PT97820B - PROTEIN OBTAINING PROCESS MAP2-KINASES, MICROORGANISMS AND CELL LINES COMPREHENDING MAP2-KINASE RECOMBINANT MOLECULES AND DETENTION OF THE PRESENCE OF CELL FACTORS ACTIVITY - Google Patents

Abstract

This invention relates to the process of obtaining proteins and recombinant nucleic acid molecules representing members of the MAP2-kinases family and micro- organisms and cell lines containing recombinant MAP2- kinase molecules. This invention also provides a process for analysing the activity of cell factors, specifically activity of the nerve growth factor, in which MAP2-kinase activation serves as an indicator of the activity of the cell factor. This process can be used to assess compounds in relation to the presence of a desired cell factor activity.

Description

PATENTE N^a . 97 820PATENT N ^a . 97 820

Processo de obtenção de proteína MAP2-quinases, de microorganismos e linhas de células compreendendo moléculas recombinantes de MAP2-quinase e de detecção da presença de actividade de factores celulares para queProcess of obtaining MAP2 protein kinases, microorganisms and cell lines comprising recombinant MAP2 kinase molecules and detecting the presence of cellular factor activity so that

REGENERON PHARMACEUTICALS, INC., e BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM, pretendem obter privilégio de invenção em Portugal.REGENERON PHARMACEUTICALS, INC., And BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM, intend to obtain privilege of invention in Portugal.

RESUMO presente invento refere-se ao processo de obtenção de proteínas e moléculas de ácido nucleico recombinantes que representam membros da família das MAP2-quinases, e de microorganismos e linhas de células compreendendo moléculas recombinantes de MAP2-quinase.SUMMARY The present invention relates to the process of obtaining recombinant proteins and nucleic acid molecules that represent members of the MAP2 kinase family, and microorganisms and cell lines comprising recombinant MAP2 kinase molecules.

presente invento proporciona ainda um processo para a análise da actividade de factores celulares, nomeadamente da actividade do factor de crescimento de nervo, no qual a activação da MAP2-quinase serve como um indicador da actividade do factor celular.the present invention further provides a process for the analysis of the activity of cellular factors, namely the activity of nerve growth factor, in which the activation of MAP2 kinase serves as an indicator of the activity of cellular factor.

Este processo permite a avaliação de compostos, relativamen te à presença de uma actividade de factor celular desejada.This process allows the evaluation of compounds, with respect to the presence of a desired cell factor activity.

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MEMÓRIA DESCRITIVADESCRIPTIVE MEMORY

1. INTRODUÇÃO1. INTRODUCTION

O presente invento refere-se a uma família de proteína MAP2-quinases recentemente identificada. Baseia-se, em parte, na clonagem e caracterização de três proteínas MAP2-quinases, designadas por ERK1, ERK2 e ERK3, que são expressas no sistema nervoso central, entre outros. Este invento proporciona ácidos nucleicos e proteínas da MAP-quinase, recombinantes, linhas celulares e microrganismos contendo moléculas de MAP-quinase, recombinantes, e processos de bioensaio para a detecção da presença de compostos biologicamente activos que utilizam moléculas de MAP-quinase, recombinantes.The present invention relates to a recently identified MAP2 protein kinase family. It is based, in part, on the cloning and characterization of three MAP2 protein kinases, called ERK1, ERK2 and ERK3, which are expressed in the central nervous system, among others. This invention provides recombinant MAP kinase nucleic acids and proteins, recombinant cell lines and microorganisms containing MAP kinase molecules, and bioassay processes for detecting the presence of biologically active compounds using recombinant MAP kinase molecules.

2. HISTORIAL DO INVENTO2. HISTORY OF THE INVENTION

2.1. CASCATAS DA PROTEÍNA QUINASE2.1. PROTEIN KINASE CASCADES

E REGULAÇÃO DA FUNÇÃO CELULARAND REGULATION OF CELLULAR FUNCTION

A cascata de reacções de fosforilação, iniciada por um receptor da tirosina-quinase, tem sido proposta como um mecanismo de transdução potencial para receptores de factores de crescimento, incluindo o receptor da insulina (Cobb e Rosen, 1984, Biochim. Biophys. Acta. 738:1-8; Denton et al., 1984, Biochem. Soc. Trans. 12.:768-771). Na sua revisão do papel da fosforilação proteica no controlo normal da actívidade enzimática, Cohen (1985, Eur. J. Biochem. 151:439-448) afirma que a amplificação e diversidade na acção hormonal são conseguidas por dois mecanismos principais, a fosforilação reversível de proteínas e a formação de segundos mensageiros; muitas proteínas chave de regulação são interconvertidas entre formas fosforiladas e não fosforiladas, por proteína-quinases celulares e algumas proteína-fosfatases.The cascade of phosphorylation reactions, initiated by a tyrosine kinase receptor, has been proposed as a potential transduction mechanism for growth factor receptors, including the insulin receptor (Cobb and Rosen, 1984, Biochim. Biophys. Acta. 738: 1-8; Denton et al., 1984, Biochem. Soc. Trans. 12.:768-771). In his review of the role of protein phosphorylation in the normal control of enzymatic activity, Cohen (1985, Eur. J. Biochem. 151: 439-448) states that amplification and diversity in hormonal action are achieved by two main mechanisms, reversible phosphorylation of proteins and the formation of second messengers; many key regulatory proteins are interconverted between phosphorylated and non-phosphorylated forms, by cellular protein kinases and some protein phosphatases.

Algumas hormonas parecem transmitir a sua informação para o interior da célula por activação de sistemas de sinal transmembranares que controlam a produção de um número relativamente pequeno de mediadores químicos; os segundos mensageiros. Estes segundos mensageiros, por sua vez, regulam a actívidade das proteína-quinase e fosfatase, alterando os estados deSome hormones appear to transmit their information into the cell by activating transmembrane signal systems that control the production of a relatively small number of chemical mediators; the second messengers. These second messengers, in turn, regulate the activity of protein kinase and phosphatase, changing the states of

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fosforilação de muitas proteínas intracelulares e, consequentemente, controlando a actividade de enzimas que são reguladas pelo seu grau de fosforilação (ver Figura l). Os receptores para outras hormonas são, eles próprios, proteína-quinases ou interagem directamente com proteína-quinases para iniciarem cascatas de sinalização de proteína-quinase. Acredita-se que esta série de acontecimentos podem explicar a diversidade associada com a acção de várias hormonas (Cohen, 1985, Eur. J. Biochem. 151:439-448? Edelman et al., 1987, Ann. Rev, Biochem. 56:567-613).phosphorylation of many intracellular proteins and, consequently, controlling the activity of enzymes that are regulated by their degree of phosphorylation (see Figure 1). The receptors for other hormones are themselves protein kinases or interact directly with protein kinases to initiate protein kinase signaling cascades. It is believed that this series of events may explain the diversity associated with the action of various hormones (Cohen, 1985, Eur. J. Biochem. 151: 439-448? Edelman et al., 1987, Ann. Rev, Biochem. 56 : 567-613).

A insulina, tal como a maioria dos reguladores celulares, exerce os seus efeitos em muitos processos celulares através de alterações do estado de fosforilação dos resíduos de serina e treonina de proteínas reguladas. A insulina exerce estes efeitos através do seu receptor, que tem uma actividade intrínseca de proteína quinase específica para a tirosina (Rosen et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:3237-3240; Ebina et al., 1985, Cell 40.:747-758). De notar que as proteínas codificadas por vários oncogenes são também proteína tirosina-quinases. Por exemplo p₆₈gag-^r°s, uma proteína transformadora transmembranar, apresenta muitas semelhanças com o receptor da insulina, tendo uma identidade em aminoácidos de 50% (para discussão, ver Boulton et al., 1990, J. Biol. chem. 265:2713-2719).Insulin, like most cell regulators, exerts its effects on many cellular processes by altering the phosphorylation status of regulated protein serine and threonine residues. Insulin exerts these effects through its receptor, which has an intrinsic tyrosine-specific protein kinase activity (Rosen et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3237-3240; Ebina et al., 1985, Cell 40.:747-758). Note that proteins encoded by various oncogenes are also protein tyrosine kinases. For example p ₆₈ gag- ^r ° s, a transmembrane transforming protein, has many similarities to the insulin receptor, having an amino acid identity of 50% (for discussion, see Boulton et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 2713-2719).

Crê-se que também o factor de crescimento do nervo, NGF, um agente neurotrófico necessário para o desenvolvimento e funcionamento de certos neurónios do sistema nervoso central e periférico, influencia funções celulares, pelo menos em parte, por alteração da fosforilação de proteínas intracelulares. Tem sido observado que o NGF promove alterações na fosforilação de certas proteínas celulares (discutido em Volonte et al., 1989, J. Cell. Biol. 109:2395-2403; Aletta et al., 1988, J. Cell. Biol. 106:1573-1581? Halegoua e Patrick, 1980, Cell 22.:571-581,- Hama et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83.: 2353-2357; Romano et al., 1987, J. Neurosci, 7.:1294-1299). Além disso, o NGF parece regular várias actividades de proteína-quinases diferentes (Blenis e Erikson, 1986, EMBO J. 5.:3441-3447,- Cremins et al., 1986,It is also believed that the nerve growth factor, NGF, a neurotrophic agent necessary for the development and functioning of certain neurons in the central and peripheral nervous system, influences cellular functions, at least in part, by altering the phosphorylation of intracellular proteins. It has been observed that NGF promotes changes in the phosphorylation of certain cellular proteins (discussed in Volonte et al., 1989, J. Cell. Biol. 109: 2395-2403; Aletta et al., 1988, J. Cell. Biol. 106 : 1573-1581 - Halegoua and Patrick, 1980, Cell 22.:5371-581,- Hama et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 .: 2353-2357; Romano et al., 1987, J. Neurosci, 7.:1294-1299). In addition, NGF appears to regulate several different protein kinase activities (Blenis and Erikson, 1986, EMBO J. 5.:3441-3447,- Cremins et al., 1986,

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J. Cell Biol. 103:887-893; Landreth e Rieser, 1985, J. Cell. Biol. 100:677-683; Levi et al., 1988, Mol. Neurobiol. 2.:201-226; Mutoh et al., 1988, J. Biol. Cheia. 263:15853-15856; Rowland et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:7504-7513). Mutoh et al. (1988, J. Biol. Chem. 263:15853-15856) referem que o NGF parece aumentar as actividades de quinases capazes de fosforilar a proteína ribossómica S6 (S6-quinases) na linha celular PC12 de feocromocitoma de ratazana, um sistema modelo geralmente usado para estudar a função do NGF. Volonte et al. (1989, J. Cell. Biol. 109:2395-2403) afirma que a inibição diferencial da resposta do NGF por análogos de purina em células PC12, parece ter correlação com a inibição da PKN, uma proteína serina-quinase regulada pelo NGF. Adicionalmente, tem sido referido que activadores da proteína-quinase dependente do AMP cíclico (PKA) e da proteína-quinase C (PKC) mimetizam algumas mas não todas as respostas celulares ao NGF. (Levi et al., 1988, Mol. Neurobiol. 2.:201-226). Miyasaka et al. (1990, J. Biol. Chem. 265:4730-4735) relatam que o NGF estimula uma proteína-quinase, nas células PC12, que fosforila a proteína-2 associada aos microtúbulos. Curiosamente, apesar de muitos artigos relacionarem o NGF com alterações na fosforilação de proteínas celulares, a análise de uma sequência de ADNc codificando uma subunidade do receptor do NGF, que é suficiente para uma ligação de baixa afinidade com o ligando, não evidenciou um domínio da proteína tirosina-quinase na região citoplasmática de baixa afinidade para o receptor (Johnson et al., 1986, Cell 47:545-554).J. Cell Biol. 103: 887-893; Landreth and Rieser, 1985, J. Cell. Biol. 100: 677-683; Levi et al., 1988, Mol. Neurobiol. 2.:201-226; Mutoh et al., 1988, J. Biol. Full. 263: 15853-15856; Rowland et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 7504-7513). Mutoh et al. (1988, J. Biol. Chem. 263: 15853-15856) report that NGF appears to increase the activities of kinases capable of phosphorylating the ribosomal protein S6 (S6-kinases) in the rat pheochromocytoma PC12 cell line, a model system generally used to study the function of NGF. Volonte et al. (1989, J. Cell. Biol. 109: 2395-2403) states that the differential inhibition of the NGF response by purine analogs in PC12 cells appears to be correlated with the inhibition of PKN, a serine kinase protein regulated by NGF. In addition, activators of cyclic AMP-dependent protein kinase (PKA) and protein kinase C (PKC) have been reported to mimic some but not all cellular responses to NGF. (Levi et al., 1988, Mol. Neurobiol. 2.:201-226). Miyasaka et al. (1990, J. Biol. Chem. 265: 4730-4735) report that NGF stimulates a protein kinase, in PC12 cells, which phosphorylates protein-2 associated with microtubules. Interestingly, although many articles have linked NGF to changes in cell protein phosphorylation, analysis of a cDNA sequence encoding a subunit of the NGF receptor, which is sufficient for a low affinity binding with the ligand, has not shown a domain of tyrosine kinase protein in the cytoplasmic region of low affinity for the receptor (Johnson et al., 1986, Cell 47: 545-554).

2.2. A PROTEÍNA MÃP2-QUINASE2.2. THE MÃP2-KINASE PROTEIN

A proteína ribossómica S6 é uma componente da subunidade 4os ribossómica eucariota que é fosforilada em múltiplos resíduos da serina, em resposta a uma variedade de estímulos mitogénicos, incluindo a insulina, factores de crescimento e várias proteínas transformadoras (para discussão, ver Sturgill et al., 1988, Nature 334:715-718). Recentemente, foi purificada e caracterizada imunológica e molecularmente uma S6-quinase activada (Ericson e Maller, 1986, J. Biol. Chem. 261:350-355; Ericson et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7.: 3147-3155; Jones et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85.:377-3381; Gregory et al., 1989, J. Biol.The ribosomal protein S6 is a component of the eukaryotic ribosomal 4th subunit that is phosphorylated into multiple serine residues in response to a variety of mitogenic stimuli, including insulin, growth factors and various transforming proteins (for discussion, see Sturgill et al. , 1988, Nature 334: 715-718). Recently, an activated S6-kinase was purified and characterized immunologically and molecularly (Ericson and Maller, 1986, J. Biol. Chem. 261: 350-355; Ericson et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7 .: 3147- 3155; Jones et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85.:377-3381; Gregory et al., 1989, J. Biol.

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Chem. 264:18397-18401). A reactivação e fosforilação da S6-quinase ocorre in vitro por meio de uma proteína-quinase da proteína-2 estimulada pela insulina, associada aos microtúbulos, (MAP2), fornecendo mais evidências para a existência de uma cascata da proteína-quinase (Sturgill, 1988, supra; Gregory et al., 1989, supra). Verificou-se que a MAP2-quinase fosforila resíduos de serina e treonina da proteína-2 associada aos microtúbulos (MAP2) (Ray e Sturgill, 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:1502-1506; Boulton et al., 1991, Biochem. 30.:278-286). Estas observações sugerem que os passos chave na acção da insulina envolvem a activação sequencial, por fosforilação, de pelo menos duas serina/treonina proteína-quinases (Sturgill et al., 1988, Nature 334:715-718? Gregory et al., 1989, J. Biol. Chem. 264 :18397-18401; Ahn et al., 1990 , J. Biol. Chem. 265:11495-11501). nomeadamente, uma MAP2-quinase e uma S6-quinase. A MAP2-quinase parece ser transitoriamente activada pela insulina, antes da activação da S6-quinase.Chem. 264: 18397-18401). Reactivation and phosphorylation of S6-kinase occurs in vitro via an insulin-stimulated protein-2 protein kinase, associated with microtubules, (MAP2), providing further evidence for the existence of a protein kinase cascade (Sturgill, 1988, supra; Gregory et al., 1989, supra). MAP2-kinase was found to phosphorylate serine and threonine residues of protein-2 associated with microtubules (MAP2) (Ray and Sturgill, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1502-1506; Boulton et al. , 1991, Biochem. 30.:278-286). These observations suggest that the key steps in the action of insulin involve the sequential activation, by phosphorylation, of at least two serine / threonine protein kinases (Sturgill et al., 1988, Nature 334: 715-718? Gregory et al., 1989 , J. Biol. Chem. 264: 18397-18401; Ahn et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 11495-11501). namely, a MAP2 kinase and an S6 kinase. MAP2 kinase appears to be transiently activated by insulin, before S6 kinase activation.

A MAP2-quinase fosforila in vitro a S6-quinase provocando um aumento na sua actividade (Gregory et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:18397-18401; Sturgill et al., 1988, Nature 334:715-718); assim, a MAP2-quinase é provavelmente um intermediário desta cascata da proteína-quinase. A verificação de que a fosforilação do resíduo de treonina, assim como do resíduo de tirosina, é necessária para a actividade da MAP2-quinase (Anderson et al., 1990, Nature 343:651-653) sugere, tal como acontece com muitas outras proteínas, que é regulada por múltiplas fosforilações. As fosforilações podem ser transmitidas através de uma ou várias vias de transdução de sinais.MAP2-kinase phosphorylates the S6-kinase in vitro causing an increase in its activity (Gregory et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 18397-18401; Sturgill et al., 1988, Nature 334: 715-718 ); thus, MAP2 kinase is likely to be an intermediary in this protein kinase cascade. The finding that phosphorylation of the threonine residue, as well as the tyrosine residue, is necessary for MAP2-kinase activity (Anderson et al., 1990, Nature 343: 651-653) suggests, as with many others protein, which is regulated by multiple phosphorylations. Phosphorylations can be transmitted via one or more signal transduction pathways.

Adicionalmente à estimulação pela insulina, a actividade da MAP2-quinase pode ser rapidamente aumentada por uma variedade de sinais extracelulares que promovem a proliferação e/ou a diferenciação celular. Neste aspecto, a MAP2-quinase pode ser equivalente à pp42 (Cooper e Hunter, 1981, Mol. Cell. Biol. 1.:165-178), uma proteína cujo conteúdo em fosfotirosina aumenta após exposição a factores de crescimento e transformação por vírus (Rossamondo et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USAIn addition to insulin stimulation, MAP2 kinase activity can be rapidly increased by a variety of extracellular signals that promote cell proliferation and / or differentiation. In this respect, MAP2-kinase may be equivalent to pp42 (Cooper and Hunter, 1981, Mol. Cell. Biol. 1.:165-178), a protein whose phosphotyrosine content increases after exposure to growth factors and virus transformation (Rossamondo et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA

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86:6940-6943) e activação do oncogene v-ros (Boulton et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:2713-2719). Por exemplo, a actividade da MAP2-quinase é estimulada em: adipócitos 3T3-L1 diferenciados terminalmente em resposta à insulina (Ray e Sturgill, 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:1502-1506); em células adrenais cromofínicas pós-mitóticas em resposta a sinais que induzem a secreção de catecolamina (Ely et al., 1990, J. Cell. Biol. 110:731-742): em células PC12 em resposta à diferenciação neuronal induzida pelo factor de crescimento do nervo (Volonte et al., J, Cell Biol. 109:2395-2403; Miyasaka et al., J. Biol. Chem. 265:4730-4735) e em linfócitos T (Nel et al., 1990, J. Immunol. 114:2683-2689). A(s) MAP2-quinase(s) provavelmente desempenham papéis importantes na transdução de sinais em muitas vias diferentes e numa grande variedade de tipos celulares.86: 6940-6943) and activation of the v-ros oncogene (Boulton et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 2713-2719). For example, MAP2 kinase activity is stimulated in: terminally differentiated 3T3-L1 adipocytes in response to insulin (Ray and Sturgill, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1502-1506); in post-mitotic chromophinic adrenal cells in response to signals that induce catecholamine secretion (Ely et al., 1990, J. Cell. Biol. 110: 731-742): in PC12 cells in response to neuronal differentiation induced by nerve growth (Volonte et al., J, Cell Biol. 109: 2395-2403; Miyasaka et al., J. Biol. Chem. 265: 4730-4735) and in T lymphocytes (Nel et al., 1990, J Immunol 114: 2683-2689). MAP2 kinase (s) are likely to play important roles in signal transduction in many different pathways and in a wide variety of cell types.

Ray e Sturgill (1988, J. Biol. Chem. 263:12721-12727) descrevem algumas propriedades cromatograficas de uma MAP2-quinase e referem as características bioquímicas da enzima parcialmente purificada. Foi observado que a MAP2-quinase tem afinidade para matrizes cromatográficas hidrofóbicas. Verificou-se que a massa molecular da enzima parcialmente purificada era de 35 000 por cromatografia de filtração em gel e 37 000 por centrifugação em gradiente de glicerol. Verificou-se que a actividade da MAP2-quinase das fracções cromatográficas se correlaciona com a presença de uma fosfoproteína de 40 kDa, detectada, por electroforese em gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sódio (SDS-Page). Observou-se que a MAP2-quinase possuía uma Km de 7 μΜ para o ATP, não parecendo utilizar o GTP. Tem sido observado que a MAP2-quinase requer a fosforilação dos resíduos de tirosina, assim como dos resíduos de serina/treonina para a actividade. Ray e Sturgill (supra) citam vários problemas encontrados na purificação da MAP2-quinase, entre eles o mais notável é a presença de quinases contaminantes capazes de fosforilar a MAP2 in vitro. Adicionalmente, apenas são obtidas pequenas quantidades de enzima apenas parcialmente purificada após a preparação cromatográfica. Tal como já foi discutido, Rossomando et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86.:6940-6943) sugeriram que a MAP2-quinase podia ser uma forma fosforilada na tirosina daRay and Sturgill (1988, J. Biol. Chem. 263: 12721-12727) describe some chromatographic properties of a MAP2-kinase and refer to the biochemical characteristics of the partially purified enzyme. It was observed that MAP2-kinase has an affinity for hydrophobic chromatographic matrices. The molecular weight of the partially purified enzyme was found to be 35,000 by gel filtration chromatography and 37,000 by glycerol gradient centrifugation. It was verified that the MAP2-kinase activity of the chromatographic fractions correlates with the presence of a 40 kDa phosphoprotein, detected by sodium polyacrylamide-dodecyl sulfate gel electrophoresis (SDS-Page). It was observed that MAP2-kinase had a Km of 7 μΜ for ATP, and does not appear to use GTP. It has been observed that MAP2-kinase requires phosphorylation of tyrosine residues, as well as serine / threonine residues for activity. Ray and Sturgill (supra) cite several problems found in the purification of MAP2-kinase, among them the most notable is the presence of contaminating kinases capable of phosphorylating MAP2 in vitro. In addition, only small amounts of partially purified enzyme are obtained after chromatographic preparation. As already discussed, Rossomando et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86.:6940-6943) suggested that MAP2-kinase could be a tyrosine phosphorylated form of

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pp42, uma proteína pouco abundante de 42 kDa qu« transitoriamente fosforilada na tirosina após a estimulação celular com uma variedade de mitogéneos. Rossomondo et al. (supra) observaram que a fosforilação da pp42 e a activação da MAP2-quinase ocorrem em resposta aos mesmos mitogénios, que as duas proteínas co-migram em dois geles de poliacrilamida de duas dimensões e possuem mapas peptídicos semelhantes, e que as duas proteínas são co-purifiçadas em purificações sequenciais em meios de permuta aniónica, de interacção hidrofóbica e de filtração em gel.pp42, a 42 kDa low-abundant protein that is transiently phosphorylated in tyrosine after cellular stimulation with a variety of mitogens. Rossomondo et al. (supra) observed that phosphorylation of pp42 and activation of MAP2-kinase occur in response to the same mitogens, that the two proteins co-migrate in two two-dimensional polyacrylamide gels and have similar peptide maps, and that the two proteins are co-purified in sequential purifications in anion exchange, hydrophobic interaction and gel filtration media.

3. SUMÁRIO DO INVENTO presente invento refere-se a uma família de proteínas serina/treonina-quinases, recentemente identificada, que fosforilam a proteína-2 associada aos microtúbulos (MAP2). Baseia-se, em parte, na clonagem e caracterização de novas MAP2-quinases, designadas por quinases 1, 2 e 3 reguladas por sinais extracelulares (ERK1, ERK2 e ERK3) que são expressas no sistema nervoso central, e também na identificação com antissoros de um outro membro da família ERK, a ERK4. O termo ^,,MAP2-quinase aqui utilizado significará qualquer membro da família das MAP2-quinases, incluindo, mas não limitado a ERK1, ERK2 e ERK3.3. SUMMARY OF THE INVENTION the present invention relates to a family of serine / threonine kinases proteins, recently identified, which phosphorylate protein-2 associated with microtubules (MAP2). It is based, in part, on the cloning and characterization of new MAP2-kinases, called kinases 1, 2 and 3 regulated by extracellular signals (ERK1, ERK2 and ERK3) that are expressed in the central nervous system, and also in the identification with antisera another member of the ERK family, ERK4. The term ^,, MAP2-kinase used herein will mean any member of the MAP2-kinase family, including, but not limited to ERK1, ERK2 and ERK3.

Este invento proporciona moléculas de ácido nucleico e proteínas recombinantes representando membros da família MAP2-quinase e, também, microrganismos, animais transgénicos e linhas celulares contendo moléculas de MAP2-quinase recombinantes. Em concretizações adicionais do invento, o presente invento proporciona processos de ensaio para a actividade do factor celular, incluindo, mas não limitado à actividade do factor de crescimento do nervo, no qual a activação da MAP2-quinase serve como um indicador da actividade do factor celular. Estes processos podem ser extremamente úteis na selecção de compostos contendo uma actividade de factor celular desejada. Em concretizações específicas, os compostos que poderão ser úteis no tratamento da doença de Alzheimer, neuropatias periféricas e diabetes podem ser identificados usando os processos do invento.This invention provides nucleic acid molecules and recombinant proteins representing members of the MAP2-kinase family and also microorganisms, transgenic animals and cell lines containing recombinant MAP2-kinase molecules. In further embodiments of the invention, the present invention provides assay procedures for cell factor activity, including, but not limited to nerve growth factor activity, in which MAP2 kinase activation serves as an indicator of factor activity cell phone. These processes can be extremely useful in the selection of compounds containing a desired cellular factor activity. In specific embodiments, compounds that may be useful in the treatment of Alzheimer's disease, peripheral neuropathies and diabetes can be identified using the processes of the invention.

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4. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS4. DESCRIPTION OF THE FIGURES

FIGURA 1. Diagrama esquemático da relação entre a ligação da hormona a um receptor celular e consequentes alterações na fosforilação das proteínas.FIGURE 1. Schematic diagram of the relationship between the binding of the hormone to a cellular receptor and consequent changes in protein phosphorylation.

FIGURA 2. A. Análise por SDS-PAGE das fracções finais de Q-Sepharose #2, isoladas a partir de células PC12 de controlo ou tratadas com NGF. As alíquotas das fracções obtidas a partir da coluna final de purificação (Q-Sepharose #2) foram concentradas e analisadas por SDS-PAGE a 15%. De notar que fracções contendo a maior parte da actividade de MAP2-quinase continham uma banda proeminente (seta) com uma massa molecular de aproximadamente 43 000 kD, como descrito para a MAP2-quinase estimulada pela insulina. BSA, ovalbumina e citocromo C foram utilizados como padrões de tamanho.FIGURE 2. A. SDS-PAGE analysis of the final Q-Sepharose # 2 fractions, isolated from control PC12 cells or treated with NGF. The aliquots of the fractions obtained from the final purification column (Q-Sepharose # 2) were concentrated and analyzed by 15% SDS-PAGE. Note that fractions containing most of MAP2-kinase activity contained a prominent band (arrow) with a molecular mass of approximately 43,000 kD, as described for insulin-stimulated MAP2-kinase. BSA, ovalbumin and cytochrome C were used as size standards.

Β. A sequência nucleotidica completa do ADNc de ERK1 (SEQ ID N®. 1) e do seu produto proteico previsto (SEQ ID N®. 2). Os asteriscos indicam os resíduos mais conservados entre todas as proteína-quinases. As sequências dos nove péptidos trípticos que foram sequenciados encontram-se sublinhadas. Todos os resíduos determinados precisamente pela sequenciação de aminoácidos correspondem à sequência proteica codificada pelo ADNc; resíduos questionáveis verificaram-se a partir da sequência proteica codificada pelo ADNc. 0 quarto e sétimo péptidos indicados, representam os componentes peptídicos menores descritos no texto.Β. The complete nucleotide sequence of the ERK1 cDNA (SEQ ID N®. 1) and its predicted protein product (SEQ ID N®. 2). Asterisks indicate the most conserved residues among all protein kinases. The sequences of the nine triptych peptides that have been sequenced are underlined. All residues determined precisely by amino acid sequencing correspond to the protein sequence encoded by the cDNA; questionable residues were found from the protein sequence encoded by the cDNA. The fourth and seventh peptides indicated, represent the minor peptide components described in the text.

FIGURA 3. Nucleótidos e sequências proteicas previstas dos ADNc de ERK2, ERK3 e do pseudogene ERKl^. Os codões de iniciação e de terminação encontram-se em caixas; as localizações aproximadas dos subdomínios da proteína-quinase são indicadas por numerais romanos; os asteriscos indicam os resíduos mais conservados entre todas as proteína-quinases (Hanks et al., 1988, Science .241:42-52); os sinais de libra indicam os resíduos que não são conservados nas sequências indicadas.FIGURE 3. Nucleotides and predicted protein sequences of ERK2, ERK3 cDNAs and the ERK1 ^ pseudogene. The initiation and termination codons are in boxes; the approximate locations of the protein kinase subdomains are indicated by Roman numerals; asterisks indicate the most conserved residues among all protein kinases (Hanks et al., 1988, Science .241: 42-52); pound signs indicate residues that are not conserved in the indicated sequences.

A. Sequência nucleotidica (SEQ ID N². 3) e proteica prevista (SEQ ID N®. 4) de um dos dois clones de ADNc de ERK2; a região deA. Nucleotide sequence (SEQ ID NO: ² ) and predicted protein (SEQ ID NO: 4) from one of the two ERK2 cDNA clones; the region of

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codificação da proteína do outro ADNc de ERK2 corresponde exactamente, embora as sequências nas regiões flanqueadoras divirjam.The protein encoding of the other ERK2 cDNA corresponds exactly, although the sequences in the flanking regions differ.

B. Sequência nucleotídica completa (SEQ ID N^a. 5) e sequência proteica prevista (SEQ ID N^a. 6) de um dos dois clones de ADNc de ERK 3 analisados; a sequência do outro ADNc de ERK 3 corresponde exactamente, embora existam diferenças nas quantidades da sequência flanqueadoras.B. Complete nucleotide sequence (SEQ ID No. ^a . 5) and predicted protein sequence (SEQ ID No. ^a . 6) from one of the two ERK 3 cDNA clones analyzed; the sequence of the other ERK 3 cDNA corresponds exactly, although there are differences in the amounts of the flanking sequence.

C. Alinhamento da sequência parcial da ERKl^ com as sequências nucleotídicas de ERK1; apenas são indicadas diferenças em aminoácidos (incluindo o codão prematuro de terminação de ERKl^ em caixa) da sequência proteica de ERK1. Os traços indicam delecções em ambas as sequências de nucleotidos e aminoácidos.C. Alignment of the partial ERK1 sequence with the ERK1 nucleotide sequences; only differences in amino acids (including the ERK1 terminated premature codon in box) of the ERK1 protein sequence are indicated. The dashes indicate deletions in both the nucleotide and amino acid sequences.

FIGURA 4. Comparação das ERK com sequências proteicas de FUS3, KSS1 e cdc2 humana.FIGURE 4. Comparison of ERKs with human FUS3, KSS1 and cdc2 protein sequences.

A. Alinhamentos gerados por computador (MacVector Computer Analysis Software, International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT) foram visualmente optimizados. Os números romanos indicam subdomínios conservados nas proteína-quinases (Hanks et al., 1988, Science 241:42-52). Os pontos indicam identidade com a sequência ERK1, os traços indicam espaços introduzidos de forma a melhorar os alinhamentos da sequência.A. Computer generated alignments (MacVector Computer Analysis Software, International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT) have been visually optimized. Roman numbers indicate subdomains conserved in protein kinases (Hanks et al., 1988, Science 241: 42-52). The dots indicate identity with the ERK1 sequence, the dashes indicate spaces introduced in order to improve the alignments of the sequence.

B. Percentagem de identidade entre as sequências alinhadas em A determinada sobre o comprimento da sequência cdc2+; as trocas, inserções e delecções entre as duas sequências tinham todas os mesmos pesos.B. Percentage of identity between A-aligned sequences determined over the length of the cdc2 + sequence; exchanges, insertions and deletions between the two sequences all had the same weights.

FIGURA 5. A utilização de sondas específicas para ERK1, ERK2 e ERK3 proporcionam evidência para a existência de genes adicionais ERK.FIGURE 5. The use of specific probes for ERK1, ERK2 and ERK3 provide evidence for the existence of additional ERK genes.

A. A especificidade de cada uma das sondas para ERK (descritas em Materiais e Métodos) foi demonstrada pelaA. The specificity of each of the probes for ERK (described in Materials and Methods) was demonstrated by the

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hibridação de três transferências de Southern em triplicado, cada uma das quais com plasmídeos linearizados contendo as inserções de ADNc de ERK1, ERK2 e ERK3 (como marcado para cada faixa), em que cada sonda ERK é indicada abaixo das transferências.hybridization of three Southern blots in triplicate, each with linearized plasmids containing the cDNA inserts of ERK1, ERK2 and ERK3 (as marked for each lane), where each ERK probe is indicated below the transfers.

B. Sondagem das transferência de Southern contendo o ADN genómico de ratazana e humano digeridos com EcoRI com cada uma das sondas específicas para ERK; as dimensões dos fragmentos de ADN estão indicadas em quilobases.B. Probing Southern transfers containing EcoRI-digested rat and human genomic DNA with each of the ERK-specific probes; the dimensions of the DNA fragments are indicated in kilobases.

C. Sondagem de transferência de Southern contendo ADN genómico de ratazana digerido com Bglll, BamHl e Hindlll com cada uma das sondas específicas para ERK; as dimensões dos fragmentos de ADN estão indicadas em quilobases.C. Southern transfer probe containing Bglll, BamHl and Hindlll digested rat genomic DNA with each of the ERK-specific probes; the dimensions of the DNA fragments are indicated in kilobases.

FIGURA 6. Regulação independente dos transcritos de ERK nos tecidos em desenvolvimento das astroglias cultivadas e da linha celular P19 de embriocarcinoma.FIGURE 6. Independent regulation of ERK transcripts in developing tissues of cultured astroglia and embryocarcinoma cell line P19.

A. Padrões distintos de expressão para cada um dos ERK no sistema nervoso do adulto, nos tecidos periféricos do adulto e na placenta. As sondas específicas para cada um dos ERK (ver Figura 3) foram hibridadas a transferências de Northern contendo 10 Mg de ARN dos tecidos e das regiões cerebrais de adulto indicadas. ADR, adrenal; RET, retina; SC.N., nervo ciático; S.C., espinal-medula; A.BR, cérebro de adulto; CBL, cerebelo; HBR, rombencéfalo MBR, mesencéfalo; DIEN, diencéfalo; STR, corpo estriado; HIP, hipocampo; CTX, neocortex; OLF, bolbo olfactivo; SKIN, pele; HTR, coração; MUS, músculo; LUNG, pulmão; INT, intestino; KID, rim; LIV, fígado; SPL, baço; THY, timo; PLAC, placenta.A. Different expression patterns for each ERK in the adult's nervous system, in the adult's peripheral tissues and in the placenta. The specific probes for each of the ERKs (see Figure 3) were hybridized to Northern blots containing 10 Mg RNA from the tissues and from the indicated adult brain regions. ADR, adrenal; RET, retina; SC.N., sciatic nerve; S.C., spinal cord; A.BR, adult brain; CBL, cerebellum; HBR, rombencephalon MBR, midbrain; DIEN, diencephalon; STR, striatum; HIP, hippocampus; CTX, neocortex; OLF, olfactory bulb; SKIN, skin; HTR, heart; MUS, muscle; LUNG, lung; INT, intestine; KID, kidney; LIV, liver; SPL, spleen; THY, thymus; PLAC, placenta.

B. Os transcritos de ERK são regulados durante o desenvolvimento no sistema nervoso e nos tecidos periféricos. Dez μg de ARN total, isolado dos estados de desenvolvimento indicados (E; dia embrionário; P: dia pós-natal; AD: adulto), de cérebro, espinal-medula, hipocampo (HIPP), fígado e coração de ratazana foram comparados quanto à hibridação com cada uma das sondasB. ERK transcripts are regulated during development in the nervous system and peripheral tissues. Ten μg of total RNA, isolated from the indicated states of development (E; embryonic day; P: postnatal day; AD: adult), from brain, spinal cord, hippocampus (HIPP), liver and rat heart were compared for hybridization with each of the probes

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específicas para ERK.specific to ERK.

C. Os transcritos de ERK2 e ERK3 expressos a baixos níveis nas astroglias cultivadas. Dez μg de ARN total do cérebro de ratazana adulta (BRN) ou das astroglias cultivadas (AST) foram sondadas com cada uma das sondas específicas para ERK, como indicado.C. ERK2 and ERK3 transcripts expressed at low levels in cultured astroglia. Ten μg of total RNA from the adult rat brain (BRN) or from cultured astroglia (AST) were probed with each of the ERK-specific probes, as indicated.

D. Regulação independente dos genes individuais de ERK durante a diferenciação das células P19 de embriocarcinoma. Dez μ9 de ARN total do cérebro de ratazana adulta ou de célula P19 não diferenciada (STEM), induzida por ácido retinóico (NEUR) ou por DMSO (MUSC), foram usadas para preparar réplicas de transferência de Northern, que foram sondados, como indicado. LANGFR representa uma sonda para o receptor NGF de baixa afinidade, a sonda de controlo GAPDH verifica que iguais quantidades de ARN foram aplicados em cada faixa.D. Independent regulation of individual ERK genes during differentiation of embryocarcinoma P19 cells. Ten μ9 total RNA from the adult rat brain or P19 non-differentiated cell (STEM), induced by retinoic acid (NEUR) or DMSO (MUSC), was used to prepare Northern transfer replicates, which were probed, as indicated . LANGFR represents a probe for the low affinity NGF receptor, the GAPDH control probe verifies that equal amounts of RNA were applied in each lane.

FIGURA 7. Expressão de ERK2 activa em E.coli.FIGURE 7. Expression of ERK2 active in E.coli.

A. Geles corados com prata de quantidades equivalentes de proteína de lisados de E. coli que expressam ERK2 ou apenas o vector. A seta indica ERK2 recombinante.A. Silver-stained gels of protein equivalent amounts of E. coli lysates expressing ERK2 or only the vector. The arrow indicates recombinant ERK2.

B. Imunotransferência com antissoro 837 da mesma quantidade de extractos de E. coli referidos na Figura A e cerca de 40 ng de ERK1 parcialmente purificada.B. Immunoblotting with 837 antiserum of the same amount of E. coli extracts as shown in Figure A and about 40 ng of partially purified ERK1.

C. Coloração com prata (esquerda) e autofosforilação (direita) de: 162, 270 e 540 ng de ERK2 recombinante purificada.C. Silver staining (left) and autophosphorylation (right) of: 162, 270 and 540 ng of purified recombinant ERK2.

D. Actividade da quinase de ERK2 recombinante purificada, incubada com MBP durante 0, 15, 30, 45 e 60 minutos.D. Purified recombinant ERK2 kinase activity, incubated with MBP for 0, 15, 30, 45 and 60 minutes.

FIGURA 8. Especificidade de anticorpos antipeptídicos.FIGURE 8. Specificity of antipeptide antibodies.

A. Coloração com azul de Coomassie de 100 μg de proteína solúvel de células PC12 e de cérebro de ratazana adulta.A. Coomassie blue staining of 100 μg of soluble protein from PC12 cells and adult rat brain.

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B. Imunotransferência de ERK1 parcialmente purificada, ERK2 recombinante e 100 ng de proteína solúvel de células PC12, 100 μg de proteína solúvel (s) e em partículas (p) derivadas de cérebro embrionário (EM BR) e de cérebro adulto (AD BR) (preparado como descrito em Boulton et al., 1991, Biochem. 30.: 278-286) com antissoro 956.B. Immunoblotting of partially purified ERK1, recombinant ERK2 and 100 ng soluble protein from PC12 cells, 100 μg soluble protein (s) and in particles (p) derived from embryonic brain (EM BR) and adult brain (AD BR) (prepared as described in Boulton et al., 1991, Biochem. 30 .: 278-286) with antiserum 956.

C. Réplica da transferência sondada com antissoro 837.C. Replica of the transfer probed with antiserum 837.

FIGURA 9. Imunoprecipitação de proteínas ERK marcadas com 32_P de células Rat 1 HIRc B estimuladas com insulina e células PC12 estimuladas com NGF.FIGURE 9. Immunoprecipitation of ERK proteins labeled with 32 _P of Rat 1 HIRc B cells stimulated with insulin and PC12 cells stimulated with NGF.

A. A ERK1 foi imunoprecipitada com antissoro 837 a partir de: células Rat 1 HIRc B marcadas com ³²P (esquerda), expostas (+) ou não expostas (-) à insulina, e células PC12 (direita), expostas (+) ou não expostas (-) ao NGF. Os traços indicam as massas moleculares padrões de: 116, 84, 58, 48,5, 36,5 e 26,6 kDa.A. ERK1 was immunoprecipitated with antiserum 837 from: Rat 1 HIRc B cells labeled with ³² P (left), exposed (+) or not exposed (-) to insulin, and PC12 cells (right), exposed (+) or not exposed (-) to NGF. The dashes indicate the standard molecular weights of: 116, 84, 58, 48.5, 36.5 and 26.6 kDa.

B. Como na Parte A, com e sem NGF mas com imunoprecipitação desnaturante.B. As in Part A, with and without NGF but with denaturing immunoprecipitation.

C. Análise de fosfoaminoácidos de ERK1 imunoprecipitada derivada de células PC12 tratadas com o NGF. As posições dos padrões dos fosfoaminoácidos estão representadas. Após 4 horas de marcação , a ERK1 foi apenas fosforilada na serina, na ausência de NGF.C. Analysis of immunoprecipitated ERK1 phosphoamino acids derived from PC12 cells treated with NGF. The positions of the phosphoamino acid patterns are represented. After 4 hours of labeling, ERK1 was only phosphorylated in the serine, in the absence of NGF.

FIGURA 10. Imunotransferência de proteínas ERK imunoprecipitadas. As ERK foram imunoprecipitadas a partir de 1 mg de proteína do sobrenadante de células Rat 1 HIRc B, tratadas (+) ou não tratadas (-) com insulina em condições desnaturantes, utilizando o antissoro 837. As proteínas imunoprecipitadas foram resolvidas por SDS-PAGE e sondadas com anticorpos contra a fosfotirosina (P-Y) ou com antissoro ERK 691. As faixas marcadas com ERK contêm uma alíquota de uma fracção de Phenyl-Sepharose contendo ERK1 e ERK2.FIGURE 10. Immunoblotting of immunoprecipitated ERK proteins. ERKs were immunoprecipitated from 1 mg of protein from Rat 1 HIRc B cell supernatant, treated (+) or untreated (-) with insulin under denaturing conditions, using antiserum 837. The immunoprecipitated proteins were resolved by SDS-PAGE and probed with antibodies against phosphotyrosine (PY) or with an antiserum ERK 691. The bands marked with ERK contain an aliquot of a fraction of Phenyl-Sepharose containing ERK1 and ERK2.

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FIGURA 11. Cromatografia em Mono-Q dos sobrenadantes de células PC12 tratadas e não tratadas com NGF. Submeteram-se a cromatografia 10 mg de proteína de sobrenadantes de células PC12 tratadas ou não-tratadas com NGF numa coluna Mono-Q. A actividade da quinase com MBP é mostrada no painel superior. As fracções numeradas foram precipitadas e imunotransferidas com o anticorpo indicado: 956, 837 ou antifosfotirosina (aP-Y).FIGURE 11. Mono-Q chromatography of the supernatants of PC12 cells treated and not treated with NGF. Chromatography 10 mg protein from supernatants from PC12 cells treated or untreated with NGF on a Mono-Q column was chromatographed. The kinase activity with MBP is shown in the top panel. The numbered fractions were precipitated and immunotransferred with the indicated antibody: 956, 837 or antiphosphotyrosine (aP-Y).

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO5. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Com o propósito de clarificar, e não para limitar, a descrição detalhada do invento será dividida nas seguintes subsecções:In order to clarify, and not to limit, the detailed description of the invention will be divided into the following subsections:

(i) clonagem da proteína MAP2-quinase;(i) cloning the MAP2 kinase protein;

(ii) identificação de membros adicionais da família das proteínas MAP2-quinase;(ii) identification of additional members of the MAP2 kinase protein family;

(iii) expressão da proteína MAP2-quinase recombinante;(iii) expression of the recombinant MAP2 protein kinase;

(iv) produção de anticorpos anti-MAP2-quinase;(iv) production of anti-MAP2 kinase antibodies;

(v) bioensaios para activação da MAP2-quinase; e (vi) utilidade do invento.(v) bioassays for activation of MAP2 kinase; and (vi) utility of the invention.

5.1. CLONAGEM DA PROTEÍNA MAP2-QUINASE5.1. MAP2-KINASE PROTEIN CLONING

De acordo com o presente invento, a proteína MAP2-quinase pode ser clonada identificando os ácidos nucleicos clonados que contêm sequências homólogas à sequência da MAP2-quinase conhecida, por exemplo, mas não limitada, às sequências apresentadas nas figuras 2 B (SEQ ID N² . 1 ), 3 A (SEQ ID N² 3) e 3B (SEQ ID N². 5), e/ou às sequências contidas nos plasmídeos pBS-rERKl, pBS-rERK2 ou pBS-rERK3, depositadas na ATCC e com os números de acesso 40808, 40809 e , respectivamente. Alternativamente, pode ser desejável a obtenção da informação da sequência através da proteína MAP2-quinase purificada.In accordance with the present invention, the MAP2 kinase protein can be cloned by identifying the cloned nucleic acids that contain sequences homologous to the known MAP2 kinase sequence, for example, but not limited to, the sequences shown in figures 2 B (SEQ ID N ^2.1 ), 3 A (SEQ ID NO ² 3) and 3B (SEQ ID NO ^2. 5), and / or to the sequences contained in plasmids pBS-rERK1, pBS-rERK2 or pBS-rERK3, deposited with the ATCC and with access numbers 40808, 40809 and, respectively. Alternatively, it may be desirable to obtain the sequence information through the purified MAP2 kinase protein.

A MAP2-quinase purificada pode ser obtida a partir de tecidos que contenham actividade de MAP2-quinase incluindo, mas não limitado a, linfócitos T, adipócitos 3T3-L1 terminalmente diferenciados tratados com insulina, células adrenais cromofínicas pós-mitóticas induzidas a secretar catecolaminas,Purified MAP2 kinase can be obtained from tissues containing MAP2 kinase activity including, but not limited to, terminally differentiated T lymphocytes, insulin-treated 3T3-L1 adipocytes, post-mitotic chromophinic adrenal cells induced to secrete catecholamines,

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células PC12 tratadas com o factor de crescimento do nervo, tecido cerebral ou células Rat 1 HIRc B, tratadas com insulina, assim como eucariotas inferiores tal como a estrela-do-mar e oócitos de Xenopus laevis. A purificação de MAP2-quinase a partir de células PCI2 parece ser idêntica à purificação de MAP2-quinase a partir de células Rat 1 HIRc B tratadas com insulina (FIGURA 2A).PC12 cells treated with nerve growth factor, brain tissue, or Rat 1 HIRc B cells, treated with insulin, as well as lower eukaryotes such as the starfish and Xenopus laevis oocytes. Purification of MAP2 kinase from PCI2 cells appears to be identical to purification of MAP2 kinase from Rat 1 HIRc B cells treated with insulin (FIGURE 2A).

Numa concretização específica do invento, e não como limitação, a MAP2-quinase pode ser purificada em larga extensão como se segue (Boulton et al., 1991, Biochem. 30.:278-286). As células contendo MAP2-quinase podem ser usadas para preparar um extracto isento de células que compreende uma preparação bruta de MAP2-quinase. Por exemplo, células PC12 podem ser cultivadas em meio DME contendo 10% de soro fetal bovino e 5% de soro de cavalo, e antecedendo o tratamento com NGF, podem ser incubadas em meio sem soro durante cerca de uma hora. Pode ser adicionado NGF a uma concentração de cerca de 4 nM, e as células podem ser incubadas durante 5 min. Alternativamente, podem ser usadas células Rat 1 HIRc B tratadas com insulina. 0 meio pode ser removido e as células lavadas e raspadas para uma solução gelada de homogeneização, que contém p-nitrofenilfosfato 20mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) EGTA lmM, fluoreto de sódio 50mM , ortovanadato de sódio 50 μΜ e benzamidina 5mM (MAP2-quinase). Igual número de placas de células não-tratadas devem ser preferencialmente colhidas para controlos. Todos os passos seguintes são efectuados de preferência a 4°C. As células podem ser rebentadas com 30-50 impulsos de um homogeneizador Dounce e centrifugadas a 4 OOOxg, durante 5 minutos. Os sobrenadantes podem então ser centrifugados a 97 OOOxg, durante 60 minutos. Os sobrenadantes resultantes podem ser ensaiados, de preferência, imediatamente e depois congelados em azoto líquido.In a specific embodiment of the invention, and not as a limitation, MAP2 kinase can be purified to a large extent as follows (Boulton et al., 1991, Biochem. 30.:278-286). MAP2 kinase-containing cells can be used to prepare a cell-free extract that comprises a crude MAP2 kinase preparation. For example, PC12 cells can be cultured in DME medium containing 10% fetal bovine serum and 5% horse serum, and prior to treatment with NGF, they can be incubated in serum-free medium for about an hour. NGF can be added at a concentration of about 4 nM, and the cells can be incubated for 5 min. Alternatively, insulin-treated Rat 1 HIRc B cells can be used. The medium can be removed and the cells washed and scraped into a cold homogenization solution, containing 20mM p-nitrophenylphosphate, 20mM Tris-HCl (pH 7.5) 1mM EGTA, 50mM sodium fluoride, 50 μ sodium orthovanadate and 5mM benzamidine (MAP2 kinase). An equal number of plates of untreated cells should preferably be harvested for controls. All of the following steps are preferably carried out at 4 ° C. The cells can be blown up with 30-50 pulses from a Dounce homogenizer and centrifuged at 4 OOOxg for 5 minutes. The supernatants can then be centrifuged at 97,000xg for 60 minutes. The resulting supernatants can be tested, preferably immediately, and then frozen in liquid nitrogen.

Com vista à purificação da MAP2-quinase, fracções solúveis (225-300 ml) resultantes da combinação de 150-200 placas de 150 cm³, de células Rat 1 HIRc Bell tratadas com insulina, podem ser ajustadas de forma a obter uma condutividade de 3,5 mS (com água) e concentrações de 40 μΜ de AMPc, fluoreto de fenilmetilsulfoniloFor the purification of MAP2 kinase, soluble fractions (225-300 ml) resulting from the combination of 150-200 plates of 150 cm ³ , of insulin-treated Rat 1 HIRc Bell cells, can be adjusted to obtain a conductivity of 3.5 mS (with water) and concentrations of 40 μΜ cAMP, phenylmethylsulfonyl fluoride

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0,5 mM e pepstatina Ο,ΙμΜ , antes de se efectuar a cromatografia numa coluna de Q-Sepharose (1,5 x 19 cm). A coluna pode ser lavada com 4 a 5 volumes de tampão A (glicerol a 10%, Tris.HCl 25mM, pH 7,5, ortovanadato de sódio 50μΜ, ditiotreitol 1 mM , NaF 50 mM, p-glicerolfosfato 20 mM, EGTA lmM, benzamidina 10 mM, fosfato de p-nitrofenil 10 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 0,5 mM e pepstatina Ο,ΙμΜ), contendo AMPc 40μΜ. A proteína pode então ser eluída por um gradiente de NaCl (0-0,4 M) em tampão A. As fracções contendo actividade de MAP2-quinase estimulada podem ser combinadas e aplicadas a uma coluna de Phenyl-Sepharose (1,5 x 18 cm). A coluna pode ser lavada com 5 volumes de coluna de tampão A contendo NaCl 0,25M e a proteína pode ser eluída com um gradiente decrescente de NaCl 0,25 - 0,025 M seguido de um gradiente crescente de 0 - 65% de etilenoglicol em tampão A sem glicerol. A actividade da quinase pode ser recuperada da coluna de Phenyl-Sepharose e aplicada directamente a uma coluna de 5 ml (1,5 x 3 cm) de S-Sepharose, seguida de uma coluna de 5 ml (1,5 x 3 cm) de fosfocelulose. Em ambos os casos, o material não adsorvido, contendo actividade de MAP2-quinase, e 2 volumes de lavagem da coluna foram recolhidos. As fracções contendo actividade de MAP2-quinase derivadas da coluna de fosfocelulose, podem ser directamente aplicadas a uma coluna de QAE-Sepharose (1 x 24 cm). A coluna pode ser lavada com 5 volumes de tampão A e a proteína eluída com um gradiente de NaCl 0 - 0,4 M em tampão A. As fracções contendo actividade MAP2-quinase podem ser combinadas, Brij-58 pode ser adicionado até uma concentração final de 0,01% (incluído em todos os passos subsequentes), e a amostra pode ser concentrada por ultrafiltração até 1,5 - 2 ml, de forma a poder ser aplicada a uma coluna Ultrogel AcA54 (1 x 112 cm), equilibrada com tampão A contendo NaCl 0,2M e 0,01% de Brij-58. As fracções da coluna de filtração em gel podem ser recolhidas em tubos contendo leupeptina 2,4mM . As fracções contendo actividade podem ser concentradas e diluídas com Tris 25 mM (pH 7,5), DTT 1 mM, fosfato de sódio 10 mM , pepstatina 0,1 μΜ, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 0,5 mM e contendo 0,01% de Brij-58 até a condutividade ser reduzida a 3 mS, e em seguida podem ser aplicadas a uma coluna de DEAE-Celulose (0,7 x 18 cm). A actividade pode ser eluída com um gradiente NaCl de 0 - 0,25 M0.5 mM and st, ΙμΜ pepstatin, before chromatography on a Q-Sepharose column (1.5 x 19 cm). The column can be washed with 4 to 5 volumes of buffer A (10% glycerol, 25mM Tris.HCl, pH 7.5, 50μΜ sodium orthovanadate, 1mM dithiothreitol, 50mM NaF, 20mM p-glycerolphosphate, lmM EGTA , 10 mM benzamidine, 10 mM p-nitrophenyl phosphate, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and pepstatin (Ο, ΙμΜ), containing 40μΜ cAMP. The protein can then be eluted by a gradient of NaCl (0-0.4 M) in buffer A. Fractions containing stimulated MAP2-kinase activity can be combined and applied to a Phenyl-Sepharose column (1.5 x 18 cm). The column can be washed with 5 column volumes of buffer A containing 0.25 M NaCl and the protein can be eluted with a decreasing gradient of 0.25 - 0.025 M NaCl followed by an increasing gradient of 0 - 65% ethylene glycol in buffer A without glycerol. Kinase activity can be recovered from the Phenyl-Sepharose column and applied directly to a 5 ml (1.5 x 3 cm) column of S-Sepharose, followed by a 5 ml (1.5 x 3 cm) column phosphocellulose. In both cases, the non-adsorbed material, containing MAP2 kinase activity, and 2 column wash volumes were collected. Fractions containing MAP2-kinase activity derived from the phosphocellulose column, can be directly applied to a QAE-Sepharose column (1 x 24 cm). The column can be washed with 5 volumes of buffer A and the protein eluted with a 0 - 0.4 M NaCl gradient in buffer A. Fractions containing MAP2-kinase activity can be combined, Brij-58 can be added to a concentration 0.01% final (included in all subsequent steps), and the sample can be concentrated by ultrafiltration to 1.5 - 2 ml, so that it can be applied to a balanced Ultrogel AcA54 column (1 x 112 cm) with buffer A containing 0.2M NaCl and 0.01% Brij-58. Fractions of the gel filtration column can be collected in tubes containing 2.4mM leupeptin. The fractions containing activity can be concentrated and diluted with 25 mM Tris (pH 7.5), 1 mM DTT, 10 mM sodium phosphate, 0.1 μ pep pepstatin, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and containing 0.01% Brij-58 until the conductivity is reduced to 3 mS, and then they can be applied to a DEAE-Cellulose column (0.7 x 18 cm). Activity can be eluted with a 0 - 0.25 M NaCl gradient

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em tampão A. As fracções que contenham actividade podem ser combinadas e, se necessário, concentradas e diluídas como descrito acima, de forma a aplicar a amostra a uma coluna Mono-Q HR 5/5 ou Q-Sepharose (0,5 x 9 cm). A actividade da MAP2-quinase pode ser eluída com um gradiente de NaCl 0 - 0,25 M (de Mono-Q) em tampão A. As fracções podem ser ensaiadas e imediatamente congeladas em azoto liquido.in buffer A. Fractions containing activity can be combined and, if necessary, concentrated and diluted as described above, in order to apply the sample to a Mono-Q HR 5/5 or Q-Sepharose column (0.5 x 9 cm). MAP2 kinase activity can be eluted with a 0 - 0.25 M NaCl gradient (from Mono-Q) in buffer A. Fractions can be tested and immediately frozen in liquid nitrogen.

A MAP2-quinase purificada pode então ser digerida com tripsina e os peptidos resultantes submetidos a HPLC (Abersold et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84.:6970-6974), como descrito na secção 6.1.infra. Os péptidos de um dos picos resultantes podem ser submetidos a uma segunda separação cromatografica. Com vista à determinação com precisão de fragmentos da sequência proteica de MAP2-quinase, pode ser necessário efectuar repetidas purificações de péptidos e discriminar entre componentes peptídicos principais e menores, tal como será certamente reconhecido pelos peritos na arte.The purified MAP2 kinase can then be digested with trypsin and the resulting peptides subjected to HPLC (Abersold et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84.:6970-6974), as described in section 6.1. infra. The peptides from one of the resulting peaks can be subjected to a second chromatographic separation. In order to accurately determine fragments of the MAP2 kinase protein sequence, it may be necessary to carry out repeated purifications of peptides and discriminate between major and minor peptide components, as will be recognized by those skilled in the art.

Os péptidos podem ser sequenciados por qualquer método conhecido na arte. Por exemplo, as fracções contendo a enzima podem ser combinadas e pode adicionar-se Lubrol e ácido tricloroacético para uma concentração final de 0,05% e 8,5% (p/v), respectivamente, para precipitar a proteína. Após lavagem com acetona, a proteína pode ser dissolvida em tampão de electroforese e 250 pmol podem ser aplicados a um gel de poliacrilamida a 10% em SDS. A proteína pode ser transferida electroforeticamente para nitrocelulose (Schleicher and Schuell, Keene, NH). A banda de 43 kDa pode ser excisada para digestão in situ com tripsina (Abersold et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84^6970-6974). deixando o componente menor, que migra apenas um pouco mais rapidamente na nitrocelulose. Os péptidos libertados pelo pedaço de nitrocelulose excisado, podem ser submetidos a HPLC num sistema cromatográfico Modelo 130A (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) equipado com uma coluna Applied Biosystems RP-300 (2,1 x 100 mm). As separações podem ser efectuadas a um caudal de ácido trifluoroacético a 0,1% de 50 μΐ/min, utilizando um gradiente de acetonitrilo 0 - 70% (v/v) comThe peptides can be sequenced by any method known in the art. For example, fractions containing the enzyme can be combined and Lubrol and trichloroacetic acid can be added to a final concentration of 0.05% and 8.5% (w / v), respectively, to precipitate the protein. After washing with acetone, the protein can be dissolved in electrophoresis buffer and 250 pmol can be applied to a 10% polyacrylamide gel in SDS. The protein can be transferred electrophoretically to nitrocellulose (Schleicher and Schuell, Keene, NH). The 43 kDa band can be excised for in situ digestion with trypsin (Abersold et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 ^ 6970-6974). leaving the smaller component, which migrates just a little faster in the nitrocellulose. The peptides released by the excised nitrocellulose piece can be subjected to HPLC on a Model 130A chromatographic system (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) equipped with an Applied Biosystems RP-300 column (2.1 x 100 mm). Separations can be carried out at a flow rate of 0.1% trifluoroacetic acid of 50 μΐ / min, using a gradient of 0 - 70% (v / v) acetonitrile with

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-17100 minutos de duração. A absorvância do eluído, pode ser monitorizada a 214 nm e os componentes que eluiram devem ser recolhidos manualmente. Os péptidos podem ser secos em discos de 1 cm de papel Whatman GF/C e sequenciados usando um sequenciador de aminoácidos Applied Biosystems, Inc., Modelo 470A, equipado com analisador de feniltio-hidantoína Modelo 120A, de acordo com as especificações do fabricante.-17100 minutes in duration. The absorbance of the eluate can be monitored at 214 nm and the components that elute must be collected manually. The peptides can be dried on 1 cm discs of Whatman GF / C paper and sequenced using an Applied Biosystems, Inc., Model 470A amino acid sequencer, equipped with a Model 120A phenylthiohydantoin analyzer, according to the manufacturer's specifications.

A purificação de quantidades adequadas de proteína MAP2-quinase que permitem a microsequenciação torna possível a clonagem de um ADNc de MAP2-quinase. A estratégia para este tipo de clonagem, pode ser a produção de uma sonda oligonucleotídica complementar baseada num segmento com sequência de aminoácidos conhecida, e utilização dessa sonda para selecção de bibliotecas de ADNc com origem em tecidos que se supõem sintetizar ARNm que codifica MAP2-quinase, como se descreve a seguir. Em primeiro lugar, a sequência de aminoácidos derivada da proteína MAP2-quinase purificada, pode ser usada para deduzir os oligonucleótidos iniciadores (primer) que podem ser gerados e usados em técnicas usuais de selecção ou de reacções em cadeia de polimerase (PCR) (Saiki et al., 1985, Science, 230:1350-1354). Devido à degeneração do código genético, em que vários tripletos podem especificar o mesmo aminoácido, devem ser sintetizados vários oligonucleótidos para uma determinada sequência de aminoácidos, de modo a proporcionar várias potenciais combinações de sequências de nucleótidos; os oligonucleótidos resultantes são denominados iniciadores degenerados. Por exemplo, numa concretização específica do invento, pode ser sintetizada uma série de oligonucleótidos degenerados, que corresponde às cadeias codificadoras ou anti-codificadoras, para segmentos de sequências de péptidos trípticos obtidos a partir da proteína MAP2-quinase purificada. Os oligonucleótidos podem conter, preferencialmente, caudas não degeneradas nas suas extremidades 5'; cauda de cada cadeia oligonucleotídica codificadora pode conter, por exemplo, um local de restrição EcoRI, enquanto que a cauda de cada cadeia oligonucleotídica anti-codificadora pode conter, por exemplo, tua local de restrição Sall. Cada cadeia oligonucleotídica codificadora pode ser combinada com cada oligonucleótidoPurification of adequate amounts of MAP2 kinase protein that allows for microsequencing makes it possible to clone a MAP2 kinase cDNA. The strategy for this type of cloning may be to produce a complementary oligonucleotide probe based on a segment with a known amino acid sequence, and use that probe to select cDNA libraries from tissues that are supposed to synthesize mRNA encoding MAP2 kinase , as described below. Firstly, the amino acid sequence derived from the purified MAP2 kinase protein, can be used to deduce the primers that can be generated and used in the usual selection or polymerase chain reaction (PCR) techniques (Saiki et al., 1985, Science, 230: 1350-1354). Due to the degeneration of the genetic code, in which several triplets can specify the same amino acid, several oligonucleotides must be synthesized for a given amino acid sequence, in order to provide several potential combinations of nucleotide sequences; the resulting oligonucleotides are called degenerate primers. For example, in a specific embodiment of the invention, a series of degenerate oligonucleotides, corresponding to the coding or anti-coding chains, can be synthesized for segments of triptych peptide sequences obtained from the purified MAP2 kinase protein. Oligonucleotides may preferably contain non-degenerate tails at their 5 'ends; the tail of each coding oligonucleotide chain can contain, for example, an EcoRI restriction site, while the tail of each anti-coding oligonucleotide chain can contain, for example, your SalI restriction site. Each coding oligonucleotide chain can be combined with each oligonucleotide

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anti-codificador em reacções individuais de PCR, utilizando o ADNc derivado de células Rat 1 como molde; as reacções de PCR e a preparação dos moldes genómicos e de ADNc podem ser efectuadas como descrito em Maisonpierre, C. et al., 1990, Science 247:1446-1451 e Bothwell, A., Yancopoulos, G e Alt, F. , 1990, Methods for Cloning Analysis of Eukaryotic Genes, Jones e Bartlett, Boston, MA. O produto amplificado obtido utilizando, por exemplo, o oligonucleótido codificador QYIGEG e o oligonucleótido anti-codificador DLKPSN (designado por QYDL) pode então ser isolado numa coluna giratória Sephadex G-50, digerido com EcoRI e Sall, purificado por gel usando Nusieve a 2% (FMC Bioproducts) e subclonado num vector que contenha os locais de restrição adequados, como por exemplo o vector pGEM4Z (Promega).anti-encoder in individual PCR reactions, using cDNA derived from Rat 1 cells as a template; PCR reactions and preparation of genomic and cDNA templates can be performed as described in Maisonpierre, C. et al., 1990, Science 247: 1446-1451 and Bothwell, A., Yancopoulos, G and Alt, F., 1990, Methods for Cloning Analysis of Eukaryotic Genes, Jones and Bartlett, Boston, MA. The amplified product obtained using, for example, the QYIGEG coding oligonucleotide and the DLKPSN anti-coding oligonucleotide (called QYDL) can then be isolated on a rotating Sephadex G-50 column, digested with EcoRI and Sall, gel purified using Nusieve a 2 % (FMC Bioproducts) and subcloned into a vector that contains the appropriate restriction sites, such as the vector pGEM4Z (Promega).

Uma biblioteca de genes adequada, que provavelmente contenha um gene de MAP2-quinase, pode então ser pesquisada com sondas de ácido nucleico marcado (por exemplo, produto de PCR subclonado, marcado radioactivamente segundo um protocolo baseado na técnica de PCR (Maisonpierre et al., 1990, Science 247:1446-1451)). Exemplos de bibliotecas adequadas incluirão uma biblioteca de ADNc de cérebro de ratazana ou de linfócitos T, ou uma biblioteca de ADNc produzida a partir de células PC12 ou de células adrenais cromofínicas pós-mitóticas, para nomear apenas alguns. As condições de hibridação podem ser as descritas por Maisonpierre et al. (1990, Science 247:1446-1451). ou quaisquer técnicas usuais; a lavagem dos filtros pode ser preferencialmente efectuada, de início com baixo rigor (2 x SSC ( citrato de sódio 20 mM, pH 7,0, NaCl 0,15 Μ), SDS a 0,1% a 60°C) e posteriormente com elevado rigor (0,2 x SSC, SDS a 0,1% a 60°C).A suitable gene library, which probably contains a MAP2 kinase gene, can then be screened with labeled nucleic acid probes (for example, subcloned PCR product, radiolabelled according to a protocol based on the PCR technique (Maisonpierre et al. , 1990, Science 247: 1446-1451)). Examples of suitable libraries will include a rat brain or T lymphocyte cDNA library, or a cDNA library produced from PC12 cells or post-mitotic adrenal chromophinic cells, to name just a few. Hybridization conditions can be those described by Maisonpierre et al. (1990, Science 247: 1446-1451). or any usual techniques; the washing of the filters can preferably be carried out, initially with low rigor (2 x SSC (20 mM sodium citrate, pH 7.0, NaCl 0.15 Μ), 0.1% SDS at 60 ° C) and later with high accuracy (0.2 x SSC, 0.1% SDS at 60 ° C).

Uma vez obtido, um gene de MAP2-quinase pode ser clonado ou subclonado utilizando qualquer dos métodos conhecidos na arte. Pode usar-se um largo número de sistemas vector-hospedeiros conhecidos na arte. Entre os vectores possíveis, embora não se limitem a estes, incluem-se plasmídeos, cosmídeos ou vírus modificados, mas o vector deve ser compatível com a célula hospedeira usada. Estes vectores incluem, sem se limitar a estes, bacteriófagos como os derivados lambda ou plasmídeos como oOnce obtained, a MAP2 kinase gene can be cloned or subcloned using any of the methods known in the art. A large number of vector host systems known in the art can be used. Possible vectors, although not limited to these, include plasmids, cosmids or modified viruses, but the vector must be compatible with the host cell used. These vectors include, but are not limited to, bacteriophages such as lambda derivatives or plasmids such as

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6526-049-118 pBR322, pUC ou derivados6526-049-118 pBR322, pUC or derivatives

moléculas recombinantes podem ser introduzidas nas células hospedeiras via transformação, transfecção, infecção, electroporação, etc..recombinant molecules can be introduced into host cells via transformation, transfection, infection, electroporation, etc.

O gene da MAP2-quinase pode ser inserido num vector de clonagem, que pode ser utilizado para transformar, transfectar ou infectar células hospedeiras apropriadas para que se possa obter várias cópias das sequências dos genes clonados. Isto pode ser conseguido por ligação do fragmento de ADN num vector de clonagem que tenha terminais coesivos complementares. No entanto, se os locais de restrição complementares usados para fragmentar o ADN não estão presentes no vector de clonagem, as extremidades das moléculas de ADN podem ser modificadas enzimaticamente. Pode ser vantajosa a incorporação de locais de restrição para clivagem por endonucleases, nos oligonucleótidos iniciadores usados na reacção em cadeia de polímerase, de forma a facilitar a sua inserção nos vectores. Alternativamente, qualquer local de restrição desejado pode ser produzido por ligação de sequências nucleotídicas (ligadores) nas extremidades do ADN; estes ligadores podem compreender oligonucleótidos específicos sintetizados quimicamente que codificam sequências de reconhecimento de enzimas de restrição. Num método alternativo, o vector clivado e o gene da MAP2-quinase podem ser modificados por formação de caudas homopoliméricas.The MAP2 kinase gene can be inserted into a cloning vector, which can be used to transform, transfect or infect appropriate host cells so that multiple copies of the cloned gene sequences can be obtained. This can be accomplished by ligating the DNA fragment into a cloning vector that has complementary cohesive termini. However, if the complementary restriction sites used to fragment the DNA are not present in the cloning vector, the ends of the DNA molecules can be modified enzymatically. It may be advantageous to incorporate restriction sites for cleavage by endonucleases, in the oligonucleotide primers used in the polymerase chain reaction, in order to facilitate their insertion into the vectors. Alternatively, any desired restriction site can be produced by ligating nucleotide sequences (linkers) at the ends of the DNA; these linkers can comprise specific chemically synthesized oligonucleotides that encode restriction enzyme recognition sequences. In an alternative method, the cleaved vector and the MAP2 kinase gene can be modified by forming homopolymeric tails.

Em concretizações específicas, a transformação de células hospedeiras com moléculas de ADN recombinante que incorporaram um gene isolado de MAP2-quinase, ADNc ou uma sequência de ADN sintetizada, permite a produção de múltiplas cópias do gene. Assim o gene pode ser obtido em grandes quantidades pela cultura dos transformantes, isolando moléculas de ADN recombinante a partir dos transformantes e, quando necessário, recuperando o gene inserido a partir do ADN recombinante isolado.In specific embodiments, the transformation of host cells with recombinant DNA molecules that have incorporated an isolated MAP2 kinase gene, cDNA or a synthesized DNA sequence, allows the production of multiple copies of the gene. Thus the gene can be obtained in large quantities by culturing the transformants, isolating recombinant DNA molecules from the transformants and, when necessary, recovering the inserted gene from the isolated recombinant DNA.

De acordo com uma concretização preferida do invento, uma vez conseguido um clone derivado de ADNc que codifica a MAP2-quinase, um clone genómico que codifica a MAP2-quinase podeAccording to a preferred embodiment of the invention, once a cDNA-derived clone encoding MAP2 kinase has been achieved, a genomic clone encoding MAP2 kinase can

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ser isolado pelas técnicas usuais conhecidas na arte. Por exemplo, uma sonda de ácido nucleico marcada pode ser derivada do clone de MAP2-quinase e ser usada para pesquisar bibliotecas de ADN genómico por hibridação de ácidos nucleicos, utilizando, por exemplo, o método estabelecido por Benton e Davis (1977, Science 196:180) para bibliotecas de bacteriófagos e o método de Grunstein e Hogness (1975, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72: 3961-3965) para bibliotecas de plasmídeos. os clones recuperados podem então ser analisados por técnicas de mapeamento dos fragmentos de restrição e de sequenciação, de acordo com os métodos bem conhecidos na arte.be isolated by the usual techniques known in the art. For example, a labeled nucleic acid probe can be derived from the MAP2 kinase clone and used to search libraries of genomic DNA by nucleic acid hybridization, using, for example, the method established by Benton and Davis (1977, Science 196 : 180) for bacteriophage libraries and the method of Grunstein and Hogness (1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961-3965) for plasmid libraries. the recovered clones can then be analyzed by restriction fragment mapping and sequencing techniques, according to methods well known in the art.

Além disso, clones adicionais de ADNc podem ser identificados a partir de uma biblioteca de ADNc utilizando as sequências obtidas de acordo com o invento.In addition, additional cDNA clones can be identified from a cDNA library using the sequences obtained according to the invention.

5.2. IDENTIFICAÇÃO DE MEMBROS ADICIONAIS DA FAMÍLIA5.2. IDENTIFICATION OF ADDITIONAL FAMILY MEMBERS

DAS PROTEÍNA MAP2-QUINASES presente invento proporciona moléculas de ácido nucleico recombinante, correspondentes a ácidos nucleicos de mamíferos, que são homólogas às sequências de ácidos nucleicos apresentadas nas figuras 2B (SEQ ID N². 1), 3A (SEQ ID N“. 3) e 3B (SEQ ID N^Q. 5) ou a porções delas com pelo menos 10 nucleótidos.OF PROTEIN MAP2 kinases present invention provides recombinant nucleic acid molecules corresponding to nucleic mammalian acids which are homologous to the nucleic acid sequences shown in Figures 2B (SEQ ID NO : ^2. 1), 3A (SEQ ID NO. "3 ) and 3B (SEQ ID N ^Q. 5) or portions thereof with at least 10 nucleotides.

De acordo com o presente invento, pela pesquisa de uma biblioteca de ADN (compreendendo ADN genómico ou, de preferência, ADNc) com oligonucleótidos correspondentes à sequência da MAP2-quinase, derivada de dados da sequência proteica ou das sequências de ácidos nucleicos apresentadas nas figuras 2B (SEQ ID N². 1), 3A (SEQ ID N² . 3) e 3B (SEQ ID N². 5), podem ser identificados clones que codificam diferentes membros da família MAP2-quinase, como exemplificado na Secção 7, em que membros adicionais da família MAP2-quinase foram identificados. Decrescendo o rigor da hibridação, a probabilidade de identificar membros algo divergentes desta família pode aumentar. Pode ser aconselhável utilizar sequências substancialmente partilhadas por membros da família MAP2-quinase, que preferencialmente tenham já sido sequenciados, por exemplo as sequências dos domínios V e VI?According to the present invention, by searching for a DNA library (comprising genomic DNA or, preferably, cDNA) with oligonucleotides corresponding to the MAP2 kinase sequence, derived from protein sequence or nucleic acid sequences shown in the figures 2B (SEQ ID NO ^2. 1), 3A (SEQ ID NO ^2. 3) and 3B (SEQ ID NO ^2. 5), clones that encode different members of the MAP2 kinase family can be identified, as exemplified in Section 7, where additional members of the MAP2-kinase family have been identified. By decreasing the stringency of hybridization, the likelihood of identifying somewhat divergent members of this family may increase. Can it be advisable to use sequences substantially shared by members of the MAP2-kinase family, which have preferably already been sequenced, for example the sequences of domains V and VI?

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estas regiões tão conservadas podem ser particularmente úteis na identificação de membros adicionais da família MAP2-quinase. A pesquisa da biblioteca pode ser efectuada utilizando, por exemplo, a técnica de hibridação de Benton e Davies (1977, Science 196-180) ou a de Grunstein e Hogness (1975, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72.:3961-3965). Os clones identificados por hibridação podem ser novamente analisados e uma nova família de membros pode ser identificada por técnicas de mapeamento de fragmentos de restrição e de sequenciação, de acordo com os métodos bem conhecidos na arte.these highly conserved regions can be particularly useful in identifying additional members of the MAP2 kinase family. The library search can be performed using, for example, the hybridization technique of Benton and Davies (1977, Science 196-180) or that of Grunstein and Hogness (1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72.:3961 -3965). Clones identified by hybridization can be analyzed again and a new family of members can be identified by restriction fragment sequencing and sequencing techniques, according to methods well known in the art.

Pode ser desejável utilizar a tecnologia da reacção em cadeia de polimerase (Saiki et al., 1985 , Science 230 : :1350-1354) para identificar membros adicionais da família de proteínas MAP2-quinase. Por exemplo, iniciadores com sentido (sense) e anti-sentido (antisense”), correspondentes a uma sequência de uma proteína MAP2-quinase conhecida (que pareça, de preferência, ser conservada entre os membros da família de proteína MAP2-quinases já caracterizados) podem ser utilizados em PCR com o ADNc obtido de células que produzam MAP2-quinase como molde. Pode ser desejável conceber estes iniciadores de tal forma que incluam locais de clivagem por enzimas de restrição que possam facilitar a inserção de produtos de PCR em vectores de clonagem apropriados. Os produtos de PCR podem ser inseridos em vectores adequados, como referido na secção 5.1., supra, e os clones resultantes podem então ser pesquisados quanto a novos membros da família. Esta pesquisa pode ser efectuada por técnicas usuais, incluindo a análise por hibridação usando sondas correspondentes à sequência da MAP2-quinase conhecida. Por exemplo, uma série de sondas que representem diferentes regiões duma proteína MAP2-quinase já caracterizada, podem ser hibridadas com baixo rigor, a filtros duplicados contendo ADN dos clones gerados por PCR, como mencionado anteríormente. Pode observar-se que vários clones podem hibridar com algumas sondas e outros não. Novos membros da família podem, também, ser identificados com o aumento do rigor nas condições de hibridação, em que novos membros não idênticos às sondas derivadas dos membros conhecidos (ex: ERKl, ERK2 ou ERK3), hibridariam menos fortemente a elevado rigor.It may be desirable to use polymerase chain reaction technology (Saiki et al., 1985, Science 230:: 1350-1354) to identify additional members of the MAP2 kinase protein family. For example, primers with sense (sense) and antisense (antisense ”), corresponding to a sequence of a known MAP2 protein kinase (which preferably appears to be conserved among members of the MAP2 protein kinase family already characterized ) can be used in PCR with cDNA obtained from cells that produce MAP2 kinase as a template. It may be desirable to design these primers in such a way that they include restriction enzyme cleavage sites that can facilitate the insertion of PCR products into appropriate cloning vectors. PCR products can be inserted into suitable vectors, as noted in section 5.1., Above, and the resulting clones can then be screened for new members of the family. This screening can be performed by usual techniques, including hybridization analysis using probes corresponding to the known MAP2-kinase sequence. For example, a series of probes that represent different regions of a MAP2 kinase protein already characterized, can be hybridized with low rigor, to duplicate filters containing DNA from the clones generated by PCR, as mentioned above. It can be seen that several clones can hybridize with some probes and others cannot. New members of the family can also be identified with increased stringency in hybridization conditions, in which new members not identical to probes derived from known members (ex: ERKl, ERK2 or ERK3), would hybridize less strongly to high stringency.

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Alternativamente, novos membros da família podem ser identificados por mapeamento de restrição ou análise de sequenciação utilizando as técnicas usuais para revelar diferenças nos mapas de restrição ou nas sequências em relação a membros da família conhecidos.Alternatively, new members of the family can be identified by restriction mapping or sequencing analysis using the usual techniques to reveal differences in the restriction maps or sequences in relation to known family members.

5.3. EXPRESSÃO DA PROTEÍNA MAP2-0UINASE RECOMBINANTE presente invento proporciona moléculas recombinantes de proteína MAP2-quinase, que compreendem substancialmente as sequências de aminoácidos apresentadas nas figuras 2B (SEQ ID N². 2), 3A (SEQ ID N². 4) e 3B (SEQ ID N^a. 6) ou a uma porção delas, que tem uma massa molecular, determinada por SDS-PAGE, entre 41- 48 kDa ou 62 - 63 kDa, ou que compreende a porção homóloga à proteína-quinase FUS3 ou KSS1 de levedura, bem como uma curta extensão aminoterminal ou uma extensão carboxiterminal de cerca de 180 aminoácidos. O presente invento proporciona também proteína MAP2-quinases de mamífero homólogas às moléculas acima mencionadas.5.3. RECOMBINANT PROTEIN EXPRESSION MAP2-0UINASE present invention provides recombinant molecules MAP2 protein kinase, comprising substantially the amino acid sequences shown in Figures 2B (SEQ ID NO : ^2. 2), 3A (SEQ ID NO : ^2. 4) and 3B ( . SEQ ID NO : 6) or a portion of them, which has a molecular weight, determined by SDS-PAGE, between 41- 48 kDa or 62-63 kDa, or comprising a portion homologous to the protein kinase FUS3 and KSS1 of yeast, as well as a short amino terminal or a carboxy terminal extension of about 180 amino acids. The present invention also provides MAP2 protein-mammalian kinases homologous to the aforementioned molecules.

Com vista à expressão da MAP2-quinase recombinante, a sequência nucleotidica que codifica a proteína MAP2-quinase, ou uma porção dela, pode ser inserida num vector de expressão apropriado, isto é, um vector que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência inserida que codifica a proteína. Os sinais necessários para a transcrição e tradução podem, também, ser fornecidos pelo gene nativo da MAP2-quinase e/ou pelas suas regiões flanqeadoras. Vários sistemas de vector-hospedeiro podem ser utilizados para expressão da sequência que codifica a proteína. Estes incluem, embora não se limitem a eles, sistemas de células de mamífero infectadas por vírus (ex.: vírus da vacina adenovírus, etc.); sistemas de células de insectos infectados por vírus (ex.: baculovírus); microrganismos, como leveduras contendo vectores de levedura, ou bactérias transformadas com ADN de bacteriófago, ADN de plasmídeo ou ADN de cosmídeo. Os elementos de expressão destes vectores variam na sua força e especificidade. Dependendo do sistema de vector-hospediro utilizado, qualquer um dos vários elementos de transcrição e tradução adequados pode ser utilizado.In order to express recombinant MAP2 kinase, the nucleotide sequence encoding the MAP2 kinase protein, or a portion thereof, can be inserted into an appropriate expression vector, that is, a vector that contains the elements necessary for transcription and translation of the inserted sequence that encodes the protein. The signals needed for transcription and translation can also be provided by the native MAP2 kinase gene and / or its flanking regions. Various host vector systems can be used to express the sequence encoding the protein. These include, but are not limited to, virus infected mammalian cell systems (eg, adenovirus vaccine virus, etc.); insect cell systems infected by viruses (eg, baculovirus); microorganisms, such as yeasts containing yeast vectors, or bacteria transformed with bacteriophage DNA, plasmid DNA or cosmid DNA. The elements of expression of these vectors vary in their strength and specificity. Depending on the host vector system used, any of several suitable transcription and translation elements can be used.

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Qualquer dos processos previamente descritos para a inserção de fragmentos de ADN num vector pode ser utilizado na construção de vectores de expressão contendo um gene quimérico, consistindo em sinais de controlo de transcrição/tradução adequados e as sequências codificantes da proteína. Estes processos podem incluir técnicas de ADN recombinante e sintético in vitro e de recombinações (recombinação genética) in vivo. A expressão da sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína MAP2-quinase ou fragmento peptídico, pode ser regulada por uma segunda sequência de ácidos nucleicos, de tal forma que a proteína MAP2-quinase ou o péptido é expresso num hospedeiro transformado com a molécula de ADN recombinante. Por exemplo, a expressão da MAP2-quinase pode ser controlada por qualquer elemento promotor/intensificador conhecido na arte, os promotores que podem ser utilizados para controlar a expressão da MAP2-quinase incluem, embora não se limitem a estes, a região do promotor precoce do vírus SV40 (Bernoist e Chambon, 1981, Nature 290:304-310). [o promotor CMV]. 0 promotor contido na repetição terminal longa de 3' do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22.:787-797), o promotor da timidina-quinase de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78.:144-1445), as sequências reguladoras do gene da metalotionina (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); vectores de expressão procariota como o promotor da /3-lactamase (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75.:3727-3731) ou o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei, USA 80:21-25), ver também Useful proteins from recombinant bactéria, Scientific American, 1980, 242:74-94? os elementos promotores de levedura ou de outros fungos com o promotor Gal 4, o promotor ADC (álcool-desidrogenase), o promotor PGK (fosfoglicerol-quinase), o promotor da fosfatase alcalina, e as seguintes regiões de controlo da transcrição animal, que exibem especificidade tissular e têm sido utilizadas em animais transgénicos: região de controlo do gene da elastase I que é activa nas células acinares do pâncreas (Swift et al., 1984, Cell 38.:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant, Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology T_·. 425-515); região de controlo do gene da insulina que é activa nas células beta do pâncreasAny of the previously described processes for inserting DNA fragments into a vector can be used in the construction of expression vectors containing a chimeric gene, consisting of suitable transcription / translation control signals and the protein coding sequences. These processes may include in vitro recombinant and synthetic DNA techniques and in vivo recombination (genetic recombination). The expression of the nucleic acid sequence encoding the MAP2 kinase protein or peptide fragment, can be regulated by a second nucleic acid sequence, such that the MAP2 kinase protein or peptide is expressed in a host transformed with the molecule of Recombinant DNA. For example, MAP2 kinase expression can be controlled by any promoter / enhancer element known in the art, promoters that can be used to control MAP2 kinase expression include, but are not limited to, the early promoter region of the SV40 virus (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-310). [the CMV promoter]. The promoter contained in the 3 'long terminal repeat of the Rous sarcoma virus (Yamamoto et al., 1980, Cell 22.:787-797), the herpes thymidine kinase promoter (Wagner et al., 1981, Proc Natl. Acad. Sci. USA 78.:144-1445), the regulatory sequences of the metallothionine gene (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42); prokaryotic expression vectors such as the / 3-lactamase promoter (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75.:3727-3731) or the tac promoter (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 80: 21-25), see also Useful proteins from recombinant bacteria, Scientific American, 1980, 242: 74-94? promoter elements of yeast or other fungi with the Gal 4 promoter, the ADC promoter (alcohol dehydrogenase), the PGK promoter (phosphoglycerol kinase), the alkaline phosphatase promoter, and the following animal transcription control regions, which exhibit tissue specificity and have been used in transgenic animals: the control region of the elastase I gene that is active in pancreatic acinar cells (Swift et al., 1984, Cell 38.:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant, Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology T. 425-515); control region of the insulin gene that is active in pancreatic beta cells

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(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122). região de controlo do gene da imunoglobulina que é activa nas células linfóides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38.:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-5 38 : Alexander et al. , 1987 , Mol. Cell. Biol. 7.:1436-1444); região de controlo do vírus dos tumores mamários de ratinho que é activa nas células testiculares, da mama, linfócitos e mastócitos (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495). região de controlo do gene da albumina que é activa no fígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devei. 1.:268-276), região de controlo do gene da α-fetoproteína que é activa no fígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5.:1639-1648: Hammer et al., 1987, Science 235:53-58): região de controlo do gene da α-1-antitripsina que é activa no fígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devei. 1.:161-171), região de controlo do gene da β-globina que é activa nas células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340: Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); região de controlo do gene da proteína básica da mielina que é activa nas células oligodendro-cíticas do cérebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); região de controlo do gene da cadeia leve 2 da miosina que é activa no músculo estriado (Sani, 1985, Nature 314:283-286) e a região de controlo do gene da hormona de libertação gonadotrópica que é activa no hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378I.(Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122). control region of the immunoglobulin gene that is active in lymphoid cells (Grosschedl et al., 1984, Cell 38.:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-5 38: Alexander et al., 1987 , Mol. Cell, Biol. 7.:1436-1444); mouse mammary tumor virus control region that is active in testicular, breast, lymphocyte and mast cells (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-495). control region of the albumin gene that is active in the liver (Pinkert et al., 1987, Genes and Devei. 1.:268-276), control region of the α-fetoprotein gene that is active in the liver (Krumlauf et al ., 1985, Mol. Cell. Biol. 5.:1639-1648: Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58): control region of the α-1-antitrypsin gene that is active in the liver (Kelsey et al., 1987, Genes and Devei. 1.:161-171), the control region of the β-globin gene that is active in myeloid cells (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-340: Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94); control region of the myelin basic protein gene that is active in oligodendro-cytic cells in the brain (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712); control region of the myosin light chain 2 gene that is active in the striated muscle (Sani, 1985, Nature 314: 283-286) and the control region of the gonadotropic release hormone gene that is active in the hypothalamus (Mason et al ., 1986, Science 234: 1372-1378I.

Os vectores de expressão contendo imersões do gene da MAP2-quinase podem ser identificados por três abordagens gerais: (a) hibridização ADN-ADN, (b) presença ou ausência das funções de um gene marcador” e (c) expressão das sequências inseridas. Na primeira abordagem, a presença de um gene estranho inserido num vector de expressão pode ser detectada por hibridação ADN-ADN, utilizando sondas que compreendem sequências que são homólogas a um gene da MAP2-quinase inserido. Na segunda abordagem, o sistema vector-hospedeiro recombinante pode ser identificado e seleccionado com base na presença ou ausência de certas funções de gene marcador (ex.: actividade da timidina-quinase, resistência a antibióticos, transformação fenotípica, formação de corpos de oclusão em baculovírus, etc.) causado pela inserção dos genes estranhos no vector. Por exemplo, se o gene da MAP2-quinaseExpression vectors containing MAP2 kinase gene immersions can be identified by three general approaches: (a) DNA-DNA hybridization, (b) presence or absence of the functions of a marker gene ”and (c) expression of the inserted sequences. In the first approach, the presence of a foreign gene inserted into an expression vector can be detected by DNA-DNA hybridization, using probes that comprise sequences that are homologous to an inserted MAP2 kinase gene. In the second approach, the recombinant vector-host system can be identified and selected based on the presence or absence of certain marker gene functions (eg, thymidine kinase activity, antibiotic resistance, phenotypic transformation, formation of occlusion bodies in baculovirus, etc.) caused by the insertion of foreign genes in the vector. For example, if the MAP2 kinase gene

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for inserido na sequência do gene marcador do vector, os' nantes contendo a inserção do gene da MAP2-quinase podem ser identificados pela ausência da função do gene marcador. Na terceira abordagem, os vectores de expressão recombinantes podem ser identificados por ensaio do produto do gene estranho expresso pelo recombinante. Estes ensaios podem basear-se, por exemplo, nas propriedades físicas ou funcionais do produto do gene da MAP2-quinase em sistemas de bioensaio, como descrito na Secção 5.2., supra. No entanto, se as células contendo as construções da expressão do gene da MAP2-quinase contêm MAP2-quinase intrínseca, a actividade resultante da expressão da construção pode ser distinguida da actividade da quinase endógena (ex.: pondo uma marca distinguível na molécula recombinante) ou por subtracção dos níveis de fundo de quinase endógena.is inserted into the sequence of the vector marker gene, the names containing the MAP2 kinase gene insertion can be identified by the absence of the marker gene function. In the third approach, recombinant expression vectors can be identified by assaying the foreign gene product expressed by the recombinant. These assays can be based, for example, on the physical or functional properties of the MAP2 kinase gene product in bioassay systems, as described in Section 5.2., Above. However, if the cells containing the MAP2 kinase gene expression constructs contain intrinsic MAP2-kinase, the activity resulting from the expression of the construct can be distinguished from the activity of the endogenous kinase (eg by placing a distinguishable mark on the recombinant molecule) or by subtracting the background levels of endogenous kinase.

Uma vez identificada e isolada uma molécula de ADN recombinante particular, podem ser utilizados vários métodos conhecidos na arte para a sua propagação. Uma vez estabelecidos um hospedeiro e condições de crescimento adequadas, os vectores de expressão recombinantes podem ser propagados e preparados em quantidade. Como previamente explicado, os vectores de expressão que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados aos vectores seguintes e aos seus derivados: vírus humanos ou animais, tais como o vírus da vacina ou o adenovírus; vírus de insectos, tal como o baculo-vírus; vectores de leveduras; vectores derivados de bacteriófagos (ex.: lambda) e vectores de ADN de plasmídeos e cosmídios para mencionar apenas alguns.Once a particular recombinant DNA molecule has been identified and isolated, various methods known in the art for its propagation can be used. Once a suitable host and growth conditions have been established, recombinant expression vectors can be propagated and prepared in quantity. As previously explained, expression vectors that can be used include, but are not limited to, the following vectors and their derivatives: human or animal viruses, such as the vaccine virus or adenovirus; insect viruses, such as the baculo-virus; yeast vectors; vectors derived from bacteriophages (eg lambda) and plasmid and cosmid DNA vectors to name just a few.

Adicionalmente, pode ser escolhida uma estirpe de células hospedeiras que module a expressão de sequências inseridas ou que modifique e processe o produto do gene numa maneira específica desejada. A expressão a partir de certos promotores pode ser aumentada na presença de certos indutores; desta modo, a expressão da proteína MAP2-quinase manipulada geneticamente pode ser controlada. Além disso, diferentes células hospedeiras possuem mecanismos caracteristicos e específicos para o processamento e modificação de tradução e pós-tradução de proteínas (ex.: glicosação, clivagem). Linhas celulares ouIn addition, a host cell strain can be chosen that modulates the expression of inserted sequences or that modifies and processes the gene product in a specific desired manner. Expression from certain promoters can be increased in the presence of certain inducers; in this way, the expression of the genetically engineered MAP2 kinase protein can be controlled. In addition, different host cells have characteristic and specific mechanisms for processing and modifying translation and post-translation proteins (eg, glycosation, cleavage). Cell lines or

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-26sistemas hospedeiros apropriados podem ser seleccionadoá 5fe forma a assegurar o processamento e a modificação desejados da proteína clonada. Por exemplo, a expressão num sistema bacteriano pode ser utilizada para a produção de um produto proteico não glicosado. A expressão em leveduras produzirá um produto glicosado. A expressão em células de mamíferos pode ser utilizada para assegurar a glicosação nativa da proteína MAP2-quinase heteróloga. Além disso, diferentes sistemas de expressão vector/hospedeiro podem efectuar as reacções de processamento, tal como das clivagens proteolíticas, em diferentes extensões.-26, appropriate host systems can be selected to ensure the desired processing and modification of the cloned protein. For example, the expression in a bacterial system can be used to produce an unglycoside protein product. Yeast expression will produce a glycated product. Expression in mammalian cells can be used to ensure native glycosylation of the heterologous MAP2 protein kinase. In addition, different vector / host expression systems can carry out processing reactions, as well as proteolytic cleavages, to different extents.

Uma vez identificado um recombinante gue expressa o gene da MAP2-quinase, o produto desse gene deverá ser analisado. Isto pode ser conseguido por ensaios baseados nas propriedades físicas ou funcionais do produto.Once a recombinant that expresses the MAP2 kinase gene has been identified, the product of that gene should be analyzed. This can be achieved by tests based on the physical or functional properties of the product.

Uma vez identificada a proteína MAP2-quinase, ela pode ser isolada e purificada pelos métodos usuais incluindo a cromatografia (ex.: de permuta iónica, de afinidade ou cromatografia em gel de exclusão), centrifugação, solubilidade difrencial ou qualquer outra técnica comum utilizada na purificação de proteínas.Once the MAP2 kinase protein has been identified, it can be isolated and purified by the usual methods including chromatography (eg, ion exchange, affinity or exclusion gel chromatography), centrifugation, differentiated solubility or any other common technique used in protein purification.

A presença de actividade da MAP2-quinase funcional pode ser determinada como se encontra descrito na Secção 5.5., infra.The presence of functional MAP2-kinase activity can be determined as described in Section 5.5., Below.

5.5. GENES E PROTEÍNAS DA MAP2-OUINASE5.5. MAP2-OUINASE GENES AND PROTEINS

Utilizando os métodos detalhados acima e nas secções de Exemplo 6 e 7, foram determinadas as seguintes sequências de ácidos nucleicos e deduzidas as correspondentes sequências de aminoácidos. As sequências de ADNc de duas MAP2-quinases de ratazana foram determinadas e encontram-se representadas nas FIGURAS 2B (SEQ ID N^e. 1), 3A (SEQ ID N⁵. 3) e 3B (SEQ ID N². 5). Cada uma destas sequências, ou seus equivalentes funcionais, pode ser utilizada de acordo com o invento. Adicionalmente, o invento refere-se a genes e proteínas da MAP2-quinase isolados a partir de suínos, ovinos, bovinos, felinos, aves, equinos ou caninos, assim como a partir de fontes primatas e de qualquer outra espécie onde exista actividade da MAP2-quinase. O presenteUsing the methods detailed above and in the sections of Example 6 and 7, the following nucleic acid sequences were determined and the corresponding amino acid sequences were deducted. The cDNA sequences of two MAP2 kinases rat were determined and are shown in Figures 2B (SEQ ^and ID. 1), 3A (SEQ ID NO : ^5. 3) and 3B (SEQ ID NO : ^2. 5). Each of these sequences, or their functional equivalents, can be used according to the invention. In addition, the invention relates to MAP2 kinase genes and proteins isolated from pigs, sheep, cattle, felines, birds, horses or dogs, as well as from primate sources and any other species where MAP2 activity exists. kinase. The gift

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invento também proporciona ERK4, tal como é identificada e descrita na Secção 7, infra. que corresponde a uma proteína com massa molecular de cerca de 45 kDa. 0 invento é ainda dirigido a sub-sequências homólogas dos ácidos nucleicos da MAP2-quinase compreendendo pelo menos dez nucleótidos, compreendendo tais subsequências porções hibridáveis da sequência da MAP2-quinase que têm utilidade, por exemplo, nos ensaios de hibridação, análises por transferência de Southern e Northern, etc.. O invento também proporciona proteína MAP2-quinases, fragmentos e derivados delas, de acordo com as sequências de aminoácidos apresentadas nas FIGURAS 2B (SEQ ID N². 2), 3A (SEQ ID N^a. 4) e 3B (SEQ ID N^s, 6), ou equivalentes funcionais a elas, e proteínas homólogas a essas proteínas, sendo essa homologia de pelo menos de cerca de 30%. O invento também proporciona fragmentos ou derivados da proteína MAP2-quinase que compreendem determinante(s) antigénicas, ou que são funcionalmente activos, ou que possuem pelo menos seis aminoácidos de comprimento. Tal como tem sido utilizado, funcionalmente activo significa possuir capacidade para fosforilar MAP2 ou outros substratos relevantes (ex.: MBP, S6-quinase; ver Secção 5.5., infra).The invention also provides ERK4, as identified and described in Section 7, below. which corresponds to a protein with a molecular mass of about 45 kDa. The invention is further directed to homologous sub-sequences of the MAP2 kinase nucleic acids comprising at least ten nucleotides, such subsequences comprising hybridizable portions of the MAP2 kinase sequence which are useful, for example, in hybridization assays, transfer analysis Southern and Northern etc .. the invention also provides MAP2 protein kinase, fragments and derivatives of them, according to the amino acid sequences shown in FIGURES 2B (SEQ ID NO : ^2. 2), 3A (SEQ ID NO ^to 4) . and 3B (SEQ ID N ^s , 6), or functional equivalents to them, and proteins homologous to those proteins, this homology being at least about 30%. The invention also provides fragments or derivatives of the MAP2 protein kinase that comprise antigenic determinant (s), or that are functionally active, or that are at least six amino acids in length. As used, functionally active means having the ability to phosphorylate MAP2 or other relevant substrates (eg MBP, S6-kinase; see Section 5.5., Below).

Por exemplo, as sequências de ácidos nucleicos representadas nas Figuras 2B (SEQ ID N=. 1), 3A (SEQ ID N^a . 3) e 3B (SEQ ID N^a . 5) podem ser alteradas por substituições, adições ou delecções que originarão moléculas funcionalmente equivalentes. Devido à degenerescência das sequências nucleotídicas codificantes, outras sequências de ADN que codificam substancialmente a mesma sequência de aminoácidos como as que são apresentadas nas FIGURAS 2B (SEQ ID N^a. 2), 3A (SEQ ID N^B. 4) e 3B (SEQ ID N^a. 6) podem ser utilizadas na prática do presente invento. Estas incluem, embora não se limitem a elas, sequências nucleotídicas contendo todas, ou apenas porções, dos genes da MAP2-quinase apresentados nas FIGURAS 2B (SEQ ID N^a. 1), 3A (SEQ ID N^a. 3) e 3B (SEQ ID N^a. 5) que são alteradas por substituição de diferentes codões que codificam um resíduo de aminoácido funcionalmente equivalente na sequência, produzindo deste modo uma alteração silenciosa. Do mesmo modo, proteínas MAP2-quinase do invento, ou fragmentos ou derivados dela, incluem, mas não estão limitados, àqueles queFor example, the nucleic acid sequences represented in Figures 2B (SEQ ID N =. 1), 3A (SEQ ID N ^a . 3) and 3B (SEQ ID N ^a . 5) can be changed by substitutions, additions or deletions that will yield functionally equivalent molecules. Due to the degeneracy of the coding nucleotide sequences, other DNA sequences that substantially encode the same amino acid sequence as those shown in FIGURES 2B (SEQ ID N ^a . 2), 3A (SEQ ID N ^B. 4) and 3B (SEQ ID No. ^a . 6) can be used in the practice of the present invention. These include, but are not limited to, nucleotide sequences containing all, or only portions, of the MAP2-kinase genes shown in FIGURES 2B (SEQ ID N ^a . 1), 3A (SEQ ID N ^a . 3) and 3B ( SEQ ID NO ^a . 5) which are altered by substituting different codons that encode a functionally equivalent amino acid residue in the sequence, thereby producing a silent change. Likewise, MAP2 kinase proteins of the invention, or fragments or derivatives thereof, include, but are not limited to, those that

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contêm como sequência primária de aminoácidos, toda ou parte da sequência de aminoácidos substancialmente como representado nas FIGURAS 2B (SEQ ID N^a . 2), 3A (SEQ ID F. 4) e 3B (SEQ ID N^a . 6), incluindo as sequências alteradas nas quais foram substituídos resíduos de aminoácidos da sequência por resíduos funcionalmente equivalentes resultando numa alteração silenciosa. Por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos da sequência podem ser substituídos por outros aminoácidos de polaridade semelhante que actuam como equivalentes funcionais, resultando numa alteração silenciosa. Os substitutos para um aminoácido na sequência podem ser seleccionados de entre outros membros da classe à qual o aminoácido pertence. Por exemplo, os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem a arginina, a lisina e a histidina. Os aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem o ácido aspártico e o ácido glutâmico. Também incluídas no âmbito deste invento encontram-se as proteínas MAP2-quinase, ou fragmentos ou derivados dela, que são diferencialmente modificados durante ou após a tradução, por exemplo, por fosforilação, glicosação, clivagem proteolítica, ligação a uma molécula de anticorpo ou a outro ligando celular, etc.. Por exemplo, pode ser desejável modificar a sequência de uma MAP2-quinase conhecida, de tal forma que a fosforilação específica, ou seja serina e treonina, já não seja necessária ou tão importante.contain as a primary amino acid sequence, all or part of the amino acid sequence substantially as depicted in FIGURES 2B (SEQ ID No. ^a . 2), 3A (SEQ ID F. 4) and 3B (SEQ ID No. ^a . 6), including altered sequences in which amino acid residues of the sequence have been replaced by functionally equivalent residues resulting in a silent alteration. For example, one or more amino acid residues in the sequence can be replaced by other amino acids of similar polarity that act as functional equivalents, resulting in a silent change. Substitutes for an amino acid in the sequence can be selected from among other members of the class to which the amino acid belongs. For example, non-polar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine. The polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine. The positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine. Negatively charged amino acids (acids) include aspartic acid and glutamic acid. Also included within the scope of this invention are MAP2 kinase proteins, or fragments or derivatives thereof, which are differentially modified during or after translation, for example, by phosphorylation, glycosylation, proteolytic cleavage, binding to an antibody molecule or another cell ligand, etc. For example, it may be desirable to modify the sequence of a known MAP2-kinase in such a way that specific phosphorylation, ie serine and threonine, is no longer necessary or so important.

Adicionalmente, as sequências de ácidos nucleicos que codificam a MAP2-quinase recombinante do invento podem ser manipuladas geneticamente de forma a modificar o processamento ou a expressão da MAP2-quinase. Por exemplo, e não por limitação, uma sequência sinal pode ser inserida a montante das sequências codificadoras da MAP2-quinase de modo a permitir a secreção de MAP2-quinase, facilitando deste modo a sua extracção e biodisponibilidade.In addition, the nucleic acid sequences encoding the recombinant MAP2 kinase of the invention can be genetically engineered to modify MAP2 kinase processing or expression. For example, and not by limitation, a signal sequence can be inserted upstream of the MAP2 kinase coding sequences to allow the secretion of MAP2 kinase, thereby facilitating its extraction and bioavailability.

Adicionalmente, uma dada MAP2-quinase pode ser mutada in vi72 686In addition, a given MAP2 kinase can be mutated in vi72 686

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tro ou in vivo, de modo a criar e/ou destruir as sequências de tradução (iniciação e/ou terminação), ou a criar variações nas regiões codificadoras e/ou formar ou destruir locais de endonucleases de restrição, a fim de facilitar a modificação adicional in vitro. Qualquer técnica de mutagénese conhecida na arte pode ser utilizada, incluindo mas não se limitando à mutagénese dirigida ao local, in vitro. (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253 :6551) . à utilização de ligadores TAB® (Pharmacia), etc..or in vivo, in order to create and / or destroy the translation sequences (initiation and / or termination), or to create variations in the coding regions and / or to form or destroy restriction endonuclease sites, in order to facilitate modification additional in vitro. Any mutagenesis technique known in the art can be used, including but not limited to site-directed mutagenesis, in vitro. (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551). the use of TAB® connectors (Pharmacia), etc.

5.4. PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-PROTEÍNA-MAP2-QUINASE5.4. PRODUCTION OF ANTI-PROTEIN-MAP2-KINASE ANTIBODIES

De acordo com o invento, a proteína MAP2-quinase, ou fragmentos ou derivados dela, podem ser usados como imumogénicos para a produção de anticorpos anti-MAP2-quinase. Proporcionando uma produção de quantidades de proteína MAP2-quinase relativamente abundantes, usando técnicas recombinantes para a síntese da proteína (baseada nas sequências de ácidos nucleicos da MAP2-quinase do invento), o problema das quantidades limitadas de MAP2-quinase foi obviado.According to the invention, the MAP2 kinase protein, or fragments or derivatives thereof, can be used as immumogens for the production of anti-MAP2 kinase antibodies. By providing a production of relatively abundant amounts of MAP2 kinase protein, using recombinant techniques for protein synthesis (based on the MAP2 kinase nucleic acid sequences of the invention), the problem of limited amounts of MAP2 kinase has been overcome.

Para melhorar ainda a probabilidade de produzir uma resposta imunitária anti-MAP2-quinase, a sequência de aminoácidos da MAP2-quinase pode ser analisada de forma a identificar porções da molécula que possam estar associadas com o aumento da imunogenicidade. Por exemplo, a sequência de aminoácidos pode ser submetida a análise por computador para identificação de epítopos de superfície que apresentem gráficos gerados por computadores de hidrofilicidade, probabilidade de superfície, flexibilidade, índice antigénico, hélice anfifílica, folha anfifílica e estrutura secundária da MAP2-quinase. Alternativamente, a sequência de aminoácidos deduzida da MAP2-quinase de várias espécies pode ser comparada e regiões relativamente não homólogas identificadas; estas regiões não homólogas serão provavelmente imunogénicas para várias espécies.To further improve the likelihood of producing an anti-MAP2 kinase immune response, the MAP2 kinase amino acid sequence can be analyzed in order to identify portions of the molecule that may be associated with increased immunogenicity. For example, the amino acid sequence can be subjected to computer analysis to identify surface epitopes that display computer generated hydrophilicity, surface probability, flexibility, antigenic index, amphiphilic helix, amphiphilic leaf and secondary structure of MAP2-kinase . Alternatively, the deduced amino acid sequence of MAP2 kinase from various species can be compared and relatively non-homologous regions identified; these non-homologous regions are likely to be immunogenic for several species.

Para a preparação de anticorpos monoclonais dirigidos contra a MAP2-quinase, qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpo em linhas celulares contínuas em culturaFor the preparation of monoclonal antibodies directed against MAP2 kinase, any technique that provides for the production of antibody molecules in continuous cell lines in culture

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pode ser utilizada. Por exemplo, a técnica do hibridoma originalmente desenvolvida por Kohler e Milstein (1975, Nature 256:495-497). assim como a técnica do trioma, a técnica do hibridoma das células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4.:72), a técnica do hibridoma EBV para produção de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy”, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96) e semelhantes estão dentro do âmbito do presente invento.can be used. For example, the hybridoma technique originally developed by Kohler and Milstein (1975, Nature 256: 495-497). as well as the trioma technique, the human B cell hybridoma technique (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4.:72), the EBV hybridoma technique for producing human monoclonal antibodies (Cole et al., 1985 , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy ”, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96) and the like are within the scope of the present invention.

Os anticorpos monoclonais para uso terapêutico podem ser anticorpos monoclonais humanos ou anticorpos monoclonais quiméricos homem-ratinho (ou outras espécies). Os anticorpos monoclonais humanos podem ser produzidos por numerosas técnicas conhecidas na arte (ex.: Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. sei. U.S.A. 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72-79; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16). As moléculas quiméricas de anticorpo podem ser preparadas contendo um domínio de ligação de antigénio de ratinho com regiões humanas constantes (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82:6851, Takeda et al., 1985, Nature 314:452).Monoclonal antibodies for therapeutic use can be human monoclonal antibodies or chimeric human-mouse (or other species) monoclonal antibodies. Human monoclonal antibodies can be produced by numerous techniques known in the art (eg, Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72-79; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92: 3-16). Chimeric antibody molecules can be prepared containing a mouse antigen binding domain with constant human regions (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6851, Takeda et al., 1985, Nature 314: 452).

Vários procedimentos conhecidos na arte podem ser utilizados para a produção de anticorpos policlonais contra epítopos de MAP2-quinase. Para a produção de anticorpos, vários animais hospedeiros podem ser imunizados, por injecção, com a proteína MAP2-quinase, ou fragmentos ou derivados dela, incluindo embora não se limitando a coelhos, ratinhos, ratazanas, etc.. Vários adjuvantes podem ser utilizados para aumentar a resposta imunológica, dependendo da espécie hospedeira, incluindo mas não se limitando ao adjuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerais como o hidróxido de alumínio, substâncias de tensioactivas como a lisolecitina, os poliois plurónicos, os polianiões, os péptidos, as emulsões oleosas, as hemocianinas de lapa (género Fissurella), o dinitrofenol e os adjuvantes humanos potencialmente úteis como o BCG (Bacilo de Calmette-Guerin) e o Corynebacterium parvum.Various procedures known in the art can be used for the production of polyclonal antibodies against MAP2 kinase epitopes. For the production of antibodies, various host animals can be immunized, by injection, with the MAP2 kinase protein, or fragments or derivatives thereof, including, but not limited to, rabbits, mice, rats, etc. Various adjuvants can be used to increase the immune response, depending on the host species, including but not limited to Freund's adjuvant (complete and incomplete), mineral gels such as aluminum hydroxide, surfactant substances such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oily emulsions, keyhole limpet hemocyanins (genus Fissurella), dinitrophenol and potentially useful human adjuvants such as BCG (Bacillus of Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum.

Um clone molecular de um anticorpo para um epítopo da MAP2-A molecular clone of an antibody to an MAP2- epitope

-quinase pode ser preparado por técnicas conhecidas. A metodologia do ADN recombinante (ver por exemplo; Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) pode ser utilizada na construção de sequências de ácido nucleico que codificam moléculas de anticorpo monoclonal, ou a sua região de ligação ao antigénio.kinase can be prepared by known techniques. The recombinant DNA methodology (see for example; Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) can be used in the construction of nucleic acid sequences that encode molecules of monoclonal antibody, or its antigen-binding region.

As moléculas de anticorpo podem ser purificadas por várias técnicas conhecidas, por exemplo, a cromatografia de imunoabsorção ou de imunoafinidade, métodos cromatográficos como HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência) ou uma combinação deles , etc..Antibody molecules can be purified by several known techniques, for example, immunosorbent or immunoaffinity chromatography, chromatographic methods such as HPLC (high performance liquid chromatography) or a combination of them, etc.

presente invento proporciona moléculas de anticorpo, assim como fragmentos dessas moléculas de anticorpo.the present invention provides antibody molecules, as well as fragments of those antibody molecules.

Os fragmentos de anticorpo que contêm o idiotipo da molécula podem ser geradas por técnicas conhecidas. Por exemplo, esses fragmentos incluem, mas não estão limitados: ao fragmento F(ab')₂ que pode ser produzido por digestão com pepsina da molécula de anticorpo; aos fragmentos Fab' que podem ser produzidos por redução das pontes dissulfureto do fragmento F(ab')₂ e aos fragmentos Fab que podem ser produzidos por tratamento da molécula de anticorpo com papaína e um agente redutor.Antibody fragments that contain the molecule's idiotype can be generated by known techniques. For example, these fragments include, but are not limited to: the F (ab ') ₂ fragment that can be produced by pepsin digestion of the antibody molecule; to Fab 'fragments that can be produced by reducing the disulfide bridges of the F (ab') ₂ fragment and to Fab fragments that can be produced by treating the antibody molecule with papain and a reducing agent.

5.5. BIOENSAIO PARA A ACTIVIDADE DA MAP2-QUINASE5.5. BIOENSE FOR MAP2-KINASE ACTIVITY

A actividade da MAP2-quinase pode ser medida por utilização de qualquer ensaio adequado para quinases conhecido na arte. Por exemplo, e não como limitação, o método descrito por Boulton et al. (1990, J. Biol. Chem., 265:2713-2719) . como se apresenta a seguir. 0 ensaio para a fosforilação da MAP2 pode conter Hepes 30 mM (pH 8), ATP 50 μΜ (1-50 cpm/fmol), ditiotreitol 1 mM, benzamidina 1 mM, MgCl₂ 10 mM, albumina de soro bovino 100μg/ml, 3 μg de MAP2 e não mais do que 10 μg de amostra de proteína num volume final de 30 μΐ durante 10 minutos a 30°C. A quantidade de MAP2 no ensaio (100 Mg/ml) pode ser escolhida por conveniência de análise, por SDS-PAGE e por precipitação. A enzima não é saturadaMAP2 kinase activity can be measured using any suitable kinase assay known in the art. For example, and not as a limitation, the method described by Boulton et al. (1990, J. Biol. Chem., 265: 2713-2719). as shown below. The MAP2 phosphorylation assay may contain 30 mM Hepes (pH 8), 50 μΜ ATP (1-50 cpm / fmol), 1 mM dithiothreitol, 1 mM benzamidine, 10 mM MgCl ₂ , 100μg / ml bovine serum albumin, 3 μg of MAP2 and no more than 10 μg of protein sample in a final volume of 30 μΐ for 10 minutes at 30 ° C. The amount of MAP2 in the assay (100 Mg / ml) can be chosen for convenience of analysis, by SDS-PAGE and by precipitation. The enzyme is not saturated

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com o substrato mesmo até uma concentração de MAP2 de 1,36 mg/ml. No entanto, com 100 /xg/ml de MAP2 pode esperar-se um comportamento linear da actívidade enzimática com o tempo pelo menos durante 30 minutos. Todas as amostras, excepto os sobrenadantes não fraccionados, podem ser ensaiados rotineiramente como descrito acima, na presença de 1 mg de albumina de soro bovino. Os ensaios podem ser terminados pela adição de ácido tricloroacético a 10% e os precipitados podem ser recolhidos em filtros de fibra de vidro. Todos os ensaios, excepto os acima mencionados, podem ser interrompidos pela adição de 0,25 volumes de Tris-HCl 0,3 M (pH 6,9), contendo mercaptoetanol 2 M, glicerol a 50% e SDS 10 %, e analisados por electroforese em SDS usando geles de poliacrilamida a 5% (MAP2). Os geles podem ser corados com azul de Coomassie, descorados com metanol a 10% e ácido acético a 10%, secos e submetidos a auto-radiografia a -80°C utilizando um filme Kodak XS-5 ou BB-5 com écrans de intensificação Dupont Quanta III. As bandas do substrato podem ser excisadas dos geles e o ³²P pode ser quantificado utilizando contagem de cintilação em líquido.with the substrate even to a MAP2 concentration of 1.36 mg / ml. However, with 100 µg / ml MAP2 a linear behavior of the enzymatic activity can be expected over time for at least 30 minutes. All samples, except unfractionated supernatants, can be tested routinely as described above, in the presence of 1 mg of bovine serum albumin. The tests can be terminated by the addition of 10% trichloroacetic acid and the precipitates can be collected on glass fiber filters. All tests, except those mentioned above, can be stopped by adding 0.25 volumes of 0.3 M Tris-HCl (pH 6.9), containing 2 M mercaptoethanol, 50% glycerol and 10% SDS, and analyzed by SDS electrophoresis using 5% polyacrylamide gels (MAP2). Gels can be stained with Coomassie blue, bleached with 10% methanol and 10% acetic acid, dried and subjected to radiography at -80 ° C using a Kodak XS-5 or BB-5 film with intensifying screens Dupont Quanta III. The substrate bands can be excised from the gels and ³² P can be quantified using liquid scintillation counting.

5.6. UTILIDADE DO INVENTO5.6. UTILITY OF THE INVENTION

O presente invento pode ser utilizado para proporcionar sistemas de modelo únicos para o estudo de mecanismos de hormonas e de outros factores celulares, e pode também ser usado em processos de pesquisa de compostos quanto à actívidade de factores hormonais/celulares e para identificar agentes que actuem como antagonistas ou agonistas.The present invention can be used to provide unique model systems for the study of mechanisms of hormones and other cellular factors, and can also be used in compound screening processes for the activity of hormonal / cellular factors and to identify agents that act as antagonists or agonists.

De acordo com várias concretizações do invento, as moléculas de MAP2-quinase recombinante podem ser usadas para criar novos sistemas de modelo para o estudo de mecanismos de hormonas e de outros factores celulares. Por exemplo, e não como limitação, as moléculas recombinantes do invento podem ser incorporadas em células ou organismos de tal forma que quantidades superiores ao normal de MAP2-quinase são produzidas, podendo assim avaliar-se os efeitos da hiperactivação da MAP2-quinase. A sobreprodução de MAP2-quinase pode identificar aspectos da resposta a factores hormonais/celulares relacionados com a actívidade daAccording to various embodiments of the invention, recombinant MAP2 kinase molecules can be used to create new model systems for the study of mechanisms of hormones and other cellular factors. For example, and not as a limitation, the recombinant molecules of the invention can be incorporated into cells or organisms in such a way that higher than normal amounts of MAP2-kinase are produced, thus being able to evaluate the effects of MAP2-kinase hyperactivation. Overproduction of MAP2 kinase can identify aspects of the response to hormonal / cellular factors related to the activity of

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MAP2-quinase, particularmente quando avaliada em comparação com células ou organismos que produzam quantidades normais de MAP2-quinase.MAP2 kinase, particularly when evaluated against cells or organisms that produce normal amounts of MAP2 kinase.

Alternativamente, as moléculas de MAP2-quinase recombinante podem ser manipuladas geneticamente, de tal forma que células ou organismos que contenham as moléculas recombinantes produzam uma forma mutante de MAP2-quinase, por exemplo, a ausência de actividade normal de quinase da MAP2-quinase para a serina/treonina. A quinase mutante pode, numa base de concentração, sobrepôr-se ou superar os efeitos da MAP2-quinase normal e assim criar células ou organismos com uma aberração funcional no que diz respeito à função da MAP2-quinase. Está também previsto que estas sequências de ácidos nucleicos, mutantes, possam resultar na mutação do gene endógeno da proteína MAP2-quinase, por exemplo, por recombinação homóloga, criando verdadeiros mutantes de MAP2-quinase. Em resultado dos altos níveis de expressão de ARNm codificador de MAP2-quinase no sistema nervoso central, e no papel da MAP2-quinase na formação dos emaranhados neurofibrilares, pode ser possível criar um animal transgénico não humano que expresse uma molécula MAP2-quinase mutante no seu sistema nervoso central (por exemplo, através de uma sequência promotora específica do cérebro) e que pode servir como um sistema de modelo animal para desordens neurológicas como a doença de Alzheimer ou neuropatias periféricas.Alternatively, recombinant MAP2 kinase molecules can be engineered genetically, such that cells or organisms containing the recombinant molecules produce a mutant form of MAP2 kinase, for example, the absence of normal MAP2 kinase kinase activity for serine / threonine. The mutant kinase can, on a concentration basis, overlap or overcome the effects of normal MAP2-kinase and thus create cells or organisms with a functional aberration with respect to the function of MAP2-kinase. It is also anticipated that these mutant nucleic acid sequences may result in the mutation of the MAP2 kinase endogenous gene, for example, by homologous recombination, creating true MAP2 kinase mutants. As a result of the high levels of mRNA expression encoding MAP2 kinase in the central nervous system, and the role of MAP2 kinase in the formation of neurofibrillary tangles, it may be possible to create a non-human transgenic animal that expresses a mutant MAP2 kinase molecule in the its central nervous system (for example, through a specific promoter sequence in the brain) and which can serve as an animal model system for neurological disorders such as Alzheimer's disease or peripheral neuropathies.

Além disso, porque o presente invento possibilita pela primeira vez a produção de grandes quantidades de MAP2-quinase purificada, ele permite a produção de anticorpos anti-MAP2-quinase. Os anticorpos anti-MAP2-quinase, policlonais ou monoclonais, podem ser utilizados em experiências que utilizam células ou organismos que estudam os efeitos da neutralização selectiva da função da MAP2-quinase. Estas experiências poderão elucidar o papel específico da MAP2-quinase na acção do factor hormonal ou celular.Furthermore, because the present invention makes it possible for the first time to produce large quantities of purified MAP2-kinase, it allows the production of anti-MAP2-kinase antibodies. Anti-MAP2 kinase antibodies, polyclonal or monoclonal, can be used in experiments using cells or organisms that study the effects of selective neutralization of MAP2 kinase function. These experiments may elucidate the specific role of MAP2-kinase in the action of the hormonal or cellular factor.

Uma concretização importante do presente invento refere-se a processos para a selecção de compostos com actividade do factorAn important embodiment of the present invention relates to processes for the selection of compounds with factor activity

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hormonal ou celular. Em concretizações específicas, o presente invento proporciona um processo de deteccão da presença de um composto com uma actividade semelhante à do factor de crescimento do nervo, incluindo: (i) a cultura de células que produzam uma proteína MAP2-quinase (que é activada pelo factor de crescimento do nervo) na presença de um composto suspeito de ter uma actividade semelhante à do factor de crescimento do nervo (o que quer dizer uma actividade semelhante mas não necessariamente idêntica à do NGF, incluindo, por exemplo, a capacidade de suportar o crescimento dos neurónios simpáticos em cultura) e (ii) a detecção de alterações nos níveis de actividade da proteína MAP2-quinase, em que um aumento na actividade é indicativo da presença de uma actividade semelhante à do factor de crescimento do nervo. De igual modo, numa outra concretização específica, o presente invento proporciona um processo de detecção da presença de um composto com actividade semelhante à da insulina, e que inclui (i) a cultura de células que produzem uma proteína MAP2-quinase (que pode ser activada pela insulina) na presença de um composto suspeito de ter uma actividade semelhante à da insulina (o que quer dizer uma actividade semelhante mas não necessariamente idêntica à da insulina, incluindo, por exemplo, a capacidade de activar a MAP2-quinase, em células que respondem à insulina) e (ii) a detecção de alterações nos níveis de actividade da proteína MAP2-quinase, em que um aumento na actividade é indicativo da presença de uma actividade semelhante à da insulina. 0 presente invento proporciona, deste modo, um processo poderoso para a identificação de compostos que podem ser úteis no tratamento de diabetes. 0 presente invento, também, proporciona processos análogos que pesquisam a actividade de outros factores hormonais ou celulares. Em concretizações adicionais do invento, pode ser desejável, que nos processos de pesquisa acima mencionados, se utilizem linhas celulares que compreendam uma molécula de ácido nucleico, recombinante, codificadora de uma MAP2-quinase de mamífero, incluindo, mas não se limitando a, moléculas de ácido nucleico, recombinantes, contendo sequências substancialmente como as representadas nas FIGURAS 2B (SEQ ID N². l), 3A (SEQ ID N². 3) e 3B (SEQ ID N^B. 5). Estas linhas celulares podem expressarhormonal or cellular. In specific embodiments, the present invention provides a process for detecting the presence of a compound with an activity similar to that of nerve growth factor, including: (i) culturing cells that produce a MAP2 kinase protein (which is activated by nerve growth factor) in the presence of a compound suspected of having an activity similar to that of nerve growth factor (meaning an activity similar but not necessarily identical to that of NGF, including, for example, the ability to support the growth of sympathetic neurons in culture) and (ii) the detection of changes in the activity levels of MAP2 kinase protein, in which an increase in activity is indicative of the presence of an activity similar to that of nerve growth factor. Likewise, in another specific embodiment, the present invention provides a process for detecting the presence of a compound with insulin-like activity, and which includes (i) culturing cells that produce a MAP2 kinase protein (which can be activated by insulin) in the presence of a compound suspected of having insulin-like activity (meaning an activity similar but not necessarily identical to that of insulin, including, for example, the ability to activate MAP2 kinase in cells that respond to insulin) and (ii) the detection of changes in the activity levels of the MAP2 kinase protein, in which an increase in activity is indicative of the presence of an insulin-like activity. The present invention thus provides a powerful process for identifying compounds that may be useful in the treatment of diabetes. The present invention also provides analogous processes that screen for the activity of other hormonal or cellular factors. In further embodiments of the invention, it may be desirable that in the aforementioned research methods, cell lines are used that comprise a recombinant nucleic acid molecule encoding a mammalian MAP2-kinase, including, but not limited to, molecules nucleic acid, recombinants containing sequences substantially as shown in FIGURE 2B (SEQ ID NO : ^2. l), 3A (SEQ ID NO : ^2. 3) and 3B (SEQ ID NO: ^B. 5). These cell lines can express

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preferencialmente níveis elevados de MAP2-quinase, e deste modo podem proporcionar um ensaio mais sensível para a activação da MAP2-quinase. 0 presente invento proporciona também processos semelhantes, em que as células utilizadas para a pesquisa compreendam uma sequência de ácidos nucleicos recombinante substancialmente homóloga às sequências representadas nas FIGURAS 2B (SEQ ID N^a. 1), 3A (SEQ ID N². 3) e 3B (SEQ ID N² . 5) ou uma porção delas. Os processos do invento podem ser utilizados para identificar compostos que possam ser eficazes no tratamento de neuropatias periféricas ou que possam promover a regeneração do nervo. Além disso, porque os neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal, capazes de responderem ao NGF, são consistentemente afectados nos primeiros estágios da doença de Alzheimer, os processos do presente invento podem ser particularmente úteis na identificação de compostos com actividade semelhante à do NGF que possam ser eficazes no tratamento na doença de Alzheimer. Adicionalmente, estes processos podem permitir a identificação de moléculas capazes de ultrapassar a interacção hormona/receptor. Isto pode ser clinicamente útil, na inibição da actividade da MAP2-quinase num organismo, utilizando, por exemplo, moléculas pequenas como os análogos purínicos.preferably high levels of MAP2 kinase, and thus can provide a more sensitive assay for MAP2 kinase activation. 0 The present invention also provides similar methods wherein the cells used for research comprise a sequence of recombinant nucleic acids substantially homologous to the sequences shown in Figures 2B (SEQ ID NO ^a. 1), 3A (SEQ ID NO : ^2. 3) , and 3B (SEQ ID NO ^2. 5) or a portion thereof. The processes of the invention can be used to identify compounds that can be effective in the treatment of peripheral neuropathies or that can promote nerve regeneration. In addition, because the cholinergic neurons of the basal forebrain, capable of responding to NGF, are consistently affected in the early stages of Alzheimer's disease, the processes of the present invention may be particularly useful in identifying compounds with NGF-like activity that may be effective in treating Alzheimer's disease. In addition, these processes can allow the identification of molecules capable of overcoming the hormone / receptor interaction. This can be clinically useful in inhibiting MAP2 kinase activity in an organism, using, for example, small molecules such as purine analogs.

Em concretizações adicionais do presente invento a MAP2-quinase recombinante pode ser usada para a identificação de outras moléculas, tais como as quinases relacionadas com os factores celulares ou com a acção hormonal. Por exemplo, a MAP2-quinase recombinante pode ser usada para identificar quinases adicionais por purificação de afinidade, em que a MAP2-quinase é utilizada para aderir a outras quinases que participam numa cascata de fosforilação associada à MAP2. As porções sequenciadas do receptor para o NGF estão, provavelmente, associadas fisicamente a uma proteína-quinase ainda não identificada. A MAP2-quinase recombinante pode ser útil no estudo destas interacções.In further embodiments of the present invention, recombinant MAP2 kinase can be used for the identification of other molecules, such as kinases related to cellular factors or hormonal action. For example, recombinant MAP2 kinase can be used to identify additional kinases by affinity purification, where MAP2 kinase is used to adhere to other kinases that participate in a MAP2 associated phosphorylation cascade. The sequenced portions of the NGF receptor are likely to be physically associated with an unidentified protein kinase. Recombinant MAP2-kinase can be useful in studying these interactions.

Noutra concretização, a detecção de alterações na actividade de uma proteína MAP2-quinase, resultante da cultura de células na presença de um composto conhecido ou suspeito de afectar aIn another embodiment, the detection of changes in the activity of a MAP2 kinase protein, resulting from cell culture in the presence of a compound known or suspected of affecting the

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actividade da proteína MAP2-quinase, pode ser utilizada para detectar a presença ou medir a quantidade desse composto e a sua capacidade de modular os níveis de actividade da MAP2-quinase. Esse efeito na actividade da MAP2-quinase pode ocorrer directa ou indirectamente (ex.: através de uma via de transdução de sinal). Num exemplo específico desta concretização, a presença de uma molécula de neurotrofina (incluindo mas não limitada ao NGF, factor neurotrófico derivado do cérebro, neurotrofina-3 (NT-3) e outros membros da família de moléculas NGF/BDNF/NT-3) pode ser detectada através de um aumento de actividade de uma proteína MAP2-quinase após cultura de células na presença de uma amostra suspeita de conter essa molécula de neurotrofina. As células que são cultivadas nestes ensaios devem expressar receptores para a molécula de neurotrofina a ser detectada, podendo estes ser endógenos ou recombinantes.MAP2 kinase protein activity, can be used to detect the presence or measure the amount of that compound and its ability to modulate MAP2 kinase activity levels. This effect on MAP2 kinase activity can occur directly or indirectly (eg, via a signal transduction pathway). In a specific example of this embodiment, the presence of a neurotrophin molecule (including but not limited to NGF, brain-derived neurotrophic factor, neurotrophin-3 (NT-3) and other members of the NGF / BDNF / NT-3 family of molecules) it can be detected by an increase in the activity of a MAP2 protein kinase after cell culture in the presence of a sample suspected to contain that neurotrophin molecule. The cells that are cultured in these assays must express receptors for the neurotrophin molecule to be detected, which can be endogenous or recombinant.

6. EXEMPLO: CLONÃGEM MOLECULAR DE UMA PROTEÍNA MÃP2-QUINASE6. EXAMPLE: MOLECULAR CLONING OF A MÃP2-KINASE PROTEIN

ESTIMULADA PELA INSULINA: H0M0L0GIA COM 0 CONTROLO DOINSULIN STIMULATED: H0M0L0GIA WITH CONTROL OF THE

CICLO CELULAR REGULADO PELA FERORMONACELLULAR CYCLE REGULATED BY THE FERORMONA

6.1. MATERIAIS E MÉTODOS6.1. MATERIALS AND METHODS

6.1.1. LINHAS CELULARES6.1.1. CELL LINE

As células Rat 1 HIRc B (McClain et al., 1987, J. Biol. Chem., 262:14663-14671) foram obtidas através de Don McClain (Veterans Administration Medicai Center, San Diego, CA). A insulina de porco foi uma oferta de Mary Root (Eli Lilly). As enzimas de restrição foram obtidas em New England Bilabs.Rat 1 HIRc B cells (McClain et al., 1987, J. Biol. Chem., 262: 14663-14671) were obtained from Don McClain (Veterans Administration Medical Center, San Diego, CA). Pork insulin was an offer from Mary Root (Eli Lilly). Restriction enzymes were obtained from New England Bilabs.

6.1.2. PURIFICAÇÃO E SEQUENCIAÇÃO DE PÉPTIDOS TRIPTICOS DE MAP2-QUINASE6.1.2. PURIFICATION AND SEQUENCING OF MAP2-KINASE TRIPTIC PEPTIDES

A MAP2-quinase foi purificada a partir de células Rat 1 HIRc B tratadas com insulina (Boulton et al., 1990, Biochem., 30:278-286), digerida com tripsina e os péptidos resultantes submetidos a HPLC (Abersold et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:MAP2 kinase was purified from insulin-treated Rat 1 HIRc B cells (Boulton et al., 1990, Biochem., 30: 278-286), digested with trypsin and the resulting peptides subjected to HPLC (Abersold et al. , 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:

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:6970-6974). Os péptidos de um dos picos resultantes, foram submetidos a uma segunda separação cromatográfica. A sequência de aminoácidos foi obtida a partir de sete picos distintos. Um dos picos continha uma mistura de três péptidos, com um componente principal e dois secundários; a sequência do péptido principal foi determinada com base na sua recolha, mas a atribuição dos aminoácidos dos componentes secundários à sua sequência peptídica foi determinada com base na sequência de ADNc (ver a seguir).: 6970-6974). The peptides from one of the resulting peaks were subjected to a second chromatographic separation. The amino acid sequence was obtained from seven different peaks. One of the peaks contained a mixture of three peptides, with one major and two minor components; the sequence of the main peptide was determined based on its collection, but the attribution of the amino acids of the secondary components to its peptide sequence was determined based on the cDNA sequence (see below).

6.1.3. CLONAGEM DUM FRAGMENTO AMPLIFICADO DO ADNc6.1.3. CLONING OF AN AMPLIFIED cDNA FRAGMENT

DA MAP2-QUINASEMAP2-KINASE

Sintetizou-se uma série de oligonucleótidos degenerados que correspondiam às cadeias codificadoras e anticodificadoras dos fragmentos das sequências dos péptidos trípticos obtidos. Os oligonucleótidos continham caudas não degeneradas nas suas extremidades 5^Z; a cauda de cada cadeia oligonucleotídica codificadora tinha um local de restrição de EcoRI, enquanto a cauda de cada cadeia oligonucleotídica anticodificadora continha um local de restrição Sall. Cada cadeia oligonucleotídica codificadora foi combinada com cada cadeia oligonucleotídica anticodificadora em reacções individuais de PCR, utilizando ADN genómico de ratazana ou ADNc de células Rat 1 como molde; as reacções de PCR e a preparação dos moldes de ADNc e genómico foram efectuados como descrito por Maisonpierre et al. (1990, Science 247:1446-1451) e Yancopoulos e Alt (1990, Methods for Cloning and Analysis of Eucariotyc Genes”, Jones and Bartlett, Boston, MA). 0 produto amplificado obtido utilizando o oligonucleótido codificador QYIGEG e o oligonucleótido anticodificador DLKPSN (designada QYDL) foi isolado utilizando uma coluna de rotação Sephadex G-50, digerido com EcoRI e Sall, purificado por Nusieve a 2%, (FMC Bioproducts), e subclonado no vector pGEM4Z (Promega).A series of degenerate oligonucleotides were synthesized which corresponded to the coding and anti-coding chains of the fragments of the obtained triptych peptide sequences. The oligonucleotides contained non-degenerate tails at their 5 ^Z ends; the tail of each coding oligonucleotide chain had an EcoRI restriction site, while the tail of each anti-coding oligonucleotide chain contained a SalI restriction site. Each coding oligonucleotide chain was combined with each anti-coding oligonucleotide chain in individual PCR reactions, using rat genomic DNA or Rat 1 cell cDNA as a template; PCR reactions and the preparation of cDNA and genomic templates were carried out as described by Maisonpierre et al. (1990, Science 247: 1446-1451) and Yancopoulos and Alt (1990, Methods for Cloning and Analysis of Eucariotyc Genes ”, Jones and Bartlett, Boston, MA). The amplified product obtained using the QYIGEG encoding oligonucleotide and the DLKPSN anti-encoding oligonucleotide (designated QYDL) was isolated using a Sephadex G-50 rotation column, digested with EcoRI and Sal, purified by 2% Nusieve, (FMC Bioproducts), and subcloned in the pGEM4Z vector (Promega).

6.1.4. SELECÇÃO DA BIBLIOTECA DE ADNc6.1.4. SELECTION OF THE cDNA LIBRARY

Pesquisaram-se 600 000 placas de uma biblioteca de ADNc de cérebro de ratazana construída no vector Lambda Zap 2 (Stratagene) utilizando como sonda o produto de PCR QYDL subclonado; a sonda foi marcada radioactivamente utilizando um protocolo com base na PCR, descrito por Maisonpierre et al.. As600,000 plates of a rat brain cDNA library constructed in the Lambda Zap 2 vector (Stratagene) were screened using the subcloned QYDL PCR product as a probe; the probe was radioactively labeled using a PCR-based protocol, described by Maisonpierre et al.

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condições de hibridação foram descritas por Maisonpierre et al.; depois da hibridação, os filtros foram primeiro lavados com baixo rigor (2 x SSC, SDS a 0,1% a 60 °C) e depois com alto rigor (0,2 x SSC a 0,1% a 68°C).hybridization conditions have been described by Maisonpierre et al .; after hybridization, the filters were first washed with low rigor (2 x SSC, 0.1% SDS at 60 ° C) and then with high rigor (0.2 x 0.1% SSC at 68 ° C).

6.1.5. SEQUENCIAÇÃO DO ADN6.1.5. DNA SEQUENCING

A sequenciação foi efectuada utilizando o método de terminação da cadeia com dideoxinucleótido (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74.:5463-5467), com o conjunto Sequenase (versão 2,0) e com os protocolos recomendados (U.S. Biochemical). Toda a sequência foi verificada por sequenciação de ambas as cadeias de ADN, utilizando oligonucleótidos apropriados correspondentes à sequência da MAP2-quinase ou à sequência flanqueadora do plasmídeo.Sequencing was carried out using the dideoxynucleotide chain termination method (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74.:53463-5467), with the Sequenase set (version 2.0) and with recommended protocols (US Biochemical). The entire sequence was verified by sequencing both DNA strands, using appropriate oligonucleotides corresponding to the MAP2 kinase sequence or the plasmid flanking sequence.

6.1.6. ANÁLISE DE NORTHERN isolamento do ARN, a transferência de Northern e a hibridação com sondas marcadas, foram efectuados como descrito por Maisonpierre et al. (1990, Science 247:1446-1451).6.1.6. NORTHERN ANALYSIS RNA isolation, Northern blot and hybridization with labeled probes were performed as described by Maisonpierre et al. (1990, Science 247: 1446-1451).

6.2. RESULTADOS6.2. RESULTS

A MAP2-quinase purificada, isolada a partir de células Rat 1 HIRc B tratadas com insulina, consiste numa banda principal de M_r=43000. A electroforese em gel de poliacrilamida SDS das fraeções finais da Q Sepharose #2, isoladas a partir de células PC12 de controlo ou tratadas com NGF, indica que a purificação da MAP2-quinase a partir das células PC12, parece processar-se em condições semelhantes à purificação das MAP2-quinases com origem em células Rat 1 HIRc B tratadas com insulina (Figura 2A.). Após a clivagem com tripsina, as sequências de aminoácidos de sete dos péptidos trípticos foram obtidas da banda de 43 kD; estes péptidos encontram-se sublinhados na FIGURA 2. Nenhum dos péptidos está contido nas proteínas da base de dados Genbank. No entanto as sequências consensuais, características das proteínas quinases de serina/treonina (Hanks et al., 1988, Science 241:42-52). GEGAYG (parte do local de ligação do nucleótido) e DLKPSN foram encontradas entre os péptidos trípticos isolados desta proteína.Purified MAP2 kinase, isolated from insulin-treated Rat 1 HIRc B cells, consists of a major band of M _r = 43000. SDS polyacrylamide gel electrophoresis of the final Q Sepharose # 2 fractions, isolated from control PC12 cells or treated with NGF, indicates that purification of MAP2 kinase from PC12 cells appears to be under similar conditions to the purification of MAP2-kinases from Rat 1 HIRc B cells treated with insulin (Figure 2A.). After trypsin cleavage, the amino acid sequences of seven of the triptych peptides were obtained from the 43 kD band; these peptides are underlined in FIGURE 2. None of the peptides are contained in the proteins of the Genbank database. However, consensus sequences, characteristic of serine / threonine protein kinases (Hanks et al., 1988, Science 241: 42-52). GEGAYG (part of the nucleotide binding site) and DLKPSN were found among the triptych peptides isolated from this protein.

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Oligonucleótidos degenerados correspondentes a várias regiões diferentes da sequência de aminoácidos resultante foram utilizados em reacções de PCR. Os oligonucleótidos correspondentes aos segmentos dos péptidos que contêm as sequências conservadas GEGAYG e DLKPSN, resultaram nos segmentos mais fortemente produzidos, em fragmentos amplificados com tamanho esperado, utilizando moldes de ADNc preparados a partir de fibroblastos Rat 1. Baseado nas homologias com outras proteína-quinases, assumiu-se que a sequência GEGAYG está mais próxima do terminal N da proteína e a DLKPSN está mais próxima do terminal C da proteína. Estas sequências estão separadas por cerca de 120 aminoácidos na maioria das proteína-quinases. As reacções de PCR utilizando o oligonucleótido degenerado que codifica os aminoácidos QYIGEG (SEQ ID N^a . 7) (5^/-TTCTAGAATTCCA(A,G)TA(C,T)AT(A,T,C)GG(A,T,C,G)GA(A,G)GG-3^z, SEQ ID N^s. 8) e o oligonucleótido degenerado correspondente à cadeia anticodificadora para os aminoácidos DLKPSN (SEQ ID N^B. 9) (5'-TTCTCGAGTCGAC(A,G)TT(A,T,C,G)GA(A,T,C,G)GG(C,T)TT(A,T,C,G)A(A,G)A,G)TC-3', SEQ ID N^a. 10) produziram um produto amplificado de aproximadamente 360 bp. 0 produto de PCR foi subclonado e sequenciado para confirmar a sua identidade como uma nova proteína-quinase. 0 produto de PCR foi então usado como uma sonda para a selecção na biblioteca de ADNc de cérebro de ratazana. Um único clone que hibridava com alto rigor foi isolado; este clone contém uma inserção de 1,9 kb. A análise por transferência de Northern, revelou uma banda correspondente a um ARNm de 1,9 kb, indicando que a inserção correspondia a um clone de comprimento total.Degenerate oligonucleotides corresponding to several different regions of the resulting amino acid sequence were used in PCR reactions. The oligonucleotides corresponding to the segments of the peptides containing the conserved GEGAYG and DLKPSN sequences, resulted in the most strongly produced segments, in amplified fragments of expected size, using cDNA templates prepared from Rat 1 fibroblasts. Based on homologies with other protein kinases , it was assumed that the GEGAYG sequence is closer to the N-terminus of the protein and DLKPSN is closer to the C-terminus of the protein. These sequences are separated by about 120 amino acids in most protein kinases. PCR reactions using degenerate oligonucleotide encoding QYIGEG amino acids (SEQ ID NO ^a. 7) (5 ^/ -TTCTAGAATTCCA (A, G) TA (C T) AT (A, T, C) GG (A, T , C, G) GA (A, G) GG-3 ^z , SEQ ID N ^s . 8) and the degenerate oligonucleotide corresponding to the anti-encoding chain for the DLKPSN amino acids (SEQ ID N ^B. 9) (5'-TTCTCGAGTCGAC (A , G) TT (A, T, C, G) GA (A, T, C, G) GG (C, T) TT (A, T, C, G) A (A, G) A, G) TC -3 ', SEQ ID NO ^a . 10) produced an amplified product of approximately 360 bp. The PCR product was subcloned and sequenced to confirm its identity as a new protein kinase. The PCR product was then used as a probe for selection in the rat brain cDNA library. A single clone that hybridized with high rigor was isolated; this clone contains a 1.9 kb insert. Northern blot analysis revealed a band corresponding to a 1.9 kb mRNA, indicating that the insert corresponded to a full-length clone.

A inserção de ADNc tem uma única e longa estrutura de leitura que podia codificar uma proteína de pelo menos 367 resíduos com uma M_r maior ou igual a 42 000; ela contém a sequência primária de sete dos péptidos trípticos isolados a partir de MAP2-quinase estimulada pela insulina. Adicionalmente, a sequência exacta de dois péptidos adicionais de uma sequência mista é encontrada no ADNc traduzido. Em conjunto estes péptidos trípticos consistem em 115 resíduos, estando todos eles de acordo com a sequência do ADNc traduzido, representando maisThe cDNA insert has a single long reading frame that could encode a protein of at least 367 residues with an M _r greater than or equal to 42,000; it contains the primary sequence of seven of the triptych peptides isolated from insulin-stimulated MAP2 kinase. In addition, the exact sequence of two additional peptides from a mixed sequence is found in the translated cDNA. Together these triptych peptides consist of 115 residues, all of which are in accordance with the translated cDNA sequence, representing more

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do que 31% do suposto produto de transcrição. A correspondência exacta entre a sequência dos péptidos trípticos extensiva e o produto de tradução previsto, proporciona uma evidência substancial de que o ADNc codifica a MAP2-quinase estimulada pela insulina. Designámos o gene ERKl, para quinase-l regulada por sinal extracelular”.than 31% of the alleged transcription product. The exact match between the extensive triptych peptide sequence and the predicted translation product, provides substantial evidence that the cDNA encodes insulin-stimulated MAP2-kinase. We designated the ERKl gene, for kinase-l regulated by extracellular signal ”.

ERKl contém os 15 resíduos invariáveis encontrados em todas as proteína-quinases; apresenta também homologias substanciais com todos os subdomínios definidos por Hanks et al., 1988, Science 241:42-52). e contém resíduos caracteristicos de proteínas serina/treonina-quinases. A comparação com outras proteína-quinases revela semelhanças impressionantes entre a MAP2-quinase e as proteína-quinases KSS1 (Courchesne et al., 1989, cell 58:1107-1119) e FUS3 (Ellion et al., Cell 60:649-664) recentemente isoladas de leveduras. Ver infra e a FIGURA 4. A ERKl-quinase é idêntica em 56% a KSSl e idêntica em 56% a FUS3. A KSSl e FUS3 apresentara aproximadamente o mesmo grau de semelhança (57%) uma com a outra e com a MAP2-quinase; elas são todas significativamente menos homólogas com outras quinases do que o são uma com a outra. Todas as três compartilham a maior parte das suas homologias mais importantes com a subfamília de quinases CDC28/cdc²⁺ (a ERKl-quinase é idêntica em 41% a esta quinase). No entanto, KSSl, FUS3 e MAP2-quinase não possuem a sequência VPSTAIR que se encontra no subdomínio III de todas as homólogas funcionais CDC28. Além disso, todas estas três quinases também compartilham as extensões do terminal C que não se encontram nas CDC28/cdc²⁺ quinases. Ao contrário das FUS3 e KSSl quinases, a MAP2-quinase contém uma extensão N-terminal significativa de pelo menos 17 aminoácidos.ERKl contains the 15 invariant residues found in all protein kinases; it also presents substantial homologies with all the subdomains defined by Hanks et al., 1988, Science 241: 42-52). and contains characteristic residues of serine / threonine kinase proteins. Comparison with other protein kinases reveals striking similarities between MAP2 kinase and protein kinases KSS1 (Courchesne et al., 1989, cell 58: 1107-1119) and FUS3 (Ellion et al., Cell 60: 649-664 ) recently isolated from yeasts. See below and FIGURE 4. ERKl-kinase is 56% identical to KSSl and 56% identical to FUS3. KSSl and FUS3 had approximately the same degree of similarity (57%) with each other and with MAP2-kinase; they are all significantly less homologous with other kinases than they are with each other. All three share most of their most important homologies with the CDC28 / cdc ²⁺ kinase subfamily (ERKl-kinase is 41% identical to this kinase). However, KSSl, FUS3 and MAP2-kinase do not have the VPSTAIR sequence that is found in subdomain III of all CDC28 functional homologues. In addition, all three of these kinases also share C-terminal extensions that are not found on CDC28 / cdc ²⁺ kinases. Unlike FUS3 and KSS1 kinases, MAP2-kinase contains a significant N-terminal extension of at least 17 amino acids.

A ERKl difere também dos homólogos das leveduras no terminal C e entre os motivos DGF e APE dos subdomínios VII e VIII, que contêm inserções de diferentes comprimentos com resíduos fosforiláveis (ex.: Thr-238 e Thr-242 em ERKl). Ambas as regiões fracamente conservadas entre as quinases de leveduras têm estado implicadas na determinação de características funcionais únicas das quinases individuais. Num certo número de quinases o segmentoERKl also differs from yeast counterparts at the C-terminal and between the DGF and APE motifs in subdomains VII and VIII, which contain inserts of different lengths with phosphorylatable residues (eg Thr-238 and Thr-242 in ERKl). Both poorly conserved regions among yeast kinases have been implicated in determining the unique functional characteristics of individual kinases. In a number of kinases the segment

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residente entre os subdomínios VII e VIII é autofosforilado de uma forma que influência a actividade enzimática (ex.: o receptor para a insulina das proteínas quinases dependente do AMPc). A conservação entre quinases pode também revelar resíduos funcionalmente importantes. Existe uma tirosina conservada no subdomínio 1, cuja fosforilação em CDC28 se sabe inibir a actividade da proteína quinase. Próximo do terminal C da proteína existe uma sequência (resíduos 367-379) que merece particular atenção como local potencial de fosforilação da tirosina devido a interessantes semelhanças com a região reguladora autofosforilada do receptor para a insulina. Três resíduos de tirosina estão localizados nesta região e espaçados identicamente aos do receptor (YX₃YY); quatro resíduos ácidos, determinantes importantes para o reconhecimento pelas proteínas tirosinas quinases, estão nas proximidades, A presença de sequências semelhantes ao local de fosforilação do receptor da insulina é consistente com evidências que sugerem que a ERK1 (MAP2-quinase) pode ser um substrato para o receptor da insulina.resident between subdomains VII and VIII is autophosphorylated in a way that influences enzyme activity (eg, the cAMP-dependent insulin receptor for protein kinases). Conservation between kinases can also reveal functionally important residues. There is a conserved tyrosine in subdomain 1, whose phosphorylation in CDC28 is known to inhibit protein kinase activity. Near the C-terminus of the protein is a sequence (residues 367-379) that deserves particular attention as a potential site of tyrosine phosphorylation due to interesting similarities with the autophosphorylated regulatory region of the insulin receptor. Three tyrosine residues are located in this region and spaced identically to those of the receptor (YX ₃ YY); four acid residues, important determinants for recognition by protein tyrosine kinases, are nearby. The presence of sequences similar to the phosphorylation site of the insulin receptor is consistent with evidence suggesting that ERK1 (MAP2-kinase) may be a substrate for the insulin receptor.

6.2.1. DISTRIBUIÇÃO TISSULAR E INDUCIBILIDADE DO TRANSCRITO DA MAP2-QUINASE6.2.1. TISSULAR DISTRIBUTION AND INDUCIBILITY OF THE MAP2-KINASE TRANSCRIPT

Uma sonda feita a partir de ADNc de MAP2-quinase identifica um único transcrito de 1,9 kb por análise de transferência de Northern, indicando que o nosso clone de ADNc representa a quase totalidade do comprimento do transcrito. 0 transcrito da MAP2-quinase é detectado em todos os tecidos e linhas celulares examinadas. Curiosamente, o transcrito é expresso em altos níveis (de 3 a 6 vezes) no sistema nervoso central, em comparação com outros tecidos examinados. A abundância de transcritos de MAP2-quinase em cérebro de ratazana adulta foi estimada em cerca de 0,0005% por pesquisa de 10⁶ fagos de uma biblioteca de ADNc de cérebro de ratazana com alto rigor. 0 transcrito é claramente detectável nos fibroblastos Rat 1 e nas linhas celulares PC12, expressando ambos MAP2-quinase fortemente activável.A probe made from MAP2 kinase cDNA identifies a single 1.9 kb transcript by Northern blot analysis, indicating that our cDNA clone represents almost the entire length of the transcript. The MAP2 kinase transcript is detected in all tissues and cell lines examined. Interestingly, the transcript is expressed at high levels (3 to 6 times) in the central nervous system, compared to other tissues examined. The abundance of MAP2 kinase transcripts in adult rat brain was estimated to be about 0.0005% by screening 10 ⁶ phages from a rat brain cDNA library with high accuracy. The transcript is clearly detectable in Rat 1 fibroblasts and PC12 cell lines, both expressing strongly activable MAP2-kinase.

6.3. DISCUSSÃO6.3. DISCUSSION

A sequência de aminoácidos foi obtida a partir de péptidos trípticos isolados da proteína MAP2-quinase purificada 6 000 ve72 686The amino acid sequence was obtained from tryptic peptides isolated from the purified MAP2-kinase protein 6,000 ve72 686

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zes, a partir de fibroblastos de ratazana estimulados com insulina. A sequência foi utilizada para conceber oligonucleótidos degenerados que levaram à clonagem molecular de ADNc de 1,9 kb, através de uma estratégia baseada em PCR. O ADNc prevê uma proteína com uma massa molecular maior ou igual a 42 000, designada ERK1, que contém sequências consistentes com todas as sequências de péptidos trípticos obtidos a partir de MAP2-quinase purificada, e responsável por mais de 31% da sequência primária da proteína. Assim, este ADNc parece codificar a MAP2-quinase estimulada pela insulina.from rat fibroblasts stimulated with insulin. The sequence was used to design degenerate oligonucleotides that led to the molecular cloning of 1.9 kb cDNA, through a PCR-based strategy. The cDNA predicts a protein with a molecular mass greater than or equal to 42,000, called ERK1, which contains sequences consistent with all the tryptic peptide sequences obtained from purified MAP2-kinase, and responsible for more than 31% of the primary sequence of protein. Thus, this cDNA appears to encode insulin-stimulated MAP2 kinase.

Muitas proteína-quinases fosforilam a MAP2 (Aklyma et al., 1986, J. Biol. Chem, 261:14797-14803; Akiyama et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:15648-15651; Hernandez et al., 1987, J. Neurochem. 48:84-93). A MAP2-quinase aqui clonada molecularmente, distingue-se pela sua rápida activação pela insulina (Boulton et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:2713-2719? Ray et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 84:1502-1506; Ray et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:3753-3757; Ray et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:12721-12727; Hoshi et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:5396-5401; Sturgill et al., 1988, Nature 334:715-718; Anderson et al., 1990, Nature 343:651-653). Embora as funções fisiológicas desta enzima não sejam conhecidas, o seu papel na regulação da fosforilação de S6 foi proposta, depois de ter sido mostrado que a MAP2-quinase fosforila e activa a S6-quinase II, purificada a partir de Xenopus laevis (Sturgill et al., 1988, Nature 343:715-718). tal como S6 quinase de fígado de coelho (Gregory et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:18397-18401). O envolvimento da MAP2-quinase em mecanismos de sinal é indicado adicionalmente pela presença da fosfotirosina na quinase (Ray et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:3753-3757; Boulton et al., 1991, Biochem. 30.:278-186; Boulton et al., May 1991, Cell). Apesar de não se ter mostrado que o receptor da insulina catalisa esta fosforilação, o facto de que a desfosforilação dos resíduos de tirosina diminui a actividade (Anderson et al., 1990, Nature 343:651-653; Boulton and Cobb, May 1991, in Cell Regulation, Vol. II) apoia a impressão de que a MAP2-quinase actua numa fase precoce do mecanismo de transdução de sinal, e é, porMany protein kinases phosphorylate MAP2 (Aklyma et al., 1986, J. Biol. Chem, 261: 14797-14803; Akiyama et al., 1986, J. Biol. Chem. 261: 15648-15651; Hernandez et al. , 1987, J. Neurochem. 48: 84-93). MAP2-kinase here molecularly cloned, is distinguished by its rapid activation by insulin (Boulton et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 2713-2719? Ray et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1502-1506; Ray et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3753-3757; Ray et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 12721-12727; Hoshi et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 5396-5401; Sturgill et al., 1988, Nature 334: 715-718; Anderson et al., 1990, Nature 343: 651-653). Although the physiological functions of this enzyme are not known, its role in regulating S6 phosphorylation has been proposed, after MAP2-kinase has been shown to phosphorylate and activate S6-kinase II, purified from Xenopus laevis (Sturgill et al., 1988, Nature 343: 715-718). such as rabbit liver S6 kinase (Gregory et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 18397-18401). MAP2 kinase involvement in signal mechanisms is further indicated by the presence of phosphotyrosine in the kinase (Ray et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3753-3757; Boulton et al., 1991, Biochem 30.:278-186; Boulton et al., May 1991, Cell). Although the insulin receptor has not been shown to catalyze this phosphorylation, the fact that dephosphorylation of tyrosine residues decreases activity (Anderson et al., 1990, Nature 343: 651-653; Boulton and Cobb, May 1991, in Cell Regulation, Vol. II) supports the impression that MAP2-kinase acts at an early stage of the signal transduction mechanism, and is therefore

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consequência, talvez requlada directamente pelo receptor da insulina. Evidência adicional indicando um papel para esta quinase na sinalização de numerosos agentes é conseguida pela indicação de que a MAP2-quinase pode ser a pp42 (Rossomando et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:6940-6943). uma proteína cujo teor em fosfotirosina aumenta após a transformação por vírus e exposição a factores de crescimento (Cooper et al., 1981, Mol. Cell. Biol. X: 165-178). A MAP2-quinase ou uma enzima com ela muito relacionada, é também activada por uma variedade de agentes que promovem a diferenciação ou expressão de funções diferenciadas, mas não a proliferação celular (Boulton et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:2713-2719; Ray et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 84:1502-1506; Ray et al., 1988, Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 85.:3753-3757; Ray et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:12721-12727 : Hoshi et al. , 1988 , J. Biol. Chem. 263:5396-5401; Ely et al., 1990, J. Cell Biol. 110:731-742; Volonte et al., 1989, J. Cell Biol. 109:2395-2403: Miyasaka et al., 1990 , J. Biol. Chem. 265 : 4730-4735). Por exemplo, purificámos recentemente uma MAP2-quinase estimulada por um factor de crescimento do nervo, a partir de células PC12 até quase à homogeneidade, pelo mesmo processo desenvolvido para a purificação da enzima estimulada pela insulina. Esta enzima, por SDS-PAGE, apresenta o mesmo tamanho da quinase estimulada pela insulina. Além disso, a actividade tem propriedades comuns com a da MAP-quinase activada pelo factor de crescimento do nervo, descrito por Greene e colaboradores (Volonte et al., 1989, J. Cell Biol. 109:2395-2403 and Miyasaka et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:4730-4735).consequence, perhaps directly claimed by the insulin receptor. Additional evidence indicating a role for this kinase in signaling numerous agents is achieved by indicating that MAP2-kinase may be pp42 (Rossomando et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6940-6943) . a protein whose phosphotyrosine content increases after virus transformation and exposure to growth factors (Cooper et al., 1981, Mol. Cell. Biol. X: 165-178). MAP2 kinase, or an enzyme closely related to it, is also activated by a variety of agents that promote differentiation or expression of differentiated functions, but not cell proliferation (Boulton et al., 1990, J. Biol. Chem. 265 : 2713-2719; Ray et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1502-1506; Ray et al., 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85.:3753-3757; Ray et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 12721-12727: Hoshi et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 5396-5401; Ely et al., 1990, J. Cell Biol. 110: 731-742; Volonte et al., 1989, J. Cell Biol. 109: 2395-2403: Miyasaka et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 4730-4735). For example, we recently purified a MAP2-kinase stimulated by a nerve growth factor, from PC12 cells to almost homogeneity, by the same process developed for the purification of the enzyme stimulated by insulin. This enzyme, by SDS-PAGE, has the same size as the insulin-stimulated kinase. In addition, the activity has properties common to that of MAP kinase activated by nerve growth factor, described by Greene et al. (Volonte et al., 1989, J. Cell Biol. 109: 2395-2403 and Miyasaka et al. , 1990, J. Biol. Chem. 265: 4730-4735).

A dramática homologia entre ERK1 e as duas quinases de levedura, KSS1 e FUS3, é consistente com um papel crítico e evolucionariamente conservado para esta nova família de quinases, na medição da resposta a sinais extracelulares. As quinases de leveduras desempenham papéis antagonistas na regulação do ciclo celular de leveduras em resposta aos factores de cruzamento, as únicas hormonas péptidas que se sabe mediarem a comunicação intercelular nas leveduras. Ambas as quinases parecem actuar por ajustamento fino da actividade de CDC28, uma proteínaThe dramatic homology between ERK1 and the two yeast kinases, KSS1 and FUS3, is consistent with a critical and evolutionarily preserved role for this new family of kinases, in measuring the response to extracellular signals. Yeast kinases play antagonistic roles in regulating the yeast cell cycle in response to crossing factors, the only peptide hormones known to mediate intercellular communication in yeasts. Both kinases appear to work by fine-tuning the activity of CDC28, a protein

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-4472 686 serina/treonina-quinase relacionada, que é o regulador indispensável do ciclo mitótico, provavelmente por interacção com uma ciclina de levedura. Aparentemente a FUS3 possui dois papéis de regulação. Parece ser importante na condução da suspensão do ciclo celular em Gl, induzido pela ferormona, direetamente pela inibição da activação da CDC28 ou pela promoção da inactivação de uma ciclina requerida para activar a CDC28; a activação de FUS3 por ferormonas promove também, independentemente, funções de cruzamento específicas. Ao contrário, a KSS1 promove a reentrada no ciclo celular seguindo a suspensão do ciclo celular induzida por ferormonas; a KSS1 pode funcionar por activação da mesma ciclina que a FUS3 pode inactivar. Aparentemente a ERK1 representa um paralelo nos mamíferos, talvez funcional e evolucionariamente, em relação às quinase das leveduras. Assim, a ERK1 pode actuar por mecanismos semelhantes para regular o ciclo celular em resposta a uma variedade de sinais extracelulares. Tal como a FUS3, a ERK1 aparentemente também desempenha um papel regulador nas respostas que não envolvam direetamente o ciclo celular. A dramática homologia entre ERK1 e as quinases de levedura levanta a possibilidade de as leveduras poderem proporcionar um sistema experimental útil em que se introduza a ERK1 para a análise da sua função.-4472 686 related serine / threonine kinase, which is the indispensable regulator of the mitotic cycle, probably by interaction with a yeast cyclin. Apparently, FUS3 has two regulatory roles. It appears to be important in driving the cell cycle suspension in G1, induced by the pheromone, directly by inhibiting the activation of CDC28 or by promoting the inactivation of a cyclin required to activate CDC28; the activation of FUS3 by pheromones also independently promotes specific crossing functions. On the contrary, KSS1 promotes reentry into the cell cycle following the cell cycle suspension induced by pheromones; KSS1 can function by activating the same cyclin that FUS3 can inactivate. Apparently ERK1 represents a parallel in mammals, perhaps functionally and evolutionarily, in relation to yeast kinase. Thus, ERK1 can act by similar mechanisms to regulate the cell cycle in response to a variety of extracellular signals. Like FUS3, ERK1 also apparently plays a regulatory role in responses that do not directly involve the cell cycle. The dramatic homology between ERK1 and yeast kinases raises the possibility that yeasts can provide a useful experimental system in which to introduce ERK1 for the analysis of its function.

A actividade da MAP2-quinase, ou semelhante MAP2-quinase, é incrementada em muitos tipos diferentes de células em resposta a uma vasta variedade de estímulos. No decorrer da clonagem de ERK1, também clonámos molecularmente outras quinases relacionadas. A identificação de uma família de enzimas de mamífero relacionadas com as MAP2-quinases e que são homólogos estruturais das KSS1 e FUS3 quinases de levedura, sugere que os eucariotas multicelulares superiores, têm as suas quinases apropriadas, originalmente utilizadas para detectar perturbações do meio ambiental por organismos unicelulares, para mediar as respostas aos sinais extracelulares. A clonagem molecular desta família de proteínas relacionadas com a MAP quinase facilita o esclarecimento dos mecanismos de regulação deste grupo de enzimas e estudo dos seus papéis fisiológicos.The activity of MAP2-kinase, or similar MAP2-kinase, is increased in many different types of cells in response to a wide variety of stimuli. In the course of ERK1 cloning, we also molecularly cloned other related kinases. The identification of a family of mammalian enzymes related to MAP2-kinases and which are structural homologues of yeast KSS1 and FUS3 kinases, suggests that higher multicellular eukaryotes have their appropriate kinases, originally used to detect environmental disturbances by unicellular organisms, to mediate responses to extracellular signals. The molecular cloning of this family of proteins related to MAP kinase facilitates the clarification of the regulatory mechanisms of this group of enzymes and the study of their physiological roles.

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7. EXEMPLO: ERK, UMA FAMÍLIA DE PROTEÍNAS SERINA/7. EXAMPLE: ERK, A FAMILY OF SERINE PROTEINS /

ZTREONINA-QUINÃSES QUE SÃO ACTIVADAS E FOSFORILADAS NAZTREONIN-KINESES THAT ARE ACTIVATED AND PHOSPHORILLATED IN THE

TIROSINA EM RESPOSTA À INSULINA E AO NGFTYROSINE IN RESPONSE TO INSULIN AND NGF

7.1. MATERIAIS E MÉTODOS7.1. MATERIALS AND METHODS

7.1.1. ISOLAMENTO E ANÁLISE DA SEQUÊNCIA DE NOVOS GENES DE ERK7.1.1. ISOLATION AND ANALYSIS OF THE SEQUENCE OF NEW ERK GENES

A sonda QYDL descrita em Boulton et al. (1990, Science 249:64-671 foi utilizada para pesquisar a biblioteca de ADNc de cérebro de ratazana, construída no vector Lambda Zap II (Stratagene), assim como a biblioteca de ADN genómico de ratazana, derivada de ADN de fígado de ratazana (Sprague-Dawley) parcialmente digerido com a endonuclease de restrição Sau3A e depois clonado no vector do bacteriofago EMBL3/SP6/T7 (Clontech). Após a hibridação (Maisonpierre et al., 1990a, Science 247:1446-1451). os clones fágicos ERK2 e ERK3 foram identificados (e eventualmente purificados) por lavagem dos filtros da biblioteca utilizando um baixo rigor normal (citrato de sódio 20 mM, pH 7,0, NaCl 0,15, dodecilsulfato de sódio a 0,1% (SDS), a 60°C). As inserções nos clones fágicos foram subclonadas no plasmídeo Bluescript2 (Stratagene) e caracterizados por análise da sequência de ADN utilizando o método de terminação da cadeia com dideoxinucleótido (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74.:5463-6467), com a versão 2,0 do conjunto Sequenase e com os protocolos recomendados (U.S. Biochemical).The QYDL probe described in Boulton et al. (1990, Science 249: 64-671 was used to screen the rat brain cDNA library, built on the Lambda Zap II vector (Stratagene), as well as the rat genomic DNA library, derived from rat liver DNA ( Sprague-Dawley) partially digested with the restriction endonuclease Sau3A and then cloned into the bacteriophage vector EMBL3 / SP6 / T7 (Clontech), after hybridization (Maisonpierre et al., 1990a, Science 247: 1446-1451). ERK2 and ERK3 were identified (and eventually purified) by washing the filters in the library using a low normal stringency (20 mM sodium citrate, pH 7.0, 0.15 NaCl, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), at 60 ° C) The inserts in the phage clones were subcloned into the plasmid Bluescript2 (Stratagene) and characterized by DNA sequence analysis using the dideoxynucleotide chain termination method (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. USA 74.:53463-6467), with version the Sequenase 2.0 assembly and the recommended protocols (U.S. Biochemical).

7.1.2. PRODUÇÃO DAS SONDAS ESPECÍFICAS PARA ERK7.1.2. PRODUCTION OF SPECIFIC PROBES FOR ERK

Os oligonucleótidos (17 bases) correspondentes às sequências de ADN laterais das regiões N-terminais relativamente não conservadas de ERK1 (aminoácidos 5-67), de ERK2 (aminoácidos 14-138) e de ERK3 (aminoácidos 11-105), foram utilizados para amplificar precisamente estas regiões codificadoras a partir de plasmídeos contendo cada uma das inserções de ADNc de ERK. As regiões de codificação N-terminais foram utilizadas porque elas eram as regiões menos homólogas entre estas três ERK. As amplificações por reacção em cadeia de polimerase (PCR) foram também efectuadas com cada par destes iniciadores, utilizando o ADNc de cérebro de ratazana ou o ADN genómico de ratazana como molde. Cada uma destas amplificações resultou em fragmentosOligonucleotides (17 bases) corresponding to the side DNA sequences of the relatively unconserved N-terminal regions of ERK1 (amino acids 5-67), ERK2 (amino acids 14-138) and ERK3 (amino acids 11-105), were used to precisely amplify these coding regions from plasmids containing each of the ERK cDNA inserts. The N-terminal coding regions were used because they were the least homologous regions among these three ERKs. Polymerase chain reaction (PCR) amplifications were also performed with each pair of these primers, using rat brain cDNA or rat genomic DNA as a template. Each of these amplifications resulted in fragments

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indistinguíveis tanto no caso de ser utilizado o ADN genómico ou o ADNc, o que indica que estas sondas não possuem qualquer intrão no gene de ERK. Os três fragmentos amplificados a partir dos plasmídeos foram marcados radioactivamente, utilizando o método da reacçâo em cadeia de polimerase e hibridados com transferências de Southern contendo ADN genómico humano e de ratazana (como descrito em Maisonpierre et al., 1990, Science 247:1446-14511; os filtros foram hibridados com cada uma das sondas específicas para ERK marcadas radioactivamente, a 68°C na presença de fosfato de sódio 0,5 M, pH 7,0, albumina de soro bovino a 1% (fracção V, Sigma), SDS a 7%, EDTA 1 mM (Mahmoudi e Lin, 1989, Biothecniques 2:331-333) e 100 Mg/ml de ADN de esperma de salmão sonicado e desnaturado, sendo depois lavados a 68°C, tal como em Maisonpierre et al. (1990, Science 247:1446-1451) e submetidos a autoradiografia.indistinguishable whether genomic DNA or cDNA is used, which indicates that these probes have no intron in the ERK gene. The three fragments amplified from the plasmids were radiolabelled using the polymerase chain reaction method and hybridized with Southern blots containing human and rat genomic DNA (as described in Maisonpierre et al., 1990, Science 247: 1446- 14511; the filters were hybridized with each of the radiolabeled ERK-specific probes at 68 ° C in the presence of 0.5 M sodium phosphate, pH 7.0, 1% bovine serum albumin (fraction V, Sigma) , 7% SDS, 1 mM EDTA (Mahmoudi and Lin, 1989, Biothecniques 2: 331-333) and 100 Mg / ml sonicated and denatured salmon sperm DNA, then washed at 68 ° C, as in Maisonpierre et al. (1990, Science 247: 1446-1451) and submitted to autoradiography.

7.1.3. ANÁLISE POR TRANSFERÊNCIA DE NORTHERN7.1.3. NORTHERN TRANSFER ANALYSIS

As dissecações de tecidos e regiões cerebrais de ratazanas Sprague-Dawley (Harlan Sprague Dawley, Inc.) foram efectuadas como descrito em Maisonpierre et al., 1990, Neuron 5/501-509. As amostras dissecadas foram imediatamente congeladas em azoto líquido. Ratazanas grávidas com um determinado tempo foram utilizadas para obter tecidos embrionários, sendo o dia de positividade para o esperma designado por dia El; o dia do nascimento foi designado por PO. As ratazanas adultas (com 6-8 semanas de idade) pesavam em média 150 a 275 g. Os ARN totais foram isolados por homogeneização em Liei 3 M/ureia 6 M, como descrito em Bothwell et al., 1990, Preparation of DNA and RNA. In Methods for Cloning and Analysis of Eucariotyc Genes, Jones e Bartlett, Boston, MD, pp. 15-16. A electroforese em gel, a transferência capilar para membranas de nylon (MagnaGraph, Micro Separations, Inc.) a reticulação UV às membranas foram efectuadas como descrito por Maisonpierre et al., 1990, Neuron 5.: 501-509. Os filtros foram hibridados com as sondas específicas para ERK marcados radioactivamente e lavados como descrito na secção precedente. A coloração de triplicados de geles com brometo de etídio, mostrou que quantidades equivalentes de ARN total estavam a ser ensaiados (Maisonpierre et al., 1990, Science,Dissections of tissues and brain regions from Sprague-Dawley rats (Harlan Sprague Dawley, Inc.) were performed as described in Maisonpierre et al., 1990, Neuron 5 / 501-509. The dissected samples were immediately frozen in liquid nitrogen. Pregnant rats with a certain time were used to obtain embryonic tissues, the day of sperm positivity being called day El; the day of birth was designated as PO. Adult rats (6-8 weeks old) weighed an average of 150 to 275 g. Total RNAs were isolated by homogenization in 3 M Liei / 6 M urea, as described in Bothwell et al., 1990, Preparation of DNA and RNA. In Methods for Cloning and Analysis of Eucariotyc Genes, Jones and Bartlett, Boston, MD, pp. 15-16. Gel electrophoresis, capillary transfer to nylon membranes (MagnaGraph, Micro Separations, Inc.) and UV crosslinking to the membranes were performed as described by Maisonpierre et al., 1990, Neuron 5 .: 501-509. The filters were hybridized with radiolabeled ERK-specific probes and washed as described in the preceding section. Staining of gel triplicates with ethidium bromide showed that equivalent amounts of total RNA were being tested (Maisonpierre et al., 1990, Science,

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247;1446-1451) em cada transferência; este facto foi confirmado por hibridação de várias transferências com uma sonda para o ARNr 28S.247; 1446-1451) in each transfer; this was confirmed by hybridization of several transfers with a probe for the 28S RNA.

7.1.4. CULTURA DE CÉLULAS DE ASTRÓGLIA E7.1.4. CELL CULTURE OF ASTROLOGIA AND

EMBRIOCARCINOMAS P19EMBRYOCARCINOMAS P19

Para se obter células de astróglia purificadas, hipocampo de ratazanas recém-nascidas foram dissecadas, dissociadas e cultivadas em meio contendo soro (DMEM suplementado com soro bovino fetal a 10%). Aos 7² e 9^S dias da cultura os balões foram agitados vigorosamente de forma a remover as células não astrogliais. As astróglias foram então plaqueadas em placas de 100 mm e cultivadas durante 28 dias antes da preparação de ARN. 0 subclone S1801A1 do embriocarcinoma P19 (McBurney et al., 1982, Nature 2999:165-167) foi cultivado e induzido como descrito por Dinsmore e Solomon (1991, Cell 64.:817-826). O ARN foi preparado três dias após a indução.To obtain purified astroglia cells, the hippocampus of newborn rats were dissected, dissociated and cultured in serum-containing medium (DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum). After 7 days ^{2:09 S} culture flasks were vigorously shaken to remove non astroglial cells. The astroglia were then plated on 100 mm plates and cultured for 28 days before RNA preparation. The P1 embryocarcinoma subclone S1801A1 (McBurney et al., 1982, Nature 2999: 165-167) was cultured and induced as described by Dinsmore and Solomon (1991, Cell 64.:817-826). RNA was prepared three days after induction.

7.1.5. ESTIRPES BACTERIANAS E PLASMÍDEOS7.1.5. BACTERIAL AND PLASMID STYLES

A estirpe E. coli W3110 lacl^F, uma estirpe que sobreproduz o repressor do operão da lactose e o vector plasmídico pCPllO foram usados nos estudos descritos por Panayotatos (1988, Gene 74.:357-363). Os vectores foram manipulados para a expressão de ERK2, utilizando as reacçoes em cadeia de polimerase da maneira que se segue: o iniciador oligodesoxirribonucleótido sintético 5^Z (RAE-21) foi projectado de forma a conter um local único Sall imediatamente a seguir ao codão de iniciação ATG para a metionina, por alteração da sequência GTA-CGA (Val-Arg) em TCG-ACA (Ser-Thr). O iniciador 3^Z (RAE-22) incluía um local único EagI a seguir ao codão de terminação TAA. 0 vector de expressão pCPllO foi linearizado com Sall e EagI, e o fragmento resultante de 3652 pb foi purificado por electroforese em gel de agarose. 0 vector e o fragmento de PCR digerido e purificado de forma semelhante, foram ligados e transformados em E. coli W3110 lacl^F”. Os transformantes contendo o plasmídeo desejado foram seleccionados por mapeamento de restrição e confirmou-se por sequenciação do ADN que um candidato positivo (pRPN117), continha o gene na sua totalidade ligado ao sinal de iniciação deThe E. coli strain W3110 lacl ^ F, a strain that overproduces the lactose operon repressor and the plasmid vector pCP11O were used in the studies described by Panayotatos (1988, Gene 74.:357-363). The vectors were engineered for the expression of ERK2, using the polymerase chain reactions as follows: the synthetic 5 ^Z oligodeoxyribonucleotide primer (RAE-21) was designed to contain a single Sal site immediately after the codon of ATG initiation for methionine, by changing the sequence GTA-CGA (Val-Arg) in TCG-ACA (Ser-Thr). The 3 ^Z primer (RAE-22) included a unique EagI site following the TAA stop codon. The pCP11O expression vector was linearized with Sal and EagI, and the resulting 3652 bp fragment was purified by agarose gel electrophoresis. The vector and the similarly digested and purified PCR fragment were ligated and transformed into E. coli W3110 lacl ^ F ”. Transformants containing the desired plasmid were selected by restriction mapping and it was confirmed by DNA sequencing that a positive candidate (pRPN117) contained the gene in its entirety linked to the initiation signal of

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-48tradução na estrutura de leitura correcta.-48 translation into the correct reading structure.

pRPN125: este plasmídeo é idêntico ao pRPN117 excepto que os codões dos primeiros dois aminoácidos têm a sua sequência nativa restaurada. Isto foi conseguido com dois iniciadores internos de PCR que se alongaram ao longo das sequências alvo e transportavam as modificações desejadas, e dois iniciadores externos que serviram para amplificar o fragmento desejado. Duas reacções, cada uma contendo 1 μ% de pRPN117 com molde, foram efectuadas: uma contendo 5 gg do iniciador RAE-10 e 0,5 μ% do iniciador RAE-28, e a outra contendo 5 μ$ do iniciador RAE-22 e 0,5 μ% do iniciador RAE-27. Depois de 10 ciclos de PCR (cada um consistindo numa incubação durante 1 min. a 92°C, 2 min. a 55°C, 2 min. a 72°C), as duas amostras foram combinadas e submetidas a outros 25 ciclos (consistindo na incubação durante 1 min. a 94°C, 2 min. a 55’C, 4 min. a 74°C) no aparelho de ciclização-térmico de ADN. Porque iniciadores internos RAE-28 e RAE-27 são totalmente complementares um em relação ao outro, os produtos da primeira etapa das reacções PCR podem, subsequentemente, naturar-se. Além disso, na segunda etapa de reacções, a presença de concentrações substancialmente maiores dos iniciadores externos RAE-10 e RAE-22, leva à síntese de grandes quantidades do produto desejado. 0 produto da reacção final de PCR foi purificado por PAGE. Um fragmento de 3349 pb foi obtido por digestão do pRPN117 com Aat II e Eag I e purificação por electroforese em gel de agarose. Ambos os fragmentos foram ligados e transformados em E. coli W3110 lacl^F”. Os transformantes foram seleccionados por mapeamento de restrição para o plasmídeo desejado, e um dos candidatos positivos (pRPN125) foi ainda caracterizado por sequenciação de ADN na região do iniciador 5·.pRPN125: this plasmid is identical to pRPN117 except that the codons of the first two amino acids have their native sequence restored. This was achieved with two internal PCR primers that stretched along the target sequences and carried the desired modifications, and two external primers that served to amplify the desired fragment. Two reactions, each containing 1 μ% of pRPN117 with template, were performed: one containing 5 gg of the RAE-10 primer and 0.5 μ% of the RAE-28 primer, and the other containing 5 μ $ of the RAE-22 primer and 0.5 μ% of the RAE-27 primer. After 10 cycles of PCR (each consisting of an incubation for 1 min at 92 ° C, 2 min at 55 ° C, 2 min at 72 ° C), the two samples were combined and subjected to another 25 cycles ( consisting of incubation for 1 min at 94 ° C, 2 min at 55'C, 4 min at 74 ° C) in the DNA thermal cyclization apparatus. Because internal primers RAE-28 and RAE-27 are completely complementary to each other, the products of the first stage of the PCR reactions can subsequently be natured. In addition, in the second reaction stage, the presence of substantially higher concentrations of the external primers RAE-10 and RAE-22, leads to the synthesis of large quantities of the desired product. The final PCR reaction product was purified by PAGE. A 3349 bp fragment was obtained by digesting pRPN117 with Aat II and Eag I and purifying by agarose gel electrophoresis. Both fragments were ligated and transformed into E. coli W3110 lacl ^ F ”. Transformants were selected by restriction mapping to the desired plasmid, and one of the positive candidates (pRPN125) was further characterized by DNA sequencing in the 5 · primer region.

Para a fermentação, as células foram agitadas em caldo LB a 37°C até DO₅₉₀=l. A lactose foi adicionada para uma concentração final de 1% e a incubação foi prolongada por mais 20 horas. As células foram recolhidas por centrifugação a 6 000 x g durante 30 minutos, foram ressuspensas num excesso de três vezes (p/v) em tampão A (Tris-HCl 100 mM, pH 7,5, EDTA 50 mM, pH 8,0, e DTT 0,2 mM), e armazenadas a -20°c.For fermentation, the cells were shaken in LB broth at 37 ° C until DO ₅₉₀ = 1. Lactose was added to a final concentration of 1% and the incubation was extended for another 20 hours. The cells were collected by centrifugation at 6,000 xg for 30 minutes, resuspended in excess of three times (w / v) in buffer A (100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM EDTA, pH 8.0, and 0.2 mM DTT), and stored at -20 ° C.

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7.1.6. PURIFICAÇÃO DE ERK2 RECOMBINANTE As células (2 g) foram descongeladas à temperatura ambiente, incubadas em gelo com 2 mg de lisozima durante 20 minutos e passadas através de uma prensa french (SLM-Aminco) a 5,3xl0⁴ kPa (8 000 psi. A suspensão viscosa então obtida foi diluída 2 vezes com tampão A e homogeneizada adicionalmente com um Polytron 3 impulsos de 1 minuto (Kinematica) ligada na posição 4. Após uma centrifugação a 11 000xg durante 10 minutos a 4°C, o sobrenadante foi diluído 5 vezes com tampão B ( Hepes 20 mM, pH 7,5, EDTA 0,1 mM, ditiotreitol 2 mM e NaCl 20 mM) e aplicado a azul Affigel (Biorad) equilibrado em tampão B. As proteínas foram eluídas com lOOml de um gradiente linear de NaCl 0,02 - 1 M em tampão B. As fracções de ERK2 (NaCl 0,4 - 1 M) foram diluídas com tampão c (histidina 20mM, pH 5,6, EDTA 0,1 mM, ditiotreitol 2mM e NaCl 20 mM) para reduzir o NaCl a 0,1 M e aplicadas a uma coluna de DEAE-celulose (ZetaPrep 60, CUNO) equilibrada com o tampão C. A coluna foi lavada por passos com NaCl 0,1 - 1 M, com incrementos de 0,1 Μ. A ERK2 eluída entre NaCl 0,6 - 0,9 M avaliou-se ser mais de 90% pura (ex.: FIGURA 7C).7.1.6. RECOMBINANT ERK2 PURIFICATION The cells (2 g) were thawed at room temperature, incubated on ice with 2 mg of lysozyme for 20 minutes and passed through a French press (SLM-Aminco) at 5.3 x 10 ⁴ kPa (8 000 psi). The viscous suspension then obtained was diluted 2 times with buffer A and further homogenized with a 1 minute Polytron 3 pulses (Kinematica) connected in position 4. After centrifugation at 11,000xg for 10 minutes at 4 ° C, the supernatant was diluted 5 times with buffer B (20 mM Hepes, pH 7.5, 0.1 mM EDTA, 2 mM dithiothreitol and 20 mM NaCl) and applied to Affigel blue (Biorad) balanced in buffer B. The proteins were eluted with 100 ml of a gradient linear 0.02 - 1 M NaCl in buffer B. ERK2 fractions (0.4 - 1 M NaCl) were diluted with buffer c (20mM histidine, pH 5.6, 0.1 mM EDTA, 2mM dithiothreitol and NaCl 20 mM) to reduce NaCl to 0.1 M and applied to a DEAE-cellulose column (ZetaPrep 60, CUNO) balanced with the size bread C. The column was washed stepwise with 0.1 - 1 M NaCl, in 0.1 Μ increments. ERK2 eluted between 0.6 - 0.9 M NaCl was found to be more than 90% pure (eg, FIGURE 7C).

7.1.7. MEDIÇÃO DA ACTIVIDADE DE ERK2 RECOMBINANTE7.1.7. MEASUREMENT OF RECOMBINANT ERK2 ACTIVITY

A autofosforilação de ERK2 foi efectuada a 30°C, durante 30 minutos, na presença de MgCl₂ 10 mM, dititotreitol 1 mM, benzamidina lmM, Hepes 30 mM, pH 8,0, e de [)f-³²P]ATP. A actividade da quinase foi determinada por incubação de ERK2 com ATP 50 μΜ, MgCl₂ 20 mM, ditiotreitol 1 mM, benzamidina lmM e MBP ou MAP2 (0,1 mg/ml). As reacções foram interrompidas com ácido tricloroacético a 10% como em Boulton et al. 1991, Biochemistry 30.:278:286.Autophosphorylation of ERK2 was carried out at 30 ° C, for 30 minutes, in the presence of 10 mM MgCl ₂ , 1 mM dithitotreitol, 1 mM benzamidine, 30 mM Hepes, pH 8.0, and [) f- ³² P] ATP. Kinase activity was determined by incubating ERK2 with 50 μ AT ATP, 20 mM MgCl ₂ , 1 mM dithiothreitol, 1 mM benzamidine and MBP or MAP2 (0.1 mg / ml). The reactions were stopped with 10% trichloroacetic acid as in Boulton et al. 1991, Biochemistry 30.:278:286.

7.1.8. MARCAÇÃO, IMUNOPRECIPITACÃO E ANÁLISE DE FOSFOAMINOÃCIDOS DE ERK17.1.8. ERK1 PHOSPHOAMINO ACID MARKING, IMMUNOPRECIPITATION AND ANALYSIS

As células Rat 1 HIRc B ou células PC12, contidas em duas placas de 100 mm, foram transferidas para uma solução de Krebs-Ringer-bicarbonato, isenta de soro, em albumina de soro de bovino a 2% (Smith et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:2641-2645). Após uma incubação durante a noite ou apenas duJRat 1 HIRc B cells or PC12 cells, contained in two 100 mm plates, were transferred to a serum-free Krebs-Ringer-bicarbonate solution in 2% bovine serum albumin (Smith et al., 1980 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2641-2645). After an overnight incubation or just duJ

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6526-049-118 rante 60 minutos, as células foram marcadas com ácido ortofosfórico-32p (i mci/ml), durante 50 minutos, com ou sem a adição de insulina (0,18 μΜ) ou de NGF (75 ng/ml) nos últimos 5 minutos da incubação. As células foram lavadas em meio arrefecido em gelo, ressuspensas em 1 ml de tampão de homogeneização (p-nitrofenilfosfato 20 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, EGTA lmM, fluoreto de sódio 50 mM, ortovanadato de sódio 50 μΜ e benzamidina 5 mM) contendo fluoreto de fenilmetilsulfonilo 2 mM e pepstatina 0,1 μΜ e homogeneizadas em homogeneizador de Dounce. Após uma sedimentação a 100 OOOxg durante 1 hora a 4°C, os sobrenadantes (1 ml) foram pré-clarifiçados uma vez com soro pre-imune, sendo depois repartidos para incubação, durante 1 hora em gelo, com 5 μΐ de cada um de antissoro 837 ou de soro pré-imune. Os imunocomplexos foram recolhidos com Pansorbin (Calbiochem) e lavados com tampão de homogeneização com Triton X-100 a 0,2%, contendo primeiro NaCl 2 M, depois NaCl 0,15 M e finalmente NaCl 0,15 M com 0,01% de SDS. As pelotas foram ressuspensas em 40 μΐ de tampão de amostra de electroforese concentrado 2,5 vezes, fervidos durante 10 minutos e aplicados num gel de poliacrilamida a 10% SDS. As aliquotas (5 μΐ) do padrão ERK1, foram transferidas para nitrocelulose de modo a confirmar por imunotransferência que a banda marcada radioactivamente em cada imunoprecipitado co-migrava com a ERK1. Para imunoprecipitações desnaturantes, os sobrenadantes foram ajustados para concentrações finais de 0,5% de SDS e ditiotreitol 1 mM. As amostras foram fervidas 1-2 minutos e diluídas 4 vezes com tampão de homogeneização contendo deoxicolato de sódio a 1,25%, Trinton X-100 a 1,25% e ou ditiotreitol 0,1 mM (ou 1 mM) e então imunoprecipitadas como acima mencionado. As bandas correspondentes ao ERK1 foram excisadas dos geles secos e hidrolisadas em HC1 6 N, durante 90 minutos. Os fosfoaminoácidos foram analisados como descrito por cooper et al., 1983, Methods in Enzymology, Vol. 99, J. D. Corbin e J. G. Hardman, eds, New York Academic Press, pp 387-402.6526-049-118 for 60 minutes, cells were labeled with orthophosphoric acid-32p (i mci / ml) for 50 minutes, with or without the addition of insulin (0.18 μΜ) or NGF (75 ng / ml ) in the last 5 minutes of the incubation. The cells were washed in ice-cooled medium, resuspended in 1 ml of homogenization buffer (20 mM p-nitrophenylphosphate, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EGTA, 50 mM sodium fluoride, 50 μΜ sodium orthovanadate and 5 mM benzamidine) containing 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and 0.1 μΜ pepstatin and homogenized in a Dounce homogenizer. After sedimentation at 100 OOOxg for 1 hour at 4 ° C, the supernatants (1 ml) were pre-clarified once with pre-immune serum, then divided for incubation, for 1 hour on ice, with 5 μΐ each. antiserum 837 or pre-immune serum. The immunocomplexes were collected with Pansorbin (Calbiochem) and washed with homogenization buffer with 0.2% Triton X-100, containing first 2 M NaCl, then 0.15 M NaCl and finally 0.15 M NaCl with 0.01% of SDS. The pellets were resuspended in 40 μΐ of concentrated electrophoresis sample buffer 2.5 times, boiled for 10 minutes and applied to a 10% SDS polyacrylamide gel. The aliquots (5 μΐ) of the ERK1 standard were transferred to nitrocellulose in order to confirm by immunoblotting that the radiolabeled band in each immunoprecipitate co-migrated with ERK1. For denaturing immunoprecipitations, the supernatants were adjusted to final concentrations of 0.5% SDS and 1 mM dithiothreitol. The samples were boiled 1-2 minutes and diluted 4 times with homogenization buffer containing 1.25% sodium deoxycholate, 1.25% Trinton X-100 and or 0.1 mM dithiothreitol (or 1 mM) and then immunoprecipitated as mentioned above. The bands corresponding to ERK1 were excised from the dry gels and hydrolyzed in 6 N HCl for 90 minutes. Phosphoamino acids were analyzed as described by cooper et al., 1983, Methods in Enzymology, Vol. 99, J. D. Corbin and J. G. Hardman, eds, New York Academic Press, pp 387-402.

Para transferência dos imunocomplexos, 1 mg de sobrenadante foi imunoprecipitado em condições desnaturantes. As pelotas de Pansorbin foram lavadas duas vezes com Tris 0,25M, pH 7,5, e NaClFor transfer of the immunocomplexes, 1 mg of supernatant was immunoprecipitated under denaturing conditions. Pansorbin pellets were washed twice with 0.25M Tris, pH 7.5, and NaCl

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0,1 M, antes da electroforese. Para detectar a fosfotirosina, a transferência foi tratada com um anticorpo monoclonal para a fosfotirosina (UBI) e visualizado utilizando um anticorpo secundário de cabra anti-IgG de ratinho, conjugado com fosfatase alcalina. A imunotransferência 691 foi revelada com um anticorpo secundário de cabra anti-IgG de coelho, conjugado com a peroxidase de rábano silvestre.0.1 M, before electrophoresis. To detect phosphotyrosine, the transfer was treated with a monoclonal antibody to phosphotyrosine (UBI) and visualized using a secondary goat anti-mouse IgG antibody, conjugated to alkaline phosphatase. Immunoblot 691 was revealed with a secondary goat anti-rabbit IgG antibody conjugated to horseradish peroxidase.

7.1.9. CROMATOGRAFIA DOS EXTRACTOS EM MONO-Q SEPHAROSE As células PC12 foram cultivadas até à confluência, em placas de plástico não revestidas, em meio de Eagle modificado por Dulbecco com 5% de soro bovino fetal e 5% de soro de cavalo. 0 NGF foi adicionado a 5 de 10 placas de 150 mm, para uma concentração final de 50 ng/ml, durante 5 minutos. As células foram raspadas para tampão de homogeneização e as fracções solúveis foram preparadas e a proteína determinada como descrito em Boulton et al. (1991, Biochem. 3().:278-286). As fracções solúveis foram diluídas com 3 volumes de água e aplicadas a uma coluna Mono-Q HR 5/5, equilibrada com jS-glicerofosfato 50 mM, pH7.1.9. CHROMATOGRAPHY OF THE EXTRACTS IN MONO-Q SEPHAROSE The PC12 cells were cultured until confluence, in uncoated plastic plates, in Dulbecco's modified Eagle's medium with 5% fetal bovine serum and 5% horse serum. The NGF was added to 5 of 10 150 mm plates, for a final concentration of 50 ng / ml, for 5 minutes. The cells were scraped into homogenization buffer and soluble fractions were prepared and the protein determined as described in Boulton et al. (1991, Biochem. 3 (): 278-286). The soluble fractions were diluted with 3 volumes of water and applied to a Mono-Q HR 5/5 column, equilibrated with 50 mM jS-glycerophosphate, pH

7,3, EGTA 1 mM, ditiotreitol 1 mM, vanadato de sódio 0,1 mM e pepstatina 0,1 μΜ. A proteína foi eluída com um gradiente de NaCl 0 - 0,3 M neste tampão. Sessenta fracções de 1 ml foram recolhidas e ensaiadas quanto à actividade de MBP-quinase, utilizando 0,3 mg/ml de MBP.7.3, 1 mM EGTA, 1 mM dithiothreitol, 0.1 mM sodium vanadate and 0.1 μΜ pepstatin. The protein was eluted with a 0 - 0.3 M NaCl gradient in this buffer. Sixty 1 ml fractions were collected and tested for MBP kinase activity, using 0.3 mg / ml MBP.

7.2. RESULTADOS7.2. RESULTS

7.2.1. CLONAGEM MOLECULAR DE DUAS NOVAS ERK A mesma sonda utilizada para isolar o ADNc de ERKl (Boulton et al., 1990, Science 249:64-65) foi utilizada para pesquisar uma biblioteca de ADNc de cérebro de ratazana a um baixo rigor normal, resultando na identificação de múltiplos clones de ADNc que hibridavam. A análise destes clones conduziu à verificação da existência de pelo menos duas novas proteína-quinases, que designámos ERK2 e ERK3 (FIGURAS 3A (SEQ ID N^a . 3 e N² . 4) e 3B (SEQ ID N². 5 e N^a. 6)). A ERKl, a ERK2 e a ERK3 estão muito proximamente relacionadas com as quinases de levedura, KSS1 e FUS3, do gue com qualquer outra proteína-quinase (FIGURAS 4A e 4B). En72 6867.2.1. MOLECULAR CLONING OF TWO NEW ERK The same probe used to isolate ERKl cDNA (Boulton et al., 1990, Science 249: 64-65) was used to search a rat brain cDNA library at normal low stringency, resulting in identifying multiple hybridizing cDNA clones. The analysis of these clones led to the verification of the existence of at least two new protein kinases, which we designated ERK2 and ERK3 (FIGURES 3A (SEQ ID N ^a . 3 and N ^2. 4) and 3B (SEQ ID N ^2. 5 and N ^a . 6)). ERKl, ERK2 and ERK3 are very closely related to yeast kinases, KSS1 and FUS3, of which with any other protein kinase (FIGURES 4A and 4B). En72 686

JJ

-526526-049-118-526526-049-118

quanto que as ERK compartilham aproximadamente de 37% (ERK3) a 56% (ERKl e ERK2) de homologia com as quinases de levedura, elas estão significativamente menos relacionadas (26% de homologia para a ERK3 e 41% de homologia para a ERKl e ERK2) com os seus parentes mais próximos, a família cdc2 de quinases (Lee e Nurse, 1987, Nature 327:31-35). A ERKl e a ERK2 estão mais estreitamente relacionadas entre si (90% de identidade) do que com a ERK3 (FIGURA 2B). Utilizando a primeira metionina da sequência (que satisfaz o consenso de Kozak para os locais de restrição (Kozak, 1987, Nucleic Acids Res. 15.:8125-8148)), a proteína prevista pelo ADNc de ERK2 possui uma massa molecular de 41,2 kDa, menor do que a de ERKl (~ 43 kDa), com menos resíduos na extremidade amino antes da região catalítica. A segunda metionina da sequência de ERK2 pode ser alinhada com as metioninas iniciadoras encontradas em KSSl e FUS3.whereas ERK shares approximately 37% (ERK3) to 56% (ERKl and ERK2) homology with yeast kinases, they are significantly less related (26% homology for ERK3 and 41% homology for ERKl and ERK2) with their closest relatives, the cdc2 family of kinases (Lee and Nurse, 1987, Nature 327: 31-35). ERKl and ERK2 are more closely related to each other (90% identity) than to ERK3 (FIGURE 2B). Using the first methionine in the sequence (which satisfies the Kozak consensus for restriction sites (Kozak, 1987, Nucleic Acids Res. 15.:8125-8148)), the protein predicted by ERK2 cDNA has a molecular mass of 41, 2 kDa, less than that of ERKl (~ 43 kDa), with less residues at the amino end before the catalytic region. The second methionine of the ERK2 sequence can be aligned with the initiator methionines found in KSS1 and FUS3.

A sequência de aminoácidos deduzida para ERK3 prevê uma proteína de 62,6 kDa. Enquanto a metionina iniciadora está localizada logo a jusante da prevista para ERK2, a ERK3 possui uma extensão do terminal C de aproximadamente 180 aminoácidos, quando comparadas com a ERKl e a ERK2. Apesar desta longa extensão do terminal C, a ERK3 está notavelmente mais relacionada com a ERKl e a ERK2 (= 50% de identidade no domínio catalítico) do que com os seus parentes mais próximos (FIGURA 4B). Além disso, grupos de quase identidade entre as ERK (ex.: subdomínios V - 83% de identidade e VI - 95% de identidade; ver FIGURA 4A) demonstram que a ERKl e a ERK2 estão mais estritamente relacionadas com a ERK3, do que com a KSSl e FUS3. A sequenciação de dois clones de ADNc independentes confirmaram que a ERK3 continha SPR em vez de APE no subdomínio VIII; o ácido glutâmico na sequência APE é apenas um dos quinze resíduos invariáveis das proteína-quinases (Hanks et al., 1988, Science 241:42-52) que não se encontra conservado na ERK3. Análise mutacional com a scr tirosina-quinase revelou que o resíduo de lisina que substituía este ácido glutâmico conduziu a uma diminuição da actividade (Bryant e Parsons, 1984, Mol. Cell. Biol. 4.:862-866). Na subre-gião VI, a ERK3 contém DLKPAN, uma sequência reminiscente da tirosina e da serina/treonina quinases.The deduced amino acid sequence for ERK3 predicts a 62.6 kDa protein. While the initiator methionine is located just downstream from that predicted for ERK2, ERK3 has a C-terminal extension of approximately 180 amino acids, when compared to ERKl and ERK2. Despite this long extension of the C terminal, ERK3 is notably more related to ERK1 and ERK2 (= 50% identity in the catalytic domain) than to its closest relatives (FIGURE 4B). In addition, quasi-identity groups among ERKs (eg subdomains V - 83% identity and VI - 95% identity; see FIGURE 4A) demonstrate that ERKl and ERK2 are more closely related to ERK3, than with KSSl and FUS3. Sequencing of two independent cDNA clones confirmed that ERK3 contained SPR instead of APE in subdomain VIII; glutamic acid in the APE sequence is only one of the fifteen invariable residues of protein kinases (Hanks et al., 1988, Science 241: 42-52) that is not conserved in ERK3. Mutational analysis with scr tyrosine kinase revealed that the lysine residue that replaced this glutamic acid led to a decrease in activity (Bryant and Parsons, 1984, Mol. Cell. Biol. 4.:862-866). In sub-region VI, ERK3 contains DLKPAN, a sequence reminiscent of tyrosine and serine / threonine kinases.

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-537.2.2. EVIDÊNCIA PARA ERK ADICIONAIS ,4-537.2.2. EVIDENCE FOR ADDITIONAL ERK, 4

As sondas específicas para as ERK individuais (FIGURA 5A) foram utilizadas para determinar se existiam ou não membros adicionais desta família. Estas sondas foram originadas a partir das porções menos conservadas de cada uma das três ERK (ver Materiais e Métodos) e cada sonda demonstrou não hibridar com as outras ERK conhecidas (FIGURA 5A). A sonda específica para ERK1 identificou apenas um fragmento que hibridava fortemente e vários que hibridavam mais fracamente com ADN genómico de ratazana digerido com EcoRI, mas identificou múltiplos fragmentos que hibridavam fortemente em ADN genómico de ratazana digerido com outros enzimas de restrição (FIGURA 5B e 5C). A sonda específica para ERK2 identificou dois fragmentos EcoRI distintos em ADN genómico de ratazana e três fragmentos EcoRI em ADN genómico humano (FIGURA 5B). A sonda específica para ERK3 identificou dois fragmentos em ADN genómico de ratazana e quatro fragmentos em ADN genómico humano (FIGURA 5B). Como estas sondas não continham qualquer intrão ou qualquer dos locais de restrição utilizado na análise (ver Materiais e Métodos), estas hibridações sugerem a existência de múltiplas ERK para além daquelas já isoladas e que as ERK ainda podem ser agrupadas em subfamílias. A pesquisa de bibliotecas de ADN genómico e de ADNc de ratazana com as sondas específicas para ERK, apoia ainda a ideia de membros de subfamílias devido ao isolamento de um número de clones que hibrida apenas com uma das sondas específicas, mas apenas a baixo rigor. No entanto, nem todos podem representar genes funcionais já que a sequência parcial nucleotídica de um dos clones genómicos revelou conter um pseudogene muito relacionado com aThe probes specific to the individual ERKs (FIGURE 5A) were used to determine whether or not there were additional members of this family. These probes originated from the least conserved portions of each of the three ERKs (see Materials and Methods) and each probe demonstrated not to hybridize with the other known ERKs (FIGURE 5A). The ERK1-specific probe identified only one fragment that hybridized strongly and several that hybridized more weakly to rat genomic DNA digested with EcoRI, but identified multiple fragments that strongly hybridized to rat genomic DNA digested with other restriction enzymes (FIGURE 5B and 5C ). The ERK2-specific probe identified two distinct EcoRI fragments in rat genomic DNA and three EcoRI fragments in human genomic DNA (FIGURE 5B). The ERK3-specific probe identified two fragments in rat genomic DNA and four fragments in human genomic DNA (FIGURE 5B). As these probes did not contain any introns or any of the restriction sites used in the analysis (see Materials and Methods), these hybridizations suggest the existence of multiple ERKs in addition to those already isolated and that ERKs can still be grouped into subfamilies. The search for genomic DNA and rat cDNA libraries with ERK-specific probes further supports the idea of subfamily members due to the isolation of a number of clones that hybridize only to one of the specific probes, but only at a low level. However, not all can represent functional genes since the partial nucleotide sequence of one of the genomic clones has been shown to contain a pseudogene closely related to

ERK1 (designada ERKl^, FIGURA 3C).ERK1 (referred to as ERK1, FIGURE 3C).

7.2.3. DISTRIBUIÇÃO DISTINTA DAS ERK AO LONGO DO DESENVOLVIMENTO E NOS TECIDOS7.2.3. DISTINCT DISTRIBUTION OF ERK THROUGH DEVELOPMENT AND FABRICS

As sondas específicas para ERK1, ERK2 e ERK3 foram utilizadas para determinar a distribuição da expressão do ARNm de ERK, ao longo do desenvolvimento e nos tecidos. Na ratazana adulta todos os três ARNm de ERK foram expressos a níveis mais elevados no sistema nervoso, apesar de todos os ARNm serem detectados em todos os tecidos examinados (FIGURA 6A). NO sistema nervoso, aThe probes specific for ERK1, ERK2 and ERK3 were used to determine the distribution of ERK mRNA expression, throughout development and in tissues. In the adult rat all three ERK mRNAs were expressed at higher levels in the nervous system, although all mRNAs were detected in all tissues examined (FIGURE 6A). IN the nervous system, the

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ERK2 e a ERK3 mostraram claramente um padrão recíprocoERK2 and ERK3 clearly showed a reciprocal pattern

expressão do ARNm, com expressão mais elevada de ERK3 nas regiões rombencéfalo e expressão mais elevada de ERK2 nas regiões do prosencéfalo; comparativamente a ERKl é expressa mais uniformemente. Fora do sistema nervoso, cada uma das ERK foi expressa em quantidades mais elevadas em diferentes tecidos. A ERKl foi expressa a níveis mais elevados no intestino e na placenta e a um nível menor nos pulmões. O ARNm de ERK2 foi expresso a níveis mais elevados nos músculos, timo e coração. A sonda de ERK2 identificou três transcritos distintos, que são expressos a taxas diferentes nos diferentes tecidos; estes transcritos podem ser formas processadas diferencialmente a partir do ARNmm de ERK2 ou podem surgir a partir de outros genes da subfamília de ERK2. 0 ARNm de ERK3 foi expresso a níveis mais elevados no músculo estriado.mRNA expression, with higher expression of ERK3 in the rombencephalon regions and higher expression of ERK2 in the regions of the forebrain; comparatively ERKl is expressed more uniformly. Outside the nervous system, each ERK was expressed in higher amounts in different tissues. ERK1 was expressed at higher levels in the intestine and placenta and at a lower level in the lungs. ERK2 mRNA was expressed at higher levels in the muscles, thymus and heart. The ERK2 probe identified three distinct transcripts, which are expressed at different rates in different tissues; these transcripts may be forms differentially processed from the ERK2 mmRNA or they may arise from other genes in the ERK2 subfamily. ERK3 mRNA was expressed at higher levels in the striated muscle.

Um estudo ao longo do desenvolvimento da expressão de ERKl, ERK2 e ERK3 no sistema nervoso, revelou que o ARNm de ERK3 foi expresso a níveis mais elevados no início do desenvolvimento (especialmente na medula espinal e no hipocampo), enquanto que a expressão de ARNm de ERKl e ERK2 geralmente aumentou durante o desenvolvimento (FIGURA 6B). No cérebro, aumentos de ARNm de duas destas quinases ao longo do desenvolvimento reflectiram alterações nas quantidades de proteína de ERKl e ERK2 (ver abaixo). No fígado e no coração a expressão de todas as três ERK diminui na ratazana adulta (Figura 6B). As distribuições discretas e os padrões ao longo do desenvolvimento das ERK sugerem que elas desempenhem papéis fisiológicos únicos nas diferentes células ou talvez em resposta a diferentes sinais.A study along the development of the expression of ERKl, ERK2 and ERK3 in the nervous system, revealed that ERK3 mRNA was expressed at higher levels at the beginning of development (especially in the spinal cord and hippocampus), while the expression of mRNA of ERK1 and ERK2 generally increased during development (FIGURE 6B). In the brain, increases in mRNA from two of these kinases throughout development reflected changes in the amounts of ERK1 and ERK2 protein (see below). In the liver and heart, the expression of all three ERKs decreases in the adult rat (Figure 6B). The discrete distributions and patterns throughout the development of ERK suggest that they play unique physiological roles in different cells or perhaps in response to different signals.

Os baixos níveis de transcritos de ERK2 e ERK3 no nervo ciático (gue contém axónios neuronais e células de suporte dos neurónios (glias), mas que não possuem corpos celulares neuronais e portanto não possuem ARNm específicos) contrastam com os elevados níveis de ARNm de ERKl neste nervo periférico (FIGURA 6A). Assim, os níveis levados de ERK2 e ERK3 no cérebro, ao contrário do que sucede no nervo periférico, pode reflectir uma expressão específica nos neurónios. De modo a explorar ainda estaThe low levels of ERK2 and ERK3 transcripts in the sciatic nerve (which contains neuronal axons and neuron support cells (glia), but which do not have neuronal cell bodies and therefore do not have specific mRNAs) contrast with the high levels of ERKl mRNA. in this peripheral nerve (FIGURE 6A). Thus, the elevated levels of ERK2 and ERK3 in the brain, unlike what happens in the peripheral nerve, may reflect a specific expression in neurons. In order to further explore this

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-55r &-55r &

possibilidade, o nível de cada ERK foi comparado na totalidade do cérebro e nas culturas de células da glia, isentos de neurónios derivados de cérebros de recém-nascidos (FIGURA 6C). A diminuição no nível de expressão de ERK2 e ERK3 nestas culturas, comparativamente à expressão de ERK1, indica ainda a especificidade de ERK2 e ERK3 nos neurónios.possibility, the level of each ERK was compared in the whole brain and in glial cell cultures, free of neurons derived from newborn brains (FIGURE 6C). The decrease in the level of expression of ERK2 and ERK3 in these cultures, compared to the expression of ERK1, further indicates the specificity of ERK2 and ERK3 in neurons.

7.2.4. REGULAÇÃO DISTINTA DOS TRANSCRITOS DE ERK APÓS INDUÇÃO DA DIFERENCIAÇÃO NEURONAL OU MUSCULAR7.2.4. DISTINCT REGULATION OF ERK TRANSCRIPTS AFTER INDUCTION OF NEURONAL OR MUSCULAR DIFFERENTIATION

DAS CÉLULAS DE EMBRIOCARCINOMA A linha P19 de carcinoma embrionário normalmente apresenta um fenótipo não-diferenciado, mas pode ser induzida para diferenciar linhagens neuronais ou musculares, após tratamento com ácido retinóico (RA) ou dimetilsulfóxido (DMSO), respectivamente (McBurney et al., 1982, Nature 2999:165-167). Os transcritos que hibridam com as três sondas de ERK são cada um unicamente regulados durante a diferenciação de P19. Enquanto que os transcritos de ERK1 não mostram, ou mostram apenas uma pequena diminuição após a indução para fenótipos musculares ou neuronais, os transcritos ERK2 mostram um notável aumento apenas sobre indução neuronal (o que reproduz o padrão observado para o receptor de baixa actividade para o NGF) e os transcritos ERK3 aumentam na diferenciação, na linhagem neuronal ou muscular. Estes padrões de expressão após a diferenciação estão de acordo com as distribuições específicas de cada ERK in vivo (ver acima), e proporcionam apoio adicional para a especificidade neuronal (em vez da glial) das ERK2 e ERK3. Assim, o sistema de diferenciação P19 parece ser um útil sistema de modelo para o estudo dos papéis das ERK individuais durante a diferenciação neuronal e muscular. Curiosamente a MAP2, que pode representar um substrato normal para pelo menos algumas das ERK, é aparentemente requerida para características importantes do processo de diferenciação neuronal das P19 como a extensão das neurites e cessação da proliferação (Dinsmore and Solomon, 1991, Cell 64:817-826).EMBRYOCARCINOMA CELLS The P19 line of embryonic carcinoma usually presents a non-differentiated phenotype, but it can be induced to differentiate neuronal or muscle lines, after treatment with retinoic acid (RA) or dimethylsulfoxide (DMSO), respectively (McBurney et al., 1982, Nature 2999: 165-167). The transcripts that hybridize to the three ERK probes are each uniquely regulated during P19 differentiation. While ERK1 transcripts do not show, or show only a small decrease after induction for muscle or neuronal phenotypes, ERK2 transcripts show a notable increase only on neuronal induction (which reproduces the pattern observed for the low activity receptor for the NGF) and ERK3 transcripts increase in differentiation, in neuronal or muscular lineage. These expression patterns after differentiation are in accordance with the specific distributions of each ERK in vivo (see above), and provide additional support for the neuronal (rather than glial) specificity of ERK2 and ERK3. Thus, the P19 differentiation system appears to be a useful model system for studying the roles of individual ERKs during neuronal and muscle differentiation. Interestingly, MAP2, which may represent a normal substrate for at least some of the ERKs, is apparently required for important characteristics of the P19 neuronal differentiation process, such as the extent of neuritis and cessation of proliferation (Dinsmore and Solomon, 1991, Cell 64: 817 -826).

7.2.5. ACTIVIDADE DA ERK2 RECOMBINANTE Para iniciar a comparação das propriedades das novas ERK com7.2.5. RECOMBINANT ERK2 ACTIVITY To start comparing the properties of the new ERKs with

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-56as da ERKl purificada a partir de fibroblastos tratados com insulina (Boulton et al., 1991, Biochem. 30.:278-286), purificámos ERK2 recombinante sintetizada em E. coli (FIGURA 7A). A ERK2 recombinante purificada fosforilava-se a si mesma (FIGURA 7C) e a substratos exógenos MAP2 e MBP, de uma forma dependente do tempo (FIGURA 7D) e da concentração. As actividades específicas de duas preparações de ERK2 recombinante purificada eram de 0,6 a 1 nmol/min/mg de proteína, com MAP2 ou MBP como substratos. Isto compara-se com a actividade específica com MAP2 de 300 nmol/min/ /mg para uma preparação altamente purificada de ERKl e de 4 nmol/ /min/mg para a mesma preparação que tinha sido exaustivamente desfosforilada com a subunidade catalítica da fosfatase 2a. O facto da ERK2 recombinante possuir uma actividade específica similar à da ERKl nativa desfosforilada, sugere que a proteína recombinante está na conformação apropriada para ser activada por fosforilação.-56as of ERKl purified from insulin-treated fibroblasts (Boulton et al., 1991, Biochem. 30.:278-286), we purified recombinant ERK2 synthesized in E. coli (FIGURE 7A). The purified recombinant ERK2 phosphorylated itself (FIGURE 7C) and exogenous substrates MAP2 and MBP, in a time-dependent (FIGURE 7D) and concentration-dependent manner. The specific activities of two purified recombinant ERK2 preparations were from 0.6 to 1 nmol / min / mg of protein, with MAP2 or MBP as substrates. This compares with the specific activity with MAP2 of 300 nmol / min / mg for a highly purified ERKl preparation and 4 nmol / / min / mg for the same preparation that had been exhaustively dephosphorylated with the phosphatase 2a catalytic subunit. . The fact that recombinant ERK2 has a specific activity similar to that of native dephosphorylated ERK1, suggests that the recombinant protein is in the appropriate conformation to be activated by phosphorylation.

7.2.6. OS ANTISSOROS PODEM DISTINGUIR ERKl E ERK2 E IDENTIFICAR UMA NOVA ERK7.2.6. ANTISTERS CAN DISTINGUISH ERKl AND ERK2 AND IDENTIFY A NEW ERK

Dois antissoros policlonais diferentes, ambos produzidos contra um péptido que consistia em 16 resíduos C-terminais da ERKl (10 dos quais eram conservados na ERK2), tinham a capacidade de distinguir entre ERK1 purificada e ERK2 recombinante em imunotransferências e podiam também identificar estas proteínas e até uma nova ERK em extractos celulares em bruto. 0 antissoro 837 reconheceu ambas, a ERKl purificada e a ERK2 recombinante (FIGURA 7B), e também identificou duas proteínas de tamanhos semelhantes em extractos celulares em bruto de cérebro (FIGURA 8C). 0 antissoro 956 reconheceu a ERK1 purificada mas não a ERK2 recombinante, em extractos celulares em bruto de cérebro, este antissoro reconheceu uma proteína que co-migrava com a ERK1 purificada, assim como a nova ERK de 45 kDa (FIGURA 8B). Anticorpos produzidos contra péptidos de outros subdomínios da ERKl reconheceram também todas estas três proteínas (Boulton e Cobb, 1991, in Cell Regulation, Vol. II), verificando a identificação de ERKl e ERK2, e confirmando a existência de uma nova ERK de 45 kDa. Por imunotransferência, as quantidades das proteínas de 41 a 43 kDa aumentaram drasticamente (FIGURA 8B eTwo different polyclonal antisera, both produced against a peptide consisting of 16 ERKl C-terminal residues (10 of which were conserved in ERK2), had the ability to distinguish between purified ERK1 and recombinant ERK2 in immunoblots and could also identify these proteins and until a new ERK in crude cell extracts. Antiserum 837 recognized both the purified ERK1 and the recombinant ERK2 (FIGURE 7B), and also identified two proteins of similar sizes in crude brain cell extracts (FIGURE 8C). Antiserum 956 recognized purified ERK1 but not recombinant ERK2 in crude brain cell extracts, this antiserum recognized a protein that co-migrated with purified ERK1, as well as the new 45 kDa ERK (FIGURE 8B). Antibodies produced against peptides from other subdomains of ERKl also recognized all three of these proteins (Boulton and Cobb, 1991, in Cell Regulation, Vol. II), verifying the identification of ERKl and ERK2, and confirming the existence of a new 45 kDa ERK . By immunoblotting, the amounts of proteins from 41 to 43 kDa increased dramatically (FIGURE 8B and

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FIGURA 8C) no cérebro adulto, em comparação com cérebro embrionário, reproduzindo o aumento regulado ao longo do desenvolvimento, da acumulação de ARNm para ERK1 e ERK2, no cérebro. Com base nas especificidades dos antissoros para as ERK purificadas, assim como nas correlações entre quantidades de proteína e ARNm, designámos a proteína de 43 kDa reconhecida por ambos os antissoros nos extractos celulares em bruto de cérebro por ERKl, a proteína de 41 kDa reconhecida apenas pelo antissoro 837 por ERK2 e a nova ERK de 45 kDa como ERK4.FIGURE 8C) in the adult brain, compared to the embryonic brain, reproducing the regulated increase over the course of development of mRNA accumulation for ERK1 and ERK2 in the brain. Based on the specificities of the antisera to the purified ERKs, as well as the correlations between amounts of protein and mRNA, we designated the 43 kDa protein recognized by both antisera in crude brain cell extracts by ERKl, the 41 kDa protein recognized only by antiserum 837 by ERK2 and the new ERK of 45 kDa as ERK4.

7.2.7. AS ERK SÃO FOSFORILADAS EM RESPOSTA À INSULINA E AO NGF7.2.7. ERK ARE PHOSPHORILLATED IN RESPONSE TO INSULIN AND NGF

Foi descrito que uma proteína que co-cromatografava com a actividade da MAP-quinase era fosforilada nos resíduos de treonina e tirosina em resposta à insulina (Ray and Sturgill, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:3753-3757). Ambos os tipos de fosforilação podem ser necessários para uma actividade máxima da MAP2-quinase (Anderson et al., 1990, Nature 343:651-653; Ahn et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:11495-11591: Gomez et al., 1990, FEBS Lett. 271:119-122? Boulton e Cobb, 1991, Cell Regulation, In press). Utilizámos os nossos reagentes de anticorpo, que identificam especificamente as ERK individuais, para explorar o estado de activação e fosforilação dos membros individuais desta família de quinases em resposta a dois factores de crescimento diferentes, insulina e NGF.A protein that co-chromatographed with MAP kinase activity has been reported to be phosphorylated in threonine and tyrosine residues in response to insulin (Ray and Sturgill, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3753-3757) . Both types of phosphorylation may be necessary for maximum MAP2-kinase activity (Anderson et al., 1990, Nature 343: 651-653; Ahn et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 11495-11591: Gomez et al., 1990, FEBS Lett.271: 119-122 (Boulton and Cobb, 1991, Cell Regulation, In press). We used our antibody reagents, which specifically identify individual ERKs, to explore the state of activation and phosphorylation of individual members of this family of kinases in response to two different growth factors, insulin and NGF.

Para examinar o efeito da insulina e do NGF na fosforilação da ERKl, directamente, usámos antissoro 837 para imunoprecipitar ERKl de células -Rat 1 HIRc ou PC126 marcadas com ³²P, antes e depois de estimulação com insulina e NGF (FIGURA 9A). Embora o antissoro 837 reconheça ERKl, ERK2 e ERK4 em imunotransferências em condições desnaturantes, ele imunoprecipita a ERKl de 43 kDa, uma pequena quantidade de ERK4 de 45 kDa, mas não com a ERK2 de 41 kDa de extractos celulares em bruto sob condições não desnaturantes. Não foram detectadas bandas marcadas com ³²P em imunoprecipitados de células não tratadas, enquanto ERKl (43 kDa) marcada e uma pequena quantidade de ERK4 (45 kDa) marcada com ³²P foram imunoprecipitadas de células tratadas com insulina ou com NGF, indicando que existe fosforilação dependente da hormona deTo examine the effect of insulin and NGF on phosphorylation of ERK1 directly, we used antiserum 837 to immunoprecipitate ERKl from ³² P-labeled RAT 1 HIRc or PC126 cells, before and after stimulation with insulin and NGF (FIGURE 9A). Although antiserum 837 recognizes ERKl, ERK2 and ERK4 in immunoblots under denaturing conditions, it immunoprecipitates ERKl of 43 kDa, a small amount of ERK4 of 45 kDa, but not with ERK2 of 41 kDa of crude cell extracts under non-denaturing conditions . No ³² P-labeled bands were detected in immunoprecipitates of untreated cells, while ERKl (43 kDa) labeled and a small amount of ³² P-labeled ERK4 (45 kDa) were immunoprecipitated from cells treated with insulin or NGF, indicating that there is hormone-dependent phosphorylation of

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-58ambas as ERK (FIGURA 9A). Em condições desnaturantes, pequenas quantidades de ERK2 marcada eram também precipitadas detectavelmente após estimulação com NGF (FIGURA 9B) indicando que a ERK2, tal como a ERK1 e a ERK4, é também fosforilada em dependência da hormona.-58both ERK's (FIGURE 9A). Under denaturing conditions, small amounts of labeled ERK2 were also detectably precipitated after stimulation with NGF (FIGURE 9B) indicating that ERK2, like ERK1 and ERK4, is also phosphorylated depending on the hormone.

Para determinar se estas fosforilações incluíam a tirosina, foram efectuadas análises de fosfoaminoácidos e imunotransferência de fosfotirosina, nas ERK imunoprecipitadas. Quando duplicados de imunoprecipitados (efectuados em células Rat 1 HIRc B em condições desnaturantes (ver Métodos)) foram imunotransferidos com anticorpos contra ERK e anticorpos contra fosfotirosina, tornou-se evidente que as ERK1 e ERK2 derivadas de extractos estimulados com insulina continham fosfotirosina, enquanto muito pouca fosfotirosina era detectada em proteínas de células não estimuladas (FIGURA 10). Nenhuma fosfotirosina foi detectada na ERK4; isto pode ser devido à nossa incapacidade para a detectar com os anticorpos porque muito pouco desta proteína era imunoprecipitada; alternativamente, o aumento de fosfato na ERK4 induzido pela hormona, pode estar só nos resíduos de serina/treonina. A análise de fosfoaminoácidos de ERK1 43 kDa marcada com ³²P excisada do gel da FIGURA 9A revelou que a treonina, serina e tirosina eram fosforiladas em resposta ao NGF (FIGURA 9C). O mesmo se verificou para a ERK1 de células tratadas com insulina. Estas constatações mostraram que, pelo menos três proteínas ERK são fosforiladas em resposta à insulina e a NGF, e pelo menos duas destas contêm fosfotirosina.To determine whether these phosphorylations included tyrosine, phosphoamino acid analyzes and phosphotyrosine immunoblotting were performed on the immunoprecipitated ERKs. When duplicates of immunoprecipitates (performed on Rat 1 HIRc B cells under denaturing conditions (see Methods)) were immunotransferred with antibodies against ERK and antibodies against phosphotyrosine, it became evident that ERK1 and ERK2 derived from insulin-stimulated extracts contained phosphotyrosine, while very little phosphotyrosine was detected in proteins from unstimulated cells (FIGURE 10). No phosphotyrosine was detected in ERK4; this may be due to our inability to detect it with antibodies because very little of this protein was immunoprecipitated; alternatively, the hormone-induced phosphate increase in ERK4 may be only in the serine / threonine residues. Analysis of ³² P-labeled ³² kDa ERK1 phosphoamino acids excised from the gel of FIGURE 9A revealed that threonine, serine and tyrosine were phosphorylated in response to NGF (FIGURE 9C). The same was true for ERK1 from insulin-treated cells. These findings showed that at least three ERK proteins are phosphorylated in response to insulin and NGF, and at least two of these contain phosphotyrosine.

7.2.8. RELAÇÃO ENTRE FOSFORILAÇÃO E ACTIVACÃO DAS ERK EM RESPOSTA AO NGF7.2.8. RELATIONSHIP BETWEEN PHOSPHORILATION AND ERK ACTIVATION IN RESPONSE TO NGF

Para relacionar a fosforilação destas proteínas com as suas actividades, a seguir à estimulação com NGF, localizámos a ERK1 e a ERK2 em imunotransferências de perfis de coluna Mono Q de células PC12 de ratazana tratadas e não tratadas com NGF, utilizando os antissoros 956 e 837. 0 tratamento com NGF resultou num deslocamento na eluição de uma porção de ERK1 (das fracções 29-31 para as 38-41) e aparentemente também para a ERK2 (das fracções 25-27 para as fracções 29-31) (FIGURA 11), devidoTo relate the phosphorylation of these proteins to their activities, following stimulation with NGF, we located ERK1 and ERK2 in immunoblots of Mono Q column profiles of rat PC12 cells treated and not treated with NGF, using antisera 956 and 837 The NGF treatment resulted in a shift in the elution of a portion of ERK1 (from fractions 29-31 to 38-41) and apparently also to ERK2 (from fractions 25-27 to fractions 29-31) (FIGURE 11) , due

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6526-049-118 «t» —59— presumivelmente a alterações na fosforilação destas proteínas. Imunotransferências idênticas foram sondadas com anticorpos antifosfotirosina e revelaram pouca ou nenhuma fosfotirosina em ERKl ou ERK2, antes do tratamento com NGF. O tratamento com NGF resultou num aumento da fosforilação dos resíduos de tirosina, tanto na ERKl como na ERK2. A fosfotirosina era detectável em ambas as proteínas ERKl, deslocadas e não deslocadas, sugerindo que modificações múltiplas (como as fosforilações adicionais na tirosina, treonina e/ou serina, o que seria consistente com a análise de fosfoaminoácidos da ERKl imunoprecipitada acima descrita) são necessárias para retardar a eluição na coluna Mono Q. A análise das bandas das células tratadas com insulina do mesmo gel, indicavam que as bandas contendo a ERK com reacções cruzadas e contendo a fosfotirosina co-migravam.6526-049-118 «t» —59— presumably to changes in the phosphorylation of these proteins. Identical immunoblots were probed with antiphosphotyrosine antibodies and revealed little or no phosphotyrosine in ERK1 or ERK2 before treatment with NGF. Treatment with NGF resulted in increased phosphorylation of tyrosine residues in both ERK1 and ERK2. Phosphotyrosine was detectable in both displaced and non-displaced ERK1 proteins, suggesting that multiple modifications (such as additional phosphorylation in tyrosine, threonine and / or serine, which would be consistent with the immunoprecipitated ERKl phosphoamino acid analysis described above) are necessary to delay elution in the Mono Q column. Analysis of the cell bands treated with insulin from the same gel, indicated that the cross-reacting ERK-containing and phosphotyrosine-containing bands co-migrated.

tratamento com NGF resultou também em dois picos principais de actividade de MBP-quinase, no perfil de eluição da coluna Mono Q, que não estavam presentes no perfil de células não tratadas. 0 primeiro pico de actividade co-eluía com a proteína ERK2 deslocada (mas também co-eluía com a proteína ERKl não deslocada), enquanto o segundo pico co-eluía com a proteína ERKl substituída. O primeiro pico de actividade de MBP-quinase não era imunoprecipitável com antissoro 837, ao contrário do segundo pico. Além disso, alguma actividade do primeiro pico podia ser precipitada com um anticorpo contra ERK2 recombinante, que possuía uma capacidade limitada para imunoprecipitar a ERK2, mas nenhuma podia ser precipitada do segundo pico. Adicionalmente, a actividade de ambos os picos podia ser inactivada por ambas as fosfatases: a serina/treonina fosfatase 2a e a tirosina fosfatase CD45 (Boulton and Cobb, May 1991, in Cell Regulation, Vol. II). Assim, estas observações apoiam a conclusão de que a actividade no segundo pico é devida a uma ERKl totalmente modificada e que a no primeiro pico é devida à ERK2 activada e não a uma ERKl parcialmente modificada. No seu conjunto os dados indicam que ERKl e ERK2 são rapidamente activadas em resposta a sinais extracelulares como a insulina e o NGF, e que esta activação está relacionada com o aumento da fosforilação da tirosina, mas que, a activação por inteiro requer modificações adicionais.NGF treatment also resulted in two main peaks of MBP-kinase activity, in the Mono Q column elution profile, which were not present in the untreated cell profile. The first peak of activity co-eluted with the displaced ERK2 protein (but also co-eluted with the non-displaced ERK1 protein), while the second peak co-eluted with the replaced ERK1 protein. The first peak of MBP-kinase activity was not immunoprecipitable with antiserum 837, unlike the second peak. In addition, some activity from the first peak could be precipitated with an antibody against recombinant ERK2, which had a limited ability to immunoprecipitate ERK2, but none could be precipitated from the second peak. In addition, the activity of both peaks could be inactivated by both phosphatases: serine / threonine phosphatase 2a and tyrosine phosphatase CD45 (Boulton and Cobb, May 1991, in Cell Regulation, Vol. II). Thus, these observations support the conclusion that activity in the second peak is due to a fully modified ERK1 and that in the first peak is due to activated ERK2 and not partially modified ERK1. Taken together, the data indicate that ERK1 and ERK2 are rapidly activated in response to extracellular signals such as insulin and NGF, and that this activation is related to increased tyrosine phosphorylation, but that full activation requires additional modifications.

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6526-049-118 iíf6526-049-118 iíf

7.3. DISCUSSÃO7.3. DISCUSSION

Comparámos as sequências de três membros da família ERK. As hibridações com ADN genómico de ratazana e humano (que definem um mínimo de 3 novos genes ERK além dos ERK 1, 2 e 3 na ratazana), pesquisas em bibliotecas de ADNc e de ADN genómico, e imunotransferências com antissoros específicos para ERK (que definem pelo menos um ERK novo além dos ERK2 e ERK3), sugerem existir genes adicionais de ERK na ratazana, e talvez ainda mais na espécie humana. Existe evidência para a estimulação da actividade da MAP2/MBP-quinase em diferentes tipos de células em resposta a uma variedade de sinais; existe até uma evidência ainda mais extensiva para a fosforilação da tirosina de proteínas de 40 a 45 kDa em resposta à estimulação celular (Cooper and Hunter, 1981, Mol. Cell. Biol. .1:165-178? Maytin et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:12135-12143? Cooper et al., 1984, Mol. Cell. Biol. .4:30-37; Martinez et al., 1982, Mol. Cell. Biol. 2.5 653-685; Cooper et al., 1982, Cell 31: :263-273; Rossomando et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86:6940-6943; Ferrell and Martin, 1990, Molec. Cell. Biol. 10:3020-3025; Gold et al., 1990, Nature 345:810-813). Os nossos resultados indicam que a actividade de MAP2/MBP quinase medida em extractos de células estimuladas por insulina e NGF, é derivada não de uma só enzima, mas de pelo menos duas proteína-quinases diferentes, ERK1 e ERK2. Estes dados são consistentes com as nossas investigações que sugerem uma família alargada de enzimas relacionadas com a ERK na ratazana. Concluímos que actividades similares encontradas em outros tipos de células, em resposta a outros estímulos podem ser devidas às ERK1 e ERK2 isoladas, a ambas as enzimas e talvez a outros membros desta família. Os primeiros três membros caracterizados desta família foram isolados de uma biblioteca de ADNc de cérebro e são encontradas aos níveis mais elevados no sistema nervoso, embora a expressão de cada ERK apresente uma regulação diferente a nível tecidual e de desenvolvimento. A pesquisa em bibliotecas de outros tecidos pode levar ao isolamento de ERK com função predominante em tecidos não neurais.We compared the strings of three members of the ERK family. Hybridizations with rat and human genomic DNA (which define a minimum of 3 new ERK genes in addition to the ERK 1, 2 and 3 in the rat), searches in cDNA and genomic DNA libraries, and immunoblots with ERK-specific antisera (which define at least one new ERK in addition to ERK2 and ERK3), suggest that there are additional ERK genes in the rat, and perhaps even more in the human species. There is evidence for the stimulation of MAP2 / MBP-kinase activity in different types of cells in response to a variety of signals; there is even more extensive evidence for tyrosine phosphorylation of proteins from 40 to 45 kDa in response to cellular stimulation (Cooper and Hunter, 1981, Mol. Cell. Biol. .1: 165-178? Maytin et al., 1984 , J. Biol. Chem. 259: 12135-12143 - Cooper et al., 1984, Mol. Cell. Biol .4: 30-37; Martinez et al., 1982, Mol. Cell. Biol. 2.5 653-685 ; Cooper et al., 1982, Cell 31:: 263-273; Rossomando et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6940-6943; Ferrell and Martin, 1990, Molec. Cell. Biol. 10: 3020-3025; Gold et al., 1990, Nature 345: 810-813). Our results indicate that MAP2 / MBP kinase activity measured in extracts of cells stimulated by insulin and NGF, is derived not from a single enzyme, but from at least two different protein kinases, ERK1 and ERK2. These data are consistent with our investigations that suggest an extended family of ERK-related enzymes in the rat. We concluded that similar activities found in other types of cells, in response to other stimuli, may be due to ERK1 and ERK2 alone, to both enzymes and perhaps to other members of this family. The first three characterized members of this family have been isolated from a brain cDNA library and are found at the highest levels in the nervous system, although the expression of each ERK has a different regulation in terms of tissue and development. Research in libraries of other tissues can lead to the isolation of ERK with a predominant function in non-neural tissues.

As quinases mais proximamente relacionadas com as ERK são os produtos dos genes KSS1 (Courchesne et al., 1989, CellThe kinases most closely related to ERK are the products of the KSS1 genes (Courchesne et al., 1989, Cell

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58:1107-1111) e FUS3 (Ellon et al., 1990, 60:649-664) prèvTàmentê clonados em levedura. 0 KSS1 supera a paragem do crescimento induzida pelo factor de cruzamento. Pelo contrário, o FUS3 leva à paragem do ciclo celular em resposta aos factores de cruzamento. Devido às regiões de nova identidade entre as três ERK, parece provável a sua evolução de um precursor comum. A relação entre as ERK e os seus parentes de levedura, sugere gue as eucariotas multicelulares superiores possuam quinases apropriadas, originalmente utilizadas por respostas de cruzamento primordiais em organismos unicelulares, para mediar as respostas a sinais extracelulares. Além disso, as cdc2-quinases, que são os mais próximos parentes das ERK, parecem desempenhar papéis semelhantes na regulação do ciclo celular em eucariotas tão diversos como o homem e a levedura. Curiosamente, tal como no caso das ERK, as cdc2-quinases são também reguladas (talvez negativamente) pela fosforilação da tirosina e treonina.58: 1107-1111) and FUS3 (Ellon et al., 1990, 60: 649-664) prèvTàmentê cloned in yeast. KSS1 overcomes the growth factor-induced growth arrest. On the contrary, FUS3 stops the cell cycle in response to crossing factors. Due to the regions of new identity among the three ERKs, their evolution from a common precursor seems likely. The relationship between ERKs and their yeast relatives suggests that higher multicellular eukaryotes have appropriate kinases, originally used for primordial crossing responses in single-celled organisms, to mediate responses to extracellular signals. In addition, cdc2-kinases, which are the closest relatives of the ERK, appear to play similar roles in regulating the cell cycle in eukaryotes as diverse as man and yeast. Interestingly, as in the case of ERK, cdc2-kinases are also regulated (perhaps negatively) by tyrosine and threonine phosphorylation.

A compreensão do sinal de transdução requer a elucidação dos mecanismos pelos quais o receptor da fosforilação activada da tirosina é convertido nas fosforilações da serina/treonina que regulam os alvos a jusante. Definimos uma família de proteína serina-treonina-quinases, as ERK, como membros que são activados e fosforilados nos resíduos de tirosina em resposta ao NGF e à insulina. A iniciação da série de acontecimentos que culminam na activação das ERK pela insulina e pelo NGF podem ocorrer via receptores distintos; no entanto, sabe-se que ambas as hormonas originam a fosforilação da tirosina. Enquanto que para o receptor da insulina se reconheceu que ele contém uma actividade intrínseca de tirosina-quinase há já alguns anos, não está ainda claro como a activação do receptor do NGF origina a fosforilação intracelular da tirosina. Evidências recentes sugerem que o receptor do NGF pode conter actividade de tirosina-quinase (Kaplan et al., 1991, Nature 350:158-160) ou está associado com uma proteína desse tipo (Meakin and Shooter, 1991, Neuron 6.:153-163). Quaisquer que sejam os mecanismos envolvidos, a fosforilação das ERK representa o primeiro exemplo de proteínas intracelulares definidas que são fosforiladas na tirosina em resposta ao NGF.Understanding the transduction signal requires elucidating the mechanisms by which the receptor for activated tyrosine phosphorylation is converted into the serine / threonine phosphorylations that regulate downstream targets. We defined a family of protein serine-threonine kinases, the ERKs, as members that are activated and phosphorylated in the tyrosine residues in response to NGF and insulin. The initiation of the series of events that culminate in the activation of ERK by insulin and NGF can occur via different receptors; however, both hormones are known to cause tyrosine phosphorylation. While it has been recognized for the insulin receptor that it contains intrinsic tyrosine kinase activity for some years now, it is not yet clear how activation of the NGF receptor causes intracellular tyrosine phosphorylation. Recent evidence suggests that the NGF receptor may contain tyrosine kinase activity (Kaplan et al., 1991, Nature 350: 158-160) or is associated with such a protein (Meakin and Shooter, 1991, Neuron 6.:153 -163). Whatever the mechanisms involved, ERK phosphorylation represents the first example of defined intracellular proteins that are phosphorylated in tyrosine in response to NGF.

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As nossas observações sugerem que uma propriedade característica desta família de quinases é a de actuar com o intermediário que depende da fosforilação da tirosina para activar as cascatas de fosforilação de serina/treonina em resposta a uma variedade de sinais extracelulares, embora não esteja ainda claro se as ERK são substratos directos para proteína-quinases associadas ao receptor, ou se se encontram mais a jusante, nas cascatas. Para delinear o envolvimento das ERK individuais nas redes de fosforilação, e a forma como podem combinar a sua actuação, pode ser necessário determinar como diferentes tipos de células produzem o complexo conjunto de respostas aos muitos sinais extracelulares que activam a fosforilação da tirosina. Por exemplo, a actuação do mesmo sinal através do mesmo receptor, durante estágios de desenvolvimento diferentes ou em diferentes tipos de células, pode originar repostas diferentes (ex.: proliferação versus diferenciação). A activação das ERK específicas em diferentes contextos pode contribuir para interpretações múltiplas do mesmo sinal ou respostas comuns a sinais diferentes. A observação de que as três quinases são diferentemente expressas em tecidos em desenvolvimento e a constatação de que as ERK 2 e 3 são induzidas num sistema modelo para o desenvolvimento do neurónio enquanto a ERK1 se perde neste processo, apoiar ainda a noção de que estas enzimas desempenham papéis únicos nos mecanismos de transdução de sinal mobilizados durante o desenvolvimento. Além disso, a desregulação de tais moléculas de sinal potencialmente tão importantes pode estar envolvida na transformação celular e oncogénese.Our observations suggest that a characteristic property of this kinase family is that it acts with the intermediate that depends on tyrosine phosphorylation to activate serine / threonine phosphorylation cascades in response to a variety of extracellular signals, although it is not yet clear whether ERKs are direct substrates for receptor-associated protein kinases, or if they are further downstream, in cascades. To outline the involvement of individual ERKs in phosphorylation networks, and how they can combine their action, it may be necessary to determine how different types of cells produce the complex set of responses to the many extracellular signals that activate tyrosine phosphorylation. For example, the action of the same signal through the same receptor, during different stages of development or in different types of cells, can give rise to different responses (eg, proliferation versus differentiation). The activation of specific ERKs in different contexts can contribute to multiple interpretations of the same signal or common responses to different signals. The observation that the three kinases are differently expressed in developing tissues and the finding that ERK 2 and 3 are induced in a model system for neuron development while ERK1 is lost in this process, further supporting the notion that these enzymes play unique roles in the signal transduction mechanisms deployed during development. In addition, deregulation of such potentially important signal molecules may be involved in cell transformation and oncogenesis.

A clonagem dos genes ERK e a identificação de uma linha celular em diferenciação em que sejam independentemente reguladas pode ser utilizada para elucidação do papel das ERK nas cascatas de fosforilação, e na revelação dos mecanismos envolvidos na regulação desta família de quinases. A expressão de proteínas ERK recombinantes e seus mutantes pode ser utilizada para definir os papéis destas quinases in vivo e determinar os resíduos envolvidos na função e activação da ERK. Os anticorpos contra regiões comuns e únicas das ERK podem facilitar a observação de como membros individuais participam nas várias respostas. AThe cloning of ERK genes and the identification of a differentiating cell line in which they are independently regulated can be used to elucidate the role of ERK in the phosphorylation cascades, and to reveal the mechanisms involved in the regulation of this family of kinases. The expression of recombinant ERK proteins and their mutants can be used to define the roles of these kinases in vivo and to determine the residues involved in the function and activation of ERK. Antibodies against common and unique ERK regions can facilitate observation of how individual members participate in the various responses. THE

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-63indicação dos perfis Mono Q de que ambas, a ERK1 inactiara^s actjf^ va, contêm fosfotirosina após estimulação, sugere que a extensão da activação da ERK1 é também determinada pela fosforilação serina/treonina. O grande aumento de actividade da MBP-quinase induzido pelo ácido ocadaico (Haystead et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:16571-16580). é consistente com esta noção. A disponibilidade de proteínas recombinantes pode ser utilizada para dissecar os papéis de ambas as fosforilações, a de serina/treonina e a de tirosina, na activação da ERK. Nesta perspectiva, a ERK2 recombinante possui uma actividade semelhante à ERK1 nativa desfosforilada, sugerindo que a proteína recombinante pode estar na conformação apropriada para ser activada por fosforilação. De facto, experiências mostram que a actividade da ERK1 desfosforilada é aumentada para a actividade específica da proteína purificada activa e a actividade do recombinante ERK2 é aumentada de 150 a 200 vezes por um activador sensível ao EGF recentemente descrito por Ahn et al. (1991, J. Biol. Chem. 266:4220-4227). A capacidade de activar ERK2 in vitro verifica a utilidade das proteínas ERK recombinantes na pesquisa de substratos únicos ou compartilhados, activadores (ex.: serina/treonina e tirosina quinases) e inactivadores (ex.: fosfatases).-63 indication of the Mono Q profiles that both, ERK1 inactivated, contain phosphotyrosine after stimulation, suggests that the extent of ERK1 activation is also determined by serine / threonine phosphorylation. The large increase in MBP kinase activity induced by ocadaic acid (Haystead et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 16571-16580). is consistent with this notion. The availability of recombinant proteins can be used to dissect the roles of both phosphorylations, that of serine / threonine and that of tyrosine, in the activation of ERK. In this perspective, recombinant ERK2 has an activity similar to native dephosphorylated ERK1, suggesting that the recombinant protein may be in the appropriate conformation to be activated by phosphorylation. In fact, experiments show that the activity of dephosphorylated ERK1 is increased to the specific activity of the purified active protein and the activity of the recombinant ERK2 is increased 150 to 200 times by an EGF-sensitive activator recently described by Ahn et al. (1991, J. Biol. Chem. 266: 4220-4227). The ability to activate ERK2 in vitro verifies the usefulness of recombinant ERK proteins in the search for single or shared substrates, activators (eg serine / threonine and tyrosine kinases) and inactivators (eg phosphatases).

8. DEPÓSITO DE MICRORGANISMOS8. DEPOSIT OF MICRO-ORGANISMS

Os seguintes plasmídeos e linhas celulares foram depositados na American Type Culture Collection em Rockville, Maryland.The following plasmids and cell lines were deposited at the American Type Culture Collection in Rockville, Maryland.

N^a. de acessoN ^a . access

Linha celular Rat 1 HIRc B Plasmídeo pBS-rERKl Plasmídeo pBS-rERK2 Plasmídeo pBS-rERK3Rat 1 HIRc B cell line pBS-rERKl Plasmid pBS-rERK2 Plasmid pBS-rERK3 Plasmid

Data do depósitoDeposit date

CRL 10476 CRL 10476 31 31 de in Maio May de in 1990 nineteen ninety 40808 40808 23 23 de in Maio May de in 1990 nineteen ninety 40809 40809 23 23 de in Maio May de in 1990 nineteen ninety 14 14 de in Maio May de in 1990 nineteen ninety

O invento apresentado não deve ser limitado no seu âmbito pelas construções depositadas ou pelas concretizações descritas nos exemplos apresentados, cuja intenção é apenas a ilustração de alguns aspectos do invento e quaisquer concretizações funcionalmente equivalentes estão no âmbito deste invento. Com efeito,The presented invention should not be limited in scope by the deposited constructions or the embodiments described in the examples presented, whose intention is only to illustrate some aspects of the invention and any functionally equivalent embodiments are within the scope of this invention. Indeed,

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várias modificações do invento para além daquelas mostradas e descritas aqui, serão aparentes para os peritos na arte e pretende-se que estejam no âmbito das reivindicações em apêndice.various modifications of the invention other than those shown and described herein, will be apparent to those skilled in the art and are intended to be within the scope of the appended claims.

Várias referências foram aqui citadas, estando os seus conteúdos aqui incorporadas para referência na sua totalidade.Several references were cited here, and their contents are incorporated herein for reference in their entirety.

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Claims (8)

REIVINDICAÇÕES 1 - Processo para a detecção da presença de um composto possuindo actividade semelhante à do factor de crescimento de nervo, caracterizado por compreender:1 - Process for detecting the presence of a compound having activity similar to that of nerve growth factor, characterized by comprising: (i) cultivar células que produzem uma proteína MAP2-quinase que é activada por factor de crescimento de nervo, na presença de um composto que se suspeita ter actividade semelhante à do factor de crescimento de nervo; e (ii) detectar alterações no nível da actividade da proteína MAP2-quinase, sendo um aumento de actividade indicativo da presença de actividade semelhante à do factor de crescimento de nervo.(i) cultivating cells that produce a MAP2 kinase protein that is activated by nerve growth factor, in the presence of a compound suspected of having activity similar to that of nerve growth factor; and (ii) detecting changes in the level of MAP2 kinase protein activity, an increase in activity indicative of the presence of activity similar to that of nerve growth factor. 2 - Processo de acordo com a reivindicação l, caracterizado por as células serem células PC12.Process according to claim 1, characterized in that the cells are PC12 cells. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as células conterem uma molécula de ácido nucleico recombinante codificando uma MAP2-quinase de mamífero.Process according to claim 1, characterized in that the cells contain a recombinant nucleic acid molecule encoding a mammalian MAP2-kinase. 4 - Processo para a detecção da presença de um composto possuindo actividade semelhante à da insulina, caracterizado por compreender;4 - Process for the detection of the presence of a compound having insulin-like activity, characterized by comprising; (i) cultivar células que produzem uma proteína MAP2-quinase que é activada por insulina, na presença de tua composto que se suspeita ter actividade semelhante à da insulina; e (ii) detectar alterações no nível da actividade da proteína MAP2-quinase, sendo um aumento de actividade indicativo da presença de actividade semelhante à da insulina.(i) growing cells that produce a MAP2 kinase protein that is activated by insulin, in the presence of your compound that is suspected to have insulin-like activity; and (ii) detecting changes in the level of MAP2 kinase protein activity, with an increase in activity indicative of the presence of insulin-like activity. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por as células serem células 1 HIRc B de ratazana.Process according to claim 4, characterized in that the cells are rat 1 HIRc B cells. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por as células conterem uma molécula de ácido nucleico recombi72 686Process according to claim 4, characterized in that the cells contain a recombinant nucleic acid molecule 686 6526-049-1186526-049-118 -66nante codificando uma MAP2-quinase de mamífero.-66 encoding a mammalian MAP2-kinase. 7 - Processo para a detecção da presença de um composto que directa ou indirectamente provoca uma alteração nos níveis de actividade da proteína MAP2-quinase, earacterizado por compreender:7 - Process for the detection of the presence of a compound that directly or indirectly causes a change in the activity levels of the MAP2 kinase protein, characterized by comprising: (i) cultivar células que produzem uma proteína MAP2-quinase na presença de um composto; e (ii) detectar alterações no nível da actividade da proteína MAP2-quinase, sendo uma alteração da actividade indicativa da presença do composto .(i) cultivating cells that produce a MAP2 kinase protein in the presence of a compound; and (ii) detecting changes in the level of MAP2 kinase protein activity, a change in activity indicating the presence of the compound. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 7, earacterizado por o composto ser uma molécula de neurotrofina e por a alteração da actividade ser um aumento de actividade.Process according to claim 7, characterized in that the compound is a neurotrophin molecule and that the change in activity is an increase in activity. Lisboa, 31 j||i |99iLisbon, 31 j || i | 99i Por KEGENERON PHARMACEUTICALS, INC. e BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM =0 AGENTE 0FICIAL=By KEGENERON PHARMACEUTICALS, INC. and BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM = 0 AGENT 0FICIAL = S/S/ ReceptorReceptor F/G.l '^2/1$F / G.l '^ 2/1 $ FiG.ZFiG.Z AlAl Q-íefVtcwoSe íobverto.Q-íefVtcwoIfververted. — <á^,<rv}e$ deviv&Aos di*s cek £ 10 ~20 30 40- <á ^, <rv} and $ deviv & Aos di * s cek £ 10 ~ 20 30 40 Numevc Je frixc^oeiNumevc Je frixc ^ oei A2A2 C-Sesna.*cseC-Sesna. * Cse W ;;; --------- - -. — -o, ·*·'W ;;; --------- - -. - -O, ·*·' 0 2 0 3 0 4 00 2 0 3 0 4 0 Num«iM 4.a 4i-ateoeiIn an «iM 4.a 4i-ateoei Phanyl-SepnarosePhanyl-Sepnarose ACA-Í4 cs 30 r———————ACA-Í4 cs 30 r ——————— Ί.Ί.