PT97230B

PT97230B - Metodo para a proteccao de plantas contra patogenos mediante introducao de um gene de avirulenica ou uma sua porcao no genoma de uma planta

Info

Publication number: PT97230B
Application number: PT97230A
Authority: PT
Inventors: Peter Jozef Gerard Marie D Wit
Original assignee: Mogen Int
Priority date: 1990-04-02
Filing date: 1991-04-02
Publication date: 1998-07-31
Also published as: NL9000773A; DE69130660D1; EP0874055A3; EP0474857A1; ATE174931T1; GR3029461T3; IE911083A1; WO1991015585A1; PT97230A; IE911110A1; JPH05505110A; IL97736A; DE69130660T2; IE990337A1; AU7684591A; ES2128318T3; IL97736A0; US5866776A; EP0474857B1; CA2056439A1

Description

MÉTODO PARA A PROTECÇÃO DE PLANTAS CONTRA PATOGENQS

A presente invenção refere-se um método para a protecção de plantas contra agentes patogénicos, refere-se também a uma sequência polinucleotídica que engloba um gene avirulento (E) de um agente patogénico regulado por um promotor patogé. nico induzível e refere-se também a uma sequência polinuclejo tídica que engloba o gene resistente correspondente (R) regulado por um promotor patogénico induzível, pelo que as re. feridas sequências de ADN podem ser utilizadas no referido método. A presente invenção também se refere a uma planta obtida através do referido método.

Durante a evolução muitos fungos e bactérias que são patogénicos para as plantas especializaram-se apenas numa única espécie hospedeira ou algumas vezes mesmo apenas numa variedade da referida espécie. Deste modo podem encontrar-se espécies de agentes patogénicos que apenas colonizam determinadas culturas de hospedeiras e não colonizam outras culturas. No último caso as culturas tornam-se resistentes atra, vés de um mecanismo de defesa rapidamente induzido.

-2Tendo em vista efectuar uma colonização bem sucedj_ da da planta, o agente patogénico deve invadir, suprimir ou anular o mecanismo de defesa existente da planta. Em termos genéticos podem descrever-se as interacções da estirpe específica para a cultura de acordo com um modelo gene-a-gene, em que uma molécula proteica estimuladora (e) que codifica o gene virulento de um agênte patogénico (E) interactua com uma molécula proteica receptora (r) codificada por um gene resistente da planta (R) induzindo deste modo o mecanismo de defesa que muitas vezes se torna fenotipicamente visível através de uma resposta de hipersensibilidade (HR): a morte local de algumas células da planta, o que destrói simultaneamente o agente patogénico (De Wit, 1986).

As interacções genéticas gene-a-gene encontram-se descritas em obras literárias, especialmente as interacções entre os fungos patogénicos e as plantas (I.R. Crute, 1985), embora se saiba muito pouco acerca dos mecanismos bioquímiI cos e moleculares (De Wit, 1987, Collinge e Slusarenko, 1987).

agente patogénico que não possua o gene aviruleji to ou o agente patogénico no qual o gene avirulento não se expresse não pode estimular o sistema de defesa dos hospedeiros e subsequentemente não pode efectuar uma colonização bem sucedida: neste caso a planta hospedeira torna-se sensível ao agente patogénico.

Clonaram-se diversos genes avirulentos estirpes específicas a partir de diversas bactérias patogénicas para as plantas, transformando-se as espécies virulentas com clones genómicos de espécies avirulentas que se ensaiaram subsequentemente para se observar a avirulência em genótipos de plantas que possuem o gene resistente correspondente (Staskawicz et al., '84, Stàskawicz et al. '87, Shintaku M.

W. et al., '89, Vivian et al. '80, Hitchin et al. '89).

Este método de isolamento dos genesbacterianos avirjj lentos não é contudo aplicável aos genes avirulentos dos fuji gos devido à sua baixa eficácia de transformação e à perda de sistemas de clonagem adequados tais como vectores cosmidos com uma ampla gama de hospedeiros. 0 único fungo para o qual se determinou um sistema de transformação eficaz com um vector de replicação autónomo foi o Ustilago maydisf (Leong, 1989).

Descobriu-se que as plantas podem desenvolver uma larga protecção contra os agentes patogénicos introduzindo uma sequência pol inucleot.ídica que englobe pelo menos uma sequência do gene avirulento de um agente patogénico (E) que codifica uma molécula proteica estimuladora específica (e) ou uma sua porção, no genoma de uma planta que contenha o gene correspondente de resistência (R), e proporcionando meios para a regulação de expressão dos referidos genes de

tal modo que ocorra uma expressão simultânea apenas no sítio de infecção e que se possa conseguir a indução da referida expressão simultânea por uma ampla gama de agentes patogénicos.

E possível introduzir a sequência polinucleotídica anteriormente referida qué engloba pelo menos uma sequência de um gene avirulento de um agente patogénico (E) numa plaji ta que contenha o gene resistente (R) que se expresse pelo menos no sítio da infecção, supostamente, podendo até expres. sar-se constitutivamente em toda a planta. Neste caso o gene de avirulento (E) tem de ser regulado por um promotor que seja induzido por um agente patogénico e que permita apenas a expressão no sítio da infecção no sentido de evitar a indução de uma reacção de hipersensibi1 idade em toda a planta.

A reacção de hipersensibi1 idade pode apenas ser activada por um agente patogénico ou por uma molécula estimuladora específica produzida por um agente patogénico. A res. posta de hipersensibilidade não deve ser induzida ou deve ser dificilmente induzida por outros estímulos exteriores e deverá limitar-se a uma área em redor do sítio da infecção. Sem estas limitações a activação poderá originar a destruição virtual da planta.

Ζ

Daí é possível introduzir um gene resistente (R) correspondente ao gene avirulento (E) numa planta que ainda não contenha o gene resistente correspondente (R). Pode levar-se a efeito este procedimento através de reprodução ou através de técnicas de manipulação genética.

Num último caso e’possível introduzir uma sequência polinucleotídica que englobe pelo menos uma sequência de um gene resistente (R) ou de uma sua porção e de um promotor de planta (P) que possa ser induzido por uma ampla gama de ageji tes patogénicos de tal modo que o gene resistente se expres. se apenas no sítio da infecção. Neste caso é ainda possível para o gene avirulento (E) expressar-se constitutivamente o mesmo em toda a planta. Também é possível para o gene (E) e para o gene (R) serem regulados por promotores idênticos des. de que sejam estritamente induzíveis no sítio da infecção e apenas por um agente patogénico.

Nos aspectos anteriormente referidos é necessário que o promotor induzido pelo agente patogénico que se utilj_ ze possua as seguintes características:

a) seja induzido por todos ou pela maioria dos agentes patogénicos das plantas ou por estimuladores específicos produzidos pelos referidos agentes patogénicos ;

b) que sejam apenas virtualmente induzíveis pelos agen

tes patogénicos e não sejam susceptiveis de serem induzidos ou só muito dificilmente possam ser indu. zidos por outros estímulos exteriores;

c) que sejam capazes de expressar os genes que são con.

trolados pelo promotor a um nível especificamente local e nunca a nível sistémico.

De acordo com outro aspecto da presente invenção o gene (E) ou o gene (R) podem ser específicos de um tecido e o outro gene deve ser induzível por um agente patogénico apenas no sítio da infecção no tecido para o qual o primeiro gene é específico desse tecido.

No caso em que seja, por exemplo, possível introduzir um ge ne (R) que se expresse apenas nas raízes da planta e um gene (E) que seja totalmente induzido por um agente patogénico nas raízes ainda que possa ser induzido constitutivamente noutros tecidos obtém-se deste modo uma protecção contra os agentes patogénicos para as raízes.

gene avirulento (E) pode derivar de um fungo, de uma bactéria, de um vírus ou de um nematode. Um exemplo de um fungo patogénio para uma planta a partir do qual se pode derivar facilmente um gene avirulento é o Cladosporium fulvum.

Pode utilizar-se o gene resistente (R) que se encontra naturalmente presente por exemplo numa planta que se ja um membro da família das Solanaceae, tal como uma planta da espécie Lycopersicon esculentum.

E possível introduzir este gene (R) num outro membro da família das Solanaceae por reprodução. 0 referido outro membro também pode ainda conter o gene avirulento (E) rigorosamente regulado ou ainda subsequentemente o referido gene avirulento pode ser introduzido numa planta através de técnicas de manipulação genética. 0 gene resistente (R) pode obviamente ser também introduzido através de técnicas de manipulação genética.

A selecção da combinação do gene avirulento (E) e do gene resistente (R) assim como os promotores que se pr£ tendem introduzir numa planta através de reprodução ou de técnicas de manipulação genéticas dependerá da variedade da planta que se pretende proteger e se o gene resistente (R) se encontra naturalmente presente na planta.

Sabe-se que no reino vegetal os promotores das ρ 1 a_n tas susceptíveis de serem induzidos por agentes patogénicos são induzidos por uma ampla gama de agentes patogénicos e por agentes estimulantes específicos produzidos por esses agentes patogénicos.

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Também se sabe que estes promotores das plantas apenas se expressam de um modo muito localizado e nunca a nível sistémico.

Matton e Brisson (1989), por exemplo descrevem a sequência nucleotídica do clone de cADN (pSTH-2) que corresponde às sequências de mARN que se acumulam especificamente na bata^ ta após a estimulação com estimuladores não específicos de

P. infestans (Marineau e outros, 1987), assim como um clone estreitamente relacionado,'pSTH-21 que apresenta grandes semelhanças na sequência aminoácida com os clones de cADN correspondentes às proteínas relacionadas com patogénes induzidas por agentes patogénicos e por agentes estimuladores das ervilhas (42%) (Fritensky et al., 1988) and parsley (37%) (Somsisch 1988). Matton e Brisson (1989) também descrevem a acumulação de mARNs correspondentes aos referidos clones pSTH-2 e pSTH-21 em diversos tecidos de batata e nas folhas do tomate. Somsisch (1986) descreve um modo segundo o qual a síntese de novo das proteínas relacionadas com patogéneses (PR) nas culturas das células de salsa podem ser conseguidas por tratamento com estimuladores fúngicos. Neste sistema a síntese das proteínas-PR é precedida pela síntese do mARN de que resulta a rápida e temporária activação dos genes correspondentes. Esta activação também se observa nas plantas de salsa intactas após infecções por fungos (Somsisch, 1988) e é acompanhada por uma acumulação maciça embora local de mARN em redor das fontes infecciosas. De um modo geral os genes envolvidos na síntese de fitoalexinas são induzidos de um modo bastante restrito nas plantas por diversos tipos de agentes patogénicos e pelos seus estimula, dores específicos (Hahlbrock, H.and Scheel, D., 1989; Kuc,

J. and Rush, J.S., 1985).

Um dos métodos qué se podem utilizar para a detecção de um gene resistente (R) de uma planta em que o produto (r) do referido gene apresenta ínteracção com uma molécula proteica estimuladora específica (e) que é codificada por um gene avirulento de uma agente patogénico (E) pode ser descrita conforme se segue; de acordo com este método isolam-se uma proteína estimuladora específica (e), um gene resi£ tente (r) e subsequentemente um gene resistente (R) com o auxílio do produto de um gene avirulento (E).

Em princípio pode utilizar-se este método para o isolamento de qualquer gene resistente (r) e do gene resistente codifi_ cante (R) quando o gene avirulento correspondente (E) e o seu produto (e) são conhecidos. Pode representar-se o método conforme se segue; prepara-se uma biblioteca de cADN de uma planta que contenha o gene resistente (R) num vector de expressão, produzindo-se deste modo o produto de (R), o receptor (r). Detecta-se o clone positivo na biblioteca de cADN ligando uma molécula proteica eliciadora específica (e) à proteína receptora (r). A ligação (constituição do comple xo de (e) com (r) torna-se visível marcando (e) com um mar10 cador detectável. Este clone de cADN positivo contém a sequência que codifica o gene resistente. Pode detectar-se ge ne (R) intacto com este clone de cADN a partir da biblioteca genómica da planta que contém o gene resistente. Com o auxílio de cADN ou do clone genómico pode transformar-se uma planta que não possua o gene resistente. Efectua-se o rastreio dos transformantes positivos para se verificar se possuem ou não o gene da resistência por inoculação (coji taminação) com o agente patogénico adequado. Pode introduzir-se o gene (R) clonado nas plantas quer através de técnicas de menipulação genética quer através de reprodução.

De um modo alternativo pode clonar-se o gene (R) de resistência de acordo com métodos publicados de marcação de transposões, procedimentos que envolvem cromossomas e substituições genómicas (Dickinson. M. D. e outros, 1991).

E altamente indesejável que os agentes patogénicos | desenvolvam tolerância para uma planta que englobe os dois componentes, isto é o gene (E) e o gene (R) (os dois compo* nentes do sistema sensor) obtidos através do método de acojr do com a presente invenção, devido à utilização de promotores específicos para as plantas induzíveis, induzíveis por todos os agentes patogénicos, para induzir a expressão local simultâ nea do gene avirulento (E) e do gene resistente (R). E necessário que pelo menos um dos promotores que regule quer o gene avirulento (E) quer o gene resistente (R) seja apenas /

Λ¹¹’ induzível no sítio da infecção no sentido de evitar a destruição virtual de toda a planta o que constitui um facto obviamente indesejável.

Uma vez que os dois componentes do sistema sensor, de acordo com a presente invenção, podem ser obtidos mediante diversas combinações gene avirulento-gene resistente em qualquer planta na qual o gene avirulen to e o gene resistente se possam'expressar, é amplamente aplicável contra a maioria senão todos os agentes patogénicos do reino vegetal.

Os dois componentes do sistema sensor proporcionam uma excelente solução para reduzir a utilização de pesticidas actualmente utilizados com frequência contra os agentes patogénicos. Na devida altura isto tornara possível a modificação do meio de uma grande parte destes agentes.

A título de exemplo, proporciona-se a descrição da preparação de um sistema sensor constituído por dois componentes, de acordo com o método da presente invenção.

EXEMPLO

Aplicou-se um gene avirulento de Cladosporium fulvum (designadamente o gene avirulento avr9, que se referiu anteriormente na literatura como o gene A9) como o gene avirulento em combinação com o gene correspondente resistente Cf9, que se encontra naturalmente presente nas culturas de tomate. Este sistema sensor constituído por dois componentes pode propagar-se pelo menos por cultura em diversas espécies de gene Lycopersicon e de uma parte da família de Solanaceae e podem ser eventualmente introduzidos através de técnicas de manipulação genética nas referidas plantas ou em outras famílias.

Identificaram-se diversas moléculas estimuladoras específicas da espécie que codificam diversos fungos que in. duziam necrose nas culturas de tomate contendo os genes de resistência correspondentes (De Wit and Spikman 1982; De Wit et al. 1985). Purificou-se uma tal molécula estimuladora es. pecífica da espécie produto do gene avirulento avr9 até se atingir a homogeneidade. A proteína purificada induzia uma necrose rápida e local apôs a sua injecção em folhas de genótipos de tomate contendo o gene de resistência Cf9. Nos genótipos que continham outros genes-Cf este facto não ocor. reu. A sequência aminoácida da molécula estimuladora purifi. cada foi determinada (Schottens-Toma e De Wit 1988). A molé cuia estimuladora era formada em todas as interacções compatíveis entre as espécies que envolviam o tomate-C. fulvum com os fungos que eram avirulentos para o genótipos Cf9 dos tomates, não se verificou, contudo, uma única interacção que envolvesse as espécies de fungos que eram virulentos nos g_e nótipos Cf9 (Scholtens-Toma e outros 1989). Para se detectar o mARN que codificava a proteína que induzia a necrose, isto é a proteína estimuladora, sintetizaram-se 4 sondas oligonucleotídicas a partir de sequências aminoácidas (Fig. 1). Os oligonucleotidos continham quer misturas de nucleó*tidos (tais como os existentes na sonda B) ou inosinas (tais como os existentes na sonda D) ou uma combinação de ambos (tais como os existentes nas sondas A e C). Marcaram-se os quatro oligonucleótidos nas extremidade 5 e hibridizaram-se com manchas Northern idênticas, contendo idênticas quantida

-13' V des de poli(A)-ARN derivado de plantas de tomate saudáveis,

C. fulvum cultivado in vitro e 3 interacções compatíveis di_ ferentes de tomate-C. fulvum. A Fig. 2 indica que a sonda B se hibridizou especificamente com um mARN de aproximadamente 600 nucleótidos que se encontrava presente em duas interacções compatíveis designadamente: cultura Cf4/espécie 4 (pista 3) e cultura Cf5/eSpécie 5(pista 4). Este mARN não foi encontrado em plantas de tomate que não se encontravam infec tadas (pista 1) ou no C.fulvum cultivado in vitro (pista 2).

Não se observou qualquer hibridização na interacção da cultura de Cf5 com a espécie 2.4.5.9.11 (pista 5), tal como se poderia esperar de uma interacção de uma espécie que e vir£ lenta para os genótipos Cf9 do tomate. Deste modo conclui-se que a sonda B detectou o mARN para a proteína que induzia a necrose. As sondas A, C e D não detectaram mARNs específicos tal como se indica na Fig. 2.

Utilizou-se a sonda oligonucleotídica B num ensaio de extensão de um preparador. Marcou-se o oligonucleótido na extremidade 5 e hibridizou-se com igual quantidade de poli (A)-ARN derivado de interacções compatíveis de culturas Cf5 quer a espécie 5 quer com a espécie 2.4.5.9.11 (respectivamente representadas nas Fig. 1, pistas 4 e 5). Prolongou-se o preparador com transcriptase inversa e analisaram-se os produtos de extensão numa PAGE-gel. A Fig. 3 indica que um produto específico de extensão se formou no poli(A)-ARN de-14rivado da interacção de culturas Cf5/espécie 5 (pista 1). 0 mesmo não se verificando no poli(A)-ARN derivado da intera£ ção de culturas Cf5/espécie 2.4.5.9.11 (pista 2). 0 tamanho e a extensão do produto era de aproximadamente 270 nucleótidos o que indicava que o rnARN de avr9 possuia aproximadamente 200 nucleótidos para a sequência que codificava a proteína que induzia a necrose.

poli(A)-ARN derivado da interacção de Cf5/espécie 5 (representado na Fig. 2, pista 4) foi utilizado para se preparar uma biblioteca de cADN no lambda-gtll. Obteve-se uma biblioteca contendo 100.000 recombinantes independentes. A observação dos filtros que continham 5.000 fagos com a sonda B oligonucleotídica marcada na extremidade originou o isolamento de dois possíveis candidatos, um que se hibridizou fracamente (fago A9-1), e um que se hibridizou de um modo apreciavelmente melhor (fago A9-2).

Purificaram-se ambos os fagos e isolou-se o ADN. 0 ADN do | fago foi marcado e hibridizado com manchas que eram idênticas às manchas indicadas na Fig. 2. 0 fago A9-1 foi hibn dizado com um rnARN que continha aproximadamente 1.500 nucleótidos e que se encontrava presente numa pequena quantidade nas três interacções entre tomate e C. fulvum. Este fa. go não continha o cADN correspondente ao rnARN observado na Fig. 2 e não foi posteriormente analisado.

ADN marcado do fago A9-2 foi hibridizado com um mARN de aproximadamente 600 nucleótidos que apenas se encon. travam presentes nas interacções compatíveis de culturas Cf-4/espécie 4 e culturas Cf-5/espécie 5, isto é num padrão que correspondia à hibridização observada com a sonda o 1ig£ nucleotídica B. Por isso o fago A9-2 continha uma cópia do mARN que codificava a proteína que induzia a necrose. 0 cADN presente no fago A9-2 foi subclonado e determinou-se a sua sequência . A inserção tinha úm comprimento de 405 pares de bases e correspondia à extremidade 3 do mARN englobando um prolongamento poIi(A) de 20 nucleótidos. A inserção codificava a sequência total da proteína que induzia a necrose e encontrava-se englobada numa sequência de transcrição aberta mais longa. Calculou-se a partir da posição da sonda oligonucle£ tídica B na sequência de ADN e do tamanho do produto de extensão do preparador que a inserção do clone A9-2 não possuia aproximadamente 110 pares de bases na extremidade 5 de mARN. No sentido de se obter o comprimento total do clone de cADN examinou-se a biblioteca de cADN novamente com uma sonda de ARN marcada contendo 70 nucleótidos da extremidade 5 da inserção do clone A9-2. Obtiveram-se três fagos diferentes A9-3, A9-5 e. A9-8 e subclonaram-se e sequenciaram-se suas inserções. A sequência dos três clones era completamente idên. tica à sequência do clone A9-2 nas regiões de sobreposição.

Os 4 clones continham prolongamentos poli(A) que começavam em diferentes posições da sequência. Derivava de um ensaio

de extensão do preparador indicada na Fig. 3 em que o clone maior (A9-3) não possuía aproximadamente 35 nucleótidos. Pa. ra além disto concebeu-se um novo preparador que se hibrid£ zou na posição 75-100. Este preparador foi utilizado num ejn saio de extensão de preparador em poli(A)-ARN na presença de didesoxinucleótidos. Esta sequência de ARN conduziu à adição de outros 24 nucleótidos em frente da inserção de A9- 3. Observaram-se outros produtos finais que eram mais compridos em 5-20 nucleótidos'do que o produto que possuía a maior extensão. Os diversos produtos finais da extensão do preparador não foram originados pela degradação de mARN uma vez que um ensaio de extensão com um preparador para um mARN diferente proporcionou apenas um produto de extensão discreta com o tamanho correcto. Na Fig. 4 indica-se a sequênciade cADN de avr9 e a estrutura dos clones de cADN cor. respondentes. 0 isolamento e caracterização dos clones de cADN revelou que a proteína indutora de necrose é constitu^ da como uma proteína precursora por, pelo menos, 63 aminoácidos. De um modo surpreendente a sequência de ADN revelou um codão adicional de histidina na extremidade C da sequência da molécula estimuladora madura. Descreveu-se anteriormente que a molécula estimuladora possuía um comprimento de 27 aminoá. eidos (Scholtens-Toma e De Wit, 1988). A re-verificação dos dados sequenciais da proteína confirmou, contudo, a pre sença de um resíduo de histidina adicional na posição 28. Es. te resíduo tinha sido ignorado durante a análise original da sequência proteica devido a um baixo sinal obtido com este aminoácido. 0 peso molecular da molécula proteica estimuladora madura avr9 era de 3.189 Daltons.

Isolou-se um clone genómico do gene avirulento avr9 a partir da biblioteca genómica (no vector lambdaEMBL3) da espécie 5 de C. fulvum utilizando o clone de cADN A9-2. A análise sequencial revelou um intrão de 59 pares de bases, | uma suposta sequência TATA e diversas repatições na região promotora e terminadora.

Obtiveram-se os transformantes estáveis da espécie 2.4.5.9.11 com o clone genómico após co-transformação com pAN7 (resistência à higromicina). A espécie de tipo selvagem 2.4.5.9.11 é virulenta nos genótipos Cf9 de tomate mas o transformante não o é. Isto significa que a especificidade para as cuj. turas destes transformantes foi fenotipicamente convertida a partir de genótipos virulentos em genótipos avirulentos de Cf9 o que indica que o gene avirulento avr9 alterou o ge | nótipo de estirpe 2.4.5.9.11 no da estirpe 2.4.5.11. Este ensaio demonstra que o gene avirulento avr9 e na realidade o indutor causal da resistência em combinação com o gene Cf9 de resistência. Por isso pode concluir-se que a expressão simultânea e local de um gene avirulento (E) e o gene correspondete de resistência (R) numa planta dá origem a necrose local.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1,- Método para a protecção de plantas contra patogenos, caracterizado pelo facto de se introduzir urna sequência de um policucleõtido compreendendo pelo menos uma sequência de um gene de avirulência patogénica (E) que codifica uma molécula pro teica eliciadora específica (e) ou uma sua porção no genoma de ✓ uma planta que contem um gene de resistência correspondente (R) , na qual os genes (E) e (R) são regulados de tal forma que a expressão dos referidos genes só seja simultânea no sítio da infecção e a referida expressão simultânea possa ser induzida por uma larga gama de patogenos.
2.- Método para a protecção de plantas contra patogenos, caracterizado pelo facto de se introduzir uma sequência polinucleotídica compreendendo pelo menos uma sequência de um gene de uma avirulência (E) de um patogeno que codifica uma molécula proteica eliciadora específica (e) ou uma sua porção e um gene de resistência correspondente (R) no genoma de uma planta, na qual os genes (E) e (R) são regulados de tal forma que a expressão dos referidos genes só seja simultânea no sítio da infecção e a referida expressão .simultânea possa ser induzida por uma larga gama de patogenos.
3. - Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de a expressão simultânea no sítio da infecção ser conseguida por introdução no genoma da planta, que jã contém um gene (R,:

- de um gene de avirulência correspondente, sob o con tro lo de um promotor (P),.no qual o referido promotor íP) possa ser induzido por uma larga gama de patogenos e permita a expressão do gene (E) unicamente no sítio da infecção.
4, - Método de acordo com a reivindicação 2, caracteri zado pelo facto de a expressão simultânea no sítio da infecção ser conseguida por introdução no genoma da planta:

- de um gene se avirulência (E) sob o controlo de um promotor que permite a expressão pelo menos no sítio da infecção, e

- de um gene de resistência correspondente (R), sob o controlo de um promotor (P), no qual o referido promotor (P) pode ser induzido por uma larga gama de patogenos e permite a expressão do gene (R) unicamente no sítio da infecção.
5.- Método de acordo com qualquer das reivindicações de la 4, caracterizado pelo facto do promotor P ser seleccionado entre membros da família .Solanaceae.
6. - Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o promotor ser seleccionado entre membros do género L^cojoersicon ou Solanurn.
7. - Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto, do gene de avirulência (E) ser derivado a partir de fungos patogénicos de plantas.

J
8. - Método de acordp.com qualquer das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo facto do gene de avirulência (E) ser derivado a partir de uma bactéria patogénica de plantas.
9. - Método de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 6_; caracterizado pelo facto do gene de avirulência (E) ser derivado a partir de um nematode parasítico de plantas.

-2110.- Método de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo facto do gene de avirulência (Ξ) ser derivado a partir de um vírus patogénico de plantas.
11.- Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto do gene de avirulência (E) ser derivado de Cladosporum fulvum.
12.- Método de acordo com a reivindicação 11, caracte rizado pelo facto do gene de avirulência (E) ser avr9 ou uma sua porção.
13.- Método de acordo com a reivindicação 12, caracte rizado pelo facto do gene de avirulência avr9 compreender a sequência nucleotídica seguinte:

τ f g Sequência de mARN de avr9 e a estrutura dos clones cADN correspon dente.

................t'~ .......... _t⁸⁷ po_fy(A) — iniciador de hibridação

107_457 (An)

32_

46_-_;_454 (An)

4g_._449 (An)

A9-2 AS-3 A9-5 A9-S iniciador da sequência de ARN ! <Meee>«esM7rrc&MMMTc=TCMe=T«CT««QE7crnsT49axiiT«e:»rrT «o

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2314.- Método de acordo com as reivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo facto do gene de resistência (R) estar naturalmente presente numa planta gue é um membro da família da Solanaceae.
15.- Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto do gene de resistência (R) estar naturalmente presente numa planta da espécie Lycopersicon esculentum.
16.- Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto do gene de resistência (R) ser cf9.
17.- sequência polinucleotídica caracterizada pelo fac to de incorporar pelo menos uma sequência de um gene de avirulência (E) a partir de um patogeno de plantas que codifica uma molécula proteica eliciadora específica (e) ou uma sua porção, e um promotor de plantas (P) que pode ser induzido por uma larga gama de patogenos e que permite unicamente a expressão no sítio da infecção.
18.- Sequência polinucleotídica caracterizada pelo facto de incorporar pelo menos uma sequência de um gene de resistência (R) e um promotor de plantas (P) que pode ser induzido por uma larga gama da patogenos e que permite unicamente ex pressão no sítio da infecção.

-/419. - Planta,caracterizada pelo facto de ser obtida uti lizando um método de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 16.
20. - Planta caracterizada pelo facto de incorporar uma sequência polinucleotídica de acordo com as reivindicações 17 ou IS.