutically acceptable refers to molecular entities and to compositions which do not produce a similar allergic or undesirable reaction, such as gastric disturbances, dizziness and the like, when administered to a human. B. Polypeptide Analog

No presente invento é contemplado um polipéptido relacionado com a IL-8 que mimetiza certas funções do local activo de inter-acção com receptor da molécula de IL-8 nativa, possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondente à fórmula:In the present invention there is contemplated an IL-8-related polypeptide which mimics certain functions of the native IL-8 molecule receptor interacting active site, having an amino acid residue sequence corresponding to the formula:

Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg-Val-Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg-Val-

Val-Glu-Lys-Phe-Leu-Lys. 0 polipéptido mimetiza as funções da IL-8 promovendo a mobilização do cálcio em neutrófilos polimorfonucleares, induzindo a libertação de elastase, e, quando injectado em coelhos, promovendo a quimiotaxia de neutrófilos para uma concentração de IO-13· M. ao contrário da IL-8, o polipéptido não promove a polimerização de F-actina que resulta sob a ocupação do receptor de IL-8. 0 polipéptido do presente invento contém cerca de 18 resíduos de aminoácido. São contemplados polipéptidos adicionais, com um comprimento menor do que 18 resíduos de aminoácido, de modo a definir mais exactamente o local activo preciso. É agora conhecido, por exemplo, que um análogo de polipéptido contendo os resíduos de aminoácido 57 a 72 da IL-8 nativa é inactivo. Assim, uma porção do local activo tem de residir ou ser dirigidaVal-Glu-Lys-Phe-Leu-Lys. The polypeptide mimics the functions of IL-8 by promoting calcium mobilization in polymorphonuclear neutrophils, inducing elastase release, and, when injected into rabbits, promoting neutrophil chemotaxis to a concentration of 10 -13 M.M. versus IL -8, the polypeptide does not promote the polymerization of F-actin which results under the occupation of the IL-8 receptor. The polypeptide of the present invention contains about 18 amino acid residues. Additional polypeptides, having a length of less than 18 amino acid residues, are contemplated to more accurately define the precise active site. It is now known, for example, that a polypeptide analog containing amino acid residues 57 to 72 of native IL-8 is inactive. Thus, a portion of the active site must reside or be directed

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SCRF Case 217.1POR -10- conformacionalmente pelos resíduos de aminoácido que se encontram nos primeiros sete resíduos do local activo como presentemente se definiram.Conformationally by the amino acid residues found in the first seven residues of the active site as presently defined.

Uma sequência polipeptídica do presente invento pode diferir da sequência natural pelo facto da sequência estar modificada por uma acilação do terminal NH2, p.e., acetilação ou amidação com ácido tioglicólico, por amidação do terminal carboxilo, p.e., com amoníaco, metilamina e similares. 1. Síntese de PolipéptidoA polypeptide sequence of the present invention may differ from the native sequence in that the sequence is modified by NH2-terminal acylation, e.g., acetylation or amidation with thioglycolic acid, by carboxyl-terminal amidation, e.g., with ammonia, methylamine and the like. 1. Polypeptide Synthesis

Um polipéptido do presente invento pode ser sintetizado por qualquer das técnicas que são conhecidas dos peritos na arte dos polipéptidos, incluindo técnicas de ADN recombinantes. Preferem--se as técnicas de química sintética tais como síntese de fase sólida de tipo Merrifield, por razões de pureza, especificidade antigénica, isenção de produtos laterais indesejados, facilidade de produção e outras. Um excelente sumário das muitas técnicas disponíveis pode ser encontrado em J.M. Steward e J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; M. Bodanszky, et al., "Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, segunda edição, 1976 e J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", Vol. 2, p. 46, Academic Press (New York), 1983 para a síntese de péptidos em fase sólida e Έ. Schroder e K. Kubke, "The Peptides", Vol. 1, Academic Press (New York), 1965 para a síntese clássica em solução, cada uma das quais é aqui incorporada como referência. Grupos protectores apropriados, utilizáveis nestas sínteses, são descritos nos textos anteriores e em J.F.W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973, que é aqui incorporada como referência.A polypeptide of the present invention may be synthesized by any of the techniques that are known to those skilled in the art of the polypeptides, including recombinant DNA techniques. Synthetic chemistry techniques such as Merrifield type solid phase synthesis are preferred for reasons of purity, antigenic specificity, exemption of unwanted side products, ease of production and the like. An excellent summary of the many techniques available can be found in J.M. Steward and J.D. Young, " Solid Phase Peptide Synthesis ", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; M. Bodanszky, et al., &Quot; Peptide Synthesis ", John Wiley & Sons, Second Edition, 1976 and J. Meienhofer, " Hormonal Proteins and Peptides ", Vol. 2, p. 46, Academic Press (New York), 1983 for the synthesis of solid phase peptides and Έ. Schroder and K. Kubke, " The Peptides ", Vol. 1, Academic Press (New York), 1965 for classical solution synthesis, each of which is incorporated herein by reference. Suitable protecting groups, usable in these syntheses, are described in the foregoing and J.F.W. McOmie, " Protective Groups in Organic Chemistry ", Plenum Press, New York, 1973, which is hereby incorporated by reference.

De um modo geral, estes processos compreendem a adição sequencial de um ou mais resíduos de aminoácido ou resíduos de aminoácido adequadamente protegidos a uma cadeia de péptido crescente. Normalmente, quer o grupo amino, quer o grupo carboxilo do primeiro resíduo de aminoácido estão protegidos por um grupo protector adequado, removível selectivamente. Um grupoIn general, these methods comprise the sequential addition of one or more amino acid residues or amino acid residues suitably protected to a growing peptide chain. Typically, either the amino group or the carboxyl group of the first amino acid residue is protected by a suitable selectively removable protecting group. A group

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SCRF Case 217.1POR protector diferente, removível selectivamente, é utilizado para aminoácidos contendo um grupo lateral reactivo tal como a lisina.SCRF Case 217.1 A separate, selectively removable protector is used for amino acids containing a reactive side group such as lysine.

Usando uma síntese em fase sólida como exemplo, o aminoácido protegido ou derivado é ligado a um suporte sólido inerte através do seu grupo carboxilo ou amino não protegido. 0 grupo protector do grupo amino ou carboxilo é depois removido selectivamente e o aminoácido seguinte na sequência, possuindo o grupo complementar (amino ou carboxilo) adequadamente protegido é misturado e feito reagir sob condições adequadas para formação da ligação amida com o resíduo já ligado ao suporte sólido. 0 grupo protector do grupo amino ou carboxilo é depois removido deste resíduo de aminoácido acabado de adicionar e o aminoácido seguinte (adequadamente protegido) é depois adicionado e assim sucessivamente. Após todos os aminoácidos desejados terem sido ligados na sequência adequada, quaisquer grupos protectores terminais ou grupos laterais restantes (e o suporte sólido) são removidos, sequencialmente ou concurrentemente, para se obter o polipéptido final. 2. Ensaios de ActividadeUsing solid phase synthesis as an example, the protected amino acid or derivative is attached to an inert solid support through its carboxyl or unprotected amino group. The amino or carboxyl protecting group is then selectively removed and the next amino acid in the sequence having the appropriately protected complementary (amino or carboxyl) group is mixed and reacted under conditions suitable for forming the amide bond with the residue already attached to the support solid. The amino or carboxyl protecting group is then removed from this newly added amino acid residue and the next (suitably protected) amino acid is then added and so on. After all of the desired amino acids have been linked in the appropriate sequence, any remaining terminal protecting groups or side groups (and the solid support) are removed, sequentially or concurrently, to obtain the final polypeptide. 2. Activity Assays

Os análogos de polipéptido sintetizados quimicamente tem de possuir o carácter activo da região de interacção de receptor da IL-8. Para assegurar que essa actividade está presente realizam--se os testes seguintes. 1) Mobilização de Ca2+ em neutrófilos marcados com indo-1- -AM, 2) Libertação de elastase em neutrófilos usando um método fluorescente anteriormente descrito rj. Biol. Chem.. 260:11461 (1985)], 3) Medição da modificação da forma de neutrófilos pela diminuição do desvio do ângulo direito da luz (realizado em paralelo com a determinação de Ca2+), 4) Capacidade quimiotática medida por injecção na pele de coelho e microscopia óptica de uma biópsia 4 horas mais tarde. 3. PolipéptidosThe chemically synthesized polypeptide analogs must have the active character of the IL-8 receptor interaction region. To ensure that this activity is present the following tests are performed. 1) Mobilization of Ca2 + on indo-1-AM-labeled neutrophils, 2) Elastase release on neutrophils using a fluorescence method previously described rj. Biol. Chem. 260: 11461 (1985)], 3) Measurement of neutrophil shape modification by reduction of right angle deviation of light (performed in parallel with Ca2 + determination), 4) Chemotactic capacity measured by injection into the skin of rabbit and light microscopy of a biopsy 4 hours later. 3. Polypeptides

Também contemplado pelo presente invento é um polipéptidoAlso contemplated by the present invention is a polypeptide

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SCRF case 217.1POR -12- possuindo urna sequência de resíduos de aminoácido correspondente à fórmula: (3-20), designado por p 3-20. 0 polipétido p 3-20 é útil para induzir anticorpos do presente invento que imuno-reagem com IL-8, tal como aqui depois se descreve. C. Anticorpos 0 termo "anticorpo" refere-se a uma molécula de receptor, produzido por células B, que imuno-reage com, e se liga a um ligando de antigénio para formar um imuno-reagente. É um membro de uma família de proteínas glicosiladas, designadas por imunoglobu-linas, que se podem combinar especificamente com um antigénio. O termo "anticorpo", nas suas várias formas gramaticais, é também aqui usado para designar porções imunologicamente activas de moléculas de imunoglobulina, i.e., moléculas que contêm um local de combinação de anticorpo ou paratopo.SCRF case having an amino acid residue sequence corresponding to the formula: (3-20), designated p3-20. The β 3-20 polypeptide is useful for inducing antibodies of the present invention that immunoreact with IL-8, as described below. C. Antibodies The term " antibody " refers to a receptor molecule, produced by B cells, which immunoreacts with, and binds to, an antigen ligand to form an immunoreactant. It is a member of a family of glycosylated proteins, called immunoglobulins, that can specifically combine with an antigen. The term " antibody " in its various grammatical forms is also used herein to denote immunologically active portions of immunoglobulin molecules, i.e., molecules that contain an antibody or paratopoplast combining site.

Exemplos de moléculas de anticorpo incluem moléculas de imunoglobulina intactas, moléculas de imunoglobulina substancialmente intactas e aquelas porções de uma molécula de imunoglobulina que contêm o paratopo, incluindo as porções conhecidas na arte como Fab, Fab7, F(ab7)2 e F(v).Examples of antibody molecules include intact immunoglobulin molecules, substantially intact immunoglobulin molecules, and those portions of an immunoglobulin molecule containing the paratopo, including the portions known in the art as Fab, Fab7, F (ab7) 2 and F (v) .

As porções Fab e F(ab7)2 de anticorpos são preparadas pela reacção proteolítica de papaína e de pepsina, respectivamente, com anticorpos substancialmente intactas, por processos que são bem conhecidos. Ver, por exemplo, Patente dos E.U.A. ns 4342566 de Theofilopolous e Dixon. As porções de anticorpo Fab7 são também bem conhecidas e são produzidas a partir das porções F(ab7)2 seguindo-se a redução das ligações dissulfureto que ligam as duas porções de cadeia pesada, tal como um mercaptoetanol e seguindo--se a alquilação do mercaptano de proteína resultante com um reagente tal como iodoacetamida. Prefere-se um anticorpo contendo moléculas de anticorpo intactas e são utilizadas como aqui se ilustra. 73 116The Fab and F (ab7) 2 portions of antibodies are prepared by the proteolytic reaction of papain and pepsin, respectively, with substantially intact antibodies, by methods which are well known. See, for example, U.S. Patent 4,344,256 to Theofilopolous and Dixon. Fab7 antibody moieties are also well known and are produced from the F (ab7) 2 moieties followed by reduction of the disulfide bonds that bind the two heavy chain moieties, such as a mercaptoethanol and followed by alkylation of the mercaptan of the resulting protein with a reagent such as iodoacetamide. An antibody containing intact antibody molecules is preferred and is used as illustrated here. 73 116

SCRF Case 217.1POR 13-SCRF Case 217.1ENG 13-

A frase "anticorpo monoclonal" (MoAb) designa um anticorpo produzido por clones de uma única célula, designada por hibrido-ma, que segrega apenas um tipo de molécula de anticorpo. A célula de hibridoma é formada por fusão de uma célula produtora de anticorpos e de uma linha de células de mieloma ou outra linha de células auto-perpetuante. Estes anticorpos foram descritos em primeiro lugar por Kohler e Milstein, Nature. 256:495-497 (1975), cuja descrição é incorporada como referência.The phrase " monoclonal antibody " (MoAb) designates an antibody produced by single cell clones, termed "ma hybrid", which secretes only one type of antibody molecule. The hybridoma cell is formed by fusion of an antibody-producing cell and a myeloma cell line or other self-perpetuating cell line. These antibodies were first described by Kohler and Milstein, Nature. 256: 495-497 (1975), the disclosure of which is incorporated by reference.

Anticorpos "policlonais" (Pab) são anticorpos produzidos por clones obtidos a partir de células diferentes que segregam anticorpos diferentes que se ligam a uma pluralidade de epítopos da molécula imunogénica. ) 1. Imunoqénio de Polipéptido 0 termo "imunogénio", tal como é aqui usado, descreve uma entidade que induz a produção de anticorpos no animal hospedeiro. Em alguns casos, o antigénio e o imunogénio são a mesma entidade, enquanto que, noutros casos, as duas entidades são diferentes. A palavra "inoculo", nas suas várias formas gramaticais, é aqui usada para descrever uma composição contendo um polipéptido do presente invento, preferivelmente, Pep-1 ou Pep-3, como se mostram na Tabela l, como ingrediente activo usado para a preparação de anticorpos contra IL-8. Quando se usa um polipéptido para induzir anticorpos, está pressuposto que o polipéptido pode ser usado sozinho, ligado a um transportador ou na forma de um multímero, mas para facilidade de expressão, estas alternativas não serão aqui sempre referidas expressamente.Polyclonal antibodies " (Pab) are antibodies produced by clones obtained from different cells which secrete different antibodies that bind to a plurality of epitopes of the immunogenic molecule. ) 1. Polypeptide Immunogen The term " immunogen " as used herein describes an entity which induces the production of antibodies in the host animal. In some cases, the antigen and the immunogen are the same entity, while in other cases the two entities are different. The word " inoculum ", in its various grammatical forms, is used herein to describe a composition containing a polypeptide of the present invention, preferably Pep-1 or Pep-3, as shown in Table 1, as the active ingredient used for preparation of antibodies against IL-8. When a polypeptide is used to induce antibodies, it is assumed that the polypeptide may be used alone, attached to a carrier or in the form of a multimer, but for ease of expression, these alternatives will not be expressly referred to herein.

Para um polipéptido que contém menos do que cerca de 35 resíduos de aminoácido, é preferível usar o péptido ligado a um transportador com o propósito de induzir a produção de anticorpos.For a polypeptide containing less than about 35 amino acid residues, it is preferable to use the peptide attached to a carrier for the purpose of inducing the production of antibodies.

Quando acoplado a um transportador para formar o que é conhecido na arte como um conjugado transportador-hapteno, um polipéptido do presente invento é capaz de induzir anticorpos queWhen coupled to a carrier to form what is known in the art as a carrier-hapten conjugate, a polypeptide of the present invention is capable of inducing antibodies that

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SCRF Case 217.1POR -14-imuno-reagem com e neutralizam a IL-8. São bem conhecidos na arte transportadores úteis e são, geralmente, as próprias proteínas. Exemplos destes transportadores incluem a hemocianina de lapa Fissurela (KLH), a edestina, a tiroglobulina, albuminas tais como a albumina de soro de bovino (BSA) ou a albumina de soro de humano (HSA), glóbulos vermelhos tais como os eritrocitos de carneiro (SRBC), a toxóide do tétano, a toxóide da cólera, bem como poliaminoácidos, tais como o poli(D-lisina:ácido D-glutâmico), e similares.Immunoreactivity with and neutralize IL-8. Useful carriers are well known in the art and are generally the proteins themselves. Examples of such carriers include keyhole limpet hemocyanin (KLH), edestin, thyroglobulin, albumins such as bovine serum albumin (BSA) or human serum albumin (HSA), red blood cells such as sheep erythrocytes (SRBC), tetanus toxoid, cholera toxoid as well as polyamino acids, such as poly (D-lysine: D-glutamic acid), and the like.

Como é também bem conhecido na arte é muitas vezes benéfico ligar um polipéptido sintético ao seu transportador usando um grupo intermediário de ligação. Tal como anteriormente se referia, o glutaraldeído é um destes grupos de ligação. Contudo, quando se usa cisteína, o grupo intermediário de ligação é, preferivelmente, uma m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida (MBS).As is also well known in the art it is often beneficial to attach a synthetic polypeptide to its carrier using a linker intermediate group. As was previously mentioned, glutaraldehyde is one of these linking groups. However, when cysteine is used, the intermediate linking group is preferably m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide (MBS).

Adicionalmente, pode-se adicionar a MBS, em primeiro lugar, a um transportador por uma reacção de permuta éster-amida, como descrito por Liu et al., supra. Depois, a adição pode ser seguida pela adição de um grupo mercapto bloqueado, tal como o ácido tiolacético (CH3COSH), à ligação dupla maleimido. Após a clivagem do grupo acilo bloqueante, forma-se uma ligação dissulfureto entre o grupo mercaptano de ligação, não bloqueado, e o mercaptano do resíduo cisteína adicionado, do polipéptido sintético.In addition, MBS may first be added to a carrier by an ester-amide exchange reaction, as described by Liu et al., Supra. The addition can then be followed by the addition of a blocked mercapto group, such as thiolacetic acid (CH3COSH), to the maleimido double bond. After cleavage of the blocking acyl group, a disulfide bond is formed between the unblocked linking mercaptan group and the mercaptan of the added cysteine residue of the synthetic polypeptide.

Outros meios de imuno-potenciação incluem o uso de liposso-mas e de partículas de complexo imuno-estimulante (ISCOM). A versatilidade única dos lipossomas reside no facto de se poder ajustar a sua dimensão, nas suas características de superfície, na composição de lípido e nas várias formas como podem acomodar an-tigénios. Nas partículas de ISCOM a matriz do tipo gaiola é composta por Quil A, extraído da casca de uma árvore da América do Sul. Uma forte resposta imunitária é evocada por proteínas ou pép-tidos antigénicos ligados, por uma interacção hidrofóbica, à superfície da matriz.Other means of immuno-potentiation include the use of liposomes and immunostimulating complex particles (ISCOM). The unique versatility of the liposomes lies in the fact that their size can be adjusted, in their surface characteristics, in the lipid composition and in the various ways in which they can accommodate anions. In ISCOM particles the cage-like matrix is composed of Quil A, extracted from the bark of a South American tree. A strong immune response is evoked by antigenic proteins or peptides bound by a hydrophobic interaction to the surface of the matrix .

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SCRF Case 217.1P0R -15- A escolha do transportador está mais dependente do uso final do imunogénio do que da porção determinante do imunogénio, e é baseada em critérios não particularmente envolvidos no presente invento. Por exemplo, se um inoculo é para ser usado em animais, deverá ser seleccionado um transportador que não gere uma reacção adversa no animalicular.The choice of carrier is more dependent on the end use of the immunogen than on the immunogen's determining portion, and is based on criteria not particularly involved in the present invention. For example, if an inoculum is to be used in animals, a carrier which does not generate an adverse reaction in the animal should be selected.

Numa concretização preferida do presente invento, o inoculo compreende o polipéptido anteriormente descrito acoplado a KLH via MBS. 2. Anticorpos PoliclonaisIn a preferred embodiment of the present invention, the inoculum comprises the above-described polypeptide coupled to KLH via MBS. 2. Polyclonal Antibodies

Para induzir anticorpos neutralizadores de IL-8, administra--se uma quantidade imunogénica de um inoculo do presente invento, contendo, preferivelmente, o péptido Pep-1 ou Pep-3 como imunogénio activo, tipicamente, por injecção subcutânea ou intramuscular, a um mamífero tal como um ratinho, coelho, cabra, cavalo, humano e outros. Numa concretização preferida do presente invento, a administração foi realizada por injecções subcutâneas, em locais múltiplos, em coelhos nos dias 1, 14 e 21. 0 mamífero administrado (inoculado) é depois mantido durante um período de tempo suficiente para que o polipéptido, presente como ingrediente activo no inóculo, induza a formação de anticorpos neutralizadores, anti-IL-8. Se desejado, os anticorpos formados podem depois ser colhidos, usando técnicas bem conhecidas, e usadas em preparações para a imunização passiva (administração terapêutica de anticorpos neutralizantes) contra o local activo da IL-8, ou em ensaios ou em sistemas de diagnóstico para detectar IL-8 em amostras corporais. O anticorpo anti-péptido assim produzido é oligoclonal em relação à 11-8 e, deste modo, possui uma especificidade de epí-topo restrita em relação a antissoros policlonais anti-IL-8.To induce IL-8 neutralizing antibodies, an immunogenic amount of an inoculum of the present invention, preferably containing Pep-1 or Pep-3 peptide, is administered as the active immunogen, typically by subcutaneous or intramuscular injection, to an mammal such as a mouse, rabbit, goat, horse, human and others. In a preferred embodiment of the present invention, administration was performed by subcutaneous injections, at multiple sites, into rabbits on days 1, 14 and 21. The administered (inoculated) mammal is then maintained for a period of time sufficient for the polypeptide, present as the active ingredient in the inoculum, induces the formation of neutralizing antibodies, anti-IL-8. If desired, antibodies formed may then be harvested using well-known techniques and used in preparations for passive immunization (therapeutic administration of neutralizing antibodies) against the active site of IL-8, or in assays or in diagnostic systems to detect IL-8 in body samples. The anti-peptide antibody thus produced is oligoclonal with respect to 11-8 and thus has a restricted epimer-specificity over anti-IL-8 polyclonal antisera.

Preferivelmente, um anticorpo policlonal do presente invento está numa forma imuno-purificada. As composições de anticorpos policlonais imuno-purifiçados são produzidas por imuno-reacçãoPreferably, a polyclonal antibody of the present invention is in an immuno-purified form. Immunofluorescent polyclonal antibody compositions are produced by immunoreactivity

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SCRF Case 217.1POR -16-(adsorção) de um antissoro policlonal sobre una fase sólida contendo o imunogénio de polipéptido usado para induzir os antissoros policlonais, removendo, por lavagem da fase sólida, os anticorpos não imuno-reactivos ou fracamente imuno-reactivos, e eluindo, subsequentemente, e recolhendo os anticorpos imuno-re-agidos especificamente para formar o anticorpo imuno-purifiçado. A imuno-purificação é um processo, de um modo geral, bem conhecido na arte e pode ser realizado sob várias condições concebidas para produzir uma composição de anticorpos policlonais possuindo uma afinidade líquida mais elevada pelo imunogénio da fase sólida imuno-purificante, do que a afinidade dos antissoros policlonais de partida. No Exemplo 3D descreve-se um exemplo de imuno-puri-ficação. 3. Anticorpos Monoclonais(Adsorption) of a polyclonal antiserum on a solid phase containing the polypeptide immunogen used to induce the polyclonal antisera, removing by washing the solid phase the non-immunoreactive or weakly immunoreactive antibodies, and subsequently eluting and collecting the immunoreacted antibodies specifically to form the immunopurified antibody. Immuno-purification is a process generally well known in the art and may be performed under various conditions designed to produce a composition of polyclonal antibodies having a higher net affinity for the immuno-purifying solid phase immunogen, than affinity of the starting polyclonal antisera. Example 3 describes an example of immuno-purification. 3. Monoclonal Antibodies

Os anticorpos adequados na forma monoclonal tipicamente anticorpos inteiros, podem ser preparados usando a tecnologia de hibridoma descrita por Nimam et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 80:4949-4953 (1983), cuja descrição é aqui incorporada como referência. Resumidamente, para fornar o hibridoma a partir do qual a composição de anticorpos monoclonais é produzida, funde-se uma linha de células de mieloma ou outra linha de células auto-per-petuante, com linfocitos obtidos a partir do baço de um mamífero hiper-imunizado com um polipéptido do presente invento.Suitable antibodies in the monoclonal form typically whole antibodies may be prepared using the hybridoma technology described by Nimam et al., Proc. Natl. Acad. Know. USA. 80: 4949-4953 (1983), the disclosure of which is hereby incorporated by reference. Briefly, to form the hybridoma from which the monoclonal antibody composition is produced, a myeloma cell line or other self-pertaining cell line is fused to lymphocytes obtained from the spleen of a hyper- immunized with a polypeptide of the present invention.

Prefere-se que a linha de células de mieloma seja da mesma espécie que os linfocitos. Tipicamente, um ratinho da estirpe 129 G1X+ é o mamífero preferido. Mielomas de ratinho adequados para uso no presente invento incluem as linhas de células, sensíveis à hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), P3X63-Ag8.653 e Sp2/0-Agl4 que estão disponíveis na American Type Culture Collec-tion, Rockville, MD, com as designações CRL 1580 e CRL 1581, res-pectivamente.It is preferred that the myeloma cell line be of the same species as the lymphocytes. Typically, a 129 G1X + strain is the preferred mammal. Mouse myelomas suitable for use in the present invention include the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT), P3X63-Ag8.653 and Sp2 / 0-Agl4-sensitive cell lines which are available from the American Type Culture Collection, Rockville, MD, under the designations CRL 1580 and CRL 1581, respectively.

Tipicamente, os esplenócitos são fundidos com células de mieloma usando polietilenoglicol (PEG) 1500. Os híbridos fundidos são seleccionados pela sua sensibilidade a HAT. Os hibridomas segregando as moléculas de anticorpo do presente invento são iden-Typically, splenocytes are fused to myeloma cells using polyethylene glycol (PEG) 1500. The fused hybrids are selected for their sensitivity to HAT. The hybridomas secreting the antibody molecules of the present invention are identified

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SCRF Case 217.1POR -17-tificados usando um doseamento radio-imunológico de fase sólida (RIA) descrito no Exemplo 4.(RIA) assay described in Example 4.

Uma composição de anticorpos monoclonais do presente invento pode ser produzida iniciando uma cultura de hibridoma monoclonal compreendendo um meio nutriente contendo um hibridoma que segrega moléculas de anticorpo com a especificidade de polipéptido apropriada. A cultura é mantida sob condições e durante um período de tempo suficientes para que o hibridoma segregue as moléculas de anticorpo para o meio. 0 meio contendo anticorpo é depois recolhido. As moléculas de anticorpo podem depois ser isoladas por técnicas bem conhecidas.A monoclonal antibody composition of the present invention can be produced by initiating a monoclonal hybridoma culture comprising a nutrient medium containing a hybridoma that secretes antibody molecules with the appropriate polypeptide specificity. The culture is maintained under conditions and for a period of time sufficient for the hybridoma to secrete the antibody molecules into the medium. The antibody-containing medium is then collected. The antibody molecules can then be isolated by well-known techniques.

Os meios úteis para a preparação destas composições são ambos bem conhecidos na arte e estão disponíveis comercialmente, e incluem meios de cultura sintéticos, ratinhos consanguíneos e outros. Um exemplo de um meio sintético é o meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8:396 (1959)) suplementado com 4,5 g/1 de glucose, 20 mg/1 de glutamina e 20% de soro de vitela fetal. Um exemplo de uma estirpe de ratinho consanguíneo é a Balb/c.Useful media for the preparation of such compositions are both well known in the art and are commercially available, and include synthetic culture media, inbred mice and the like. An example of a synthetic medium is Dulbecco's minimal essential medium (DMEM; Dulbecco et al., Virol 8: 396 (1959)) supplemented with 4.5 g / l glucose, 20 mg / l glutamine and 20% of fetal calf serum. An example of an inbred mouse strain is Balb / c.

As composições de anticorpos monoclonais produzidas pelo processo anterior podem ser usadas, por exemplo, em modalidades de diagnóstico e terapêuticas nas quais a formação de um produto de imuno-reacção contendo IL-8 é desejada. D. Processos de Diagnóstico 0 presente invento contempla qualquer processo que resulte na detecção, num fluido corporal tal como o plasma sanguíneo ou o soro, de um local de interacção de receptor de IL-8 e, deste modo, da IL-8, ou da IL-8, usando uma composição de anticorpos do presente invento. 0 processo para a detecção de IL-8 por estes meios compreende a formação de um produto de imuno-reacção entre um segmento do terminal carboxilo da IL-8 no fluido vascular colhido e uma molécula de anticorpo anti-local activo da IL-8, tal comoThe monoclonal antibody compositions produced by the foregoing process may be used, for example, in diagnostic and therapeutic modalities in which the formation of an IL-8 containing immune reaction product is desired. D. Diagnostic Processes The present invention contemplates any method that results in the detection, in a body fluid such as blood plasma or serum, of an IL-8 receptor and thus IL-8 receptor interaction site, or of IL-8, using an antibody composition of the present invention. The method for detecting IL-8 by these means comprises forming an immunoreactant product between a carboxyl-terminal segment of IL-8 in the harvested vascular fluid and an active anti-IL-8 antibody site molecule, such as

subsequente do produto de 73 116of the product of 73 116

SCRF Case 217.1P0R -18- aqui se descreveu, e a detecção imuno-reacção assim formado.Described herein, and the immuno-reaction detection thus formed.

Alternativamente, o processo para a detecção de IL-8 compreende a formação de um produto de imuno-reacção entre um segmento do terminal amino da IL-8, nomeadamente, a região definida p 3-20, no fluido vascular colhido e uma molécula de anticorpo anti-IL-8, tal como aqui se descreveu, e a detecção subsequente do produto de imuno-reacção assim formado.Alternatively, the method for detecting IL-8 comprises forming an immunoreactant product between an amino-terminal segment of IL-8, namely, the region defined p 3-20 in the harvested vascular fluid and a molecule of anti-IL-8 antibody as described herein, and subsequent detection of the thus formed immuno-reaction product.

Os peritos na arte compreenderão que existem numerosos procedimentos de química de diagnóstico clínico bem conhecidos, que podem ser utilizados para formar imuno-complexos detectáveis. Deste modo, embora se descrevam aqui exemplos de processos de ensaio, o presente invento não está a eles limitado.Those of skill in the art will appreciate that there are numerous well known clinical diagnostic chemistry procedures which can be used to form detectable immuno-complexes. Thus, although examples of test procedures are described herein, the present invention is not limited thereto.

Um processo contemplado para detectar a presença de IL-8 num fluido corporal, compreende os passos de: a) mistura de uma alíquota de fluido corporal com uma composição de anticorpos que imuno-reage com um segmento do terminal carboxilo da IL-8 possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondente à fórmula:A method contemplated for detecting the presence of IL-8 in a body fluid comprises the steps of: a) mixing an aliquot of body fluid with an antibody composition that immunoreacts with a carboxy terminus segment of IL-8 having a amino acid residue sequence corresponding to the formula:

Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val-Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val-

Gln-Arg-Val-Val-Glu-Lys-Phe-Leu-Lys. b) a manutenção da mistura de imuno-reacção sob condições biológicas de ensaio durante um período de tempo suficiente para se formar um produto de imuno-reacção; e c) a detecção da presença do referido produto de imuno-reacção e, deste modo, a presença da IL-8.Gln-Arg-Val-Val-Glu-Lys-Phe-Leu-Lys. b) maintaining the immune reaction mixture under biological test conditions for a period of time sufficient to form an immunoreactant; and c) detecting the presence of said immuno-reaction product and, thus, the presence of IL-8.

Num processo de detecção de IL-8 relacionado, realizam-se os passos anteriores com a excepção de a composição de anticorpos, misturada no passo (a), conter moléculas de anticorpo que imuno-reagem com um segmento do terminal amino da IL-8 possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondente à fórmula: (3-20).In a related IL-8 detection process, the foregoing steps are performed except that the antibody composition, admixed in step (a), contains antibody molecules that immunoreact with an amino-terminal segment of IL-8 having an amino acid residue sequence corresponding to the formula: (3-20).

Para realizar os ensaios de diagnóstico, como anteriormenteTo carry out the diagnostic tests as previously

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SCRF Case 217.1POR -19- se descreveu, são contemplados sistemas de diagnóstico na forma de um conjunto de diagnóstico. E. Sistemas de Diagnóstico É contemplado um sistema de diagnóstico do presente invento para a detecção in vitro da presença de IL-8 in vivo, o sistema compreende uma composição contendo moléculas de anticorpo que imuno-reagem com um local activo de interacção de receptor da IL--8. As moléculas de anticorpo estão ligadas a meios indicadores in vitro. tais como meios indicadores de enzima. 0 sistema de diagnóstico compreende uma embalagem contendo moléculas de anticorpo que imuno-reagem com um epítopo presente num segmento do terminal carboxilo da IL-8. os anticorpos mais preferidos são anticorpos capazes de imuno-reagir com um epítopo presente numa sequência de não mais do que 18 aminoácidos de comprimento e incluindo a sequência de resíduos de aminoácido da molé-cula de IL-8 nativa, desde o resíduo 50 ao resíduo 67.As described, diagnostic systems are contemplated in the form of a diagnostic set. E. Diagnostic Systems A diagnostic system of the present invention is contemplated for the in vitro detection of the presence of IL-8 in vivo, the system comprises a composition containing antibody molecules that immunoreact with an active site of receptor interaction IL-8. The antibody molecules are linked to in vitro indicator media. such as enzyme indicator means. The diagnostic system comprises a package containing antibody molecules that immunoreact with an epitope present on a segment of the carboxyl terminus of IL-8. the most preferred antibodies are antibodies capable of immunoreacting with an epitope present in a sequence of not more than 18 amino acids in length and including the amino acid residue sequence of the native IL-8 molecule, from residue 50 to residue 67.

Um sistema de diagnóstico do presente invento, na forma de um conjunto, inclui, numa quantidade suficiente para realizar pelo menos um ensaio, uma composição contendo moléculas de anticorpo do local de interacção de receptor, activas, anti-IL-8, policlonal ou monoclonal, ou seus fragmentos, na forma de um reagente embalado em separado, conjuntamente com um marcador que indica a presença de um produto de imuno-reacção. Tipicamente, incluem-se também as instruções para uso do reagente embalado.A diagnostic system of the present invention, in the form of an assembly, includes, in an amount sufficient to carry out at least one assay, a composition containing active, anti-IL-8, polyclonal or monoclonal receptor interaction site molecules , or fragments thereof, in the form of a separately packaged reagent, together with a label indicating the presence of an immunoreactant. Typically, instructions for using the packaged reagent are also included.

Um sistema de diagnóstico relacionado, útil para a detecção in vitro da presença de IL-8, compreende uma composição contendo moléculas de anticorpo que imuno-reagem com um epítopo presente no segmento do terminal amino da IL-8, definido pelo polipéptido p 3-20.A related diagnostic system useful for in vitro detection of the presence of IL-8 comprises a composition containing antibody molecules that immunoreact with an epitope present on the amino-terminal segment of IL-8 defined by the β- 20.

Este sistema de diagnóstico relacionado na forma de um conjunto, inclui, numa quantidade suficiente para realizar pelo menos um ensaio, uma composição contendo moléculas de anticorpo, policlonal ou monoclonal, anti-IL-8, ou seus fragmentos, 73 116This related diagnostic system in the form of an assembly, includes, in an amount sufficient to carry out at least one assay, a composition containing polyclonal or monoclonal, anti-IL-8 antibody molecules, or fragments thereof, 73 116

SCRF Case 217.1POR -20-SCRF Case 217.1ENG -20-

imuno-específicos para o polipéptido p 3-20, conjuntamente com um marcador que indica a presença de um produto de imuno-reacção. Tipicamente, incluem-se também as instruções para uso do reagente embalado desta concretização. "Instruções para uso", incluem, tipicamente, uma expressão tangível descrevendo a concentração de reagente ou pelo menos um parâmetro do processo de ensaio, tal como as quantidades relativas de reagente e de amostra a serem misturadas, os períodos de tempo de manutenção para misturas de reagente/amostra, a temperatura, as condições tampão e outros. Incluem-se também, numa forma ou noutra, cartas, gráficos e similares de níveis de concentração predeterminados correlacionando condições fisiológicas específicas com níveis de IL-8immuno-specific for the β 3-20 polypeptide, together with a marker indicating the presence of an immunoreactant. Typically, instructions for use of the packaged reagent of this embodiment are also included. " Instructions for use " typically include a tangible expression describing the reagent concentration or at least one parameter of the assay process, such as the relative amounts of reagent and sample to be mixed, the maintenance time periods for reagent / sample mixtures, temperature, buffer conditions and the like. Also included in one form or another are charts, graphs and the like of predetermined concentration levels correlating specific physiological conditions with IL-8 levels

Um sistema de diagnóstico do presente invento inclui também um marcador ou meios indicadores capazes de assinalar a formação de um complexo, ligado especificamente, contendo uma molécula de anticorpo do presente invento.A diagnostic system of the present invention also includes a label or indicator means capable of signaling the formation of a specifically bound complex containing an antibody molecule of the present invention.

Adicionalmente, preferem-se os conjuntos nos quais as moléculas de anticorpo estão ligadas a meios indicadores de enzima, tais como a peroxidase de rábano silvestre (HRPO).In addition, those in which the antibody molecules are attached to enzyme indicator media, such as horseradish peroxidase (HRPO), are preferred.

Tal como são aqui usados, os termos "marcador" e "meios indicadores", nas suas várias formas gramaticais, referem-se a átomos simples e a moléculas que estão envolvidas, quer directamente quer indirectamente, na produção de um sinal detectável para indicar a presença de um complexo. Quaisquer marcador ou meios indicadores podem ser ligados ou incorporados numa molécula de anticorpo que é parte de um anticorpo ou de uma composição de anticorpos monoclonais do presente invento, ou podem ser usados em separado, e esses átomos ou moléculas podem ser usados sozinhos ou em conjunto com reagentes adicionais. Estes marcadores são eles próprios bem conhecidos da química de diagnóstico clínico e constituem parte do presente invento apenas na medida em que são utilizados com novos processos e/ou sistemas.As used herein, the terms " marker " and " indicator means " in their various grammatical forms refer to simple atoms and molecules which are involved either directly or indirectly in the production of a detectable signal to indicate the presence of a complex. Any marker or reporter means may be attached or incorporated into an antibody molecule that is part of an antibody or a monoclonal antibody composition of the present invention, or may be used separately, and such atoms or molecules may be used alone or together with additional reagents. These labels are themselves well known in clinical diagnostic chemistry and are part of the present invention only in that they are used with novel processes and / or systems.

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SCRF Case 217.1POR A ligação de marcadores, i.e., a marcação de polipéptidos e de proteínas é bem conhecida na arte. Por exemplo, as moléculas de anticorpo produzidas por um hibridoma podem ser marcadas pela incorporação metabólica de aminoácidos contendo um radio-isótopo fornecidos como componente do meio de cultura. Ver, por exemplo, Galfre et al., Meth. Enzvmol.. 73:3-46 (1981). As técnicas de conjugação dê proteínas ou de acoplamento através de grupos funcionais activados, são particularmente aplicáveis. Ver, por exemplo, Avrameas, et al., Scand. J. Immunol.. Vol. 8, Suppl. 7:7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech.. 3:889-894 (1984), e Patente dos E.U.A. nB 4493795.The binding of labels, i.e. labeling of polypeptides and proteins is well known in the art. For example, antibody molecules produced by a hybridoma can be labeled by the metabolic incorporation of radioisotope-containing amino acids provided as a component of the culture medium. See, for example, Galfre et al., Meth. Enzol., 73: 3-46 (1981). Protein conjugation or coupling techniques by activated functional groups are particularly applicable. See, for example, Avrameas, et al., Scand. J. Immunol. Vol. 8, Suppl. 7: 7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech., 3: 889-894 (1984), and U.S. Patent No. 4493795.

Os sistemas de diagnóstico podem incluir também, preferivelmente, na forma de uma embalagem separada, um agente de ligação específico. Um "agente de ligação específico" é uma entidade molecular capaz de se ligar selectivamente a uma espécie reagente do presente invento, mas que não é, ele próprio, uma molécula de anticorpo do presente invento. Exemplos de agentes de ligação específicos incluem moléculas de anticorpo, proteínas de complemento ou seus fragmentos, proteína A e outros. Preferivelmente, o agente de ligação específico pode-se ligar à molécula de anticorpo do presente invento quando esta está presente como parte de um complexo.Diagnostic systems may also preferably include, in the form of a separate package, a specific binding agent. A " specific binding agent " is a molecular entity capable of selectively binding to a reactant species of the present invention, but which is not itself an antibody molecule of the present invention. Examples of specific binding agents include antibody molecules, complement proteins or fragments thereof, protein A and the like. Preferably, the specific binding agent may bind to the antibody molecule of the present invention when it is present as part of a complex.

Em concretizações preferidas, o agente de ligação específico está marcado. Contudo, quando o sistema de diagnóstico inclui um agente de ligação específico que não está marcado, o agente é usado, tipicamente, como meio ou reagente de amplificação. Nestas concretizações, o agente de ligação específico, marcado, é capaz de se ligar especificamente ao meio de amplificação quando o meio de amplificação está ligado a um complexo contendo a espécie reagente.In preferred embodiments, the specific binding agent is labeled. However, where the diagnostic system includes a specific binding agent that is not labeled, the agent is typically used as the medium or amplification reagent. In these embodiments, the labeled specific binding agent is capable of specifically binding to the amplification medium when the amplification medium is attached to a complex containing the reactant species.

Os conjuntos de diagnóstico do presente invento podem ser usados num formato "ELISA" para detectar, por exemplo, a presença ou a quantidade de IL-8, por determinação das moléculas imuno--reactivas numa amostra de fluido corporal, tal como o soro ou oThe diagnostic kits of the present invention may be used in an " ELISA " for detecting, for example, the presence or amount of IL-8, by determining the immunoreactive molecules in a sample of body fluid, such as serum or

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SCRF Case 217.1POR -22- plasma. "ELISA" refere-se a um ensaio de imunossorção de enzima ligado que utiliza um anticorpo ou um antigénio, ligado a uma fase sólida, e um conjugado enzima-antigénio ou enzima-anticorpo para detectar e quantificar a quantidade de um antigénio ou de um anticorpo, presente numa amostra. Uma descrição da técnica de ELISA pode ser encontrada no Capítulo 22 da 4 a edição de Basic and Clinicai Immunolocrv de D.P. Sites et al., publicada por Lange Medicai Publications de Los Altos, CA, E.U.A. em 1982, e nas Patentes dos E.U.A. na 3654090; na3850752; e na 4016043, que são aqui todas incorporadas como referência.SCRF Case 217.1ENG -22- plasma. " ELISA " refers to a bound enzyme immunosorbent assay using an antibody or antigen bound to a solid phase and an enzyme-antigen or enzyme-antibody conjugate to detect and quantitate the amount of an antigen or an antibody present in a sample. A description of the ELISA technique can be found in Chapter 22 of the 4th edition of Basic and Clinical Immunolocrv of DP Sites et al., Published by Lange Medical Publications of Los Altos, CA, USA, 1982, and U.S. Patents 3654090 ; No. 3850752; and 4016043, which are incorporated herein by reference.

Deste modo, em concretizações preferidas, o componente reagente de anticorpo ou de antigénio pode ser afixado a uma matriz | sólida para formar um suporte sólido que é embalado em separado nos referidos sistemas de diagnóstico. Tipicamente, o reagente é afixado à matriz sólida por adsorção a partir de um meio aquoso, ainda que se possam usar outros modos de afixação, bem conhecidos dos peritos na arte. São bem conhecidos na arte matrizes sólidas úteis. Estes materiais incluem o dextrano reticulado disponível com a marca comercial SEPHADEX da Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NY, E.U.A.); agarose; pérolas de poliestireno com um diâmetro de cerca de 1 micron a cerca de 5 milímetros, disponíveis em Abbott Laboratories of North Chicago, IL, E.U.A.; telas à base de poli(cloreto de vinilo), poliestireno, poliacrilamida reticulada, I nitrocelulose ou "nylon", tais como folhas, fitas ou almofadas; ou tubos, placas ou as cavidades de uma placa de microtitulação tais como as constituídas de poliestireno ou de poli(cloreto de vinilo). A espécie reagente, o agente de ligação específico, marcado, ou o reagente de amplificação, de qualquer sistema de diagnóstico aqui descrito, pode ser fornecido em solução na forma de uma dispersão líquida ou na forma de um pó substancialmente seco, p.e., na forma liofilizada. Quando o meio indicador é uma enzima, o substrato da enzima pode ser também fornecido numa embalagem, em separado, de um sistema. Um suporte sólido tal como a placa deThus, in preferred embodiments, the antibody or antigen reagent component may be affixed to a matrix | solid to form a solid support which is packaged separately in said diagnostic systems. Typically, the reagent is affixed to the solid matrix by adsorption from an aqueous medium, although other display modes, well known to those skilled in the art, may be used. Useful solid matrices are well known in the art. These materials include crosslinked dextran available under the trademark SEPHADEX from Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NY, U.S.A.); agarose; polystyrene beads having a diameter of about 1 micron to about 5 millimeters, available from Abbott Laboratories of North Chicago, IL, U.S.A.; polyvinyl chloride based screens, polystyrene, crosslinked polyacrylamide, nitrocellulose or "nylon", such as sheets, ribbons or cushions; or tubes, plates or the wells of a microtiter plate such as those made of polystyrene or polyvinyl chloride. The reagent species, the labeled specific binding agent, or the amplification reagent of any diagnostic system described herein may be provided in solution as a liquid dispersion or in the form of a substantially dry powder, eg, in the form lyophilized. When the reporter medium is an enzyme, the enzyme substrate may also be provided in a separate package of a system. A solid support such as the

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SCRF Case 217.1POR -23- microtitulação, anteriormente descrito e um ou mais tampões, podem ser também incluídos como elementos embalados, em separado, neste sistema de ensaio de diagnóstico.The microtitration described above and one or more buffers may also be included as separately packaged elements in this diagnostic assay system.

As embalagens aqui descritas relativamente aos sistemas de diagnóstico são as normalmente usadas em sistemas de diagnóstico. Estas embalagens incluem garrafas de vidro e de plástico (p.e., polietileno, polipropileno e policarbonato), frascos, invólucros de plástico e de folha de plástico laminado, e outros. F. Composições Terapêuticas É também contemplada no presente invento uma composição terapêutica adequada para inibir a ligação de IL-8 e, deste modo, evitar a inflamação, compreendendo um anticorpo que imuno-reage com (a) o local de interacção de receptor da IL-8 e com (b) um análogo de polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondente à fórmula:The packages described herein for diagnostic systems are those commonly used in diagnostic systems. Such packages include glass and plastic bottles (e.g., polyethylene, polypropylene and polycarbonate), vials, plastic and sheet plastic sheeting, and the like. F. Therapeutic Compositions Also contemplated in the present invention is a therapeutic composition suitable for inhibiting IL-8 binding and thereby preventing inflammation, comprising an antibody that immunoreacts with (a) the IL receptor interaction site -8 and with (b) a polypeptide analogue having an amino acid residue sequence corresponding to the formula:

Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg-Val-Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg-Val-

Val-Glu-Lys-Phe-Leu-Lys, ou seus equivalentes biológicos, num excipiente farmaceuticamente aceitável. Esta composição consegue o seu efeito terapêutico combinando-se e neutralizando o local activo da IL-8. É contemplada uma composição terapêutica relacionada que é adequada para inibir a ligação de IL-8 e, deste modo, para a pre-venção de acontecimentos mediados pela IL-8 tais como a infla-mação, compreendendo um anticorpo que imuno-reage (a) com a IL-8 e com (b) um polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondente à fórmula: (3-20), ou seus equivalentes biológicos, num excipiente farmaceuticamente aceitável. Esta composição consegue o seu efeito terapêutico pela imuno-reacção com a IL-8 e, deste modo, interferência com (neutralização) o local activo da IL-8. Uma vez que o p 3-20 se localiza no terminal amino da IL-8, em comparação com o análogo de polipéptido p 50-67 e que não foi eficaz como análogo do local activo da IL-8, crê-se que o p 3-20 não representa um análogo do local activo. Deste modo, os anticorpos antipéptido imuno-espe-Val-Glu-Lys-Phe-Leu-Lys, or their biological equivalents, in a pharmaceutically acceptable excipient. This composition achieves its therapeutic effect by combining and neutralizing the active site of IL-8. A therapeutically related composition is contemplated which is suitable for inhibiting IL-8 binding and thus for the prevention of IL-8 mediated events such as inflammation, comprising an antibody that immunoreacts ) with IL-8 and with (b) a polypeptide having an amino acid residue sequence corresponding to the formula: (3-20), or their biological equivalents, in a pharmaceutically acceptable excipient. This composition achieves its therapeutic effect by immunoreacting with IL-8 and thereby interfering with (neutralizing) the active site of IL-8. Since op 3-20 is located at the amino terminus of IL-8, compared to the p-50 polypeptide analogue 50-67 and which was not effective as an IL-8 active site analog, it is believed that 3- 20 does not represent an analog of the active site. Thus, anti-peptide immunospecific antibodies

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SCRF Case 217.1POR -24- cíficos do p 3-20 não imuno-reagem com o local activo, per se. mas ligam-se (imuno-reagem) com a IL-8 de uma forma que interfere e que, deste modo, neutraliza a actividade de ligação da IL-8.SCRF Case 217.1ENG -24- p3-20 do not immuno-react with the active site, per se. but bind (immuno-react) with IL-8 in an interfering manner and thereby neutralize IL-8 binding activity.

Deste modo, numa outra concretização, é contemplada uma composição terapêutica que é adequada como análogo da IL-8, possuindo a capacidade de funcionar como aqui se define para um análogo de polipéptido, compreendendo um análogo de polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondente à fórmula: (50-67), ou seus equivalentes biológicos num excipiente farmaceuticamente aceitável. Esta composição consegue o seu efeito terapêutico mi-metizando o local activo da IL-8 e, deste modo, exibindo a actividade biológica da IL-8, tal como aqui se definiu para um análogo de polipéptido. A preparação de composições terapêuticas que contêm moléculas de anticorpo ou polipéptidos, como ingredientes activos, é bem conhecida na arte. Tipicamente, estas composições são preparadas como injectáveis, quer como soluções líquidas, quer como suspensões. Contudo, podem-se também preparar formas sólidas adequadas para dissolução ou suspensão em líquido antes da injecção. A preparação pode ser também emulsionada. 0 ingrediente terapêutico activo é muitas vezes misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente activo. Excipientes adequados incluem, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol ou outros, e suas combinações. Adicionalmente, se desejado, a composição pode conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tamponantes de pH, que potenciam a eficácia do ingrediente activo.Thus, in another embodiment, a therapeutic composition is contemplated which is suitable as an IL-8 analogue, having the ability to function as defined herein for a polypeptide analogue, comprising a polypeptide analogue having a corresponding amino acid residue sequence to the formula: (50-67), or their biological equivalents in a pharmaceutically acceptable excipient. This composition achieves its therapeutic effect by meticulating the active site of IL-8 and thereby exhibiting the biological activity of IL-8 as defined herein for a polypeptide analogue. The preparation of therapeutic compositions containing antibody molecules or polypeptides, as active ingredients, is well known in the art. Typically, these compositions are prepared as injectables either as liquid solutions or as suspensions. However, solid forms suitable for dissolution or suspension in liquid prior to injection may also be prepared. The preparation may also be emulsified. The active therapeutic ingredient is often mixed with excipients which are pharmaceutically acceptable and compatible with the active ingredient. Suitable excipients include, for example, water, saline, dextrose, glycerol, ethanol or the like, and combinations thereof. Further, if desired, the composition may contain minor amounts of auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffering agents, which enhance the efficacy of the active ingredient.

Um anticorpo ou polipéptido pode ser formulado numa composição terapêutica como forma de sais farmaceuticamente aceitáveis, neutralizados. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres da molécula de anticorpo) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, os ácidos clorídrico ou fosfórico, ou comAn antibody or polypeptide may be formulated into a therapeutic composition as a form of neutralized pharmaceutically acceptable salts. Pharmaceutically acceptable salts include the acid addition salts (formed with the free amino groups of the antibody molecule) and which are formed with inorganic acids such as, for example, hydrochloric or phosphoric acids, or

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ácidos orgânicos tais como os ácidos acético, oxálico, tartárico, mandélico e outros. Os sais formados com os grupos carboxilo livres podem ser também obtidos a partir de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou férrico, e de bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína e outras. G. Processos para Inibir a Resposta Inflamatória É também contemplado pelo presente invento um processo para inibição da actividade da IL-8 e, deste modo, prevenção da inflamação num paciente, compreendendo a administração a um paciente de uma composição contendo um anticorpo que imuno-reage (a) com o local de interacção de receptor da IL-8 e (b) com um análogo de polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondente à fórmula:organic acids such as acetic, oxalic, tartaric, mandelic and the like. The salts formed with the free carboxyl groups may also be obtained from inorganic bases such as, for example, sodium, potassium, ammonium, calcium or ferric hydroxides and organic bases such as isopropylamine, trimethylamine, 2-ethylaminoethanol, histidine , procaine and others. G. Processes for Inhibiting the Inflammatory Response Also contemplated by the present invention is a method for inhibiting the activity of IL-8 and thus preventing inflammation in a patient comprising administering to a patient a composition containing an antibody which immuno- reacts with the IL-8 receptor site of interaction and (b) with a polypeptide analogue having an amino acid residue sequence corresponding to the formula:

Cy s -Leu-Asp-Pro-Lys -Glu-Asn-Trp-Val -Gln-Arg-Val -Val-Glu-Lys-Phe-Leu-Lys, ou seus equivalentes biológicos, num excipiente farmaceuticamente aceitável.Cy -Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val-Glu-Arg-Val-Val-Glu-Lys-Phe-Leu-Lys, or their biological equivalents, in a pharmaceutically acceptable excipient.

Numa concretização relacionada, o invento contempla um processo para inibição da actividade da IL-8 e, deste modo, prevenção da inflamação num paciente, compreendendo a administração ao paciente de uma composição contendo um anticorpo que imuno-reage (a) com a IL-8 e com (b) um polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondente à fórmula: (3-20) ou seus equivalentes biológicos, num excipiente farmaceuticamente aceitável.In a related embodiment, the invention contemplates a method for inhibiting IL-8 activity and thus preventing inflammation in a patient comprising administering to the patient a composition containing an antibody that immunoreacts with IL- 8 and with (b) a polypeptide having an amino acid residue sequence corresponding to the formula: (3-20) or its biological equivalents, in a pharmaceutically acceptable excipient.

As composições terapêuticas contendo moléculas de anticorpos são, convencionalmente, administradas intravenosamente, por exemplo, por injecção de uma dose unitária. O termo "dose unitária", quando usado relativamente a uma composição terapêutica do presente invento, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias contendo, cada unidade, uma quantidade predeterminada de material activo, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o diluenteTherapeutic compositions containing antibody molecules are conventionally administered intravenously, for example, by injection of a unit dose. The term " unit dose ", when used in connection with a therapeutic composition of the present invention, relates to physically discrete units suitable as unitary dosages each containing a predetermined amount of active material, calculated to produce the desired therapeutic effect, in combination with the diluent

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SCRF Case 217.1POR -26- requerido; i. e., transportador ou veículo.SCRF Case 217.1ENG -26- required; i. carrier or vehicle.

As composições são administradas de um modo compatível com a formulação de dosagem e numa quantidade terapeuticamente eficaz. A quantidade a ser administrada depende do sujeito a ser tratado, da capacidade do sistema do sujeito em utilizar o ingrediente activo sem efeitos laterais adversos, e do grau de inibição da interacção desejado entre a IL-8 e o tipo de células apropriado. As quantidades precisas de anticorpo activo, requeridas para administração, dependem do julgamento do médico e são particulares para cada indivíduo. Contudo, gamas de dosagem adequadas são da ordem de 0,1 a 40 miligramas, preferivelmente, de 10 a 20 miligramas e, muito preferivelmente, de cerca de 15 miligramas, de anticorpo por quilograma de peso corporal do indivíduo, e dependem da via de administração.The compositions are administered in a manner compatible with the dosage formulation and in a therapeutically effective amount. The amount to be administered depends on the subject being treated, the ability of the subject's system to utilize the active ingredient without adverse side effects, and the degree of inhibition of the desired interaction between IL-8 and the appropriate cell type. The precise amounts of active antibody required for administration depend on the judgment of the physician and are particular to each individual. However, suitable dosage ranges are in the range of 0.1 to 40 milligrams, preferably 10 to 20 milligrams, and most preferably, about 15 milligrams, of antibody per kilogram of body weight of the subject, and depend on the route of administration. administration.

Será de esperar que uma única dose de cerca de 15 mg/kg de peso corporal de um indivíduo seja eficaz. Os regimes adequados para injecções de reforço, se requerido, são também variáveis mas, tipicamente, incluem uma administração inicial seguida de doses repetidas com intervalos predeterminados, por injecção sub-quente ou por outra administração. Alternativamente, é contemplada a infusão intravenosa contínua, suficiente para manter concentrações de 15 miligramas por quilograma de peso corporal, no sangue.A single dose of about 15 mg / kg body weight of an individual will be expected to be effective. Suitable regimens for booster injections, if required, are also variable but typically include initial administration followed by repeated doses at predetermined intervals, by sub-hot injection or by other administration. Alternatively, continuous intravenous infusion sufficient to maintain concentrations of 15 milligrams per kilogram of body weight in the blood is contemplated.

Pretende-se que os exemplos seguintes sejam ilustrativos e não limitativos do presente invento.The following examples are intended to be illustrative and not limiting of the present invention.

EXEMPLOSEXAMPLES

Pretende-se que os exemplos seguintes sejam ilustrativos mas não limitativos do presente invento. 1. Síntese de PolipéntidosThe following examples are intended to be illustrative but not limiting of the present invention. 1. Synthesis of polypeptides

Os polipéptidos correspondentes à sequência de resíduos de aminoácido 3-20, 50-67 e 57-72, aqui depois designados, respecti-vamente, por Pep-3, Pep-1 e Pep-2 da IL-8, foram sintetizados pe-The polypeptides corresponding to the sequence of amino acid residues 3-20, 50-67 and 57-72, hereinafter referred to respectively as Pep-3, Pep-1 and Pep-2 of IL-8, were synthesized by

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SCRF Case 217.1P0R -27- la técnica de fase sólida clássica descrita por Merrifield, Adv. Enzymol.. 32:221-296 (1969) adaptada para uso com um sintetizador de péptidos automático Modelo 430A (Applied Biosystems, Foster City, CA, E.U.A.). As resinas-polipéptido foram clivadas usando fluoreto de hidrogénio, extractadas e analisadas, para determinar a pureza, por cromatografia líquida de alta eficiência sobre uma coluna C18 de fase inversa fabricada por Water Associates, Milford, MA, E.U.A.(1969) adapted for use with a Model 430A automatic peptide synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) USA). The polypeptide resins were cleaved using hydrogen fluoride, extracted and analyzed for purity by high performance liquid chromatography on a reverse phase C18 column manufactured by Water Associates, Milford, MA, U.S.A.

Na Tabela 1 mostram-se as sequências de resíduos de aminoácido dos polipéptidos anteriormente referidos. TABELA 1The amino acid residue sequences of the above-mentioned polypeptides are shown in Table 1. TABLE 1

Designação da Fórmula1 2Name of Formula1 2

Sequência de Sequência de re- origem da IL-8 síduos de aminoácidoSequence Sequence of origin of IL-8 amino acid

Pep-1 Pep-2 Pep-3 50-67 57-72 3-20Pep-1 Pep-2 Pep-3 50-67 57-72 3-20

CLDPKENWVQRWEKFLK WVQRWEKFLKRAENS KELRCQCIKTYSKPFHPH 1 1 Os polipéptidos Pep-1, Pep-2 e Pep-3 são também aqui desig nados por p 50-67, p 57-72 e p 3-20, respectivamente. 2. Activação de Neutrófilos por um Polioéotido Sintético Relacionado com a IL-8 A. Ensaios In Vitro 2The Pep-1, Pep-2 and Pep-3 polypeptides are also referred to herein as p50-67, p57-72 and p3-20, respectively. 2. Activation of Neutrophils by a Synthetic Polyoletide Related to IL-8 A. In Vitro Assays 2

Preparação de célulasPreparation of cells

Recolheu-se sangue, após o consentimento informado, de voluntários normais isentos de medicação e anti-coagulou-se com uma mistura de ácido cítrico 0,14 M, citrato tri-sódico 0,2 M e dextrose 0,22 Μ. O sangue anti-coagulado foi centrifugado a 800 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente e rejeitou-se o sobrenadante de plasma rico em plaquetas. Ressuspenderam-se os eritrócitos sedimentados e as células mononucleares e polinucleares, e diluíram-se com um volume igual ao volume deBlood was collected, after informed consent, from normal volunteers free from medication and anti-coagulated with a mixture of 0.14 M citric acid, 0.2 M tri-sodium citrate and 0.22 de dextrose. The anti-coagulated blood was centrifuged at 800 x g for 15 minutes at room temperature and the platelet-rich plasma supernatant was discarded. The sedimented erythrocytes and mononuclear and polynuclear cells were resuspended, and diluted with a volume equal to the volume of

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SCRF Case 217.1P0R -28-sangue de partida com PBS 0,14 M frio, pH 7,4. As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram depois removidas da suspensão de células diluída por centrifugação em Ficoll-Hypaque (Sigma Chem. Corp., St. Louis, MO, E.U.A.) de baixo teor em endotoxina, a 400 x g durante 10 minutos a 18 graus C (18eC).SCRF Case 217.1P0R-28-blood with 0.14 M cold PBS, pH 7.4. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were then removed from the cell suspension diluted by centrifugation in low endotoxin Ficoll-Hypaque (Sigma Chem. Corp., St. Louis, MO, USA) at 400 xg for 10 minutes to 18 degrees C (18Â ° C).

As células polinucleares (neutrófilos), na suspensão de células desprovida de PBMC, foram depois recuperadas por sedimentação em dextrano. Ressuspendeu-se o sedimento de células resultante, contendo neutrófilos, numa concentração de 1,5 x 107 células/mililitro (ml), em Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS) (Sigma Chem. Corp.) isenta de cálcio. A suspensão de células ressuspendidas foi mantida em gelo e usada nas duas horas seguintes após o isolamento. (2) Mobilização de Cálcio A suspensão de células resultante, contendo neutrófilos, que exprimem o receptor de IL-8, isoladas, foi marcada por fluorescência com Indo-l-AM (Molecular Probes, Eugene, OR, E.U.A.). Misturou-se uma solução cinco micromolar (Mm) de Indo-l-AM dissolvido numa concentração final de 0,1% de dimetilsulfóxido (DMSO) com 1 x 107 neutrófilos/ml em HBSS isento de cálcio, preparados no passo (1) anterior, e manteve-se a mistura durante 30 minutos a 37°C para formar neutrófilos marcados por fluorescência. Após este período, lavou-se a suspensão de células, marcadas com Indo-1--AM, duas vezes com HBSS isento de cálcio. Ressuspenderam-se os neutrófilos resultantes, marcados por fluorescência e lavados, em HBSS contendo Hepes 10 mM, cálcio 1,5 mM e 1 grama de glucose, até uma concentração final de 2 x 106 células/ml. A suspensão de células foi depois pré-aquecida por manutenção a 37°C durante 2 minutos.Polynuclear cells (neutrophils) in the cell suspension devoid of PBMC were then recovered by sedimentation in dextran. The resulting cell pellet containing neutrophils at a concentration of 1.5 x 107 cells / milliliter (ml) was resuspended in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Sigma Chem. Corp.) calcium free. The resuspended cell suspension was maintained on ice and used within two hours following isolation. (2) Calcium Mobilization The isolated cell suspension containing neutrophils expressing the IL-8 receptor, isolated, was fluorescently labeled with Indo-1-AM (Molecular Probes, Eugene, OR, U.S.A.). A five micromolar (Mm) solution of Indo-1-AM dissolved in a final concentration of 0.1% dimethylsulfoxide (DMSO) with 1x10 7 neutrophils / ml in calcium-free HBSS prepared in the above step (1) , and the mixture was maintained for 30 minutes at 37 ° C to form fluorescently labeled neutrophils. After this period, the Indo-1-AM labeled cell suspension was washed twice with calcium-free HBSS. The fluorescently labeled, resultant neutrophils were resuspended in HBSS containing 10 mM Hepes, 1.5 mM calcium and 1 gram of glucose, to a final concentration of 2 × 10 6 cells / ml. The cell suspension was then preheated by maintenance at 37 ° C for 2 minutes.

Misturaram-se, separadamente, alíquotas da suspensão de células de neutrófilos, marcados por fluorescência, pré-aquecida, com 1 x IO"12 M do polipéptido sintético, Pep-1, produzido no Exemplo l, (TABELA 1), de IL-8 recombinante humana obtida, quer a partir de células endoteliais (Biosource, Westlake Village, CA,Aliquots of the preheated fluorescence-labeled neutrophil cell suspension aliquots were mixed with 1 x 10 qu of the synthetic polypeptide, Pep-1, produced in Example 1 (TABLE 1), IL- 8 obtained either from endothelial cells (Biosource, Westlake Village, CA,

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SCRF Case 217.1POR -29- E.U.A.) quer a partir de monocitos (Sandoz, Basel, Suíça), ou com 1 x 10“8 M do polipéptido sintético, Pep-2 produzido no Exemplo 1. Cada mistura foi submetida a fluorometria de células, pela qual se avaliaram os efeitos dos péptidos sintéticos ou da IL-8 na mobilização do cálcio em neutrófilos. A mobilização do cálcio foi medida em cada mistura pela detecção de variações na fluorescência com o tempo, num fluorometro SIM 8000. O fluorometro estava equipado com um filtro de excitação com um comprimento de onda de 340 nanometro (nm), com um filtro de emissão com um comprimento de onda de 400 nm no canal A, que representa o Indo-l-AM ligado ao cálcio, e com um filtro de emissão com um comprimento de onda de 485 nm no canal B que representa o Indo-l-AM livre. A razão entre a fluorescência detectada no canal A e a detectada no canal B (representada pela razão F) é igual ao valor da quantidade de cálcio intracelular.Or from 1 x 10-8 M of the synthetic polypeptide, Pep-2 produced in Example 1. Each mixture was subjected to cell fluorometry , by which the effects of synthetic peptides or IL-8 on calcium mobilization in neutrophils were evaluated. Calcium mobilization was measured in each mixture by detecting fluorescence variations over time on a SIM 8000 fluorometer. The fluorometer was equipped with an excitation filter having a wavelength of 340 nanometers (nm), with a emission filter with a wavelength of 400 nm on channel A, representing calcium-bound Indo-1-AM, and with an emission filter having a wavelength of 485 nm on channel B representing the free Indo-1-AM . The ratio between the detected fluorescence in channel A and that detected in channel B (represented by the ratio F) is equal to the value of the amount of intracellular calcium.

Os resultados deste ensaio, que se mostram na Figura 1, indicam que a mobilização do cálcio, em neutrófilos marcados com Indo-l-AM, aumentou dez segundos após o tratamento com o polipéptido sintético, Pep-1, tal como foi medido por fluorometria e cálculo das razões F como anteriormente se descreveu. Os resultados são comparados com as razões F calculadas a partir de neutrófilos tratados, quer com IL-8 recombinante humana, quer com o péptido sintético, Pep-2. Tanto o Pep-1 como a IL-8 recombinante humana, induzem a mobilização de cálcio que satura 20 segundos após o tratamento. Por contraste, o péptido sintético, Pep-2, não promove a mobilização do cálcio. 0 efeito do Pep-1 na mobilização do cálcio em neutrófilos mimetiza a IL-8 recombinante humana Intacta, enquanto que o Pep-2 não promove a mesma resposta.The results of this assay, shown in Figure 1, indicate that calcium mobilization on Indo-1-AM-labeled neutrophils increased ten seconds after treatment with the synthetic polypeptide, Pep-1, as measured by fluorometry and calculating the F ratios as previously described. The results are compared to the F ratios calculated from neutrophils treated with either recombinant human IL-8 or the synthetic peptide Pep-2. Both Pep-1 and recombinant human IL-8 induce calcium mobilization that saturates 20 seconds after treatment. In contrast, the synthetic peptide, Pep-2, does not promote calcium mobilization. The effect of Pep-1 on calcium mobilization in neutrophils mimics human recombinant IL-8 Intacta, whereas Pep-2 does not promote the same response.

Os resultados deste estudo indicam que os primeiros sete resíduos de aminoácido do terminal amino do Pep-1 são responsáveis pela capacidade do Pep-1 em se ligar ao receptor da IL-8. Deste modo, polipéptidos adicionais do presente invento possuem um comprimento da sequência de resíduos de aminoácido na gama de 7 a 30 e, preferivelmente, não mais do que 20 a 25 resíduos, e contêm a sequência CLDPKEN. Preferivelmente, estes péptidos possuem uma sequência global que corresponde, e que é,The results of this study indicate that the first seven amino acid residues of the amino terminus of Pep-1 are responsible for Pep-1's ability to bind to the IL-8 receptor. Thus, additional polypeptides of the present invention have an amino acid residue sequence length in the range of 7 to 30, and preferably no more than 20 to 25 residues, and contain the sequence CLDPKEN. Preferably, these peptides have an overall sequence corresponding to, and which is,

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SCRF Case 217.1POR -30- preferivelemente, idêntica, à da IL-8. Preferem-se também que estes péptidos se liguem ao receptor da IL-8, tal como é evidenciado pela sua capacidade em inibir competitivamente a ligação da IL-8 ao receptor, mas não induzem a activação de neutrófilos, tal como se descreveu na secção B2 anterior, Ensaios de Actividade. Na Tabela 2 seguinte mostram-se exemplos de péptidos. TABELA 2SCRF Case 217.1AG-30- is preferentially identical to that of IL-8. It is also preferred that these peptides bind to the IL-8 receptor, as evidenced by their ability to competitively inhibit the binding of IL-8 to the receptor, but do not induce neutrophil activation, as described in section B2 previous, Activity Assays. Examples of peptides are shown in Table 2 below. TABLE 2

CLDPKENCLDPKEN

CLDPKENWCLDPKENW

CLDPKENWVCLDPKENWV

CLDPKENWVQCLDPKENWVQ

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SCRF Case 217.1POR -31- (4) Libertação de Elastase A libertação da elastase foi determinada com o substrato fluorescente oMe-succinimida-Ala-Ala-Pro-Val-metil-coumarilamída (Peninsula Laboratories). Mantiveram-se alxquotas de 2 x 106 neutrófilos isolados/ml, preparados como no passo (1) anterior, a 37“C durante 2 minutos, na presença de 2 x 10“5 M do substrato fluorescente dissolvido em DMSO a 0,1% e de 1 micrograma (/*g/ml) de citocalasina B. As alíquotas de neutrófilos, tratadas com substrato, foram depois misturadas, em separado, com os polipép-tidos sintéticos preparados no Exemplo 1. A mistura resultante foi depois submetida a análise fluoro-métrica, realizada como no passo (2) anterior num fluorometro SLM 8000 equipado com um filtro de excitação com um comprimento de onda de 380 nm e com um filtro de emissão de 4900 angstrom. A elastase libertada dos neutrófilos tratados com péptido foi medida cineticamente durante um período de 2 minutos numa "cuvette" agitada mantida a 37°C. 0 teor total em elastase dos neutrófilos foi determinado por lise das células com Triton X-100 a 1%. A libertação espontânea de elastase foi subtraída ao total para se obter a libertação de elastase corrigida.(4) Elastase Release Elastase release was determined with the fluorescence substrate oMe-succinimide-Ala-Ala-Pro-Val-methyl-coumarilamide (Peninsula Laboratories). Aliquots of isolated 2 x 106 neutrophils / ml prepared as in step (1) above were maintained at 37Â ° C for 2 minutes in the presence of 2 x 10-5 M of the fluorescent substrate dissolved in 0.1% and 1 microgram (æg / ml) cytochalasin B. The substrate treated neutrophil aliquots were then mixed separately with the synthetic polypeptides prepared in Example 1. The resulting mixture was then subjected to analysis fluorometer, performed as in step (2) above on a SLM 8000 fluorometer equipped with an excitation filter having a wavelength of 380 nm and a 4900 angstrom emission filter. The elastase released from the peptide-treated neutrophils was measured kinetically over a period of 2 minutes in a " cuvette " stirred at 37 ° C. The total neutrophil elastase content was determined by lysing the cells with 1% Triton X-100. Spontaneous release of elastase was subtracted from the total to obtain elastase release corrected.

Os resultados do ensaio de libertação de elastase indicam que o Pep-1, para uma concentração de 1 x 10-9 M, promoveu uma libertação de elastase em neutrófilos comparável à que se observa com IL-8 recombinante humana intacta. Estes resultados constituem suporte adicional para o facto de o Pep-1 conter o local activo da IL-8, mimetizando assim a activação de neutrófilos pela IL-8. B. Ensaios In Vivo O Pep-1, preparado no Exemplo 1, foi dissolvido em solução salina tamponada com fosfato (PBS) isenta de lipopolissacárido e as soluções, em concentrações compreendidas entre 1 x 10-9 Mel x 10”11 M, foram injectadas na pele de um coelho. A IL-8 recombinante humana, preparada de um modo similar, foi injectada numa área de pele separada do mesmo coelho. As injecções de PBS sozinha serviram como controlo negativo. Um segundo coelho recebeu injecções similares das soluções.Elastase release assay results indicate that Pep-1, at a concentration of 1 x 10-9 M, promoted elastase release in neutrophils comparable to that seen with intact human recombinant IL-8. These results further support the fact that Pep-1 contains the active site of IL-8, thereby mimicking the activation of neutrophils by IL-8. B. In Vivo Assays The Pep-1, prepared in Example 1, was dissolved in lipopolysaccharide-free phosphate buffered saline (PBS) and the solutions in concentrations ranging from 1 x 10 9 Mel x 10 11 11 M were injected into the skin of a rabbit. The similarly prepared human recombinant IL-8 was injected into a skin area separated from the same rabbit. Injections of PBS alone served as a negative control. A second rabbit received similar injections of the solutions.

ύ 73 116ύ 73 116

SCRF Case 217.1POR -32- A pele correspondente às áreas das injecções com Pep-1, IL-8 e PBS foi excisada dos coelhos quatro horas após a injecção. As amostras de pele excisada foram analisadas, por microscopia óptica, para avaliar a quimiotaxia de neutrófilos na área da injecção. As injecções de Pep-1 resultaram numa quimiotaxia de neutrófilos, dependente da dose, que não se distinguia do influxo induzido pelas mesmas concentrações de IL-8. Os neutrófilos não prevaleceram em áreas que receberam injecções de PBS. 3. Preparação de Anti-soros Policlonais Contra um Polipén-tido Sintético Relacionado com a IL-8 A. Preparação do Imunogénio 0 polipéptido sintético, Pep-1, preparado no Exemplo 1, foi acoplado à hemocianina de lapa Fissurela (KLH) pelo resíduo cisteína do terminal N do Pep-1 para formar conjugados Pep-l-KLH. A KLH foi dialisada contra uma solução de PBS 10 mM e ajustou-se a solução de KLH dialisada resultante até uma concentração de 20 miligrama (mg)/ml. Dissolveram-se 3 mg de éster m-maleimi-dobenzoil-N-hidroxissuccinimida (MBS) (Pierce Biochemicals, Rockford, IL, E.U.A.) em 5 ml de dimetilformamida (Pierce Biochemicals). Misturaram-se 85 microlitro (μΐ) da solução de MBS resultante com 200 μΐ da solução de KLH, para formar uma mistura de KLH-MBS que foi mantida a 25eC durante 30 minutos.Skin corresponding to the areas of the injections with Pep-1, IL-8 and PBS was excised from the rabbits at 4 hours post-injection. Excised skin samples were analyzed by light microscopy to evaluate chemotaxis of neutrophils at the injection site. Pep-1 injections resulted in dose-dependent neutrophil chemotaxis, which was indistinguishable from the influx induced by the same concentrations of IL-8. Neutrophils did not prevail in areas that received PBS injections. 3. Preparation of Polyclonal Antisera Against an IL-8 Related Synthetic Polypeptide A. Preparation of Immunogen The synthetic polypeptide, Pep-1, prepared in Example 1, was coupled to keyhole limpet hemocyanin (KLH) by the residue Pep-1 N-terminal cysteine to form Pep-1-KLH conjugates. The KLH was dialyzed against a 10 mM PBS solution and the resulting dialyzed KLH solution was adjusted to a concentration of 20 milligram (mg) / ml. 3 mg of m-maleimino-dobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS) (Pierce Biochemicals, Rockford, IL, U.S.A.) were dissolved in 5 ml of dimethylformamide (Pierce Biochemicals). 85 microliter (μ) of the resulting MBS solution was mixed with 200 μl KLH solution to form a mixture of KLH-MBS which was maintained at 25 ° C for 30 minutes.

Depois, submeteu-se a mistura de KLH-MBS através de uma coluna Sephadex G-25 (Pharmacia, Piscataway, NJ, E.U.A.) e colheram-se fracções de 1 ml de KLH tratada com MBS. Depois misturou--se 1 ml da KLH cromatografada com l ml de uma solução de 5 mg/ml de Pep-1, previamente dissolvido em PBS, para formar um imuno-génio de conjugado Pep-l-KLH. 0 pH da mistura Pep-l-KLH foi depois ajustado até pH 7,0 e, depois, manteve-se a mistura a 25°C durante três horas.The KLH-MBS mixture was then run through a Sephadex G-25 column (Pharmacia, Piscataway, NJ, U.S.A.) and 1 ml fractions of MBS treated KLH were collected. 1 ml of the chromatographed KLH was then mixed with 1 ml of a 5 mg / ml solution of Pep-1, previously dissolved in PBS, to form a Pep-1-KLH conjugate immunoassay. The pH of the Pep-1-KLH mixture was then adjusted to pH 7.0, and then the mixture was maintained at 25 ° C for three hours.

Preparou-se um imunogénio de conjugado Pep-3-KLH como ante-riormente, com a excepção de se ter usado o polipéptido sintético Pep-3 em vez do Pep-1. B. Imunização e Colheita dos Antissoros Policlonais 0 imunogénio de Pep-l-KLH, preparado no Exemplo 3A, foi 73 116A Pep-3-KLH conjugate immunogen was prepared as above, except that the synthetic Pep-3 polypeptide was used in place of Pep-1. B. Immunization and Harvest of Polyclonal Antisera Pep-1-KLH immunogen, prepared in Example 3A, was 73 116

SCRF Case 217.1POR 33-SCRF Case 217.1ENG 33-

emulsionado em adjuvante completo de Freund (CFA) e os antigénios de Pep-l-KLH foram incorporados na emulsão numa concentração de 200 /zg/1,5 ml. Injectaram-se dois coelhos, cada um, com 1,5 ml da emulsão preparada, após se terem colhido amostras de soro antes da imunização. O volume total da dose de emulsão foi dividido, em partes iguais, para administração subcutânea no dorso, espáduas e ancas de um coelho.emulsified in complete Freund's adjuvant (CFA) and Pep-1-KLH antigens were incorporated into the emulsion at a concentration of 200æg / 1.5 ml. Two rabbits were each injected with 1.5 ml of the emulsion prepared after serum samples were collected prior to immunization. The total volume of the emulsion dose was divided equally into subcutaneous administration on the back, shoulder and hip of a rabbit.

No dia 14, os coelhos receberam uma injecção de reforço do imunogénio de Pep-l-KLH emulsionado em adjuvante de Freund incompleto (IFA). No dia 21, cada coelho recebeu uma injecção intrape-ritoneal de 1 ml de uma solução de 10 mg/ml de Pep-1 livre dissolvido em 1,2 ml de PBS contendo 0,8 ml de hidróxido de alumínio. Colheram-se amostras de soro de cada coelho imunizado, 7 e 14 dias após a terceira injecção, e analisaram-se por transferência de Western como se descreve a seguir em C para a detecção de anticorpos específicos do Pep-1.At day 14, the rabbits received a booster injection of Pep-1-KLH immunogen emulsified in incomplete Freund's adjuvant (IFA). On day 21, each rabbit received an intraperitoneal injection of 1 ml of a 10 mg / ml solution of free Pep-1 dissolved in 1.2 ml of PBS containing 0.8 ml of aluminum hydroxide. Serum samples were collected from each immunized rabbit 7 and 14 days after the third injection and analyzed by Western blotting as described below in C for the detection of Pep-1 specific antibodies.

De um modo similar, prepararam-se amostras de soro usando coelhos imunizados com o imunogénio de Pep-3-KLH do Exemplo 3A, para formar anticorpos específicos do Pep-3, que foram caracteri-zados como a seguir se descreve em C. C. Análise de Antissoros Policlonais por Análise deSimilarly, serum samples were prepared using rabbits immunized with the Pep-3-KLH immunogen from Example 3A to form Pep-3 specific antibodies which were characterized as described below in CC Analysis of Polyclonal Antisera by Analysis of

Transferência de WesternWestern transfer

Separaram-se amostras de IL-8 recombinante humana, de Pep-1 e de Pep-3, numa concentração de 100 ng/ml, por electroforese em gel, e transferiram-se para nitrocelulose para análise de imuno-transferência subsequente. Misturou-se o filtro de nitrocelulose com tampão de bloqueamento de anticorpo (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,5, cloreto de sódio 0,5 M, 1% de albumina de soro de bovino e 0,05% de Tween 40) durante 3 a 12 horas à temperatura ambiente. Diluíram-se os soros colhidos a partir dos coelhos, preparados no Exemplo 3B, que se crê que contêm anticorpos imuno-reactivos com Pep-l ou com Pep-3, 1:500 no tampão de bloqueamento anticorpo e misturou-se com a nitrocelulose. A mistura resultante foi mantida durante 12 horas à temperatura ambiente para permitir a formação de um produto deHuman recombinant IL-8, Pep-1 and Pep-3 samples were collected at a concentration of 100 ng / ml by gel electrophoresis, and transferred to nitrocellulose for subsequent immuno-transfer analysis. The nitrocellulose filter was mixed with antibody blocking buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.5, 0.5 M sodium chloride, 1% bovine serum albumin and 0.05% Tween 40) for 3 to 12 hours at room temperature. The sera collected from rabbits, prepared in Example 3B, which are believed to contain Pep-1 or Pep-3, 1: 500 immunoreactive antibodies in the antibody blocking buffer were diluted and mixed with nitrocellulose . The resulting mixture was kept for 12 hours at ambient temperature to allow the formation of a product of

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SCRF Case 217.1POR -34- imuno-reacção sobre a fase sólida.Immuno-reaction on the solid phase.

Os soros pré-imunes dos mesmos coelhos foram testados simultaneamente em amostras separadas para servirem como controlo negativo. A nitrocelulose foi depois lavada três vezes com volumes em excesso de tampão de blogueamento de anticorpo. As lavagens foram seguidas da mistura da nitrocelulose com IgG anti-coelho conjugada com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (Sigma Chem. Corp.), numa diluição 1:500 em tampão de bloqueamento de anticorpo, durante uma hora à temperatura ambiente, para permitir que a IgG marcada com HRP se ligue a qualquer produto de imuno-reacção, presente na fase sólida sobre a nitrocelulose. Depois, lavou-se a nitrocelulose como aqui se descreveu e revelou-se por tratamento com 4-cloro-l-naftol como substrato, de modo a visualizar o marcador e, deste modo, qualquer produto de imuno-reacção sobre a nitrocelulose.The preimmune sera from the same rabbits were tested simultaneously on separate samples to serve as a negative control. The nitrocellulose was then washed three times with excess volumes of antibody blotting buffer. The washes were followed by mixing the nitrocellulose with horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG (Sigma Chem Corp.) in a 1: 500 dilution in antibody blocking buffer for one hour at room temperature to allowing the HRP-labeled IgG to bind to any immuno-reaction product present in the solid phase on the nitrocellulose. The nitrocellulose was then washed as described herein and developed by treatment with 4-chloro-1-naphthol as a substrate in order to visualize the label and thus any immunoreactive product on the nitrocellulose.

Os antissoros policlonais contendo anticorpos imuno-reacti-vos com a IL-8, Pep-1 e Pep-3 foram depois avaliados quanto à sua capacidade em inibirem a função da IL-8 como se descreve no Exemplo 5. D. Purificação por Imunoafinidade dos Anticorpos PoliclonaisPolyclonal antisera containing antibodies immunoreactive with IL-8, Pep-1 and Pep-3 were then evaluated for their ability to inhibit IL-8 function as described in Example 5. D. Immunoaffinity Purification of Polyclonal Antibodies

Os anticorpos anti-Pep-l e anti-Pep-3, preparados com antissoros policlonais como se descreveu no Exemplo 3C, foram purificados por imunoafinidade, usando polipéptido imobilizado na fase sólida como se segue.Anti-Pep-1 and anti-Pep-3 antibodies, prepared with polyclonal antisera as described in Example 3C, were immunoaffinity purified using solid phase immobilized polypeptide as follows.

Os polipéptidos Pep-1 e Pep-3 foram acoplados, cada um em separado, a brometo de cianogénio (CNBr)- Sepharose 4B activada (Pharmacia), numa concentração de 3 mg de proteína para l ml de gel, em tampão de acoplamento (NaCl 0,5 M e borato 0,05 M, a pH 8,5), de um dia para o outro a 4eC, para formar uma suspensão de polipéptido - Sepharose. A suspensão foi empacotada numa coluna e lavada com tampão de acoplamento para remover polipéptido não ligado, de acordo com as instruções do fabricante. Os antissoros policlonais foram misturados com uma solução tampão contendo NaClPep-1 and Pep-3 polypeptides were coupled separately to cyanogen bromide (CNBr) -sepharose 4B activated (Pharmacia), at a concentration of 3 mg of protein to 1 ml of gel, in coupling buffer ( 0.5 M NaCl and 0.05 M borate, pH 8.5) overnight at 4 ° C to form a polypeptide-Sepharose suspension. The suspension was packed onto a column and washed with coupling buffer to remove unbound polypeptide according to the manufacturer's instructions. Polyclonal antisera were mixed with a buffer solution containing NaCl

73 116 SCRF Case 217.1POR -35-73 116 SCRF Case 217.1ENG-35-

0,1 M, ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) 2 mM, benzamidina 2 mM, 0,02% de NaN3, 0,02% de Tween-20 e Tris-HCl a pH 7,4. Depois, fizeram-se passar os soros tamponados sobre a coluna de polipéptido preparado - Sepharose, para imobilizar os anticorpos anti-polipéptido sobre a coluna de anticorpo e separar os anticorpos específicos de polipéptido doa anticorpos não específicos ou fracamente específicos, e doutros componentes do soro. A coluna de polipéptido contendo anticorpo imobilizado foi lavada, subsequentemente para remover mais anticorpos não ligados e outras proteínas. O anticorpo imobilizado foi depois eluído da coluna com tiocianato de sódio (NaSCN) 3M em NaCl 1,0 M, benzamidina 4 mM, EDTA 2 mM, 0,02% de NaN3 e Tris-HCl 0,05 M a pH 7,0. Determinou-se que o anticorpo eluído e purificado tinha uma pureza superior a 95% quando analisado usando electroforese em dodecilsulfato de sódio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). 4. Preparação de Anticorpos Monoclonais Contra um Polipéptido Sintético Relacionado com a IL-8 A. Geração de Hibridomas anti-Pep-1 0 polipéptido sintético, Pep-1, é preparado na forma de um imunogénio, de acordo com o Exemplo 3. Imunizam-se ratinhos Balb/c ByJ (Scripps Clinic and Research Foundation Vivarium, La Jolla, CA, E.U.A.), intraperitonealmente (i.p.), com 50 μg de imunogénio de Pep-l-KLH preparado, em CFA, seguindo-se uma segunda e uma terceira imunização, usando o mesmo imunogénio de Pep-l-KLH, cada uma separada de cerca de três semanas, em IFA. Os ratinhos recebem um reforço de 50 μg de imunogénio do Pep-l-KLH preparado, intravenosamente (i.v.), em solução salina normal, 4 dias antes da fusão e um segundo reforço, por perfusão, similar um dia mais tarde.0.1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 2 mM benzamidine, 0.02% NaN 3, 0.02% Tween-20 and Tris-HCl at pH 7.4. The buffered sera were then passed over the prepared polypeptide-Sepharose column to immobilize the anti-polypeptide antibodies on the antibody column and separate the polypeptide-specific antibodies from the non-specific or weakly specific antibodies and other serum components . The polypeptide column containing immobilized antibody was washed, subsequently to remove further unbound antibodies and other proteins. The immobilized antibody was then eluted from the column with 3M sodium thiocyanate (NaSCN) in 1.0 M NaCl, 4 mM benzamidine, 2 mM EDTA, 0.02% NaN 3 and 0.05 M Tris-HCl at pH 7.0 . The eluted and purified antibody was found to have a purity greater than 95% when analyzed using sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). 4. Preparation of Monoclonal Antibodies Against a Synthetic Polypeptide Related to IL-8 A. Generation of Anti-Pep-1 Hybridomas The synthetic polypeptide, Pep-1, is prepared as an immunogen according to Example 3. Immunize (ip), Balb / c ByJ mice (Scripps Clinic and Research Foundation Vivarium, La Jolla, CA, USA) were mixed with 50 μg prepared Pep-1-KLH immunogen in CFA followed by a second and a third immunization, using the same Pep-1-KLH immunogen, each separated from about three weeks, in IFA. Mice are given a 50 μg boost of Pep-1-KLH immunogen prepared intravenously (i.v.) in normal saline 4 days before fusion and a second booster infusion similar a day later.

Os animais assim tratados são sacrificados e colhe-se o baço de cada ratinho. Prepara-se depois uma suspensão de células de baço. Depois, extraem-se as células de baço da suspensão de células de baço, por centrifugação, durante cerca de 10 minutos a 1000 rpm, a 23°C. Após a remoção do sobrenadante, ressuspende-se o sedimento de células em 5 ml de tampão de lise de NH4C1, e in-cuba-se durante cerca de 10 minutos.The animals thus treated are sacrificed and the spleen of each mouse is harvested. A suspension of spleen cells is then prepared. The spleen cells are then removed from the spleen cell suspension by centrifugation for about 10 minutes at 1000 rpm at 23øC. After removal of the supernatant, the cell pellet is resuspended in 5 ml of NH 4 Cl lysis buffer and incubated for about 10 minutes.

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SCRF Case 217.1POR -36- À suspensão de células lisadas adicionam-se 10 ml de Meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (GIBCO) e tampão HEPES [ácido 4-(2-hidroxietil)-l-piperidino-etanossulfónico] e essa mistura é centrifugada, durante cerca de 10 minutos, a 1000 rpm, a 23°C.To the suspension of lysed cells is added 10 ml of Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (GIBCO) and HEPES [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperidineethanesulfonic acid] buffer and this mixture is centrifuged for about 10 minutes at 1000 rpm at 23øC.

Decanta-se o sobrenadante, ressuspende-se o sedimento, em 15 ml de DMEM e HEPES, e centrifuga-se, durante cerca de 10 minutos, a 1000 rpm, a 23 °C. Repete-se o procedimento anterior.The supernatant is decanted, the pellet resuspended in 15 ml of DMEM and HEPES, and centrifuged for about 10 minutes at 1000 rpm at 23 ° C. The above procedure is repeated.

Depois, ressuspende-se o sedimento em 5 ml de DMEM e HEPES. Remove-se então uma alíquota da suspensão de células de baço para contagem. As fusões são realizadas do seguinte modo, usando a linha de células de mieloma de ratinho não segregante P3X63Ag8.653.1, um subclone da linha de células P3X63Ag8.653 (ATCC 1580). Usando uma proporção de células de mieloma para células de baço de cerca de 1 para 10 ou de cerca de 1 para 5, centrifuga-se uma quantidade suficiente de células de mieloma para formar um sedimento, lava-se duas vezes, em 15 ml de DMEM e HEPES, e centrifuga-se durante 10 minutos a 1000 rpm a 23°C.The pellet is then resuspended in 5 ml of DMEM and HEPES. An aliquot of the spleen cell suspension is then removed for counting. The fusions are performed as follows, using the non-segregating mouse myeloma cell line P3X63Ag8.653.1, a subclone of the cell line P3X63Ag8.653 (ATCC 1580). Using a ratio of myeloma cells to spleen cells of about 1 to 10 or about 1 to 5, a sufficient amount of myeloma cells are centrifuged to form a pellet, washed twice in 15 ml of DMEM and HEPES, and centrifuged for 10 minutes at 1000 rpm at 23 ° C.

Combinam-se as células de baço e as células de mieloma em tubos de 15 ml de fundo redondo. Centrifuga-se a mistura de células, durante 10 minutos, a 1000 rpm, a 23°C, e remove-se o sobrenadante por aspiração. Depois, misturam-se 200 μΐ de uma solução aquosa a 50 por cento (peso por volume) de polietilenoglicol de massa molecular 4000 (PEG; ATCC Baltimore, MD, E.U.A.) a cerca de 37°C, usando uma pipeta de 1 ml, com agitação vigorosa, para a quebra do sedimento, e misturam-se as células, gentilmente, durante um período entre 15 e 30 segundos. Centrifuga-se a mistura de células durante 4 minutos a 700 rpm.Spleen cells and myeloma cells are combined in 15 ml round bottom tubes. The cell mixture is centrifuged for 10 minutes at 1000 rpm at 23øC, and the supernatant is removed by aspiration. 200 μΐ of a 50 percent (w / v) aqueous solution of 4000 molecular weight polyethylene glycol (PEG; ATCC Baltimore, MD, USA) is then blended at about 37øC using a 1 ml pipette, with vigorous stirring, for the breakdown of the sediment, and the cells are gently mixed for a period of between 15 and 30 seconds. The cell mixture is centrifuged for 4 minutes at 700 rpm.

Cerca de 8 minutos antes de se adicionar o PEG, misturam-se, lentamente, 5 ml de DMEM mais tampão de HEPES, com o sedimento, sem perturbar as células. Após 1 minuto, quebra-se a mistura resultante, com uma pipeta de 1 ml, e incuba-se durante mais 4 minutos. Esta mistura é centrif ugada durante 7 minutos a 1000 rpm. Decanta-se o sobrenadante, misturam-se, lentamente, 5 ml de meio HT (hipoxantina/timidina) com o sedimento, e mantem-se a misturaAbout 8 minutes before PEG is added, 5 ml of DMEM plus HEPES buffer are slowly mixed with the pellet without disturbing the cells. After 1 minute, the resulting mixture is cleaved with a 1 ml pipette and incubated for an additional 4 minutes. This mixture is centrifuged for 7 minutes at 1000 rpm. The supernatant is decanted, 5 ml of HT medium (hypoxanthine / thymidine) is slowly mixed with the pellet, and the mixture is maintained

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SCRF Case 217.1POR -37-não perturbada durante 5 minutos. 0 sedimento é depois quebrado em grandes bocados e a suspensão final de células é colocada em balões T75 (2,5 ml por balão) nos quais se tinham colocado previamente 7,5 ml de meio HT. A suspensão de células resultante é incubada, a 37°C, para desenvolver as células fundidas. Após 245 horas, adicionam-se 10 ml de meio HT aos balões, seguidas de 0,3 ml de aminopterina 0,04 mH, 6 horas mais tarde. Quarenta e oito horas após a fusão, adicionam-se 10 ml de meio HAT (hipoxantina/aminopterina/timidina) aos balões.SCRF Case 217.1ENG -37- undisturbed for 5 minutes. The pellet is then broken into large pieces and the final suspension of cells is placed in T75 flasks (2.5 ml per flask) in which 7.5 ml of HT medium have been previously placed. The resulting cell suspension is incubated at 37 ° C to develop the molten cells. After 245 hours, 10 ml of HT medium is added to the flasks, followed by 0.3 ml of 0.04 mH aminopterin, 6 hours later. Forty-eight hours post-fusion, 10 ml HAT medium (hypoxanthine / aminopterin / thymidine) is added to the flasks.

Três dias após a fusão, plaqueiam-se as células viáveis em placas de cultura de tecidos de 96 cavidades com cerca de 2 x 10^ células viáveis por cavidade (um total de 768 cavidades), em meio tampão de HAT, tal como se descreve em Kennett et al., Curr Top. Microbiol. Immunol.. 81:77 (1978). As células são alimentadas sete dias após a fusão com meio HAT e, depois, com intervalos de aproximadamente 4-5 dias, conforme necessário, com meio HT. O crescimento é seguido microscopicamente, e os sobrènadantes da cultura são colhidos cerca de duas semanas mais tarde e analisados para determinar a presença de anticorpo, específico do Pep-1, por doseamento radio-imunológico (RIA) em fase sólida.Three days after fusion, the viable cells are plated on 96-well tissue culture plates with about 2 x 10 5 viable cells per well (a total of 768 wells) in HAT buffer medium as described in Kennett et al., Curr Top. Microbiol. Immunol., 81: 77 (1978). Cells are fed seven days after fusion with HAT medium and then at approximately 4-5 day intervals as required with HT medium. The growth is followed microscopically, and the culture supernatants are harvested about two weeks later and analyzed for Pep-1 specific antibody by solid phase radioimmunoassay (RIA).

Resumidamente, adicionam-se 50 μΐ de PBS, contendo 5 /ig/ml de imunogénio de Pep-l-KLH preparado, às cavidades de placas de microtitulação. As placas são mantidas de um dia para o outro (cerca de 16 horas) a 4°C, para permitir que o imunogénio de Pep-l-KLH adira às paredes das cavidades. Após lavagem das cavidades, quatro vezes com tampão SPRIA (KC1 2,68 mM, KH2P04 1,47 mM, NaCl 137 mM, Na2HP04 8,03 mM, 0,05% de Tween-20, 0,1 ΚΙϋ/ml de Traysol, 0,1% de BSA e 0,015% de NaN3), adicionam-se 200 μΐ de tampão SPRIA contendo 3% de soro de cabra normal (NGS) e 3% de albumina de soro de bovino (BSA), a cada cavidade, para bloquear os locias de ligação de proteína em excesso. As placas são mantidas durante 30 minutos a 20°C, vazam-se as cavidades por agitação e secam-se por absorção para formar um suporte sólido, i.e., uma matriz sólida à qual se fixa operativamente o imunogénio de Pep-l-KLH.Briefly, 50 μl of PBS, containing 5 μg / ml prepared Pep-1-KLH immunogen, is added to the wells of microtiter plates. The plates are maintained overnight (about 16 hours) at 4Â ° C, to allow Pep-1-KLH immunogen to adhere to the walls of the wells. After washing the wells, four times with SPRIA buffer (2.68 mM KCl, 1.47 mM KH2 PO4, 137 mM NaCl, 8.03 mM Na2HPO4, 0.05% Tween-20, 0.1 ΚΙϋ / ml Traysol , 0.1% BSA and 0.015% NaN 3), 200 μl of SPRIA buffer containing 3% normal goat serum (NGS) and 3% bovine serum albumin (BSA) were added to each well, to block the excess protein binding locias. The plates are maintained for 30 minutes at 20Â ° C, the wells are leached by shaking and dried by absorption to form a solid support, i.e., a solid matrix to which Pep-1-KLH immunogen is operatively attached.

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SCRF Case 217.1POR -38- A cada cavidade, adicionam-se depois 50 μΐ de sobrenadante de cultura de tecidos de hibridoma para formar uma mistura de imuno-reacção em fase sólida-líquida. A mistura é mantida, durante 2 horas a 37eC, para permitir a formação de produtos de imuno--reacção em fase sólida. Após lavagem das cavidades como aqui an-teriormente se descreveu, adicionam-se 50 μΐ de IgG de cabra an-ti-ratinho, marcada (Cappel Laboratories, Downington, PA, E.U.A.), com 0,25 /tg de proteína por ml, a cada cavidade, para formar uma mistura reaccional de marcação. Essa mistura é mantida durante 1 hora a 37°C para permitir a formação de produtos de imuno-reacção em fase sólida, marcados com Após lavagem das cavidades como anteriormente se descreveu, a quantidade de produto, marcado com 125I, ligado a cada cavidade, é determinada por detecção gama.In each well 50 μΐ of hybridoma tissue culture supernatant is then added to form a solid-liquid-phase immuno-reaction mixture. The mixture is maintained for 2 hours at 37 ° C to allow the formation of solid phase immuno-reaction products. After washing the wells as described hereinbefore, 50 μl of labeled goat anthra-mouse IgG (Cappel Laboratories, Downington, PA, USA), with 0.25 μg protein per ml, to each well, to form a labeling reaction mixture. This mixture is maintained for 1 hour at 37 ° C to allow the formation of solid phase immunoreaction products labeled with After washing the wells as described above, the amount of 125 I-labeled product, bound to each well, is determined by gamma detection.

Os hibridomas são seleccionados, a partir de culturas de hibridoma que segregam anticorpos anti-Pep-l para os seus meios de cultura, e caracterizados adicionalmente como aqui se descreveu.Hybridomas are selected from hybridoma cultures that secrete anti-Pep-1 antibodies to their culture media, and further characterized as described herein.

Os hibridomas são produzidos e seleccionados a partir de culturas de hibridoma que segregam anticorpos anti-Pep-3, usando os processos que anteriormente se descreveram com excepção de se usar o Pep-3 em vez do Pep-1, como o polipéptido de imunização e de pesquisa. B. Produção e Purificação do Anticorpo Monoclonal Pep-1 O hibridoma anti-Pep-l é cultivado numa atmosfera humidificada com 5% de Co2, a 37°C, em DMEM contendo L-glutamina 2 mM, 50 μg de gentamicina por ml, 10% de soro fetal de bovino e 10% de soro de cavalo, todos da Grand Island Biological Co., Lawrence, MA, E.U.A., 10% de meio NCTC de Microbiological Associates, Ro-ckville, MD, E.U.A., hipoxantina, 1 mM e timidina 0,3 mM, ambos da Sigma Chemical Corp. A concentração de células é mantida na gama de cerca de 1-2 x 105 células por ml de meio a cerca de l-2xl06 células por ml de meio, para o crescimento e divisão das células e produção de anticorpo.Hybridomas are produced and selected from hybridoma cultures which secrete anti-Pep-3 antibodies, using the procedures described above except that Pep-3 is used in place of Pep-1, as the immunizing polypeptide and of research. B. Production and Purification of Pep-1 Monoclonal Antibody Pep-1 hybridoma is grown in a humidified atmosphere with 5% Co 2 at 37øC in DMEM containing 2 mM L-glutamine, 50 μg gentamycin per ml, 10% fetal bovine serum and 10% horse serum, all from Grand Island Biological Co., Lawrence, MA, USA, 10% NCTC medium from Microbiological Associates, Ro-kville, MD, USA, hypoxanthine, 1mM and 0.3 mM thymidine, both from Sigma Chemical Corp. The concentration of cells is maintained in the range of about 1-2 x 105 cells per ml of medium to about 1-2x106 cells per ml of medium, for growth and division of cells and production of antibody.

Para produzir fluido ascítico de tumor contendo moléculas deTo produce ascites tumor fluid containing

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SCRF Case 217.1POR -39-anticorpo anti-Pep-1, sensibilizaram-se imunologicamente ratinhos Balb/c, com 10 semanas de idade, por injecção intraperitoneal com 0,3 ml de óleo mineral e, subseguentemente, injectaram-se intra-peritonealmente com 3-5 x 105 células de hibridoma anti-Pep-1. Os ratinhos inoculados são depois mantidos durante um período de tempo suficiente para se acumularem fluidos ascíticos de tumor, contendo anticorpos, p.e., durante cerca de 10 a cerca de 21 dias. 0 fluido ascítico é recolhido e clarificado por centrifugação a 15 000 x g durante 1 hora a 4°C e armazenado congelado a -20°C.Anti-Pep-1 antibody, 10-week-old Balb / c mice were immunized immunologically by intraperitoneal injection with 0.3 ml of mineral oil and subsequently injected intraperitoneally with 3-5 x 105 anti-Pep-1 hybridoma cells. The inoculated mice are then maintained for a period of time sufficient to accumulate tumor-containing ascites fluids, e.g., antibodies for about 10 to about 21 days. The ascites fluid is collected and clarified by centrifugation at 15,000 x g for 1 hour at 4 ° C and stored frozen at -20 ° C.

As moléculas de anticorpos anti-Pep-1 são isoladas a partir do fluido ascítico, submetendo o fluido a cromatografia líquida rápida de proteínas (FPLC) sobre uma coluna de permuta aniónica Pharmacia Mono QHR 5/5, num sistema de FPLC da Pharmacia (ambos da Pharmacia, Inc.) usando um gradiente de NaCl de 0-0,5 M, em Tris 10 mM, pH 8,0, e seguindo as instruções fornecidas com a coluna. As moléculas de anticorpo anti-Pep-1 assim isoladas podem depois ser transferidas, para qualquer diluente fisiologicamente tolerável, por diálise.The anti-Pep-1 antibody molecules are isolated from the ascites fluid, by subjecting the fluid to Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) on a Pharmacia Mono QHR 5/5 anion exchange column in a Pharmacia FPLC system (both from Pharmacia, Inc.) using a 0-0.5 M NaCl gradient in 10 mM Tris, pH 8.0, and following the instructions provided with the column. The isolated anti-Pep-1 antibody molecules can then be transferred to any physiologically tolerable diluent by dialysis.

Altemativamente, as moléculas de anticorpo anti-Pep-1 podem ser isoladas, a partir do fluido ascítico de tumor, por precipitação com sulfato de amónio de acordo com o processo descrito por Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Pratice. Academic Press, p 100-101 (1983). Resumidamente, esse processo compreende misturar lentamente solução saturada de sulfato de amónio com o fluido ascítico, até se atingir uma concentração de sulfato de amónio de cerca de 45% a cerca de 50%. As imunoglobu-linas precipitadas são depois recolhidas por centrifugação a 2000 x g, preferivelmente, a 10 000 x g. o precipitado é lavado 2 ou 3 vezes em solução de sulfato de amónio saturada a 40%. as moléculas de anticorpo anti-Pep-1 precipitadas, são depois diali-sadas contra 500-1000 volumes de solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou qualquer outro diluente fisiologicamente tolerável desejado, para remover o sulfato de amónio. 0 fluido de diálise é mudado várias vezes com intervalos de algumas horas. A concentração de proteína da solução de anticorpo anti-Pep-1 dia-lisada, recuperada é determinada pelo método de Lowry [Lowry etAltematively, the anti-Pep-1 antibody molecules can be isolated from the tumor ascites fluid by precipitation with ammonium sulfate according to the procedure described by Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. Academic Press, p 100-101 (1983). Briefly, this process comprises slowly mixing saturated ammonium sulfate solution with the ascites fluid until an ammonium sulfate concentration of about 45% to about 50% is reached. The precipitated immunoglobulins are then collected by centrifugation at 2000 x g, preferably at 10,000 x g. the precipitate is washed 2 or 3 times in 40% saturated ammonium sulfate solution. the precipitated anti-Pep-1 antibody molecules are then dialysed against 500-1000 volumes of phosphate buffered saline (PBS) or any other physiologically tolerable diluent desired to remove the ammonium sulfate. The dialysis fluid is changed several times at intervals of a few hours. The protein concentration of the recovered dia-lysed anti-Pep-1 antibody solution is determined by the method of Lowry [Lowry et al.

çj1'Î ± 1 '

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SCRF Case 217.1POR -40 al., J. Biol. Chem., 193, 265-275 (1951)] usando um padrão de albumina de soro de bovino. A confirmação da especificidade funcional dos anticorpos an-ti-Pep-1, quer numa amostra de soro obtida no Exemplo 3, quer no sobrenadante da cultura de hibridoma, é determinada, em ensaios de ligação a neutrófilos exprimindo receptores de IL-8, em ensaios de competição a seguir descritos no Exemplo 5. O hibridoma anti-Pep-3, preparado como se descreveu no Exemplo 4A, é cultivado como se descreveu anteriormente para o hibridoma anti-Pep-1. As moléculas de anticorpos anti-Pep-3 são purificadas a partir do hibridoma anti-Pep-3 como anteriormente se descreveu para as moléculas de anticorpos anti-Pep-1. A confirmação da especificidade funcional dos anticorpos anti-Pep-3, quer numa amostra de soro obtida no Exemplo 3, quer no sobrenadante da cultura de hibridoma, é determinada na análise de transferência de Western do Exemplo 3C e nos ensaios de ligação a neutrófilos exprimindo o receptor da IL-8, como se descreve no Exemplo 5. 73 116SCRF Case 217.1 PG -40 al., J. Biol. Chem., 193, 265-275 (1951)] using a bovine serum albumin standard. Confirmation of the functional specificity of the an-ti-Pep-1 antibodies, either in a serum sample obtained in Example 3, or in the hybridoma culture supernatant, is determined, in neutrophil binding assays expressing IL-8 receptors, in competition assays described below in Example 5. The anti-Pep-3 hybridoma, prepared as described in Example 4A, is cultured as described above for the anti-Pep-1 hybridoma. Anti-Pep-3 antibody molecules are purified from the anti-Pep-3 hybridoma as described above for the anti-Pep-1 antibody molecules. Confirmation of the functional specificity of the anti-Pep-3 antibodies, either in a serum sample obtained in Example 3 or in the hybridoma culture supernatant, is determined in the Western blot analysis of Example 3C and in the neutrophil binding assays expressing the IL-8 receptor, as described in Example 5. 73 116

SCRF Case 217.1POR -41-SCRF Case 217.1

vre da IL-8 ligada a neutrófilos. A radioactividade total associada às células foi determinada por detecção em contador gama. A ligação específica da IL-8 associada às células, foi calculada subtraindo a radioactividade associada às células, que resultou em misturas mantidas na presença de um excesso molar de 100 vezes de IL-8 não marcada, à radioactividade total. Na Figura 2 mostram-se os resultados líquidos ou específicos da reacção de ligação da IL-8 iodada a neutrófilos, representando, cada ponto, a média ± o erro padrão de média (EPM) de três experiências independentes. Os resultados mostram que as suspensões de neutrófilos , contendo receptores de IL-8, se ligam à IL-8 iodada numa reacção específica e não saturável. B. Ensaios de Inibição (1) Anticorpos Policlonais anti-Pep-1 A ligação de IL-8 iodada ao local de interacção de receptor da IL-8 em neutrófilos, foi confirmada realizando ensaios de inibição com anticorpos policlonais anti-Pep-1 preparados no Exemplo 3. A IL-8 foi iodada como se descreveu em A, como anteri-ormente, e misturaram-se, separadamente, concentrações crescentes da IL-8 marcada, compreendidas entre 3 x 10“10 M e 1 x 10”9 M, com 2 mg/ml de anticorpo policlonal anti-Pep-1 para formar uma mistura de imuno-reacção que foi mantida a 37 °C durante 30 minutos. Prepararam-se fragmentos FAB dos anticorpos anti-Pep-1 e avaliaram-se também nos ensaios de inibição seguindo o mesmo procedimento. Os fragmentos Fab foram preparados a partir de soros usando os protocolos do fabricante e o conjunto de preparação, para a preparação de Fab, Immunopure (Pierce Chemical Co., Rock-ford, IL, E.U.A.).neutrophil bound IL-8. The total radioactivity associated with the cells was determined by gamma counter detection. Specific binding of the cell associated IL-8 was calculated by subtracting the cell-associated radioactivity which resulted in mixtures maintained in the presence of a 100-fold molar excess of unlabeled IL-8, at the total radioactivity. The net or specific neutrophil iodinated IL-8 binding reaction results are shown in Figure 2, each dot representing the mean ± SEM of three independent experiments. The results show that neutrophil suspensions, containing IL-8 receptors, bind to iodinated IL-8 in a specific and unsaturated reaction. B. Inhibition Assays (1) Anti-Pep-1 Polyclonal Antibodies The binding of iodinated IL-8 to the IL-8 receptor interaction site on neutrophils was confirmed by performing inhibition assays with anti-Pep-1 polyclonal antibodies prepared in Example 3. IL-8 was iodinated as described in A as above, and increasing concentrations of the labeled IL-8, ranging from 3 x 10- 10 M to 1 x 10- 9, were mixed separately. M, with 2 mg / ml of anti-Pep-1 polyclonal antibody to form an immunoreaction mixture which was maintained at 37 ° C for 30 minutes. FAB fragments of anti-Pep-1 antibodies were prepared and also evaluated in the inhibition assays following the same procedure. Fab fragments were prepared from sera using the manufacturer's protocols and the preparation kit for the preparation of Fab, Immunopure (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, U.S.A.).

Após o período de manutenção, as misturas de imuno-reacção foram misturadas, separadamente, com alíquotas de 2 x 106 neutró-filos/ml, preparados no Exemplo 1, para formar uma mistura de imuno-reacção celular. A mistura resultante foi mantida como nos ensaios de ligação da IL-8. A reacção de ligação foi terminada como anteriormente se descreveu. A ligação específica da IL-8 ao local de interacção de re-After the maintenance period, the immuno-reaction mixtures were separately mixed with aliquots of 2 x 106 neutrophils / ml prepared in Example 1 to form a mixture of cellular immuno-reaction. The resulting mixture was maintained as in the IL-8 binding assays. The ligation reaction was terminated as previously described. The specific binding of IL-8 to the re-

73 116 SCKF Case 217.1POR -42-73 116 SCKF Case 217.1GB -42-

mento com anticorpos policlonais anti-Pep-1, foram calculados como se descreveu em A. A ligação da IL-8 ao local de interacção de receptor da IL-8 em neutrófilos foi inibida por tratamento, quer com anticorpos anti-Pep-1 intactos quer com fragmentos Fab anti-Pep-1, para todas as concentrações de IL-8 iodada avaliadas no ensaio, como se mostra na Figura 2. Os resultados indicam que os anticorpos policlonais dirigidos contra a sequência de resíduos de aminoácido 50-67 da IL-8, Pep-l, são eficazes na ligação ao local activo na IL-8, evitando deste modo a ligação da IL-8 ao local de interacção de ligando da IL-8 (receptor) em neutrófilos. (2) Anticorpos Policlonais anti-Peo-1 e anti-Peo-3 Purificados por Imuno-afinidade Determinou-se também a capacidade de composições de anticorpos anti-IL-8 e purificadas por imuno-afinidade, preparados no Exemplo 3D, em inibirem a ligação de IL-8 a neutrófilos contendo receptores de IL-8. Para os ensaios de inibição, os neutrófilos foram isolados como se descreveu no Exemplo 1. Os ensaios de inibição foram realizados misturando primeiramente alíquotas separadas de neutrófilos, numa concentração de 1 x 10^ células/ml, com 50 /xg/ml de fragmentos Fab de anticorpos anti-Pep-1 e anti--Pep-3, purificados por imuno-afinidade, para formar misturas anticorpo-célula. Os fragmentos Fab foram preparados como se descreveu no passo (1) anterior. Neste ensaio testaram-se também o anti-IL-8 e um anticorpo de controlo, anti-ll-29. As misturas resultantes foram mantidas, durante 5 minutos a 37°c, antes da adição de aproximadamente 10 μΐ de -^^^I-IL-8, a 40 000 cpm, preparada como se descreveu no Exemplo 5A. As misturas contendo IL-8 foram depois mantidas durante 30 minutos a 37°C, para permitir que a IL-8 se ligue aos receptores da IL-8 em neutrófilos, se o local de ligação de receptor da IL-8 não estivesse bloqueado pelos anticorpos testados.anti-Pep-1 polyclonal antibodies were calculated as described in A. The binding of IL-8 to the IL-8 receptor interaction site on neutrophils was inhibited by treatment with either intact anti-Pep-1 antibodies either with anti-Pep-1 Fab fragments, for all concentrations of iodinated IL-8 evaluated in the assay, as shown in Figure 2. The results indicate that polyclonal antibodies directed against the amino acid residue sequence 50-67 of IL -8, Pep-1, are effective at binding to the active site on IL-8, thereby preventing the binding of IL-8 to the IL-8 (receptor) ligand interaction site on neutrophils. (2) Immuno-Affinity Purified Anti-Peo-1 and Anti-Peo-3 Polyclonal Antibodies The ability of anti-IL-8 and immuno-affinity purified antibody compositions, prepared in Example 3D, to inhibit the binding of IL-8 to neutrophils containing IL-8 receptors. For the inhibition assays, neutrophils were isolated as described in Example 1. Inhibition assays were performed by first mixing separate aliquots of neutrophils at a concentration of 1 x 10 4 cells / ml with 50æg / ml of Fab fragments of anti-Pep-1 and anti-Pep-3 antibodies, purified by immunoaffinity, to form antibody-cell blends. The Fab fragments were prepared as described in step (1) above. In this assay anti-IL-8 and a control antibody, anti-IL-29, were also tested. The resulting mixtures were maintained for 5 minutes at 37 ° C prior to the addition of approximately 10 μl of IL-8 at 40,000 cpm, prepared as described in Example 5A. The IL-8-containing mixtures were then maintained for 30 minutes at 37 ° C to allow IL-8 to bind to IL-8 receptors on neutrophils if the IL-8 receptor binding site was not blocked by the IL-8 receptors. antibodies tested.

As células foram depois centrifugadas, através de uma mistura de óleos de silício, durante 15 minutos, como se descreveu no Exemplo 5A. A radioactividade no sobrenadante resultante e no se-The cells were then centrifuged through a mixture of silicon oils for 15 minutes as described in Example 5A. The radioactivity in the resulting supernatant and the

73 11673 116

SCRF Case 217.1P0R -43- dimento foi depois medida por detecção gama. A ligação específica, associada a células, da IL-8 aos neutrófilos, foi calculada como se descreveu no Exemplo 5A, com a excepção de se ter usado um excesso molar de 200 vezes de IL-8 não marcada para calcular a ligação não específica. A percentagem de inibição foi depois determinada pelo cálculo da diferença entre a ligação específica associada às células na presença e na ausência de anticorpos adicionados.SCRF Case 217.1P0R -43- was measured by gamma detection. The cell-specific binding of IL-8 to neutrophils was calculated as described in Example 5A, except that a 200-fold molar excess of unlabeled IL-8 was used to calculate non-specific binding. The percent inhibition was then determined by calculating the difference between the specific binding associated with the cells in the presence and absence of added antibodies.

Na Figura 3 mostram-se os resultados dos ensaios de inibição, nos quais ambos os anticorpos anti-IL-8 e anti-Pep-1 inibiram completamente a ligação da IL-8 iodada aos receptores de IL-8 em neutrófilos. o anticorpo anti-Pep-3 era aproximadamente 100% eficaz. Não se observou inibição com o anticorpo de controlo, 11--29. Os resultados indicaram que os anticorpos policlonais purificados por imunoafinidade, Pep-1 e Pep-3, dirigidos contra a sequência de resíduos de aminoácido 50-67 e contra a sequência de resíduos de aminoácido 3-20, respectivamente, da IL-8, eram ambos eficazes na ligação ao local activo da IL-8, evitando, deste modo, a ligação da IL-8 aos receptores da IL-8 em neutrófilos. (3) Anticorpos Monoclonais anti-Pep-1The results of the inhibition assays in which both the anti-IL-8 and anti-Pep-1 antibodies completely inhibited the binding of iodinated IL-8 to IL-8 receptors on neutrophils are shown in Figure 3. the anti-Pep-3 antibody was approximately 100% effective. No inhibition was observed with the control antibody, 11--29. The results indicated that immunoaffinity purified polyclonal antibodies, Pep-1 and Pep-3, directed against the amino acid residue sequence 50-67 and against the amino acid residue sequence 3-20, respectively, of IL-8, were both effective at binding to the active site of IL-8, thereby avoiding the binding of IL-8 to IL-8 receptors on neutrophils. (3) Anti-Pep-1 Monoclonal Antibodies

Os anticorpos monoclonais anti-Pep-1 purificados, preparados no Exemplo 4, foram também avaliados como inibidores competitivos da ligação da 125l-IL-8, no local de interacção de receptor da IL-8 em neutrófilos, em ensaios realizados como se descreveu para os anticorpos policlonais. 6. Inibição da Activacão de Neutrófilos com Anticorpos de Polinéptido Sintético Relacionado com a IL-8 A. Anticorpos policlonais anti-Pep-1The purified anti-Pep-1 monoclonal antibodies prepared in Example 4 were also evaluated as competitive inhibitors of 125β-IL-8 binding at the site of IL-8 receptor interaction in neutrophils in assays performed as described for the polyclonal antibodies. 6. Inhibition of Neutrophil Activation with IL-8 Related Synthetic Polynucleotide Antibodies A. Anti-Pep-1 Polyclonal Antibodies

Os anticorpos policlonais anti-Pep-1, preparados no Exemplo 3, foram avaliados pela sua capacidade em inibirem a activação de neutrófilos, medida pela mobilização de cálcio realizada como no Exemplo 2.A.(2). 0 Pep-1, preparado no Exemplo 1, foi misturado com anticorpos policlonais anti-Pep-1, para formar uma mistura de imuno-reacção de péptido como se descrevu no Exemplo 5A. Mistu- 73 116Anti-Pep-1 polyclonal antibodies prepared in Example 3 were evaluated for their ability to inhibit neutrophil activation as measured by the calcium mobilization performed as in Example 2.A. (2). Pep-1, prepared in Example 1, was mixed with anti-Pep-1 polyclonal antibodies to form a peptide immunoreaction admixture as described in Example 5A. Mistu- 73 116

PP

SCRF Case 217.1POR -44-rou-se uma allquota de neutrófilos Isolados exprimindo o receptor da IL-8, preparada no Exemplo 1, com a mistura Pep-l/anti-Pep-1, e manteve-se como se descreveu no Exemplo 2.A. (2). A mistura foi submetida a fluorometria para medição de mobilização de cálcio, realizada como se descreveu no Exemplo 2.A.(2).An isolated allus of neutrophils was expressed by expressing the IL-8 receptor prepared in Example 1 with Pep-1 / anti-Pep-1 mixture, and maintained as described in Example 2.A. (2). The mixture was subjected to fluorometry for measurement of calcium mobilization, performed as described in Example 2.A. (2).

Os anticorpos policlonais anti-Pep-1 inibiram a mobilização do cálcio induzido pelo Pep-1, tal como se mostra na Figura l. Os resultados indicam que os anticorpos policlonais dirigidos contra a sequência de resíduos de aminoácido 50-67 da IL-8, Pep-1, são eficazes na ligação ao local activo da IL-8, evitando deste modo, a ligação da IL-8 ao local de interacção de receptor da IL-8 em neutrófilos e evitando a consequente activação de neutrófilos medida por mobilização de cálcio. B. Anticorpos Monoclonais anti-Pep-1Anti-Pep-1 polyclonal antibodies inhibited the mobilization of Pep-1-induced calcium, as shown in Figure 1. The results indicate that polyclonal antibodies directed against the amino acid residues 50-67 of IL-8, Pep-1, are effective at binding to the active site of IL-8, thereby preventing the binding of IL-8 to site of interaction of IL-8 receptor on neutrophils and avoiding the consequent activation of neutrophils measured by calcium mobilization. B. Anti-Pep-1 Monoclonal Antibodies

Os anticorpos monoclonais anti-Pep-1 purificados, preparados no Exemplo 4, foram também avaliados pela sua capacidade em inibirem a activação de neutrófilos em ensaios de mobilização de cálcio. Os ensaios são realizados como se descreveu para os anticorpos policlonais no ponto A anterior.The purified anti-Pep-1 monoclonal antibodies prepared in Example 4 were also evaluated for their ability to inhibit neutrophil activation in calcium mobilization assays. Assays are performed as described for the polyclonal antibodies at point A above.

Embora o presente invento tenha sido agora descrito em termos de certas concretizações preferidas, e exemplificado relativamente a estas concretizações, um perito na arte entenderá que se podem fazer várias modificações, variações, omissões e substituições, sem sair do espírito do presente invento. Deste modo, pretende-se que o presente invento seja apenas limitado pelo âmbito das reivindicações seguintes.Although the present invention has now been described in terms of certain preferred embodiments, and exemplified with respect to these embodiments, it will be understood by one skilled in the art that various modifications, variations, omissions and substitutions may be made without departing from the spirit of the present invention. Accordingly, it is intended that the present invention be limited only by the scope of the following claims.

Claims (11)

73 116 SCRF Case 217.1P0R -45- REIVINDICAÇÕES 1 - Processo de preparação de um análogo polipéptido do local de interacção do receptor da interleucina-S (IL-8), que interactua com o receptor, possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula: Cis-Leu-Asp-Pro-Lis-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg-Val-Val-Glu--Lis-Fe-Leu-Lis, caracterizado por se adicionarem sequencialmente os resíduos de aminoácido à cadeia peptídica em crescimento, estando o terminal amino ou o terminal carboxilo protegido com um grupo protector selectivamente removível, adequado, até se ter preparado o análogo polipeptídico desejado.A method of preparing a polypeptide analog of the receptor interacting site of interleukin-S (IL-8), which interacts with the receptor, having an amino acid residue sequence corresponding to The present invention provides a process for the preparation of a compound of the formula: ## STR1 ## in which the amino acid residues are sequentially added to the the amino terminus or carboxyl terminus being protected with a suitable selectively removable protecting group until the desired polypeptide analogue has been prepared. 2 - Processo de preparação de um anticorpo monoclonal que imunorreage com o local de interacção do receptor de IL-8 e com um análogo de polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula: Cis-Leu-Asp-Pro-Lis-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg-Val-Val-Glu--Lis-Fe-Leu-Lis, caracterizado por se cultivar um hibridoma, obtido por fusão de uma célula de mieloma, ou de outra linha de células auto-perpetuadas, com uma célula produtora do anticorpo, num meio nutriente adequado, sob condições e por um período de tempo adequados para que o hibridoma segregue as moléculas de anticorpo para o meio, recolha do meio contendo o anticorpo e isolamento do anticorpo.A method of preparing a monoclonal antibody which immunoreacts with the IL-8 receptor site of interaction and with a polypeptide analogue having an amino acid residue sequence corresponding to the formula: Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu -Asn-Trp-Val-Gln-Arg-Val-Val-Glu-Lys-Fe-Leu-Lys, characterized by culturing a hybridoma obtained by fusing a myeloma cell, or other auto- and maintained with an antibody producing cell in a suitable nutrient medium under conditions and for a period of time suitable for the hybridoma to secrete the antibody molecules into the medium, to collect the medium containing the antibody and to isolate the antibody. 3 - Processo para a detecção da presença de IL-8 num fluido corporal, caracterizado por compreender os passos de: (a) misturar uma alíquota de fluido corporal com uma composição de anticorpo que imunorreage com um segmento do terminal carboxi de IL-8 possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula: Cis-Leu-Asp-Pro-Lis-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg-Val-Val-Glu- -Lis-Fe-Leu-Lis, (b) manter a referida mistura de imunorreacção sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo suficienteA method for detecting the presence of IL-8 in a body fluid comprising the steps of: (a) mixing an aliquot of body fluid with an antibody composition that immunoreacts with a carboxy-terminal segment of IL-8 having a sequence of amino acid residues corresponding to the formula: Cis-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg-Val-Val-Glu-Lys-Fe-Leu-Lys, maintaining said immunoreaction admixture under biological assay conditions for a sufficient period of time 73 116 SCRF Case 217.1POR -46- para formar um produto de imunorreacção; e (c) detectar a presença do referido produto de imunorreacção e assim a presença de IL-8.To form an immunoreaction product; and (c) detecting the presence of said immunoreaction product and thus the presence of IL-8. 4 - Processo de produção de um sistema de diagnóstico sob a forma de conjunto de diagnóstico para determinação da presença de um local de interacção com o receptor de IL-8, caracterizado por se embalar, numa quantidade suficiente para realizar pelo menos uma determinação: (a) uma anticorpo que compreende uma molécula de anticorpo que imunorreage com um segmento do terminal carboxi de IL-8 possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula: Cis-Leu-Asp-Pro-Lis-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg-Val-Val-Glu--Lis-Fe-Leu-Lis, (b) um marcador para indicação da presença de moléculas de anticorpo no produto de imunorreacção formado.A method of producing a diagnostic system in the form of a diagnostic set for determining the presence of a site of interaction with the IL-8 receptor, characterized in that it is packaged in an amount sufficient to achieve at least one determination: ( a) an antibody comprising an antibody molecule which immunoreacts with a carboxy terminal segment of IL-8 having an amino acid residue sequence corresponding to the formula: Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val -Gln-Arg-Val-Val-Glu-Lys-Fe-Leu-Lys, (b) a label for indicating the presence of antibody molecules in the formed immunoreaction product. 5 - Processo de preparação de uma composição terapêutica adequada para a prevenção de inflamações, caracterizado por se associar um anticorpo que imunorreage com (a) o local de IL-8 que interactua com o receptor e (b) um análogo de polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula: Cis-Leu-Asp-Pro-Lis-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg-Val-Val-Glu- -Lis-Fe-Leu-Lis, ou seus equivalentes biológicos, com um excipiente farmaceu-ticamente aceitável.A method of preparing a therapeutic composition suitable for the prevention of inflammation characterized in that an antibody is immunoreacted with (a) the site of IL-8 interacting with the receptor and (b) a polypeptide analog having a sequence of amino acid residues corresponding to the formula: Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg-Val-Val-Glu-Lys-Fe-Leu-Lys, or their biological equivalents, with a pharmaceutically acceptable excipient. 6 - Processo de preparação de um polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula: LisGluLeuArgCisGlnCisIleLisThrTirSerLisProFeHisProHis caracterizado por se adicionarem sequencialmente os resíduos de aminoácido à cadeia peptídica em crescimento, estando o terminal amino ou o terminal carboxilo protegido com um grupo protector selectivamente removível, adequado, até se ter preparado o análogo polipeptídico desejado. SCRF Case 217.1P0R -47- R*v s*PA process for the preparation of a polypeptide having an amino acid residue sequence corresponding to the formula: LysGluLeuArgCisGlnCisIleLisThrTirSerLisProFeHisProHis characterized in that the amino acid residues are sequentially added to the growing peptide chain, the amino terminus or the carboxyl terminus being protected with a selectively removable protective group , until the desired polypeptide analogue has been prepared. SCRF Case 217.1P0R -47- R * v s * P 7 - Processo de preparação de um anticorpo monoclonal que imunorreage com IL-8 e com vim polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula: LisGluLeuArgCisGlnCisIleLisThrTirSerLisProFeHisProHis caracterizado por se cultivar um hibridoma, obtido por fusão de uma célula de mieloma, ou de outra linha de células auto-perpetuadas, com uma célula produtora do anticorpo, num meio nutriente adequado, sob condições e por um período de tempo adequados para que o hibridoma segregue as moléculas de anticorpo para o meio, recolha do meio contendo o anticorpo e isolamento do anticorpo.A method of preparing a monoclonal antibody which immunoreacts with IL-8 and polyimidazole having a sequence of amino acid residues corresponding to the formula: LysGluLeuArgCisGlnCisIleLisThrTirSerLisProFeHisProHis characterized by culturing a hybridoma obtained by fusing a myeloma cell or another self-perpetuating cell line with an antibody producing cell in a suitable nutrient medium under conditions and for a period of time suitable for the hybridoma to secrete the antibody molecules into the medium, collection of the medium containing the antibody, and isolation of the antibody. antibody. 8 - Processo para a detecção da presença de IL-8 numa amostra de fluido corporal, caracterizado por compreender os passos de: (a) misturar uma alíquota de fluido corporal com um anticorpo que imunorreage com um segmento do terminal amino de IL-8 possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula: LisGluLeuArgCisGlnCisIleLisThrTirSerLisProFeHisProHis para formar uma mistura de imunorreacção? (b) manter a referida mistura de imunorreacção sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo suficiente para formar um produto de imunorreacção; e (c) detectar a presença do referido produto de imunorreacção e assim a presença de IL-8.A method for detecting the presence of IL-8 in a body fluid sample comprising the steps of: (a) mixing an aliquot of body fluid with an antibody that immunoreacts with an amino-terminal segment of IL-8 having a sequence of amino acid residues corresponding to the formula: LisGluLeuArgCisGlnCisIleLisThrTirSerLisProFeHisProHis to form an immunoreaction mixture? (b) maintaining said immunoreaction admixture under biological assay conditions for a period of time sufficient to form an immunoreaction product; and (c) detecting the presence of said immunoreaction product and thus the presence of IL-8. 9 - Processo de produção de vim sistema de diagnóstico sob a forma de conjunto de diagnóstico para determinação da presença de IL-8 numa amostra, caracterizado por se embalar, numa quantidade suficiente para realizar pelo menos uma determinação: (a) um anticorpo que compreende uma molécula de anticorpo que imunorreage com um segmento do terminal amino de IL-8 possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula: LisGluLeuArgCisGlnCisIleLisThrTirSerLisProFeHisProHis, e (b) um marcador para indicação da presença de moléculas -48- 73 116 SCRF Case 217.1POR de anticorpo no produto de imunorreacção formado.A diagnostic system for determining the presence of IL-8 in a sample, characterized in that it is packaged in an amount sufficient to effect at least one determination: (a) an antibody comprising an antibody molecule which immunoreacts with an amino-terminal segment of IL-8 having an amino acid residue sequence corresponding to the formula: LysGluLeuArgCisGlnCisIleLisThrTirSerLisProFeHisProHis, and (b) a marker for the presence of molecules -48- 73 116 SCRF Case 217.1 antibody to the immunoreaction product formed. 10 - Processo de preparação de uma composição terapêutica adequada para a prevenção de inflamações, caracterizado por se associar um anticorpo que imunorreage com (a) IL-8 e (b) um polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula:A method of preparing a therapeutic composition suitable for the prevention of inflammation, characterized in that an antibody which immunoreacts with (a) IL-8 and (b) a polypeptide having an amino acid residue sequence corresponding to the formula: ou seus equivalentes biológicos, com um excipiente farmacêuticamente aceitável. Lisboaor their biological equivalents, with a pharmaceutically acceptable excipient. Lisbon '11. SET 1991 Por THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE =0 AGENTE 0FICIAL='11. SET 1991 By THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE = 0 0FICIAL AGENT =