PT98109A - RECOMBINANT PROCESS FOR THE PREPARATION OF NEW PROTEIN - Google Patents
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Description
-φ·-φ ·
Descrição referente à patente de invenção de HOEGHSI JâPAíí I»I MIíESD, japonesa, industriai e comercial, com sede em 10-16, 8 eborae, Akasáka, Minato-ku, fokyo Japão, (inventores: lamotsu Ha-shiiooto , lenichi liíezuka, Itesayo shi Eumegawa e Sunao lakeshita., residentes no Japão), para >f£RQ-OESSQ PARA â EIPREBSlQ M HIQ- TEÍm os'F-i mmjmà m oêwus HQSBMRAS»*Description of the invention of the HOEGHSI Japanese Patent and Trademark Office with its registered office at 10-16, 8 eborae, Akasaka, Minato-ku, Japan (inventors: lamotsu Ha-shiiooto, lenichi liíezuka, Itesayo shi Eumegawa and Sunao lakeshita, residing in Japan), to < RTI ID = 0.0 > < EMI ID =
Descrição Pormenorizada da Inveneao Pampo de Utilização Industrial A presente invenção refere-se a uma. nova proteína que tem actlvidade de desenvolvimento ou de diferenciação de células ósseas e de actlvidade de desenvolvimento e diferenciação de células do cérebro, um 1BI que codifica a referida proteína e a produção da mencionada proteína por processos de tecnologia genética* fécnica Anterior JCadomatsu e col* (1938, Biochem. Biophys. Res* Pom raun. 151« 1312 - 1313) descobriram um novo gene que codifica um polipéptido com 9 971 dalton, designado Ϊ-3Κ1, que é rico em resíduos de lisina básica e- é expressado espeeificamente na M*A,Detailed Description of the Invention The present invention relates to a. a novel protein having activity in the development or differentiation of bone cells, and in the development and differentiation activity of brain cells, a 1BI encoding said protein and the production of said protein by prior art genetic technology processes JCadomatsu et al. (1938, Biochem Biophys Res. Pom., 151, 1312-1313) have discovered a novel gene encoding a 9,971-dalton polypeptide designated Ϊ-3Κ1, which is rich in basic lysine residues and is specifically expressed in BAD,
fase de desenvoIvimento inicial d© teratoeareinona embriónico do rato* Kadomatsu e ool. (1990# J. Oell Biol. 110, 60? * 616) também descobriram que MIEI é um polipéptido segregado e uma hormona para o crescimento de células e para a diferenciação de células semelhantes a uma proteína que pertença à família ... do faetor de crescimento de transformação (263?)-betá*initial embryonic teratogenic rat developmental phase Kadomatsu et al. (1990) J. Oell Biol. 110, 60, 616) also found that MIEI is a secreted polypeptide and a hormone for cell growth and differentiation of cells similar to a protein belonging to the family of the faetor of transformation growth (263?) - betas *
Entre as proteínas da família fGE-beta, foram descobertas recentemente as proteínas morfogénieas do tecido ósseo (BMP) que se espera serem úteis no tratamento de fraetu-ras ósseas (Wozney e col«# 1988, Science 242» 1528 - 1534}*Among the proteins of the fGE-beta family, bone morphogenic proteins (BMPs) have recently been discovered which are expected to be useful in the treatment of bone fractures (Wozney et al., 1988, Science 242,1528-1534)
Por outro lado, relativamente aos factoree de crescimento derivados de células de cérebro, descobriu-se receatemente o faetor de crescimento dos nervos (ISE), que se espera seja u-tilizado no campo médico.On the other hand, relative to the brain cells derived growth factor, the nerve growth factor (ISE), which is expected to be used in the medical field, has been found to be harmful.
Entre as doenças que afeetam m pessoas idosas, a osteoporose * a demência têm-se tomado gradualmeate um problema social importante nos países industrialmente avançados* O número de pacientes que sofrem destas doenças espera-se que aumente no futuro. Por conseguinte, um gene espeeifieemente expressado em células de ©steoblastas ou de células de cérebro ou os seus produtos codificado® esperam-se que sejam ú-teis ao diagnóstico e/ou ao tratamento destas doenças.Among the diseases that afflict the elderly, osteoporosis * dementia has gradually become a major social problem in industrially advanced countries * The number of patients suffering from these diseases is expected to increase in the future. Therefore, a gene specifically expressed in brain cells or brain cells or their encoded products are expected to be useful in the diagnosis and / or treatment of these diseases.
Esboço da Invenção 1 presente invenção proporciona um clone de q&W especificamente expressado numa Inha de células osteoblasti- •i* cas, HG3$3®1» estabelecida a partir da parte superior do crâ nio' de ratos e também uma nova proteína codificada pelo cABH. A presente invenção também proporciona um clone de cABH que codifica a correspondente proteína humana isolada da biblioteca de cABN construída a partir de células humanas usando u-ma amostra áe eABI que codifica a nova proteína de rato. 2SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a Q & A clone specifically expressed in an osteoblastic cell line, HG 3 3 3, established from the top of the skull of rats and also a novel protein encoded by cABH. The present invention also provides a cABH clone encoding the corresponding human protein isolated from the cABN library constructed from human cells using a human ABA sample encoding the novel rat protein. 2
A presente invenção também proporciona uma proteína que tem 168 resíduos de aminoácidos* A nova proteína perten ce à família ME que é um grupo de proteínas com actividade de diferenciação de células ou de desenvolvimento de células* 0 mME que codifica a proteína é fortemente expressado em HG313S1 e fraeamente expresso em células de cérebro e células IIH323, mas mão no rim* baço, timo, fígado, pulmão ou músculos do esqueleto de ratos*The present invention also provides a protein having 168 amino acid residues. The novel protein belongs to the ME family which is a group of proteins with cell differentiation or cell development activity. The coding of the protein is strongly expressed in HG313S1 and weakly expressed in brain cells and IIH323 cells, but hand in the kidney * spleen, thymus, liver, lung or skeletal muscles of rats *
Rm primeiro lugar, a invenção refere—se a uma proteína que tem a sequência de assino ácidos da seguinte formula (I)First, the invention relates to a protein having the acid sequence of the following formula (I)
Het-A*l-A*2- Gln-Gln- 2yr-&ln-Gln-(Hn-Arg-Arg-lys-ibe-Ala-Ala-Ala-Phe-Ieu-Ala-A*3-Ile-fhe-Ile-Iieu-Ala-Ala-Yal-àsp-íl2ir-Ala-(Jlu-Ala-Sly-Lys-Ijys-G-lu-Iiys-Pro-Glu-lys—lys-Tal—Iiys-lys-Ser—Hn-Arg-Arg-lys-ibe-Ala-Ala-Ala-Phe-Leu-Ala-Î ± -β-Ile-β-Het-Aβ-Gln- Allyl-Ala-Ala-Ala-Ala-Allyl-Ala-Ala-Sly-Lys-Allyl-Allyl-Allyl-Allyl-Allyl-Allyl-
Asp-Oys-G-ly-Glu-frp-G-ln-Èrp-Ser-Tal-Cys-Val-PrO-lbr-Ser-G-ly-Asp-Oys-Gly-Gly-Gly-G-In-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-
Asp— Gys- (yly— I»eu—Grly— ibr—Arg—Glu— Sly—Shr—Arg—$fer—Gly—Ala—Glu— Gys-lys-Gln-fhr-Met-liya-fbr-Glii-Arg-Oys-lys-Ile-iro-Gys-Asa-2rp-lys-I)ys-Gln-fhe-©ly-Ala-&lu-0ye-lys-fyr-eFla-Bie-§ln-Ala-frp-G-ly-&lu-Cys-ilsp-lieu-Asn-2iir-Ala-I*eu~Iiys-íbr-Arg-'Bir-Gly-Gly-Ala-Glu-Gys-Lys-Gln-fhr-Met-liya-fr-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Arg- Arg-Oys-Ile-Ile-Ile-Iro-Gys-Asa-2β-Lys-I) and s-Gln-β-Ala- fr-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Al-
Ser—leu—Xiys—Arg—Ala—I»eu—His—Asn—Ala,—A^4—Gys—Gln—lys—Ibr—Vel—Ser-leu-Xys-Arg-Ala-I-His-Asn-Ala, -A4-Gys-Gln-lys-
Thr-Ile-Ser-lys-B?o-Gys-&ly-Lye-ieu-$br-iys-Pra-£ys-]?ro-G-ln-Thr-Ile-Ser-Lys-B-o-Gys-ly-Lys-Ile-Ser-Lys-
Ala-Glu-3er-lys-lys-lys^lya-%s-Glu-&ly-lys~lys-Gln-Grlu-I>ys-Ala-Glu-3er-lys-lys-lys-lya-lys-Glu-lys-lys-Gln-Glu-l-
Ket-leu-Asg rijKet-leu-Asg rij
Hesta sequência de aminoaciáos, Axl e Ser ou Gin, 1x2 é Ser ou Ala, Ax3 é leu ou fbe e Ax4 é Aep cu Glu*In this amino acid sequence, Axl and Ser or Gin, 1x2 is Ser or Ala, Ax3 is leu or fbe and Ax4 is Aep as Glu *
Um exemplo desejável de proteínas proporcionadas pela presente invenção e uma proteína com uma sequência de a minoácidos descrita na seguinte formula (2*1) de GSf-1 de ra to ou (I-II) de ÔSl-l bumano*A desirable example of proteins provided by the present invention is a protein having a sequence of the amino acids described in the following formula (2 * 1) of γ1 -1 -buman raffinate or (I-II)
‘ί γ ΡΡ Ρ
í^t-Ber-Ser-ain-&ln«2^&In-(Jln-S3m^S-*irg-I.ys-Phe-Ala-Ala^ ála-Bie^Iíeu-Ala-Iieu^Ile-Bie-Ile-Ijeu-Ala^âla-Va^Asp^Ilir-Ala-2-yl] -benzo [1,2-a] pyrimidin-2-yl] Ile-Ile-Ile-Ile-Ala-Ala-Va-Asp-Ile-Ala-
Asp-Gys-Gly-Slu-^p-Sln-Srp-Ser-Tal^Oye-Tal-Pro-Tíiir-Se^&ly-Asp-Gys-Gly-Slu-β-S-Srn-Ser-Tal-Oye-Tal-Pro-Thiyr-
Isp-OyS-Oay^U^Isp-Oys-Oay-U-
OyS^IJyS-Gln-3?hr-&l»t^Lye-l1hr-Bln^Arg-Gys-%B“'Ile-I>2’0,'cyí5“rÁen"1-Arg-Arg-Arg-Gys-B-Ile-I-gt; 2'-Arg-Arg-Arg-Gys-
Trp-liys-Lys-&ltt-Plie^&ly-Ala-&lu^Cys-Iiye^O}yr*<«Glii^?iie*Glia.*Al&- 2rp»^-ly-G-lU“*0ys-^lsp“Iieu-Asa*ílir-AXa~1jôu--I>ys-Sh3?-Arg~Siia>®ly~Trp-Lys-Lys-Ltt-Plie-Ly-Ala-Lys-Lys-Lys-Lys-Plie-Lys- Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Si-Asp-
Ser-Ieu-LyS“Arg-Ala-Iieu~Iis-Asa-Ala»Asp*Cys«G'l33.-ly8^ílir^Val-Arg-Ala-Ile-Ala-Ala-Asp-Cys-Gly-Allyl-Val-
Slir-Ile-Ser-Lys-Pro-Gy3-GlF-Lys-I^u-$lir-Lys*PrQ-I.y3-l)ro*Glii-Lys-Pro-Lys-Pro-Gy3-Glf-Lys-Lys-Lys-Lys * PrQ-Lys-L-Gly-
Ala-Glu-Ser-Iiys-Lys-<‘Ly»-Iiy»-'I»ys~Glu-&ly^Sys->Iíya-G’ln^Glu^IyS'r*Ala-Glu-Ser-Iys-Lys-Lys-Lys-Lys and Lys-Glu-Lys-
WW
Ilet-Iieu-Asp ri-aIlet-Iieu-Asp ri-a
Ket-&ln-Ala-Gln-&ln-2yp-&la-&ia-*Gla-Arg^g-3iya-a«-Ala«Al^*Ala-Gln-1n-2β-Ala-Ala-Ala-Gln-Ala-Ala-Ala-Gln-
Ala-Plia.I«u-Ala-Phe*Ile-Plse-Ile-Iêii-Ãla-ikla-Yal-Asp*$iir-Ala-Ala-Phe-Ile-Plse-Ile-Ile-Ile-Ala-Ile-Yal-Asp-Ala-Ala-
GltL-Ala-Gly-I.ys-IJys-Glu-I.yswPro^Gla-liys-I»ys-Yal-I.ye~Lys^S«r-Gln-Ala-Gly-Iys-Iys-Gly-Iys-Pro-Gln-Lys-Ys-Yal-Lys-Lys-
Asp-Gys-Gly-Gla-Slrp-Glii-Prp-Ser-Yal-Cyís^Yal-P^o-^-Ser-Gly* ásp-ays-Gly-Ieu-Gly-^Shr-Arg^Glu-Gly-Sbr-Arg-iair-Gly-Ala-Glu-Asp-Gys-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Pr-Ser-Yal-Cytis-Yal-P-o-Ser-Gly-Asp-Asys-Gly-Leu-Gly-Gly-Arg-Gly-Gly -S-Arg-Arg-Gly-Ala-Glu-
Cys»iys»£ln^lbr»Het~lys-Tbr«&2n^Arg»Oy3~lys^Ile~ir0^Gys^Asn- 2rg-iya-lys«Gln-Pbe~&ly~Ala»&lu-Gys~lys«T;Fr*&ln-Pbe-Gln-Ala- lrjN&ly-Glu~Gys~Aep-I«u-Asa~$br~iUa»I«u-Iys“£br“Arg~íOhr-G-ly·Cys-lys-lys-lys-lys-Tb-2n-Arg-Lys-lys-lys-lys-Gys-Asn-lys-lys-Gln-Pbe-lys- -Leu-Gln-Ala-Lys-Glu-Gys-Lys-T-Fr-L-Pbe-Gln-Ala-Lys-Glu-Gys-Aze- Arg-Ohr-G-ly
Ser-leu-Iys~Arg-Ala~Ieu-HiS“âsn“Ala~Glu*0ys-S3n»Iys"*:Kir-*'Val·*' l,hr“-Ile-Ser-Xys-Pro-Cys^Gly-Lys-»I«u-Shr*I«ys-Pro*Iiys-a?o*-&ln- Âla-Glu“Ser~lys-Iys»lys-Iys~Lya~&lu~&ly~bys»lys»Gln-Glii~I»yB’''* êlet-Leu-lspSer-Ile-Ser-Xys-Pro-Cys-Ala-Ser-Xys-Arg-Ala-Ser-Xys-Arg- -Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys- Gln-Gln-Lys and Lys-Lys-Gln-Gln-Lys
fMlJ A iuyemçao também se refere a um AM que codifica a sequência de aminoacidos da formula (X)*The invention also relates to an AM encoding the amino acid sequence of formula (X)
Uma parte dos resíduos de aminoácidos da formula (I) pode ser modificada por supressão f substituição ou adição de resíduos de aminoáeidos na proporção «m que a aetividade * 4 *A portion of the amino acid residues of formula (I) may be modified by suppression or substitution or addition of amino acid residues in the proportion "
cia proteína aão seja reduzida* Alem disso* não só se incluem na presente invenção os ABI que codificam a sequência de aai-noácidos de comprimento completo de fórmula (II) ou as suas sequências parcialmeate modificadas mas também se inclui ima porção do AM» A invenção também se refere a um vector de expres** são que compreende 1) AM quê codifica a proteína a ser produzida; 2) ira promotor apropriado# tal como um promotor precoce de antigene ΐ de vírus ST 40, apropriadamente orientado a montante da sequência de codificação; e 3) os outros fragmentos de AM necessários paa expressar um gene exogénico na célula hospedeira. A invenção também se refere a um inserto para a produção das proteínas com a sequência de aminoácidos de for-* mula (I)* que compreende 1) a transformação de uma sélula hospedeira com © vector de expressão proporcionado pela invenção; 2) a cultura das células transformadas; e em seguida# 3) a produção da citada proteína* A invenção também se refere a uma proteína obtida por cultura das células hospedeiras transformada® pelo vector de expressão proporcionado pela presente invenção; hma ^proteína* significa 1) uma proteína com a sequência de comprimento completo de aminoácidos de fórmula (I); ou 2) uma proteína com as sequências de aminoácidos de comprimento completo mas modificadas por supressão* substituição ou adição de aminoácidos à sequência áe fórmula (i); - 5 -In addition, not only are ABIs encoding the full-length amino acid sequence of formula (II) or their partial partial sequences are included, but also include the portion of AMγA invention also relates to an expression vector which comprises 1) AM encoding the protein to be produced; 2) appropriate promoter # such as an ST 40 antigen early promoter, suitably oriented upstream of the coding sequence; and 3) the other AM fragments required to express an exogenous gene in the host cell. The invention also relates to an insert for the production of proteins having the amino acid sequence of formula (I), which comprises 1) transforming a host cell with the expression vector provided by the invention; 2) the culture of the transformed cells; and thereafter # 3) the production of said protein. The invention also relates to a protein obtained by culturing the host cells transformed by the expression vector provided by the present invention; hma ^ protein * means 1) a protein having the full length amino acid sequence of formula (I); or 2) a protein having the full length amino acid sequences but modified by deletion or substitution or addition of amino acids to the sequence of formula (I); - 5 -
3) uma parte das sequências de aminoáeidos áe 1) ou 2).3) a part of the amino acid sequences 1) or 2).
Efeito» da Invenção \_/· 0 ADH que codifica os 168 resíduos de amiuoáoidos proporcionado pela presente invenção pode ser utilizado na produção de urna proteína com a sequência de 168 aminoáeidos de comprimento completo ou seu» fragmentos. 0 referido &M po de ser ligado com qualquer promotor apropriado, tal como promotor precoce de antlgenio T de vírus S740 e inserido num vee tor de expressão. A mencionada proteína pode ser segregada pe la célula hospedeira transformada pelo citado reator de expressão* Como a proteína não sítio de glicosil&ção na sua sequência de aminoáeidos, a proteína pode ser produzida utilizando bactérias tais como E*. coli ou leveduras. à proteína produzida de acordo com & presente invenção possui actividade de diferenciação de células ou de crescimento de células da mesma maneira que as outras proteínas pertencentes à família ME* Portanto, espera-se que a proteína seja util ^‘tratamento e/ou no diagnóstico da osteopcrose e da demência* O referi do lãM pode ser itilizaâo como amostra para s isolamento de contrapartidas humanas da biblioteca de cAM construída a par tir de uma linha de células estabelecida a partir de osteoblas tomas humanos ou a partir de células de neurónios do cérebro ou de células de tumores * pescrição de uma Forma de Realização da Invenção Proteína 031-1 A proteína proporcionada pela invenção foi retirada de uma biblioteca de cABI de células H03f3^1# uma linha de células o steoblésticas estabelecida a partir da parte superior de crânios de ratos, através de uma seleeção áe hibridi-, zaçao diferencial comparada com ΙΙΗ3'Ι3* uma linha de células — 6 — 1Effect of the Invention The DNA encoding the 168 amino acid residues provided by the present invention may be used in the production of a protein having the full-length 168 amino acid sequence or fragments thereof. Said & M can be ligated with any suitable promoter, such as S740 virus T antigen early promoter and inserted into an expression carrier. Said protein can be secreted by the host cell transformed by said expression reactor. As the non-glycosylation site protein in its amino acid sequence, the protein can be produced using bacteria such as E *. coli or yeast. to the protein produced according to & the present invention has cell differentiation or cell growth activity in the same manner as the other proteins belonging to the ME family. The protein is therefore expected to be useful in the treatment and / or diagnosis of osteoprosis and dementia. can be used as a sample for the isolation of human counterparts from the cAM library constructed from a cell line established from human osteoblasts or from cells of brain neurons or from tumor cells. of an Embodiment of the Invention Protein 031-1 The protein provided by the invention was removed from a cABI library of H03 cells and a steboles cell line established from the upper part of rat skulls by a sequence Differential hybridization compared to ΙΙΗ3'Ι3 * one cell line - 6-1
de fibroblastos "bem estabelecida* Então, is ando o qàM que eo difica GS2-1 de rato como amostra, seleeeionou-se um gMM que codifica 082-1 humano a partir da biblioteca áe &âlm humano* Esta sequência de nueleótidos que codifica a mencionada proteína é representada pela fórmula II. axaminou-.se a especificidade dos tecidos de GSE-1 de rato com o método de mancliamea to de Northern entre os diversos tecidos de rato, tais como cérebro, músculos, rim, fígado, baço, timo e pulmão. Gs sinais positivos, o que significa a expressão de máRH que codi-fica a citada proteína, observaram-se apenas ao cerebro»well-established fibroblasts. Thus, what is the GS2-1 of rat as a sample, a human-coded gMM encoding human? -gamma? was selected from the human? -amin library. This sequence of novelty coding for said protein is represented by formula II. the tissue specificity of rat GSE-1 was assayed with the Northern Mannan method among the various mouse tissues, such as brain, muscle, kidney, liver, spleen, thymus and lung. Positive signals, which means the expression of malRH encoding the said protein, were observed only to the brain.
Sj,/ 0 OSE-1 tem o seguinte perfil de característicae: 1) contém 163 resíduos de aminoócidos que incluem a primeira "metio nina no sítio de partida e é uma proteína forte-mente básica e Mdrofíiica contendo 17 a 13¾ de resíduos áe lisina em relação ao total de resíduos dos aminoãci-dos; 2) não contes sítio de glieosil&ção j 3) contém des resíduos de cisteína, o que sugere a estrutura tridimensional muito complexa do OSIr-1; 4} o perfil de 03Γ-1 mencionado em 1) a 3} sugeriu a elevada homologia entre GSP-1 e HS1, que se refere ao desenvolvimento e à diferenciação de células. Gom base em ca da uma das sequências de aminoácidos, a homologia sequen ciai entre í-lll e 032-1 de rato é calculada como sendo igual a 48,3%* Gs resíduos de acíinoácidds coo homologia ( (designados com asterisco) são indicados no esquema seguinte1) contains 163 amino acid residues including the first " methionine " at the starting site and is a strongly basic and hydrophilic protein containing 17 to 13% of the amino acid residues lysine in relation to the total amino acid residues; 2) contains no glieosylation site and 3) contains cysteine residues, which suggests the very complex three-dimensional structure of OSIr-1; 4 the 03Γ-1 profile mentioned in 1) to 3 suggested the high homology between GSP-1 and HS1, which refers to the development and differentiation of cells. Based on one of the amino acid sequences, the sequential homology between Î ± -1 and β32-1 of rat is calculated to be equal to 48.3%. Glycerin residues with homology (designated as asterisks) are indicated in the following scheme
- 7 - τ- 7 - τ
1 OSF-1 mf&AiiFiãL iiiM&wm bagiesbk 100 $11 OSF-1 mfi &
t tt t XX **36 363¾ 363¾ 3fc36 um mm^mAOT gbmgsxsgs vjxesjfg&dck WM «*» 1 32t t t t XX ** 36 363¾ 363¾ 3fc36 a mm OT mAb gbmgsxsgs vjxesjfg & dck WM «*» 1 32
101 150 GSB-lí 'OTOAWSSOB miM2§ SM&âlfíMB OOE372ISKF X * 3E3E 36* 1 Xtt St 36 *36 X 36*101 150 GSB-1 OTOAWSSOB miM2§ SM & OMB 372ISKF X * 3E3E 36 * 1 Xtt St 36 * 36 X 36 *
COELTKPKPO *·** ag 4Pm«»V wW Í-2E-1 S YKEESW&AC2) GS$G2£âB0G SCEKKAB.YSAÒ C0ESIRV2KP 33 ctshkskie: 82 151 168 osjwi? Assmms mmua>COELTKPKPO * · ** ag 4Pm «» V wW Í-2E-1 S YKEESW & AC2) GS $ G2 £ âB0G SCEKKAB.YSAÒ C0ESIRV2KP 33 ctshkskie: 82 151 168 osjwi? Assmms mmua >
1 XX πε-ι í mmmi} .. 83 90 í-íKl e uma proteína segregada (ou um pollpéptido) e JUt 4^ # supoe-se ser um factor de diferenciação de células de earcino ma embriónico controladas pelo ácido retinoico (Fu 2o mo mura e col» , Seikagaku, 1989* 61» 1040). 0 0Si-l é muito semelhau-te a í;ll exeepto em relação à sua especificidade de tecido pa ra o osteoblastoma e cerebro. â proteína proporcionada pela invenção inclui a sequência de aminoacidos de comprimento com pleto de 031·! ou um fragmento de 033-1 com substaneialaente a mesma actiridade que 031-1. A proteína de acordo com a presente invenção pode ser segregada como parte da sequência de aminoacidos de fórmu la (I). Com base na liomologia áa sequência âe aminoácidos da cada proteína, GSE-l e provavelmente clivado no resíduo de Gin na posição 78 e no resíduo de Arg na posição 84 e, em se- «* 3 *»And a secreted protein (or a polypeptide), and JUt 4 'is thought to be a differentiating factor of retinoic acid-controlled (Em Mura et al., Seikagaku, 1989, 61, 1040). SeI-1 is closely related to its tissue specificity for osteoblastoma and brain. The protein provided by the invention includes the full length amino acid sequence of? or a 033-1 fragment with the same activity as 031-1. The protein according to the present invention may be secreted as part of the amino acid sequence of formula (I). Based on the lyomology of the amino acid sequence of each protein, GSE-1 is probably cleaved on the Gin residue at position 78 and on the Arg residue at position 84 and, in some cases,
gizida, I segregado como uma proteína com cerca de 9 000 dal·* toa* Portanto, a proteína de acordo com a presente invenção inclui partes da proteína de fórmula (1) e de mutantes de OSP *1 eom substituição de alguns resíduos de aminoóeidos com sabe taneialmente a mesma actividade que ÔSP-1. AM que Codifica a Proteína 0Sí?-l A expressão ”ASI que codifica a proteína de acordo ooia a presente invenção11 significa 1) um ADI que tem uma sequência de núcleotidos que codifica a sequência de aminoácidos de fórmula (I)$ ou 2) um AM que codifica ou uma parte de OSiWl ou substitutos de resíduos de aminoácidos com substancialmente a mesma actividade de 0S2F-1. lima sequência típica de nueleótidos é representada na seguinte fórmula (II) Α.2(ϊ-Ι2α-1ί(ίΙ*0Α·ϋ*0Αυ*$ΑΧ*αΑ{ϊ-0ΑΘ-0ί1ϋ*0£Κί?»Ζ&Α*ΑΜ-ϊ2Ι*&0Α*αδα!*Thus, the protein according to the present invention includes parts of the protein of formula (1) and of mutants of OSP * 1 and substitution of some amino acid residues with tannially knows the same activity as δSP-1. Coding for the protein according to the present invention means 1) an ADI having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of formula (I) or (2) a AM which encodes either a portion of OSiW1 or amino acid residue substitutes having substantially the same activity of 0S2F-1. A typical sequence of nucleotides is represented in the following formula (II) Α 2 (ϊ-Ι 2α-1 ((ΙΙΑΑΑΑΑϋϋΑΑΑΑΑ nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue nue) * ΑΜ-ϊ2Ι * & 0Α * αδα! *
a/iU-GGS-GC-^AáG*MA»(}AG*iiAA*GGW*aí\á-iiââ*MIJ*&2G*AAIJ*MÇ*2!C:iW(a) GG-GGG-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG
{Hií3*!ESi£*a&â*aAÁ*fGG*0AG*2GS*â&f*&2G^2&I*a$G*00I-AM«A&I-aGÍJ-lí/iG*'J!a2*GStJ*I28*GS0-AO2*e&G*GáG«-aSG»AO[í>»GG?«ÁC2-G(JZ*dCI*&AG* 2GC-A A1J- 0Atí*AGG* A2G-AAG* AGI*- GAGr-A&iW 2G2-AAGr-Á2C- CCY- 5HxG*» AAC-2GG-AAG*AAG*CAtJ*$22-*GG2-Ges;-§â(3*,MG*MU*'2A0*GAG*220*GAG*GGI* 2CTG*GGá«G-Ax^*TG2*GAG*02Y*MI*AG2*GGG*I2G*AAG*ÁCC*AGA-AC2*GGS* AG-1- 0 2(j*A/lG*GGâ* GO X-G 2S~Q AO-ilal-» GO Y-GA2- 2GX- C AG-AáTJ-AC Ϊ- G-20-AGG-AmG-ÇGC-MG-GGG-SGS-GGCWAiir-GSY-ACC-AAG-CCG-AAtr-GOf-CM-GGU-GAlí-2CIí-AáG-MG-AAG-AM-AAG-G-AA-GGG-AA5-AAA-GAG-GAG-AAG-A2G-G2G-GA2-2AA(1) and (2) and (2) to (2) and (2) to (2) and (2) (1) and (2) and (2) and (2) and (2) and (3) and (4) A2G-AAG * AGI * -GAGr-A & 2G2-AAGr-A2C-CCY-5HxG * AAC-2GG-AAG * AAG * CAtJ * 22- * GG2-Ges; GAG * GAG * 220 * GAG * GGI * 2CTG * GGa * G-Ax ^ TG2 * GAG * 02Y * MI * AG2 * GGG * I2G * AAG * ACC * AGA-AC2 * GGS * AG-1- 0 G-20-AGG-AmG-GGC-MG-GGG-SGS-G-20-AGG-GGG-SGS -GGCWAiir-GSY-ACC-AAG-CCG-AAtr-GOf-CM-GGU-GAlI-2CI-AAG-MG-AAG-AM-AAG-G-AA-GGG-AA5-AAA-GAG-GAG-AAG-A2G -G2G-GA2-2AA
C*JC * J
iíesta sequência de nucleótidos, lí é A ou G, Y ó C 9In this nucleotide sequence, A 1 or G, Y or C 9
ou f, lí I G ou 2, 2l âo» C* Tt los G» & M í f ou A. lías seguintes fórmulas (1I-I) e (ΙΖ-ΙΣ), representa ••se respectiyamente exemplos de uma forma de realização de ABF que codifica CSP-1 de rato e OSi-l humano.or 2, 2, 3 or 4; (1I-I) and (ΙΖ-ΙΣ), respectively, represents examples of an ABF embodiment encoding rat CSP-1 and human OSi-1.
Al^íC^SGG-CÂ^GilA-fÂS-O/iG^GAG-CiU-G&i^Á&Â-MiwSTiíWGGA^GGÍV (K3€^ffC^Cfe-GCá«fíÍ^Aff«f$G*Afa*ff^eGA^2^e^Sâfí-AG!&-GC!D«· GAMGC-GG(^AA(^AM~GAí^MA-0Cl^GAA-AÂA-AÁG-Giô-ÂAá-MíG-10A-GAG*Í1Gf-GGA-.GM*~2GG~CáG-i,GG-*áG2-G2G-l1GC-G2d-002-ACC-AGC-GGG~ GAC- 2G£~ GGA-* ££G- GGG~ACC~CGG- GAG~ GGG-AC-T~0GG-AG2- GGC-GGC* GAG-ÍG£^iL4A-0ÂG^AGG«áfG*MG^AGriVGAG*AGA«$Gf-ââG^Aí20*Ge2-»fGe»AÂG-5rGS-MG»AAG-.GA&.fff‘3^GGiWG02*GAG*i!GG»áAG^fAG*Gâ{^$i,G-GáG»GG2^ l1GG-.GGA-&M*2G$-eAG»Cl5G-M2-‘AGG*GGG*22&-MG-AG0»AGA-AC®-GSG« âGG-G5G-AáG-GGA«GG2^C2G-0áG»AA2i**G0$^GA€»2Gf-0áG*âiyWAO2^&2G-AGG-ASG-fGG-áAG^eGG-ACta^CTGC^MG^GfG-ACO^MG-OGG-AAG-eGS^GâA-GGG-GAG-2GA-AAG«AAG»AAG-AAâ-*AâG--GAA«GG0^M&.MÂ-GAG-GAG*AAG-A£G~GfG~GA£~£âA A‘2G-GAC—GG2-CM-GAG-fÁe*.GAG-GáG-eAG-GGíLV0GiWMiWíi!fS^GGA*GG2«» δΟΟ«220-ϊϊ^&ΟΑ«ϊϊβ^Αϊϊ*ϊίί^Α2Α·-02&-δΟΑ*δΟ$*&ϊ6-&Α2»ΑΟΜΟΐν GAA-GGA-GGG-AAG-AAA-GAG~ÁAA-*-CGA-“GM“AAA-Ai\â-G£G-AAG^AAG-2Gi-&AG-2G3GGA-GAA^2GG -CAG-aGGkAGi^GfG-SGa-GfG-GGC-AeG-AGT-GGiW GAÊ^!í)Gf-GGG^G2&-GG0-A0A^GGG^GAG-GGG*A8íweGG-AGMGA^GC2^GAG-SGe-AAG»GAA^A0C«.A'2G*MG*A0G^GA^AGA^2&f*âAS-Afe-CGe*íG0-áAe-2GG»MG-AAG~0M^22f»GGG“GGG-*GàG-2GG«*AM«fâG«GAG>*f2GwGAG»GCG-$GG-GGA-‘GAA-xG2--Gâ{>-Gíi1G--M0^ACâ-*GGC-*G2GwM6*s-AfíG«‘A&á»AG2«GGA-Α&1^α$δ-ΜΟ·Ο®Α^αθΟ-^$δ*βΑ(^Μ!Β«^ΜΑΑ*α^0Αβ*ΑΑ&-ΑΟΜ!εα-AGG^ArfCWfGG-AáG*.GOe-.2Gf£-GGG-MA-CfG^AGC^AAG-.GOe»AM-OC2-CAA^ GGA-0AA-2G2-AiiG^AAG-AAG^AAA“AAG«-GAA-GGO^AAG-AáiWGAG-GAG^AAG-. ASCkOlEG- GA2* 2ΔΑ /*ιι-π_7 - 10 -Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu- GAMGC-GG (Î »GA-GA-GA-GA-GA GA-GA GA-GA GA-GA GA-10A GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG ACC-CGG-GAG-GGG-AC-T-0GG-AG2-GGC-GGC * GAG- GAGGAGGGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGGAGGGGGGGGGGGGGGGAGGAGGAGGAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG GAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG '2Gf-0AG * âiyWAO2 ^ & 2G-AGG-ASG-FGG-AAG ^ Egg-ActA ^ CTGC ^ MG ^ GfG steel ^ MG-OGG-AAG-EGS ^ GAA-GGG-GAG-2GA-AAG' AAG AAG-AAâ- * Aâ-G-GAA-GAG-GAG-GAG-GAG * gAG-gAG-eAG-GGíLV0GiWMiWíi fS ^ GGA * GG2 «» δΟΟ '220-ϊϊ ^ &! ΟΑ "ϊϊβ ^ Αϊϊ * ϊίί ^ Α2Α · -02 & -δΟΑ * δΟ $ * & ϊ6- & Α2» GA A-GGA-GGG-AAG-AAA-GAG-AAA-CGA-GM-AAA-Ai-GAG-AAG-AAG-2GI-AG-2G3GGA-GAA-2GG -CAG-aGGkAGi ! ^ GfG-SGA-GfG-GGC-Aeg-AGT-GGiW gae ^ t) Gf-GGG ^ G2 & -GG0-A0A ^ GGG ^ GAG, GGG * A8íweGG-AGMGA ^ CG2 ^ GAG-SGE-AAG 'GAA ^ A-C-G-GGG-GGG-GGG-GGG-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG "fag" GAG > * f2GwGAG 'GCG- $ GG-GGA-'GAA-XG2 - {Ga > -Gíi1G - M0 ^ ACA G2GwM6 * * * GGC- s-afig' 'A & A' AG2 ' GGA-Α Α 1--ΜΟ Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο * * * * * * * * * * ΜΑΑ ΜΑΑ ΜΑΑ ΜΑΑ ΜΑΑ ΜΑΑ ΜΑΑ ΜΑΑ ΑΑ ΑΑ ΑΑ ΑΑ α α α α α α α α α α α α α α α α α α α α α α α. AAG-AAG-AAG-AAA-AAG-AAG-AGGA-AAG-GAA-AMA-GAA-GAG-AA-2G2- GAG-AAG-. ASCkOlEG-GA2 * 2ΔΑ / * ιι-π_7 - 10 -
cias áe nueleotidos que codificai a sequência de aminoacidos podem ser determinadas usando tabelas de eodões genéticos gje ralsente disponíveis· Portanto, o A3)I que codifica a proteína proporcionada pela invenção é ou o ADI com a sequência de nu-cleótidos de formula (II) ou o seu isêmero por degenerescência* A expressão nisêmere por degenerescência” significa um APS com uma sequência de núcleo tidos que codifica a proteína idêntica a GSÍ?~I mas que utiliza um codao ou codoes equivaleu tes*amino acid sequences encoding the amino acid sequence can be determined using tables of available genetic codes. Therefore, the A3) I encoding the protein provided by the invention is either the ADI with the nucleotide sequence of formula (II) or its isomer by degeneracy. The expression "degeneracy" means an APS having a nucleotide sequence which encodes the protein identical to GS1Î ± but using an equivalent cDNA or coding sequence,
Bceoarao&o do APS que Codifica a Proteína OSP-1Bceoarao & APS Coding Protein OSP-1
Os APS de acordo com a presente invenção podem ser sintetizadas por qualquer processo correntemente usado para a síntese química de oligonucleotidos com base nas sequências de nueleotidos descrita» na presente invenção* 0 AM de acordo com a presente invenção que eodifi ca 0S3F-1 áe rato pode também ser preparado por meio dos seguintes processos típicos áe tecnologia genética, que consistem em *5 + 1) semear 2,2 x 10 células pór placa (placa de cultura de plástico, 10 centímetros áe diâmetro, total de quarenta placas) de uma linba de células ooteoblásticas, MG3S3I1, estabelecida a partir da parte superior do crânio do rato (Eodama e col*, Jpn. J* Gral, Biol, 23* 899 * 901); 2) cultivar as células durante Cerca de nove dias a 37° 0, com opcional mudança do meio j 3) colectar as células quando o numero destas atinge o valor 8 x lô**-; 4) isolar & AM total das células % 5) purificar o miALM; 11The APS according to the present invention may be synthesized by any process currently used for the chemical synthesis of oligonucleotides based on the novelty sequences described in the present invention in accordance with the present invention which encodes a sequence may also be prepared by the following typical genetic technology methods which consist of 2.2 x 10 cells per plate (plastic culture dish, 10 centimeters in diameter, total of forty plates) of one lymphoma of ooteoblastic cells, MG3S3I1, established from the top of the mouse skull (Eodama et al., J. Gen. Biol, 23, 899, 901); 2) culturing the cells for about nine days at 37 ° C, with optional change of the medium; and 3) collecting the cells when the number thereof reaches the value 8x10-8; 4) isolate & AM total cells% 5) purify the miMALM; 11
6) preparar uma biblioteca cie câã&Jf e, e© seguida, 7) elonar o sráM pretendido.6) preparing a library of cells, and then 7) eluting the desired sample.
Como referências para as operações 4} a 7), indicam -se os manuais publicados tais como Molecular Oloning t A la-boratory Kanusl (1982, editado por $* Maniatis e eol* e publi cada por Cold Spring Harbor laboratory). lambém é possível isolar o cíjuDM áe células de seres humanos ou de espécies diferentes de ratos a partir de uma bi blioteca de cABI da correspondente espécie utilizando eABií de rato como amostra para seleccionar. A proteína OSI-1 pode ser produzida, por qualquer célula hospedeira, como células de 1. eoli. levedura ou animais com o promotor apropriado a cada célula* Os procedimentos pormenorizados podem realizar-se de acordo com os métodos descritos no manual de K&niatis (iMd.}, etc* A presente invenção I explicada utilizando formas de realização preferidas. Os métodos usados nas formas de rea lização preferidas são os seguintes.As references to operations 4 to 7), the published manuals such as Molecular Oloning, Borat Kanusl (1982, edited by E. Maniatis et al. And published by Cold Spring Harbor Laboratory) are indicated. it is also possible to isolate the cDNA from human or different mouse species from a cABI library of the corresponding species using rat E. coli as a sample for selection. The OSI-1 protein can be produced, by any host cell, as 1. eoli cells. yeast or animals with the appropriate promoter to each cell. Detailed procedures may be carried out according to the methods described in the K & Niatis (iMd.) manual, etc. The present invention is explained using preferred embodiments. used in the preferred embodiments are as follows.
Adquiriram-se enzimas de restrição nas firmas lew Eoglead Biolabs (USA) e 'falsara. tShuzo (Japão) e empregaram-se de acordo com as instruções áos fornecedores. Ia firma lakara Shuso, adquiriu-se um estojo de supressão, 14 ligase e fosfatas© alcalina de bactérias. O sistema **de síntese de cáM maijsí foi adquirido em Amerslmm (Inglaterra). A AM? traascriptadas inversa, o estojo de purificação de màBM e o adaptador BeoRI--líotl foram adquiridos em Pharmacia (Suécia). Adquiriu-se o estojo de marcação de ABI escorvado aleatoriamente à firma Boehringer n&nnheim YamaneacM (Japao). O vector de clonação 12 —Restriction enzymes were purchased from the firms Biology Biolabs (USA) and false. tShuzo (Japan) and were employed according to the instructions to the suppliers. In the case of Shuso, a suppression kit, ligase and alkaline phosphates of bacteria were obtained. The system of maize synthesis was obtained from Amersham (England). The AM? reverse transcriptase, the mAb purification kit and the BeoRI-lithium adapter were purchased from Pharmacia (Sweden). The ABI marking kit randomly primed was purchased from Boehringer n & nheimheim Yamaneac (Japan). Cloning vector 12-
lambda gtlG e o estojo de embalagem ia vitro “Sigapatik gold" foram adquiridos em Stratagen© (Sstados Unidos da America}, A transformagao de .13» coii e a ligação de illH realizaram-se como é descrito por Maniatis e eol. (ibid*)»lambda gtlG and the in vitro packaging kit "Sigapatik gold " were purchased from Stratagen (United States of America). Transformation of Î »13 and binding of β1H were carried out as described by Maniatis et al. (ibid.).
EIEMPI0SEIEMPI0S
Sresmlo 1Sresmlo 1
Breparação de uma Biblioteca de cAIM a Partir de Células M0325E1 de uma linha de Células Osteoblasticas HurínicasBreeding of a cAIM Library from M0325E1 Cells from a Hurinic Osteoblastic Cell Line
Sxtraíu-se o ARM total pelo método da guanídina (Planiatis e col», iMd.) de 8 x 10^ células da linha de células osteoblésticas imirínicas, M633?3B1| depois, purificou-se o mAPJI do áSIT total com o “estojo de purificação de mARH* (Phar macia). Sintetizou-se o oABH de fita dupla a partir do raARH pelo "sistema de síntese cAPH mais". Olonou-se o eáM de tira dupla sintetizado no sector de clonação lambda gtlO depois da ligação de um adaptador de ScoHl-Hotl por meio $4 ASH ligase e empacotou-se em partículas lambda com o estojo de empacotamento in vitro "Gigapack gold”* Os fagos empacotados foram guardados em tampão SM (Haniatis e col», (ibid,)* Determinou--se a eficiência desta biblioteca infectando 35, coli 0600 (Ja panese Câncer Research Resources Bank, Instituto Racional de Sauáe éo Japão, H2Q05) com estes fagos, obtendo-se como resul tado 1,4 t. 10^ placas/micrograma de cAM*The total ARM was removed by the guanidine method (Planiatis et al., M.M.) of 8 x 10â ^ cells from the imirinic osteoblastic cell line, M633β3B1. then the mAPHI of the total site was purified with the mARH purification kit (soft Phar). The double-stranded oABH was synthesized from the raARH by " synthesis system cAPH plus ". The double strand synthesized in the lambda gt10 cloning sector was blotted after the binding of a ScoH1-Hotl adapter to 0.5 M ASH ligase and packed in lambda particles with the in vitro packaging kit " Gigapack gold " Packaged phages were stored in SM buffer (Haniatis et al., (Ibid.). The efficiency of this library was determined by infecting 35, coli 0600 (Ja panese Cancer Research Resources Bank, Japan Rational Institute of Saua, H2O05) with these phages, yielding as a result 1.4 t.v. plaques / microgram of cAM *
Picagem de Olores Específicos de 1-10323131 Seleccionados por i-eio de Seleccão Diferencial contra a Linha de Oelulas fibro-blásticas Murírijcas !!lH3f3 e Reclon&ção no Yector, de Plasmí-dio nUOllSSpecific Smell Scavenging 1-10323131 Selected by Differential Selection against the Line of Murine Fibroblast Oellules and the Reclamation of the Plasmid Yield
Sintetizou-se uma amostra de cáDl radioactivo usan . do transeriptase inversa de AM? a partir de mâRH quer de célu 13A sample of radioactive cDNA was synthesized using. of AM reverse transeriptase? from mâRH or from 13
las Α03£3ΕΙ quer de células ICIH3'T3 (A200 GH1 1653}# preparadas de acordo com o mesmo método que as células KG5fil3Sl* Selec eionaram-se cerca de 1,5 2 10^ eloaes da biblioteca de cAM de dlulas S0323B1 preparadas ao Exemplo 1 por Mbridizaçao de placas usando uma amostra áe eAM radioaotivo uma a uma e obtiveram-se setenta e oito elones que se Mbràdizam especifi e&mente com uma amostra de cADH de HG323B1» ihctraíu-se o fago de ΑΊΜ de cada clone com fenol# precipitou-se com etanol a 10% (Ilsniatis e col., ibid* ) e purificou-se o inserto de cAM de cada clone depois de fraccio-namento por tamanhos por electroforese con gel de agarose do fago de AM digerido com BcoEI (Maniatis e col*# ibid.)* &?©* psraraswse amostras radio activas de cada clone a partir deles utilizando o estojo de marcação de ΑΊΜ escorvado aleatoriamen te (Boehriager Mancheis Yamarauchi)*(A200 GH1 1653) cells prepared according to the same method as the KG5fil3S1 cells. Approximately 1.5-210 moletons of the S0323B1 cell cAM library prepared from Example 1 by Mbridizaçao plates using a sample AE eaM radioaotivo one by one and there were obtained seventy-eight clones that Mbràdizam specificities and & mind with a sample ACHR of HG323B1 'ihctraíu, the phage from each clone with phenol ΑΊΜ # precipitated with 10% ethanol (Ilsniatis et al., ibid) and the cAM insert of each clone was purified after fractionation by size by agarose gel electrophoresis of BcoEI-digested AM phage ( Maniatis et al.) And radioactive samples of each clone were made from them using the randomly primed marc-label kit (Boehriager Mancheis Yamarauchi)
Subasteu-se 0,3 micrograma de mAM preparado a par tir ou âe ΓΙ03Ϊ3.31 ou de HIH523 a eleetrcforese em gel de agarose com desnaturação por formaldeído e 1rans feriu-se paca uma membrana de nylon (B20D31B* pall Bio Support, Estados Unidos da America do Morte} por transferencia capilar (Kaaiatis e col*, ibid).0.3 microgram of mAM prepared either from ΓΙ03Ϊ3.31 or from HIH523 was subjected to formaldehyde denaturation agarose gel electrophoresis and transfected with a nylon membrane (B20D31BPall Bio Support, USA of America do Morte) by capillary transfer (Kaaiatis et al., ibid).
Cada clone foi ainda seleecionado relativameate ã sua taxa de expressão em células Í1C323S1 e MIH313 pelo método de transferencia de Morthern com uma amostra radioactiva deri vada de cada clone. Então# eseo2heu-ss um clone# designado i-:G031 devido à sua expressão específica em células Í-10323E1* 0 inserto de cAM que se obteve por digestão do fa go clone Í- C031 com IcoRl foi clonado para dentro do vector de elonação pUGUS (íakara Shuso) enquanto se elimina o seu fosfato de extremidade 5* P®r meio áe fosfatase alcalina microbiana (Íakara. Sbuzo)# por meio de 24 APH ligase, para se produzir 0 plasmídio p;iGG3l# cuja estrutura esta representada na - 14Each clone was further synthesized relative to its expression rate in ¹³C323S1 and MIH313 cells by the Morthern transfer method with a radioactive sample derived from each clone. Then, a clone designated i-: G031 because of its specific expression in Î ± -10323E1 cells. The cAM insert that was obtained by digestion of the Î ± -CO-Clone faecal with IcoR1 was cloned into the elonation vector pUGUS (kkara Shuso), while removing its 5'-end phosphate and microbial alkaline phosphatase medium (Ibara Sbuzo) # by means of 24 APH ligase to produce the plasmid pGG341 whose structure is represented by - 14
figura 1«figure 1"
Ssqtieaslamento de ASM do laser to de oêDlí âe Ώι-ιϋΰ31Ώι-ιϋΰ31 Ώ Ώ ϋΰ ϋΰ ϋΰ ϋΰ ϋΰ ϋΰ ϋΰ ϋΰ ϋΰ ϋΰ ϋΰ ϋΰ ϋΰ ϋΰ ϋΰ ϋΰ ϋΰ ϋΰ ϋΰ ϋΰ ϋΰ ϋΰ ϋΰ
Xtepois â& digestão de pMG031 com Sphl e 3amSl, eonstrairam-se dez mutsntes de supressão usando o Mestojo de supressão de quilo-*sequênciasn (1‘akara Slraso), X&tes rautantes por supressão foram designados como pM05M., ^10031-2 .·, e pKCQ31~10 (figura 2). A sequência de ABI do inserto de eÂM de pí-lGG31 e os seus mutantes de supressão foram determinados utilizando um sequenciador automático de ÂM (modelo 370Λ, Applied 3io-sysieras) com a orientação do sítio de HindlH para o sítio de EcoRi. Seterminaram-se aprorimaáamente trezentos pares de bases da sequência de nueleotidos de cada clone e compôs-se a sequência completa de eAM combinando os dados de sobreposição das sequências* A sequência completa e a sua sequência de aminoácidos deduzida estão representadas na figura 3 e a proteína codificada por este õâM foi designada como OSP-i àe ra to* ·Xtepois â & pMG031 digestion with SphI and 3amSl if eonstrairam-Dec mutsntes suppression using the suppression Mestojo kilogram sequênciasn * (1'akara Slraso), X &. rautantes TES deletion were designated as pM05M, · ^ 10031-2. , and pKCQ31-10 (Figure 2). The ABI sequence of the β1GG31 βM insert and its deletion mutants were determined using an ÂM (370Âμ model, Applied 3io-sysieras) automated sequencer with the orientation of the HindIII site to the EcoRI site. Three hundred base pairs of the nucleotide sequence of each clone were cleaved aphorximately and the complete sequence of eAM was composed by combining the sequence overlap data. The complete sequence and its deduced amino acid sequence are shown in figure 3 and the protein encoded by this Î "M was designated as OSP-i
Exemplo 4Example 4
Expressão Específica âe QSP-I de Rato nos lecidosSpecific Mouse QSP-I Expression
Realizou-se a transferência de lortliern para exami nar s expressão específica de OSf-1 de rato nos tecidos*The transfer of lortliern was performed to examine mouse OSf-1 specific expression in tissues *
Preparou-se ΑΪ0.Τ total pelo método da guanidina a partir de timo, baço, cérebro, rim, pulmão, fígado e másculos 3unto ao esqueleto, que foram retirados áe dez ratos com a idade de quatro semanas (05731/61), adquiridos à firma 01EA J1PÁI, Inc*. Submeteram-se 10 microgramas de ÂRÉ preparado a . partir de cada tecido, M03$5E1 ou NIH3S3, a electroforese em - 15 -Total ΑΪΤ Prepar was prepared by the guanidine method from the thymus, spleen, brain, kidney, lung, liver and skeletal muscles, which were removed from ten rats at the age of four weeks (05731/61), purchased to the firm 01EA J1PÁI, Inc *. 10 micrograms of prepared RÉA were subjected to. From each tissue, M03 $ 5E1 or NIH3S3, the electrophoresis in
gel de agarose de desnaturação com formaldeído e fixaram-se em membranas de nylon*formaldehyde denaturation agarose gel and fixed on nylon membranes *
Digeriu-se pAC03I com 2eoRI e o fragmento do inser to de oADu foi fraccionado por tamanhos por meio de electrofo rese em gel de agarose e purificado. Sintetizou-se uma amostra radioactiva a partir deste fragmento com o "estojo de mar cação de ASB escorvado aleatoriamente*» ilealizou-se a análise da mancha áe transferencia de Ebrtiiern usando estas membranas e amostras e observou-se u ma elevada expressão em í;C3E3Bl e uma relativamente pequena expressão em cérebro e líIR3i'3 (BAgura 4*)*PACO3I was digested with 2R and the fragment of the DNA insert was size-fractionated by agarose gel electrophoresis and purified. A radioactive sample was synthesized from this fragment with the randomly primed ASB marking kit. Analysis of the Erbner stain was performed using these membranes and samples and a high expression was observed in , C3E3B1 and a relatively small expression in brain and lipid (BAgura 4 *) *
Exemplo 5Example 5
Glonagão áe um cAM que Codifica Q8B»i HumanoGlonagone to a cAM encoding Human Q8B
Utilizando pACQ31 que contém cADI que codifica OSF-1 como amostra, seleecionaram-se 4 x 10^ clones áe uma bi blioteca de cÁW da parte superior das têmporas cerebrais humanas (Glonetech, Oo., número de código GIHL1094a) por Mbrl-dização em placas e depois retirou-se um clone fago positivo* 0 elone foi designado HBB.1* Então, isolou-se o inserto áe cAPI? em HBE1 por digestão com ScoRI e ligou-se a pUGUS (faka ra Shuso, ΰο·, Japão) para criar pBBR.1 que corresponde a pMG031»Using pACQ31 containing cDNA encoding OSF-1 as a sample, 4 x 10 cl clones were selected from a library of cAW from the upper human brain temples (Glonetech, WO, code number GIHL1094a) by Membrane in plates and then a positive phage clone was removed. The elon was designated HBB.1. Then, the insert was isolated from cAPI? in HBE1 by digestion with ScoRI and ligated pUGUS (Faka ra Shuso, Japan) to create pBBR.1 corresponding to pMG031
Exemplo 6Example 6
Sequenciamento de AM do inserto de cÁM de pHBRlAM Sequencing of pHBR Insertion of CAM
Depois da digestão de pHBEl com BstI e BamHI, conjr ’ truíram-se dez mutantes de supressão usando o “estoco de supressão de quilo-sequSneias" (fakara Shuzo). Estes mutaates obtidos por supressão foram designados como pHBEl-Ι, pBBEl-2, pHBRl—3 * *·· ô pHBRl—10. 16Following the digestion of pHBEl with BstI and BamHI, ten deletion mutants were conjugated using the "quench storage kit-sequences" " (fakara Shuzo). These deletion mutates were designated as pHBEL-Ι, pBBEl-2, pHBRI-3 * * * pHBRI-10. 16
As sequências &e àW âo inserto é&M de pHBEl e os seus mutantes obtidos por supressão foram determinados usando um sequeneisdor de AM automático (modelo 370A* Applied (Bio-systems), na orientação do sítio de HindIII* Beterminaram-s e aprosdLaadasente duzentos pares de bases da sequencia de nucleé tidos de cada clone e a sequência completa de cAM foi constituída combinando os dados áe sobreposição das sequências. Â sequência completa e a sua sequência áe aminoaeidos deduzida estão representadas na Figura 6»The sequences " W " and " insert " are pHBEl and their mutants obtained by deletion were determined using an automatic AM sequencer (model 370A * Applied (Bio-systems), orienting the HindIII site. Approximately two hundred base pairs of the nucleotide sequence of each clone and the complete sequence of cAM was made up by combining the sequence overlapping data. The complete sequence and its deduced amino acid sequence are shown in Figure 6.
Exemplo 7Example 7
Gonstrucão de um vector áe Expressão cara 03ff-l e produção de OSB-1 Usando esse Tector sGonstruction of a vector áe Expression face 03ff-l and production of OSB-1 Using this Tector s
Eealizou-se a expressão de GSP-l procedendo de a-cordo com o processo descrito no Fedido de Patente Japonesa Publicado para Inspecção Publica Sbo 63-267288 com o título l,Kétod.o para Expressar proteínas em Oelulas Animais Usando G-e nes Amplificados In ¥itro”*Expression of GSP-1 was performed according to the procedure described in Japanese Patent Application Laid-Open for Public Inspection Sbo 63-267288 entitled Title 1, to Protect Animals in Animal Ovules Using Amplified Genes In ¥ itro "*
Inseriu-se o cAM para 081-1 no vector de cassete pHS©747 (Japanese Oancer Research iiesources Bank» Instituto ilaoional de Saúde do Japão, ¥1047) entre o promotor precoce de antigene SY4C T e o sinal adicional poli á, como se descre ve mais adiante.CAM for 081-1 was inserted into the cassette vector pHS® 747 (Japanese Oancer Research iiesources Bank, Japan Health Institute, ¥ 1047) between the early promoter of SY4C T antigen and the additional poly Î ± signal as if described below.
Sm primeiro lugar, removeu-se o sítio de EcoAI a montante do promotor precoce do antigenio S/φ 1' de pMSG747 por x3reenchimento da folga usando fragmento de Klenow ('fakara Sbuso), seguido de religação com ligase. Introduziu-se um úni co novo sítio de EcoHI no único sítio de PstI entre o promotor 8 ¥40 e o sinal poli A inserindo um oligonueleotido liga-dor ScoRI sintético* 0 vector construído como novo, designado por pHS&757* foi utilizado para amplificação do gene in vi tro (figura 5). 17 -First, the EcoAI site was removed upstream of the early promoter of the 1 'S / φ 1' antigen of pMSG747 by x loading the gap using Klenow fragment ('Fakara Sbuso'), followed by religation with ligase. A single new EcoHI site was introduced into the single PstI site between the ¥ 40 promoter and the poly A signal by inserting a synthetic ScoRI ligand oligonucleotide. The newly constructed vector designated pHS & 757 * was used to amplification of the in vitro gene (Figure 5). 17 -
& 0 fragmento de clflf de GSIf-1 foi inserido ao sitio ϋοοΕΙ de pMSQ-757* na orientação correeta para expressão de 0BB-1 e o plasmídio foi designado somo plasmídio pOil. Pode obter-se um fragmento unitário de expressão 'de 08M. de -extre aidades coesivas assimétricas (III) digerindo pGH com BstXI* 5* GiGG . GGAOSSGS 3*& The cliff fragment of GSIf-1 was inserted into the ϋοοΕ sitio site of pMSQ-757 in the correct orientation for 0BB-1 expression and the plasmid was designated as pOll plasmid. A unit expression fragment of? 08M can be obtained. (III) digesting pGH with BstXI * 5 * GiGG. GGAOSSGS 3 *
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3f OCGOCrACC GG5?G 5* rui 7 ITo entanto, a digestão de pOPl com BstXI origina dois fragmentos de tamanhos mal to próximos e é bastante difícil separar esses dois fragmentos por fraecionamento de tamanhos. Por consequência, o plasmídlo pHSG-11 (Japanese Oaacer Research Resources Bank, Instituto Racional de Saúde do Japão, ΤΠ3049) foi inserido no sítio Ihol a Jusante do sinal poli  de pQPl* 0 plasmídio assim construído foi designado como p02?3* li listurou-se um fragmento de expressão (III) acima mencionado com um fragmento de á® (I?) preparado a partir do veetor eosmídio pHS&293 (Japanese Câncer Research Resources Bank, Instituto Racional de Saúde do Japão, 733046} » ©o» uma proporção molar igual a 20 : 1 e, ea seguida, ligou-se em série por meio de 54 lígase, como se descreve no Pedido de Patente de Invenção Japonesa Publicado para, Inspecção pública Slio63-267288 5» ÚSm GGAG&Gm 3* gene neo * sítio cos 3f CGOCGRGO GSTG 5’ fivj - 18However, digestion of pOP1 with BstXI yields two fragments of up to near-sized size and it is quite difficult to separate these two fragments by size fractionation. As a result, plasmid pHSG-11 (Japanese Oaacer Research Resources Bank, ΤΠ 3049) was inserted into the Ihole site downstream of the poly β signal of pQP1. The plasmid thus constructed was designated as p02β3β1 an above-mentioned expression fragment (III) was cleaved with an Î ± (Iβ) fragment prepared from the pHS & 293 (Japanese Cancer Research Resources Bank, Japan Rational Health Institute, 733046) A molar ratio equal to 20: 1, and then serially ligated by filtration, as described in Japanese Published Patent Application Laid-Open Publication Slio63-267288 5 GGAG & Gm 3 * gene neo * site cos 3f CGOCGRGO GSTG 5 'fivj - 18
iânpaeotcm^ô o fragmento de AE? âe cadeia comprida ea £sgo lambda la vltro e amplificou-se em IS. coli 0m2ú6 (depositado ea Jferãentation Researoà Ias ti tate* ágeney of Industrial ucieace and feehnology, ísukuba» como iME p-911ú; ia-keshiia e ool.* 1983, G-ene 71* 9 - 18) e empacotou-se la vi-· vogoa partículas de fago lambda para preparar uma grande quan tidsde de' cosmí&io· EDw. 'jjraasfectou-se ο para células GHO (ovário de criceto chinês) pelo método convencional da copre-oigitagao coa fosfato de cálcio e seleecionaram-se os clones resistentes a «-418. Batão, preparou-se o ARI.' total de cada elouo pelo método da guaniídina e determinou-se o nível de expressão do gene G3B-X por análise· de transferencia de Northern usando. gííM de 03¥-X como amostra e escolheu-se o elone de maior produção,.The fragment AE? long chain and is lambda la vltro and amplified in IS. (deposited and the Applicant's Restrictions on Industrial Technology and Feasibility, Japan as well as Japan, Japan, Japan, Japan, Japan, Japan, Japan, and Japan) and packaged vi - vows lambda phage particles to prepare a large amount of cosmid · EDw. was added to GHO (Chinese hamster ovary) cells by the conventional calcium phosphate coprecipitation method and the -418-resistant clones were isolated. Bat, the ARI was prepared. ' total of each eluate by the guanidine method and the level of expression of the G3B-X gene was determined by using Northern blot analysis. of 03 ¥ -X as a sample and the highest production elone was chosen.
Cultivaram-ae as células do elone escolhido em al-fa-MSI contendo 10yõ de soro de feto de vitela, durante vinte e quatro horas e cletectou~se a proteína OBf-1 na cultura sobrenadaste .The cells of the chosen elone in alfa-MSI containing 10æl of calf fetal serum were grown for 24 hours and the OBf-1 protein cleaved in the supernatant culture.
Breve descrição dos besenhosBrief description of the
KJ A ilgura 1 representa us mapa do plasmídio priCGGl. A caixa aberta é o cnli! inserido eme codifica G8P-1 de rato. i. seta indica o gene resistente a ampicilina. G círculo fecha do é a origem da replicação do plasmídio. á I?igura 2 representa uma estrutura de segmentos do inserto cA3H de pHC031 e dos seus cies mutantes de supressão. is linhas cheias são cATM inseridos contidos em cada plasmídios. As sotas assinalam regiões erga sequência foi determinada e o sentido do sequenciamento dos núcleotidos. A figura 3 representa a sequência de nueleotidos completa do clDH inserido de pKCG^l e a sequência de aminoáci dos de GSB-i de rato dedusida da sequência de nueleotidos. % - 19The fragment 1 represents a map of the plasmid priCGG1. The open box is the cnli! inserted into and encodes rat G8P-1. i. arrow indicates the ampicillin resistant gene. G circle is the origin of plasmid replication. Figure 2 shows a segment structure of the pHC031 insert cA3H and its mutant suppression cells. filled lines are cATM inserted contained in each plasmid. The dots indicating regions erga sequence was determined and the sense of nucleation sequencing. Figure 3 depicts the complete nucleotide sequence of the inserted clDH of pKCGIII and the mouse GSB-i amino acid sequence from the sequence of nucleotides. % - 19
ta sublinhado o segmento ligador JcoEI-Ilotl* Um símbolo oom tris asteriscos,, aasst e o eodao de acabamento da translação« A figura 4 mostra o resultado da analise de transferencia e sanehamento de nortaera para a especificidade do tecido de expressão pelo gene de OSf-l. dada pista indica: 1« timo; 2- baço; 3- cérebro; 4- rim; 5- fígado; 6« pulmão; 7* músculos 3unto ao esqueleto; 8- células MC313E1; e 9- célu las ΙίϊΗ3$3. IBS e 23S indicam as posições de MM ribossémico« A figura 5 representa vm mapa do plasmídio pSSS757* L eaisa aberta é o sinal poli A* A seta aberta é 0 promotor precoce do antigene S 740 i5. A seta © o sentido e a posição a-proximada do gene de resistência a cloranfenieol. 0 círculo fechado é a origem âa replieação do plasmídio. A figura S representa a sequencia completa de nu- cleotidos do cAUI inserido de pHBAl e a seqencia de aminoaci-dos de OSf-1 humano dedusida a partir da sequencia de nucleó-tidos.Figure 4 shows the result of the transfer and normalization analysis of nortaera for specificity of the expression tissue by the OSf gene. -l. given clue indicates: 1 «thymus; 2- spleen; 3- brain; 4- kidney; 5- liver; 6 'lung; 7 * muscles 3 to the skeleton; 8-MC313E1 cells; and 9-cells at ΙίϊΗ3 $ 3. IBS and 23S indicate the positions of ribosomal MM. Figure 5 depicts a plasmid map pSSS757. The open arrow is the poly A signal. The open arrow is the early promoter of the S 740 antigen. The arrow is the direction and a-close position of the chloramphenicol resistance gene. The closed circle is the origin of plasmid replication. Figure S represents the complete nucleotide sequence of the inserted cAUI of pHBAl and the amino acid sequence of human OSf-1 deduced from the nucleotide sequence.
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