PT98382A - Processo para a preparacao de uma vacina que contem uma proteina de calsse ii da membrana exterior de neisseria meningitidis - Google Patents

Description

ANTECEDENTES DO INVENTO O compIsKO de proteína da membrana exterior COMPC) de Meisserla meningitidis é utilizado como um veículo imunolégico em vacinas para utilização em humanos* 0 OMPC consiste em vesículas contendo uma variedade de proteínas assim como lípidos membrana-sos, incluindo lipopolissacãridos CLPS ou endotoKina}, 0 OMPC tens a propriedade de aumento imune* e quando um antigénio é quimicamente acoplado a ele, resulta numa resposta de anticorpo aumentada ao antigénio* 0 OMPC é currentemente utilizado em vacinas para recém-nascidos humanos contra agentes infec— ci0305 tais como Haemophilus influenzae, e torna os recém-nascidos capazes de produzir uma IgS e uma resposta de memória imune ao fosfato de polirribosil ribital (PRP5 de H. influenzae, quando o PRP estás quimicamente ligado ao OMPC* 0 OMPC é uma mistura de uma variedade de proteínas e lípidos5 e não foi conhecido qual o componente ou componentes do OMPC que conferem o efeito benéfico de intensificação imune aos antigénios acoplados, Contudo, alguns dos aspectos potencialmente negativos de utilização do OMPC em vacinas humanas incluem reacçBes relacionadas com LPS tais como febre, choque entíotóKico, hipotensão, neutropenia, activação da via de complemento alternativa, coagulação intravascular e possível morte,

Além disso, os conjugados de OriPC-antigénio são bastante heterogéneos visto que o antigénio se pode tornar conjugado a qualquer uma das porçSes de proteína que constituem o OMPC»

PB3ECTIVQS DO INVENTO

LiiTiíS É um objectiva do presente invento proporcionar

proteína de Classe II subsiancia1mente pura, a principal proteína imunointensificadora <MIEP> derivada directamente a partir da membrana exterior de Meisseria meningitidis. livre de outros componentes de membrana exterior de Meisseria meninqitidis. É um outro objectivo do presente invento proporcionar MIEP recombinan-is substancialmente pura da membrana exterior de Heisseria meninqititiis, produsida numa célula hospedeira recombinante. completamente livre de todas as outras proteínas de Meisseria meningitldis. Um objectivo adicional do presente invento é o de proporcionar uma proteína de imunoveículo eficac para a intensificação de uma resposta imune aos antigénios, compreendendo quer WEP purificada directamente a partir da membrana exterior de Meisseria meningitidis. quer i*fIEP recombinante de Meisseria meninqitíriis produsida numa célula hospedeira recombinante. Um outra objectivo do presente inventa é o de proporcionar uma proteína que possua actividads mitogénica imune, compreendendo quer MIEP purificada directamente a partir da membrana exterior de Meisseria meningitiriis. quer MIE? recombinante de Meisseria meningitidis produsida numa célula hospedeira recombinante. Um objectivo adicional do presente invento é o de proporcionar CGfflDCsiçoes de vacina contendo quer a Μ.ΙΕΡ recombinsnte, quer a M1EP purificada directamente a partir da membrana exterior de Meisseria meniogitidis. Estes e outros objectivos tornar-se-ão evidentes a partir de. descrição seguinte. imBIQ.DQ......ir- mma [0 0 presente invento dis respeito ã principal proteína imunointensif icadora, de Classe II ClilEP) da membrana exterior de Meisseria meninqitidis. na forma substancialmente pura, livre de outras proteínas de membrana exterior de Meisseria meninaitidis cont aminantss e L?S= A MIE? do presente invento, quer purificada directamente a partir da membrana exterior de células de

Meisseria meninqitidis, quer derivada a partir de uma célula hospedeira recomfoinante produtora de MIEP reeombinante de Nslsseria mcnlnqitidis, possui actividade de veiculo imunolégioo e actividade mitogénics. A MIEP do presente invento, quando acoplada a um antigénio, á capas de imunaintensificação visto que a resposta do anticorpo ao antiqènio acoplado é aumentada ou o antigênio á transformado num antigénio ϊ-dependsnte que assegura a produção de imunoglobulinas da classe IgB. Os antiqênios que podem ser acoplados à MIEP do presente invento incluem proteínas virais, proteínas bacterianas e polissacáridos, péptidos sintéticos , outros antigènios imunagénicos, e antiqênios não imunoqéni-cos ou fracos0 .QESEWHQS,

Figura 1 -· As respostas dos anticorpos de recipientes de transferencia adoptivos, que receberam células da baço inoculadas separadamsnte com PRP-DT e MIEP, ou OMPC, ou ΣΑΑ-OMPC, foram medidas por ELISA em amostras de sangue tiradas nos dias indicados após imunização com PRP-OMPC .

Figura 2 - Ensaio de proliferação de linfócitos para a actividade initogánica da MIEP, in vibro, 0 ausenta de incorpora-çlo de '"‘H—timidina no DMA celular foi medido a seguir à exposição das células a albumina de saro de bovina CBSA), PRP-OMPC, OMPC, MIEP ou CNBr„

Figura 3 - Os conjugados PRP-MIEP foram testados quanto â imunogenicidade em ratinhos assim como em macacos Rhssus recém-nascidos, As respostas dos anticorpos foram medidas por ELISA e RIA,

Satae-se que certas substâncias que por elas próprias induzem uma resposta imune que consiste somente a?a anticorpos de classe Igil e nenhuma memória» podam sar transformadas em antigé-nios totalmente imunogénicos que induzem anticorpos IgG e íçM assim como memória» por acoplamento químico a uma substância fortemente aniigénica ícélula—T dependente)Este fenómeno imunológico é denominado por “efeito de veículo”s enquanto que a porção não imunogênioa ou fraca» e a substância íortemenis antigènica são denominados "hapteno” e “veículo”,. respectivamen-te» A injecçlo do complexo hapteno-veículo num animal resultará na formação de anticorpos por linfócitos-B» alguns dos quais ssrao específicos para» e ligar-se-ão ao hapieno» s outros que serão específicos para» e ligar-se-ão ao veículo» Um aspecto adicional do efeito de veículo ê o de que após uma exposição subsequente ao complexo hapteno-veículo, sucederá uma resposta de anticorpo vigorosa ao hapteno» Isto é denominado uma memória ou resposta anamnést i ca = 0 efeito de veículo parece envolver funções mediadas por certos linfóeiios-T» chamados “linfócitos-T auxiliares”. ft molécula de veiculo estimula o Iinfócíto-Τ auxiliar a ajudar» de certa forma» a formação de 1intácitos—8 produtores de anticorpos de classe 1§B anti-haptsno e de uma resposta de memória»

Os linfócitos-T auxiliares estão normaLmente envolvidos na produção» por 1infócitos-B» ds anticorpos específicos para um certo tipo de antigénios» denominados antigénios "T-dependentes”, mas não para outros antigénios denominados antigénios ”T-indepsn--dentes”» Uma molécula de veículo pode converter u#n hapteno - 6 - T—independentes fraca ou não imunoaénico numa molécula T-depen-dente fortemente antigénica» Além disso» uma resposta de memória saguir-se-á a uma exposição subsequente ao complexo hapteno-veí-cuId s consistirá primeiramente em Ig6, que é característica de antigénios T-dependentss e não de antigénios T~independsntes» A utilidade das moléculas de veiculo não está limitada á utilização com antigénios T--independentes mas pode também ser utilizada com antigénios T-dependentes. A resposta de anticorpo a um antigênio T--dependente pode ser intensificada por acoplamento do antigânio a um veículo» mesmo que o antigénio possa, por ele mesmo3 induzir uma resposta ds anticorpo»

Algumas outras moléculas têm a capacidade ds estimular, geralmentej todo o sistema imune» Estas moléculas são denominadas "mitogénios" s incluem proteínas de plantas assim como produtos de bactérias» Os mitogénios fazem proliferar as linfócitos—B s/ou Ϊ, s podem intensificar amplamente muitos aspectos da resposta imune incluindo fagocitos© aumentada, resistência aumentada á infecçlo, imunidade a tumor aumentada» e produção de anticorpos aumentada»

Muitos agentes causadores de doenças infscciosas podem, por eles próprios, induzir anticorpos protectores que podem ligar a matar, tornando-os inofensivos, ou podem causar a morta ou tornar inofensivo o agente causador de doenças s seus produtos secundários» A recuperação destas doenças resulta» usualmente, em imunidade de longa duração em virtude dos anticorpos protectores gerados contra os componentes allamente antigénicos do agente infeccicso»

Os anticorpos protectores são parte do mecanismo de defesa natural de humanos e de muitos outros animais, e são s

encontrados no sangue assim coma em outros tecidos s fluidos corporais, é a função principal, da maioria das vacinas. induzír anticorpos protectores contra agentes inf sedosos s/ou seus produtos secundários, sem causar doença. 0 OilPC de N. meningitidis tem sido utilizado, com sucesso, para induzir respostas de anticorpo em humanos quando o □MFC está quimicamente acoplado a antigénios independentes de células--"!', incluindo polissacáridos bacterianos. 0 QsIPC contém várias proteínas de membrana exterior bacterianas assim coiro lipidos bacterianos. Adicionalmente, o OMPC tem uma estrutura lipossómica tri-dimensional. A eficácia do OMPC como um veiculo imunológico pensou--se depender de uma ou mais das proteínas de membrana bacteria-nas. lipidos bacterianos, da estrutura lipossómica tri-dimensio-nal, ou de uma combinação de proteínas, lipidos, e estrutura lipossómica bacterianos. Os requerentes descobriram que uma das proteínas, MIEP, possui o veiculo imunológico e propriedades imunointensifiesdoras de vesículas de QHPC, e é eficaz na forma purificada, livre de outras proteínas s lipidos de membrana de N. meningitidis., e numa estrutura não vesicular tri-dimensional. Os requerentes também descobriram que a MIEP, quando quimicamente acoplada a um polissacárido bactsriano, funciona tão bem como o GMPC na indução de resposta de anticorpo ao polissacárida. Os-requerentes descobriram adicionalmente que a ΜϊEP é a proteína ds Classe II da membrana exterior de M. meningitidis. A proteína de Classe II de N. meningitidis é uma proteína ds porina EMurâkami, K., et al... í i989), Irrfeccion And ímmunity, 57, pgs» 2318-233. As porinas encontram-se na membrana exterior ds todas as bactérias 8ra.m-negat.ivas.

Embora d presente invento seja exemplificado pela πϊΕΡ de Njs._____meningitldis, á prontamente evidente àqueles peritos na

arte que qualquer proteína da membrana exterior de qualquer bactéria Sram-nsgativa, que tenha um veículo imunoiógico s actividade imunointensificadora, é abrangida pelo presente invento» Exemplos de bactérias Sram-nsgativas incluem mas nlo estão limitados a espécies dos géneros Nsisseria» Escherichta, Eseudomonas .s Haemapifilus» SalmonslIa, SMaMlâ.» iS2rdet^LlaP

Klebsiel la,, Serratia, Ysrsinia, Vibrio, s Enterobacter. A MIEP pode ser empregue para potenciar a resposta de anticorpo a materiais altamente anticénicos, fracamente antigéni-cos? e não antigênicos» Os termos "antigánio" e “material antigè-nica" que são utilizados aqui alternadamente incluem um ou mais agentes nlo viáveis, imunogènicos, fracaments imunogánicos, não imunogánicos, ou dessensibilisantes íantialérgicas) de bactérias, vírus» ou outras origens» 0 componente antigènico pode consistir num pó 5sco? numa fase aquosa tal como uma solução aquosa, ou numa suspensão aquosa e semelhantes» incluindo misturas dos mesmos, contendo um agente ou agentes nlo viáveis, imunogénicos, fracamente imunogénicos, não imunogenicos, ou dessensibilicantes» A fase aquosa pode convenientemente ser compreendida pelo material antigènico num liquido parentericamsnte aceitável» Por exemplo, a fase aquosa pode estar na forma de urna vacina em que o antigánio é dissolvido numa solução salina equilibrada, solução salina fisiológica, solução salina ts.n5pana.da com fosfato, fluidos de cultura de tecidos, ou outros meios em que passa ter crescido um organismo, A fase aquosa pode também conter conservantes s/ου substâncias convencianalmente incorporadas em preparações de vacina, As emulsões adjuvantes contendo an bi. génio conjugado a MIEP podem ser preparadas empregando técnicas bem conhecidas na arte»

'τ’ Ο antigánic» pode estar na forma de antigénio purificado ou parcialmente purificado incluindo, mas não limitada a, anligé-nios derivados de bactérias, vírus, fungos, rickettsiaii ou o antigénio pode ser um alerg-snio incluindo, mas não limitado a, pólens, poeiras» cinzas vulcânicas, ou exiractos dos mesmos; ou o antigénio pade estar na forma da um tónico ou um veneno incluindo, mas não limitado a, tóxicos ou venenos derivados de répteis ou insectos venenosos,. 0 antigénio pode também estar na forma de um péptido sintético, ou de um fragmento de um polipéptido maior, ou qualquer subporção de uma molécula ou componente derivado de bactéria, célula de mamífero,, fungo, vírus, rickettsia, alergé™ nio3 tóxico ou veneno,. Em todos os casos, os antígénios estarão na forma em que as suas propriedades tóxica s virulenta foram reduzidas ou destruídas s que quando introduzidos num hospedeiro adequado irão ou induzir imunidade activa pela produção nele de anticorpos contra as proteínas específicas, pépiidos, microorga-nisrnos, extractos, ou produtos de microorganismos utilizados na preparação do antigénio,, tóxicos, venenos, ou, no caso de alergé-nios, irão auxiliar no alívio dos sintomas da alergia devido ao alergênio específico,.

Os antigénios podem ser utilizados quer sozinhos quer em combinação., por exemplo, antígénios bacterianos múltiplos,, antigénios virais múltiplos, antígénios de mícoplasma múltiplos, antígénios de rickettsia múltiplos, toxóides de bactérias ou •vírus múltiplos, alerqéníos múltiplos, proteínas múltiplas, pépiidos múltiplos ou podem ser conjugados à MIEP combinações de qualquer dos produtos antecedentes»

Os antigénios de particular importância são derivados de bactérias incluindo, mas não- limitadas a B. pertussis, yâBsaSfiitâ-JmíIMmv e içterohaemarrhaqiag, S. paratyphi A e B, C,.. áitílillêLia®? C»__tetani,, Ç^_totuli,num, C, perfrinqens, C, feseri»

s outras bactérias de gangrena gasosa, ti anthracis, Y.__pestis,

PiL-JMlltocida:, V,,.....choiaraa, Neiss^j^neninaitidis, Wgpnp.rrheag. mmϊίmΩλλ^L·.lΠ2Júámzm.; X^gonsffia.....gallitiiuffi, e semelhantes; de células de mamíferos incluindo,; mas nio limitadas a células de tumor, células infectadas por vírus, células geneticamente construídas, células crescidas em cultura, entradas· de células ou tecidos, e semelhantes? de vírus incluindo, mas não limitados ao vírus linfotrépico T humano Ctipos múltiplos), vírus da imunodeficieneia humana (tipos s variantes múltiplos), poliovírus (tipos múltiplos),, adenovírus (tipos múltiplos), vírus parainflu-ensa (tipos múltiplas), sarampo, parotidite, vírus sinciciais respiratórios, vírus influsnea (tipos vários), tifo (SF„>, vírus de encsfalomielits equina Ocidental s Oriental, encefalomielite B„ japonesa, encefalomielite de primavera-verão Russa, vírus da peste porcina, vírus tia doença de Me&castle, varicela, raiva, sinomose canina e felina e vírus semelhantes, de rickettsias incluindo, mas não limitados aa tifo epidèmico e endémico ou outros membros do grupo da febre macuiosa (meningite cerebrospinal),; de vários venenos de aranha a cobra ou de quaisquer dos alergénios conhecidos, incluindo mas não limitados àqueles de erva-de-santiago Ctasneira)., pé de casa., extrsetos de pélens, pólens de erva, e semelhantes»

Os polissacàridos deste invento podem ser quaisquer poliss-acâridos bacterianos com grupos ácidos, mas não se pretende que estejam limitados a quaisquer tipos particulares, Exemplos de tais pol issacàridos bacterianos incluem pol Isssc áridos de Streptococcus pneumonias (pneumococos) dos tipos 6A, áB, 1ΘΑ, 1IA, 18C, 19A, 19f, 2®, 22F, e 23Fs Streptococcus Brupo B dos os polissacàridos tipos Ia, 1b, II e III? polissacárido de i-iasmophilus influencae sorotipo hg polissacàridos de Heisssria meningitidis serogrupos A, B, C, X, Y, W135 e 29E= e polissacàridos de Escherlchia coli Kl, K12, K13, K29 e Κ1ΘΘ,, Contudo,

particularmente preferidos, são aqueles polissacáridos capsularas selesesenados a partir do grupo consistindo em polissacàridos de H, influenzae sarotipo b, tais como descrito em Rosenberg et al., ãu Biol* Chem. , 236, 2845-2849 (1961) e Zamenhof et al«. ã. Biol. Chem», 2®3, 695-7Θ4 ÍÍ953Í» 0 polissacárido de Streptococcus pneumssniae ipneusococos) do tipo 6A ou do tipo 68, tais como descrito em Robbins et al, , Infeccion and Immunity, 26, NS 3 1116—1122 (Dezembro, 1979)p polissscârido de pneumococo do tipo 19F, tal como descrito em C» J» Lee et aL, Reviews of Infeccious Diseasss, 3, NQ 2, 323-331 C1981)§ s polissacárido de pnsumoooco tipo 23F, tal coma descrito em 0» Larm et al,, Adv. Carbohyd Chem and Biochem., 33, 295-321, ri« 3,; Tipson st al., ed«, Academic Press 1976« A MIEP pode ser purificada a partir do OMPC derivado de culturas de N» mertingitidis que crescem da maneira usual como descrito na Patente E.U.A, número 4459286 s na Patente E.LS.A. número 4830852» A purificação do OMPC pode ser feita de aoordo com o processo descrito n&. Patente E„U=A= número 4271147, 4459286, e 4830852. A MIEP pode também ser obtida a partir de DNA, reeoefoi-nartie construído em células hospedeiras por expressão do DMA reeamhinanie que codifica a MIEP = Q DMA que codifica a MIEP pode ser obtida a partir de células de N, meninaitidis EMurafcami, K«, gt aL, \1989), Infeccion And Immuiriity, 57, pgs. 23183, ou o DMA pode ser produzida sinteticamente utilizando técnicas de síntese de õNh padrão. 0 DMA que codifica a MIEP pode ser expresso em células hospedeiras recombinantes Incluindo, mas não limitadas a células de bactérias, leveduras, insectos, mamíferos ou de outros animais, dando MIEP recombinante» Os processos preferidos do presente invento para a obtenção de MIEP são a purificação de MIEP a partir de OMPC e a expressão de DMA recombinante do DMA que codifica a MIEP derivado de M. aeninoitidis.

A MIEP purificada í u í. preparada a part ir de VStoíCUl as de DMPC por lise com dodecil 5tf 1 f ato de sódio <BD5 / {jâs vesícul -¾ ~· seguida por electroforese em gel de SDS-poliacri1 amida (ΡΑΒΕ). Λ V*i MIEP foi eluída a partir do i. 5 dialisada conira U.ÍR t. ampao de pH elevado e concentrada» Gs processos padrão tíe electroforese em poliacrilamida pode© ser utilizados para purific ar a MIEP cuias de OHPC» I axs processos são descritos em . Mole: cu lar s A Laboratory Manua1 , Sambrook, J, et al., <19 89) , Cold

Spring Harijar Lafaaratory Press5 Mew York , e Current Protocols In Molecular Biology, (1987) Ausubel F. M. et al„„ editores Wiley and Sonsn New York.

Os processos padrão de eluicão de proteínas a partir de geles de SDS-poliacrilamida são descritos em Bunkapi1ler, M. e Lujan, E», <1986), Purification of Microaram Ouaniiiies of G tí"X§ v s by Po I y ac ry L& uixdw Ge· I otein Mi cr oc har SC teri (0d x T ton N.,J„ ^ Irf Cu Γ" ΟΓ- t Proto col .5>U DS X Fn M„, e t _ '1 edi tor 0S A MIEP pr epar atía aes ta DclFâ con j ugaçã Q «£ tó ntigéni s1uias de mamife ros, r icketts ia. r: mg os, pépt .idos. prot eínas3 DOÍ ítiqên XG b

Electraphoresis, em llsthods of X Τ.ΟΓ J. Shively > Humanna Press s in Mo1seu1ar tíiology <1987) Wiley and Sons, NcW V O r ti :: mans-ira esta prontamen te adequa™ derivados d e bac térias, virus* alergénios, tóxicos ou V snenos« i ssac á ridos, ou qualquer outro ft ΜItr recombinante pode ser preparada por expressão do DMA de N* meninqitidis genémico que codifica a ΜΪΕΡ em bactérias5 u -sm levedura, por exemplo, S. QS[! i*_ííBΧΙ

nòrnxco que cod; Utr !ns meninqxtidi p preparado para taçSo aleatória do DMA de 018V -Ξ-. técni ca de Mani c\ t i S s ! = , SC al. Ο 1 ona- Q por exemplo,, E, coli 1 Para se obter o DMA q é extractado a· oartir geíB qiAsr por τ ragcnei molecular seguida pel ( 1

Cell, 15, pg = 687¾ quer por clivagem com uma sndonuclesse de restrição pelo processo de Snsithiss, et_____ajU , <1978);= Science, 202« pg, 1248=, 0 DMA genésnico é então incorporado num vector de clonagem apropriado, por exemplo, fago lambda Ever Bainbroak, J« et aL, í'J.98?) , Molecular Cloninq, A Laboratory Manual, Cold I Spring Harbor Press, Msn YorkJ= Alternativamante, a técnica de reacção em cadeia de polimerase (PCR) (Psrkin Elmer) pode ser utilisada para amplificar as sequências de DMA especificas no DMA genémicD CRoux, et al =.· =, (1989), Biotechniques, 8, pg = 483= 0

tratamento PCR requer um oligonucleátido de DMA que possa hibri-) dar com as sequências de DMA especificas no DMA aenómico. A sequência de DMA dos oligonucleétidos de DMA que podem hibridar com DMA de MIEP no DMA genómico de N. meningitidis pode ser determinada a partir da sequência de aminoáeido de MIEP ou por referência à sequência de DMA determinada para a principal proteína de membrana de Classe II de N = meningitidis EMarakami, K», et al =,, (1989), Infeccion and Immunity, §7, pgs* 23183 = A MIEP recDiiibinante pode ser separada de outras proteí-nas celulares por utiiisaçSo de uma coluna de afinidade feita com anticorpos monDClcfsãis ou policlonais específicos para a MIEP» Estas colunas de afinidade são feitas por adição tios anticorpos a Affige!~i0 CBiorad), um suporte ds gel que è pré-activado com estéres de M-hidroxissuccinimida de modo que os anticorpos formem ligações covalsntss com o suporte de pérolas ds gel ds agarose» Os anticorpos sSo então acoplados so gel via ligaçSss amida com o braço sspaçador ,= Os ésteres activados restantes, são então destruídos com etanolamina HC1 í II ípH 8), A coluna é lavada com água seguido por glicina HC1 ©,23 M ÍpH 2,6) para remover qualquer anticorpo não conjugado ou proteína estranha» A coluna ê então equilibrada em solução salina tamponada com fosfato ( pH /,3) e os sobranadantes ds cultura de células ou extractos de células contendo MIEP são passados lentamente através da coluna»

1 4 A coluna é então lavada com solução salina tamporiada com fosfato até que a densidade áptica tftoq(.A> caia para a de fundo, então a proteína é eluída com glieina-HCl 0S23 Μ ipH 2,,6), A proteína é então dialisada contra solução salina tamponada com fosfsta.

Os conjugados do presente invento podem ser quaisquer conjugados. polissacárido-MIEP estáveis acoplados através de espanadores bigenéricos contendo um grupo tioáter s uma amina primária,, que formam ligações covalent.es hidroliticamente lábeis com o polissacérido e a rsIEP„ Contudo,, conjugados preferidos de acordo com este inventos são aqueles que podem ser representados pelas férmulass Fs—A—E—S-B-Pro ou Ps-A'-S-E'-B'~Pro, em que Ps representa um polissacáritio^ Pro representa a proteína bacterlana MIEPs e A-E—S~B e A'-S~E'-B' constituem espanadores bigenéricos flue contfm ligações tioéter covalentes hidroliticamsnte estáveis,, e que formam ligações covalentes ítais coiuq ligações amida ou éster hidroliticamente lábeis) com as roacromoléculas,, Pro e Ps Ha espaçador';, A—E—S—8s S é enxofre $ E á o produto de transformação de um grupo tiofilico que foi feito reagir com um grupo tiol =, s è representado por

OR II I —CCH—, em que R é H ou CHT,, e p é 1 a 3; A é m -cAcch_.) CH_,) r(CH^) -MH ·· m v n

. r: 15 em que W ê 0 ou NH 5 m é Θ a 45 π é ^ w. -5 ? ts V è CK- ? 0 5 S,NR OU UHLO-Η n onde C* *" Λ 2 \ GT H ou. aíqux Io C_. OU ϋ,-. ta! que se Y fo !" CH._ então quer ra qu.er n r*cU-i podem ser iguais a Ξ5Π 3 5 e se v for 0 au. S, então m ώ maior do que i e n é maior do que 15 e 3 É - C CH.-e) CH^CH^) D“

JÍ. Dr Z C £fjf| C] J 0 C[- 2, Zé NH„, NHCR', COOH,

□u ti f onoe rc O | li BU N--L íUH,-, ::::--::1 OiuO W!3 f ΧΠ 1. wOS aC XCf--~'X w X-· 'à IX:

Depois na sspaçador, A"~S—E''~B’ 5 S é enxofrep A:

W li i 1 ·= e K‘ -CNHCH„) R -iú' â em que a e

é OH.-,, uU HOY ' ϊ ^ fíICCH C 'CH._) „ -- P ' onde Ϋ ’ ô ou tir iCOR' 5 e W 5 p e R' são como defen tíos bcx ma5 s P -· ώ d produto de trans' formaçlo de um grupo tiofil ca que foi f ei to reagir com um grupo tiol, e #

representada por —uH—, em que R é como defenido acima, e E?J

0 !S

ο

Ν- Ο Ο Β' é -(Q-U)^C-, em que ρ é i a 3» Adicionalmente, dos sspaçadorss higenèricos, A-E-B-8 e Α'-Β-Ε'-Β’ ds componentes E-B-B e Α'-Β-Ε1, são determináveis s quantifiçáveis, refíectindo esta identificação a covallíncia da ligação do conjugado ligando o lado do iíoéter de enxofre qus tem origem no polissacárido cavalentemente modificado com d lado do espaçador que tem origem na protsina "funciona lizada.

Então os conjugados,! Ps-A-E-E-B-Pro, ds acordo com este invento podem conter espaçadorss cujos componentes incluem derivados ds, inter a Há* dióxido de carbono, i,4-butanadiafflina, e S-carboximetil-N-acetil-homocisteína? dióxido de carbono, 1,5-~pentanodiamina, e S-carboximatil-N-acstil-hoíiíOcisieina? díókido de carbono, 3-OKa-Í ,'5-pentanodiamina, e S-carboximetil™ -N-acetxl-hocnocistsinas dióxido ds carbono, 1,4-~hutanod lamina, s S™csrboximet.il~N~acsiilcisteinas dióxido de carbono, 1,3-propano-diamina, e S-carboximetil-N-bensDil-homocisteína; dióxido ds carbono, 3-aza—i , S—pen t ano diamina, e S-carbo?-; imeti 1 -N-acet i 1 eis™ teinaj e dióxido de carbono, i,2-stanodíamina, glicina, e S-- <succin-2-i 1) -N-aceti1—homocisteína= Os conjugados, Ps-A' ~S™E' --Β'-Ργο, ds acordo com este invento, podem conter sspaçadorss cujos componentes incluem derivados de, inter alia; dióxido de carbono e S-carboximetilcisteaminag dióxido ds carbono e 8-a-carhoxiet.il >cisteaminag dióxido de carbono e

S-carbc3Kiínetil-honiocistsaminap dlóKido de carbono, S-ísuccin-2--ilIcisteamins, e glicinag e diéKido de carbono s S-carboKime-tilcisteína.

No processo do presente invento, o polissacárido está modificado cova lente-mente por (a) solubiIicagão num solvente orgânico nSo hidroKí1ico, depois <b> activação com um reagente bifuncional, (c) reacçlo deste polissacárido activado com um bis-nuclsófilo, e finalmente, se necessário, ainda (d) funciona-lização deste polissacárido modificado quer por reacçâo, (i) com um reagente gerador de sítios eisetroíilícos (por enemplo, tiolfílico) quer, íiií com um reagente gerador de grupos tio!„ A proteína é, reciprocaments, quer feita reagir (i) com um reagente gerador de grupos tiol quer (ii) com um reagente gerador de sítios tiolíílicos, depois o polissacárido modificado covalente-mente e a proteína funcionalizada slo feitos reagir conjuntamenta para formar o conjugado covalentemente ligado, estável, e a mistura final â purificada para remover polissacáritíos e proteínas que náo reagiram.. 0 processo deste invento inclui também a ssleeçlo de um mjicleófiia ou bis-nucieófilo que reagirá com o pol issacárido activado para formar um polissacárido modificado covalentemente com sítios electrofilicos pendentes ou grupos tiol pendentes, prevenindo assim â necessidade de adicionalmente funcionslizar o pol issacárido bis—nucleàf ,i. ia modificado antes de reagir ο pol issacárido covalentemente modificado com a proteína covalentemente modificada. A funcionalização da proteína para qualquer uma das formas de porções pode também ser realizada em ssais do que um passa de acordo com a selecçSo de reagentes nestes passos.

No primeiro passo com vista a modificar covalentemente o polissacárido, a polissacárido sólido tem de ser solubi1 içado .

Uma veg que os grupos hidraKilo alcoólicos nueleofil 1-cos de um polIssacárido nlo podem competir quimicamente para reagentes slectrofilicos com os nidroMilos da água numa solução aquosa, o golissacárido devia ser dissolvido em solventes não aquoso <não hidrosi1icos)= Os solventes adequados incluem dimeti 1formamida, dimetilsulfόκίαο, dimetilacetamida , formamida, N,N' -ctimetil imidacol idinona, e outros solventes apréticos, similarmente polares, preferivelmente dimeti1formamida,

Adicionalmente, á utilização destes solventes, a amónio, l-acabicicloCZ,2,23oc~ conversão dos polissacáridos (por eKempIe, os polissacáridos capsulares de H, influenzae tipo fa, que são polímeros de fosfato de rihose-ribitoi>, que tiro hidrogénios ácidos, tais como mono- e diésteres de ácido fosfórico, numa forma da sai apropriada, faz com que os polissacáridos se tornem prontamente solúveis nos solventes acima. Os hidrogénios acídicos nestas macromoléculas podem ser substituídos por catiSes hidrofóbicos, grandes, tais como tri- ou tatra-alquil<C1- a tano, í ?8-diaaabicicloC5.^[email protected] ou catiSes similares, pariicularmenie tri- ou tetra-alquil(C,- a C,~> amónio, e o tri- ou 1 ϋ tetra-alquilamónio resultante ou saís similares de polissacáridos fosforilados prontamente dissolvidos nos solventes acima a cerca de 17°-5e°C, enquanto agitados durante desde um minuto s. uma hora. 0 polissacárido de H, influenzae, serotipo B, parcial-mente hidrolisado foi convertido no sal de tetrabutilamómia, depois dissolvido em dimetiIsulfóKido (Egan et al,, J. ftmer« CheiTi, Soç,, 104, 2898 (1982)), mas este produto já nlo ê antigé-nico, e por conseguinte è inútil para a preparação de vacinas. Em contraste, os Requerentes realicarass a solubil icação de um polissacárido não hidrolisado, intacto, por passagem do polissacárido -através de uma resina de permuta catiónica ácida forte, na

forma de tetra-alquilamónio, ou por neutralização cuidadosa do polissacárido com hidróKido de ietra-alquilaménio, preferivelmente pelo procedimento anterior, e par conseguinte conservaram a viabilidade do polissacárido para utilização na vacina iffíunogénica.

Os passos subsequentes são então dirigidos para superar a outra limitação significativa.. f isica-química para fazer ligações covalentes a polissacáridos, sendo aquela a faltai de grupas funcionais nos polissacáridos, outros que não grupos hid γοκΙ lo5 que sao suficiente-mente reactivos com reagentes utilizados normal ou praticamente para a funcionalização de unidades com as quais é desejada a ligação. A activação do polissacárido para formar um polissacárido activado, raacção com his-nucleóflios para formar um polissacárido nucieòfilo funciona-lizado, s funcionalização com reagentes geradores quer de sitias electrofilicos quer de grupos tiols são todas dirigidas para modificar cova1entemente o polissacárido e desenvolver grupos funcionais no polissacárido em preparação para conjugação.

Na passo seguinte, α polissacárido solubilizado é activado por reacçao com um reagente Pifuncional a cerca de 0°“50OC5 enquanto agitada durante dez minutos a uma hora, com a razão de peso crucial de agente de activante para polissacárido no intervala de IsS a 1=12, No passado, esta activação foi realizada por reacçSo do polissacárido com brometo de cianogènio. Contudo, os derivados activados com brometo de cianogènio, que t'§m uma “proclividade" para diói-s vizinhos, mostraram estabilidade transitória durante diálise contra um tampão de fosfato. Por conseguinte, embora a activação com brometo de cianogènio seja ainda possivel de acordo com o presente invento, este reagente é fracsmenie utilizado na activação de polissacáridos e não é

preferido. Por outro lado, os reagentes bifuncionais preferidos para activação de polissacàrido incluem derivados do ácido 0

sS •7 _ *? "?t carbónico, H^-C-K", em que R s R~ podem ser indspendentemente azolilo, tal como imidazolilo? .haletos; ou ésteres de fenilo, tais como p-nitrofenilo, ou poli-nalofenilo* 0 earhaniltíiimidazol, um reagente particularmente preferido, reagirá com os grupos hidroxilo para formar imidazo-liluretancs do polissacàrido, e os cloroformatos de arilo incluindo, por exemplo, cioroformato de nitrofenilo, produzirão carbonatos misturados tío polissacàrido, Em cada caso, o polissa-cárido activado resultante é muito susceptivel a reagentes nucleoíilicos, tais como aminas, e é por conseguinte transformado nas uretanas respectivas. feito

Na fase seguinte, o polissacàrido activado é reagir com um reagente nuclsofilico, tal como uma amina.

Η H

particularmente diaminas, por exemplo, , ÍCH^YÍCH^hÍh , em qus m é $ a 4, n é 0 a 3S e Y é CH^5 0, 8, MR', CHCO^H, onde R' á H j ww. „· - t,· » «jr κπ cao ΠΙ a u ; *ão I 2, de modo que se r for CFIv- ou uai alquilCt ou 0. podem ser iguais a zero, s se Y for 0 ou 3, então m é maior ao qus 1 ;i e n é maior do qus 1, num grande excesso total ds amina (isto é, por exemplo, um excesso molar de 50 a 1ΘΘ vezes de amina vsrsus agente activante utilizado), A reacçlo é mantida num banho de gelo durante 15 minutos a uma hora depois mantida durante 15 minutos a uma hora a cerca de 17° a 4Θ°0,

Um polissacàrido activado, quando feito reagir com uma ai&mina, por exemplo, 1,4—butanodiamina, resultará num polissacá-rida em forma de ursiana com aminas pendentes, qus pode então ser funcionalizado adicionalmente por seilação. Os carbonatos 21 misturados reagirão também prontamente com diaminas para resultar ssi grupos amina pendentes» AIternslivamente, o paiissacárido activado pode ser feito reagir com um nucleófilo, tal como uma monD-haloacetamida de um diaminoaleano, por exemplo, 4--bromoacetamidabutilamina (ver, W» B. Lawson st ai», tioppe SeylsrJs Z.·, Physisl Cham»„ 549» 2Sí (1908)), para gerar um polissacárido modificado eovalenie-mente com sítios electrofilicos pendentes» Ou, d polissacárido activado pode ser feito reagir com um aminotiol, tal como cis-teamina Caminostanotiol) au cistsins, exemplos; ds derivados; que são bem conhecidos na arte ds síntese de pêptidos, para produzir um polissacárido com grupos tiol pendentes» Em ambos ds casos, não é necessária a funcionalizaçSo adicional antes do acoplamento do polissacárido modificado covalentemente à proteína "veículo” bacfceriana modificada» 0 ultimo passo na preparação do polissacárido, a funcionalisação adicional, se necessária, do polissacárido, pode tomar a forma de reacção do polissacárido nuclaófilo funcionali-zatío quer com um reagente para gerar sítios electrofílicos (isto é, tiofílico) quer com um reagente para gerar grupos tiol»

Os reagentes adequados para utilização na produção de sítios electrofí1icos, incluem por exemplo, aqueles para acilação a «-haloacetilo ou s-halopropionilo, derivados tais OR como ΧΟΟΗΧ (era que R é H ou CH-.S I é CL Br ou 1: e X‘ è nitro— fenoxilo, dinitrofenoxilo, pentaclorofenoxilo, pentafluorc-feno-xilo, haleto, 0—íM—hidroxissuccinimidilo) ou acido), particular— mente, ácido cloroacético ou. ácido «—hromopropiónico, com a reacção a decorrer a um pH de 8 a 11 (mantido neste intervalo pela adição de base, se necessário) e a uma temperatura de cerca

de Φ* a 35°C, durante í© minutos 5 uma hora. Um polissscárido amino derivado pode ser seilado com aminoácidos de maleimido sctivados (ver, 0. Keller et al ..·, Helv. Chim. Ac ta., 58, 531 (1975)) para produzir grupos maleimido.

O

O

—CCCH2)PN JJ

O em que p è 1 a 3ρ com um agente 2-haloacetiXante, tal como bromoacetato de p-nitrofenil% ou com um derivado α-halocetona do ácido carboxílico» por exemplo, / ho2c '/ \x 0CCH2Br (Ber, 67, 12©4= (1934)) de modo a produzir polissacáridos apropriadamente funcional içados susceptíveis para. substituição tio. □s reagentes adequados para utilização na produção de grupos tiol incluem» por exemplo, reagentes adiantes» tais como tiolactonas, por exemplo, r4CNH-O , 0 CH2)p. •s em que R é alquilC^ a CP ou arilo mono ou bicíclico, tal MHCORT CH-COX- , como C.Hs-. ou C, H,, e p á 1 a me -•Ο,.ηΒΟΗ^(CH„5 .CH-CuXJ , em que m é & a 4, R^ é alquilC^ a ou e X" è como definido acima» seguido por tratamento com HSCH?CHo0H^ ou IMHCOR·"’ C^H^-S-S-CH^jCCH^) èhCOX' j em que m, Rw e X" slo como definidos iraediataraente acima, depois tratamento com ditioireitol» Tais rsacçõss são realisadas numa atmosfera de azoto., a cerca de S° a 35 °C e a um pH de B a ii (cora base adicionada, quando necessário, para manter o pH dentro deste intervalo)., durante uma a vinte e quatro horas» Por eKemplo, um polissacárido amino derivado pode ser feito reagir cora

para produzir um polissacárido apropriadamente funcionalizado. São então produzidos por estes passos polissacá-· ridos covalentemente raodificadosdas formas, Ps—ft—E®— ou Ps—A'— -SH™, em que EI é -CCHX ou

A*

-CCCH2)pN s A5 A'5 Rs K e p sao como definidos acima. A funcionalisacão separada da proteína a ser acoplada aa polissac-àrido, envolve a rsacção da proteína com um ou mais reagentes para gerar um grupo tiol , ou a reacção da proteína com um ou mais reagentes ρ-ara gerar um centro electrofílico íisto é, „ tiofí1ico)-

Ma preparação para a conjugação com um polissacàrido electrofílico funcionalizado, a proteína é feita reagir num ou. dois passos com um ou mais reagentes para gerar grupos tiol,. tais como aqueles reagentes acilantes utilizados para gerar grupos tiol em polissacáridos, como discutido nas páginas 15-17 acima,. As proteínas tioladas podem ser também preparadas por proteínas carbOKi activadas aminantes, tais como aquelas mostradas em Atassi et_al, 5 BigçJseflt et Bioghvs. Acta, 670, 30Θ;,· ( Í9S1) , com aminotiois, para criar a proteína lidada„ Uma concretização preferida deste passo do processo envolve a acilação directs dos grupos amino pendentes íisto é, grupos lisilo) da proteína com IM-acetil—bomocisteínatiolactona a cerca de 0o a -35°C e pH 8--11, durante cinco minutos a duas horas, utilizando pesos equivalentes de rsagsntes„

Uuando t/ΕΓ é Ο ο N(CH2)pC, ο as condições a a processo de preparação da proteína funcional .i--· sads slo como discutidos acima para a preparação do polissacárido complementa por reacçSa com ácidos de maieimido activados.

Ma preparação para a conjugação com um polissacárido bacteria.no modificado covalentemente com grupos tiol pendentes, a proteína é acilada com um reagente gerando um centro eleeirofí-lico, incluindo tais agentes s CH,. 0 í H e XCri - CX ‘ ? em que K s X' são 0 lè acilantes, por exemplo, ΧΟΗ,,Ο—X ’ como definidos acimas e íl \ 11 I NCCH2)aC-X- , em que X" é corno definido acima» As proteínas adequadas com centros electrof iliços também incluem, por essiipla, aquelas preparadas por acilação dos grupos lisilamino pendentes com um reagente, tal como ácidos de maleimido activados, por exemplo, ο ο

Λ ° NOCCCH2)nNV V ο Ο

ou por reacção da proteína carboxi-activada com derivadas mona---haloacetilo de diaminas* Em ambas as reacçSes de preparação, a temperatura é tíe Θ* a 35°C durante cinco minutos a uma hora s o pH ê de 8 a 11= ft formação do conjugado ê então, sieramente, uma questão de facer reagir qualquer ura dos polissaeáridos modificados covaientemente tendo centros elsctrofilícos pendentes com a proteína bacteriana HIEP tendo grupos tiol pendentes a um pH de 7 a 9, em raz&ss de pesos equivalentes aproximadas,, numa atmosfera de acoto, durante seis a vinte e quatro horas a cerca de 17° a 4®°C,, para dar um conjugado covalente* Exemplos de tais reacçSes incluems

NHCOCH. ÒHCO-P OH 0 ro

Ps-CÉCH^CH^Ca,CHmNHCCH„Br + HSCH^CH^ oh - - - 0 * nhcôch;

PscAcH^CH^CH^CH^NHCCH^SCH^CH^èHCOPro, em que um oolissacárido jL. £. «£. .*£. j£. jC, activado que foi feito reagir com 4—bromoacetamidcbuiilamina é feito reagir com uma proteína que fai feita reagir com M-acetil--•"hoírsocisteínatiolactonaf para formar um conjugado, ep

OHIII PsCNY"

-NCCHaN HSCH2CH2NHCCH2CH2CPro

OII

PsCNHT NHCCH2- N

CH,CH2NHCCH2CH2CPro

OII '(ande Y'' é um radical alquilCU-li-,) ? em que um oolissacàrido amino derivado que foi feitO reagir com ácidos de maleimido activados é feito reagir com uma proteína carboKi-âctivada que foi aminada com um aminoticl? para formar um conjugado*

Similarmente^ qualquer um dos polissacáridos modificados covalentemente com grupos tio! pendentes pode ser feito reagir com a proteína bacteriana MIEP tendo centros elsctrofíli-cos pendentes para dar um conjugado covslsnts, Um exemplo de uma tal reacçSo éi

0 0 0 H ϋ EE Et j

PsCWHCH„CH„SH + ProCCH„CH„CHÍKCH„) ,NHCOCH-Br------------> OH ^ ^ OH ^ 0^

PsC^CH«CH^SCH„C uú U Si () ^NHCChUjCH^CPro, em que um polissacérido activado que foi feito reagir com um aminotiol é feito reagir com uma proteína earhoxi—activada que tox feita reagir com derivados mono-haloacstilo de uma diamins^ para formar um conjugado.

Comes a actividade eleetrofílica de um e>fcésso de grupos haloacetilo necessita de ser eliminada, a rsaeção do conjugado com um tiol de baixo peses molecular,, tal como n-aeefcilcisteamina, realizará esta finalidade,, A utilização deste reagente? n-aestil-cisteamina, também permite a contagem de confirmação das porçSes de haloacetilo utilizadas (ver Secção D), porque a S-carboxime·-tilcisteamina que ê formada pode 5sr, unicamente, detectada pelo processo de Spae:kman!? lloore e Stein»

Estes conjugados são então centrifugados a cerca tíe 1ΘΘ ΦΘΘ x g utilizando um rotor de ângulo fixo durante cerca de duas horas a cerca ds 1° a 20CC, ou são submetidos a um qualquer de uma variedade de outros procedimentos de purificação, incluindo a penetração em gel, cromatografia ds exclusão tónica, centrifugação de gradiente» ou outra cromatografia de adsorçSo diferencial, para remover proteínas e polissacàridos ligados não covalente-mentSp utilizando o ensaio de covalfncia para o espaoador hige-nêrico (ver abaixo) como um processo de seguimento da actividade biológica desejada» A separação adicional dos reagentes pode ser realizada por cromatografia de exclusão de tamanho numa coluna» ou no caso de proteínas não solúveis muito grandes, a separação pode ser realizada por ultracentrifugação» A análise do conjugado para confirmar a covalSncia, e consequantemente a estabilidade da conjugado, â realizada par hidrólise do conjugado (preferivelmente com HC1 6 N a 11&°C durante 2Φ horas)3 depois análise quantitativa para o aminoàcido do espaçados hidrolíticamente estável contendo a ligação tioéter e aminoácidos constituintes da proteína» A contribuição dos aminoàcidos da proteína pode ser removida, se necessário, por comparação com o amino-ácido apropriado padrão para -a proteína

envolvida, reflsctindo o valor do aminoácido restante a cDvslin-cia do conjugado, ou o aminoácido do sspaçador pode ser concebido para aparecer fora tio amirmácido padrão da proteína na análise» 0 ensaio de covalãncia é também útil para monitorizar os procedimentos de purificação para marcar a intensificação de concentração dos componentes biologicamente activos. Nos exemplos

OH 0

MHCOCtL acima, a hidrólise de PsCitH^CH^CH^CH^WHCCH^àCH^CH^CHCOP resulta na libertação de S-carboximetil-homocisteína, NH2

;TO ho,:,cch,,sch^chj ,chco_,h « a hidrólise de

0 °\ EeCNHT NHCCH2 N

o o

II II H2CH2NHCCH2CH2CPro resulta na libertação do ácido aminodicarboxilico, HO^CCH^CHSCH„CH^NH„q e a hidrólise de λ! ,£ * £.<£.£.*

HO,C

OH PsCMCHj:H;,SCHJjA OH 0 0 η n (CH._, > . NHCCH._,CH,.sCPro resu 1 ta na 1 ibertaçSo de , H-NCH^CH^SCH^CO-H por clivagem da molécula Ps-A-E-S-B-Pro nas ligações peptídicas e noutras ligações hidroliticamente instáveis» Os processos cromatoqráficos, tais como aqueles de Spackman, lioore, e Stein, podem então ser aplicados convenzentemente e determinada a razão de constituintes de aminoácido. •'•M Ah *T S-carboximetiIcisteamina

A produção óptima d® anticorpos IqS raquar a colabora-ção dos linfócitos ϊ ε B com sspecificidade para d antigénio ds interesse. Os linfócitos T sSo incapazes ds reconhecer os polis-sacáridos mas podem proporcionar auxilio para as respostas do anticorpo IgG anti-polissacárido se o polissscárido estiver cavalentemente ligada a uma proteina que a célula T é capaz de reconhecer.

Em ratinhos este requisito existe para respostas de anticorpo, secundárias, assim corno primárias, e é especifico ds veiculo, isto à? uma resposta a anticorpo secundária ocorre somente se as células T auxiliares tiverem sido, previamente, sensibilizadas com proteina veiculo utilizada para a imunização secundária. For conseguinte, a capacidade de uns ratinho para produzir sarna resposta de anticorpo secundária a um conjugado de PRP-proteína é dependente da presença de linfócitos T inoculados com especificidade para a proteina veiculo. A demonstração da capacidade da MIEP para proporcionar um veiculo que inocula respostas ds anticorpo anti-PRP foi feita em ratinhos adoptivamente inoculados com PRP ligado covalente-mente a um veiculo heterólogo, toxéide ds difteria (DTK Foi utilizada a transferência adoptiva de modo a determinar se a administração de linfócitos inoculados com MIEP sôzinha era suficiente para gerar actividsds de célula T auxiliar eficaz para a formação de anticorpo anti-PRP em resposta a PRP-0!'iPC« As respostas de anticorpo anti-PRP secundárias comparáveis foram induzidas por PRP-DnPC quando os linfócitos inoculados com MIEP ou OMPC foram transferidos, indicando assim o reconhecimento de células Ϊ de resíduos da OMPC na porção MIEP·,

Os conjugadas PRP-MIEP foram testadas quanto ã imano-gsnicide.de em ratinhos assim como em macacos Rhesus recém-nascidos» A resposta imune sai ambos os ’ modelos animais partilha» com humanos recém-nascidos, uma deficiência na sua capacidade para gerar respostas de anticorpo contra antigénios T-independentes tais como poiissacáritios bacterianos» Estes animais são normaIments utilisados como modelos para determinação da resposta imune de humanos recém-nascidos a vários antigénios»

De maneira semelhante, podeffi ser preparados os conjugados nIEP”péptidQ? por exemplo onde q péptido è um péptido determinante de neutralicação principal (PND) de HIV» Um processo de produção de tais conjugados inclui a formação de um espaçados bigenérico entre a rlIEP activada a os péptidos PND de Hlv activa-dos como descrito e especifica- mente reivindicado no Pedido de Patente copendente CCaso Merck MRL91/125)» 0 ligando pode incluir uma porção polissacarídea, como descrito na USSN 555 558 iCaso Merck ί8Θ88>,, O novo conjugado deste invento compreende MIEr, a principal proteína imunointensificadora da complexo de proteína de membrana exterior COliPC) de Meisserís meningiiidis b, ligado covalentemente a péptidos PND de HIv=

Os conjugados são preparados pelo processo de acoplamento covalsnts de péptido activada a uma proteína activada» Os componentes de péptido e proteína sio estivados separadamente para exibir quer grupos electrofí1icos quer nucleofi1icas pendentes de modo que as ligações covalentes se formarão entre o péptido e a proteína após contacto»

Os ifflunogênios conjugados covalentes que resultam das sérias de raacções descritas acima podem ser convenientemente considerados como um conjugado em que as funcionalidades múltiplas da péptido são construídas após uma fundação ds MIEP»

Quando os componentes de péptido ‘do conjugado são capazes de provocar respostas- imunes neutral is antes de Hl V? os conjugados deste inventa podem ser administrados a mamíferos em quantidades i muno'.Logic emente eficazes? com ou sem imunomodulado-res adicionais5 antivíricos, ou componentes antibacfcerianos? s são úteis para induzir respostas imunes de mamíferos contra a porção peptidilo dos conjugados? para induzir anticorpos neutra-lisantes de HIV em mamíferos, ou para produzir vacinas para administração a humanos para prevenir a contracção da infscção ou doenças por HIV in- aluindo SIDA, ou para administração a humanos afastados com infecção ou doenças por HIV incluindo SIDA*

Numa concretização preferida? o conjugado do invento tem a estrutura gerais

j < PEP—A—i—MIEP ou de seus sais farmaceuticamente aceitáveis? em ques PEP é um péptido PND de HIV? ou um péptido capaz de criar respostas imunes em mamíferos que reconhecem o PHD de HIV= F1IEP é uma proteína do complexo de proteína de membrana exterior COMPO de Neisseria meningitidis h quer produzida recombinantsmente quer purificada a partir de DMPCq -A- é uma ligação covalente? preferivelmente um espaçador bigenéricos j é a percentagem em massa do péptido no co-conjugatío? e está preferivelmente entre 1% e 5@% da massa total de proteína no conjugado* 0 conjugado do invento pode ser preparado por qualquer um dos processos comuns conhecidos na arte para a preparação de conjugados péptido-proteína? tal como? por exemplo? a química bigenérica descrita na Patente dos EUA 4 695 624 e Marburg st al =, ? J.A.CxS. 1©S, 528Ξ (1986)? e nos Pedidos de Patente USS-N 362

179ρ 55 558ρ 555 966 e 555 339, Numa concretização preferida, é utilizado um processo que utiliza as funcionalidades nuclsofíliças disponíveis,, encontradas nss proteínas, tal como o grupo amino de lisins, o grupo imidazol de histidina, ou os grupos hidroxilo de serina, ireonina, ou tirosina. Em termos prácticos, o número de sítios nuclsofilicos de proteína disponíveis podem ser determinados por um ensaio apropriado que pode compreender tiolação com tiolactona de N—acetil-homocisteína5 seguida por ensaio ds Ellman CEllman, 8.L., Arch, Biocbem» Biophys,, 82, 70 í!959)j para determinação de grupos sulfidrilo totalsnents livres e/ou por alquilaçlo com um amincsácitío de bromoacetilo, ensaiados por análise de aminoácidos» 0 processo preferido pode ser realizada de várias maneiras em que a sequência» processo de activaçlo, e reacção dos grupos de proteína e péptido podem ser variados, 0 processa pode compreender os passos dss

Processo 1; la, reacção dos grupos nuclsofilicos ds proteína com um reagente, por exempla, com N-acetil—homocistsínatiolactona, que gera grupos tiol na proteínas; s lb, reacçSo do produto do passo ia. com pépiidos previamsnte derivados de modo a juntar um grupo electrofílico preferivelmente compreendendo maleimido,, no péptido» Uma concretização preferida deste invento, que pode ser preparada de acordo com este processo, tem a estruturas

ο ΜΙΕΡ - (NH-C—R-ν II Ο

Ν—R-C-N-PEP)j Ο

II I Ο Η ου. de seus sais farmaceuticamente aceitáveis» em aue PEP, MlfcP, e j, são como definidos suprap a) -alquilo inferior-, fa) -alquilo inferior substituído-,, c> -c ic1Da1qui1o-, d) -cicloalquilo substituído-, e) ™fenilo-§ —RI és a 5 - h i d r og ên i o , b) -alquilo inferior, ou L- / DU « Ir: 0 0j | :-;íj ϊ !’ S » Do mesmo modo, uma concretiHaçlo preferida do tendo a estruturas invento ο

MIEP-(NH-C—R em que todas as variáveis sSa coíbo definidas acima5 pode ser preparada pelo processo 2S que compreende os passos de;; 2a. reacção dos grupos rmcleofilicos de proteína com um reagente electrofílico faifuncional? tal como éster as hidronis-succinimida do ácido malsimidoalcanóico? de modo a gerar uma proteína electrofílicap s 2b* rescçSo do produto do passo 2a= com um pèptido contendo um nueleófilo, tal como um grupo tiol»

Uma concreticaçSa altamente preferida do processa 1s é descrita abaixo em detalhe e no esquema A» Ds acordo com o esquema? a proteína imunogénica é a proteína de Classe II do complexo ds proteína da membrana exterior COMPC) ds IMeisseria meningitidis b3 quer purificada a partir da membrana bacteriana quer produzida por meios recombinantes« 0 processo compreende os passos des a*x» reacçSo da MIEP «I)P tendo grupos nucleofilicos.. incluindo grupos amino livres devido á presença de lisinss ou proteína amino-terminalP com um agente de tiolaçSo5 preferivelmente N-aceti I-homccisteínatiolactona ? para gerar M1EP C11 > tendo !,m" moles ds grupos sulfidrilo disponíveis para reacçlo cocn uma

tiofilag a=ii» quantificação do número de sulfidrilos disponíveis apensos à MxEP no passo is.i, para determinar o valor de KmK, preferivelmente por ensaio Ellman CEllman, 6 = 1.= 5 Arch= Biochem,, Biochem,, Biophys» 5 82, 7Θ <1959) 3p e h« contactar o produto do passo a„ cora ura excesso, <>m>5 de ura PMD de HXV que tinha sido prsviamente derivado de modo a apensar um grupo electrofíliso, preferi™ velmente com ura ácido maleimidoalcanóico5 e ma is preferível™ mente com ácido maleimidopropiónico Cesta derivação è alcançada por N-profcecção de todos os grupos amino no pépiido que não deveria estar derivado= s reacçSo dos grupos amino de péptido livra cora um reagente bifuncional, preferi™ velraente maleiraida™ alcanoiloxissuccinimitia,, e mais preferi™ velmenie maleimitíopro™ pioniloxissuccinimida), para gerar o conjugado deste invento < I ϊ I) ,, 0 produto conjugado pode ser purificado, por exemplo,, por diálise num tampSo tendo uma força iénica entre ©=,@@í H e í N e um ρΗ entre 4 e íi5 s mais preferivelmente num meio aquoso tendo uma força iónica entre ©S©1 e ©,1 n e um pH entre 6 e í© = /

I. MCEP

II. MEEP-C nh-c- o H) m NH-COCH3

III. MIEP-

0 processes descrit.es acima, e detslhadq na Esquema A pode ser modificado as modo que a MIEP seja derivada de modo a ser ligada covalentemente a uma ticrfils, tal conses uns derivado de maleimida, enquanto qua o péptido é setivsdo da modo a ser ligado covalantemente a sulfidrilos livres, Este s outro processo altsrnativoj caiam naturalmenta no âmbito desta dsscriçsoy incluindo variações deste processo? tais como variações da sequfneia de reacção de espécies activadas, du razões de reagentes. 0 processo para a produção dos conjugados deste invento pode ser empregue para produzir qualquer conjugado em que seja desejado um conjugado peptido-proteina e é particularmente significativo onde o aumento de imunogenicidade do péptido seja requerido,

Os conjugados aqui descritos podem estar incluídos em composições contendo um veicula inerte e são úteis quando formulados apropriadamente como uma vacina. Isto pode incluir primei-rsínsnte a adsorção em alumèn ou combinação com emulsionantes ou adjuvantes conhecidos na arte de formula- ções de vacinas, Os processos qua utilizam os imunogénios conjugados covalentes deste invento irtcluems <a> utilização como uma ferramenta de laboratório para caraeterizar as relações estrutura-função do péptido PND de HlVq <b) utilização como um imunogénio para alcançar anticorpos neutralizantes de ΗϊV num mamífero cujos anticorpos, podem ser isolados e administrados a um humano de modo a prevenir a infse-ção por HIV5 ou para limitar a proliferação de ΗIV pés-infseção,, ou para tratar humanos afeciados por infseção ou. doenças por ΗϊV incluindo SIDA, (c> utilização como uma vacina para imunizar humanos contra infseção por HlV ou para tratar a pós—infecção sm humanoss ou para auxiliar uma resposta imune nsutralizante de HIV num humana afectada com infecçla SIDA, ou doenças por'HlV incluindo

Como uma ferramenta de laboratório,, o conjugado é útil quando administrado a uns mamífero numa quantidade imunologicamsn™ te eficaz, para gerar um péptido anti-PND, respostas imunes anti-HIV ou neutralizantes de Hív=, 0 mamífero pode ser reforçado com conjugado adicional para elevar a resposta imune, 0 antissoro á obtido a partir de um tal mamífero por sangramento do mamífero, centrifugação do sangue para separar o componente celular do soro, s isolamento das proteínas de anticorpo a partir do soro se necessário, de acordo com os processos conhecidos na arte. Tais preparações de antissoro ou anticorpo podem ser utilizadas para caracterizar a eficácia de um péptido PMD de HIV num conjugado para. criar anticorpos anti-péptido PMD, anti-HXV ou neutral izantes de HlV de mamífero, num mamífero,= Os ensaios ELISA que utilizam o péptido não conjugado s o antissoro são úteis em ensaios in vitra para medirem a indução de anticorpos anti-pép-tido. Uns ensaio in vitra para medir a capacidade neutralizarste de HIV do antissoro com- prsende a incubação de uma preparação de HXV vivo com uma preparação do antissoro, depois incubação da preparação ds HIV tratado com antissoro com células portadoras de receptores CD4, s medição da extensão de. protecção celular concedida pelo antissoro. Estes ensaios s as características do antissoro produzido por um conjugado dado podem ser utilizados para estudar o relacionamento estrutura—funcção do péptido PHB„ 0 conjugado é útil para induzir respostas de anticorpos de mamífero como descrito no parágrafo anterior, s tais anticorpos podem ser utilizados para passivamente imunizar humanos para prevenir a infacção por HIV, ou para limitar a proliferação da HIV pós-infecção, ou para tratar humanos afectados com infecção ou doenças por HIV incluindo SIDA,, c s

0 conjugado é útil cosia uma vacina que.-pode ser administrada a humanas para prevenir a infseção ou prolife- ração do HIVj ou a humanos sofrendo da doença de HIV da infecçlo por HIV» incluindo SIDA e complexos relacionados, ou a humanos com teste seropositivo para o vírus HIV. 0 conjugado pode ser administrado em cojunção com outros compostos anti-HIV, tais como AZT, ou mais geralmente compostos anti-virais, ou em conjunção com outras vacinas, antibióticos, ou imunomodaladores (ver Tabela 1 abaixo)« A forma do imunogénio dentro da vacina toma várias coníiguraçSss moleculares» Uma única espécie molecular do conjugada antigénica III satisfará frsquentemente como um sntigénio útil e adequado para a prevenção ou tratamento da doença por HIV incluindo SIDA ou ARC» Outros antigénios na forma ds misturas sao também vantajosos, e consistem numa mistura de conjugados que diferem, por exemplo, na razão de massa de péptido para proteína total= fidicionalmente, os conjugados numa mistura podem diferir na sequência de aminoácidos do PMD»

Um vector, transportador ou adjuvante imunológico pode ser adicionado como um veículo imunológico de acorda com as testes ou a práctica imunológica convencional»

Podem ou não ser adicionados adjuvantes durante a preparação das vacinas deste invento» 0 alumén é o adjuvante típico e preferida em vacinas humanas, especialmente na forma ds um gel de hidróxido de alumínio tixotrópico, viscoso e homogéneo» Por exemplo, uma concretização do presente invento é a vacinação profiláctica de pacientes com uma· suspensão de adjuvante de alumén como veicula e de uma mistura de conjugados como o conjunto seleccionado de imunogénios ou antigénios»

As vacinas deste invento podem ser administradas gficazmentej quer em perlados de pré-exposiçao quer de pós-expo-siçao, em combinaçla com quantidades eficazes dos antivirai.s? imunomoduladoress antibióticass au vacinas de SIDA da Tabela I Cfonte5 Market Letter „ 30 de Nov=? 1987 ? p„ 26-27; Genetic

Engineerinq News.. uan„ 198a„ Vai« p» 26« 3

i

Morna da droga AL-721

TABELA I â^_MÍÍvirais

Produtor Ethigsn

Indicaglo ARC, PGL BETASERON <inter ferão beta)

Triton Biosciences SIDA, ARC, Ktí

CfiRRISYN ípaliroanoacetato)

Carrington Labs

ARC CYTOVENE (ganclclovir)

Bynlex

JMV DDC < didesoMici tid ina)

Hoffmann-La Roehe

SIDA, ARC FOSCARMET <fosfonoformata de trissódio>

Astra Atí inf HIV, CHv retinites

Rbone-Poulenc Sante infecçlo por

HIV AAbreviaturas? SIDA (Sindroma da Imunodeficiência Adquirida)? ARC (Complexo Relacionado com a SIDA)p CMV (Citomegalovírus, que causa uma infecçao oportunista resul- tando na cegueira ou morte em pacientes com SIDA) 5 HIV ÍVirus da Imursodeficiência Humana, anteriormente conhecido como LAV, HTLV-III ou ARV)k KS (Sarcoma de Karposiís; PCP (Pneumonia Pneumonocystis cariníi, uma infecçao oportunis- ta>§ PSL (Linfadenopatia generalizada persistente), v 5

Nojg......da,Uroqa Produtor Indicações

ORWIDYL Merrell Dom PCP <eflornitins)

PEPTIDE T Península Labs SIDA (Sequgncia de oc t a pêptidc/

RETICUL03E Advanced Virai SIDA, ARC (nucleofosfoprotelna) Rssssrc h

IR Bu.rrouohs welieoms SIDA, ARC

(zidovutíinap ΑΖΪ) adiantado, SIDA pediátrica, KS, ΗIV a s s i n i „, ΗIV menos agudo, envolvimento neurológico.

aJ

J

RiFABUTÍN í ansam.ic.ina LM imstrexato) υ ΑΦβί VIKhíDLE f ribavirina WELLhERON ; int0r1'5v"Ãu al f

Ad

U.— L* HJ

Warner-Lam

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Ueno l-iofcf C-hssis h f LA AHC Industry ÍCfSl jÇí .. Ar

Burrouans KS? HXV? sfn comtainscSa com Β I jsunompd» 1 adores

Wdísís da Broa-a Produtor T p H i Γr ABPP (bropirimina) Upi ohn SIDA avançada k:s AMPLIBEN CRNA mal emparelhado) DuPont HEli Research ARC, PSL (Anticorpo de intsrferSo an ti--humano) Advanced Biotherapy Concepts SIDA, ARC, KS Factor Estimulante Santíoc Senetics SIDA, ARC, Hl' de Colónias íQM--CSF) Institute KS CL246738 CCL246738) American Cynamid SIDA IMREB-l 1 í§H~£íCj SIDA, ARC, PSL, KS IHRE6-2 Imreq SIDA, ARC, PBL, KS IMUTHíOL (d i iiocarhama to de diatilo) nerieux Institute SIDA, ARC IL-2 (interlaucina--2) Cetus H i ο A Ko

Morna da Drooa P fí-í d U t ϊ_! Γ Indicações í L—2 <interlsueina~2> Hoffmann-La Rache ImmuneK BIDA;i !<S INTRON-A í i n te r f ® r S o a 1 f a) Sc her i ng-"P 1 oug h K8 ISORRIMOSINE < inosina prabones) Newport Pharmaceuticals ARC= PSL, pacientes ssroposiiivos ao HIV í metionina sncafalina) INI Pharmaceuticais SIDAs ARC rlTP-PE < mu ram i 1 “ t r i pê ρ ΐ i do > Ciba-Geigy ΤΗΥπΟΡΕΝΤIN (TP-S) (composto tímico) Ortho Pharmacsuticals infeeçSo pelo HIV ROFERON CintsrfsrSo alfa) Hoffmann-La Roche KS (eritropoietina recomfainan te) Ortho Pha rmaceu t ica1s anemia severa assoe» a SIDA & terapia do RETROVIR TREXAM Cnaltrexona) OuPon^ SIDA, ARC 5f Sr

iWF Cfaetar da necross de tumor)

UjeSíf ϊ i ! i

Hh!L: 5 K::ffi cDmbinaçSo com interferlo qamí

C. AnMfeiéligQS

LyphoMed

PCF PENTAM 3ΘΘ

Cisetionato de pentarnid ina)

SIDA, ARC

Sag

Dever-ss-á compreender que o âmbito das combinações das vacinas deste inventa com antivirais, imunansaduladares, antibióticos ou vacinas contra SIDA não está limitado à lista na Tabela acima,, mas inclui em princí- pia qualquer combinação com qualquer composição farmacêutica útil para o tratamento da SIDA» As vacinas contra a SIDA ou HIV deste invento incluem vacinas a ser utilizadas pré- ou pós-eMposição para prevenir ou tratar a infscção ou doença por ΗIV, s são capazes de produzir uma resposta imune especifica para o imunogènio»

Os conjugados deste invento, quando utilizados como uma vacina, são para serem administrados em quantidades imunalogica-mente eficazes» As dosagens entre 1 pg s 5ΦΦ μα de proteína conjugada, s prefsriveimsnte entre 5© ug s 3ΘΘ pg de proteína conjugada são para serem administradas a um mamífero para induzir respostas imunes anti-pèptido, anti-HIV, ou neutral is antes de HIV. Cerca de duas semanas após a administração inicial, pode ser administrada uma dose ds reforço, e- depois novsmente sempre que os títulos do anticorpo ds soro diminuem. 0 conjugado deveria ser adminis- trado intramuscularmente ou por qualquer outra via conve- niente ou eficaz, a uma concentração entre i© ug/ml e i mg/ml5 s preferivelmente entre 5© a 5Θ© pg/ml, num volume suficiente para perfazer o total requerido para a eficâcia imunolègica» D conjugado pode ser prê-adsorvido no gel de hidró— Kido de alumínio ou no adjuvante de RLBI <GB 222021IA, documento prioritário EUA 212 919 requerido a 29/Θ6/Ι988) e suspenso numa solução salina fisiológica estéril antes da injecção» A porção de proteína devia comportar-se como um inten-sifieador imune» έ desejável, na escolha da proteína, evitar aquelas que resultam na activagão não especifica da resposta imune tio recipiente iresctogenicidade)» Na Patente EUA 4 695 624, H&rburg et al» utilizaram o compleKO de proteína de membrana exterior (OMPC) derivado de Meisseria meninaltidis para preparar conjugados de políssacárído-proteína» 0 OMPC provou ser adequado, embora outras proteínas imunogénicas possam sar utilizadas» 0 presente invento utiliza a principal proteína imunoiniensifiçado r a <MIEP> de Classe II de OMPC» Têm sido inventados vários processos de purificação do OMPC a partir de bactérias Gram-negaiivas EFrasch et al»» J» Εκρ» íied» 140, 87 (1974)= Frase h et al», J. Εκρ» Med. 147, 629 <1978) $ Zollinger et al Patente dos EUA 4 707 543 <1987), Hsiting et al», Acta Path» Microbiol. Scand» Sect» C» 89, 69 (1981)¾ Helting et al. , Patente dos EUA 4 271 1473» 0 OMPC pode ser utilizado aqui essencialmente de acordo com o processo de Helting, a partir do qual a MIEP pode ser purificada adicional mente LMurakami, !<„» et al» , Infection and Immunity, 57, 2318 (1989)3, para proporcionar uma imunointensificação necessária para induzir respostas imunes em mamíferos para péptidos PND de HIV, A H1EP pode ser derivada por dissociação do OMPC isolado, ou. alternati- vamente, produzido através de expressão recomhinante das porções imunogé— nicas desejadas de OMPC» Os processos de preparação e utilização de uma subunidade de OMPC são descritos no pedido de Patente dos

EUA co-pendente Séries Nos» 555 d29p 55o 9/8,5 ε 555 2&4 (Casos Merck #18159, 1811Θ, e 1818ΘΡ respectívamenfce)»

Os péptidos PMD de HIV que podem ser utilizados para preparar espécies do conjugado deste invento podem ser péptidos lineares ou cíclicos» Os péptidos lineares podem ser preparados pela conhecida química sintética de péptidos em fase sólida, per expressar reconminante do DMA que codifica as sequências de péptido desejáveis ou por fragmentação das proteínas de HIV isoladas» Os péptidos PHD de HIV cíclicos podem ser preparados por ciclizsção de péptidos lineares, por exemplo (a) por oxidação de péptidos que contêm pelo menos duas cisteinas para gerar ciclos ligados por dissuifurstoj íb> por formação de um ciclo ligado por amida§ (c> por formação de um ciclo ligado por tio-éter» Os processos para a preparação de tais péptidos são aqui descritos» mas esta descrição rsSo devia ser construída como exaustiva ou limitante» Os conjugados deste invento são úteis sempre que um péptido componente seja um PMD de HIV ou seja capaz de inocular respostas imunes em mamíferos que reconhecem PMDs de HIV»

Os péptidos PMD5 quer aqueles conhecidos na arte quer os compostos novos aqui descritos e separadamente reivindicados nos Pedidos de Patente dos E„U,,ft„ co-pendenies Séries Mos» 555 1Í2 e 555 227, (Casos Merck Mos» 18149 e 1815Θ) e no Pedida de Patente dos E.LÍ.A» co-rsqusrido (Casos Merck Nos» 18(1681 B> são definidos como sequências peptidilo capazes da induzir uma resposta imune neutralisante de HIV num mamífero, incluindo a produção de anticorpos neutralizantes ds HIV»

Um problema principal ultrapassado pelo presente invento é o da variabilidade da sequência in ter iodada de HIV» Por exemplo, no PND que ocorre na terceira região hipervariàvel da gpi2® (ver abaiKo), embora certas aminoácidos tenham mostrada ocorrer em dadas localizações na maioria dos isolados·, não existe qualquer pedaço de sequência de primária estritamente preservada,, Esta dificuldade é ultrapassada, por este invento porque ele permite a conjugação de uma mistura de péptidos tendo sequências PND de tantos isolados de HXV diferentes quantos os necessários para se obter uma ampla protecção» AIternativament.e5 pode ser preparada uma mistura de conjugados altamente protectora por mistura de conjugadosr, cada um dos quais é preparado ssparadamsn-te com uma porção de péptitio que fornece proieeção contra um único ou vários isolados de HIv=

Os aminoácidos encontrados perto ou entre os aminoáci” das 296 e 341 de gp!2e têm mostrado satisfazer os critérios que definem um PND= Mo isolado IIIB de HIV5 uma sequência de 41 aminoácidos tens sido descrita como se segue <8ES XDs ls>s -He Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arq Lys Ser Ile Arg He Oln Arg 6Iy Pro Oly Arg Ala Phe Vai Thr Ile Gly Lys Ils Gly Asn Met Arq Bln Ala His Cys Asn Ile Ser---5 sendo as duas cisteinas ligadas por dissulfurato uma à outra para formar uma laçada» 0 trimero -Bly Pro BIy~ è exposto na extremidade da laçada do PMD« Os péptidos de diferentes isolados de HIV desta mesma região tíe gpl2© formam anticorpos neuiralizantes específicos de isolado quando apresentados aos sistemas imunes de cabras e cobaias como conjugados com hemocianina de lapa (Fissurella)» Q principal epitopo neutralicante na sequência de 41 meross apresentado acima, é compreendido pelos oito aminoácidos que rodeiam e incluem o trimero --Gly Pro Gly- CJavaherian et ai«t PHftS USA 86,, 6768 (1989)3» Na tabela II abaixo é apresentado um certo número de péptidos lineares de diferente comprimento e composição que podem ser utilizados para preparar os conjugados deste invento, s dado o nome do isolado que contém um pépfcido tendo a sequência do péptido tabelado, juntemente com um nome aqui atribuído àquele

f-i 10 'C c péptido para facilidade de referência. do de cada péptido rsorasanta CÃ poseib a uma proteína iim unogénica? 'V* jP; .1 como AdicÍDnalmsntBs os ainxnoâcitíO' S Ifi arcado nm 1 fina potíem 'faz sr parte de • 8 ng í atío esquer dade de ligar d péptido . ΜΣΕΡ naquela posição» • tais como norleucina s PMtMga.....PHD dg HIV .Lineares

Isolado Ssaufncia ds péotidas Nome SEQ ID de HIV Nos MN r-Tyr Asn Lys Arg Lys Arg PNDÍ42 2 Ile His I1b Sly Pro Sly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn He Ile Bly Thr SC r-Asn Asn Thr Thr Arg Ser PND-SC 3 Ile His Ile Sly Pro Sly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Sly Asp Ile IΙΪΒ r-ft-sn Asn Thr Arg Lys Ser Ile PND13S 4 Arg Ile Bln Arg Sly Pro Sly Arg Ala Phe Vai Thr Ile Gly Lys lis Gly Asn IIIB r-Arg Ile Gin Arg Gly Pro Gly PND135-1S 5 Arg Ala Phe Vai Thr Ile Sly Lys Ile Gly Asn IIIB MN r-Arg Ils Gin Arg Sly Pro Sly PND135-12 6 Arg Phe Vai Thr r—His Ils Sly Pro Sly Arg Ala PND-MNS 7 Phe

q. _ MN r--G I y Pr o tíly Arg A 1 PND-MNó 8 LftV-1 r-Ile Sln Arg Ala Phe B1 y Pvn. t t w p I \.f Arg Prffi-LAV— 1 hf SF2 —I le Tyr 11a Ala Phe Sly Pr d Sly írn y PND-SF2 Ί C'i NY5 r-Ile Ala Ils Thr Leu SI v Pro B1 y Arg PN/J—ím v h 11 CDC4 Vai Trp Gly Pro J v Arg PMD—CDC4 12 RF r-Ile Thr Lys Vai Ile G1 y Pro Gly Arq PMD-RF ·? T. ELI r-Thr Pro Ils Ser Leu !ri 1 y Leu SI v Bln PND-ELI 14* .-Ϊ. (7t r-Thr Pro Ils Ala Leu 61 y Leu Sly Gin I~ £, w 1 rç l·.:' λ ; ru-it. r—Ile His Phe A1 a. Leu G1 y Pro Sly Sln PND-liAL 16 7’T r-Ile Arg Ile vai Phe G1 v r* V O Gly \ va U· y ».i PND-Z3 ,t —r i / Esta lista ; j.t^n uma '» * ... ,P_ _ pj... t . ... Λ. .*j . . .. d© ssquincias PND* No entanto. ma um guia ilustrativo par qufncia3 os péc saqt sugestivo o os w. 1 *" í d i TXcSS ds ugados coí ma ac mi PMD útsi descrito

Pd conse ara formar o

R

imunogénio deste invento são qualquer um dos péptidos tabelados □u variantes imunDlogicamente equivalentes do tema sugerido por estas sequências peptidilo» A natureca das variações é considerada em seguida. A sequência primária deste PND de HIV parece ter uma sequência de aminoàcidos de núcleo conservado., compreendida pela sequência tetramérica -Bly Pro 81 y Arg-, CSEQ IDs i8s) com uma divergência que aumenta nos dois lados desta sequência entre os isolados de HXV» Alguns isolados têm sequências que divergem mesmo no tetrãmera5 tendo sequências de núcleo --8ly Pro 81y Lys™ (BEQ íDs 19s>, -Bly Pro Bly 8Ln- (8EQ IBs 2@s), e mesmo -Bly Leu Gly Sln~ CSEQ IDs 21s). Todas estas possíveis sequências fsssm parte do âmbito desta descrição como sequências peptídicas que sao vantajosas para a conjugação da acordo com este invento. 0 comprimento do péptido é um factor significativo na promoção de respostas imunes cruxadamente rsactivss. Isto â, uma resposta imune criada contra um dado epítopo de peptidilo pode reconhecer epítopos similares do mesmo ou ds diferentes isoladas ds HIV com base no número de aminoàcidos no eoítopo sobre © acima do epítopo da neutralizaçlo critica* Adicional mente, o comprimento do péptido é também responsável pela determinação da probabilidade de ©mposição ao sistema imune do determinante responsável pela produção de uma resposta neutralicante de HIV.

De forma a maKimixar a probabilidade de apresentação ds epítopos importantes. a química foi desenvolvida pelo que os péptidos de PND podem ser fechados numa dada configuração tridimensional» Sabe—se que o PND de 4í aminoàcidos do isolado 11ΪS de HIvf. representado acima, é configurado como uma laçada pela presença da ligação dissulfureto cisteína-a-cisteína» Contudo, os dis-suifuretos podem ser làhsis sota certas condições es por

c:;./ conseguintes podem permitir que a laçada abra ε que o péptido exista numa forma linear. Por conseguinte, adicionalmente aos pèptidos lineares, os pèptidos cíclicos ligados par dissuifureta e os novos pèptidos PMB de HIV tendo estruturas cíclicas não lábsis aqui descritos mas separadamente reivindicados como pèptidos livres nos Pedidos de Patente dos E.U.A, (caso Merck co-requerido 18©é8íB)? 555 112 e 555 227, podem ser todos utilizados como o componente de PEP na formação do conjugado deste inven to.

Os pèptidos que podem ser utilizados na formação destes conjugados podem ser derivados como fragmentos as proteínas-naturais igpl£0 por exemplo), por expressão rscombinante de suas porçSes ou por síntese química de acordo com os processos conhecidos na arte. Adicionalmente, os novos PNDs cíclicos podem ser sinteticamente preparados de acordo com os processos aqui descritos. As sequências podem conter quer L—aminoácidos quer u-aminoá-eidos ou aíninaácidos não usuais. Adicional mente, a química tíe conjugação é suficientemente flexível para que a escolha apropriada de reagentes de derivação de pèptidos permita a conjugação bem sucedida.

Os pèptidos sintéticos têm sido preparados por um certo número de estratégias conduzidas quer em solução quer em suportes sólidos. Os textos excelentes que cobrem os princípios e técnicas, básicos, sãos Principies of Peptide Synthesis. Bodanszky. M., Springer-Verlag <19841 § Solld.......Phase ......Peptide . Synthesis,

Stewari J, M., Young, J. D., Pierce Chemical Corapany (21 ed. 1984)p e The Psptides. Sross, E., Meisnhofsr, J„, Academic Press, Inc., <1979). Contudo, os processos aqui descritos não estão limitados à descrição destes textos.

Os péptidos cíclicos sintéticas podem ser preparados em duas fases» Primeiro, o péptido linear pode ser sintetizado num sintetizador de péptidos Hilligen 9Θ5Θ ou num ABI 431A utilizando a química de 9-fluorenilmsfciloKicarbonilo (Fmoc) e ésteres de pentaf luorofenilo de aminGácidos Fmac protegidos na cadeia lateral que siso reagentes conhecidos ou utilizando s resina Wang derivada, química de PmGC e anidridos simétricos de aminoàcidos

Fmoc protegidos na cadeia lateral, preparados in___situ, como raagen tes«

Segundo, o péptido linear pode ser ciclizado, quer em solução quer com o péptido ainda ligado à resina de fase sólida» A ciclizaçSo pode ser realizada por qualquer técnica conhecida na arte, que pode compreender, por exemplos a) a incorporação de resíduos de cisteína no péptido linear em qualquer extremidade da sequência que vai formar a laçada ε permitir a formação da ligação dissulfureto sob condições oxidsntes conhecidas na arte; ta) a preparação de um péptido contendo cisteína como em (a) mas mantendo as cisteinas como sulfidriios livres Cou como tióis protegidos por Acm que são desprotegidos aos sulfidriios livres) e o tratamento do péptido com dibromsto de o-xiXileno ou um reagente similar, tal como o diiodeto, dicloreto ou um alquilo inferior de cadeia linear ou ramificada di-haiogenado tendo entre dois s oito átomos as carbono; tais reagentes reagem com os átomos de enxofra das cisteinas para formar uma estrutura cíclica contendo duas ligações tioéter não lábeis ao benzeno ou ao alquilo; c) permitir que um grupo livre de um lado dos aminoéci— dos em laçada se torne ligado por amida ao grupo·carboxilo livre do outro lado dos aminoàcidos em laçada através tía formação de ligações peptídicas mediadas por DPPA, BOP ou reagentes similares» Cada uma destas estratégias ê dada em mais detalhe abaixo, após apresentação de uma descrição generalizada dos péptidos cíclicos produzidos por estes processos»

Assim, sem limitar o inventa de conjugadas das péptidas ou orocessos de produçlk mesmos, seguintes, os péptido*

FiSSB que podem ser uonjucisous apos rerfsoçlu de grupais pvOtec tur1.-·™· apropriados quando necessário, de acordo com este invento, incluem aqueles representadas pela estrutura PEP, que inclui as péptidos lineares da Tabela ΙΊ acima e os péptidos cíclicos: r H HO•r1-n-r8-c-<!Í. r6

Pro-Gly / \ Gly ArgR2 W*-r5 Í7 em que: r é a posição de 1i gaçlo entr e PEP do opc ionalmente um aminoác ido marcador , se i c .'i. d α m arcadors t***. n é !i a) uma ligação, o I 1 b) um ptípt.’ido de 1 a 5 aminoá eidos inen ; t© um aminqác ido marcado r que migra . numa de a.rsa lise de íti íTl •i i i O ti ím jk d w (P que está isola. ami noâ eidos que ocorrem n&t uraϊmente; ρ ref er áe i do gama amino fou. t- x r ,i* c o rt }5 -alanina ou ornit sinaj dr

és

a) ou uma ligaçlo ou um péptido até' i7'aminoàcidos se R"" for um péptidD de pelo menos 2 aminoàcidos, ou b> um péptido entre 2 a 1.7 aminoàcidos, se R~ for uma ligaçSDg Rã és a) ou uma ligação ou um péptido até 17 aminoàcidos se R*“ for um péptido de pelo menos 2 aminoàcidos,. ou b) um péptido entre 2 a 17 aminoàcidos, se R"" for uma ligaçSog R** és 7 7 for , ou a) -nH-CH-CO—, com K' Ixgado ao carnono merino, se R' _ -ζ ·7 bJ uma Ixqaçáo de H" a Ι-Γ iZT. ”~f R~, se R’’ for carbonilo ou -CDCH^CH^CHí COWH? )MHCO-\ FC' éi a> um péptido de um a cinco aminoàcidos, incluindo opcionalmente um sminoácido marcador, b) -OH, -COOH. d) —CONH, ou e) -NH?, f) -susen te %

R a) uma cadeia lateral de aminoáeidos» seleccionada a

partir da cadeia lateral de qualquer um dos aminoácidos D s L comuns,, (ver tabela de Definições e Abreviações), se a ligação 7 opcional (...................) a R estiver ausente» b) -Rd-B-S-, ou se R/ for FT1, ou c) -RW-HH- se R' for -C=0 5 OR -C-CH^-CH^-CH-NH-CeOs 0 CONHL· b) -C=05 ou έοΝΚ.

R R" ã uma ligação ou alquilo inferior entre um e oito carbonos? RV és a)

ou b) xllileno

a) alquilo inferior, ou b) -CHo-0-CH„-í s Z é. · toda a ocorrência de uma variável á independsntede toda a outra occrrlncia da mesma variável» Quando um péptido for sintetizada com um aiiíinoácido terminal amino protegido, o grupo protsctor do terminal amino tal como henziloxicarbonilo (Z) para proteger aminas, ou airetamidometilo CAcm) para proteger sulfxdrilos, pode ser removido de acordo com os processos conhecidos na arte e aqui SKsmplifiçados» 0 grupo desprotegido assim revelado pode ser utilizado na formação de ligações covalentes, através do ligante r, è proteína imunogénica» v _ _ “-r b.fii seguida, os sminoacidos -R“-81y Pro 01 y Arg-K"-·, que formam o Bnúcleo” dos péptidos PND, e que contribuem para a formação da laçada de um péptido cíclico, serão referidos como aminoácidos em laçada ou micleo» Contudo, quando a ligação 6 *7 opcional entre Ru e R" estiver ausente, a estrutura, PEP. é linear s inclui todos as péptidos lineares da Tabela II»

Quer o péptido seja linear quer cíclico, as sequências v _ 3 de aminoácidos que compreendem EJ~ e K' de PEP podem ser uma qualquer combinação de aminoácidos, incluindo as sequências que rodeiam o tetrámero -Bly Pro Bly Arg·-· do núeleo em qualquer uma das sequências da Tabela íl = Assim, os aminoácidos do núcleo representados por — R*"—Gly Pro Sly Arg--K~- podem ser adicionalmen— te definidas como tendo a estrutura de aminoácidos de núcleos ~W2~Siy Pro Β1Υ ftrg-K3X4Kfl|~

qí}\ quss v Λ £Í1 um on st.it u i n t s? leccion&ck ctes a / ss? r* x n a »5 . ΧΠ c> srginina? d) -histidina, a) cí i u i. a (r i π a si cu f) trsoninas

V ccnstituintB ds R'“

.J U B. s; isDlauciinSj b) arçinina, d) raetionina; X é um constituinte d n 15 amin oác: i d os 3 e .im gaçSo ou unr pépiido ité K„ é um constituinte de R~ seleccionado a partir de: a) alanina. b) arqinina, m c) valinas ΚΆ ê um constituinte de e é seiecclanado a partir des -a) f en i 1 a 1 an i n a,, b) isDleacina, c) valina, ou d) leucinap ê um constituinte de R'J s é uma ligação du um péptido até 15 aminoâcidos.

Os péptidos cíclicos podem ser estruturas ligadas por dissulfureto ou uni cicio formado através de unia ligação ou estrutura não iábil. 0 termo "ligação não làhil” significa uma ligação covalente, diferente de uma ligação dissulfureto. Exem--· pios de tais ligações não láfosis slo as ligaçSíes amida s tioèter como descritas nos Pedidos de Patente USSM co-pendentes 555 112 e 555 257„ Estas ligaçSes covalentes podem ser através os uma estrutura em ponte5 tal como xilileno, através de um alquilo inferior,, através ds -CH^-0”CHo ou através de uma ponte ligada jl. +£· par amida ao aminpécido» Alterando a estrutura em ponte e/ou o rsúfiiera e combinação dos sminoécidos incluídos no péptido , a conformação da estrutura em laçada do ciclo pode ser optimizada, permitindo a boa sintonização do spítopo ΡΗΪ) apresentado ao sistema imune. Por exemplo, a utilização de uma ponte de o-xili-leno gera uma estrutura em laçada "esticadora" diferente de quando è utilizado, por exemplo, um alquilo inferior de cadeia linear de oito carbonos, como a ponte. Assim, os conjugados deste invento são úteis quer como reagentes para analisar a relação c

fc estrutura-função do epitapa de PMD na criação ds rsspostas imunes anti-péptldo, anti-HIV, neutralizantss ds Ηϊν e anti-BIDA a® mamíferos, quer como componentes para a formulação de vacinas anti-doençaoe mV» incluindo SIDA»

Os produtos sintéticos obtidos podem ser caracterizados por espectrometria de massa com bombardeamento rápido de átomos EFAB-MSj ? HPLC ds fase inversa, análise da aminoácidos ou espec-troscopia de ressonância magnética nuclear CRHN)» «« PtgMdQm. Clc.llc.os através de......Cisteinas Ligadas por.....Dissulfure- tos

Os péptidos contendo resíduos ds cisteína em qualquer lado dos aminoácidos em laçada podem ser ciclizados sob condiçSes oxidantss aos ciclos ligados por dissuífureto» Os processos para se atingir a ligação por dissuífureto sao conhecidas na arte» Um exemplo de péptidos ligados por dissuífureto úteis neste invento é dado infra no Exemplo 1©S onde è produzido o cPMD4 e no Exemplo ÍS onde é produzido o e:PND33» No Exemplo i©? é utilizado um processo que utiliza o derivado Acm da cisteína para gerar cPNDs ligados por dissuífureto» mas são igualmente aplicáveis outros processos» No Exemplo 18, o péptidc que contém dois sulfidrilos é1 oxidado em ácido diluído,, Os péptidos ligados por dissuífureto são preferidos no presente invento»

Assim, numa concretização preferida deste invento, o péptido tem a estrutura C8EQ IDs 18;)s

Pr ο Η Η OGly r-R1 -N-C-C-R2 & -σίγ

Arg Η Η Ο R3-N-C-C-R-

-R ου. do seus sais inaríRsceutxcamsnte -aceitáveis, em aus: a) hidroqénio. i onde e em que r hr? i f·? -o

O

0 :|_í

CH

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~©“ or -@-Ip θίτι que K: í. ΙΛΙΛ Á. .1 \

OU

HS í G

R 1 ès

a) uas ligação, ou incluindo opcional- b> um péptido de í a 5 aminoácidos, mente um soinoácido marcador? 2 R os um péptido ds 3 a 1® aminoácidos „3 K" é: um pèptiao d© 3 a i® aminoácidos a) —QH, ta) um péptido de 1 a 5 aminoácidos, incluindo opcional-mente um aminoácido roarcador, ou R1"" é alquilo inferior entre um e oito carbonos. 0 alquiles inferior consiste em alquiles de cadeia linear ou ramificada tendo de um a oito carbonos, a não ser que ‘T« de outro modo especificado. Em seguida, os aminoácidos

Pro Bly Arg-R'-', que contribuem para a formação da laçada de um péptido cíclico, serão referidos como aminoácidos em laçada.

Numa concretização do invento, o péptido cíclico tendo a estrutura <SEQ IDs lSs)g

Η Η Ο H-Nle-N-C-C-X^ Χ2 D Ργο —Gly / \ Gly Arg Ή Κ ο ι I Η -Ε ρ Γί5 p;:\rfiuO yOf ds um pt ida linear tend a e Η H 0 H-Nlo-N-C-C- 8

I SH

Prg —Cly \ ψ Argxnx,x2 x3xtxm-

H Η O N-C-C-R5 SH m que : onaoo a par*t 4 é um constituinte ds sele; 1 a) serina, b) proline? c) droinine. d> histidina, e) g 1 litsmina 5 que r-._ rr· r-. ·? r-“ *í a, ou

f) treoninas

Xr é um constituinte de R" ssleccionado a partir ds íTIDS n t!í arqxmna, que è prsrsrida, e> vãlins, ou d) metioninas

XrJ é um constituinte de R·1- e á um aminoácidc ou. um péptido até 8 aminoácidos? X.... é um constituinte de R“ ssleccionado a partir de; a) alanina, b) arginina ,= ou c) valinas X» ê um constituinte de R“’ e é ssleccionado a partir des H* a) f en i 1 a I an i ri a. b) isolsucin; c) valina, ou ri) 1 isucinaii 6V — “ ~ _ X é um constituinte de ?C e é um aminoácido õu um péptido até « asBinoácidos» é preferivelmente Isoleucina.

Os novos pêptidos cíclicos ligados por dissulfureto utilizados neste invento Ce separadamente reivindicados no caso

Merck co-requerido 18Θ68ΙΒ, USSN _______________) podem ser preparados essencialmente em duas fasess Primeiro o péptido linear ê sintetizado num sintetizadar de pêptidos Milligen 9Φ5Θ ou num ABI-431A utilizando a química de 9-fluorenilmetiloxicarbonilo iFmoc) e ésteres de pentafluorofeniio de aminoàcidos apropriadamente Fmoc protegidos na cadeia, lateral como reagentes ou utilizando a resina Wang derivada? química de Fmoc e anidridos simétricos de aminoàcidos Fmoc protegidos na cadeia lateral, preparados in si tu·, como reagentes.·

Segundo, o péptido linear è ciclizado, quer em solução quer com o péptido ainda ligado à resina de fase sólida por incorporação de resíduos de cisteina no péptido linear em qualquer extremidade da sequê'nci.a que vai formar a laçada a oxidação destes ao dissulfureto. Numa concretização preferida, a cicliza— çlo é realizada por exposição do péptido a <a) H„Cu, <b) oxigénio atmosférico, (c) Ci-UCN aquoso contenda cerca de Θ,Ι - 0,5% de TF A ou Cd) ferricianeto aproximadamente θ,ΐπ. 0 processo preferido é a exposição ao oxigénio atmosférico.

Os produtos obtidos podem ser caracterizados por sspectrometria de massa, com bombardeamento rápido de átomos EFAB-MS3, HPLC de fase inversa, análise da aminoácidos ou espec-troscopia de ressonância magnética nuclear ÍRMN)«

Ass i π· , as péptidos úteis neste Invento podem ser preparados como adicionalmants descrito abaixo em Ci) e (ii)s i3 Cieligação de Pé.a.t_idos..no.....j^tadpJàólidoi. 1 _'7

Um pépiido linear contendo C* e U*" em qualquer lado dos 5 _7 aminoácidos em laçada, onde C“ e i%~ elo os dois cisterna ou um outro aminoécido contendo grupos sulíitírilo livres na cadeia lateral, é preparado de acordo com os procedimentos sintéticos conhecidos \ver discussão supra) , Mo PWD ciclico completado, as 8 cadeias laterais contendo sulfidrilo, (-RU~SH>, contribuem para a 8 preparação aos grupos -R ~S- da estrutura HMD de HIV cíclica completada mostrada acima, Os aminoácidos a serem incorporados que t®m cadeias laterais rsactivas <grupos R> são utilizados numa forma apropriadansente protegida no grupo R, Por exemplo, a histidins é trifsnilmstil- ÍTrt) ou Boc-protegida e a arginina è 4-metoxi-2,3,ó-trimeti1f ersi Isu1foni1- (Mfcr) protegida,

Preferivelmente, é adquirida uma resina coíh na sua forma protegida por Acm jà ligado à resina, por exemplo, resina Fmoc-"L"“CysCAcm)“0“Wang, A cisteína incorporada no lado de terminal asinino dos aminoácidos em laçada, C% pode também ser o 1 7 derivado Acm, Quer C* quer C** podem ser ligados a aminoácidos adicionais, R* ou FT respectivamente, que podem ser utilizados na formação de conjugados com moléculas veículo ou podem servir como aminoácidos marcadores para subsequente análise de aminoácidos, tal como quando â utilizada a norleucina ou ornitina,: 0 enxofra das cistainas acatamidometiladas é feito reagir à temperatura ambiente durante cerca de 15 horas num scslvente compatível com a resina, tal como uma concentração de 1-50% de um ácido orgânico, preferivelmente ácido acético a cerca de Í0/L- em dimetilfarmansida (DMF) anidra, com um excesso molar de

aproxinsadaroente quatro veses de um sal de metal pesado, tal como acetato snercúrico EHg (OAc >n2, para cada grupo Asm» 0 tioéter de metal pesado resultante, por exemplo □ tioéter de acetato mercú-rico do péptido» PEP<S-HgOAc) , ê então lavado e seco- A adição da excesso de sulfursto de hidrogénio em DMF rende o sulfureto de metal insolúvel, por exemplo sulfursto mercúrico CHgS), a o péptido com grupos sulfidrilo livres» Os sulfidrilos livres são então oxidados por um dos processos anteriormenie mencionados» AIternativamente, os tióis protegidos por Acm podam ser directa-mente convertidos no dissulfureto cíclico por tratamento com iodo rmm solvente de metanol/DMF» iiiL-ClSlizasIO-Je-PéaM^

Aplica-se essencialmsnte d mesmo processo descrito acima para a ciclieação no estado sólido com duas variantes principais^ 8e o péptido for clivado íTFA a 95%/etanouitiol a 4%/tioanisoi a 1%) a partir de uma resina da pepsina KA, são também removidos os grupos protsctores de cadeia lateral lábsis ao ácido, incluindo CysíTrt) que proporciona a função —SH livre necessária» Contudo» se for utilicada a protecçSo CystAcm) è então requerida a clivagem de acetato merciârica/sulfursto de hidrogénio para o grupo -~8H livre, como um procedimento independente, com o péptido linear quer na resina quer fora da resina»

Contudo» um processo & a utilização de protecção

Cys(Acm) e resina Sasrina ou Pepsina KH, e clivagem do péptido linear tc-tal mente protegido a partir da resina com TFA a ,2_, Í%/wM“Cl0„ 0 acetato mercúrico/sulfureto de hidrogénio converte então selectivamsnte a CysíAcm) no grupo -SH livre e a ciclisaçao é efectuada no péptido de outro modo protegido» Neste ponto, o péptido pode ser maleimidado in situ» selectivaments no terminal N„ Os grupos protsctores de cadeia lateral lábsis ao ácido são

clivados com TFA a 98%/iioanisol a 2% e o pâpiido cíclico ê isolado por HPLC- Contudo, o processo preferido é o de clivar o pépiido da resina ε permitir a ciclisaçlo por um dos processos anteriormente mencionados» 0 processo mais preferido é o de permitir a oxidação ao ar durante cerca de uma a cinquenta horas entre iô s 40*0»

Assim,, numa concretização deste invento particularmente preferida, um péptido <CPiMD 33) tendo a estrutura CSEQ íDs 22s); H-Nle Cys Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ils His lie Bly Pro } { 81y Arg Ala Phs Tyr Thr Thr Lys Asn

O-U ϊΐε IIe Bly Cys-OH í “ i S---------------- 8-CH„ é conjugado â ΜΪΕΡ quer através do terminal amino Mie quer de uma das lisinas internas para gerar uma ou uma mistura de todas as estruturass •-υ

.X - mip4 H-C-CH-CHj-CB,-· o mcoc»,

Η 1 C-H-Hl·- Cjj· • i C ! ieoc«cyi

Tyr Mn Ly· Arg Ly» Arg 22· Kl» li* Oly Fre

Oly oiy η· ii· Mn ty· tw iw iyr fí>· ai· Mg e-2) c-Mg ty- Mg XL »· U· "Y "*· 0l* A1* *" r« WKT-j K-C-CH-CRj-CTtj-· 0 JfHCOCHj DVV^eiV,-1 0

C-K-(CII|)4 -ç-K-Mn Tyr çy*-M-çy· x1· rl* Mn Lye ^ Nl· COOH

I Η H

Tyr Thr e-3) H Kl ~Γί· C-CH-C^-CHj-e o NHCOCHj ;B| (X-tCX,J,-C-R.CClt,)4

OiC-Mg il· κι· II· Oly Pr o 01 y Aro Alt ptw Tyr Thr O-N-Xrj Ly· tan Tyr ey.-*-*-ey· Oly II· II· |Un Ly·

H R Rl· COOH e-4) COOH Rl· I I OiÇ-ton II· II· Oly Cyi-l-i-Cyi Tyr A«n Ly» Xrg Ly» ΚΙΙΡ-f K-C|CH-C«^*CJ^-f 0 HHCOCH, 0 »r5

,R—(CRj)i-C-h-(C1%)4 -c-K-Thr Thr Tyr Ph· u· λτς oly Pre Oly II· Hli Η X em que prefsr é a percentagem em massa de is 1 mente entre 21 e 5£*% da péptido na conjugada e está massa de proteína total no conjugado.

to- Péptidos dc. I icos .atrayég._da_ _ou §UiJj^íIss..^^ i- Cieligação de .,P#gjyj,PS_j30_Estado_^ÓUdoj- Um péptido linear 1 contende C e CP" em qualquer lado dos aminaâcidos em laçada, onde 1 ... o C e ι:*" são os dois oisteina ou um outro aminoácido contendo sulfidrilo é preparada de acorda com as procedimentos sintéticos conhecidos Cver discussão supra) No PMD cíclico completado, €,1 a ·"£ · *7 C*· fazem parte dos grupos R“ e R" da estrutura PEP mostrada acima» Os aminoácidos a serem incorporados que têm cadeias laterais reactivas (grupos R) são utilizados numa forma apropria-damente protegida no grupo R = Por exemplo, a histidina é trife— nilmetil- (Trt) protegida, a arginina pode ser 4-ffietax 1--2,3,6- —trimetilfenilsulfonil- (Mtr) protegida» trrincioles of____Peptide

Synthesis» Bodanszky» M», Springsr-vsriag Cí984)f Solid____Phase

Peptide Synthesls, Stewart 3, M», Young, D», Pierce Chemical Company <2ã ed» 1984)| s The Feptides» Gross, E., Meienhofer, J», Academic Press, Inc», (1979)2» 2

Preferivelmente, e adquirida uma resma com C na sua forma protegida por Acm já ligado á resina, por exemplo, resina Fmoc-L“Cys(Acm)-0™Wang.. A cisteína incorporada no lado de terminal amino dos aniinoácidos em laçada, C% pode também ser o i o derivado Acm. Wusr C“ quer ΙΓ’ podem ser ligados a aminoácidos _ \ <=·, adicionais, κ ou R'" respectivamente, que podem ser utilizados na formação de conjugados com moléculas veiculo ou podem servir como aminoácidos marcadores para subsequente análise de aminoácidos, tal como quando é utilizada a norleucina ou ornitina» 0 enxofre das cisteínas acetamidometiladas έ feito reagir à temperatura ambiente durante cerca de 15 horas num solvente compatível com a resina, tal como ácido acético a 1w% em dimeti1formamida CDMF) anidra, com um bkcbsso molar de » »

aproximadaments quatro veses de uai sal da sustai pesado, tal cosa acetato mercúrico CHq(OAc, para cada grupe Acm» 0 tioéter de metal pesado resultante, por exemplo o tioéter de acetato me Teórica do péptido-;i ΡΞΡ<S-HqOAc5 , é então lavada e seco. A adiçSo ds excesso de sulfureto de hidrogénio em DMF rende o sulfureto de metal insolúvel, par exemplo sulfursta síisrcúrico (HaS), e o péptitío com grupos sulfidrilo livres» é adicionada à resina derivada uma mistura de uma quantidade aproximadamenle equimolar, quando comparada com o péptido, de dibrorasto ou dicloreto ds α-xilileno, um alquilo inferior dihromado ou diclorado, -CH-O-CH- 1,3-di-haIogenado ou um reagente similar que irá proporcionar um comprimento ds cadeia desejável» é lentamente adicionado um grande excesso de amins terc.iária3 preferivelmente trietilamina (NEt^.) em DHF» A reacçlo com a porção de péptido ds bis~sulfidrilo é deixada prosseguir durante cerca de dezasseis horas á temperatura ambiente, dando o péptido cíclico derivado da grupo ds ponte ligado à resina,, A desprotecção dos grupos protectores de cadeia lateral sensíveis ao ácido e a clivagem a partir da resina são realizadas por tratamento com ácido trifluoroacético (TFA) a 95% na presença de 1,2-etanotíitíCfl a 4% e tioanisol a 1%* 0 péptido cíclico dissolvido pode então ser separado da resina por filtração, 0 filtrado é evaporado s o produto residual bruto é purificado por cromato— grafia liquida de alta pressão CHPLC) de acordo comi processos conhecidos, por exemplo por HPLC ds fase inversa» LL·......£IÇllll£ÍQ-^e-£éBtMos_effi.....So 1 uç los

Aplica-se essencialmente o mesmo processo descrito acima para a ciclização no estado sólido com duas variantes principais;! Se o péptido for clivado (TFA a 95%/etanodiiiol a 4%/tioanisoI a 1%) a partir de uma resina de pepsina KA, são ο ο

também removidos; os grupos protectores de cadeia lateral lábeis ao ácido,, incluindo CysíTrt) que proporciona a função ~SH livre necessária„ Contudo3 se for utilizada a protscção CysíAcm} é então requerida a clivagem de acetato mercúrico/sulfureto de hidrogénio para o grupo -SH livre3 como um procedimento independente,, com o péptido linear quer na resina quer fora da resina,.

Contudo5 o processo preferido é a utilização de protec-cão CysíAcm) s resina Sasrina ou Pspsina KH, e clivagem do péptido linear totalmente protegido a partir da resina com TFA a ÍX/CH^Cl^. 0 acetato mercúrico/sulfureto de hidrogénio converte então selsctivaments a CysíAcm) no grupo -SH livre e a ciclização é efectuada no péptido de outro modo protegido- Os grupos protec-tos-es de cadeia lateral làheis ao ácido sao clivados com TFA a 95%/etanQditiol a 4%/iioanisoI a 1% e o péptido cíclico â isolada por HPLC, A remoção dos reagentes em excesso» tal como dibrometo de xilileno que nlo rsagiuP antes da clivagem com ácido dos grupos protectoresj é convenientemente realizada- por exemplo., por uma operação de HPLC de fase inversa de gradiente descontinuo antes de uma eluição por gradientes mais salsctiva.

Os péptidos PND de HIv cíclicos preparados de acordo com esta subsecção incluem,, mas não estão limitados,, aos cPMDs de amostra representados abaixo,, Gs processos desta subsecção sao geraiments aplicáveis a pequenos péptidos e particularmente aplicáveis a péptidos entre 5 e 3# smincsácitíos» Um tamanho de anel óptimo pode incluir entre 5 a IQ aminoâcídos,, incluindo o trímero —Gly—Pro—Gly— e este tamanho de anel ê facilmente mantido por produção de ciclos tíe péptidos lineares tendo o número a combinação de aminoácidos= apropriado-

S 9

Os péptidos representativos resultantes do processo descrito nesta subsecção b* partes Ci) e (ii) são descritos no Pedido de Patente U»8=S=N= 555 227= Contudo? o invento de conjugados não devia ser construído como limitado à utilização daquelas concretizações particulares de péptidos PND cíclicos de HIV, Outras sequências de péptidos PND de HIV lineares podem ser ciclizadas essencial mente da mesma forma utilizada para propor-cionar aquelas péptidos* Podiam ser geradas séries de péptidos tendo [email protected] primárias divergentes e seriam benéficas neste invento desde que continuassem a induzir uma resposta imune anti-péptido, anti-HXV ou neutralizanta da HIV» c» Ciclização através da Formação ds Ligação Afflida

Os novos péptidos PND de HIV cíclicos ligados por amida podem ser preparados por conjugação, essencial menta sm duas fasess Primeiro, é preparado o pèptido linear, por exemplo num sintstizador tíe péptidos ABI-43ÍA, pela química sintética ds péptidos em fase sólida, por exemplo utilizando a química de Fmoc s aminoâcidos apropriadaments Fí?ioc protegidas na cadeia lateral, como reagen tes =

Segundo, o péptido linear é clivado a partir da resina e ciclizado em solução permitindo que o terminal amino livre do péptido, o grupo amino livra de uma isoglutamina ds terminal amino, ou uni grupo €--amina ou fí-amino livra de unia lisina num lado dos aíiiinoácidos em laçada, seja ligado por amida a um qrupo carboxilo livre no lado da terminal carboxilo dos aminoécidos em laçada através da formação de ligação peptídica mediada por DPPA? BOP ou u.ik reagente similar»

Os produtos obtidos podem ser caracterizados por espectrofiíetria da massa com bombardeamento rápido de átomos

ChAB-ríbj , HPLC de fase inversa, análise da aminoácidos ou espsc-troseopia de ressonância magnética nuclear íEMi\!> »

Assim, as concretizações sltemente preferidas deste / invento são conjugados, tendo liqaçSes covalentes da HIEP a um PND da HIV cíclico ligado por amida, preparados como anteriormen-te descrito. Onde o PMD for de um isolado predominante, tal como o isolada ΙΙΪΒ de HIV ou MN de HIV, uma vacina conjugada ou uma mistura da tais vacinas de conjugado, á altamente vantajoso para profilaxia ou tratamento da SIDA ou ARC. Gs exemplos de tais concretizações preferidas tendo a estruturas a) Γ MIEP- N-C-CH-CHj-C^-S II I r 0 NHCOCBj

O

Η O I II CHjCHj-C-N-Nle-NCCHj)4-C-C- His-Ile-Gly-Pro-Cly- Arg-Ala-Pho C«)

I H-N—C ¢2¾) 2 CH ° HjNOC

-N-C*0 i H V)

H MEP— N-C-ÇH-CHj-CHj-S „ 0 NHCOCHj T>

0 H

Η O l II

CKjCHj-C- N-Nle- N-C-C-Gln- Arg-Gly- Pro-Cly-Arg C«) I I

CÇHa)4 (e) n—C-H S

Ala . -Phe J ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em qu.es j e a percentagem em massa de péptido no conjugado e está preferivelmente entre 1% e 5Φ% da massa de proteína total no conjuga-do 5 e-ao ateie para induzir respostas imunes anti—péptido em mamíferos, para induzir anticorpos neutralizantss de HIV em mamíferos,

para formular vacinas para impedir a doença ou infecçlo por HIV ou para tratar humanos atingidos pela doença ou infecçlo do HIV, incluindo SIDA ou ARC,

Uma ou mais das vacinas conjugadas deste invento podem ser utilizadas em espécies ds mamíferas quer para protecção activa quer passiva profilacticamente ou terapeuticamente contra agentes infecciosos tais como, na concretização preferida deste invento, Haemophilus insf luenzae serotipo B, ou doenças induzidas pelo vírus da imunodeficiência Humana, A protecção activa pode ser realizada por injscçlo ds uma quantidade eficaz capaz de produzir quantidades mensuráveis de anticorpos <por e:iSíipIo, cerca de i mícrograma a cerca de 5© pq, dependendo do antigénio) de um antigénio (por exemplo PRP, péptidos PND de HIV) na forma de r1IEP"Conjugado de cada um dos conjugados a ser administrado por dose, A utilização de um adjuvante (por exemplo, alúmen) pretende também estar no âmbito deste invento, A protecçSo passiva pode ser realizada por injecçáo do antissoro total obtido a partir de animais previamente doseados com o ΜϊΕΡ-conjugado ou conjugados, ou a giobulina ou outras fracçQss contendo anticorpo dos referidos antissoros, com ou sem um veículo farmaceuíicaments aceitável, tal como uma solução salina estéril, Tal giobulina é obtida a partir do antissoro total por cromatografia, fracciona-msnta em álcool ou sal ou e lectrof ore-se, h protecçSo passiva pode ser realizada por procedimentos de anticorpo monoclonal padrão ou por imunização de hospedeiros mamíferos adequados.

Numa concretização preferida deste invento, o conjugado é utilizado para vacinação imunogénica activa de humanos, espe— ciaímente recém-nascidos e crianças, indivíduos imunocomprometi— dos. Para estabilidade adicional, estes conjugados podem também ser liofilízados na presença de lactose (por exemplo, a 20 pq/mL de PRP/4 mg/mL de lactose) antes da utilização. s c ε

Um nivel de d OSíi ugem UfH dos MIEP -conjugados ' H Γ"?Ι ! cor í >m w’ ponden do a entre apr "Ο Λ i de í m icrogr ama a 5 mil ig? ^ama juç J-Sdo para c on juqados dia *4<J *M. pc= ? ou pèptido PND de pr« i sndo é í Asna quanti .dade de cada seu derivado a ser administrada. mademente 2 e |j.g d e PRP, ou cerca s de péptido na forma de HlEP-con- necessário, podem também ser adicionais do MIEP-eonjugado í i^sacândi o de H * xn i iuacae, ssru·- HIV, numa única administração» Se administ radas uma ou duas doses h ou seu dor i ysdo? numa dosagem XfBâ « coinparaveí aqueia des 0 invento é definido adicionalmente por referencia exemplos seguintes, que se pretende que sejam ilustrativos e não

Preparação do OKPC de Msisssria meningitidis Bli serotipo 2 A. Fermentação I. Nsisseria meningitidis grupo BI 1

Um tubo contendo a cultura liofiliçada ds Nsisseria meningitidis <obtida a partir ds Dr = M, firtsnstsins Walter Esed Array Institute of Research (WRAIR)» Washington,, D = C.) foi aberto e foi adicionado Eugonhroth (BBL). A cultura foi riscada em declives ds ágar fluelier Hinton s incubada a 37*0 com 00.-., a 5% durante 36 horas3 tempo no qual o crescimento foi colhido em meio de leite desnatado a 10% ÍDifco), e as aliquotas foram congeladas a ™70°C= A identidade do organismo foi confirmada por aglutinação com antissoro especifico fornecido por WRA1R, e soro padrão fornecido por Difco.

Um frasco da cultura da segunda passagem foi desconge-lad o s riscado para 1Θ placas de ágar Columbia Bheep Blood <CBAB~BBL), As placas foram incubadas a 37°C com C0_.., a 5% durante 18 horas após o que o crescimento foi colhido em I@# mL de meio de leite desnatado a 10%= as aliquotas foram retiradas em quantidades de €>,5 mL e congeladas a ·~7Θ°0„ 0 organismo foi identificado positivaments por aglutinação com antissoro específica;, fermentação em açúcar e coloração Oranu

Um frasco da cultura desta passagem foi descongelado., diluído com Mueller—Hinton Broth e riscado em 4Θ placas de áqar ds Mueller-Hinton= As placas foram incubadas a 37 *C com 00^ a 6% durante 18 horas após o que o crescimento foi colhido em 17 mL ds 3

maio de leite desnatado a í®%¥ foram retirarias aliquotas mt quantidades de ®s3 ml. e congeladas a -7Θ°0, 0 organismo foi identificado positivamsnte em coloração 8ram3 aglutinação com antissoro específico e teste de DKidase» 2, Fermentação e recolha da pasta de células a* Desenvolvimento do Inócuio-· 0 inócuio cresceu num frasco congelado de sveisseria meninqitidis do Grupo B, B~ii do acima (passagem 4), Foram inoculados dez declives de ágar Muel ler-Hinton s seis foram colhidos sprojiimadaments 18 horas mais tardes s utilizados como inócuio para 3 frascos de 25® mL de meio dialisado ds levedura de Gotschiich a pH 6,35« A DoGsèè0 TQ1 ajustada a ®,18 e incubada até a 0 = 0.,,,. estar entra i a 1,3= 1 mL desta cultura foi utilizado para inocular cada um dos 5 de 2L= Os frascos Erlenmeyer (cada um contendo 1 Litro de meio; vsr abai;-io) e incubados a 37°C num agitador a 2®Θ rpm, A D,0« foi monitorizada a intervalos de uma hora a seguir è inoculação, Resultaram 4 litros de caldo de cultura3 numa de 1,28,

Fermentatíor tíe Sementes de 7® Litros- Foram utilizadas aproKimadamente 4 litros de cultura de sementes para inocular um fermentador de 7Θ Litros estéril contendo cerca de 4® litros de meio de produção completo (ver abaino), As condições para a fermentação de 7®-litros incluíram 37°C, 185 rpm com pulverização de ar de í® litros /minuto e controlo de pH constante a cerca de pH 750 durante cerca de 2 horas, Para este lote, a 0,0.,,, final foi de ¢3,,732 após 2 horas,

Fermsntador de Produção de Bw-Litross

Foram utilizados aprozimadaments 4® litros ds cultura de sementes para inocular um fermsntador de B:M4· litros estéril if £

Ci

contendo 568,2 litros de meio de produçSo completo íver abaixo). Este lote -foi incubado a 37 °C, i®® rpm com pulverizaçSo de ar de 6® litros/minuto e controlo de pH constante a pH 7,®,, Para esta porçSo, a D.Q. final foi de 5,58 treze horas após inoculação» 3= Meio Completo para Frascos Erlenmeyer e fermen--tadorss de 7® e 8®ô~litros»

EoesiiLJl. ácido L-glutlímicD 1,5 g/litro MaC 1 6.® g/litro NaoHP04, anidro 2,5 g/litro ΝΗλ01 1,25 g/litro KOI ®„®9 g/litro L”cistsína HC1 ®,®2 g/litro

FrscçSo B (Dialíssdo da Levedura de Sotschlichlí

Foram dissolvidos 128® g de Extracto de Levedura de Difco em 6,4 litros de água destilada» A solução foi dialisada em 2 unidades de diálise de fibra cêncava Amicon DC~3® cam ir®s cargas Hí®Sri„ Foram dissolvidos 384 g de MgS0^»7H^0 e 32ΘΘ g de dsxtrose no dialisado e o volume total levada até 15 litros com água destilada» O pH foi ajustado a 7,4 com NaOH, esterilizado per passagem através de um filtro de ®,22 μι, e transferido para o fermentador contendo a Fracçlo A» Β4

Para ds frascos Erleruneyers Foram adicionados í litro de FracçSo A e 25 mL de FracçSa B s o p-H foi ajustado a 7..0-7,2 ca® NaGHn

Para o fermsntador da 70 litross Foram adicionados 41,8 litros ds Fracção A e 9ΘΘ mL de Fracçio B e o pH foi ajustado a 7,0-7,2 com NaOl-L

Para o fermsntador ds 8ΘΦ litross Foram adicionados 553 litros de FracçSa A e ί5,θ mL ds Fracçla B e a pH foi ajustada a 7 5 Φ—7 p 2 cdís NaOH „ d» Colheita e Inactivaçãos

Após a fermentação estar completa, foi adicionado fenol num vaso separado, para o qual o caldo de células foi então transferido, rendendo uma conceniraçlo em fenol final de cerca de 0,5L 0 material foi mantido à temperatura ambiente com agitação cuidadosa até que a cultura não seja mais viável (cerca de 24 horas). eu Cent r i fu q açlo

Após cerca ds 24 horas a 4°C, os 614,4 litros de fluido de cultura inactivada foram centrifugados através de centrífugas de fluxo continuo Sharples, 0 peso da pasta ds células após tratamento com fenol foi de 3,075 kg„

Isolamento do ΟΗΐ-'ϋ

Passo 1, Concentração e diafiltração A cultura inactivada com fenol foi concentrada para cerca da 30 litros a diafiltrada em água destilada estéril utilizando filtros de fibra cfíncavs de Θ.,2 μ CENKA).

Passo 2» Extracçao

Um volume igual de tampão 2X TED £ tampão TRIS Θ,Ι M EDTA Θ,01 M, pH 8,5, com desoxicolato de sódio a θ,5%3 foi adicionado ás células diafiltradas concentradas» A suspensão foi transferida para um tanque ds temperatura regulada para extracção do OMPC a 56°C com agitação durante 30 minutos» 0 extracto foi centrifugado a cerca de 18βββ rpm numa centrífuga de fluxo continuo Sharples a uma velocidade de fluxo de cerca de 80 mL/minuto, a cerca ds 4°C* Q sobrenadants viscoso foi então recolhido e armazenado a 4°C» As pelotas de células extractadas foram reextractadas em tampão TED como descrito acima» Os sobrenadant.es foram reunidos e armazenados a 4°C»

Passo 3» Concentração por UItrafiltração 0 extracto reunido foi transferido para um vaso de temperatura regulada ligado a filtros de polissulfona ds Θ,Ι micron AB-Tech» A temperatura do extracto foi mantida a 25*C no vaso ao longo do processo de concentração» A amostra foi concentrada dez vezes a uma pressão de transmembrana média entre 75,79 e 165,30 kPa»

Passo 4» Colheita e Lavaqem do UMPC 0 retido do Píí/ssq 3 foi cer 's X. V X s ϋ.ϋΐΓ^Ο w :*í ΐ y»·» P d Qp* 1600Θ0 K y (; Λ3?·ΤΚ^;λ7 rpm) a cerca de 7 0°C numa centrífuga de fluxo c on tinuo a uma V01 oc .idade ci0 tíuko ο π tre 3®0 a 50Θ mL/minuto, e o sobre- nadan t.0 "fox rejeitado» h pelota de UMPC foi suspensa em tampão TED ( 1V0 mL de tampãog 20 mL/g de pe i o ta} e o Passo 2 e Passa 4 f oram r8ps t idcis duas vszes ( omifindo o Passo 3>»

isso 3« recuperação da Produto OMPC ODUHCS aquosa fo um fil tro j: ϋ ί 4* ¢.- "i U0

As pelotas lavadas do Passo 4 foram suspensas em 1@Θ mL de água destilada com uma vareta de vidro e um homogsnsisadar asseqursr a suspensão completa» A suspensão de OMPC eefárí 1 tif i ‘i -> SC.X i -B.ÚS. u,úiiisa*íljo uni Til cro :ibra côncava de Θ„1 e H«___inxiy.o=iS.as tipo b

Pr s p a r a l. a o o o <PRP) larido caosui iiesenναivxmenca dos ímcluíu tn -"««mente

Fa· um cufeo 1 IDt 1 !c\Qí-í G£?

SBluC oohi 1

i i U.S mtiuensae s-s /68, recebido da State em t mL de meio de inóculo o) e esta suspensão fox tipo b5 (cultivado a partir de R Universiiy of New York) foi suspenso de HaeiTiOohi 1 us estéril (ver abai

espalhada em 9 declivas de Agar Chocolate CBBL).« O pH do meio de inóculo foi ajustado a 7,2 + Θ,ί (um valor iipico foi pH 7,23) e a solução de meia foi esterilizada antes da utilização em auto-clave a 121*0 durante 23 minutos» Apés 20 horas de incubação a 37 °C num pote de vela, α crescimento de cada placa foi ressus-panso em 1-2 ml. de meio de inóculo de Baemoohilus, e foram reunidos paras de declives» liei o de Inéculo ds Hasmoohilus g/Litro Peptona ds soja 10 NaC 1 5 HaHnP04 3,1 Na2HP04 13,7 κ,,ηρο, ώ. H* 2,5 áqua destilada até volume

As células ressuspensss de cada par de declives foram inoculadas em três frascos Erlenmeyer de 25@ mL contenda cerca de 1ΦΘ mL de meio de Produção e de Semente de Haemophi1usa Os frascos de 256 mL foram incubados a 37°C durante cerca ds 3 horas até ser alcançada uma D0,,._. de cerca de 1=3» Estas culturas foram òou utilizadas para inocular os frascos de 2 litros CabaiKo)= contendo

Fase Bs Frascos Erlenmeyer não despistados íBaffled) d® 2 litros- foram utilizados 5 mL de cultura da "Fase A55 (acima) para inocular cada um dos cinco frascos de dois-litros.

HM

Um valor de típico no fim do período de incuba- cada uni cerca de Ι,β litro ds meio de produção-e de sementes de Hasmophilus completo (ver abaixo). Os frascos foram então incubados a 37*C num agitador rotativo a cerca de 2ΘΘ rpm durante cerca de 3 horas çSo foi de cerca de 1,0»

Meio de Produção e de Semente de Hagmoofíiius Completo

Por litro

Mal-UPO^ 3,1 g/L

aL 'T

Na^HPO^ 13,7 g/L

Peptona de Soja 10 g/L

Diafiltrado de exiracto de levedura (1) 10 g/L

K?HP04 2,5 g/L

MaCl 5,0 g/L

Glucose (2) 5,0 g/L

Adeninadinucleólido de Nicotinamida

(WAD) (3) Ξ mg/L

Hemina <4> 5 mg/L

Os sais s a peptona ds soja foram dissolvidos em pequenos volumes ds água livre de piroqénios, quente e levadas a.o volume final correcto com água livre de piragársios quente adicional» Os ferroentadores ou frascos foram então esterilizados em autoclave durante cerca ds 25 minutos a 121 °C,, e após arrefecimento foram adicionados, assepticamente» diafiltrado de extraeto ds levedura (1), glucose C2>, NAD (3), e Hemina (4) aos frascos ou fermentadores antes da inoculação»

Ci) Diafiltrado ds extracto de leveduras foram dissolvidos 1©@ g de extracto de levedura de cervejeiro (Ainher) em 1

litro de água destilada e ulirafiltrados utilizando uma unidade de fibra cSncavs Amicon DC»3© coni csrgas Hl© κ 5© com um corte (cutoff) de 5© kd» 0 filtrado foi recolhido s esterilizado por passagem através de um filtro tís @g22 μ» (2> A glucose foi preparada como uma solução a 25% estéril em água destilada» <3> Uma solução armazenada de NAD contendo 2© mg/mL foi esterilizada por passagem através de um (filtro de 9,,22 μ) e adicionada assspticamente iinediatamente antes da inoculação» (4) Uma solução concentrada ds Hemina 3% foi preparada por dissolução de 2Φ& mg em 1Θ mL de NaOH Θ,Ι M e o volume ajustado com égua estsri1izada? destilada até 1©© mL» A solução foi esterilizada durante 2© minutos a Í21°C e adicionada assenti™ camente ao meio final antes ds inoculação»

Fase Cs Fermentador de Sementes de 7©--litros™ Três litros do produto da Fase B foram utilizados para inocular um fermentador contendo cerca de 46» litros de Meio de Produção e de Semente de Haemoohilus completos (preparado como descrito acima) e 17 mL de agente anti-espuma UCON B625» 0 pH na inoculação foi de 7»4»

Fase Ds Fermentador de Produção de 8Θ0-litros- Foram utilizados aproximadamente 4Θ litros do produto do "Fase CH para inocular um fermentador de 8©õ-litros contendo 57© litros de Meio de Produção e de Semente ds Haemoohi1us (preparado como descrito acima)s medido até ao volume necessários e foram adicionados 72 fúL de agente anti-espuma UCON LB625»

A fermentação foi mantida a 37 °C .com· ' agitação a 1ΘΘ rpm5 com a D.O.^^ e níveis "6δΘ de pH medidos aproKimadamente em todas as duas horas até a DO.. estabilizar durante um período de duas horas5 após o que a fermentação foi terminada Cuma DO,, final típica foi de cerca de 1,2 após cerca de 2Θ horas).

cQLHEim,...E_iMAmmíM

Foram inactivsdos aproKimadamente 6ΘΘ litros do lote por colheita num ” tanque de morte51 contendo 12 litros de ti me rosa 1 a 1 %«

CLARIFICAÇÃO

Após IS horas de inactivação a 4°C, o lote foi centri-fuçado numa centrífuga de fluxo continuo Sharples com taça ds 10, ió cm a uma velocidade ds fluxo ajustada para manter a clareza do produto (variável entre 1 „3 e 3,6 litros por minuto),, 0 sohrenadante obtido após centrifugação <15Φ6Θ rpm) foi utilizado para recuperar o produto,,

ISOLAMENTO E CC

&cm POR ULTRAFILTRAQ^Q 0 sobrenadante de duas fermentações de produção foi reunido e concentrado de 2 a 8°C numa unidade de ultrafiltração

Eoiiiicon Xrl~50 com vinte cangas de fibra côncava com um corte v

Ccutott) de 5Φ kd (área de membrana 4=5 m \ fluxo de ar 2,0 Lpm s 137,8 kPa)» A concentração foi tal que após aproximadamente 4,5 horas, cerca tíe 19ΘΘ litros tinham sido concentrados para 57,4 litros. 0 filtrado foi rejeitado.

PRECIPITAÇÃO COM ETANQL.....A 48%

Foram adicionados» gota-a-gota, aos 57,4 litros ds retido por ultrafiltração, 53 litros ds etanol a 95% durante í hora com agitação a 4*0 para uma concentração final da etanol a 48% em volume» A mistura foi agitada durante duas horas adicionais a 4*C para assegurar a precipitação completa, e α sobrena-dants foi recolhida a seguir â passagens através de uma única centrífuga de fluxo continuo Sharples de 10,16 cm a 15Θ&Θ rpm a uma velocidade de fluxo de cerca ds 0,4 litros por minuto» A pelota foi rejeitada s o fluido clarificado foi trazido para etanol a 82% com a adição ds 40,7 litros de etanol a 95% durante um período de uma hora» A mistura foi agitada durante três horas adicionais para assegurar a precipitação completa» recuperm^Q Dâ...SEtyMM..EiLQIâ Q precipitado insolúvel em etanol a 82% a solúvel em etanol a 48% resultante foi recolhido por centrifugação numa centrífuga de fluxo continuo Sharples de 10,16 cm a 15000 rpm com uma velocidade ds fluxo de cerca de í>,24 litros por minuto & foi rejeitado o sobrenadante em etanol a 82%. 0 rendimento de produto bruto foi de cerca de 1,4 kg de pasta húmida»

iKIBBCcsg„.mjxgREio......DE.....CÁLCIO 0 1,4 kg do material insolúvel em etanol a 82%, foi misturado num vaso de dispersão Daymax 2°~8*C com 24,3 litros de água destilada, fria» Foram adicionados a esta mistura, 24,3 litros ds CaC 1^.21-i^Q 2 ΙΊ, frio, e a mistura foi incubada a 4*C durante 15 minutos» 0 vaso foi então lavado com 2 litros de CaCl^.SH^Q 1 M, resultando em cerca de 5Θ litros de volume final» PRECIPITADO CQfl ETANQL_... A__25%.

Os 5® litros ds extracto ds CaCl„ foram trazidos para stanol a 25% por adição gota-a-gota ds 16,7 litros ds stanol a 95% com agitação, a 4°C durante 3Θ minutas. Após agitaçãa adicional durante 17 horas,, a mistura foi recolhida por passagem através ds uma centrífuga, ds fluxo continuo Sharples a 4*0=, Q sobrsnadants foi recolhido s a pelota foi rejeitada,, PRECIPITAÇÃO COH ETANOL· fi 38% £ RECOLHA DA. PASTA.......ΡΕ_ΡΒ0ΡϋΙΟ

BffiJTO 0 sobrsnadants solúvel em stanol a 25% foi trazido para etanol a 38% pela adição gota-a-gota de 13,9 litros de stanol a 95%, com agitação, durante um período de 3® minutos. A mistura foi então deixada premanecer com agitação durante uma hora, depois sem agitação durante 14 horas, para assegurar a precipitação completa. A mistura resultante foi então centrifugada numa centrífuga de fluxo continuo Sharples de 10,16 cm a 15ΦΘΘ rpm <velocidade de fluxo de ®,2 litros par minuto) para recolher o precipitado de polissacárido de H. influenzae bruto. lEnuBâSia A pelota da centrifugação foi transferida para um misturador Waring ds 4,545 litros contendo 2 a 3 litros da etanol absoluto s misturada durante 3® segundos à velocidade maior. A mistura continuou durante 3® segundos ligado Con), e 3® segundos desligado (of), até resultar num ρ6 branco duro. 0 pá- foi recolhido num funil de Buchnsr com um disca de filtro de tsflon & lavado sequencialmente, in situ, com duas porções de í litro de stanol absoluto e porções de 2 litros de acetona. 0 material foi então seca5 in vácuo* a 4°C durante 24 haras, resultando em cerca de 337 g (peso seco) de produto*

Cerca de 168 gramas do material seco do passo de trituração (cerca de metade do total) foram ressuspensos em 12 litros de acetato de sódio ®,488 M, pH 6,9, com a ajuda de um vaso da dispersão Dsymas-i* A solução de acetato de sódio foi imediatam-snte SKtractada com 4,48 litros de uma solução de fenol aquosa fresca feita como se segues 590 mL de acetato de sódio ®,488 ti, pH 6,9, foram adicionados a cada uma de oito garrafas de 1,5 kg de fenol (Mallinckrodt cristalino) num vaso de pressão de 2© litros e misturados na suspensão. Cada eictracto de fenol foi centrifugado durante 2,5 horas a 3000Θ rpm s 4°C na ultracentri-fuga K2 ÍEIectronucIeonics;* 0 efluente aquoso foi entractado tr@s vezes adicionais com solução de fenol aquosa fresca como descrito acima* As fases de fenol foram rejeitadas*

ULTRAFILTRACSQ A fase aquosa da primeira eKtracçlo com fenol acima (12,2 litros) foi diluída com 3Θ0 litros da água destilada fresca e diafiltrada a 4°C num aparelho de ultrafiltração Amicon BC-30 utilizando 3 cargas de corta (cutoff) de ίθ kd, H10PÍ0, para remover o fenol de transporte» A unidade Amicon foi lavada e a lavagem adicionada ao retido, tal que o volume final foi de 31,5 litros* 0 uitrafi1 trado foi rejeitado* FRECIFITACSO.....COM.....ETftNOL A 67%

Foi adicionado 0,81 litro de CaCl^ 2,0 M aos 31,5 litros de dialisado do passo anterior (a concentraçãa de CaCl^

.•cL 94 final foi da ®,®o rí> e a solução foi trazida para etanoi a 82% ccnií adição gota-a—gota e agitação rápida durante uma hora, de 4855 litros de etanoi a 95%» Após 4 horas de agitação, depois da manutenção durante 12 horas a 4°C, o sobrenadante foi escoado por meio de sifão e α precipitado foi recolhido por centrifu.gaçao numa centrifuga de fluxo contínuo Sharplss de 10,16 cm (158ΘΘ rpm) 5 a. 4°C durante 45 minutos» A pelota ds polissacárido resul·--tante foi triturada num misturador Waring de 4,545 litros utilizando vibrações de 3® segundos com 2 litros de etanoi absoluto, recolhido num funil de Buchner equipado com um disco de filtro de teflon, s lavada» in situ- com quatro porçSes de í litro de etanoi absoluto seguido por duas porçges de 1 litro de acetona» A amostra foi então seca num prato pesado, in vácuo, a 4°C durante 2® horas, 0 rendimento foi de cerca de 1®2 gramas de pó seco, 0 rendimento de todas as sxtrscçSes com,fenol foi reunido resultando num total de 212,6 gramas de pó seco»

UklBílMÍ^^___29%_LJíECfíUaâ_BQ__fBMUTO

FINAL

Os 212,6 gramas do pó seco acima foram dissolvidos em 82»? litros de água destilada, aos quais foram adicionados 2,13 litros de 0501^,211^0 2 M, CCaCl^ ©5®5 M> , 2,5 mg de políssacári-do/mL>, s a mistura foi trazida para etanoi a 29% com adição gota-a-gota de 29,86 litros de etanoi a 95% durante 3® minutos» A mistura foi clarificada imediatamante por centrifugação numa uitracentrifuga í<2 contendo uma taça de titãnio !<3 e um núcleo Noryl Kii (3®®tí® rpm s 150 sL por minuto de· velocidade da fluxo) a 4°C» A pelota foi rejeitada e o sobrenadante foi trazido para etanoi a 38% peia adição ds 17,22 litros de etanoi a 95% durante 3® minutos com agitação,, Após agitação durante 3® minutos adicionais a mistura foi deixada premanecer sem agitação a 4°C durante 17 horas e o precipitado foi recolhido utilizando uma centrífuga

„ Qj:rt _ de flu.KD contínuo Sharp?los de 10,16 cm a 15ΦΦ& rpm (foram requeridos 45 minutos)„ A pasta resultante foi transferida para um misturador Waring de 4,545 litros contendo 2 litros de etanol absoluto e misturada à maior velocidade durante 4 ou 5 ciclos de 3Θ segundos ligado5 30 segundos desligado., até ser formado um pó branco duro. Este p6 foi recolhido num funil de Buchner equipado com um disco de teflon Zitex e lavado sequencialmente, in situ, com duas porções de Φ,5 litros, frescas e uma porção de í litro de etanol absoluto? a com duas porções de X litro de acetona. 0 produto foi removido do funil e transferido para um prato pesado para secagem? in vácuo, a 4°C (durante 25 horas)» 0 rendimento final do produto foi de 79,1 gramas de peso seco»

Clonagem do liNA qenómico que codificação a lilEP

Foram colocadas cerca de ©?i g das células de N„ meninqitidis inaciivadas com fenol (ver Exemplo 1) num tubo fresco» As células inactivadas com fenol foram ressuspensas em 567 μΐ. de tampão TE ETRIS-HC1 ίΦ mM? EDTA 1 mM, pH 8?Θ3. As células ressuspensas foram adicionados 3Θ μΙ_ de SDS a ΧΘΧ, e 3 μ!_ de 2Θ mg/ml. de proteinase K (Sigma)» As células foram misturadas e incubadas a 37°C durante cerca de X hora» apés o que foram adicionados 1®Θ μϋ_ de NaCl 5 M e -agitados vigorosamente. Foram então adicionados 8Θ μ-L de brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB) a 1¾ em NaCl 0,7 M? misturados vigorosamente? e incubados- a -65°C durante 1Θ minutos» Foi adicionado um volume igual (cerca de Θ57 a 0?8 mL) de clorofórmio/álcool isoamilico (a uma rasSo de 24sl, respectiyamente), misturado vigorosamente e centrifugado a cerca de 10000 κ g durante cerca de 5 minutos» A fase aquosa (superior)

fai transferida para um novo tubo e a fase orgânica;foi rejeitada» Foi adicionado à fase aquosa um volume iqual de fanal/cloro-fórmio/álcool isoamilico <a uma rasa o de 25:24;i, respeciivamen-te>, misturado vigorosamente, e centrifugado a ΙβΘβ# κ g durante cerca rje 5 minutos» A fase aquosa (superior) foi transferida para um novo tubo e foram adicionados ®sò volumes (cerca de 42Θ μΙ_> de álcool isopropílico, misturados vigorosamente, e o DNA precipitado foi csntrifugada a ΙΘ00Θ κ g durante 1® minutos» 0 sobrsna-dante foi rejeitado, e a pelota foi lavada com etarso 1 a 7Θ%» A pelota ds DMA foi seca e rsssusperssa em 10® pL de tampSo TE, e representa o DMA genónsico de N, meningitidls»

Foram sintetizados dois oligonucisótidos de DMA que correspondem ao terminal 5' do gene MIEP a ao terminal 3' do gene MIEP EMurakami, E«C», et al. „ <Í989>, Infection and X ismun i ty, 57» pg« 2318-233, A [email protected] dc# oligonucleótido de DMA especifica para o terminai 5' do gene MIEP foi: 5' -ACTAGTT8CAAT8AAAhAATCCCT8-3 ' | s para o terminal 3" do gene MIEP f oi s 5'—GPíATTCASATTAGGAATTTGTT-3'« Estes oligDnucIeéiidos de DMA forans sutilizados como iniciadores para a amplifisração da rsacção de cadeia da polimerase (PCR) do gene flIEP utilizando 1® nanogramas de DMA genómico de M, meningitidis, 0 passo de amplificação da PCR foi realizado ds acordo com os procedimentos fornecidos pelo fabricante CPerkin Elmer), 0 DMA as MIEP amplificado foi entáD digerido com as endonucleases de restrição Spel e EcoRI, 0 fragmento de DNA de 1»3 kilobasB (kb>, contendo a região sie codificaçã?:i completa da MIEP, foi isolado por electroforese num gel de agarose a í,5%, e recuperado do osl por slectroeluiçSsD ECurrent Protocols iri Molecular Biology, (1987), Ausufael, R,M., Brerit, R., Kingston, R-E», Moore, D = D», Smith, Seidman, «3.Θ. e Struhl , K. , edições, Breene Publishing Assoe*3« \ . Ο vector plasmideo pUC-19 foi digerido' com Spel e EcoRI « 0 DNA de HIEP Spel-EcoRI purificado em gel foi ligado ao vector pUC-19 Spel-EcoRI © foi utilizado para transformar a estirpe de E, coli DH5» Os transformantss contendo o vector pUC-19 com o DMA de HIEP ís3 kpb foram identificados por elaboração de um mapa com endonuclease de restrição^ e o DMA de rilEP foi sequenciado para assegurar a sua identidade»

ConstrugSa......do..vector pcl/1..6a.l 0 promotor Gal í® foi isolado a partir do plasmideo YEp52 EBroach, et aL, CÍ983) em Experimentai Nanipulation of Sene Expression* Inouye,, M(Etí) Academic Press pgs„ 83-1173 por purificação em gsl do fragmento ds ®g5 quilo parss da bases Ckpb) obtida após clivagem com Sau 3A e Hind III» 0 tersninatíor ADHi foi isolado a partir do vector pGAP.!tADH2 EKniskern» et a 1 „, <i98á>>?

Gene, 46, pg. 135-1412 por purificaçSo em gel do fragmento de ®y35 kpb obtido por clivagem com Hind III e Spel„ Os dois fragmentos foram ligados com a .DMA ligase 14 ao vector puclSdeltarfind 1I1 purificado em gsl Cd sitio Hind III foi eliminado por digestão do pUCiS com Hind III» terminação coesiva com o fragmento Klsnow de DNA polimerase I de E» coli,; e ligação com DMA ligase 14) que tinha sido digerido com BamHI e Sohl para criar o vector

de origem pSa1lô-tADHi» Este tem um sitio de clonagem Hind__III único na junção Salíôp.fíDHi^. 0 sitio ds clonagem Hind 111. único de Oalí#p*tADHí foi mudado para um sitio ds clonageas BamHI único por digestão de 8a1i®p =tADHl com Hind III» purificação em gel do DNA cortado? e ligação.i utilizando DNA ligase T4,; ao seguinte ligando Hind Lll:zêãiiàíL‘ 90 5'-ASCTCBSATCCS-3' 3r-BCCTA66CTCBA-5', Q plssmideo resultante,, pSali©íB)tADHi3 delecionou o sitio Hind III e gerou um sitio de clonagem BamHI único. 0 fragmento [email protected] foi isolada a partir de pBalÍ0<B)tftDHl por digestão com SmaI a Sohl„ terminado coesiva- mente com DMA polimerase T4? e purificado em gel. 0 vsctor de vai-vem (shuttle) de levedura pCl/i EBrake et al.. (1984). Proc.

Nat'1. Acad. Sei. EUA, 8_i5 pg. 4642---4é4è3 foi digerido com Sph.I. terminado coesivamente com DNA polimerase T4=, não purificado.

Este fragmento foi ligado ao vsctor com DNA ligase. A mistura reaccional de ligação foi então utilizada para transformar células de E. coli HBl@í para células smpici1ina-resistentes3 e os transfarmadores foram anlisados por hibridação numa linha 3·? única do ligando Hxnd 111 BamHí marcado com " ?, A nova construção do vector, pcil 1 .Oal l©p(B>ADHl^. foi confirmada por digestão com Hind......Ijl, e lamH|,. EXEMPLO 5

Construção de um Vector de fc.M pressão de MIt.P de Levedura com MIEP Seqyfnciss de DNA iniciadoras Cleader)

Um fragmento de DNA contendo a região de codificação completa de MIEP foi gerado por digestão do pUC19»MIEP #7 com ifíSLl & EcoRI, purificação em gel do DNA de MIEP,, terminado coesivamente com DNA polimerase T4 99 0 vsctor de expressão interna . de levedura pCI/1»BalΙθρΐΒΙΑΟΗΙ^ foi digerido com BêtmHX π desfosforilado com fosfatase alcalina de intestino de vitelo,, e terminado coesivamente com DNA polimerase T4 = 0 DNA foi purificado em gel para remover o vsctor não cortado»

0 fragmento,, terminado ccíssivamente, 1 „ 1 kpb de MIEP foi ligado ao vsctor pCi/1 ,= Bal iôp(B) ADH1terminado coesiva- sientss a mistura rsaccional de ligação foi utilizada para transformar células de E» coli DHS competentes para células ampicilina-rssistsntss» Os transformadorss foram analisados por "T-2 hioridsçSa num aligonuc:leótido de DNA marcado com rs AABCTCB6ATCCTASTTBCAATB,» » .3* , que foi concebido para ser homólogo com sequfncias que se sobrepoem ã junção de MIEP--vsctor. Foram feitas preparsçSss de DNA a partir da hibridação de transformantes positivas e digeridas cqoi Kpnl s Sa 11 para verificar que o fragmento de MIEP estava na orientação correcta para expressão da promotor Sali©» A confirmação adicional da construção de DNA foi obtida por didesoKi-sequenciaçlo do promotor Gali0 na rsgiSo da codificação de MIEP. A expressão da MIEP pelos transformantes foi detectada por análise de mancha Western. A MIEP recombinants produzida nos transformantes co—migrou em geles de poiiacrilamida com a MIEP purificada a partir de vesículas de OnPC? e foi imunologicamente reactiva com anticorpos específicos para a MIEP, -.λ

α V/*·;

Construção ds um Vector ds Expressão ds MIEP de Levedura cuíii uma Sequência de DNA de MIEP modificada em 5'

Um oligonucleótida de DNA contendo um sitio HindiII, um iniciador Cleadsr) não traduzido 5" de levedura conservada (NTL > =, um codlo de iniciação de metionina (ATG)3 os primeiros 89 codãos da ivílEP madura (começando com Asp na posição +2©) e um sitio Konl (na posição +89) foi gerada utilizando a técnica de reacção em cadeia de polimsrass (PCR) == 0 PCR foi realizado como especificado pelo fabricante (Perfcin Elmer Cetus) utilizando o plasmídeo ρϋ019ΝΙΕΡ4Ξ#7 como a matriz s os oligómeros de DNA seguintes como iniciadores; ΰ'CTAASCTTAACAAAA7SBACSTTACCTTGTAC80TACAATP* Ώ ACSeiACCGAA8CCGCCTTTCAA8';: .

Para remover a região 5‘ do clona de illEP,: o plasmideo pUC19r1IEP42#7 foi digerido com Kpnl s Hindi11 e o fragmento de vector 3S4 kpb foi purificado em gel de agarose» 0 fragmento PCR de 28Θ pb foi digerido com Kpnl e HindiII, purificado em gel de agarose5 e ligado com o fragmento de vector de 3P4 kpb» Os transformantes ds £»__coli HBlôí (BRL) foram analisados por hibridação de oligonuelsótidos ds DNA s o DNA de transformantes positivos foi analisado por digestão com enzima de restrição» Para assegurar que não foram introduzidas mutações durante o passo PCR, o DNA gerado por PCR de 28© pb dos transformantes positivos foi sequenciado» 0 plasmideo resultante contém uma inserção Hindi II-EcoRI consistindo em NTL de levedura3 codão ATB, e a estrutura de leitura aberta completa íuRr-j de MlbP -começando no codSo Asp taminoãcido +2®)=

Os veotores sáe expressão de rlXEP de levedura foram construídos como se segue- Os vectores pBaliS/pcl/l e pBAP/pCl/1 CVlasuk, B.P., et al,. (1989Í J.B.C,* 264. pg. 121©Ó~Í21Í23 foram digeridos com BamH!„ terminados nSo coesivamente íflush) com o fragmento Klenow de DNA polimerase I, e desfosforilados com fosfatase alcalina de intestino de vitelo,, Estes vectores lineares foram ligados com o KlenotAj tratado e o fragmento Hindi 11---EcoRI purificado em gel descrito acima- que contém o NTL de levedura, AT8 s ORF de f!IEP e formando pBal ΙΘ/pcl/HIEP e pBAP/pBAP/pCl/MIEP. A estirpe de Saccharomyces SãLÊíMãÊ U9 Cqal 1 ®pqal4-~ > foi transformada com α plasmideo pSal l@/p/pcl/r!IEP = Os clones recombinantes foram isolados e examinados para a expressão de HIEP- Os clones foram feitos crescer a 37 °C com agitação em meio sintêctico <leu~; contendo glucose a 2% íp/v) para uma D = 0» : de cerca de 6,0- Foi entSo adicionada galactose a 2% íp/v) para induzir a expressão de nlEP a partir do promotor Sal!®- As células foram feitas crescer durante 45 horas adicionais a seguir à intíuçlo com galactose a uma D-0-^^ de cerca de 9«®- As células foram então colhidas por centrifugação. A pelota celular foi lavada com água destilada e congelada.

Mancha Western para MIEP Recomfainante

Para determinar se a levedura estava a exprimir MIEP, foi feita a análise de mancha Western- SSo utilizados geles Movex Laemmlx de i® a Í5 cavidades, I mm, a doze por cento- As células de levedura foram partidas em H^D utilizando pérolas de vidro ípode ser utilizado dadecilsulfato as sódio (BDS) a 2% durante o

processo de quebra)» Us detritos celulares foram removidos por centrifuqação durante í minuto a 1ΘΘΘΘ κ g» 0 sobrenadante foi misturado com tampão de desenvolvimento de amostra, como descrito para a purificação em gel de poliacrilamida da MIEP* As amostras foram desenvolvidas a 35 mA» utilizando OMPC como um controlo de referência? até o marcador de corante bromofenol sair do gel»

As proteínas foram transferidas para papel de nitroce-iulos-Sj tamanho de poro Φ?45 μ, utilizando um aparelho de transferência NOVEK= Após transferência o papel de nitrocelulose foi bloqueado com albumina de soro de bovina a 5% em solução salina tamponada com fosfato durante i hora? após o que foram adicionados 15 ml. de uma diluição ί^ΐβθθ de snti-ríIEP de coelho (gerado com Μ1ΕΡ purificado em gel utilizando procedimentos padrão). Após incubação durante a noite á temperatura ambiente foram adicionados 15 mL de uma diluição ΙπΙΘΘΦ de IgB anti-coelho de cabra conjugada com fosfatase alcalina» Após 2 horas de incubação a mancha foi desenvolvida utilizando FA8T RED TR BALT (Sigma) e fosfato de Naphthol-AS-HX (Sigma)» 1KÍH£LQ..7

Expressão bactsriana da HIEP recombinanta 0 piasmideo ρϋ019-Μ1ΕΡ contendo a inserção de gene MIEP da l.,3 quilo pares de bases» foi digerido com endonucieases de restrição Spel e EcoRl» 0 fragmento de i,l kpfa foi isolado e purificado num gel de aqarose utilizando técnicas padrão conhecidas na arte» 0 piasmideo ρΤΑΒ3Σ>5 contendo o promotor TAC de dois cistrSes a um sítio ECORI único5 foi digerido com ECORI» Foram formadas extremidades coesivas quer no DMA de MIEP de 1,3 kpb

quer no vsctor pTACSD 5 uti 1 i zando DMA pol imsrase T4 (Boehringer Mannheins) de acorda com as dirsctivas do fabricante» 0 DMA de MIEP de i53 kpb terminado coesivamente foi ligado ao vector terminado cossivassnts utilizando DMA ligase T4 (Boehringsr ríannhsim) de acordo coo as direetivas do fabricanteu 0 DMA ligado foi utilizado para transformar a estirpe E» coli DHoalOMAX ÍBRL) de acordo com as direetivas do fabricante» As células transformadas foram colocadas em placas de ágar contendes 25 ug de canami-cina/ínL e 5Φ μα ds periicilina/mL, e incubada durante cerca de 15 horas a 37*C» Um oligonueleótido de DMA com uma sequência homóloga com SilEP foi marcado com P s utilizado para analisar filtros de nitrocelulose contendo colónias desnaturadas lisadas das placas de transformantss utilizando técnicas de hibridaçSo de DMA padrão» As colónias que eram positivas por hibridaçSo foram assinaladas em mapa utilizando sndonuclsasss tís restrição para determinar a orientação do gene HÍEP» A expressão da HIEP pelos transformantes foi detestada por análise de manchas Western» A HIEP recombinante produzida nos transformantes consignou em geles de poliacrilamitía com a HIEP purificada a partir de vesículas de OMPCs e foi imunoiogicamente reactiva com os anticorpos específicos para a HIEP»

:HiwíLO R

Preparação da HIEP Purificada a partir de lipossomas OMPC ou a partir ds Células Recambinantes por Eleetroforesa em Gel de Poiiacrilamida

Foram utilizados os geles de acrilamida/BIQ (37;!5ϊ1>,, IS κ 14 cíb» 3 mm de espessura» 0 gel de aglomeração foi de pQixacrxlamida a 4% e o gel ds separação foi de poiiacrilamida a X2%= Foram utilizados aproKimadamente 5 μα de vesícula de ί®4 proteína ou proteína de célula hospedeira recombinants por gel» Foi adicionado a 1 ml. ds OMPC snL de tampão ds amostra Cglicerol a 4%y DTT 3ΦΦ m!1» TRIS 100 mn3 Azul de bromofenol a 0,,001%.. pH 7?0)„ A mistura foi aquecida a 105¾ durante 20 minutos e deixada arrefecer até á temperatura ambiente antes de carregada no gel. Q gel foi desenvolvido a 200-400 milíamperes« com arrefecimento, até o azul de bromofenol atingir o fundo do gel. Foi cortada uma faixa vertical do gel (cerca de 1-2 cm de largura) e corada com Coomassie/acetato cúprico A faixa foi descorada até a banda de MIEP (cerca de 38 !<d) se tornar visível. A faixa foi então colocada na sua posição em gel original e a área de MIEP foi excisada a partir do restante do gel utilizando um bisturi. A área excisada foi cortada em cubos (cerca de 5 mm) e eiuida com tampão TRIS @?Θί i13 pH €)=.1,, Após 2 ciclos de eiuiçSo o eluído foi avaliado quanto á pureza por SÓS-FASE» O sluído foi combinado com ura conjunto ípool) comum de eluídos s dialisado contra tampão ds barato (ácido bórico 05í M, pH 11,5),, Após diàlise a proteína eluída foi concentrada utilizando um agitador de células Amicon com membranas YM10 (corte (cutoff) de peso molecular 1ΦΦΘ0) . 0 material foi purificado adicionalmente por passagem através ds uma coluna de tamanho PDl® (Pharmacia;. Piscataway, NJ), e foi armazenado à temperatura ambiente em tampão ds borato.

Actividads ds veículo da MIEP num Conjugado PRP-DMPC Covalente

ImunizaçSes: Ratinhos C3H/h‘elM machos (Charles River, Wilmington, MA) foram imunizados iniraperitonealmente (IP) com PRP covalentemente ligado a OriPC CPRP-QIiPC?' ccmprendendo 2,5 pg ds PRP s 17 uq de Dív!PC> ou PRP acoplado s DT \PRP~DTn contendo 2,5-2,7 pg de PRP e 1,8-5,4 pg de DT) ÍConnaught Laboratories, Willo^dale, DNT>, suspensos em 0,5 mL da solução salina de fosfato tampão CPBS) ®,@i 11= Um segundo grupo de ratinhos C3H--HeN machos, receberam quer 17 pg ds MIEP, 17 pg de OriPC, quer 17 pg de OMPG-IAA ÍOMPC- derivado com N-acetil-homocisteína tiolactona, e fechado Ccapped) com iodoacstamida)» Os dadores de células para experiências de transferência adoptiva foram imunizados duas vezes IP, com 21 dias ds intervalo, e as células de baço foram recolhidas 1® dias após a segunda imunização» Os recipientes de transferência adoptiva fora® ratinhos C3H/HeM machos dando uma irradiação gama no corpo total de 5ΘΘΡ a partir de uma fonte de 1 /C7

Cs e reconstituídos zmedxatsments por xniecçSo intravenosa ae 8 x i®' células de baço ds cada um ds dois dadores singeneicos inoculados saparsdsisente com PRP~-D7, e OMPC, MIEP, ou OMPC-lftA. v

Os ratinhos de controlo receberam a x 1®’ células de baço de um ratinho inoculado com PRP-OHPC e um número igual de células de baço a partir de um ratinho dador não inoculado» ELISA____para___anticorpo anti-PRPs Foram introduzidas aminas rsactivas em PRP ds H,_influenzae purificado por tratamen

to com carbonildiimidazol e reacçlo com butanodiamina como descrito por rlarburq et_al. s Patente dos EUA 4 8S2 317= Este PRP derivado foi eromatografado sobre Sephadex G-25 em tampão de bicarbonato de sódio ®,1 !1, pH 8 = 4= Foi adicionada N-hidroxissuc-cinimidobiotirsa CPisrce Chemical, Rockfortí, IL) em dimstilsulfó-xido ao eluido a uma concentração final de @,3 mg/mL e feita reagir no escuro durante 4 horas à temperatura ambiente (cerca de 25-28°C). A N-hidroKissuccinimidobiotina que não reagiu foi removida por filtração em gel sobre Ssphadex B—25 em PBS = As placas ELISA de cloreto de polivinilo Costar (Cambridge, !VIA) foram revestidas com 5® pg/cavidade ds avidina (Piercs Chemical)

a 1© μα/mL em tampão de bicarbonato de sódio ô*í M* pH 955? dursnts a noite á temperatura ambiente e humidade de 100%. As placas foram lavadas 3 vezes com solução salina tamponada com TRIS ©*©5 M* pH 8*5™ contendo TMsen-20 a 0*05% CTBS-Ϊ)* e bloqueadas com TBS-T ma is gelatina a Θ,1% (tampão de bloqueio) è temperatura ambiente e humidade ds 100% durante 1 hora™ As placas foram manchadas sem lavagem* foram adicionados 5# pg/cavidade de PRP-biotina em PBS a 15-4© ug/mL* e as placas foram incubadas durante t hora. As placas foram lavadas 3 vezss com TBS-T antes da adição da amostra™ As amostras foram adicionadas em séries da duas diluições em tampão de bloqueio* s incubadas durante Ξ horas à temperatura ambiente e humidade de 1®©%™ As placas foram então lavadas 3 vezes com TBS-T* e foram adicionadas anti-imunoglobu-linas conjugadas de fosfatas® alcalina apropriadas diluídas em tampão de bloqueio™ Os anticorpos utilizados foram a Igíl anti-ratinho ds cabra CJackson Immunoresearch™ West Srove* rft>* Ig8 (Fc> íjackson Immunoresearch)* IgSl (gama) (BRL* Saithersburg* MD)* IqS2a (gama) (BRL)* IgS2fo (gama) (Southern Biotechnology Associates* Birmingham* AL)* Ig83 (gama) (Southern Biotechnology Associates)™ e IgS anti-coelho de cabra (Jackson ImtnunDresearch)« As placas foram incubadas durante 2 horas à temperatura afi?biente e humidade de 1ΘΘ%* lavadas com tampão de bloqueio* e d desenvolvimento do substracto foi realizado utilizando fosfata de p-ni-trofenilo ií mg/mL em dietanolamina i «* Kirkegaard and Perry, Gaithersburg* MD)™ As diluições foram consideradas positivas se a absorvtncia da amostra excedesse a ahsorvãncia média mais 3 vezes o desvio padrão da S brancos de reagentes* e se a diferença na afosorvtncia entre sucessivas diluições fosse de ©*©1 ou maior™ Os títulos terminais foram definidos como o reciproca da maior diluição que deu uma reacção positiva no ELISA como descrito acima™ Os logaritmos dos títulos recíprocos foram comparados entre os grupos em tratamento por análise de duas vias da

variância CLindeman, K = H» st a1=„ íi9Q©}, Introduciion to

Bivariate and Multivariaie Analysis, Scott Foresman (pub»>, New York],

RIA para quantificação de anticorpo anti-PRP

As amostras experimantais da saro £ saram testadas quanto á quantidade de anticorpos anti-PRP foram diluídas a is2, 1s55 e is20s utilizando soro de feto de vitelo como o dilusnts» 25 μΐ. de cada amostra de soro diluída foram transferidos, em duplicado, para frascas RIA de ®55 ml. (Sarstedt)» Uma solução as PRP marcado com I foi diluída para dar entre 3ΦΦ e 8Q& contagens par minuta (cpm) por 5© μ!_, utilizando solução salina 1 '25 tamponsda com fosfato como o diluente» 5Φ μ!_. de ’’”I~PRF diluída farás transferidos para cada frasco RIA, misturados vigorosaments e incubados durante cerca de 15 horas a 4°C = 75 μι. de uma solução saturada de sulfato de amónio a 4°C foram adicionadas a cada frasco RIA , misturados vigorosamente s incubados a 4°C durante 1 hora. Os frascos RIA foram então centrifugados durante 10 minutos a 1Θ0Φ0 x g, o sobrenadante foi rejeitada e as cpm na pelota foram medidos num contador gama <LKB>„

Uma curva padrão consistindo em séries de duas diluições ae um antissoro contendo uma quantidade conhecida de anticorpos anti-PRP foi preparada como descrito acima e foram ensaiadas concusnitantemente com as amostras de soro experimentais» A quantidade de anticorpos snti— PRP na curva padrão está. entre 14 pq/mL como a maior quantidade de anticorpos e 0=®56 pg/mL como a menor quantidade de anticorpos = Iodas as amostrais foram desenvolvidas em duplicado» A cpm média das amostras duplicadas foi comparada com a curva padrSo para calcular a quantidade de anticorpos anti-PRP presentes nas amostras de soro experimentais»

Respostas de Anticorpo de Recipientes de transferencia êdoeMvgs!

Os recipientes de células de baço inoculados separada-mente com PRP-DT, e ou MIEP ou OMPC ou JAA-Qr!PC* responderam à Imunização com PRP-OHPC por produção de quantidades equivalentes de anticorpo anti-PRP IgBl s IoG2a de soro em 4 dias (ver Figura i>. Os ratinhos irradiados reconstituídos com células de baço que foram inoculadas com veicula de ríIEP ou OnPC ou IftA-OMPC, tinham significativamente maiores títulos de anticorpo anti-PRP IgBl <Ρ<Φ50Θ1) e IgS2a (ρ<θ3θ4> após imunização com PRP-OMPC do que os ratinhos de controlo, dando células de baço inoculadas com PRP-DT mas não com células de baço inoculadas com OMPC» As respostas de anticorpo do soro è imunização com PRP-OHPC em ratinhos aos quais foram dadas células de baço inoculadas separadamente com PRP-DT e ou MIEP ou OMPC ou IAA-OMPC foram comparáveis àquelas em ratinhos aos quais foram dados células de baço inoculadas com PRP-OMPC <p>é?12 para anticorpo IgBl nos dias 6-13, e p>0,5 para anticorpo IgS2a nos dias 9—13). MSo foi observada qualquer resposta a anticorpo quando os ratinhos irradiados reconstituídos com células de baço inoculadas com PRP-DT e células de baço inoculadas ou com MIEP ou com OMPC foram imunizados com PRP sem um veiculo de proteína» A análise estatística foi feita por análise de duas vias da variância <ANOVA) ELindeman, R«H. et ai*, Intro- duction to Bivariate and Multivariate Analysis, < 198*3), Scott

Foresmsn Cpub., >, Ne^ York3«

1 Or-i

Estes resultados demonstram que a iilEP funcionou em ratinhos assim como o OMPC para induzir uma resposta de células T auxiliares de veiculo para gerar anticorpos IgB anti-PRP. EXEMPLO :l©

fíctividade mitoqénica da HIEP A HIEP purificada a partir do OMPC de M,. meninqxtidis fci testada quanto è actividade mitogénxcs num ensaio de proliferação de liivfócitos» Os linfécitos esplénicos de murino foram obtidos a partir de ratinhos C3H/HeN5 C3H/FeJ,; C3H/HeJ» ou Baib/c. Os ratinhos ou eram naturais ou tinham sido vacinados previamente com PRP-ui1PC= As células de baço foram passadas através de um peneiro ds malha fina. estéril para remover dstri-tos estremais s suspensas em meio K CRPI1I 1640 (OIBCO) ma is soro de feto de vitelo a 10% CArmourK Slutamina 2 mri iSIBCO)? Hepes í© mH íSIBCO), 1Θ0 μ/mL de penicilina/i©0/pg/mL de estreptomicina (GlBCO)ç e B-mercaptoetanol 5Θ μΜ \Biorad>3„ A Seguir è pipatagem para romper grupos da células., a suspensão foi centrifugada a 3ΘΘ κ g durante 5 minutos,; e a pelota foi ressuspensa num tampão de Ixse de células sanguíneas vermelhas OMH^Cl ©?íò π a 9©% CFisher) 5 TRIS-HC1 @57 M a Í0% (sigma)} pH 7=,23 è. temperatura afi;bisnte? ©51 mL de cêiuIas/mL de tampão durante dois minutos. As células foram estratifiçadas com 5«nL. de soro de feto de vitelo e csntrifugadas a 40©© κ y durante í© minutosP depois lavadas com meio í< duas vezes e ressuspensas em meio K a O x i©1" células/mL. Estas células foram implantadas em placas de 9è- cavidades (i€?© μΙ/cavidade) juntamente com í©0 μΐ de proteína ou amostra ds péptido, em triplicado. A HIEP de N»____meninqitldis foi purificada como pravia- mente descrito no Exemplo 7» As proteínas de controlo incluem

albumina de soro de? bovino, PRP-OMPC e o próprio OMPC, s a lipopolissacárido (endotoxina)= Todas as amostras foram diluídas em meio K para concentrações de 1, 6,5, 13, 26, 52, ίΦ5, ε 13Θ pg/rnLp depois implantadas em placas como descrito acima tal que as suas concsntrações finais fossem inetade das suas cancentrações originais* As cavidades em triplicado foram também incubadas para cada tipo de célula suspensa só em meio K, para determinar a linha ds base da proliferação celular*

Nos dias 3s 5, ou 7 de cultura, as cavidades foram

Mrp pulsadas com 25 μΐ. tíe '"'H-timidina (Amersham) contenda I mCi/25 uL* As cavidades foraai recolhidas Ιό™ 18 horas mais tarde num colsctor Skatron, e as contagens por minuto (CPM) foram medidas num contador ds cintilação de liquido* A troca da rsds em cpm foi calculada por subtracçSo do número médio de cpm ton?ado por cavidade por células só sm meio K, da média da cpm experimentai * 0 índice de estimulação? foi determinado por divisão da cpm sxperimental média pela média de cpm aas cavidades de controlo,,

Como mostrado na Figura 2, a vacina de ΙΊΪΕΡ assim como a vacina de DMPC e PRP-OfiPC resultaram na proliferação de linfó-citos de ratinhos vacinados previamente* Esta actividade mitogé-nica não pareceu ser devida ao lipop-olissacàrido CLP3) uma vez que a ΙΊΙΕΡ estava livre da LPS detectável, medida por ensaios de pxrogenxcidade em coelho, e o efeito proliferativo foi maior do que aquele que poderia ter sido causado pelo LPS presente em quantidades abaixo do nível de detectabilidade em qeles de poliacriX anuída corados com prata*

Ί 'S 1 .1 exemploji

Conjugação do polissacárido PRP ds H„ influsnzae tipo-b â MIEP ds H. meningitidis

As conjugaçSes químicas foram conduzidas tíe acordo com α processo descrito na Patente dos EUA número 4 S82 317 *

Foram misturados 10 mg de ΗϊΞΡ em 3 fflL de tampão de borato 0,1 H, pH 11,5, com 1Θ mg ds sal dissódico do ácido etilsnodiaminatstraacético CEDIA, Sigma Chemicals) e 4 mg de ditiotreitol (sigma Chemical)» A solução de prr>taína foi varrida vigorosamente com M-.» Foram adicionados 1.25 mg de M-acetil-homo-cisteinatiolactona (Aldrich Chemicals) è solução de MIEP, e a mistura foi incubada á temperatura ambiente durante ié horas» Foi então duas vezes dialisada sob hp» contra 2 L de tampão tíe borato 031 M pH 9,5» contendo EDTA 4 mH, durante 24 horas â temperatura ambiente» A proteína tiolada foi então ensaiada para d teor em tiol pelo reagente de Ellman (Sigma Chemicals) e a concentração em proteína foi determinada par reagente Bradford CPierce Chemicals). Para a conjugação da MIEP ao PRP, foi adicionado um sxcssso de 1,5 vezes (p/pí de PRP da H»___influenzae ssrotipo o bromoacetilado à solução ds MIEP e o pH foi ajustado a 9--9,5 com NaOH 1M» A mistura foi deixada incubar sob W^, durante 6 a S horas à temperatura ambiente» Mo fim do tempo de reacção, foram adicionados 25 u.L de N-acetilcisteamina (Chemicals Dynamics) à mistura, s toi dexxada permanecer durante 18 horas sob N... à temperatura

•íL ambiente» A solução ds conjugado foi acidificada até entre pH 3 a 4 com HC1 í W, e centrifugada a 1ΘΘΘΘ κ g durante 10 minutos» 1 fflL do sobrenadants foi aplicado directassente numa coluna ds Supero-se 6B FPLC (1,6 κ 50 cm» Pharmacia) e o conjugado foi eluido com PBS« 0 pico de volume vazio que contém o conjugado de

polissacárido-proteína (PRP-HIEP), foi reunido». A solução de conjugado fai então filtrada através 00 um filtro de 6,22 μ para esterilização» EXI&0-12

Demonstração de Imunogsnicidade dos conjugados de PHr-MIEP

Imunizaçaess Ratinhos Balo/c machos (Charles River» Wilmingion, MA) foram imunizados IP com PRP covalentemente conjugado a MIEP como descrito no Exemplo 11» utilizando 2,5 qg de PRP em θ,5 ml. ds alumén pré-formado» Os ratinhos de controlo foram imunizados com quantidades equivalentes de PRP dado como PRP-CRM <2,5 μα de PRP/è,25 μα de CRMs 1/4 da dose humana), PRP-DT (2;;5 pg de PRP/1,8 qg de DT5 1/10 da dose humana), s PRP—QHPC (2,5 pg de PRP/35 μα de OMPC; 1/4 da dose humana)»

Macacos Rhssus recém-nascidos, 3-13,5 semanas de idade, foram imunizados com conjugados de PRP-MIEP absorvidos em alumén, Cada macaco recebeu 0,25 mL ds conjugado em dois sítios diferentes ds injecção, para uma dose total de 0,5 mL. Os macacos foram imunizados nos dias Φ, 23, e 5ò, s foram retiradas amostras ds sangue todas as duas a quatro semanas.

As respostas de anticorpo foram medidas pelo ELISA descrito no Exemplo 9, que distingue a classe e subclasse da resposta de imunoglobulins» Um RIA que quantifica o anticorpo anti-PEP total Cver Exemplo 9) foi também utilizado para avaliar a resposta do macaco, As respostas de anticorpo de recipientes de conjugados de PRP-HIEP são mostradas na Figura 3= *

Os resultados mostram que os conjugados de PRP--MÍEP são capazes de gerar uma resposta imune em macacos Rhasus recém-nascidos e ratinhoss consistindo em anticorpo anti-PRP IqG © numa resposta de memória,, Isto está em contraste com o PRP-CRH e PRP--DT que não induzem anticorpo anti-PRP mensurável» Assim, a MIEP funciona como uma proteína de veiculo imunológico para d PRP e é capaz de produzir uma resposta tíe anticorpo anti-PRP quando conjugada covalentemenis ao antigenio de PRP» A rlIEP purificada é por conseguinte uma proteína de veículo imunológico eficaz substituindo o DnPC heterogènio na construção de vacinas de conjugado de polissacãrido bacíeriano, ffiJ£L0„.i3 PREPèRmm DQ CQNJUefeDQ MI£P-cPhlP15r

Foram adicionados a 10,5 ml de uma solução de MIEP <1585 m-g/mL, 18,4 mg total) contida num frasco de 50 mL, 2,6 mL de um tampão de borato l,,® li» oH 11» 0 pH foi ajustado a 1&VQ com NaOH 5N após adição de 37 mg de EDTA e 11 mg de ditiotreitol * Então, foram adicionados 346 mg de W-acetil-hoiiiocisteínatiolacto-na e o pH novamente ajustado a li com NaOH 5N„ Esta solução foi desgaseifiçada? o ar substituído por azoto e a solução envelhecida durante 23 horas sob unja atmosfera de azoto, A amostra foi então diaiisada contra 4L de borato pH 9f.Ξ contendo 1® mL de EDTA durante 7 hp contra novos 4L durante 22 h e finaImante contra um tampão de borato M pH 9,5 contendo 1,9 mg de DTT durante 16 h. Este tratamento deu uma solução que contém um total de 4,84 pmoles de tiol (por ensaio Ellmaní. Isto compara-se com 249 nanomoles de SH/mg de proteína» -· 114 -

Uma amostra da 1® mg de cPNDiS msleimi.dado do Exemplo 13 foi dissolvida em 1 m!_ de H^O a 5® pL deste foram utilizados para um ensaio de maleimida pelo processo Ellman inverso, para dar 5=4 umoles (total) de maleimida. Uma aliquota de ®,9 mL <4,88 pmoles) da solução foi adicionada à solução de MIEP tiolada (pH a qual ficou, imediatamente turva e após 3 h e 4® minutos não permaneceu nenhum titulo de tiol (por ensaio EilmanK A solução (14 mL) foi dialisada duas vezes versus 4L. de um tampão de barato ®,®1 M, pH 9,5 durante 27,5 s 38 h respecti-varoente, Um ensaio em 1Θ® pL para uma composição de aminoácido deu os seguintes resultadoss 15,9 13.7 48.8 em 10® μί_ mostrou ®,95 1111, isto traduz-se sm para a carga de proteína nanoffloles/® =, 1 mL de amostras norleucina β-alanina lisina

Um ensaio de proteína Bradford mg/mL» Utilizando um peso molecular ds 176,7 pg/mL de pâpticla,. Assim* o péptido foi de 18,6%, EXErSPLb 14 PREPARAÇÃO DE CONJUCfADO MIEP-CPND31 s

Foram adicionados a 6,5 mL de uma solução ds MIEP (1,7 mg/mL), 1,5 mL de um tampão de borato ®,í M, pH íl s o pH ajustado a 11 com 5 uL de NaOH SN. A esta foram adicionados 21 mg de EDTA & 6,5 mg de DTT e a solução foi sfsctuada por rotação durante 15 min= Então, foram adicionados 2®0 mg de ·N—acetil—ho™ mocisteínatiolactona, a solução desgasaifiçada e o ar substituído

par M-,,. Após envelheci menta na caixa de N0 durante 1,5 h, α pH foi ajustada a 10,68 com NaOH 5N, o processo de desgaseificaçSo repetido,, s o envelhecimento continuou durante 20,5 h« A solução foi dialisada versus 4L de borato 0, i M, pH 9,5 contendo EDTA õ, ®t M durante 6,5 h seguida por 41. de borato Θ,Ι i‘l, pH 9,6, EDTA 1Θ mH contendo 1 mg de ditiotreitol durante 17 h= Um ensaio Ellman indicou 2,27 pmoles (total) de tíol que é equivalente a 205 nanomoles de SH/mg de proteína» A esta solução de proteína tioiada foram adicionados Θ,55 ml_ de cPNDSl maleimidado do Exemplo 14 (3,77 pmoles/mg, par ensaio Eilman inverso, 2,Θ7 pmoles total>* Foi notada uma turva— ção instantânea* Foram adicionadas Θ,5 mg de cPMD31 maleimidados,, adicionais, e a mistura envelhecida durante 1 hora*

Para remover os pèptidos não conjugados, a mistura foi dialisada em tubos de diálise, tendo um limite de exclusão de peso molecular de 12Θ0Θ-1400Θ, vsrsus 4L de borato 0,í ri, pH 9,48 durante 5,25 horas s versus 4L de borato ΰ,ΘΙ H, pH 9,68 durante 66 horas* Um total de 8 mL de solução permaneceram a partir das quais 200 μΙ_ foram removidos para análise de aminoácidos norleucina 22,8 nanoraoles/200 μί„ lisina 85,9 nanosoles/2®0 pL» A solução foi então dialisada versus 20Θ mL ds tampão de fosfato 0,í H, pH 7,07 que foi 5 M em ureia, dando um volume final de 6,5 ml.» Um ensaio de proteína Bradford revelou 1,26 mg de proteína/mL (8,2 mg total)» Assim, 0,912 pmoles ds péptido (8 mL X 22,8 nanomoles/Θ,2 mL) a um peso molecular de 1204 =1,1 mg de péptido (total)·.· Por conseguinte, neste caso, foi conseguido 13% de um péptido para uma canga de proteína*

Slntsss sá Estado Sólido de cPND4 ligado a dissulfuretos

Ufís péptido PHD linear foi preparado numa resina wang utilizando um sinteiizador de péptido ABI--43IA, a partir de resina Fmoc-L-CysCAcm}-0-Wang (Θ,όΐ msq/qram)* Foram utilizadas a química de Fmoc e os anidridos simétricos de FmQC-aminoâcido (excesso 4KS preparados in situ) coma reagentes numa escala de ®,2S mmole para gerar 745 mg do péptidos fiem Mtr resina Fmoc -Hle-uys-Hi s—11e~B1y—Pro-S1y~krg-A1a-P he-Cy s--0- 'rt ÃCffl

Wang »

Uma soluçSo de iodo em metanol a 5%/DMF anidro tlml) foi adicionada à resina Wang derivada, seca mostrada acima e agitada â temperatura ambiente durante 4 horas. A resina foi filtrada, lavada com DMF anidro (5x2 ml>3 e finalmente ressus-pensa em DMF <2 ml)* Foram adicionadas duas gotas de uma solução de tiossulfato de sódio 0,1 M em água e agitadas durante poucos segundos» A resina foi lavada com DMF aquoso a 95¾ (3 íi 2 ml), DMF anidro (2 ml), cloreto de metileno (3x2 ml), éter (3 >í 2 ml) a seca* 0 Fmoc θ outras grupos protectores foram removidos por tratamento com piperitíins a 2ô% em DMF durante 2D minutos, e a resina foi lavada e seca. A resina foi clivada do péptido cíclico ligada a dissulfureto por tratamento com TFA a 95%/stanoditiol a 4%/tioanisoi a í% Cí ml) à temperatura ambiente durante 6 horas. A saluçlo foi filtrada, a resina lavada com TFA a ΙΘΘΤ, adicional (3 x 2 ml) e a solução novamente seca» •ι A HPLC preparativa utilizando duas colunas de fase inversa Vydac C18 2*ΙΞ κ 25 cm em série s um gradiente de sluição de CH_CN a 2Θ até 24% durante 9®'5 iselamento permitido de um pico de eluição eKacto a 36,66'' sob estas condiçSes* A HPLC analítica rendeu um única pica após cα-cramatografia de um péptido padrão cíclico ligado por dissulfureto com o produto obtido da HPLC de preparação* 0 FAB-riS deu um Π1-Η-13 ’ de :1171, que á consistente com o cPMD4 de estrutura cíclica ligado a dissul-furte to CSEQ IDs 23?)!

H-NIa-Cys—His~IIs-Bly-Pro-Sly—Arg-Ala-Phe—Cys-CQOH

EXEMPLO 16 ......çe.Mgl5-L igado.. a. ...Péptido s_ 0 péptido linear Cbz-Nle—LysCBoc>-Bln—Argífltr)---61y--'Pro·-· -Gly-ArgíMtrJ-Ala-Pha foi sintetizado seguindo os processos da fase sólida num sintetizador de pépiídcs ABI 431A utilizando 373 miligramas CO,! mmolss) de resina de álcool Fmoc-íenilalanii-p--~a 1 comibenzilico* A eKcepçSo da norleucina, que foi obtida na forma protegida do benziloxicarbonilo CChz), os L-~aminoácidps ^ utilizados foram os derivados de fXuorenilroetoMicarbonilo ÍFmoc) tendo os grupos protsctores de cadeia lateral lébeis ao ácido* apropriados* 0 produto da resina de polipêptidcs derivado foi transferido para um funil de vidro sedimentado, lavado com diclorometano e seco, para dar Θ,6 g de produto de resina poli--péptido* 0 péptido foi clivado da resina por tratamento com è ml de uma mistura 95?2:3 de TFAsis2—stanadiaisanisal durante 16 horas* A mistura reacionsl foi filtrada através de um funil de /

vidro sedimentado3 a resina lavada com 1Θ ml de-TFA e os filtrados combinados» A seguir è concentração a cerca de i a 2 ml de óleo amarei o j o péptido linear foi recuperado por trituração ccni 40© ml de éter de distilo,, sm porções ds 5Θ ml e filtração num funil de vidro sedimentado. Dissolução com í©@ ml de TFA a 1% seguida de Iicfilizaçao rendeu 298 mg ds péptido linear. 0 pó de péptido foi dissolvido em &©© ml de lii¥!j-, neutralizado com © = 42 ml ds dilsopropiletilasiiina s tratado com ©s©77 ml de difsnilfasforilazids» A solução foi agitada no escuro durante 7© noras a 4°C para permitir a formação da lactama cíclica. Após sKtinçSo por adição de 3 ml de ácido acético glaciar» a mistura reaocional foi concentrada a cerca de 1 a 2 ml tís óleo3 dissolvida em ácido acético aquoso a 1©% e liofilizada» O péptido cíclico foi purificado por crsasatografia ds smcIusSq de tamanho 8-15 utilizando ácido acético a 5% como a fase móvel„ As fracções» monitorizadas por deiscçSo Uv5 contendo a péptido foram reunidas e liofilizadas para dar 135 mg de péptido cíclico seco» Todos os resultados obtidos eram consistentes com a estrutura cPMDlSs

que pode também ser representada cornos

Z-Nle-Lys-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-^lie 4-N-c=° (ε)

Des p r c? t ec ç á o de cPND15 para d ar__a forma de Hidrogénio?

A desprotecç ;So ds ePNDiS foi θ. I c sn π ada por dissolução do pép*b jLdo cíclico Síí s 2€? ml de ácido acético aquasi: 1 a 3Θ% & ΙΊ .1. d rogenaç Sd 3 27P5ò k :Pa durante :tò hor as sobr e 10© mg DS pàilâGlO a 1 Θ% em ca rbon0» ft mistura, rescciona 1 foi f i1 irada Q[\\ 1 x t-S 'para remover o catalisador t? u Ti.1 trado iui liufiiiEsdu= HFLC de fase inversa ufcilisanda uma coluna semi-orep. vydac C1S foi d'j c j t „ * ico dss prcteg ido a pi icá vel 3. todos os •pr D 'í egido d e b enzila Ki- 0 1 X ivr e do pép tido que lin O em prs para it· cí ϋ pi ara c ΟΠ f ir fflãdâ por FAB- MS ? *esul tados u*C3. 1 xsarja para se carboniIo = para dar ionra activada uuuii ser HPLC analítica s análise de aminDácido e todí foram consistentes com a estrutura de cPNDÍSs

9 E / t H-Nle-C-N-Lys-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe (a)CH2 j:=0 ·

h2^ h2 h2 que podem também ser representada comas H-Nle-L^s-Gln-Ar g-Gly-P r o-Gly-Ar g-Ala-Phe (CH2^—N-C=0 (ε) £MqELQ..iz Síntese da ci~’ND3Ís v Dais aramas (Θ?ά meq/grama) de resina Fmoc-Phe-Wang foram carregados num sintetizadar ABI 43IA» Os protocolos de acoplamento simples de Fmoc foraoi utilizados para adicionar Fmoc~HÍa5 Fmoc---Arq(Tos) ? Ροοο·--Ργο5 Fmoc-IIe» Fmoc-HisCTrt) , Boc--Lys(Fmoc) s Chz-Nls para produzir 3?7 gramas de resina de péptido linear tendo a sequ§ncias BGc-Lys<Ns‘~Z-Nj.e)--Hisí Trt.}---I le— •~G1 y-Pro—BI y-Arg C Tos) -AIa-Phs. 0 péptido foi clivado da resina por tratamento com TFA a 95%? água a 5% durante duas horas» A resina foi removida por filtração5 o TFA removida do filtrado por evaporação in vacuo s o resíduo triturado com éter de distilo·» 0 precipitado foi recuperado por filtração e secagem para dar 1,,7 gramas de péptido linear tendo a [email protected] H-LysíIM^-Z-NleJ-His-I le-Gly-Pro-Gly·---Arq (Tos) - Ala-Phe« 0 péptido foi tratada com Boc-isoqlutamina-QMp (®s7i gramas, 2 nmoles) e DIEA (¢3=,35 nsl 3 2 nimoles) em DHF C10 ml> durante a noite à temperatura ambiente» A BMF foi evaporada s o

resíduo tratado com éter de distilo» 0 precipitada foi recuperado por filtração e lavado com acetato tíe etilo» 0 péptido seco (1=,9 gramas) foi tratado com TFA {1®0 ml) durante ®?5 horas. 0 TFA foi evaporado in vácuo. a resina triturada com éter de distilo s o precipitada fai recuperado por filtração e seco. 0 péptido foi dessalinisado em Sepbadex G-i© em ácido acético a 10% como o eiuente. As fracçSes de péptido foram iiofilizadas para dar 152 gramas C®57? mmol.es} des H- isoBln-Lys í N Z-Wle) —His— Ϊ le—BI y-Psra—Bl y~Arg (Tos> —AI a-Phe,

Duas porções 55 gm. @33é maoles) do péptido foram dissoIvidas5 separsdamente, em 1©0© «nL de DMF arrefecidas com gelo e foram adicionados DIEA (ôslè mL? #==9 mmolas) s DPPA í0312 ml.) e as soluções foram agitadas durante a noite à temperatura ambiente. A DMF foi evaporada in vácuo e os resíduas combinadas e solubilidades em CHCI-.= A fracçao orgânica foi lavada com ácido cítrico aquoso a 5%? depois seca em HçSO^ e evaporada para dar 0,78 gm de péptido cíclico bruto. Este material foi tratado com HF liquido <10 mL) contando aniso 1 <1 m-L) durante duas horas a 0°C. 0 HF foi evaporado e o resíduo foi purificado por eluiçlo gradativa em HPLC de fase inversa (Vydac 0-18., CH~.CN a θ-50%5 sm 5Θ minutos utilizando TFA aquoso a β„1% como o tampão5 para dar 25Θ mg de cPMD31 puro (12Θ4) =. i Η HOI . i !

His-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe HoCHN-C=0 EXEíIPLÇLie

PreparsçSo de HaleimidopropionaI'-cPNDi5s

••horam dissolvidos 1@ miligramas de sal de t'rifluoroace-iato de cPMDíS em 0S3 ml de uma mistura Ís2 de H^GsíleCN. A solução foi arrefecida num banho de gelo e depois foram adicionados 10Θ uL de solução de NaHCO^ β?345 Π5 seguida por 3S5 mg ds Éster M-bidroxisuccinimida do ácido maleimidopropiónico. A rsaeçSo foi deixada prosseguir com agitação durante uma hora» seguida por extinção com 3 μΐ_ de ácido trifluoroacático» A mistura reaccional foi filtrada através de um filtro de 0,2 micron e o filtro foi lavado com ©,= 2 ml de água» Os filtrados combinados foram injectados numa coluna de fase inversa vydac CiS ds 2» 15 X 25 cm» A coluna foi eluida isocraticamente durante 1β minutos a uma velocidade ds fluxo de 1Θ ml/min coni ffeCN a 25%/TFA a 051%? seguida por elaição gradativa de rleCN a Ξ5 a 40%/TFA a 0i% durante 2Θ minutos» 0 produto que elui entre 2Θ e 32 min foi concentrado a liofilisado dando 7 mg do sal de triíluoroacetato de malei/Hidc?propionol-cPMD15 como um pó amorfo brar?co» 0 FftB-MS revelou um ião principal irB-H) a 12&2» A titulação para o malei-raido por extinção de ensaio Ellman deu uma concentração de ©f54 pmoles por mg do maleimidopropionol“c:PMD15B EXEMPLO 19

Preparação ris MaImmMmrmlmmlzçSMM.:

Seguindo o procedimento do Exemplo 13, foram f ei tas reagir 37,è mg do sal trifluoroacetato de cPMD3i com 8,3 mg de estér de maleimidopropional ds M-hidroxissuccinimids em θ,4 ml de uma solução de NãHCO.,. β,322 M e 1,2 ml de is2 H„OsMsCN, seguido de extinção com i®,5 μΐ de TFA» A HPLC de preparação íneCM a 3#%/TFA isocrático a Θ,1% durante 1Θ minutos seguida por gradiente ds eluiçlo de iieCN a 3Φ-5Θ% durante 5 min deu um pico de eluiçlo de produto ©ntrs 18-25 min. 0 produto liofilizado pesava 26 mg e o maleimido do titulo foi de 0,57 pli/mg* 0 FAB-nS deu um ião principal (M-Hi) a 1356= A análise de aminoáeidos deu Nle~4è0, B-alanina=420 e Lys=4ó0 nmoles/mq» A análise de RMN deu um singuleto a 6,93 ppm ímaleimido H). EXEMPLO.. 2Θ.

Protocolo para Inoculação da Animais cora as conjugados MIEP-cPND15 e MlEP-cPND31 deste inventos

Foi utilizado alúmen como um adjuvante durante as séries ds inoculação» 0 inóculo foi preparado por dissolução do conjugado em solução salina fisiológica a uma concentração de conjugado final de 3β@ pg/ml„ Foi adicionado alumèn realizado igel de hidróxido de alumínio) à solução a um nível final de 50Θ pg/fisl de alumínio. 0 conjugado foi deixado adsorvsr—se para o gel de slumén durante duas horas á temperatura ambiente. Seguindo—se à adsorçSo, o gel com o conjugado foi lavado duas vezes com solução salina fisiológica e ressuspsnso em solução salina para uma concentração de proteína de 3ΘΘ ug/ml.

Os macacos verdes (grssn) africanos foram inoculados individualmente com trfs doses de 3Θβ μη ou tris doses de 10Θ p.g do conjugada adsarviáo em alumén» Cada dose foi injectada intra-muscularmeníe* As doses foram distribuídas com um mãs de intervalo (semana β, 4., 8, 28) « Os animais foram sangrados em intervalos de duas semanas,. As amostras de soro foram preparadas a partir de cada sangria para ensaiar o desenvolvimento de anticorpos específicos como descrito nos exemplos subsequentes» MEmáL2l

Análise de Soros para Anticorpos IqB Anii-Péptidos

Cada amostra de soro é analisada por ensaio de imuno-adsorção com enzima ligado (ELISA), As placas de microtítulo de poliestireno foram revestidas com ® ,5 pg por cavidade do péptido sintático (não conjugado a HIEP) em solução salina fisiológica tamponada com fosfato (PBS) a 4°C„ Cada cavidade foi então lavada com PBS contenda ds T'WEEN-20 (PBS-T), G soro de teste, diluído em séries em PBS-T, foi adicionado ãs cavidades contendo páptido e deixada reagir com o péptido sasorvioa durante uma hora a 36°C» Após lavagem com PBS-Ts a IgB anti-humsna de cabra conjugada com fosfatase alcalina foi adicionada às cavidades de teste e foi deixada reagir durante uma hora a 3ò°C, As cavidades fora® então lavadas extensivamente em PBS-T» Cada cavidade recebeu fosfato de ρ-nitrofeniio a ©?í% em dietanolamina a 1®%, ρΗ 9,8, contendo rlgCl^,òH^O Θ..5 mM» A raacção seguinte foi deixada raalizar-ss à temperatura ambiente durante 3Θ minutos, ao mesmo tempo que era terminada pela adição de NaDH 3,® N„

Quanto maior for a interseção ds anticorpos no soro de teste com o substrato de péptido, maior será a quantidade de

fosfatsse alcalina ligada à cavidade* A enzinís fosfatsse media a decomposição de fosfato de p-nitrofsnilo para uma substância molecular que absorve luz a um comprimento de onda de 485 nm. Consaquentementes existe uma relacçâo directa entre a absorvãncia a 485 nm de luz no final da reacção ELISA e a quantidade de anticorpo ligado a péptido»

Todos os macacos inoculados com os conjugados maleimi-dopropÍDnil-cPWD15-ÍÍIEP e maleimidopropianil~cPND31~MíEP desenvolvem anticorpos especif .icamente capazes de ligar o péptida, iXIi3ELS_22

Análise de Soros para a Actividsde que Neutraliza Especificamente a Infecção por HlVn A actividade neutral izants de virus é determinada co?n um ensaio descrito por Robertson et al. , J. virol, Methads 28% 195-282 Cí988>* O ensaio mede a actividade neutralisante de HIv especifica no soro de teste* 0 ensaio é baseado na observação de que as células HT-4, uma linha de células linféidss-T humanas, estão prontamente susceptiveis a infecção com HIV e após um período de replicação tio virus* são mortas como um resultado da infecçSo* 0 soro de teste é tratado a 56°C durante &Φ minutos antes do ensaio* Este tratamento é requerido para eliminar inibidarss não específicos da replicação de HIV* 0 soro tratado por aquecimento, diluído em séries sm meio de cultura, de células RPM 1-16485 é misturado com uma dose de infecção padrão de HIV» A dose ê determinada antes do ensaio como contendo -a ma is pequena quantidade de virus requerida para matar todas as células MT-4 na

cultura de ensaio após um período ds /-8 dias» h mistura virus- ·—soro S deitada interagir durante uma hora a 37°C» É depois 5 adicionada a 1¾¾) κ 1Θ células n'T-4 suspensas em meio de crescimento RPMI-íó40 suplementado com soro de feto ds bovino a 1Θ%» As culturas foram incubadas a 37°C em atmosfera de 00^ a 5¾ durante 7 dias» SMo fim do período ds incubação5 um corante metabólicos ΙΓΓΪ» é -adicionado a cada cultura» Este corante é de cor amarela após inspscção visual» Na presença de células vivas» o corante é processado metabolicainente para espécies moleculares que rendem uma cor asul visível» 0 H1V neutralizado não pode replicar-se nas células MT-4 alvo e por conseguinte nlo mata as células» Conse-qusntementeP a neutralização positiva é determinada pelo desenvolvimento da cor azul a seguir à adição do corante metabólico» EXEMPLO 23

Preparação de um Dissulfureto Cíclico para conjugaçãos 1» Preparação ds cPND33 (SEO IDs 22¾>s H-Mle Cys Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ils His Ile ©iy Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn Ile Ile Gly Cys-DH <Ct, peso da fórmula = 3023»è> us 26 meros foram montados no sintetizador Milligen #905© s partindo da resina Fmoc-L-CysíTrU-OPKA parcialmente racemizada íMilligen porção B 090426» ôs081 meq/g), utilizando 2,47 g (0.2Θ0 meq)» 0 rendimento teórico é ds 6Θ4 mq„ A resina

foi misturada com um volume ds pérolas ds vidrb'«Sigma 150-212 μβι)« A mistura encheu completsmente duas colunas de i x i® cm, ligadas em séria» Os raagentss foram ésteres de Fmac-Pfp (excepto para a trsonina, que era OHBt), utilizando quatro vezes o sxcasso molar em solvente ds M-nístilpirrolidina» A protecçSío de cadeia lateral era; Tyr itrc-hutilo) i Lys (Boc);· Arg (litr)^ His íBocli! Thr í terc--but.il) 5 Cys Cfrt)* 0 protocolo foi modificado para dar "7 Q 11 1 O \ 3 1 4 um açodamento dudo com Lvs' § Ile'; Ile “ s 01v""X Pro* ; Βίν* ϊ „ 15 ' . 17 18 19 20 * T, 23* '24 „ ' ηγο ϋ Pne ; Tyr 5 i hr § Thr | Ixe = Ile ..· Os tempos os reciclo de aciiaçãto foram prolongados ds 3Θ para 6Θ minutos para todas as unidades, excepto para Blyiv e Ala “ s para 90 minutos í 1 03 para Ile' í2k)| Ue"” <2x>;; Ile“'- C2x) e Ile (2;;> = A resina derivada foi mantida como à medida que o terminal amirio livre foi lavado cdcií CH~XI.-> s seco ao ar» A mistura da resina derivada seca s as pérolas de vidro foi rsssuspensas em TFA a 95%, etanotíiiiol a 4%, CH-,.SPh a 1% (30 ml.) a 23 °C num frasco selado» com agitação suave num tabuleiro de oscilação durante 3 horas» A mistura amarela brilhante foi entlo filtrada e os insolúveis foram vigorossmente extractados com TFA a 10®% í3 κ 20 mL). Os filtrados laranja escuro foram evaporados para dar uma goma oleosa, marrom pálida» Após trituração com éter mL) este material tomou-se instantaneamente num sólido sem cor, que foi transferido para um filtro por trituração com éter adicional C3 x 2® mL)» Após secagem» o produto bruto foi obtido coma um pó sem cor fino <583 mg)»

A HPLC de fase inversa analítica CTFA a ©»1% aquoso/OU ·«* a 22%, lambda = 215 nm, A = ®,Θ5» 2»tí mL/min»J numa coluna Vydac de 0s46 κ 25,6 cm de cerca de 5Φ μα de amostra, dissolvido em 50 uL de TFA a 0,1% aquoso/CH-Xh! a 2Θ%, injectado 4 pL, revelou u?ft componente principal (36,29'' ) e um componente secundário de eluição posterior» Estes foram recolhidos separadamente após

injecçio ds uma aiiquota ds 3Θ mg s outra aiiquota da 50 mg tía amostra para duas colunas de preparação Vydac C.,c> de 2,21 κ 25,Θ cm em séries lgradiente linear durante 60''; TFA a 0,í%/CH_CN a 23-27%, lambda « 215 ni», A * 3,©«, 10 ii»L/min3. Um total de 35,2 mg do material da eluição anterior (44,45"> s 8,2 mg do material de eluiçSo posterior foram recuperados a seguir è liofílização. 0 FAB-MS do produto principal deu um lFH-Hj ‘ = 3022,1 e um CM+Na3* ::: 3Θ44..2 que é consistente com a massa calculada.. 2^...PREPARãSlQ.....ji?Q_jn S^LBJEEI^CiSLlCQ»—CSEQ_IDi__22Jj. H-Nle !ys Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn CH2

Ile Ile Gly Cys-OH -S-GH2 a.. OXIDAÇÃO INDUZIDA POR K^FsíCM) 0 composto de ditiol de 26 meros linear (35,0 mg) foi dissolvido em água destilada dssgassifiçada (38 mL) a 23 °C para dar uma solução sem cor límpida a pH 2=73» O pH foi ajustado a 8,5 com NFLOH 0,1 N e a solução foi coberta com uma atmosfera de asoto» Uma aiiquota do material foi operada imediatamente em HPLC de rase inversa analítica e verificou—se sofrer emidação como evidenciado pelo aparecimento de um pico antecipado*

Foi adicionada por meio de seringa hipodérmica conduzi— aa por energia* com agiraçlo magnética, uma solução recente-mente preparada de K^FeíCN)^ 0,®1M a 23°C, sob azoto. A análise de uma pequena, aiiquota por HPLC revelou, a conversão total da material

ds partida a um tempo de eluição anterior» A mistura rsaccionsl CpH 8g3> foi misturada com ácido acético aquoso e agitada a um dado pH de 4,ô, A solução foi filtrada para remover o nsaterial insolúvel e a solução amarela clara foi evaporada e depois liofilizada para dar cerca de 27 = 9 mg de uns pó amarela pálido» 0 material foi dissolvido em TFA a ®P1%/CH_,CM a 2Θ% e aluído por gradiente numa HPLC preparativa» Um pico de aiuição anterior principal s um pico de eluiçlo posterior C4?i) foram separadamente recolhidos e liofilizados para dar 6=1 mg ao material de eiuiçSo anterior e 1*5 mg do posterior» Análise por FAB-MS do material de eluição anterior; ΕΜΉ-Π ' 3019*7? rfi+Nâ-Γ 3042*5; análise por FAS-MS do material de eluiçSo posteriors CM-H-íj" 3Θ2tH+Naj* tío material anterior = 3041*5? os quais corres™ pendem todos à massa correcta para o c:PMD33 ciclizado, 0 material de eluiçSo posterior è o diasiêreomero de terminal carboxilo da D~cisteína, A análise de aminoácidos dos produtos deu as composi-çSss de aminoácidos previstas para os produtos cic: 1 içados e confirmou que o material de eluição posterior era o diastéreomero contendo a D-cisteina,

b. OXIDftcKD ftQ AR 0 26 meros linear preparado em (1) acima <8è mg* 28,4 pmoies) foi dissolvido em TFA a 0*Í%/acstonItriIo a 2Θ% aquoso (284 nsL) a 23 °C e a solução foi deixada permanecer aberta ao ar. A ciclizaçlo foi monitorizada por HPLC de fase inversa a a amostra mostrou estar quase conipletamente convertida ao material ua eluiçao anterior* com quase completo desaparecimento do imaterial de partida linear* durante t - 24 horas, A solução incolor, límpida foi evaporada até cerca de 8 mL ponto em que foi

adicionada uma amostra de i© mg adicionais preparada da mesma maneira que os 86 mg A amostra combinada foi evaporada até cerca ds 9 mL» A solução incolor turva foi submetida a separação por HPLCs em duas operações separadas» em duas colunas C*g Vydac de 2,12 x 25,0 cm, em série» As duas fracçSes foram separadamente recolhidas, um pico as eluiçlo anterior e um pico de eluiçãc? posterior» Cada pico foi separadamente evaporado e lioíilizado para dar 3ô,i mg e 9,7 mg dos materiais anteriores e posteriores, respectivaments» G material de eluição anterior foi combinado com outras preparações de material de eluição ciclizado anterior para dar um total de 47,5 mg de ura pó leve aculado muito claro» A HPLC analítica deste material deu um único pico» 3,._. PREPARADO DO ANIDRIDO,.....PP.... ÂCi..l>Q,_..3"MftLEll!llJP0PRQPláMlCQ. 0 ácido 3“-maÍeimidopropi6nico (226 mg) foi coberto com 5 mL de anidridc acético e a mistura foi aquecida a i3©°C durante 3,75 h e depois envelhecida durante a noite à temperatura ambiente» A solução foi concentrada para um óleo e o espectro de RilN ÍGDCl,) indicou uma mistura do homoanidrido e do anidrido misturado dos ácidos acética e maleimidopropiónico» 0 ácido de partida mostrai o meti leno adjacente ao carbonilo como um triplsto centrado em 2,68 ppm enquanto que no anidrido estas ressonâncias aparecem a 2,81 ppm» A purificação foi efectuada por sublimado fraccional, primeiro a 7β*ϋ e ®,2 mm e depois a 12®°C a 0,2 mm» A fracção posterior foi removida do aparelho por dissolução em CDCI_, rendendo 34 mg de homoanidrido puro após evaporação do solvente» Este foi recristalicado a partir de CDCl... e ciclo-he™ xano rendendo o material que funde a Í43-147°C»

Calculado para C, 52,51| H, 3,78? N, 8,75.

Encontrados C, 51,73? H, 3,67; N, 8,16, RHN a 20Θ MHz (CDCl^)s 2,83 (2H,t5, 3,84 &,73 Í2H,s>» 31 —

4, êCI-LApaO "SELgCTIVft» PO CPNP53 O cPND33 (22,5 mqn páptido estimado em 7Θ% é equivalente & 15,75 inq ou 5,212 fiiicromoles > foi dissolvido em ±2,© mL ds um tampão de ácido morfolinostano-sulfónico Θ,ΙΙΙ pH 5,25 s arrefecido em banho de gelo. A análise desta solução s o progresso da reacção foram seguidos por HPLC numa coluna DBS de 25 cm utilizando acstonítrilo aquoso a 25%s ácido irifXuoroacéiico CFFft) a ©,1% como eluente» 0 anitírido de ácido maleimidopropiõ-nica (2,© mg, è,25 micromoles) foi dissolvido em ©,6ΘΘ mL de tetra-hidrofurano seco e ©,o mL desta solução (correspondente a 3,2 micromoles de anidrido) foi adicionado à solução pspiidica acissa. Passados 3Φ ssg»» foi removida uma aliquota de 7 fflicro-litros e avaliada por HPLC,, Este ensaio foi repetido a ©,25, ©,,50, 1,25, 2,25 s 3,® h» Passadas 3,5 h a solução foi liofili-Zâda = 0 liofilizado foi dissolvida em 2,© mL de acetanitrilo aquoso a 2€i%, filtrada através ds um filtro ds ©,2 micron e preparativamente cromatoqraíado em três operações de ©,7©© mL numa coluna C-18 Zorfaax de 21,2 mm κ 25 cm = Foi utilizado o programa de eiuiçSa seguintes velocidade de fluxo -- 1© mL/nsinp eluição isocrática coas acstonítrilo aquoso a 25%/TFb a ©,1a (12 min>r; gradiente para acstonítrilo a 28% íi© min)j gradiente para acstonítrilo a 35% (8 min>„ As fracçSss da cauda foram isoladas por concentração e liofilização para dar 8,9 mg de material ds partida recuperado (penúltima fracção) e 9,6 mg ds um produto que tinha um espectro de massa (FAB) indicando um peso molecular de 3172 (ΐ,,Βπ o derivado níono-maleimidopropionilo de cPND33) „ 0 produto foi posteriormente carsctsrizado por uma análise de sequência olhando á ausência de iisina (a ausência de qualquer sequência iria implicar acilação no terminal amino). Os resultadas indicam que a maioria mas não todas as porções

mslsimidaprapionllG estia ligadas à lisina mais*psrto do terminal carboKilo.

Embora a especificação anterior ensine os princípios do presente invento,, com exemplos fornecidos para o fim de ilustração 5 dever-se-á compreender que a prática do invento abrange todas as variações* adaptações? modificações ou dslecçSes usuais que estia no Smbito das reivindicações seguintes s seus equivalentes*

(2) INFORMAÇÃO PARA SEG ID NOs is U) CARACTERíSTICAS DA SEBUtNCIAs (A) COMPRIMENTOS 41 âfflinaácidos ÍB) TIPOs aiiiinoácido (D) TOPOLOGIAs linear <ii) TIPO DE MOLÉCULAs péptido (iii) HIPOTÉTICOS mo (v) TIPO DE FRAGMENTOS interno <i x) CARACTERf STICA s (A) NOME/CHAVEs ligaçao dissulfureto <B) LOCALIZAÇÃO? 3,,38 <xi> DE3CRIÇK0 DA SEGUâNCIAs SEG ID NOs Is

Xle Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser He Arg 1 5 10 15

Ile Gin Arg Gly Prc Gly Arg Ala Phe Vai Thr lie Gly Lys He 20 25 30

Gly Asn Mei Arg Oln Ala His Cys Asn íle Ser 35 4© (2) INFORMAÇÃO PARA SEO ID NOs 2s (i) CARACTERiSTICAS DA SEQUtNCIAa (A) COHPRIMENTOs 24 asRinoácidos CB) TIPOs aminoécido <D> TOPOLOGIAs linear (ii> TIPO DE MOLÉCULAs péptido <hí> DESCRIÇÃO DA SEGUêNCIAs SEG ID NOs 134

Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phts 1 5 1® 15

Tyr Thr Thr Lys Asn Ile Ile Sly Thr 2Φ í 2) INFORMAÇÃO PARA SEQ Σ0 NOs 3s \i) GARACTERíSTICAS DA SEQUêWClAs ÍA) COMPRIMENTOS 25 aminoácidos CB) TIPO: aminoàcido (D) TOPOLOGIA: linear íii> TIPO DE MOLÉCULAs péptido íxi) DESCRIÇÃO DA SEQUêWClAs SEQ ID NO: 3;

Asn Asn Thr Thr Arg Ser Ile His Σla 81y Pro Sly Arg Ala Phe 1 5 W 15

Tyr Ala Thr Sly Asp Ile Ile Sly Asp Ile 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4s <i> GARACTERiSTICAS DA SEQUÊNCIA: CA) COMPRIMEWTOs 25 aminoácidos CB> TIPQs aminoàcido CD) TOPOLOSIA: linear tii> TIPO DE MOLéCULAs péptido (xi> DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NOs 4s

Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile Gin Arg Gly Pro Sly Arg 1 5 10 15

Ala Phe Vai Thr Ile Gly Lys lie Gly Asn 2ô 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NOs 5s

Ci> CARACTERiSTICAS DA SEQUÊNCIA: CA) COMPRIMENTOS 18 aeiinoácidos (B) TIPOs aminoâcido (D) TOPOLOGIAS linear (ii) TIPO DE MOLÉCULAS péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIAs SEQ ID NO: 5s

Arg Ile Gin fírg Gly Pro Oly ftrg Ala Phe Vai Thr IIs Gly Lys 1 5 10 15

Ile Gly Asn (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: és (i) CARACTER*STICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTOS ii aminoácidoa <B) TIPOs amirtoácido CD) TOPOLOGIA: linear Ui) TIPO DE MOLÉCULAs péptido íxi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIAS SEQ ID NOs és

Arg Ile Gin Arg Gly Pro Oly Arg Phe Vai Thr 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NOs 7s ii) CARACTERíSTICAS DA SEQUÊNCIA: CA) COMPRIMENTOS 8 aminoácidos CB) TIPOs amincácido CD> TOPOLOGIA; linaar

Cii) TIPO DE MOLÉCULAs péptido

Ckí) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA; SEQ ID NO; 7; His Ile Sly Pro Sly Arg Ala Phe 1 5 i2> INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NOs 8:

(i) CARACTERíSTICAS DA SEQUÊNCIAs ÍA> COMPRXHENTDs L· aminoâcidos CEO TI PO s am i n oác ida <D) TOPOLOBIA£ linear <ii> TIPO DE MOLÉCULAS péptido <Ki) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIAs SEQ W NOs 8s

Gly Pro Sly Arg Ala Phe 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID Nus 9s U) CARACTERíSTICAS DA SEQUÊNCIAs íA) COMPRIMENTOs 9 afliinoácidas < B > TI PO s aiTs i n oác i d o (D) TOPOLOGIAS linear (ii) TIPO DE MOLÉCULAs péptido íxi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIAS SEQ ID NOs 9s

Ile Bln Arg Bly Pro Sly Arg Ala Phe í 5 <2> INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NOs 10s <i) CARACTERíSTICAS DA SEQUÊNCIA; CA) COMPRIMENTOS 9 aminoácidos í B) TIPO s aminoàcido CD) TOPOLOBIAs linear (ii) TIPO DE MOLÉCULAS péptido ÍKi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIAS SEQ ID NOs 10s íle Tyr lia Gly Pro Gly Arg Ala Phe i 5

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NG: ils íi) CAEACTEKÍSTICAS DA SEQUêiMCIAs CA) COMPRIMENTOS 9 aminoácidos CB) TIPO? aminDàcido CD) TOPOLOSXAs linear

Cii) TIPO DE MOLÉCULAS péptido (xi5 DESCRIÇÃO DA SEQUêNCIAs SEQ ID NOs lis ils Ala Ile Sly Pro Sly Arg Thr Lsu i 5 C2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NOs 12s

Ci) CARACTERíSTICAS DA SEQUêNCIAs CA) COnPRIMENTOs 9 sininpácidos CB) TIPOs aminoácido CD) T0P0LD8IAs lirmar Cii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi> DESCRIÇÃO DA SEQUêNCIAs SEQ ID NOs 12?

Vai Thr Leu Sly Pro Sly Arg Vai Trp i 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NOs 13?

Ci) CARACTERISTICÃS DA SEQUÊNCIA? CA) COMPRIMENTO? 9 aminoácidos CB) TIPO? aminoácido CD) TOPOLOSIAs linear

Cii) TIPO DE MOLÉCULAs péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUêNCIAs SEQ ID NOs 13s II© Thr Lys Sly Pro wly Arg Vai Ile 138 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ W NQs 145 <I> CARACTERíSTICAS DA SEQUÊNCIA? ÍA) COMPRIMENTOS 9 aminoácidos CB) TIPO? aíiiinoácida (D) TOPOLOBIAs linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA? péptido <kí) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA? SEQ ID NOs 14? 1 íir Pra IXe Gly Leu Gly Gin Ser Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NOs 15s {i > CARACTERíST1CAS DA SEQUÊNCIA? <A> COMPRIMENTO? 9 affiinoácidas (B) TIPOs aminoácido CD) TOPOLOBIAs linear <ii) TIPO DE MOLÉCULAS péptido (i) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA? SEQ ID NO? 15?

Thr Pro Ile Biy Leu Bly SIn Ais Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO? 16?

Ci) CARACTERíSTICAS DA SEQUÊNCIA? (A) COMPRIMENTO? 9 aminoácidos (B) TIPO? afninoáciuG (D) TOPOLOBIAs linear <ii) TIPO DE MOLÉCULA? péptido

(Mi) DESCRIçm DA SEQUÉNCIAs 3EQ ID NOs 16s íls His Rhe Sly Pro Bly BIn Ãla Leu 1 5 <2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO a 17s <i) CARACTERtSTICAS DA SEQUÊNCIA? CA) COMPRIMENTOS 9 aminoácídos CB) TI PO a aminaácido CD> TOPOLOBIAs linear íii) TIPO DE MOLÉCULA: páptido ÍKi) DESCRIÇSO DA SEQUÉNCIAs SEQ ID NOs 172

Ile Arg Ile Sly Pro Sly Lys vai Phs 1 5 <2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NOs 18a

Cl) CARACTERtSTICAS DA SEQUÉNCIAs CA) COMPRIMENTOS 4 aminoáeidos CB) TIPOs amincácido C D) TOPOLOG1A s ambos <ii) TIPO DE MOLÉCULAs péptidc

Cxi) DESCRIÇÃO DA SEQUÉNCIAs SEQ ID NOs 18s Gly Pro Giy Arg (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NOs 19s

Ci) CARACTERíSTΣCAS DA SEQUÉNCIAs CA) COMPRIMENTOS 4 aininaácidos < 8) TI PO s am i n oà e .1. cl o CD) TOPOLOSIAs ambas íii) TIPO DE MOLÉCULAS péptida

<kí> DESCRIÇSO DA SEQUÊNCIA; SEQ ID NOs 19;

Gly Pro Gly Lys 1 <2> INFORMAÇÃO PARA SEQ ID MO; 2Θ; íi) CARACTERíSTICAS DA SEQUÊNCIA; (A) COMPRIMENTOS 4 aminoácidos íB> TIPO; smincácidc (D) TOPOLOGIA; ambos i i.3.) TIPO DE MOLÉCULA; péptido (Ki) DESCRIÇÃO DA SEQUtNCIAs SEQ ID NOs 2®s 01y Pro Gly Gin i í2) INFORMAÇÃO PARA BEQ ID NO; 21s íi) CARACTERiSTICAS DÃ SEQUÊNCIA; íA) COMPRInEHTOs 4 aminoácidos (B) TIPO; aminsácido CD) TOPOLOGIA; ambos iii) TIPO DE MOLÉCULA; pâptido ÍKi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA; SEQ ID NOs 21s

Gly Leu Gly Gin i Í2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0 = 22; íi) CARACTERiSTICAS DA SEQUÊNCIA; CA> COMPRIMENTO; 26 aminDécidos

CB) ! IPU i afíiinoâcida - .- * CD) TOPOLOGIAg ambos íii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido <ík) CARACTER :t ST I CA % (A) NOME/CHAVEs sitia modificada <B> LOCALIZAÇÃOs 1 (D) OUTRA INFORMAÇÃOs /classificaçla^Nls /nota=“norleucins” íixí CARACTERiSTICAs 1A) NOME/CHAVEs ligação dissulfureto CB) LOCALIZAÇSQs 2»=26 íkí) DESCRIÇÃO DA SEOUtNCIfis BEQ ID NOs 22ϊ

Leu Cys Tyr Asn Lys Arg Lys Arg lis His Ile Sly pra Gly Arg í 5 10 Í5

Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn Ile Ile Gly Cys 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NOs 23s li) CARACTERiSTICAS DA SEQUÊNCIA2 (A) COMPRIMENTO? 11 aminoãcidos (B) TIPOs aminoácido (D) TOPOLOGIAs ambos <ii> TIPO DE MOLÉCULAS péptido < i.k ) CARACTERiSTICAs (A> NOME/CHAVEs sítio modificado 1B5 LOCALIZAÇÃOs 1 (D) OUTRA INFORMÃÇSDh /classificaçlo=NIe /RDta=unDrlsLicina <kí> DESCRIÇÃO DA SEQUéNCIAs SEQ ID NOs 23s

Lsu Cys Hí£ Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phs Cy<=· 1 5 1® Í2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NOs 24π (i) CARACTERxSTICAS DA SEQUéNCIAs ÍA) COMPRInENTOs 4 aminoácidos ÍB) TIPOs aminDácido (D) TOPOLOGIAS ambas (ii> TIPQ DE MOLéCULAs péptido í κi > DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA! SEQ ID NOs 24s

Gly Pro Sly Vai 1

Claims (3)

1. SgIVMiSfiSggSl iâ ~ Processo para a preparação da uma vacina para utilização em mamíferos5 caractsrizado por compreender a proteína ds Classe II da membrana exterior de Msissaria menina itldis,, serogrupa 8, acoplada a um antigénio, numa gama de percentagem entre 0, i% e 50% da uma proteína da classe II num conjugado antigénio, vacina que em mamíferos irá induzir ou intensificar a formaçSo de anticorpos específicos para o referido antigénio. 2â ~ Processo de acordo com a reivindicação i, caracte-rizado por os antigá.nios serem derivados ds bactérias, vírus, células de mamíferos, fungos, ‘"'ricksttsia", alergéneos, téxicos ou venenos, péptidos sintéticos, s fragmentos de polipéptidos»
2. 31 - Processo ds acordo com a reivindicação í, caracte-rizado por a proteína de Classe II da membrana exterior ds Heissaria meninqitidis, serogrupo B, ser uma proteína recombinan-ts produzida numa célula hospedeira recombinants.
3. 41 - Processo para a preparação de uma composição caracterizado por se misturar uma quantidade eficaz de pelo menos 1 ug para a imunização ds espécies de mamíferos da conjugado polissacárido/protsina, que compreende o polissacárido ds HaSBBBfailW* irrf 1 uenzas, ssrotipo B, e a proteína da membrana exterior de Classe II ds Meisseria meninqitidis. seragrupo B, s um veículo farmaceuticamsnts aceitável. Lisboa, 18 de Julho de 19vl

   J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3.* 1200 LISBOA