PT972075E - Methods for assessing cardiovascular status and compositions for use thereof - Google Patents

Description

DESCRIÇÃODESCRIPTION

"MÉTODOS PARA AVALIAR O ESTADO CARDIOVASCULAR E COMPOSIÇÕES PARA A SUA UTILIZAÇÃO"" METHODS FOR EVALUATING THE CARDIOVASCULAR STATE AND COMPOSITIONS FOR ITS USE "

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a polimorfismos genéticos úteis para avaliar o estado cardiovascular em humanos.FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to genetic polymorphisms useful for assessing the cardiovascular state in humans.

Antecedentes da Invenção 0 sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS) desempenha um papel importante na fisiologia cardiovascular em mamíferos. Especificamente, o RAAS regula a homeostase sal-água e a manutenção do tónus vascular. A estimulação ou a inibição deste sistema, respectivamente, aumenta ou diminui a pressão sanguínea e as perturbações neste sistema podem estar envolvidas na etiologia de, por exemplo, hipertensão, acidente vascular cerebral e enfarte do miocárdio. 0 sistema RAAS pode, igualmente, ter outras funções, tais como, e. g., controlo do crescimento celular. 0 sistema renina-angiotensina inclui, pelo menos, renina, enzima conversora da angiotensina (ACE), angiotensinogénio (AGT), receptor da angiotensina II de tipo 1 (ATI) e receptor da angiotensina II de tipo 2 (AT2). 0 AGT é o substrato específico da renina, uma protease do aspartilo. O gene do AGT humano contém cinco exões e quatro 1 intrões que se estendem por 13 Kb (Gaillard et ai., DNA 8:87-99, 1989; Fukamizu et al., J. Biol. Chem. 265:7576-7582, 1990). O primeiro exão (37 pb) codifica para a região 5' não traduzida do ARNm. O segundo exão codifica para o péptido sinal e para os primeiros 252 aminoácidos da proteína madura. Os exões 3 e 4 são mais curtos e codificam, respectivamente, para 90 e 48 aminoácidos. O exão 5 contém uma sequência codificante curta (62 aminoácidos) e a região 3' não traduzida. O AGT do plasma é sintetizado, principalmente, no fígado e a sua expressão é regulada positivamente por estrogénios, glucocorticóides, hormonas da tiróide e angiotensina II (Ang II) (Clauser et al., Am. J. Hypertension 2:403-410, 1989). A quebra do segmento amino-terminal do AGT pela renina, liberta uma pró-hormona decapeptídica, angiotensina-I, a qual é, adicionalmente, processada no octapéptido activo, angiotensina II, pela carboxipeptidase de dipeptidilo, designada enzima conversora da angiotensina (ACE). A quebra do AGT pela renina é o passo limitante da velocidade, na activação do sistema renina-angiotensina. Várias observações epidemiológicas indicam um papel possível do AGT, na regulação da pressão sanguínea. Foi observada uma correlação altamente significativa entre a concentração do AGT no plasma e a pressão sanguínea, em estudos epidemiológicos (Walker et al., J. Hypertension 1:287-291, 1979). De um modo interessante, foram identificados vários dimorfismos alélicos no gene do AGT. A frequência de, pelo menos, dois destes (174M e 235T) foi parcialmente caracterizada e, em determinadas populações, demonstraram encontrar-se significativamente aumentadas em indivíduos hipertensos (Jeunemaitre et al., Cell 71:169-180, 1992). Para além disso, 2 foi sugerido que um polimorfismo especifico, ο 235T, esteja directamente envolvido na aterosclerose coronária (Ishigami et al., Circulation 91:9514, 1995). Para além disso, a presença de A ou G na posição 1218 na região reguladora do AGT foi correlacionada com diferenças na capacidade de transcrição in vitro deste gene (Inuoe et. al., J. Clin. Invest. 99:1786, 1997. Para além disso, o documento WO 94/08048 discute a associação de variantes moleculares do gene do AGT com a hipertensão. O gene da ACE humana é, igualmente, um candidato como marcador para a hipertensão e para o enfarte do miocárdio. Os inibidores da ACE constituem uma abordagem terapêutica importante e eficaz no controlo da hipertensão humana (Sassaho et al. Am. J. Med. 83:227-235, 1987) . No plasma e na superfície das células endoteliais, a ACE converte a molécula da angiotensina I inactiva (Ang I) em angiotensina II activa (Ang II) (Bottari et al., Front. Neuroendocrinology 14:123-171, 1993) . Um outro substrato da ACE é a bradicinina, um vasodilatador potente e inibidor da proliferação de células do músculo liso, o qual é inactivado pela ACE (Ehilers et al., Biochemistry 28: 5311-5318, 1989; Erdos, E.G., Hypertension 16:363-370, 1990; Johnston, C.I. Drugs (supl. 1) 39:21-31, 1990) .BACKGROUND OF THE INVENTION The renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) plays an important role in cardiovascular physiology in mammals. Specifically, RAAS regulates salt-water homeostasis and maintenance of vascular tone. Stimulation or inhibition of this system, respectively, increases or lowers blood pressure and disorders in this system may be involved in the etiology of, for example, hypertension, stroke and myocardial infarction. The RAAS system may also have other functions, such as, e.g. control of cell growth. The renin-angiotensin system includes at least renin, angiotensin converting enzyme (ACE), angiotensinogen (AGT), type 1 angiotensin II receptor (ITA) and type 2 (AT 2) angiotensin II receptor. AGT is the specific substrate of renin, an aspartyl protease. The human AGT gene contains five exons and four introns spanning 13 Kb (Gaillard et al., DNA 8: 87-99, 1989; Fukamizu et al., J. Biol. Chem., 265: 7576-7582, nineteen ninety). The first exon (37 bp) encodes the 5 'untranslated region of the mRNA. The second exon encodes for the signal peptide and for the first 252 amino acids of the mature protein. Exons 3 and 4 are shorter and encode, respectively, 90 and 48 amino acids. Exon 5 contains a short coding sequence (62 amino acids) and the 3 'untranslated region. Plasma AGT is mainly synthesized in the liver and its expression is upregulated by estrogens, glucocorticoids, thyroid hormones and angiotensin II (Ang II) (Clauser et al., Am. J. Hypertension 2: 403-410, 1989). The cleavage of the amino terminal terminus of AGT by renin releases a decapeptide prohormone, angiotensin-I, which is further processed into the active octapeptide, angiotensin II, by the dipeptidyl carboxypeptidase, termed angiotensin converting enzyme (ACE) . The breakdown of AGT by renin is the rate-limiting step in the activation of the renin-angiotensin system. Several epidemiological observations indicate a possible role of TGA in the regulation of blood pressure. A highly significant correlation was observed between plasma AGT concentration and blood pressure in epidemiological studies (Walker et al., J. Hypertension 1: 287-291, 1979). Interestingly, several allelic dimorphisms were identified in the AGT gene. The frequency of at least two of these (174M and 235T) was partially characterized and, in certain populations, have been shown to be significantly increased in hypertensive individuals (Jeunemaitre et al., Cell 71: 169-180, 1992). In addition, 2 it has been suggested that a specific polymorphism, 235 235T, is directly involved in coronary atherosclerosis (Ishigami et al., Circulation 91: 9514, 1995). In addition, the presence of A or G at position 1218 in the AGT regulatory region was correlated with differences in the in vitro transcription capacity of this gene (Inuoe et al., J. Clin. Invest. 99: 1786, 1997). In addition, WO 94/08048 discusses the association of molecular variants of the AGT gene with hypertension The human ACE gene is also a candidate as a marker for hypertension and for myocardial infarction ACE inhibitors are an important and effective therapeutic approach in the control of human hypertension (Sassaho et al., Am Med J. 83: 227-235, 1987) .In plasma and on the surface of endothelial cells, ACE converts the inactive angiotensin I molecule (Ang I) in active angiotensin II (Ang II) (Bottari et al., Front, Neuroendocrinology 14: 123-171, 1993) Another ACE substrate is bradykinin, a potent vasodilator and inhibitor of muscle cell proliferation smooth, which is inactivated by ACE (Ehil ers et al., Biochemistry 28: 5311-5318, 1989; Erdos, E.G., Hypertension 16: 363-370, 1990; Johnston, C.I. Drugs (suppl.1) 39: 21-31, 1990).

Os níveis da ACE são muito estáveis dentro de indivíduos, mas diferem muito entre indivíduos. Foi sugerido que os níveis da ACE plasmática sejam geneticamente determinados como consequência de polimorfismos dialélicos, situados dentro ou na proximidade do gene da ACE. Antes da presente invenção, não foi demonstrada qualquer associação definitiva entre polimorfismos e hipertensão ou pressão sanguínea. No entanto, foi identificado um maior risco de enfarte do miocárdio, num grupo de indivíduos 3 com um polimorfismo da ACE, designado como ACE-DD (Cambien et al., Nature 359: 641-644, 1992) e foi identificado um risco 12 vezes superior de enfarte do miocárdio, num subgrupo de doentes que têm uma combinação do polimorfismo ACE-DD da ACE e um dos polimorfismos do AGT (235T) descrito acima (Kamitani et al., Hypertension 24:381, 1994). Recentemente, foram identificados e caracterizados seis polimorfismos da ACE (Villard et al., Am. J. Human Genet. 58:1268-1278, 1996). 0 documento WO 93/00360 divulga um método para detectar polimorfismos no gene da ACE através de uma técnica de amplificação em cadeia.ACE levels are very stable within individuals, but differ greatly between individuals. It has been suggested that plasma ACE levels are genetically determined as a consequence of diallel polymorphisms, located within or in proximity to the ACE gene. Prior to the present invention, no definitive association between polymorphisms and hypertension or blood pressure has been demonstrated. However, a higher risk of myocardial infarction was identified in a group of individuals 3 with an ACE polymorphism, designated ACE-DD (Cambien et al., Nature 359: 641-644, 1992) and a risk 12 times higher myocardial infarction in a subgroup of patients who have a combination of ACE-DD ACE polymorphism and one of the AGT (235T) polymorphisms described above (Kamitani et al., Hypertension 24: 381, 1994). Recently, six ACE polymorphisms have been identified and characterized (Villard et al., Am. J. Human Genet., 58: 1268-1278, 1996). WO 93/00360 discloses a method for detecting polymorphisms in the ACE gene by means of a chain amplification technique.

As acções vasoconstrictoras, promotoras do crescimentoVasoconstrictor actions, which promote growth

celular e conservadoras de sais da Ang II, são mediadas através da ligação a e activação dos receptores da angiotensina, dos quais, pelo menos, dois tipos foram clonados (ATI e AT2). O receptor da Ang II de tipo 1 (ATi) , uma proteína com sete domínios transmembranares, ligada à proteína G, encontra-se amplamente distribuída no organismo e medeia quase todos os efeitos conhecidos da Ang II (Fyhrquist et al., J. Hum. Hypertension 5:519-524, 1995).cellular and conservative effects of Ang II salts are mediated through the binding and activation of angiotensin receptors, of which at least two types have been cloned (ATI and AT2). Ang II type 1 receptor (ATi), a seven-domain transmembrane protein, bound to G protein, is widely distributed throughout the body and mediates almost all known effects of Ang II (Fyhrquist et al., J. Hum Hypertension 5: 519-524, 1995).

Foram identificados vários polimorfismos no gene do receptor ATi. Os estudos iniciais sugerem que, pelo menos, um destes seja mais frequente em indivíduos hipertensos (AT1166C) (Bonnardeaux et al., Hypertension 24:63-69, 1994). Este polimorfismo, combinado com o polimorfismo ACE-DD, demonstrou correlacionar-se significativamente com o risco de enfarte do miocárdio (Tiret et al., Lancet 344:910-913, 1994). O documento WO 96/05324 divulga um método e um kit para a detecção da predisposição ao enfarte do miocárdio, pela detecção de uma inserção/eliminação no gene da ACE e de um polimorfismo na posição 1166 do gene do ATI. 4 A elevada morbilidade e mortalidade associada com a doença cardiovascular demonstram uma necessidade na técnica de métodos e composições que permitam a determinação e/ou a previsão do regime terapêutico que irá resultar num efeito mais positivo do tratamento, num doente sofrendo de doença cardiovascular. Isto inclui a identificação de indivíduos que são mais ou menos susceptíveis a regimes terapêuticos particulares, incluindo, e. g., fármacos particulares que são convencionalmente utilizados para tratar a doença cardiovascular. Existe, igualmente, uma necessidade na técnica de métodos e composições que permitam a identificação de indivíduos que têm uma predisposição à doença cardiovascular, tal como, e. g., enfarte do miocárdio, hipertensão, aterosclerose e acidente vascular cerebral, para facilitar uma intervenção precoce e a prevenção da doença.Several polymorphisms have been identified in the AT 1 receptor gene. Initial studies suggest that at least one of these is more frequent in hypertensive individuals (AT1166C) (Bonnardeaux et al., Hypertension 24: 63-69, 1994). This polymorphism, combined with the ACE-DD polymorphism, has been shown to correlate significantly with the risk of myocardial infarction (Tiret et al., Lancet 344: 910-913, 1994). WO 96/05324 discloses a method and kit for detecting predisposition to myocardial infarction by detecting an insertion / deletion in the ACE gene and a polymorphism at position 1166 of the ATI gene. The high morbidity and mortality associated with cardiovascular disease demonstrate a need in the art for methods and compositions that allow for the determination and / or prediction of the therapeutic regimen that will result in a more positive treatment effect in a patient suffering from cardiovascular disease. This includes the identification of individuals who are more or less susceptible to particular therapeutic regimens, including, e.g. particular drugs which are conventionally used to treat cardiovascular disease. There is also a need in the art for methods and compositions that enable the identification of individuals having a predisposition to cardiovascular disease, such as e.g. myocardial infarction, hypertension, atherosclerosis, and stroke, to facilitate early intervention and prevention of disease.

Sumário da Invenção A presente invenção proporciona métodos para avaliar o estado cardiovascular num indivíduo humano, como definido nas reivindicações. 0 estado cardiovascular é o estado fisiológico do sistema cardiovascular, como se reflecte em um ou mais marcadores do estado. Os marcadores do estado incluem, sem limitação, parâmetros clínicos, tais como, e. g., pressão sanguínea ou perfil eletrocardiográfico, assim como diagnósticos do estado cardiovascular realizados por profissionais médicos experientes, tais como, e. g., enfarte agudo do miocárdio, enfarte silencioso do miocárdio, acidente vascular cerebral e aterosclerose. São, igualmente, incluídas, na avaliação do estado cardiovascular, modificações ao longo do tempo dos 5 marcadores do estado. Os métodos da invenção são realizados pelos passos de : (i) determinação da sequência de uma ou mais posições polimórficas dentro de um ou mais dos genes codificando a enzima conversora da angiotensina (ACE), angiotensinogénio (AGT) e o receptor da angiotensina II de tipo 1 (ATI) no indivíduo, para estabelecer um padrão polimórfico para o indivíduo; e (ii) comparação do padrão polimórfico estabelecido em (i) e os padrões polimórficos para indivíduos que apresentam marcadores pré-determinados do estado cardiovascular. 0 padrão polimórfico para o indivíduo é, de um modo preferido, altamente semelhante e, de um modo mais preferido, idêntico ao padrão polimórfico de indivíduos que apresentam marcadores do estado particulares, síndromes cardiovasculares e/ou padrões particulares de resposta a intervenções terapêuticas.Summary of the Invention The present invention provides methods for evaluating cardiovascular status in a human subject as defined in the claims. Cardiovascular status is the physiological state of the cardiovascular system, as reflected in one or more markers in the state. State markers include, without limitation, clinical parameters, such as, e.g. blood pressure or electrocardiographic profile, as well as diagnoses of cardiovascular state performed by skilled medical practitioners, such as, e.g. acute myocardial infarction, silent myocardial infarction, stroke, and atherosclerosis. Also, in the evaluation of the cardiovascular state, modifications over time of the 5 markers of the state are included. The methods of the invention are carried out by the steps of: (i) determining the sequence of one or more polymorphic positions within one or more of the genes encoding the angiotensin converting enzyme (ACE), angiotensinogen (AGT) and the angiotensin II receptor of type 1 (ITA) in the subject, to establish a polymorphic pattern for the individual; and (ii) comparison of the polymorphic pattern established in (i) and the polymorphic patterns for individuals who have predetermined markers of cardiovascular status. The polymorphic pattern for the subject is preferably highly similar and, more preferably, identical to the polymorphic pattern of individuals having particular markers of status, cardiovascular syndromes and / or particular patterns of response to therapeutic interventions.

Por exemplo, pode ser utilizada uma comparação entre o padrão polimórfico de um indivíduo e os padrões polimórficos de indivíduos apresentando respostas diferentes a uma intervenção terapêutica particular, para prever a capacidade de resposta do indivíduo a essa intervenção. De uma forma semelhante, os métodos da invenção podem ser utilizados para prever a predisposição a diferentes síndromes cardiovasculares. A invenção proporciona, igualmente, ácidos nucleicos isolados codificando a ACE, AGT e ATI, num indivíduo, compreendendo, cada um dos quais, pelo menos, uma posição polimórfica, como definida nas reivindicações. Em formas de 6 realização preferidas, a posição polimórfica, quer isolada, quer em combinação com outras posições polimórficas nas sequências da ACE, AGT ou ATI humanos ou em um ou mais outros genes humanos, é preditiva de um nivel particular de resposta a um determinado tratamento e/ou indica uma predisposição a uma ou mais sindromes clinicas associadas com a doença cardiovascular.For example, a comparison between the polymorphic pattern of an individual and the polymorphic patterns of individuals presenting different responses to a particular therapeutic intervention may be used to predict the individual's responsiveness to that intervention. In a similar manner, the methods of the invention can be used to predict predisposition to different cardiovascular syndromes. The invention also provides isolated nucleic acids encoding ACE, AGT and ATI, in a subject, each comprising at least one polymorphic position as defined in the claims. In preferred embodiments, the polymorphic position, either alone or in combination with other polymorphic positions in human ACE, AGT or ATI sequences or in one or more other human genes, is predictive of a particular level of response to a particular treatment and / or indicates a predisposition to one or more clinical syndromes associated with cardiovascular disease.

Os ácidos nucleicos isolados, de acordo com a invenção (os quais são descritos utilizando a numeração indicada na Tabela 1 abaixo), são: (i) Ácidos nucleicos codificando a ACE, tendo uma ou mais posições polimórficas na posição da região regulador, numerada 5106; nas posições na região codificante, numeradas como 375, 582, 731, 1060, 2741, 3132, 3387, 3503 e 3906; e na posição 1451, como numerada na entrada X621855 do Genbank, em que as sequências nas posições polimórficas na região reguladora da ACE, são uma ou mais de 5106T; e/ou as sequências nas posições polimórficas na região codificante são um ou mais de 375C, 582T, 731G, 1060A, 2741T, 3132T, 3387C, 3503G e 3906A. A invenção abrange, igualmente, um ácido nucleico codificando uma eliminação dos nucleótidos 1451-1783, como numerados na entrada X62855 do Genbank. (ii) Ácidos nucleicos codificando o AGT, tendo uma ou mais posições polimórficas nas posições na região reguladora, numeradas 395, 412, 432, 449, 692, 839, 1007, 1072 e 1204; nas posições na região codificante numeradas, como 273, 912, 997, 1116 e 1174; e na posição 49, como numerada na entrada M24688 do Genbank, em que as sequências nas posições polimórficas na região reguladora do AGT, são uma 7 ou mais de 412T, 1072A; as sequências na posição polimórfica na região codificante são uma ou mais de 273T, 997C e a sequência na posição 49 na entrada M24688 do Genbank é A ou G. (iii) Ácidos nucleicos codificando o ATI, tendo uma ou mais posições polimórficas em posições na região reguladora, numeradas 1427, 1756, 1853, 2046, 2354, 2355 e 2415; e na posição na região codificante, numerada como 449, em que as sequências nas posições polimórficas na região reguladora do Atl, são um ou mais de 1427T, 1756Ά, 1853G, 2046C, 2354C, 2355C e 2415G; e/ou as sequências nas posições polimórficas na região codificante são 449C. A invenção abrange, igualmente, bibliotecas de sequências de ácido nucleico isoladas, como definidas nas reivindicações, em que cada sequência na biblioteca compreende uma ou mais posições polimórficas nos genes codificando a ACE, AGT ou ATI humanos. São, igualmente, proporcionadas sondas de ácido nucleico, como definidas nas reivindicações, que hibridam especificamente com as posições polimórficas identificadas; péptidos e polipéptidos compreendendo posições polimórficas; e anticorpos específicos para polimorfismos, i. e., anticorpos específicos para uma sequência que se ligam diferencialmente a variantes polimórficas dos polipéptidos da ACE, AGT ou ATI, como definido nas reivindicações e que, de um modo preferido, podem ser utilizados para identificar variantes polimórficas particulares.The isolated nucleic acids according to the invention (which are described using the numbering indicated in Table 1 below) are: (i) Nucleic acids encoding ACE having one or more polymorphic positions at the position of the regulatory region, numbered 5106 ; at positions in the coding region, numbered as 375, 582, 731, 1060, 2741, 3132, 3387, 3503 and 3906; and at position 1451, as numbered at Genbank entry X621855, wherein the sequences at the polymorphic positions in the ACE regulatory region are one or more of 5106T; and / or the sequences at the polymorphic positions in the coding region are one or more of 375C, 582T, 731G, 1060A, 2741T, 3132T, 3387C, 3503G and 3906A. The invention also encompasses a nucleic acid encoding an elimination of nucleotides 1451-1783, as numbered at Genbank entry X62855. (ii) AGT encoding nucleic acids having one or more polymorphic positions at the positions in the regulatory region, numbered 395, 412, 432, 449, 692, 839, 1007, 1072 and 1204; at positions in the numbered coding region, such as 273, 912, 997, 1116 and 1174; and at position 49, as numbered at entry M24688 of Genbank, wherein the sequences at the polymorphic positions in the AGT regulatory region are 7 or more of 412T, 1072A; the polymorphic position sequences in the coding region are one or more of 273T, 997C and the sequence at position 49 at the Genbank entry M24688 is A or G. (iii) ATI encoding nucleic acids having one or more polymorphic positions at positions at regulatory region, numbered 1427, 1756, 1853, 2046, 2354, 2355 and 2415; and at the position in the coding region, numbered as 449, wherein the sequences at the polymorphic positions in the regulatory region of the Atl are one or more of 1427T, 1756, 1853G, 2046C, 2354C, 2355C and 2415G; and / or the sequences at the polymorphic positions in the coding region are 44 ° C. The invention also encompasses libraries of isolated nucleic acid sequences as defined in the claims, wherein each sequence in the library comprises one or more polymorphic positions in genes encoding human ACE, AGT or ATI. Also provided are nucleic acid probes as defined in the claims, which specifically hybridize to the identified polymorphic positions; peptides and polypeptides comprising polymorphic positions; and antibodies specific for polymorphisms, i. specific antibodies to a sequence that bind differentially to polymorphic variants of the ACE, AGT or ATI polypeptides as defined in the claims and which may preferably be used to identify particular polymorphic variants.

Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona kits, como definidos nas reivindicações, para a determinação de padrões polimórficos nos genes da ACE, AGT, e/ou ATI de um indivíduo. Os 8 kits compreendem um meio para detectar sequências polimórficas, incluindo, sem limitação, sondas oligonucleotidicas que hibridam com as posições polimórficas ou adjacentes e anticorpos específicos para polimorfismos.In yet another aspect, the invention provides kits as defined in the claims for the determination of polymorphic patterns in the ACE, AGT, and / or ATI genes of an individual. The kits comprise a means for detecting polymorphic sequences, including, without limitation, oligonucleotide probes which hybridize to the polymorphic or adjacent positions and antibodies specific for polymorphisms.

Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona alvos ácido nucleico e polipeptídicos, como definidos nas reivindicações, para utilização em métodos de rastreio para identificar candidatos a fármacos cardiovasculares. Os alvos ácido nucleico podem ser, e. g., ADN ou ARN e têm, de um modo preferido, pelo menos, cerca de, 10 e, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de, 15 resíduos de comprimento e compreendem uma ou mais posições polimórficas. Os péptidos alvo têm, pelo menos, cerca de, 5 aminoácidos de comprimento e podem ser do mesmo tamanho ou maiores do que os polipéptidos da ACE, AGT ou ATI completos.In yet another aspect, the invention provides nucleic acid and polypeptide targets as defined in the claims for use in screening methods to identify candidates for cardiovascular drugs. Nucleic acid targets may be e.g. DNA or RNA and are preferably at least about 10, and more preferably at least about 15 residues in length and comprise one or more polymorphic positions. The target peptides are at least about 5 amino acids in length and may be the same size or larger than the complete ACE, AGT or ATI polypeptides.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃODETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Definições: 1. Um "polimorfismo", como aqui utilizado, representa uma variação na sequência de um gene num indivíduo. Uma "posição polimórfica" é uma posição nucleotídica pré-determinada dentro da sequência de um gene ou uma posição de aminoácido pré-determinada na sequência de um polipéptido, nos quais se encontra localizado um polimorfismo. Um indivíduo "homozigótico" para um polimorfismo particular é aquele, no qual ambas as cópias do gene contêm a mesma sequência na posição polimórfica. Um indivíduo "heterozigótico" para um polimorfismo particular é aquele, no qual as duas cópias do gene contêm sequências diferentes na posição polimórfica. 2. Um "padrão de polimorfismo", como aqui utilizado, representa um conjunto de um ou mais polimorfismos, que podem ser contidos na sequência de um único gene ou de uma pluralidade de genes. Um padrão de polimorfismo pode compreender polimorfismos de aminoácidos ou de nucleótidos. 3. "Ácido nucleico" ou "polinucleótido", como aqui utilizado, refere-se a polímeros contendo purinas e pirimidinas de qualquer comprimento, quer polirribonucleótidos, quer polidesoxirribonucleótidos, querpolirribo-polidesoxirribonucleótidos mistos. Os ácidos nucleicos incluem, sem limitação, moléculas de cadeia dupla e simples, i. e., híbridos de ADN-ADN, ADN-ARN e ARN-ARN, assim como "ácidos nucleicos proteína" (PNA) formados pela conjugação de bases com uma estrutura base de aminoácido. Isto inclui, igualmente, ácidos nucleicos contendo bases modificadas. 4. Um ácido nucleico ou polipéptido "isolado", como aqui utilizado, refere-se a um ácido nucleico ou polipéptido que é removido do seu ambiente original (por exemplo, o seu ambiente natural se este for de ocorrência natural). Um ácido nucleico ou polipéptido isolado contém menos de, cerca de, 50%, de um modo preferido, menos de, cerca de, 75% e, de um modo muito preferido, menos de, cerca de, 90% dos componentes celulares com os quais este se encontrava originalmente associado. 10 5. Uma sequência de ácido nucleico ou polipeptídica que é "derivada" de uma sequência designada, refere-se a uma sequência que corresponde a uma região da sequência designada. Para sequências de ácido nucleico, isto abrange sequências que são homólogas ou complementares à sequência. 6. Uma "sonda" refere-se a um ácido nucleico ou a um oligonucleótido que forma uma estrutura híbrida com uma sequência num ácido nucleico alvo, devido à complementaridade de, pelo menos, uma sequência na sonda com uma sequência no ácido nucleico alvo. 7. Os ácidos nucleicos são "hibridáveis" entre si quando, pelo menos, uma cadeia de ácido nucleico pode emparelhar com outra cadeia de ácido nucleico, sob condições de restringência definidas. A restringência da hibridação é determinada, e. g., por a) a temperatura na qual a hibridação e/ou a lavagem são realizadas e b) a força iónica e polaridade (e. g., formamida) das soluções de hibridação e de lavagem, assim como por outros parâmetros. A hibridação requer que dois ácidos nucleicos contenham sequências substancialmente complementares; dependendo da restringência da hibridação, no entanto, podem ser tolerados emparelhamentos incorrectos. A restringência adequada para a hibridação de ácidos nucleicos depende do comprimento dos ácidos nucleicos e do grau de complementaridade, variáveis bem conhecidas na técnica. Por exemplo, "restringência elevada", como aqui utilizado, refere-se à hibridação e/ou lavagem a 68 °C em 0,2 X SSC, a 42 °C em formamida 50%, 4 X SSC ou sob condições que permitam níveis de hibridação equivalentes aos observados sob qualquer destas duas condições. 11 8. Um "gene" para uma proteína particular, como aqui utilizado, refere-se a uma sequência de ácido nucleico contígua, correspondente a uma sequência presente num genoma, a qual compreende (i) uma "região codificante," a qual compreende exões (i. e., sequências codificando uma sequência polipeptídica ou "sequências codificantes de proteínas"), intrões e sequências na junção entre exões e intrões; e (ii) sequências reguladoras, as quais flanqueiam a região codificante tanto nos terminais 5' como 3'. Por exemplo, o "gene da ACE", como aqui utilizado, abrange as regiões reguladoras e codificantes do gene humano codificando a enzima conversora da angiotensina. De um modo semelhante o "gene do AGT" abrange regiões reguladoras e codificantes do gene humano codificando o angiotensinogénio e o "gene do ATI" abrange regiões reguladoras e codificantes do gene humano codificando o receptor da angiotensina II de tipo I. Tipicamente, as sequências reguladoras de acordo com a invenção encontram- -se localizadas 5' (i. e., a montante) do segmento da região codificante. As sequências de referência, obtidas do Genbank, as quais foram utilizadas na realização da presente invenção são apresentadas na Tabela 1. 12Definitions: 1. A " polymorphism " as used herein represents a variation on the sequence of a gene in a subject. A " polymorphic position " is a predetermined nucleotide position within the sequence of a gene or a predetermined amino acid position in the sequence of a polypeptide in which a polymorphism is located. A " homozygous " for a particular polymorphism is that in which both copies of the gene contain the same sequence in the polymorphic position. A " heterozygous " for a particular polymorphism is that in which the two copies of the gene contain different sequences in the polymorphic position. 2. A " polymorphism standard " as used herein represents a set of one or more polymorphisms, which may be contained in the sequence of a single gene or a plurality of genes. A polymorphism pattern may comprise amino acid or nucleotide polymorphisms. 3. " Nucleic acid " or " polynucleotide " as used herein refers to polymers containing purines and pyrimidines of any length, either polyribonucleotides or polydeoxyribonucleotides, or mixed polydeoxyribonucleotides. Nucleic acids include, without limitation, single and double-stranded molecules, i. e.g., DNA-DNA, DNA-RNA and RNA-RNA hybrids, as well as " protein nucleic acids " (PNA) formed by the conjugation of bases with an amino acid base structure. This also includes nucleic acids containing modified bases. An " isolated nucleic acid or polypeptide " as used herein refers to a nucleic acid or polypeptide that is removed from its original environment (e.g., its natural environment if it is naturally occurring). An isolated nucleic acid or polypeptide contains less than, about 50%, preferably less than about 75%, and most preferably less than about 90% of the cellular components with the which it was originally associated. 5. A nucleic acid or polypeptide sequence that is " derived " of a designated sequence, refers to a sequence corresponding to a region of the designated sequence. For nucleic acid sequences, this encompasses sequences that are homologous or complementary to the sequence. 6. A " probe " refers to a nucleic acid or an oligonucleotide that forms a hybrid structure with a sequence in a target nucleic acid, due to the complementarity of at least one sequence in the probe with a sequence in the target nucleic acid. 7. Nucleic acids are " hybridizable " each other when at least one nucleic acid strand can anneal to another strand of nucleic acid under defined stringency conditions. The stringency of the hybridization is determined, e.g. by a) the temperature at which hybridization and / or washing are performed and b) the ionic strength and polarity (e.g., formamide) of the hybridization and lavage solutions, as well as by other parameters. Hybridization requires that two nucleic acids contain substantially complementary sequences; depending on the stringency of the hybridization, however, mismatches may be tolerated. Suitable stringency for nucleic acid hybridization depends on the length of the nucleic acids and the degree of complementarity, variables well known in the art. For example, " high stringency ", as used herein, refers to hybridization and / or washing at 68 ° C in 0.2X SSC, at 42 ° C in 50% formamide, 4X SSC or under conditions allowing hybridization levels equivalent to those observed under either of these two conditions. 8. A " gene " for a particular protein, as used herein, refers to a contiguous nucleic acid sequence, corresponding to a sequence present in a genome, which comprises (i) a " coding region, " which comprises exons (i.e., sequences encoding a polypeptide sequence or " protein coding sequences "), introns and sequences at the junction between exons and introns; and (ii) regulatory sequences, which flank the coding region at both the 5 'and 3' ends. For example, the " ACE gene " as used herein encompasses the regulatory and coding regions of the human gene encoding the angiotensin converting enzyme. In a similar fashion the " AGT gene " encompasses regulatory and coding regions of the human gene encoding angiotensinogen and the " ATI gene " encompasses regulatory and coding regions of the human gene encoding the Type I angiotensin II receptor. Typically, the regulatory sequences according to the invention are located 5 '(i.e., upstream) of the coding region segment. The reference sequences, obtained from Genbank, which were used in carrying out the present invention are shown in Table 1.

Tabela 1Table 1

Abreviatura Sequência Modelo Comparada Numeração de acordo com a entrada da sequência no GenBank Região Reguladora do AGT X15323 (SEQ ID N°. 1) X15323 (SEQ ID N°. 1) Região Codificante do AGT M24686 (exão2) (SEQ ID N°. 2) M24687 (exão 3) (SEQ ID N°. 3) M24688 (exão4) (SEQ ID N°. 4) M24689 (exão 5) (SEQ ID N°. 5) As sequências codificantes de proteínas do exão 2-5 foram processadas em conjunto, como descrito nas entradas do GenBank. 0 Nucleóide 1 é atribuído ao primeiro nucleótido do codão iniciador de metionina. Região Reguladora da ACE X94359 (SEQ ID N°. 6) X94359 (SEQ ID N°. 6) Região Codificante da ACE J04144 (SEQ ID N°. 7) X62855 (intrão 16) (SEQ ID N°. 8) J04144 (SEQ ID N°. 7) 0 nucleóide 1 é atribuído ao primeiro nucleótido do codão iniciador de metionina. X62855 (SEQ ID N°. 8) Região Reguladora do ATI U07144 (SEQ ID N°. 9) U07144 (SEQ ID N°. 9) Região Codificante do ATI S80239 (exão 3) (SEQ ID N°. 10) S77410 (exão 5) (SEQ ID N°. 11) A sequência codificante da proteína de S80239 (SEQ ID N°. 10) foi processada para a posição 288 da entrada S77410 (SEQ ID N°. 11). 0 nucleóide 1 é atribuído ao primeiro nucleótido do codão iniciador de metionina na entrada S80239 (SEQ ID N°. 10). 13 0 presente requerente verificou, surpreendentemente e inesperadamente, a existência de polimorfismos genéticos dentro dos genes humanos que codificam a ACE, AGT e ATI, os quais, isoladamente ou em combinação, podem ser utilizados para avaliar o estado cardiovascular. De acordo com a invenção, o padrão polimórfico das sequências da ACE, do AGT e/ou do ATI num indivíduo, pode predizer a capacidade de resposta do indivíduo a intervenções terapêuticas particulares e servir como um indicador da predisposição a várias formas da doença cardiovascular. A invenção proporciona métodos para avaliar o estado cardiovascular, pela detecção de padrões polimórficos num indivíduo. A presente invenção proporciona, igualmente, ácidos nucleicos isolados derivados dos genes da ACE, AGT e ATI, os quais compreendem estes polimorfismos, incluindo sondas que hibridam especificamente com posições polimórficas; polipéptidos e péptidos isolados compreendendo resíduos polimórficos; e anticorpos que reconhecem, especificamente, polipéptidos da ACE, AGT ou ATI, contendo um ou mais aminoácidos polimórficos. Métodos para a Avaliação do Estado Cardiovascular A presente invenção proporciona métodos de diagnóstico para a avaliação do estado cardiovascular num indivíduo humano. 0 estado cardiovascular, como aqui utilizado, refere-se ao estado fisiológico do sistema cardiovascular de um indivíduo, como reflectido em um ou mais marcadores ou indicadores. Os marcadores do estado incluem, sem limitação, medições clínicas, tais como, e. g., pressão sanguínea, perfil eletrocardiográfico e análise diferenciada do fluxo sanguíneo. Os marcadores do estado, de acordo com a invenção, incluem diagnósticos de uma ou mais síndromes cardiovasculares, tais como, e. g., hipertensão, 14 enfarte agudo do miocárdio, enfarte silencioso do miocárdio, acidente vascular cerebral e aterosclerose. Deverá ser entendido que um diagnóstico de uma síndrome cardiovascular realizada por um profissional médico abrange medições clinicas e avaliação médica. Os marcadores do estado, de acordo com a invenção, são avaliados utilizando métodos convencionais bem conhecidos na técnica. São, igualmente, incluídas na avaliação do estado cardiovascular, modificações quantitativas ou qualitativas em marcadores do estado ao longo do tempo, tais como os que podem ser utilizados, e. g., na determinação da resposta de um indivíduo a um regime terapêutico particular.Abbreviation Sequence Comparative Model Numbering according to the entry of the sequence in GenBank AGT Regulatory Region X15323 (SEQ ID No. 1) X15323 (SEQ ID No. 1) AGT Coding Region M24686 (exon2) (SEQ ID NO. 2) M24687 (exon 3) (SEQ ID No. 3) M24688 (exon 4) (SEQ ID NO: 4) M24689 (exon 5) (SEQ ID No. 5) The protein coding sequences of exon 2-5 were processed together as described in the GenBank entries. Nucleoid 1 is assigned to the first nucleotide of the methionine initiator codon. ACE Regulatory Region X94359 (SEQ ID No. 6) X94359 (SEQ ID No. 6) ACE Coding Region J04144 (SEQ ID NO: 7) X62855 (Intron 16) (SEQ ID NO: 8) J04144 ( SEQ ID No. 7) The nucleotide 1 is assigned to the first nucleotide of the methionine initiator codon. (SEQ ID NO: 10) S7-4104 (SEQ ID NO: 8) ATI Regulatory Region U07144 (SEQ ID No. 9) U07144 (SEQ ID NO: 9) ATI Coding Region S80239 (exon 3) exon 5) (SEQ ID NO: 11) The S80239 protein coding sequence (SEQ ID NO: 10) was processed to position 288 of the entry S77410 (SEQ ID NO: 11). The nucleotide 1 is assigned to the first nucleotide of the methionine initiator codon at the entry S80239 (SEQ ID NO: 10). The present inventor has surprisingly and unexpectedly verified the existence of genetic polymorphisms within human genes encoding ACE, TGA and ATI, which alone or in combination can be used to assess cardiovascular status. According to the invention, the polymorphic pattern of ACE, AGT and / or ITA sequences in a subject can predict the individual's responsiveness to particular therapeutic interventions and serve as an indicator of predisposition to various forms of cardiovascular disease. The invention provides methods for evaluating cardiovascular status by detecting polymorphic patterns in a subject. The present invention also provides isolated nucleic acids derived from the ACE, AGT and ATI genes, which comprise these polymorphisms, including probes that specifically hybridize to polymorphic positions; isolated polypeptides and peptides comprising polymorphic residues; and antibodies that specifically recognize ACE, AGT or ATI polypeptides, containing one or more polymorphic amino acids. Methods for Evaluating Cardiovascular Status The present invention provides diagnostic methods for evaluating cardiovascular status in a human subject. The cardiovascular state as used herein refers to the physiological state of an individual's cardiovascular system as reflected in one or more markers or indicators. State markers include, without limitation, clinical measurements, such as, e.g. blood pressure, electrocardiographic profile and differentiated analysis of blood flow. The markers of the condition according to the invention include diagnoses of one or more cardiovascular syndromes, such as e.g. hypertension, acute myocardial infarction, silent myocardial infarction, stroke, and atherosclerosis. It should be understood that a diagnosis of a cardiovascular syndrome performed by a medical professional encompasses clinical measurements and medical evaluation. The state markers according to the invention are evaluated using conventional methods well known in the art. Also included in the evaluation of cardiovascular status are quantitative or qualitative changes in markers of the condition over time, such as those that may be used, e.g. in determining the response of an individual to a particular therapeutic regimen.

Os métodos são realizados pelos passos de : (i) determinação da sequência de uma ou mais posições polimórficas dentro de um ou mais dos genes codificando a enzima conversora da angiotensina (ACE), angiotensinogénio (AGT) ou receptor da angiotensina II de tipo 1 (ATI) no indivíduo, para estabelecer um padrão polimórfico para o indivíduo; e (ii) comparação do padrão polimórfico estabelecido em (i) com os padrões polimórficos de humanos apresentando diferentes marcadores do estado cardiovascular. O padrão polimórfico do indivíduo é, de um modo preferido, altamente semelhante e, de um modo muito preferido, idêntico ao padrão polimórfico de indivíduos que apresentam marcadores do estado particulares, síndromes cardiovasculares, e/ou padrões de resposta particulares a intervenções terapêuticas. Os padrões polimórficos podem, igualmente, incluir posições polimórficas em outros genes, as quais são apresentadas, em combinação com uma ou mais posições 15 polimórficas no ACE, AGT ou ATI, para serem correlacionadas com a presença de marcadores do estado particulares.The methods are performed by the steps of: (i) determining the sequence of one or more polymorphic positions within one or more of the genes encoding angiotensin converting enzyme (ACE), angiotensinogen (AGT) or angiotensin II type 1 receptor ( ATI) in the subject to establish a polymorphic pattern for the subject; and (ii) comparison of the polymorphic pattern established in (i) with the polymorphic patterns of humans showing different markers of cardiovascular status. The polymorphic pattern of the subject is preferably highly similar and most preferably identical to the polymorphic pattern of subjects presenting particular markers of particular condition, cardiovascular syndromes, and / or particular response patterns to therapeutic interventions. Polymorphic patterns may also include polymorphic positions in other genes which are presented in combination with one or more polymorphic positions in ACE, AGT or ITA to be correlated with the presence of particular markers of the condition.

Numa forma de realização, o método envolve a comparação do padrão polimórfico de um indivíduo com os padrões polimórficos de indivíduos que demonstraram responder positivamente ou negativamente a um regime terapêutico particular. O regime terapêutico, como aqui utilizado, refere-se a tratamentos que visam a eliminação ou a melhoria de sintomas e eventos associados com a doença cardiovascular. Esses tratamentos incluem, sem limitação, uma ou mais de, alteração da dieta, estilo de vida e regime de exercício; técnicas cirúrgicas invasivas e não-invasivas, tais como aterectomia, angioplastia e cirurgia de desvio coronário; e intervenções farmacêuticas, tais como administração de inibidores da ACE, antagonistas do receptor da angiotensina II, diuréticos, antagonistas do alfa-adrenorreceptor, glicósidos cardíacos, inibidores da fosfodiesterase, antagonistas do beta-adrenorreceptor, bloqueadores do canal de cálcio, inibidores da redutase de HMG-CoA, bloqueadores do receptor da imidazolina, bloqueadores do receptor da endotelina e nitritos orgânicos. São, igualmente, abrangidas as intervenções com agentes farmacêuticos ainda não conhecidos, cuja actividade se correlacione com padrões polimórficos particulares, associados com a doença cardiovascular. 0 presente requerente verificou que os padrões polimórficos particulares se correlacionam com a capacidade de resposta de um indivíduo aos inibidores da ACE (ver, e. g., Exemplo 3, abaixo). É contemplado, por exemplo, que os doentes que são candidatos a um regime terapêutico particular sejam submetidos a rastreio para padrões polimórficos que se correlacionem com a capacidade de resposta a esse regime particular. 16In one embodiment, the method involves comparing the polymorphic pattern of an individual with the polymorphic patterns of individuals who have demonstrated to respond positively or negatively to a particular therapeutic regimen. The therapeutic regimen as used herein refers to treatments aimed at eliminating or ameliorating symptoms and events associated with cardiovascular disease. Such treatments include, without limitation, one or more of, dietary change, lifestyle and exercise regimen; invasive and non-invasive surgical techniques, such as atherectomy, angioplasty and coronary bypass surgery; and pharmaceutical interventions, such as administration of ACE inhibitors, angiotensin II receptor antagonists, diuretics, alpha-adrenoceptor antagonists, cardiac glycosides, phosphodiesterase inhibitors, beta-adrenoceptor antagonists, calcium channel blockers, HMG-CoA, imidazoline receptor blockers, endothelin receptor blockers and organic nitrites. Also covered are interventions with pharmaceutical agents as yet unknown, whose activity correlates with particular polymorphic patterns associated with cardiovascular disease. The present inventors have found that particular polymorphic patterns correlate with an individual's ability to respond to ACE inhibitors (see, e.g., Example 3, below). It is contemplated, for example, that patients who are candidates for a particular therapeutic regimen are screened for polymorphic patterns that correlate with the responsiveness to that particular regimen. 16

Numa forma de realização preferida, é determinada a presença ou ausência de um padrão polimórfico que compreende ACE 2193 A/G, AGR 1072 G/G e ATI 1167 A/A (ver abaixo), num indivíduo, para identificar a capacidade de resposta de um indivíduo aos inibidores da ACE .In a preferred embodiment, the presence or absence of a polymorphic standard comprising ACE 2193 A / G, AGR 1072 G / G and ATI 1167 A / A (see below) is determined in a subject to identify the responsiveness of an individual to ACE inhibitors.

Numa outra forma de realização, o método envolve a comparação do padrão polimórfico de um indivíduo com padrões polimórficos de indivíduos que apresentam ou apresentaram um ou mais marcadores de doença cardiovascular, tais como, e. g., pressão sanguínea elevada, perfil eletrocardiográfico anormal, enfarte do miocárdio, acidente vascular cerebral ou aterosclerose (ver, e. g., Exemplo 2, abaixo).In another embodiment, the method involves comparing the polymorphic pattern of an individual with polymorphic patterns of individuals having or exhibiting one or more cardiovascular disease markers, such as e.g. elevated blood pressure, abnormal electrocardiographic profile, myocardial infarction, stroke or atherosclerosis (see, e.g., Example 2, below).

Na realização dos métodos da invenção, o padrão polimórfico de um indivíduo pode ser estabelecido, obtendo ADN do indivíduo e determinando a sequência em posições polimórficas pré-determinadas na ACE, AGT e ATI, tais como as descritas acima. O ADN pode ser obtido a partir de qualquer fonte celular. Os exemplos não limitantes de fontes celulares, disponíveis na prática clínica, incluem células sanguíneas, células bucais, células cervicovaginais, células epiteliais da urina, células fetais ou quaisquer células presentes em tecidos obtidos por biópsia. As células podem ser, igualmente, obtidas a partir de fluidos corporais, incluindo, sem limitação, sangue, saliva, suor, urina, fluido cerebroespinal, fezes e exudados de tecidos no local de infecção ou de inflamação. O ADN é extraído a partir da fonte celular ou do fluido corporal, utilizando qualquer dos vários métodos que são padrão na técnica. Deverá ser entendido 17 que o método particular, utilizado para extrair ADN, irá depender da natureza da fonte. A determinação da sequência do ADN extraído, em posições polimórficas nos genes da ACE, AGT, e/ou ATI é realizada por qualquer meio conhecido na técnica, incluindo mas não limitado à sequenciação directa, hibridação com oligonucleótidos específicos para um alelo, PCR específico para um alelo, PCR com ligase, quebra HOT, electroforese em gel de gadiente desnaturante (DDGE) e polimorfismo conformacional de cadeia simples (SSCP). A sequenciação directa pode ser realizada por qualquer método, incluindo, sem limitação, sequenciação química, utilizando o método de Maxam-Gilbert; por sequenciação enzimática, utilizando o método de Sanger; sequenciação por espectrometria de massa; e sequenciação utilizando uma tecnologia baseada em chips. Ver, e. g., Little et al., Genet. Anal. 6:151, 1996. De um modo preferido, o ADN de um indivíduo é, inicialmente, submetido a amplificação por reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando iniciadores de amplificação específicos.In carrying out the methods of the invention, the polymorphic pattern of an individual can be established by obtaining DNA from the subject and determining the sequence at predetermined polymorphic positions in ACE, AGT and ATI, such as those described above. DNA can be obtained from any cell source. Non-limiting examples of cellular sources available in clinical practice include blood cells, buccal cells, cervicovaginal cells, urine epithelial cells, fetal cells or any cells present in biopsy-derived tissues. Cells may also be obtained from body fluids, including, without limitation, blood, saliva, sweat, urine, cerebrospinal fluid, feces and tissue exudates at the site of infection or inflammation. DNA is extracted from the cell source or body fluid using any of the various methods which are standard in the art. It will be understood that the particular method, used to extract DNA, will depend on the nature of the source. Determination of the extracted DNA sequence at polymorphic positions in the ACE, AGT, and / or ATI genes is performed by any means known in the art, including but not limited to direct sequencing, hybridization with allele specific oligonucleotides, specific PCR for one allele, PCR with ligase, HOT break, denaturing gentler gel electrophoresis (DDGE) and single chain conformational polymorphism (SSCP). Direct sequencing can be performed by any method, including, without limitation, chemical sequencing, using the Maxam-Gilbert method; by enzymatic sequencing using the method of Sanger; mass spectrometry sequencing; and sequencing using a chip-based technology. See, e.g. Little et al., Genet. Anal. 6: 151, 1996. Preferably, the DNA of an individual is initially subjected to polymerase chain reaction (PCR) amplification using specific amplification primers.

Numa forma de realização alternativa, o tecido da biópsia é obtido a partir de um indivíduo. Os anticorpos que são capazes de distinguir entre formas polimórficas diferentes da ACE, AGT, e/ou ATI são, então, aplicados a amostras do tecido para determinar a presença ou a ausência de uma forma polimórfica especificada pelo anticorpo. Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais, de um modo preferido, monoclonais. A medição da ligação específica de anticorpos a células pode ser realizada por qualquer método conhecido, e. g. , citometria de fluxo quantitativa ou imunoensaio ligado a enzima ou ligado a fluorescência. A presença ou a ausência de um polimorfismo ou 18 padrão polimórfico particular e a sua distribuição alélica (í. e., homozigotia vs. heterozigotia) são determinadas, por comparação dos valores obtidos a partir de um doente, com normas estabelecidas a partir de populações de doentes que apresentam padrões polimórficos conhecidos.In an alternative embodiment, the biopsy tissue is obtained from a subject. Antibodies that are capable of distinguishing between different polymorphic forms of ACE, TGA, and / or ITA are then applied to tissue samples to determine the presence or absence of a polymorphic form specified by the antibody. The antibodies may be polyclonal or monoclonal, preferably monoclonal. Measurement of the specific binding of antibodies to cells can be performed by any known method, e.g. g. , quantitative flow cytometry, or enzyme linked or fluorescence linked immunoassay. The presence or absence of a particular polymorphic polymorphism or pattern and its allelic distribution (i.e., homozygosity vs. heterozygosity) are determined, by comparison of values obtained from a patient, with standards established from populations of patients with known polymorphic patterns.

Numa forma de realização alternativa, o ARN é isolado a partir do tecido da biópsia, utilizando métodos padrão, bem conhecidos dos comuns especialistas na técnica, tais como extracção com tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio (Chomocyznski et ai., 1987, Anal. Biochem., 162:156.) 0 ARN isolado é, então, submetido a transcrição reversa acoplada à amplificação pela reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR), utilizando iniciadores oligonucleotídicos específicos. As condições do emparelhamento do iniciadores são escolhidas de forma a assegurar transcrição reversa e amplificação específicas; Deste modo, o aspecto de um produto de amplificação constitui um diagnóstico da presença de alelos particulares. Numa outra forma de realização, o ARN é submetido a transcrição reversa e amplificado, após o que, as sequências amplificadas são identificadas por, e. g., sequenciação directa.In an alternative embodiment, the RNA is isolated from the biopsy tissue using standard methods well known to those of ordinary skill in the art, such as guanidine-phenol-chloroform thiocyanate extraction (Chomocyznski et al., 1987, Anal. Biochem., 162: 156). Isolated RNA is then reverse transcribed coupled to amplification by the polymerase chain reaction (RT-PCR), using specific oligonucleotide primers. The primer pairing conditions are chosen so as to ensure specific reverse transcription and amplification; Thus, the appearance of an amplification product constitutes a diagnosis of the presence of particular alleles. In another embodiment, the RNA is reverse transcribed and amplified, whereupon, the amplified sequences are identified by e.g. direct sequencing.

Na realização da presente invenção, a distribuição de padrões polimórficos, num número elevado de indivíduos apresentando marcadores particulares do estado cardiovascular, é determinada por qualquer dos métodos descritos acima e é comparada com a distribuição de padrões polimórficos em doentes que foram classificados em termos de idade, origem étnica, e/ou quaisquer outros parâmetros estatística ou medicamente relevantes, que apresentam, quantitativamente ou qualitativamente, diferentes marcadores do estado. As correlações são realizadas utilizando qualquer método conhecido 19 na técnica, incluindo regressão logística nominal ou análise de regressão dos mínimos quadrados padrão. Desta forma, é possível estabelecer correlações estatisticamente significativas entre padrões polimórficos particulares e estados cardiovasculares particulares. É adicionalmente, possível estabelecer correlações estatisticamente significativas entre padrões polimórficos particulares e modificações no estado cardiovascular tais como, as resultantes, e. g., de regimes de tratamento particulares. Desta forma, é possível correlacionar padrões polimórficos com a capacidade de resposta a tratamentos particulares.In carrying out the present invention, the distribution of polymorphic patterns in a large number of individuals having particular markers of cardiovascular status is determined by any of the methods described above and is compared to the distribution of polymorphic patterns in patients who have been classified in terms of age , ethnic origin, and / or any other statistically or medically relevant parameters that present, quantitatively or qualitatively, different markers of status. Correlations are performed using any method known in the art, including nominal logistic regression or standard least square regression analysis. In this way, it is possible to establish statistically significant correlations between particular polymorphic patterns and particular cardiovascular states. It is furthermore possible to establish statistically significant correlations between particular polymorphic patterns and changes in cardiovascular status such as, e.g., e. of particular treatment regimes. In this way, it is possible to correlate polymorphic patterns with the ability to respond to particular treatments.

Posições Polimórficas em Genes Codificantes da ACE, AGT ePolymorphic Positions in ACE, AGT and

ATIATI

As posições polimórficas dos genes codificantes da ACE, AGT e ATI, que são abrangidas pela invenção, são identificadas pela determinação da sequência de ADN da totalidade ou de parte dos genes da ACE, AGT, e/ou ATI numa multiplicidade de indivíduos, numa população. A determinação da sequência de ADN pode ser realizada utilizando qualquer método convencional, incluindo, e. g., sequenciação química ou enzimática.The polymorphic positions of the genes encoding ACE, AGT and ATI, which are encompassed by the invention, are identified by determining the DNA sequence of all or part of the ACE, AGT, and / or ATI genes in a multiplicity of individuals in a population . Determination of the DNA sequence may be performed using any conventional method, including, e.g. chemical or enzymatic sequencing.

As posições polimórficas da invenção incluem, sem limitação, as listadas abaixo, cuja numeração corresponde às sequências do Genbank listadas na Tabela 1. (i) ACE: posições na região reguladora (designada como ACR) , numeradas 5106, 5349 e 5496; as posições na região codificante (designada como ACE), numeradas 375, 582, 731, 1060, 1215, 2193, 2328, 2741, 3132, 3387, 3503 e 3906; e a posição 1451, como numerada na entrada X62855 do Genbank. 20 (ii) AGT: posições na região reguladora (designada como AGR) , numeradas 395, 412, 432, 449, 692, 839, 1007, 1072, 1204 e 1218; as posições na região codificante (designada como AGT), numeradas 273, 620, 803, 912, 997, 1116 e 1174; e a posição 49 como numerada na entrada M24688 do Genbank. (iii) ATI: posições na região reguladora (designada como ATR), numeradas 1427, 1756, 1853, 2046, 2354, 2355 e 2415; e as posições na região codificante (designada como ATI), numeradas 449, 678, 1167 e 1271.The polymorphic positions of the invention include, without limitation, those listed below, the numbering corresponding to the Genbank sequences listed in Table 1. (i) ACE: positions in the regulatory region (designated ACR), numbered 5106, 5349 and 5496; the positions in the coding region (designated ACE), numbered 375, 582, 731, 1060, 1215, 2193, 2328, 2741, 3132, 3387, 3503 and 3906; and position 1451, as numbered at Genbank entry X62855. (Ii) AGT: positions in the regulatory region (designated as AGR), numbered 395, 412, 432, 449, 692, 839, 1007, 1072, 1204 and 1218; the positions in the coding region (designated as AGT), numbered 273, 620, 803, 912, 997, 1116 and 1174; and position 49 as numbered at entry M24688 of Genbank. (iii) ATI: positions in the regulatory region (designated as ATR), numbered 1427, 1756, 1853, 2046, 2354, 2355 and 2415; and positions in the coding region (designated as ATI), numbered 449, 678, 1167 and 1271.

Em formas de realização preferidas, a sequência, em cada uma das posições polimórficas acima é uma de: (i) Região Reguladora da ACE: 5106C, 5106T, 5349A, 5349T, 5496T e 5496C; (ii) Região Codificante da ACE: 375A, 375C, 582C, 582T, 731A, 731G, 1060G, 1060A, 1215C, 1215T, 2193G, 2193A, 2328A, 2328G, 2741G, 2741T, 3132C, 3132T, 3387T, 3387C, 3503G, 3503C, 3906G e 3906A; e uma eliminação dos nucleótidos 1451-1783, como numerados na entrada X62855 do Genbank; (iii) Região Reguladora do AGT: 395T, 395A, 412C, 412T, 432G, 432A, 449T, 449C, 692C, 692T, 839G, 839A, 1007G, 1007A, 1072G, 1072A, 1204C, 1204A, 1218A, 1218G; (iv) Região Codificante do AGT: 273C, 273T, 620C, 620T, 803T, 803C, 912C, 912T, 997G, 997C, 1116G, 1116A, 1174C e 1174A; e A ou G na posição 49 na entrada M24688 do Genbank; 21In preferred embodiments, the sequence in each of the above polymorphic positions is one of: (i) ACE Regulatory Region: 5106C, 5106T, 5349A, 5349T, 5496T and 5496C; (ii) ACE coding region: 375A, 375C, 582C, 582T, 731A, 731G, 1060G, 1060A, 1215C, 1215T, 2193G, 2193A, 2328A, 2328G, 2741G, 2741T, 3132C, 3132T, 3387T, 3387C, 3503G, 3503C, 3906G and 3906A; and an elimination of nucleotides 1451-1783, as numbered at Genbank entry X62855; (iii) AGT Regulatory Region: 395T, 395A, 412C, 412T, 432G, 432A, 449T, 449C, 692C, 692T, 839G, 839A, 1007G, 1007A, 1072G, 1072A, 1204C, 1204A, 1218A, 1218G; (iv) AGT Coding Region: 273C, 273T, 620C, 620T, 803T, 803C, 912C, 912T, 997G, 997C, 1116G, 1116A, 1174C and 1174A; and A or G at position 49 at entry M24688 of Genbank; 21

(v) Região Reguladora do ATI: 1427A, 1427T, 1756T, 1756A(v) ATI Regulatory Region: 1427A, 1427T, 1756T, 1756A

1853T, 1853G, 2046T, 2046C, 2354A, 2354C, 2355G, 2355C 2415A e 2415G; e (vi) Região Codificante do ATI: 449G, 449C, 678T, 678C, 1167A, 1167G, 1271A e 1271C.1853T, 1853G, 2046T, 2046C, 2354A, 2354C, 2355G, 2355C 2415A and 2415G; and (vi) ATI Coding Region: 449G, 449C, 678T, 678C, 1167A, 1167G, 1271A and 1271C.

Um indivíduo pode ser homozigótico ou heterozigótico para uma posição polimórfica particular (ver, e. g.r Tabela 6, abaixo).An individual may be homozygous or heterozygous for a particular polymorphic position (see, e.g., Table 6, below).

Os exemplos não limitantes de padrões polimórficos compreendendo um ou mais polimorfismos nos genes da ACE, AGT, e/ou ATI, de acordo com a invenção, incluem os seguintes, os quais foram correlacionados com uma incidência aumentada de sinais clínicos da doença cardiovascular:Non-limiting examples of polymorphic patterns comprising one or more polymorphisms in the ACE, AGT, and / or ATI genes according to the invention include the following, which have been correlated with an increased incidence of clinical signs of cardiovascular disease:

ACR 5349 A/T, AGR 1218 A; ACR 5496 C, AGR 1204 A/C; ACR 5496 C/T , AGR 1218 A, AGT 62 0 C/T; ACE 2193 A, AGR 1204 C, ACE 2328 G; ACE 2193 A, , AGR 1204 A/C; ACE 3387 T, AGR 1218 A; ACE 3387 T, AGT 620 C/T; AGR 1204 A/C, ATI 678 C/T; AGR 1204 A/C, ATI 1271 A/C; ACE 1215 C, AGR 1204 A/C; AGR 1204 A/C, ATI 1167 A, ACE 3906 A/G; AGR 1204 A, AGT 620 C, ATI 1271 A, ATI 1167 A, AGR 395 A/T; AGR 1204 A/C, AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A, AGR 395 T; AGR 1204 A/C, AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A/G, AGR 395 T; AGR 1204 A, ATI 678 C, ATI 1167 A, AGR 395 A/T; AGR 1204 A/C, ATI 678 C/T, ATI 1167 A, AGR 395 T; AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A, AGR 395 T; AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A/G, AGR 395 T; AGT 620 C, ATI 1271 A, ATI 1167 A, AGR 395 A/T; AGT 620 C, ATI 678 A, ATI 1167 A, AGT 395 A/T; AGT 620 C/T, ATI 678 C/T; ATI 1167 A, AGT 395 T; ACE 2193 A, AGR 1218 A, 22 AGT 8 03 A; ACE 2193 A, AGT 62 0 C/T; ACE 232 8 G, AGT 62 0 C/T; ACE 3387 T, AGR 1204 A/C; ACE 2193 A, ACE 2328 G, AGR 1204 C; e ACE 2193 A/G, AGR 1072 G/G, ATI 1167 A/A. Ácidos Nucleicos Polimórficos Isolados, Sondas e Vectores A presente invenção proporciona ácidos nucleicos isolados, compreendendo as posições polimórficas descritas acima para os genes da ACE, AGT e ATI humanos; vectores compreendendo os ácidos nucleicos; e células hospedeiras transformadas compreendendo os vectores. A invenção proporciona, igualmente, sondas que são úteis para detectar estes polimorfismos.ACR 5349 A / T, AGR 1218 A; ACR 5496 C, AGR 1204 A / C; ACR 5496 C / T, AGR 1218 A, AGT 62 0 C / T; ACE 2193 A, AGR 1204 C, ACE 2328 G; ACE 2193 A,, AGR 1204 A / C; ACE 3387 T, AGR 1218 A; ACE 3387 T, AGT 620 C / T; AGR 1204 A / C, ATI 678 C / T; AGR 1204 A / C, ATI 1271 A / C; ACE 1215 C, AGR 1204 A / C; AGR 1204 A / C, ATI 1167 A, ACE 3906 A / G; AGR 1204 A, AGT 620 C, ATI 1271 A, ATI 1167 A, AGR 395 A / T; AGR 1204 A / C, AGT 620 C / T, ATI 1271 A / C, ATI 1167 A, AGR 395 T; AGR 1204 A / C, AGT 620 C / T, ATI 1271 A / C, ATI 1167 A / G, AGR 395 T; AGR 1204 A, ATI 678 C, ATI 1167 A, AGR 395 A / T; AGR 1204 A / C, ATI 678 C / T, ATI 1167 A, AGR 395 T; AGT 620 C / T, ATI 1271 A / C, ATI 1167 A, AGR 395 T; AGT 620 C / T, ATI 1271 A / C, ATI 1167 A / G, AGR 395 T; AGT 620 C, ATI 1271 A, ATI 1167 A, AGR 395 A / T; AGT 620 C, ATI 678 A, ATI 1167 A, AGT 395 A / T; AGT 620 C / T, ATI 678 C / T; ATI 1167 A, AGT 395 T; ACE 2193 A, AGR 1218 A, 22 AGT 08 03 A; ACE 2193 A, AGT 62 0 C / T; ACE 232 8 G, AGT 62 0 C / T; ACE 3387 T, AGR 1204 A / C; ACE 2193 A, ACE 2328 G, AGR 1204 C; and ACE 2193 A / G, AGR 1072 G / G, ATI 1167 A / A. Isolated Polymeric Nucleic Acids, Probes and Vectors The present invention provides isolated nucleic acids comprising the polymorphic positions described above for the human ACE, AGT and ATI genes; vectors comprising the nucleic acids; and transformed host cells comprising the vectors. The invention also provides probes which are useful for detecting such polymorphisms.

Na realização da presente invenção, são utilizadas muitas técnicas convencionais em biologia molecular, microbiologia e ADN recombinante. Essas técnicas são bem conhecidas e são completamente explicadas em, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I e II, 1985 (D.N.In the practice of the present invention, many conventional techniques are used in molecular biology, microbiology and recombinant DNA. Such techniques are well known and fully explained in, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D.N.

Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M.L. Gait ed.);Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M.L. Gait ed.);

Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames e Higgins); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1997, (John Wiley and Sons); e Methods in Enzymology Vol. 154 e Vol. 155 (respectivamente, Wu e Grossman e Wu eds). A inserção de ácidos nucleicos (tipicamente ADNs), compreendendo as sequências da presente invenção, num vector é, facilmente, realizada quando os terminais de tanto os ADNs como do vector compreendem locais de restrição compatíveis. Se isto não puder ser realizado, poderá ser necessário modificar os 23 terminais dos ADNs e/ou do vector, pela digestão de projecções de ADN em cadeia simples, produzidas por quebra com endonuclease de restrição, de forma a produzir extremidades rombas ou alcançar o mesmo resultado, pelo preenchimento dos terminais em cadeia simples com uma polimerase de ADN adequada.Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1997, (John Wiley and Sons); and Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (respectively, Wu and Grossman and Wu eds). Insertion of nucleic acids (typically DNAs) comprising the sequences of the present invention into a vector is readily accomplished when the termini of both the DNAs and the vector comprise compatible restriction sites. If this can not be accomplished, it may be necessary to modify the DNA and / or vector termini by digesting single-stranded DNA projections produced by restriction endonuclease cleavage to produce blunt ends or to achieve the same result, by filling the single stranded ends with a suitable DNA polymerase.

Alternativamente, pode ser produzido qualquer local pretendido, e. g., pela ligação de sequências nucleotidicas (adaptadores) aos terminais. Esses adaptadores podem compreender sequências oligonucleotidicas especificas que definem locais de restrição pretendidos. Os locais de restrição podem ser, igualmente, produzidos pela utilização da reacção em cadeia da polimerase (PCR) . Ver, e. g., Saiki et al., 1988, Science 239:48. 0 vector quebrado e os fragmentos de ADN podem ser, igualmente, modificados, se necessário, por extensão homopolimérica.Alternatively, any desired site, e.g. by linking nucleotide sequences (adapters) to the termini. Such adapters may comprise specific oligonucleotide sequences that define desired restriction sites. Restriction sites may also be produced by the use of the polymerase chain reaction (PCR). See, e.g. Saiki et al., 1988, Science 239: 48. The broken vector and the DNA fragments may also be modified, if necessary, by homopolymer extension.

Os ácidos nucleicos podem ser isolados, directamente, a partir de células ou podem ser sintetizados quimicamente, utilizando métodos conhecidos. Alternativamente, pode ser utilizado o método de reacção em cadeia da polimerase (PCR) para produzir os ácidos nucleicos da invenção, utilizando, quer cadeias sintetizadas quimicamente, quer material genómico como padrões. Os iniciadores utilizados para a PCR podem ser sintetizados, utilizando a informação de sequência aqui fornecida e podem ser, adicionalmente, concebidos para introduzir novos locais de restrição adequados para, se pretendido, facilitar a incorporação num determinado vector, para expressão recombinante.Nucleic acids can be isolated directly from cells or can be chemically synthesized using known methods. Alternatively, the polymerase chain reaction (PCR) method may be used to produce the nucleic acids of the invention using either chemically synthesized strands or genomic material as well as standards. Primers used for PCR may be synthesized using the sequence information provided herein and may be further designed to introduce new suitable restriction sites to, if desired, facilitate incorporation into a given vector for recombinant expression.

Os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser flanqueados por sequências génicas da ACE, AGT ou ATI nativas ou 24 podem encontrar-se associadas com sequências heterólogas, incluindo promotores, intensificadores, elementos de resposta, sequências sinal, sequências de poliadenilação, intrões, regiões não codificantes 5'- e 3'- e semelhantes. Os ácidos nucleicos podem ser, igualmente, modificados de várias formas conhecidas na técnica. Os exemplos não limitantes dessas modificações incluem metilação, "coberturas", substituição de um ou mais dos nucleótidos de ocorrência natural com um análogo, modificações internucleotidicas, tais como, por exemplo, as que apresentam ligações sem carga (e. g., fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações com carga (e. g., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.) . Os ácidos nucleicos podem conter uma ou mais partes adicionais ligadas covalentemente, tais como, por exemplo, proteínas (e. g., nucleases, toxinas, anticorpos, péptidos sinal, poli-L-lisina, etc.), intercalantes (e. g., acridina, psoraleno, etc.), quelantes (e. g., metais, metais radioactivos, ferro, metais oxidativos, etc.) e alquilantes. São, igualmente, incluídos PNAs. 0 ácido nucleico pode ser derivatizado pela formação de uma ligação metilo ou etilfosfotriéster ou fosforamidato de alquilo. Para além disso, as sequências de ácido nucleico da presente invenção podem ser, igualmente, modificadas com uma marcação capaz de proporcionar um sinal detectável, quer directamente, quer indirectamente. As marcações características incluem radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina e semelhantes. A invenção também proporciona, vectores de ácido nucleico, compreendendo as sequências génicas divulgadas, derivadas da ACE, AGT e ATI ou seus derivados ou fragmentos. Foi descrito um grande número de vectores, incluindo vectores plasmídicos e fúngicos, para replicação e/ou expressão em vários hospedeiros 25 eucariotas e procariotas e podem ser utilizados em terapia génica, assim como em clonagem simples ou na expressão de proteínas. Os exemplos não limitantes de vectores adequados incluem, sem limitação, plasmídeos pUC, plasmídeos pET (Novagen, Inc., Madison, WI) ou pRSET ou pREP (Invitrogen, San Diego, CA) e muitas células hospedeiras adequadas, utilizando métodos aqui divulgados ou referidos ou, de outra forma, conhecidos dos especialistas na técnica relevante. A escolha do vector/hospedeiro em particular não é decisiva para a realização da invenção.The nucleic acids of the present invention may be flanked by native ACE, AGT or ATI gene sequences or may be associated with heterologous sequences, including promoters, enhancers, response elements, signal sequences, polyadenylation sequences, introns, non- 5 'and 3' coding sequences and the like. Nucleic acids can also be modified in various ways known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, " coatings ", substitution of one or more naturally occurring nucleotides with an analogue, internucleotide modifications, such as, for example, those having uncharged linkages (eg, methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, carbamates, etc.) and with filler bonds (eg, phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.). Nucleic acids may contain one or more additional covalently attached moieties such as, for example, proteins (eg, nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.), intercalators (eg, acridine, psoralen, etc.), chelators (eg, metals, radioactive metals, iron, oxidative metals, etc.) and alkylating agents. PNAs are also included. The nucleic acid may be derivatized by the formation of a methyl or ethylphosphotriester or alkyl phosphoramidate bond. In addition, the nucleic acid sequences of the present invention may also be modified with a label capable of providing a detectable signal, either directly or indirectly. Typical labels include radioisotopes, fluorescent molecules, biotin and the like. The invention also provides nucleic acid vectors comprising the disclosed gene sequences derived from ACE, AGT and ATI or derivatives or fragments thereof. A large number of vectors, including plasmid and fungal vectors, have been described for replication and / or expression in various eukaryotic and prokaryotic hosts and may be used in gene therapy, as well as in simple cloning or in protein expression. Non-limiting examples of suitable vectors include, without limitation, pUC plasmids, pET plasmids (Novagen, Inc., Madison, WI) or pRSET or pREP (Invitrogen, San Diego, CA) and many suitable host cells using methods disclosed herein or referred to or otherwise known to those skilled in the relevant art. The choice of the particular vector / host is not decisive for carrying out the invention.

As células hospedeiras adequadas podem ser transformadas/transfectadas/infectadas como adequado, atrvés de qualquer método adequado, incluindo electroporação, incorporação de ADN mediado por CaCl2, infecção fúngica ou virai, microinjecção, microprojécteis ou outros métodos estabelecidos. As células hospedeiras adequadas incluem bactérias, arqueobactérias, fungos, em especial, leveduras e células vegetais e animais, em especial, células de mamífero. Foi isolado Um grande número de regiões reguladoras da iniciação e terminação da transcrição e demonstraram ser eficazes na transcrição e na tradução de proteínas heterólogas, em vários hospedeiros. São conhecidos na técnica, exemplos destas regiões, métodos de isolamento, forma de manipulação, etc. Sob condições de expressão adequadas, as células hospedeiras podem ser utilizadas como uma fonte de péptidos e polipéptidos derivados da ACE, AGT ou ATI, produzidos recombinantemente.Suitable host cells may be transformed / transfected / infected as appropriate, by any suitable method, including electroporation, incorporation of CaCl 2 mediated DNA, fungal or viral infection, microinjection, microprojectiles or other established methods. Suitable host cells include bacteria, archaebacteria, fungi, in particular, yeasts and plant and animal cells, especially mammalian cells. A large number of transcriptional initiation and termination regulatory regions have been isolated and have been shown to be effective in transcription and translation of heterologous proteins in various hosts. Examples of such regions, methods of isolation, form of manipulation, etc. are known in the art. Under suitable expression conditions, the host cells may be used as a source of recombinantly produced ACE, AGT or ATI derived peptides and polypeptides.

Podem ser, igualmente, introduzidos ácidos nucleicos codificando sequências génicas derivadas da ACE, AGT ou ATI, em células, através de eventos de recombinação. Por exemplo, essa sequência pode ser introduzida numa célula e, deste modo, 26 efectuar recombinação homóloga no local de um gene endógeno ou de uma sequência com identidade substancial com o gene. Podem ser, igualmente, utilizados outros métodos baseados em recombinação, tais como, recombinações não-homólogas ou eliminação de genes endógenos por recombinação homóloga.Nucleic acids encoding gene sequences derived from ACE, AGT or ATI can also be introduced into cells through recombination events. For example, such a sequence may be introduced into a cell and thereby carry out homologous recombination at the site of an endogenous gene or sequence having substantial identity to the gene. Other methods based on recombination, such as, non-homologous recombination or deletion of endogenous genes by homologous recombination may also be used.

Os ácidos nucleicos da presente invenção encontram utilização como sondas para a detecção de polimorfismos genéticos e como moldes para a produção recombinante de péptidos ou polipéptidos derivados da ACE, AGT ou ATI, normais ou variantes.The nucleic acids of the present invention find use as probes for the detection of genetic polymorphisms and as templates for the recombinant production of normal or variant ACE, AGT or ATI derived peptides or polypeptides.

As sondas de acordo com a presente invenção compreendem, sem limitação, ácidos nucleicos isolados com, cerca de, 10-100 pb, de um modo preferido, 15-75 pb e, de um modo muito preferido, 17-25 pb de comprimento, os quais hibridam, sob condições de restringência elevada, com uma ou mais das sequências polimórficas, derivadas dos genes da ACE, AGT ou ATI, aqui divulgadas ou com uma sequência imediatamente adjacente a uma posição polimórfica. Para além disso, em algumas formas de realização, pode ser utilizada uma sequência génica completa como sonda. Numa série de formas de realização, as sondas abrangem as posições polimórficas nos genes da ACE, AGT ou ATI divulgadas acima. Numa outra série de formas de realização, as sondas correspondem a sequências imediatamente adjacentes a posições polimórficas. 27The probes according to the present invention comprise, without limitation, isolated nucleic acids of about 10-100 bp, preferably 15-75 bp, and most preferably 17-25 bp in length, which hybridize under conditions of high stringency to one or more of the polymorphic sequences derived from the ACE, AGT or ATI genes disclosed herein or with a sequence immediately adjacent to a polymorphic position. In addition, in some embodiments, a complete gene sequence may be used as a probe. In a series of embodiments, the probes encompass the polymorphic positions in the ACE, AGT or ATI genes disclosed above. In another series of embodiments, the probes correspond to sequences immediately adjacent to polymorphic positions. 27

Polipéptidos da ACE, AGT e ATI Polimórficos e Anticorpos Específicos para o Polimorfismo A presente invenção abrange péptidos e polipéptidos isolados, codificando a ACE, AGT e ATI, compreendendo posições polimórficas divulgadas acima. Numa forma de realização preferida, os péptidos e os polipéptidos são alvos de rastreio úteis para identificar fármacos cardiovasculares. Noutras formas de realização preferidas, os péptidos e os polipéptidos são capazes de promover anticorpos num animal hospedeiro adequado, que reagem, especificamente, com um polipéptido compreendendo a posição polimórfica e que o distinguem de outros polipéptidos que têm uma sequência diferente naquela posição.ACE Polypeptides, AGT and ATI Polymorphs and Antibodies Specific to Polymorphism The present invention encompasses isolated peptides and polypeptides encoding ACE, AGT and ATI, comprising polymorphic positions disclosed above. In a preferred embodiment, the peptides and polypeptides are useful screening targets useful for identifying cardiovascular drugs. In other preferred embodiments, the peptides and polypeptides are capable of promoting antibodies in a suitable host animal, which specifically react with a polypeptide comprising the polymorphic position and distinguishing it from other polypeptides having a different sequence at that position.

Os polipéptidos, de acordo com a invenção, têm, de um modo preferido, pelo menos, cinco ou mais resíduos de comprimento, de um modo preferido, pelo menos, quinze resíduos. São descritos abaixo, métodos para obter estes polipéptidos. São utilizadas muitas técnicas convencionais em bioquímica de proteínas e imunologia. Essas técnicas são bem conhecidas e explicadas em Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, 1987 (Mayer e Waler, eds; Academic Press, Londres); Scopes, 1987, Protein Purification: Principies and Practice, Segunda Edição (Springer-Verlag, N.I.) e Handbook of Experimental Immunology, 1986, Volumes I-IV (Weir e Blackwell eds.).The polypeptides according to the invention preferably have at least five or more residues in length, preferably at least fifteen residues. Methods for obtaining these polypeptides are described below. Many conventional techniques in protein biochemistry and immunology are used. Such techniques are well known and explained in Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, 1987 (Mayer and Waler, eds; Academic Press, London); Scopes, 1987, Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.I.) and Handbook of Experimental Immunology, 1986, Volumes I-IV (Weir and Blackwell eds.).

Podem ser utilizados ácidos nucleicos compreendendo sequências codificantes de proteínas, para controlar a expressão recombinante de polipéptidos derivados da ACE, AGT ou ATI, em células intactas ou em sistemas de tradução acelulares. 0 código genético conhecido, adaptado, se pretendido, para uma expressão 28 mais eficiente num determinado organismo hospedeiro, pode ser utilizado para sintetizar oligonucleótidos codificando as sequências de aminoácido pretendidas. Os polipéptidos podem ser isolados a partir de células humanas ou a partir de organismos ou células heterólogos (incluindo, mas não limitados a, células bacterianas, fúngicas, de insecto, vegetais e de mamífero), nos quais foi introduzida e expressa uma sequência codificando uma proteína adequada. Para além disso, os polipéptidos podem ser parte de proteínas de fusão recombinantes.Nucleic acids comprising protein coding sequences may be used to control the recombinant expression of ACE, AGT or ATI derived polypeptides in intact cells or in acellular translation systems. The known genetic code, adapted, if desired, for more efficient expression in a particular host organism, can be used to synthesize oligonucleotides encoding the desired amino acid sequences. The polypeptides may be isolated from human cells or from heterologous organisms or cells (including, but not limited to, bacterial, fungal, insect, plant and mammalian cells), into which a sequence encoding a protein. In addition, the polypeptides may be part of recombinant fusion proteins.

Os péptidos e os polipéptidos podem ser sintetizados quimicamente por processos automatizados, comercialmente disponíveis, incluindo, sem limitação, síntese em fase sólida exclusiva, métodos em fase sólida parcial, condensação de fragmentos ou síntese em solução clássica. Os polipéptidos são, de um modo preferido, preparados por síntese de péptidos em fase sólida, como descrito por Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149.Peptides and polypeptides can be chemically synthesized by automated, commercially available processes including, without limitation, proprietary solid phase synthesis, partial solid phase methods, fragment condensation or synthesis in classical solution. Polypeptides are preferably prepared by solid phase peptide synthesis as described by Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149.

Os métodos de purificação de polipéptidos são bem conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, electroforese em gel em disco preparativa, focagem isoeléctrica, HPLC, HPLC de fase reversa, filtração em gel, permuta iónica e cromatografia de partição e distribuição contracorrente. Para alguns objectivos, é preferido produzir o polipéptido num sistema recombinante, no qual a proteína contém uma sequência marcadora adicional que facilita a purificação, tal como, mas não limitada a, uma sequência de poli-histidina. 0 polipéptido pode, então, ser purificado a partir de um lisado bruto da célula hospedeira, por cromatografia numa matriz de fase sólida adequada. Alternativamente, podem ser utilizados anticorpos produzidos contra a ACE, AGT ou ATI ou contra péptidos derivados destes, 29 como reagentes de purificação. São possíveis outros métodos de purificação A presente invenção abrange, igualmente, derivados e homólogos dos polipéptidos. Para alguns objectivos, as seguências de ácido nucleico, codificando os péptidos, podem ser alteradas por substituições, adições ou eliminações, gue fornecem moléculas funcionalmente equivalentes, i. e., variantes conservadoras de função. Por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido dentro da sequência podem ser substituídos por outro aminoácido com propriedades semelhantes, tais como, por exemplo, aminoácidos carregados positivamente (arginina, lisina e histidina); aminoácidos carregados negativamente (aspartato e glutamato); aminoácidos neutros polares; e aminoácidos não-polares.Polypeptide purification methods are well known in the art, including, without limitation, preparative disk gel electrophoresis, isoelectric focusing, HPLC, reverse phase HPLC, gel filtration, ion exchange and partition chromatography, and countercurrent distribution. For some purposes, it is preferred to produce the polypeptide in a recombinant system, wherein the protein contains an additional marker sequence that facilitates purification, such as, but not limited to, a polyhistidine sequence. The polypeptide may then be purified from a crude host cell lysate by chromatography on a suitable solid phase matrix. Alternatively, antibodies raised against ACE, AGT or ATI or peptides derived therefrom may be used as purification reagents. Other purification methods are possible. The present invention also encompasses derivatives and homologs of the polypeptides. For some purposes, nucleic acid sequences encoding the peptides may be altered by substitutions, additions or deletions, which provide functionally equivalent molecules, i. conservative variants of function. For example, one or more amino acid residues within the sequence may be substituted by another amino acid having similar properties, such as, for example, positively charged amino acids (arginine, lysine and histidine); negatively charged amino acids (aspartate and glutamate); polar neutral amino acids; and non-polar amino acids.

Os polipéptidos isolados podem ser modificados, por exemplo, por fosforilação, sulfatação, acilação ou outras modificações das proteínas. Estes podem ser, igualmente, modificados com uma marcação, capaz de proporcionar um sinal detectável, quer directamente, quer indirectamente, incluindo, mas não limitado a, radioisótopos e compostos fluorescentes. A presente invenção abrange, igualmente, anticorpos que reconhecem, especificamente, as posições polimórficas da invenção e distinguem um péptido ou um polipéptido contendo um polimorfismo particular de um que contenha uma sequência diferente nessa posição. Esses anticorpos específicos para a posição polimórfica, de acordo com a presente invenção incluem anticorpos policlonais e monoclonais. Os anticorpos podem ser promovidos num hospedeiro animal por imunização com componentes imunogénicos derivados da ACE, AGT ou ATI ou podem ser formados 30 por imunização in vitro de células imunitárias. Os componentes imunogénicos utilizados para promover os anticorpos podem ser isolados a partir de células humanas ou produzidos em sistemas recombinantes. Os anticorpos podem ser, igualmente, produzidos em sistemas recombinantes, programados com o ADN adequado codificando anticorpo. Alternativamente, os anticorpos podem ser construídos pela reconstituição bioquímica de cadeias pesadas e leves purificadas. Os anticorpos incluem anticorpos híbridos (i. e., contendo dois conjuntos de combinações de cadeia pesada/cadeia leve, reconhecendo, cada uma delas, um antigénio diferente), anticorpos quiméricos (i. e., nos quais as cadeias pesadas, as cadeias leves ou ambas, são proteínas de fusão) e anticorpos univalentes (í. e., compreendidos por um complexo cadeia pesada/cadeia leve, ligado à região constante de uma segunda cadeia pesada). São, igualmente, incluídos fragmentos de Fab, incluindo fragmentos de anticorpos Fab' e F(ab)2· Os métodos de produção da totalidade dos tipos de anticorpos acima e derivados são bem conhecidos na técnica e são discutidos abaixo com maior detalhe. Por exemplo, em Mayer e Walker, 1987, Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, (Academic Press, Londres), são divulgadas técnicas para produzir e processar anti-soros policlonais. A metodologia geral para preparar anticorpos monoclonais através de hibridomas é bem conhecida. Podem ser criadas linhas celulares imortais, produtoras de anticorpos, por fusão celular e, igualmente, por outras técnicas, tais como transformação directa de linfócitos B com ADN oncogénico ou por transfecção com o vírus de Epstein-Barr. Ver, e. g., Schreier et ai., 1980, Hybridoma Techniques; Patentes U.S. N° 4341761; 4399121; 4427783; 4444887; 4466917; 4472500; 4491632; e 4493890. Os painéis de anticorpos monoclonais produzidos contra epitopos derivados da ACE, AGT ou 31 ATI podem ser submetidos a rastreio para várias propriedades; i. e., para isotipo, afinidade de epitopo, etc.The isolated polypeptides may be modified, for example, by phosphorylation, sulfation, acylation or other modifications of the proteins. These may also be modified with a label, capable of providing a detectable signal, either directly or indirectly, including, but not limited to, radioisotopes and fluorescent compounds. The present invention also encompasses antibodies that specifically recognize the polymorphic positions of the invention and distinguish a peptide or a polypeptide containing a particular polymorphism from one containing a different sequence at that position. Such polymorphic position specific antibodies according to the present invention include polyclonal and monoclonal antibodies. Antibodies can be promoted in an animal host by immunization with immunogenic components derived from ACE, AGT or ATI or can be formed by in vitro immunization of immune cells. The immunogenic components used to promote the antibodies may be isolated from human cells or produced in recombinant systems. The antibodies may also be produced in recombinant systems, programmed with the appropriate DNA encoding antibody. Alternatively, the antibodies may be constructed by the biochemical reconstitution of purified heavy and light chains. Antibodies include hybrid antibodies (ie, containing two sets of heavy chain / light chain combinations, each recognizing a different antigen), chimeric antibodies (ie, in which heavy chains, light chains or both, are proteins and univalent antibodies (i.e., comprised of a heavy chain / light chain complex, linked to the constant region of a second heavy chain). Also included are Fab fragments including Fab 'and F (ab) 2 antibody fragments. Methods of producing all of the above types of antibodies and derivatives are well known in the art and are discussed in more detail below. For example, in Mayer and Walker, 1987, Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, (Academic Press, London), techniques are disclosed for producing and processing polyclonal antisera. The general methodology for preparing monoclonal antibodies through hybridomas is well known. Immortal, antibody-producing cell lines can be created by cell fusion and also by other techniques, such as direct transformation of B lymphocytes with oncogenic DNA or by transfection with the Epstein-Barr virus. See, e.g. Schreier et al., 1980, Hybridoma Techniques; U.S. Patent Nos. 4,342,761; 4,399,121; 4,427,783; 4444887; 4,466,917; 4472500; 4491632; and 4493890. Panels of monoclonal antibodies raised against epitopes derived from ACE, AGT or ATI can be screened for various properties; i. e.g., for isotype, epitope affinity, etc.

Os anticorpos desta invenção podem ser purificados por métodos padrão, incluindo, mas não limitados a, electroforese preparativa em gel em disco, focagem isoeléctrica, HPLC, HPLC de fase reversa, filtração em gel, permuta iónica e cromatografia de partição e distribuição contracorrente. Em, e. g., The Art of Antihody Purification, 1989, Amicon Division, W.R. Grace & Co são divulgados métodos de purificação de anticorpos. Em Protein Purification: Principies and Practice, R.K. Scopes, Ed., 1987, Springer-Verlag, Nova Iorque, NI, são descritos métodos gerais de purificação de proteínas.Antibodies of this invention can be purified by standard methods, including, but not limited to, preparative gel electrophoresis on disk, isoelectric focusing, HPLC, reverse phase HPLC, gel filtration, ion exchange and partition chromatography, and countercurrent distribution. In, and. The Art of Antihody Purification, 1989, Amicon Division, W.R. Grace & Co methods of antibody purification are disclosed. In Protein Purification: Principles and Practice, R.K. Scopes, Ed., 1987, Springer-Verlag, New York, NY, general methods of protein purification are described.

Os métodos para a determinação a capacidade imunogénica das sequências divulgadas e as caracteristicas dos anticorpos resultantes específicos para uma sequência e das células imunitárias são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os anticorpos promovidos em resposta a um péptido compreendendo uma sequência polimórfica particular podem ser testados para a sua capacidade para reconhecer, especificamente, essa sequência polimórfica, í. e., ligarem-se diferencialmente a um péptido ou a polipéptido, compreendendendo a sequência polimórfica e, deste modo, distingui-lo de um péptido ou polipéptido semelhante que contenha uma sequência diferente na mesma posição. Métodos de Diagnóstico e Kits A presente invenção proporciona kits para a determinação da sequência em posições polimórficas dentro dos genes da ACE, AGT e ATI num indivíduo. Os kits compreendem um meio para determinar 32 a sequência em uma ou mais posições polimórficas e podem incluir, opcionalmente, dados para análise de padrões polimórficos. Os meios para a determinação da sequência podem compreender reaqentes baseados em ácidos nucleicos e imunológicos adequados (ver abaixo). De um modo preferido, os kits compreendem, igualmente, tampões adequados, reagentes de controlo, quando apropriado, e instruções para determinar a sequência numa posição polimórfica. Os kits podem, igualmente, compreender dados para correlacionar padrões polimórficos particulares com regimes de tratamento desejáveis ou outros indicadores. Métodos de diagnóstico e kits baseados em ácidos nucleicos: A invenção proporciona métodos baseados em ácidos nucleicos para a detecção de padrões polimórficos numa amostra biológica. A sequência das posições polimórficas particulares, nos genes codificando a ACE, AGT, e/ou ATI, é determinada, utilizando qualquer meio adequado conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, hibridação com sondas especificas para o polimorfismo e sequenciação directa. A presente invenção proporciona, igualmente, kits adequados para aplicações de diagnóstico baseados em ácidos nucleicos. Numa forma de realização, os kits de diagnóstico incluem os seguintes componentes: (i) ADN sonda: o ADN sonda pode ser pré-marcado; alternativamente, o ADN sonda pode não ser marcado e os ingredientes para a marcação podem ser incluídos no kit, em contentores separados; e 33 (ii) Reagentes de hibridação: o kit pode, igualmente, conter outros reagentes e materiais adequadamente embalados, necessários para o protocolo de hibridação particular, incluindo matrizes de fase sólida, se aplicável, e padrões.Methods for determining the immunogenicity of the disclosed sequences and the characteristics of the resulting specific antibodies to a sequence and immune cells are well known in the art. For example, antibodies raised in response to a peptide comprising a particular polymorphic sequence may be tested for their ability to specifically recognize that polymorphic sequence, e.g. and., bind differentially to a peptide or polypeptide, comprising the polymorphic sequence and thereby distinguish it from a similar peptide or polypeptide which contains a different sequence in the same position. Diagnostic Methods and Kits The present invention provides kits for determining the sequence at polymorphic positions within the ACE, AGT and ATI genes in a subject. The kits comprise a means for determining the sequence at one or more polymorphic positions and may optionally include data for analysis of polymorphic patterns. Means for determining the sequence may comprise reagents based on suitable nucleic and immunological acids (see below). Preferably, the kits also comprise suitable buffers, control reagents, where appropriate, and instructions for determining the sequence in a polymorphic position. The kits may also comprise data for correlating particular polymorphic patterns with desirable treatment regimens or other indicators. Nucleic acid-based diagnostic kits and kits: The invention provides nucleic acid-based methods for the detection of polymorphic patterns in a biological sample. The sequence of the particular polymorphic positions in genes encoding ACE, AGT, and / or ITA is determined using any suitable means known in the art, including, without limitation, hybridization with probes specific for polymorphism and direct sequencing. The present invention also provides kits suitable for nucleic acid-based diagnostic applications. In one embodiment, diagnostic kits include the following components: (i) probe DNA: probe DNA can be pre-labeled; alternatively, the probe DNA may be unlabeled and the ingredients for labeling may be included in the kit in separate containers; and (ii) Hybridization reagents: The kit may also contain other reagents and suitably packaged materials required for the particular hybridization protocol, including solid phase matrices, if applicable, and standards.

Numa outra forma de realização, os kits de diagnóstico incluem: (i) Iniciadores para a determinação da sequência: os iniciadores de sequenciação podem ser pré-marcados ou conter uma parte de purificação por afinidade ou de ligação; e (ii) Reagentes para a determinação da sequência: o conjunto pode, igualmente, conter outros reagentes e materiais adequadamente embalados, necessários para o protocolo de sequenciação particular. Numa forma de realização preferida, o conjunto compreende um painel de iniciadores de sequenciação, cujas sequências correspondem a sequências adjacentes às seguintes posições polimórficas: ACE 2193 A/G, AGR 1072 G/G, ATI 1167 A/A; assim como meios para a detecção da presença de cada sequência polimórfica. Métodos de diagnóstico e kits baseados em Anticorpos: A invenção proporciona, igualmente, métodos baseados em anticorpos para a detecção de padrões polimórficos numa amostra biológica. Os métodos compreendem os passos de : (i) fazer contactar uma amostra com uma ou mais preparações de anticorpo, 34 em que cada uma das preparações de anticorpo é específica para uma forma polimórfica particular da ACE, AGT ou ATI, sob condições nas quais se pode formar um complexo antigénio-anticorpo estável, entre o anticorpo e os componentes antigénicos na amostra; e (ii) a detecção de qualquer complexo antigénio-anticorpo, formado no passo (i) , utilizando qualquer meio adequado conhecido na técnica, em que a detecção de um complexo, indica a presença na amostra da forma polimórfica particular.In another embodiment, the diagnostic kits include: (i) Sequencing primers: the sequencing primers may be pre-labeled or contain an affinity or binding purification portion; and (ii) Sequence determination reagents: the kit may also contain other appropriately packaged reagents and materials required for the particular sequencing protocol. In a preferred embodiment, the kit comprises a panel of sequencing primers, the sequences of which correspond to sequences adjacent to the following polymorphic positions: ACE 2193 A / G, AGR 1072 G / G, ATI 1167 A / A; as well as means for detecting the presence of each polymorphic sequence. Antibody-Based Diagnostic Methods and Kits: The invention also provides antibody-based methods for the detection of polymorphic patterns in a biological sample. The methods comprise the steps of: (i) contacting a sample with one or more antibody preparations, wherein each of the antibody preparations is specific for a particular polymorphic form of ACE, AGT or ATI, under conditions in which can form a stable antigen-antibody complex between the antibody and the antigenic components in the sample; and (ii) detecting any antigen-antibody complex formed in step (i), using any suitable means known in the art, wherein the detection of a complex indicates the presence in the sample of the particular polymorphic form.

Tipicamente, os imunoensaios utilizam um anticorpo marcado ou um componente antigénico marcado (e. g., que compete com o antigénio na amostra para a ligação ao anticorpo). As marcações adequadas incluem, sem limitação, moléculas baseadas em enzimas, fluorescentes, quimioluminescentes, radioactivas ou coradas,. São, igualmente, conhecidos ensaios que amplificam os sinais da sonda, tais como, por exemplo, os que utilizam biotina e avidina e imunoensaios marcados com enzima, tais como, ensaios ELISA. A presente invenção proporciona, igualmente, kits adequados para aplicações em diagnóstico baseados em anticorpos. Os kits de diagnóstico incluem, tipicamente, um ou mais dos seguintes componentes: (i) Anticorpos específicos para polimorfismos: os anticorpos podem ser pré-marcados; alternativamente, o anticorpo pode não estar marcado e os ingredientes para a marcação podem ser incluídos no kit, em contentores separados ou ser proporcionado um anticorpo secundário, marcado; e 35 (ii) Componentes da reacção: o conjunto pode, igualmente, conter outros reagentes e materiais adequadamente embalados, necessários para o protocolo do imunoensaio particular, incluindo matrizes de fase sólida, se aplicável, e padrões.Typically, immunoassays use either a labeled antibody or a labeled antigenic component (e.g., which competes with the antigen in the sample for binding to the antibody). Suitable labels include, without limitation, enzyme-based, fluorescent, chemiluminescent, radioactive or stained molecules. Assays that amplify the probe signals, such as, for example, those using biotin and avidin and enzyme-labeled immunoassays, such as ELISA assays, are also known. The present invention also provides kits suitable for diagnostic applications based on antibodies. Diagnostic kits typically include one or more of the following components: (i) Antibody specific for polymorphisms: antibodies may be pre-labeled; alternatively, the antibody may be unlabeled and the ingredients for labeling may be included in the kit, in separate containers or a labeled secondary antibody is provided; and (ii) Reaction components: the assembly may also contain other reagents and suitably packaged materials required for the particular immunoassay protocol, including solid phase matrices, if applicable, and standards.

Os kits referidos acima podem incluir instruções para realizar o teste. Para além disso, em formas de realização preferidas, os kits de diagnóstico são adaptáveis a operação de elevada capacidade de processamento e/ou automatizada.The above kits may include instructions for performing the test. Furthermore, in preferred embodiments, the diagnostic kits are adaptable to high throughput and / or automated operation.

Alvos dos Fármacos e Métodos de RastreioDrug Targets and Screening Methods

De acordo com a presente invenção, as sequências nucleotidicas derivadas de genes codificando a ACE, AGT e ATI e sequências peptídicas derivadas de polipéptidos da ACE, AGT e ATI, em particular os que contêm uma ou mais sequências polimórficas, compreendem alvos úteis para identificar fármacos cardiovasculares, i. e., compostos que são eficazes no tratamento de um ou mais sintomas clínicos da doença cardiovascular.According to the present invention, nucleotide sequences derived from genes encoding ACE, AGT and ITA and peptide sequences derived from ACE, AGT and ATI polypeptides, in particular those containing one or more polymorphic sequences, comprise targets useful for identifying drugs cardiovascular, i. compounds which are effective in treating one or more clinical symptoms of cardiovascular disease.

Os alvos dos fármacos incluem, sem limitação, (i) ácidos nucleicos isolados a partir de derivados dos genes codificando a ACE, AGT e ATI e (ii) péptidos isolados e polipéptidos derivados de polipéptidos da ACE, do AGT edo ATI, compreendendo, cada um, uma ou mais posições polimórficas. 36 Métodos de rastreio in vitro:Targets of the drugs include, without limitation, (i) nucleic acids isolated from derivatives of the genes encoding ACE, AGT and ATI, and (ii) isolated peptides and polypeptides derived from ACE, AGT and ATI polypeptides, each comprising one, one or more polymorphic positions. 36 In vitro screening methods:

Numa série de formas de realização, um ácido nucleico isolado compreendendo uma ou mais posições polimórficas é testado in vitro para a sua capacidade de ligação a compostos de teste numa forma especifica para uma sequência. Os métodos compreendem: (i) proporcionar um primeiro ácido nucleico contendo uma sequência particular numa posição polimórfica e um segundo ácido nucleico, cuja sequência é idêntica à do primeiro, excepto numa sequência diferente, na mesma posição polimórfica; (ii) fazer contactar os ácidos nucleicos com uma multiplicidade de compostos de teste, sob condições adequadas à ligação; e (iii) identificar os compostos que se ligam selectivamente à primeira ou a segunda sequência de ácido nucleico.In a series of embodiments, an isolated nucleic acid comprising one or more polymorphic positions is tested in vitro for its ability to bind test compounds in a sequence specific form. The methods comprise: (i) providing a first nucleic acid containing a particular sequence in a polymorphic position and a second nucleic acid, the sequence of which is identical to that of the first, except in a different sequence, in the same polymorphic position; (ii) contacting the nucleic acids with a multiplicity of test compounds, under conditions suitable for binding; and (iii) identifying those compounds that selectively bind to the first or second nucleic acid sequence.

Ligação selectiva, como aqui utilizado, refere-se a qualquer diferença mensurável em qualquer parâmetro de ligação, tal como, e. g., afinidade de ligação, capacidade de ligação, etc.Selective binding, as used herein, refers to any measurable difference in any binding parameter, such as, e.g. e.g., binding affinity, binding ability, etc.

Numa outra série de formas de realização, um péptido isolado ou polipéptido, compreendendo uma ou mais posições polimórficas, é testado in vitro para a sua capacidade de ligação a compostos de teste, de uma forma especifica para uma sequência. Os métodos de rastreio envolvem: 37 i) proporcionar um primeiro péptido ou polipéptido contendo uma sequência particular numa posição polimórfica e um segundo péptido ou polipéptido, cuja sequência é idêntica ao primeiro, excepto numa sequência diferente, na mesma posição polimórfica; (ii) fazer contactar os polipéptidos com uma multiplicidade de compostos de teste, sob condições adequadas para a ligação; e (iii) identificar os compostos que se ligam selectivamente a uma das sequências de ácido nucleico.In another series of embodiments, an isolated peptide or polypeptide comprising one or more polymorphic positions is tested in vitro for its ability to bind test compounds in a sequence-specific manner. The screening methods involve: i) providing a first peptide or polypeptide containing a particular sequence in a polymorphic position and a second peptide or polypeptide, the sequence of which is identical to the first, except in a different sequence, in the same polymorphic position; (ii) contacting the polypeptides with a multiplicity of test compounds, under conditions suitable for binding; and (iii) identifying those compounds that selectively bind to one of the nucleic acid sequences.

Em formas de realização preferidas, são utilizados protocolos de rastreio com elevada capacidade de processamento para inspeccionar um grande número de compostos de teste, para a sua capacidade de ligação aos genes ou péptidos divulgados acima, de uma forma especifica para uma sequência.In preferred embodiments, high throughput screening protocols are used to inspect a large number of test compounds for their ability to bind to the genes or peptides disclosed above in a sequence specific manner.

Os compostos de teste são submetidos a rastreio a partir de grandes bibliotecas de compostos sintéticos ou naturais. Actualmente, são utilizados numerosos meios na síntese aleatória e dirigida de compostos baseados em sacáridos, péptidos e ácidos nucleicos. Encontram-se comercialmente disponíveis bibliotecas de compostos sintéticos, de Maybridge Chemical Co (Trevillet, Cornwall, RU), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH) e Microsource (New Milford, CT) . Encontra-se disponível de Aldrich (Milwaukee, WI), uma biblioteca de compostos químicos raros. Alternativamente, encontram-se disponíveis bibliotecas de compostos naturais, sob a forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetais e animais de, e. g., Pan Laboratories (Bothell, WA) ou MycoSearch (NC) ou são 38 facilmente produzíveis. Adicionalmente, as bibliotecas e os compostos, naturais e produzidos sinteticamente, são facilmente modificados através de meios químicos, físicos e bioquímicos convencionais. Métodos de rastreio in vivo:Test compounds are screened from large libraries of synthetic or natural compounds. Numerous media are currently used in the random and directed synthesis of compounds based on saccharides, peptides and nucleic acids. Libraries of synthetic compounds from Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH) and Microsource (New Milford, CT) are commercially available. It is available from Aldrich (Milwaukee, WI), a library of rare chemical compounds. Alternatively, libraries of natural compounds are available in the form of bacterial, fungal, plant and animal extracts of e.g. Pan Laboratories (Bothell, WA) or MycoSearch (NC) or are readily producible. In addition, natural and synthetically produced libraries and compounds are readily modified by conventional chemical, physical and biochemical means. In vivo screening methods:

As células intactas ou os animais completos que expressam as variantes polimórficas dos genes codificando a ACE, AGT, e/ou ATI podem ser utilizados nos métodos de rastreio para identificar candidatos a fármacos cardiovasculares.Intact cells or whole animals expressing the polymorphic variants of genes encoding ACE, AGT, and / or ITA may be used in screening methods to identify candidates for cardiovascular drugs.

Numa série de formas de realização, é estabelecida uma linha celular permanente a partir de um indivíduo apresentando um padrão polimórfico particular. Alternativamente, as células (incluindo, sem limitação, células de mamífero, insecto, levedura ou bacterianas) são programadas para expressar um gene compreendendo uma ou mais sequências polimórficas, pela introdução de ADN adequado. A identificação de compostos candidatos pode ser realizada, utilizando qualquer ensaio adequado, incluindo, sem limitação, (i) ensaios que medem a ligação selectiva, de compostos de teste, a variantes polimórficas particulares da ACE, AGT ou ATI; (ii) ensaios que medem a capacidade de um composto de teste modificar (í. e., inibir ou intensificar) uma actividade ou função mensurável da ACE, AGT ou ATI; e (iii) ensaios que medem a capacidade de um composto para modificar (i. e., inibir ou intensificar) a actividade de transcrição de sequências derivadas de regiões do promotor (í. e., reguladoras) dos genes da ACE, AGT ou ATI. 39In a series of embodiments, a permanent cell line is established from an individual having a particular polymorphic pattern. Alternatively, cells (including, without limitation, mammalian, insect, yeast or bacterial cells) are programmed to express a gene comprising one or more polymorphic sequences, by the introduction of suitable DNA. Identification of candidate compounds can be performed using any suitable assay including, without limitation, (i) assays that measure the selective binding of test compounds to particular polymorphic variants of ACE, AGT or ATI; (ii) assays measuring the ability of a test compound to modify (i.e., inhibit or enhance) a measurable activity or function of ACE, AGT or ATI; and (iii) assays that measure the ability of a compound to modify (i.e., inhibit or enhance) the transcription activity of sequences derived from promoter (ie, regulatory) regions of the ACE, AGT or ATI genes. 39

Numa outra série de formas de realização, são criados animais transgénicos, nos quais (i) um ou mais genes da ACE, AGT ou ATI humanos, tendo sequências diferentes em posições polimórficas particulares são inseridos, de forma estável, no genoma do animal transgénico; e/ou (ii) os genes da ACE, AGT, e/ou ATI endógeno são inactivados e substituídos por genes da ACE, AGT, e/ou ATI humanos, tendo sequências diferentes em posições polimórficas particulares. Ver, e. g., Coffman, Semin. Nephrol. 17:404, 1997; Esther et ai., Lab. Invest. 74:953, 1996; Murakami et ai., Blood Press. Suppl. 2:36, 1996. Esses animais podem ser tratados com compostos candidatos e serem monitorizados para um ou mais marcadores clínicos do estado cardiovascular. O seguinte pretende ser exemplos não limitativos da invenção.In another series of embodiments, transgenic animals are created, in which (i) one or more human ACE, AGT or ATI genes having different sequences at particular polymorphic positions are stably inserted into the genome of the transgenic animal; and / or (ii) endogenous ACE, AGT, and / or ITA genes are inactivated and replaced with human ACE, AGT, and / or ATI genes having different sequences at particular polymorphic positions. See, e.g. Coffman, Semin. Nephrol. 17: 404, 1997; Esther et al., Lab. Invest. 74: 953, 1996; Murakami et al., Blood Press. Suppl. 2:36, 1996. Such animals can be treated with candidate compounds and monitored for one or more cardiovascular markers. The following are intended to be non-limiting examples of the invention.

Exemplo 1: Métodos para Identificação de PosiçõesExample 1: Methods for Position Identification

Polimórficas em Genes Humanos Codificando a ACE, AGT e ATIPolymorphisms in Human Genes Encoding ACE, AGT and ATI

Os estudos seguintes foram realizados para identificar resíduos polimórficos dentro dos genes codificando a ACE, AGT e ATI humanos.The following studies were performed to identify polymorphic residues within genes encoding human ACE, AGT and ATI.

Foram obtidas amostras de ADN a partir de 277 indivíduos. Os indivíduos eram Caucasianos do sexo masculino nascidos em Uppsala, Suécia, entre 1920 e 1924. Os indivíduos foram seleccionados para a população de teste, com base no seu historial médico, i. e., estes eram quer, (i) saudáveis, sem qualquer sintoma de doença cardiovascular (100); ou (ii) sofreram um enfarte agudo do miocárdio (68), enfarte silencioso 40 do miocárdio (34), acidente vascular cerebral (18), acidente vascular cerebral e enfarte agudo do miocárdio (19) ou pressão sanguínea elevada aos 50 anos de idade (39) . As amostras de ADN foram obtidas a partir de cada indivíduo. A análise das sequências de ADN foi realizada por : (i) amplificação dos fragmentos curtos de cada um dos genes da ACE, AGT e ATI, utilizando a reacção em cadeia da polimerase (PCR) e (ii) sequenciação dos fragmentos amplificados. As sequências obtidas a partir de cada indivíduo foram, seguidamente, comparadas com as sequências genómicas conhecidas da ACE, AGT e ATI (ver Tabela 1) . (i) Amplificação: as reacções de PCR utilizaram os iniciadores apresentados na Tabela 2 abaixo.DNA samples were obtained from 277 individuals. Individuals were Caucasian males born in Uppsala, Sweden, between 1920 and 1924. Individuals were selected for the test population, based on their medical history, i. These were either (i) healthy, without any symptoms of cardiovascular disease (100); or (ii) suffered an acute myocardial infarction (68), silent myocardial infarction (34), stroke (18), stroke and acute myocardial infarction (19) or elevated blood pressure at age 50 (39). DNA samples were obtained from each subject. DNA sequence analysis was performed by: (i) amplification of the short fragments of each of the ACE, AGT and ATI genes using the polymerase chain reaction (PCR) and (ii) sequencing of the amplified fragments. The sequences obtained from each individual were then compared to the known genomic sequences of ACE, AGT and ATI (see Table 1). (i) Amplification: PCR reactions used the primers shown in Table 2 below.

Tabela 2Table 2

Nome Sequência Modificação *) Nucleótidos Numeração de acordo com * *) ACE/79RB 5'-TGCGTGCTTCAGAAGTCC-3' B 158-175 i + 2 0: 1-175 ACE/82RB 5'-CCAGGG AGGTG AAG AAATC-3' B 35-53 e20, SEQ ID N°. 7 ACE/84FT 5'-AGCC AGGCAGTAATG ACCT-3' T 1-19 i-19: 1-218 ACE/94FB 5'-GCCCACTGTTCCCTTATG-3' B 1-1&- i-21: 1-76 ACE/95RB 5"-TGCCCTGACTGACAGAGC-3' B 105-122 i+23: 1-122 ACE/96RT 5'-GCCCTGGTGTGCCTGT-3' T 1-16 i-22: 1-65 ACE/107F 5'-TGCCTGGATATGTGTTGC-3' - 1-18 i-15: 1-225 ACE/107FB 5'-TGCCTGGATATGTGTTGC-3' B 1-18 i-15: 1-225 ACE/108RB 5'-GCCCTCGCCTCTCACT-3' B 23-38 i-h 16: 1-38 ACE/111RT 5'-TCCCCTCTCCCTGTACCT-3' T 17-34 i + 15: 1-34 ACE/114RB 5'-GTGCTGGGGTAGGGTAGA-3' B 101-118 i + 7: 1-118 ACE/118FT 5'-TCCCCCTGACCTGGCT-3' T 221-236 i-7: 1-253 ACE/119FB 5'-GGGGCACCGTGATGTT-3' B 1-16 i-4: 1-120 ACE/119FT 5'-GGGGCACCGTGATGTT-3' T 1-16 i-4: 1-120 ACE/120RB 5'-GCCAGAGCCTTTGGTTT-3' B 230-246 i + 5: 1-246 ACE/122FB 5'-TGGAAGAGCCGACTTACAG-3' B 1-19 i-5: 1-78 ACE/123RB 5'-TCCCAGAGGCAAAGAGG-3' B 225-241 i+4: 1-241 41 (continuação)Name Sequence Modification *) Nucleotides Numbering according to * * ACE / 79RB 5'-TGCGTGCTTCAGAAGTCC-3 'B 158-175 i + 2 0: 1-175 ACE / 82RB 5'-CCAGGG AGGTG AAG AAATC-3' B 35 -53 e20, SEQ ID NO: 7 ACE / 84FT 5'-AGCCACGTAATG ACCT-3 'T 1-19 i-19: 1-218 ACE / 94FB 5'-GCCCACTGTTCCCTTATG-3' B 1-1 > 21: 1-76 ACE / 95RB 5'-GCCCTGGTGTGCCTGT-3 'T 1-16 i-22: 1-65 ACE / 107F 5'-TGCCTGGATATGTGTTGC-3' -TGCCCTGACTGACAGAGC-3 'B 105-122 i + 23: 1-122 ACE / 1-18 i-15: 1-225 ACE / 108FB 5'-TGCCTGGATATGTGTTGC-3 'B 1-18 i-15: 1-225 ACE / 108RB 5'-GCCCTCGCCTCTCACT-3' B 23-38h 16: 38 ACE / 111RT 5'-TCCCCTCTCCCTGTACCT-3 'T 17-34 i + 15: 1-34 ACE / 114RB 5'-GTGCTGGGGTAGGGTAGA-3' B 101-118 i + 7: 1-118 ACE / 118FT 5'-TCCCCCTGACCTGGCT -3 'T 221-236 i-7: 1-253 ACE / 119FB 5'-GGGGCACCGTGATGTT-3' B 1-16 i-4: 1-120 ACE / 119FT 5'-GGGGCACCGTGATGTT-3 'T 1-16 i -4: 1-120 ACE / 120RB 5'-GAGAGAGCCTTTGGTTT-3 'B 230-246 i + 5: 1-246 ACE / 122FB 5'-TGGAAGAGCCGACTTACAG-3' B 1-19 i-5: 1-78 ACE / 123RB 5'-TCCCAGAGGCAAAGAGG-3 'B 225-241 i + 4: 1-241 41 (continued)

Nome Sequência Modificação *) Nucleótidos Numeração de acordo com * *) ACE/130F 5'-GTTTCTACTGCGGCTTCAT-3' - 1-19 i-8:1-131 ACE/130FB 5'-GTTTCTACTGCGGCTTCAT-3' B 1-19 i-8: 1-131 ACE/134RB 5'-TCCTGGAAGAGGGAGTTTC-3' B 148-166 i + 9: 1-166 ACE/145F 5'-GCAGGAT GAGAGCAACAAC-3' - 1-18 i-7:1-253 ACE/146F 5'-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3' - 1-24 ’ i-17: 1-454 ACE/147R 5'-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3' - 1-25 el7, SEQ ID N°. 7 ACE/170RT 5'-CTTCCGTGGGACTCATGT-3' T 23-40 i + 5: 1-246 ACE/171RT 5'-TGCACCGTGAGGCTCTA-3' T 136-152 i + 8: 1-152 ACE/173F 5'-GCCGAATAGGAGGAAGCA-3' MT 1-10, 1-9 i-2: 1-10, e2 ACE/174R 5' -CCCACCCCATCTCCAAGAA-3' - 166-184 i-2:1-184 ACE/175FB 5'-GCC-3' MT, B 1-3 i-2: 1-10 ACE/176RT 5'-TCCCTGATGGGCTGCTCTC-3' T 65-83 i-2:1-184 ACE/177FT 5'-CAAGGCCCTCAACCAACTC-3' T 1-19 i-24:1-50 ACE/178RB 5'-TTCCCACAAAAGCTCCAGTG-3' B 71-90 i + 24: 1-108 ACE/179R 5'-GGCTCAAAATGGCAAGTGTT-3' - 89-108 i + 24: 1-108 ACE/180FT 5'-GGGCC ATGTCCTTCTG ACTC-3' T 1-20 i-25: 1-45 ACE/181RB 5'-CAGCCTGGAGGGGTTAAGA-3' B 33-51 i+25: 1-51 ACE/182R 5'-CCCTTCTGAGCGAGCTGAGT-3' 1-6,1-14 i —26: 1-6, e2 6, SEQ ID N ° . 7 ACE/183F 5'-GGCCATGTTGAGCTACTTCAA-3' - 83-103 e25, SEQ ID N°. 7 ACE/184FB 5'-CCTCCAGCCTTGGGTCTTAA-3' B 19-38 i + 25: 1-38 ACE/185RT 5'-TTCCCATCCCAGTCTCTGGT-3' T 269-288 e26, SEQ ID N°. 7 ACE/188RT 5'-GGCAGCCTGGTTGATGAGT-3' T 116-134 el7, SEQ ID N°. 7 ACE/192FB 5'-ATTCCAGCTCTGAAATTCTCTGA-3' B 1-23 i-17:1-85 ACP/3FT 5'-GAGCCCCTCCAGCACCTC-3' T 499-5017 SEQ ID N°. 6 ACP/4RB 5*-ACCCGAGCCTGCCCACC-3' B 5302-5318 SEQ ID N°. 6 ACP/5FT 5'-GGTCGGGCTGGGAAGATC-3' T 5232-5249 SEQ ID N°. 6 ACP/6RB 5'-TCGGCTCTGCCCCTTCTC-3' B 557 6-5593 SEQ ID N°, 6 + sequência adicional a jusante jj ACP/7FT 5'-GCCCTTTCTCCAGCTTCCTCT-3' T 5361-5381 SEQ ID N°. 6 ACP/8RB 5'-CGGCGGCAGCAGCAACA-3' B 5666-5682 SEQ ID N°, 6 + sequência adicional a jusante ACP/11FB 5'-GAGCCCCTCCAGCACCTC-3' B 499-5017 SEQ IDNo. 6 ACP/12RT 5'-ACCCGAGCCTGCCCACC-3' T 5302-5318 SEQ ID N°. 6 ACP/13FB 5'-GGTCGGGCTGGGAAGATC-3' B 5232-5249 SEQ ID N°. 6 ACP/14RT 5'-TCGGCTCTGCCCCTTCTC-3' T 557 6-5593 SEQ ID N°, 6 + sequência adicional a jusante ACP/15FB 5'-GCCCTTTCTCCAGCTTCCTCT-3' B 5361-5381 SEQ ID N°. 6 ACP/16RT 5'-CGGCGGCAGCAGCAAC A-3' T 5666-5682 SEQ ID N°, 6 + sequência adicional 42 (continuação)Name Sequence Modification *) Nucleotides Numbering according to * * ACE / 130F 5'-GTTTCTACTGCGGCTTCAT-3 '- 1-19 i-8: 1-131 ACE / 130FB 5'-GTTTCTACTGCGGCTTCAT-3' B 1-19 i- 8: 1-131 ACE / 134RB 5'-TCCTGGAAGAGGGAGTTTC-3 'B 148-166 i + 9: 1-166 ACE / 145F 5'-GCAGGAT GAGAGCAACAAC-3' - 1-18 i-7: 1-253 ACE / 146F 5'-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3'-1-24 'i-17: 1-454 ACE / 147R 5'-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3'-1-25 el7, SEQ ID NO. 7 ACE / 170RT 5'-CTTCCGTGGGACTCATGT-3 'T 23-40 i + 5: 1-246 ACE / 171RT 5'-TGCACCGTGAGGCTCTA-3' T 136-152 i + 8: 1-152 ACE / 173F 5'-GCCGAATAGGAGGAAGCA 3 'MT 1-10, 1-9 i-2: 1-10, e2 ACE / 174R 5'-CCCACCCCATCTCCAAGAA-3' - 166-184 i-2: 1-184 ACE / 175FB 5'-GCC-3 'MT, B 1-3 i-2: 1-10 ACE / 176RT 5'-TCCCTGATGGGCTGCTCTC-3' T 65-83 i-2: 1-184 ACE / 177FT 5'-CAAGGCCCTCAACCAACTC-3 'T 1-19 i -24: 1-50 ACE / 178RB 5'-TTCCCACAAAAGCTCCAGTG-3 'B 71-90 i + 24: 1-108 ACE / 179R 5'-GGCTCAAAATGGCAAGTGTT-3' -89-108 i + 24: 1-108 ACE / 180FT 5'-GGGCC ATGTCCTTCTG ACTC-3 'T 1-20 i-25: 1-45 ACE / 181RB 5'-CAGCCTGGAGGGGTTAAGA-3' B 33-51 i + 25: 1-51 ACE / 182R 5'-CCCTTCTGAGCGAGCTGAGT- 3 '1-6.1-14 i -26: 1-6, e2 6, SEQ ID NO. 7 ACE / 183F 5'-GGCCATGTTGAGCTACTTCAA-3 '- 83-103 e25, SEQ ID NO. 7 ACE / 184FB 5'-CCTCCAGCCTTGGGTCTTAA-3 'B 19-38 i + 25: 1-38 ACE / 185RT 5'-TTCCCATCCCAGTCTCTGGT-3' T 269-288 and 26, SEQ ID NO. 7 ACE / 188RT 5'-GGCAGCCTGGTTGATGAGT-3 'T 116-1347, SEQ ID NO. 7 ACE / 192FB 5'-ATTCCAGCTCTGAAATTCTCTGA-3 'B 1-23 i-17: 1-85 ACP / 3FT 5'-GAGCCCCTCCAGCACCTC-3' 499-5017 SEQ ID NO. 6 ACP / 4RB 5 * -ACCCGAGCCTGCCCACC-3 'B 5302-5318 SEQ ID NO. 6 ACP / 5FT 5'-GGTCGGGCTGGGAAGATC-3 'T 5232-5249 SEQ ID NO. 6 ACP / 6RB 5'-TCGGCTCTGCCCCTTCTC-3 'B 557 6-5593 SEQ ID NO: 6 + additional sequence downstream ACP / 7FT 5'-GCCCTTTCTCCAGCTTCCTCT-3' T 5361-5381 SEQ ID NO: 6 ACP / 8RB 5'-CGGCGGCAGCAGCAACA-3 'B 5666-5682 SEQ ID NO: 6 + additional sequence ACP / 11FB downstream 5'-GAGCCCCTCCAGCACCTC-3' B 499-5017 SEQ ID NO. 6 ACP / 12RT 5'-ACCCGAGCCTGCCCACC-3 'T 5302-5318 SEQ ID NO. 6 ACP / 13FB 5'-GGTCGGGCTGGGAAGATC-3 'B 5232-5249 SEQ ID NO. 6 ACP / 14RT 5'-TCGGCTCTGCCCCTTCTC-3 'T 557 6-5593 SEQ ID NO: 6 + additional sequence ACP / 15FB downstream 5'-GCCCTTTCTCCAGCTTCCTCT-3' B 5361-5381 SEQ ID NO. 6 ACP / 16RT 5'-CGGCGGCAGCAGCAAC A-3 'T 5666-5682 SEQ ID NO: 6 + additional sequence 42 (continuation)

Nome Sequência Modificação *) Nucleótidos Numeração com * *) de acordo a jusante ANG/1FT 5' -ATGGCACTTAAAGGTCAGTTAAT-3' T 336-358 SEQ ID N ° . 2 ANG/2RB 5' -TACGGAAGCCCAAGAAGTT-3' B 726-745 SEQ ID N ° . 2 ANG/5FT 5' -CTCCCC AACGGCTGTCTT-3' T 797-814 SEQ ID N ° . 2 ANG/6RB 5' -AGCAGCAACAT CCAGTTCTGT - 3 ' B 1119-1139 SEQ ID N ° . 2 ANG/7FT 5' -TCCCACGCTCTCTGGACTT-3' T 1099-1117 SEQ ID N ° . 2 ANG/8RB 5' - CT GAT CT CAGC TACACAT GGATACTA-3 ' B 1290-1315 SEQ ID N ° . 2 ANG/15FT 5* -CCTGTCTTGGGTGACTCTTC-3' T 7-26 SEQ ID N ° . 3 ANG/17FB 5' -TTCTGGGCTAAATGGTGACA-3' B 285-304 SEQ ID N ° . 2 ANG/18RT 5' -CTTGTCTTCGGTGTC AAGTTT-3' T 675-695 SEQ ID N ° . 2 ANG/19FB 5' -GGGAGCCTTGGACCACAC-3' B 839-856 SEQ ID N ° . 2 ANG/20RT 5' -AGCCTGC ATG AACGTGTCAA-3' T 1147-1167 SEQ ID N ° . 2 ANG/21FB 5' -TGGTGGGCGTGTTCACA-3' B 1018-1034 SEQ ID N ° . 2 ANG/22RT 5' -GCCAGAGCCAGCAGAGA-3' T 1264-1280 SEQ ID N ° . 2 ANG/29RB 5' -CCACATTCCAGGGGAGAC-3' B 335-352 SEQ ID N ° . 3 ANG/30FB 5' -CCTGTCTTGGGTGACTCTTC-3' B 7-26 SEQ ID N ° . 3 ANG/32RT 5' -CCACATTCCAGGGGAGAC-3' T 334-352 SEQ ID N ° . 3 ANP/1FT 5' -GTCCCTTCAGTGCCCTAATAC-3' T 314-334 SEQ ID N ° . 1 ANP/2RB 5' -AC AGCCAGATTG AAAGAC AC A-3' B 593-613 SEQ ID N ° . 1 ANP/3FT 5' -AACCCTTTTACTGGTC ATGTG A-3' T 492-513 SEQ ID N ° . 1 ANP/4RB 5' -CGCTCATGGGATGTGTGAC-3' B 747-765 SEQ ID N ° . 1 ANP/5FT 5' -TGTTTTCCCCAGTGTCTATTAGA-3' T 686-708 SEQ ID N ° . 1 ANP/6RB 5' - GCAGGGT CGAGT TACACAT T T - 3' B 982-1003 SEQ ID N ° . 1 ANP/7FT 5' -CCTCAGGCTGTCACACACCTA-3' T 909-929 SEQ ID N ° . 1 ANP/8RB 5' -CGGCTTACCTTCTGCTGTAGT-3' B 1246-1266 SEQ ID N ° . 1 ANP/9FB 5' -CTCCTTGAACCTGCTTGTGTT-3' B 273-293 SEQ ID N ° . 1 ANP/10RT 5' -GCATTGAAAGATGTGCTGTTCT-3' T 548-569 SEQ ID N ° . 1 ANP/11FB 5' -TAACGACTACAAAAGCAAGTCTTAC-3' B 446-469 SEQ ID N ° . 1 ANP/12RT 5' -AGAGGGCAGGGGAGAGTCT-3' T 805-823 SEQ ID N ° . 1 ANP/13FB 5' - GGCAGCAGGGT CAGAAGT - 3' B 766-783 SEQ ID N ° . 1 ANP/14RT 5' -GCT GGAGAGGAGGGT TACAT-3' T 1127-1146 SEQ ID N ° . 1 ANP/15FB 5' -TGCAAACTTCGGTAAATGTGT-3' B 970-990 SEQ ID N ° . 1 ANP/16RT 5' -CAGAACAACGGCAGCTTCT-3' T 1224-1242 SEQ ID N ° . 1 AT1/5FT 5' -ACTGGCTGACTTATGCTTTTTACT-3' T 547-570 SEQ ID N ° . 11 AT1/6RB 5' -GGGTT GAAT T T T GGCACT CATA-3 ' B 884-905 SEQ ID N ° . 11 AT1/7FT 5' -GCCAGTTTGCCAGCTATAAT-3' T 809-828 SEQ ID N ° . 11 AT1/8RB 5' -T GAT GCCTAGTTGAAT CAATACA-3' B 1123-1145 SEQ ID N ° . 11 AT1/9FT 5' - GAAGGCT TAT GAAAT T CAGAAGA-3 ' T 1003-1025 SEQ ID N ° . 11 AT1/1ORB 5' - AAAGT CGGT T C AGT CCACAT AA-3 ' B 1535-1556 SEQ ID N ° . 11 AT1/16FB 5' -AAACAGCTTGGTGGTGATAGTC-3' B 469-490 SEQ ID N ° . 11 AT 1/17 RT 5' -GCAGGTGACTTTGGCTACAA-3' T 762-781 SEQ ID N ° . 11 AT1/18 FB 5' -CCTGTACGCTAGTGTGTTTCT ACT-3' B 667-690 SEQ ID N ° . 11 AT1/19RT 5' -AGGAAACAGGAAACCCAGTATAT - 3' T 932-955 SEQ ID N ° . 11 43 (continuação)Name Sequence Modification *) Nucleotides Numbering with * *) according downstream ANG / 1FT 5'-ATGGCACTTAAAGGTCAGTTAAT-3 'T 336-358 SEQ ID NO. 2 ANG / 2RB 5'-TACGGAAGCCCAAGAAGTT-3 'B 726-745 SEQ ID NO. 2 ANG / 5FT 5'-CTCCCC AACGGCTGTCTT-3 'T 797-814 SEQ ID NO. 2 ANG / 6RB 5'-AGCAGCAACAT CCAGTTCTGT-3 'B 1119-1139 SEQ ID NO. 2 ANG / 7FT 5'-TCCCACGCTCTCTGGACTT-3 'T 1099-1117 SEQ ID NO. 2 ANG / 8RB 5 '- CT GAT CT CAGC TACACAT GGATACTA-3' B 1290-1315 SEQ ID NO. 2 ANG / 15FT 5 * -CCTGTCTTGGGTGACTCTTC-3 'T 7-26 SEQ ID NO. 3 ANG / 17FB 5'-TTCTGGGCTAAATGGTGACA-3 'B 285-304 SEQ ID NO. 2 ANG / 18RT 5 '-CTTGTCTTCGGTGTC AAGTTT-3' T 675-695 SEQ ID NO. 2 ANG / 19FB 5'-GGGAGCCTTGGACCACAC-3 'B 839-856 SEQ ID NO. 2 ANG / 20RT 5'-AGCCTGC ATG AACGTGTCAA-3 'T 1147-1167 SEQ ID NO. 2 ANG / 21FB 5 '-TGGTGGGCGTGTTCACA-3' B 1018-1034 SEQ ID NO. 2 ANG / 22RT 5'-GCCAGAGCCAGCAGAGA-3 'T 1264-1280 SEQ ID NO. 2 ANG / 29RB 5'-CCACATTCCAGGGGAGAC-3 'B 335-352 SEQ ID NO. 3 ANG / 30FB 5'-CCTGTCTTGGGTGACTCTTC-3 'B 7-26 SEQ ID NO. 3 ANG / 32RT 5'-CCACATTCCAGGGGAGAC-3 'T 334-352 SEQ ID NO. 3 ANP / 1FT 5'-GTCCCTTCAGTGCCCTAATAC-3 'T 314-334 SEQ ID NO. 1 ANP / 2RB 5 '-AC AGCCAGATTG AAAGAC AC A-3' B 593-613 SEQ ID NO. 1 ANP / 3FT 5'-AACCCTTTTACTGGTC ATGTG A-3 'T 492-513 SEQ ID NO. 1 ANP / 4RB 5 '-CGCTCATGGGATGTGTGAC-3' B 747-765 SEQ ID NO. 1 ANP / 5FT 5 '-TGTTTTCCCCAGTGTCTATTAGA-3' T 686-708 SEQ ID NO. 1 ANP / 6RB 5'-GCAGGGT CGAGT TACACAT T T-3 'B 982-1003 SEQ ID NO. 1 ANP / 7FT 5'-CCTCAGGCTGTCACACACCTA-3 'T 909-929 SEQ ID NO. 1 ANP / 8RB 5 '-CGGCTTACCTTCTGCTGTAGT-3' B 1246-1266 SEQ ID NO. 1 ANP / 9FB 5'--CTCCTTGAACCTGCTTGTGTT-3 'B 273-293 SEQ ID NO. 1 ANP / 10RT 5'-GCATTGAAAGATGTGCTGTTCT-3 'T 548-569 SEQ ID NO. 1 ANP / 11FB 5'-TAACGACTACAAAAGCAAGTCTTAC-3 'B 446-469 SEQ ID NO. 1 ANP / 12RT 5'-AGAGGGCAGGGGAGAGTCT-3 'T 805-823 SEQ ID NO. 1 ANP / 13FB 5'-GGCAGCAGGGT CAGAAGT-3 'B 766-783 SEQ ID NO. 1 ANP / 14RT 5 '-GCT GGAGAGGAGGGT TACAT-3' T 1127-1146 SEQ ID NO. 1 ANP / 15FB 5 '-TGCAAACTTCGGTAAATGTGT-3' B 970-990 SEQ ID NO. 1 ANP / 16RT 5'--CAGAACAACGGCAGCTTCT-3 'T 1224-1242 SEQ ID NO. 1 AT1 / 5FT 5 '-ACTGGCTGACTTATGCTTTTACT-3' T 547-570 SEQ ID NO. 11 AT1 / 6RB 5'-GGGTT GAAT T T GGCACT CATA-3 'B 884-905 SEQ ID NO. 11 AT1 / 7FT 5'-GCCAGTTTGCCAGCTATAAT-3 'T 809-828 SEQ ID NO. 11 AT1 / 8RB 5'-GAT GCCTAGTTGAAT CAATACA-3 'B 1123-1145 SEQ ID NO. 11 AT1 / 9FT 5'-GAAGGCT TAT GAAAT T CAGAAGA-3 'T 1003-1025 SEQ ID NO. 11 AT1 / 1ORB 5'-AAAGT CGGT T C AGT CCACAT AA-3 'B 1535-1556 SEQ ID NO. 11 AT1 / 16FB 5'-AACAGCTTGGTGGTGATAGTC-3 'B 469-490 SEQ ID NO. 11 AT 1/17 RT 5 '-GCAGGTGACTTTGGCTACAA-3' T 762-781 SEQ ID NO. 11 AT1 / 18 FB 5'-CCTGTACGCTAGTGTGTTTCT ACT-3 'B 667-690 SEQ ID NO. 11 AT1 / 19RT 5'-AGGAAACAGGAAACCCAGTATAT-3 'T 932-955 SEQ ID NO. 11 43 (continued)

Nome Sequência Modificação *) Nucleótidos Numeração de acordo com * *) AT1/22FB 5'-CTGGATTCCCCACCAAATAT-3' B 1090-1109 SEQ ID N°. 11 AT1/23RT 5'-TGCTCCTTCTTTCACAAAATTAC-3' T 1438-1460 SEQ ID N°. 11 ATP/1FT 5'-CTTCCGTTATTATGTGTGATATTAGT-3' T 1244-1269 SEQ ID B0. 9 ATP/2RB 5'-GCATGTACCTAAAAAGTCCTGTC-3' B 1566-1588 SEQ ID B0. 9 ATP/5FT 5' -ATTGGCATATCCATCACCTTAA- 3' T 1628-1649 SEQ ID r. 9 ATP/6RB 5'-GATCTCCCAACTCATGCTATGA-3' B 1961-1982 SEQ ID B0. 9 ATP/7FT 5'-ATTGGATTCAATTTGCCTACAT-3' T 1846-1867 SEQ ID B0. 9 ATP/8RB 5'-TTTGGTAATACAGTTGTGGATCATA-3' B 2159-2184 SEQ ID B0. 9 ATP/9FT 5'-TGCAACTTGGGTAGCATGTC-3' T 2077-2096 SEQ ID B0. 9 ATP/10RB 5'-AGTCGTCCCGTGTCAACTATC-3' B 2370-2390 SEQ ID B0. 9 ATP/11FB 5'-CGTTGTCTTCCGTTATTATGTGT-3' B 1238-1260 SEQ ID B0. 9 ATP/12RT 5'-TTATTGCATGTACCTAAAAAGTGTA-3' T 1455-1479 SEQ ID B0. 9 ATP/15FB 5'-GCAT T CATATAAAGAT CAAAT CAGT-3' B 1600-1624 SEQ ID B0. 9 ATP/16RT 5'-CACCCTGATAACAAAACCAGATA-3' T 1929-1951 SEQ ID B0. 9 ATP/17FB 5'-CTTTCTGGC ATC AACCTCACT-3' B 1794-1814 SEQ ID B0. 9 ATP/18RT 5'-ACTTTTAAGGACGAATTAGAGAACT-3' T 2214-2238 SEQ ID B0. 9 ATP/19FB 5'-GTCCACCCTTGAATTTCATAAC-3' B 2115-2136 SEQ ID B0. 9 ATP/20RT 5'-CCCAACCTCCTCCCTCTC-3' T 2396-2413 SEQ ID B0. 9 ATP/21FT 5'-GCTCGCTCTCCCTCACGAC-3' T 2310-2328 SEQ ID B0. 9 ATP/22RB 5'-TCCAGCCGCTCCCCATC-3' B 2657-2673 SEQ ID N". 9 ATP/23FB 5'-GCTCGCTCTCCCTCACGAC-3' B 2310-2328 SEQ ID N°. 9 ATP/24RT 5'-TCCAGCCGCTCCCCATC-3' T 2657-2673 SEQ ID N°. 9 ATR/1F 5'-GCCCCTCAGATAATGTAAGCTC-3' - 1353-1374 SEQ ID N°. 11 ATR/2R 5'-AACCGGCACGAAAACTTTACT-3' - 1834-1854 SEQ ID N°. 11 ATR/3aF 5'-GCACTTCACTACCAAATGAGCA-3' - 1476-1500 SEQ ID N°. 11 ATR/4cF 5'-GCACTTCACTACCAAATGAGCC-3' - 1476-1500 SEQ ID N°. 11Name Sequence Modification *) Nucleotides Numbering according to * *) AT1 / 22FB 5'-CTGGATTCCCCACCAAATAT-3 'B 1090-1109 SEQ ID NO. 11 AT1 / 23RT 5'-TGCTCCTTCTTTCACAAAATTAC-3 'T 1438-1460 SEQ ID NO. 11 ATP / 1FT 5'-CTTCCGTTATTATGTGTGATATTAGT-3 'T 1244-1269 SEQ ID B0. 9 ATP / 2RB 5'-GCATGTACCTAAAAAGTCCTGTC-3 'B 1566-1588 SEQ ID B0. 9 ATP / 5FT 5'-ATTGGCATATCCATCACCTTAA-3 'T 1628-1649 SEQ ID r. 9 ATP / 6RB 5'-GATCTCCCAACTCATGCTATGA-3 'B 1961-1982 SEQ ID B0. 9 ATP / 7FT 5'-ATTGGATTCAATTTGCCTACAT-3 'T 1846-1867 SEQ ID B0. 9 ATP / 8RB 5'-TTTGGTAATACAGTTGTGGATCATA-3 'B 2159-2184 SEQ ID B0. 9 ATP / 9FT 5'-TGCAACTTGGGTAGCATGTC-3 'T 2077-2096 SEQ ID B0. 9 ATP / 10RB 5'-AGTCGTCCCGTGTCAACTATC-3 'B 2370-2390 SEQ ID B0. 9 ATP / 11FB 5'-CGTTGTCTTCCGTTATTATGTGT-3 'B 1238-1260 SEQ ID B0. 9 ATP / 12RT 5'-TTATTGCATGTACCTAAAAAGTGTA-3 'T 1455-1479 SEQ ID B0. 9 ATP / 15FB 5'-GCAT T CATATAAAGAT CAAAT CAGT-3 'B 1600-1624 SEQ ID B0. 9 ATP / 16RT 5'-CACCCTGATAACAAAACCAGATA-3 'T 1929-1951 SEQ ID B0. 9 ATP / 17FB 5'-CTTTCTGGC ATC AACCTCACT-3 'B 1794-1814 SEQ ID B0. 9 ATP / 18RT 5'-ACTTTTAAGGACGAATTAGAGAACT-3 'T 2214-2238 SEQ ID B0. 9 ATP / 19FB 5'-GTCCACCCTTGAATTTCATAAC-3 'B 2115-2136 SEQ ID B0. 9 ATP / 20RT 5'-CCCAACCTCCTCCCTCTC-3 'T 2396-2413 SEQ ID B0. 9 ATP / 21FT 5'-GCTCGCTCTCCCTCACGAC-3 'T 2310-2328 SEQ ID B0. 9 ATP / 22RB 5'-TCCAGCCGCTCCCCATC-3 'B 2657-2673 SEQ ID N ". 9 ATP / 23FB 5'-GCTCGCTCTCCCTCACGAC-3 'B 2310-2328 SEQ ID NO. 9 ATP / 24RT 5'-TCCAGCCGCTCCCCATC-3 'T 2657-2673 SEQ ID NO. 9 ATR / 1F 5'-GCCCCTCAGATAATGTAAGCTC-3 '- 1353-1374 SEQ ID NO. 11 ATR / 2R 5'-AACCGGCACGAAAACTTTACT-3 '- 1834-1854 SEQ ID NO. 11 ATR / 3aF 5'-GCACTTCACTACCAAATGAGCA-3 '- 1476-1500 SEQ ID NO. 11 ATR / 4cF 5'-GCACTTCACTACCAAATGAGCC-3 '- 1476-1500 SEQ ID NO. 11

Quando indicado, os iniciadores foram modificados de uma das seguintes formas: (i) uma molécula de biotina foi conjugada com o terminal 5' da sequência indicada (B) ; (ii) uma sequência de nucleótidos derivada de M13, 5'-CAGGAAACAGCTATGACT-3', foi adicionada ao terminal 5' da sequência indicada (MT); ou (iii) a sequência 5'-AGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3' foi adicionada no terminal 5' da sequência indicada (T = Cauda). Os nucleótidos foram numerados de acordo com os N°s de ID de SEQ listados na Tabela 1, onde indicado. Quando as sequências envolvidas não se encontravam publicamente disponíveis, a numeração foi como nos 44 exemplos seguintes: a designação "i-4: 1-200" indica gue a seguência do iniciador está localizada dentro da seguência que se estende 200 pb a montante e incluindo o nucleótido imediatamente a montante do primeiro nucleótido codificante do exao 4. De um modo semelhante, a designação "i+4: 1-200" indica que a sequência de iniciador está localizada dentro da sequência que se estende do nucleótido que está localizado imediatamente a jusante do último nucleótido codificante do exão 4, 200 pb a jusante. Em cada caso, a localização especifica da sequência do iniciador é indicada na Tabela 2 na coluna designada "Nucleótidos". Os componentes de reacção utilizados na PCR são descritos na Tabela 3 abaixo.When indicated, the primers were modified in one of the following ways: (i) a biotin molecule was conjugated to the 5 'terminus of the indicated sequence (B); (ii) a nucleotide sequence derived from M13, 5'-CAGGAAACAGCTATGACT-3 ', was added to the 5' terminus of the indicated sequence (MT); or (iii) the sequence 5'-AGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3 'was added at the 5' terminus of the indicated sequence (T = Tail). The nucleotides were numbered according to the SEQ ID Nos. Listed in Table 1, where indicated. When the sequences involved were not publicly available, the numbering was as in the following examples: the designation " i-4: 1-200 " indicates that the primer sequence is located within the 200 bp upstream sequence and including the nucleotide immediately upstream of the first nucleotide encoding the exon 4. Similarly, the designation " i + 4: 1-200 " indicates that the primer sequence is located within the nucleotide extending sequence that is located immediately downstream of the last nucleotide encoding the 4 200 bp exon. In each case, the specific location of the primer sequence is indicated in Table 2 in the column designated " Nucleotides ". The reaction components used in the PCR are described in Table 3 below.

Tabela 3Table 3

Condição Componentes Volume A Ultrapure dNTP Set 2,5 mM (dATP:dCTP:dGTP:dTTP = 1:1:1:1), (Pharmacia Biotech) 4 pL Tampão II para PCR lOx, (Perkin Elmer) 5 pL Solução de MgCl2 2,5 mM, 3 pL Polimerase de ADN AmpliTaq®(Perkin Elmer) (5U/mL) 0,15 pL Iniciador 1 1 pL Iniciador 2 1 pL Solução de ADN 1 pL Água purificada por O/R q.s. Tot.50 pL B Ultrapure dNTP Set 2,5 mM (dATP:dCTP:dGTP:dITP:dTTP = 2:2:1:1:2), (Pharmacia Biotech) 4 pL Tampão II para PCR lOx, (Perkin Elmer) 5 pL Solução de MgCl2 2,5 mM, (Perkin Elmer) 3 pL Polimerase de ADN AmpliTaq® (5U/mL) 0,15 pL Iniciador 1 1 pL Iniciador 2 1 pL 45 (continuação)Condition Components Volume A Ultrapure dNTP Set 2.5 mM (dATP: dCTP: dTTP = 1: 1: 1: 1), (Pharmacia Biotech) 4 Âμl 10 Âμl PCR Buffer II, (Perkin Elmer) 5 Âμl MgCl2 solution 2.5 μM, 3 μl AmpliTaq® DNA polymerase (Perkin Elmer) (5U / ml) 0.15 pL Primer 1 1 pL Primer 2 1 pL DNA solution 1 pL Purified water per O / R qs Tot.50 pL B Ultrapure dNTP Set 2.5 mM (dATP: dCTP: dGTP: dTTP: dTTP = 2: 2: 1: 1: 2), (Pharmacia Biotech) 4 pL 10X PCR Buffer II, (Perkin Elmer) 5 pL 2.5 mM MgCl 2 solution (Perkin Elmer) 3 pL AmpliTaq® DNA polymerase (5U / mL) 0.15 pL Primer 1 1 pL Primer 2 1 pL 45 (continued)

Condição Componentes Volume Solução de ADN 1 pL Água purificada por 0/R q.s. Tot.50 pL C Ultrapure dNTP Set 2,5 mM (dATP:dCTP:dGTP:dITP:dTTP = 4:4:1:3:4), (Pharmacia Biotech) 4 pL Tampão II para PCR lOx, (Perkin Elmer) 5 pL Solução de MgCl2 2,5 mM, (Perkin Elmer) 3 pL Polimerase de ADN AmpliTaq® (5U/mL) 0,15 pL Iniciador 1 1 pL Iniciador 2 1 pL Solução de ADN 1 pL Água purificada por 0/R q.s. Tot 50 pL D Ultrapure dNTP Set 2,5 mM (dATP:dCTP:dGTP:dITP:dTTP = 6:6:1:5:6), (Pharmacia Biotech) 4 pL Tampão II para PCR lOx, (Perkin Elmer) 5 pL Solução de MgCl2 2,5 mM, (Perkin Elmer) 3 pL Polimerase de ADN AmpliTaq® (5U/mL) 0,15 pL Iniciador 1 1 pL Iniciador 2 1 pL Solução de ADN 1 pL Água purificada por 0/R q.s. Tot.50 pL E Ultrapure dNTP Set 2,5 mM (dATP:dCTP:dGTP:dITP:dTTP = 4:4:1:3:4), (Pharmacia Biotech) 4 pL Tampão II para PCR lOx, (Perkin Elmer) 5 pL Solução de MgCl2 2,5 mM, (Perkin Elmer) 2,5 pL DMSO 2,5 pL Polimerase de ADN AmpliTaqGold® (5U/mL) 0,5 pL Iniciador 1 1 pL Iniciador 2 1 pL Solução de ADN 1 pL • Água purificada por 0/R q.s. Tot 50 pL F Ultrapure dNTP Set 2,5 mM (dATP:dCTP:dGTP:dTTP = 4 pL 46 (continuação)Condition Components Volume DNA solution 1 pL Purified water for 0 / R q.s. (Perkin Elmer), 50 pL C Ultrapure dNTP Set 2.5 mM (dATP: dCTP: dGTP: dTTP: dTTP = 4: 4: 1: 3: 4), (Pharmacia Biotech) 5 Âμl 2.5 mM MgCl2 solution (Perkin Elmer) 3 Âμl AmpliTaq® DNA polymerase (5U / ml) 0.15 pL Primer 1 Âμl Primer 2 Âμl DNA solution 1 Âμl Purified water per Âμg / ml qs Thin 50 pL D Ultrapure dNTP Set 2.5 mM (dATP: dCTP: dGTP: dTTP: dTTP = 6: 6: 1: 5: 6), (Pharmacia Biotech) 4 pL Buffer II for PCR 10x, (Perkin Elmer) 5 pL Solution of 2.5 mM MgCl2 (Perkin Elmer) 3 μl AmpliTaq® DNA polymerase (5U / ml) 0.15 pL Primer 1 1 pL Primer 2 1 pL DNA solution 1 pL Purified water for 0 / R qs (Perkin Elmer), 50 pL E Ultrapure dNTP Set 2.5 mM (dATP: dCTP: dGTP: dTTP: dTTP = 4: 4: 1: 3: 4), (Pharmacia Biotech) 5 μl 2.5 mM MgCl 2 solution (Perkin Elmer) 2.5 μl 2.5 μl DMSO 2.5 μl AmpliTaqGold® DNA polymerase (5U / ml) 0.5 μl Primer 1 μl Primer 2 μl 1 μl DNA solution • Water purified by 0 / R qs Tot 50 ul Ultrapure dNTP Set 2.5 mM (dATP: dCTP: dGTP: dTTP = 4 pL 46 (continued)

Condição Componentes Volume 1:1:1:1) (Pharmacia Biotech Tampão II para PCR lOx, (Perkin Elmer) 5 pL Solução de MgCl2 2,5 mM, (Perkin Elmer) 2 pL Polimerase de ADN AmpliTaq® (5U/mL) 0,5 pL Iniciador 1 1 pL Iniciador 2 1 pL Solução de ADN 1 pL Água purificada por 0/R q.s. Tot 50 pL G Ultrapure dNTP Set 2,5 mM (dATP:dCTP:dGTP:dTTP = 1:1:1:1) (Pharmacia Biotech 4 pL Tampão II para PCR lOx, (Perkin Elmer) 5 pL Solução de MgCl2 2,5 mM, (Perkin Elmer) 2 pL Polimerase de ADN AmpliTaq® (5U/mL) 0,5 pL Iniciador 1 1 pL Iniciador 2 1 pL Solução de ADN I pL Água purificada por 0/R q.s. Tot.50 pL H Ultrapure dNTP Set 2,5 mM (dATP:dCTP:dGTP:dITP:dTTP = 4:4:1:3:4), (Pharmacia Biotech) 4 pL Tampão II para PCR lOx, (Perkin Elmer) 5 pL Solução de MgCl2 2,5 mM, (Perkin Elmer) 4 pL Polimerase de ADN AmpliTaqGold® (5U/mL) 0,5 pL Iniciador 1 1 pL Iniciador 2 1 pL Solução de ADN 1 pL Água purificada por 0/R q.s. Tot.50 pL(Perkin Elmer) 5 Âμl 2.5 mM MgCl2 solution (Perkin Elmer) 2 Âμl AmpliTaq® DNA Polymerase (5U / ml) 1: 1: 1: 1) (Pharmacia Biotech Buffer II for PCR 10x, 0.5 pL Primer 1 1 pL Primer 2 1 pL DNA Solution 1 pL Purified Water per 0 / R qs Tot 50 pL G Ultrapure dNTP Set 2.5 mM (dATP: dCTP: dGTP: dTTP = 1: 1: 1: 1) (Pharmacia Biotech 4 pL 10x PCR Buffer II, (Perkin Elmer) 5 pL 2.5 mM MgCl 2 solution (Perkin Elmer) 2 pL AmpliTaq® DNA polymerase (5U / mL) 0.5 pL Primer 1 1 pL Primer 2 1 pL DNA Solution I pL Purified water per 0.50 Rs Tot.50 pL Ultrapure dNTP Set 2.5 mM (dATP: dCTP: dGTP: dITP: dTTP = 4: 4: 1: 3: 4) (Perkin Elmer) 5 pL 2.5 mM MgCl2 solution (Perkin Elmer) 4 pL AmpliTaqGold® DNA polymerase (5U / mL) 0.5 pL Primer 1 1 pL Primer 2 1 pL DNA solution 1 pL Purified water per 0 / R qs Tot.50 pL

As condições de reacção utilizadas para PCR são descritas na Tabela 4 abaixo. 47The reaction conditions used for PCR are described in Table 4 below. 47

Tabela 4 (continuação) Método de PCR Temperatura*) Tempo*) Temperatura**) Tempo Temperatura Tempo N° de ciclos***) 25 94 15 s 55 30 s 72 45 s 35 72 5 min 1 22 OO 27 94 15 s 55 30 s 72 45 s 35 72 5 min 1 22 OO 36 94 2 min 1 94 15 s 58 30 s 72 45 s 35 72 5 min 1 22 OO 38 94 2 min 1 94 15 s 60 30 s 72 45 s 15 72 5 min 1 22 OO 40 94 2 min 1 94 15 s 60 30 s 72 45 s 35 72 5 min 1 22 OO 54 96 5 min 1 96 30 s 61 30 s 72 45 s 15 72 5 min 1 22 OO 56 96 5 min 1 96 30 s 61 30 s 72 45 s 35 72 5 min 1 22 OO 64 95 2 min 95 15 s 59 30 s 72 45 s 40 48 (continuação) Método de PCR Temperatura*) Tempo*) Temperatura**) Tempo Temperatura Tempo N° de ciclos***) 72 5 min 1 22 OC 70 95 5 min 95 15 s 59 30 s 72 45 s 50 72 5 min 1 22 OC Todas as temperaturas são fornecidas em graus Celsius. *) indica as temperaturas iniciais ( °C) por defeito, e os tempos do programa. **) indica a temperatura ( °C) do programa por defeito. ***) indica o número de ciclos do programa por defeito, referindo-se à secção do programa da PCR em que são utilizadas três temperaturas diferentes.Table 4 (continued) PCR method Temperature *) Time *) Temperature **) Time Temperature Time No. of cycles ***) 25 94 15 s 55 30 s 72 45 s 35 72 5 min 1 22 OO 27 94 15 s 55 30 s 72 45 s 35 72 5 min 1 22 OO 36 94 2 min 1 94 15 s 58 30 s 72 45 s 35 72 5 min 1 22 OO 38 94 2 min 1 94 15 s 60 30 s 72 45 s 15 72 5 min 1 22 OO 40 94 2 min 1 94 15 s 60 30 s 72 45 s 35 72 5 min 1 22 OO 54 96 5 min 1 96 30 s 61 30 s 72 45 s 15 72 5 min 1 22 OO 56 96 5 min 1 96 30 s 61 30 s 72 45 s 35 72 5 min 1 22 OO 64 95 2 min 95 15 s 59 30 s 72 45 s 40 48 (PCR method) Temperature *) Time *) Temperature **) Time Temperature Time Number of cycles ***) 72 5 min 1 22 OC 70 95 5 min 95 15 s 59 30 s 72 45 s 50 72 5 min 1 22 OC All temperatures are fo in degrees Celsius. *) indicates the initial temperatures (° C) by default, and program times. **) indicates the program temperature (° C) by default. ***) indicates the number of cycles of the default program, referring to the section of the PCR program in which three different temperatures are used.

Tabela 5 (continuação)Table 5 (continued)

Fragmento Iniciador 1 Iniciador 2 Método de PCR Modificações do método de PCR Condições da reacção de PCR ANPflF ANP/1FT ANP/2RB 64 A ANPf 2F ANP/3FT ANP/4RB 64 B ANPf3F ANP/5FT ANP/6RB 64 temp empar.: 48 °C A ANPf4F ANP/7FT ANP/8RB 64 temp empar.: 59 °C D ANPf5R ANP/9FB ANP/10RT 64 A ANPf6R ANP/11FB ANP/12RT 64 B ANPf7R ANP/13FB ANP/14RT 64 A ANPf8R ANP/15FB ANP/16RT 64 CFragment Initiator 1 Primer 2 PCR method Modifications of PCR method PCR reaction conditions ANP flF ANP / 1FT ANP / 2RB 64 The ANPf 2F ANP / 3FT ANP / 4RB 64 B ANPf3F ANP / 5FT ANP / 6RB 64 ° ANPf4R ANP / 7FB ANP / 8RB 64 ANP / 8RB 64 ANP / 8RB 64 ANP / 7FB ANP / 8RB 64 ANP / 8FB / 16RT 64 C

Quaisquer diferenças são Tabela 5, abaixo. Os fragmentos amplificados no que respeita aos iniciadores utilizadas na amplificação.Any differences are given in Table 5, below. The amplified fragments with respect to the primers used in the amplification.

indicadas em "Modificações" na são descritos na Tabela 5 abaixo e às condições de reacção de PCR 49 (continuação)indicated in " Modifications " are described in Table 5 below and the PCR reaction conditions 49 (continued)

Fragmento Iniciador 1 Iniciador 2 Método de PCR Modificações do método de PCR Condições da reacção de PCR ANGe2flF ANG/1FT ANG/2RB 64 C ANGe2 f3F ANG/5FT ANG/6RB 64 c ANGe2f4F ANG/7FT ANG/8RB 64 A ANGe2 f5R ANG/17FB ANG/18RT 64 A ANGe2 f7R ANG/19FB ANG/20RT 64 A ANGe2 f8R ANG/21FB ANG/22RT 64 A ANGe3F ANG/15FT ANG/29RB 64 temp empar.: 57 °C F ANGe3R ANG/30FB ANG/32RT 64 temp empar.: 57 °C, 45 ciclos A ACPf2F ACP/3FT ACP/4RB 70 temp empar.: 62 °C E ACPf3F ACP/5FT ACP/6RB 70 temp empar.: 58 °C E ACPf 4F ACP/7FT ACP/8RB 70 E ACPf6R ACP/11FB ACP/12RT 70 temp empar.: 62 °C E ACPf 7R ACP/13FB ACP/14RT 70 temp empar.: 58 °C E ACPf8R ACP/15FB ACP/16RT 70 E ACEe2R PCR1 ACE/173F ACE/174R 38 A ACEe2R PCR2 ACE/175FB ACE/176RT 40 A ACEe4F PCR1 ACE/119FB ACE/120RB 27 A ACEe4F PCR2 ACE/119FT ACE/123RB 25 A ACEe5R PCR1 ACE/119FB ACE/120RB 27 A ACEe5R PCR2 ACE/122FB ACE/170RT 25 A ACEe7F PCR1 ACE/145F ACE/114RB 27 A ACEe7F PCR2 ACE/118FT ACE/114RB 25 A ACEe8R PCR1 ACE/130F ACE/134RB 27 A ACEe8R PCR2 ACE/130FB ACE/171RT 25 A ACEelõR PCR1 ACE/107F ACE/108RB 27 A ACEel5R PCR2 ACE/107FB ACE/111RT 25 A ACEel7R ACE/192FB ACE/188RT 40 temp empar.: 63 °C, 40 ciclos A ACEel9F PCR1 ACE/84FT ACE/79RB 27 A ACEel9F PCR2 ACE/84FT ACE/82RB 25 A ACEe21R PCR1 ACE/94FB ACE/95RB 27 A ACEe21R PCR2 ACE/94FB ACE/96RT 25 A ACEe24R PCR1 ACE/177FT ACE/179R 38 A ACEe24F PCR2 ACE/177FT ACE/178RB 40 A ACEe25F PCR1 ACE/180FT ACE/182R 38 A ACEe25F PCR2 ACE/180FT ACE/181RB 40 A 50 (continuação)Fragment Primer 1 Primer 2 PCR Method Modifications of PCR Method PCR reaction conditions ANGe2flF ANG / 1FT ANG / 2RB 64 C ANGe2 f3F ANG / 5FT ANG / 6RB 64 c ANGe2f4F ANG / 7FT ANG / 8RB 64 A ANGe2 f5R ANG / 17FB ANG / 18RT 64 A ANGe2 f7R ANG / 19FB ANG / 20RT 64 A ANGe2 f8R ANG / 21FB ANG / 22RT 64 A ANGe3F ANG / 15FT ANG / 29RB 64 temp pair: 57 ° CF ANGe3R ANG / 30FB ANG / 32RT 64 temp ACP / 4RB 70 ° C ACP / 4RB 70 ° C ACP / 5 ° ACP / 5 ° C ACP / 6RB 70 ° C Temperature: ACPf6R ACP / 11FB ACP / 12RT 70 Temperature pair: 62 ° CE ACPf 7R ACP / 13FB ACP / 14RT 70 Temperature temp: 58 ° EC ACPf8R ACP / 15FB ACP / 16RT 70 E ACEe2R PCR1 ACE / 173F ACE / 174R 38 A ACEe2R PCR2 ACE / 175FB ACE / 176RT 40A ACEeRR ACEeRfR ACEeRRR ACEeRRR ACEeRRR ACEeRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRQ ACEe7F PCR1 ACE / 145F ACE / 114RB 27 ACEe7F PCR2 ACE / 118FT ACE / 114RB 25 A ACEe8R PCR1 ACE / 130F ACE / 134RB 27 ACEeRR ACEeRR ACeelRR ACEeRR ACeelRR ACeelRR ACeelRR ACeelRR ACeelRR ACEelRR ACEelRR ACEelRR ACEelRR ACEelRR ACEelRR The ACEe9R PCR2 ACE / 94FB ACE / 96RT 25 A ACEe9R PCR1 ACeel9F PCR1 ACeel9F PCR2 ACE / 84FT ACE / 82RB 25 A ACEe21R PCR1 ACE / 94FB ACE / ACEe24R PCR1 ACE / 177FT ACE / 179R 38A ACEe24F PCR2 ACE / 177FT ACE / 178RB 40A ACEe25F PCR1 ACE / 180FT ACE / 182R 38A ACEe25F PCR2 ACE / 180FT ACE / 181RB 40A 50 (continued)

Fragmento Iniciador 1 Iniciador 2 Método de PCR Modificações do método de PCR Condições da reacção de PCR ACEe26R PCR1 ACE/183F ACE/185RT 54 A ACEe26R PCR2 ACE/184FB ACE/185RT 56 A ACEDI ACE/146F ACE/147R 36 A ATPflF ATP/1FT ATP/2RB 64 A ATPf3F ATP/5FT ATP/6RB 64 temp empar.: 58 °C A ATPf4F ATP/7FT ATP/8RB 64 temp empar.: 48 °C A ATPf5F ATP/9FT ATP/10RB 64 temp empar.: 58 °C A ATPf6R ATP/11FB ATP/12RT 64 temp empar.: 48 °C A ATPf8R ATP/15FB ATP/16RT 64 temp empar.: 55 °C G ATPf9R ATP/17FB ATP/18RT 64 temp empar.: 54 °C A ATPflOR ATP/19FB ATP/20RT 64 A ATPfllF ATP/21FT ATP/22RB 64 desnaturação inicial: 95 °C, 12 min. H ATPf12R ATP/23FB ATP/24RT 64 desnaturação inicial: 95 °C, 12 min. H ATle5f2F AT1/5FT AT1/6RB 64 A ATleõf3F AT1/7FT AT1/8RB 64 A ATle5f4F AT1/9FT AT1/10RB 64 C ATle5f6R AT1/16FB AT1/17RT 64 A ATle5f7R AT1/18FB AT1/19RT 64 C ATleõf9R AT1/22FB AT1/23RT 64 A ATl-spec. 1 ATR/1F ATR/3aF ATR/2R 40 temp empar.: 63 °C A ATl-spec. 2 ATR/1F ATR/2R ATR/4cF 40 temp empar.: 63 °C AFragment Primer 1 Primer 2 PCR Method Modifications of the PCR Method PCR reaction conditions ACEe26R PCR1 ACE / 183F ACE / 185RT 54A ACEe26R PCR2 ACE / 184FB ACE / 185RT 56 ACE / 146F ACE / 147R 36 ATPflF ATP / 1FT ATP / 2RB 64 ATPf3F ATP / 5FT ATP / 6RB 64 temp pair: 58 ° CA ATPf4F ATP / 7FT ATP / 8RB 64 temp pair: 48 ° CA ATPf5F ATP / 9FT ATP / 10RB 64 temp pair: 58 ° CA ATPf6R ATP / 11FB ATP / 12RT 64 temp pair: 48 ° CA ATPf8R ATP / 15FB ATP / 16RT 64 temp pair: 55 ° CG ATPf9R ATP / 17FB ATP / 18RT 64 temp pair: 54 ° CA ATPflOR ATP / 19FB ATP / 20RT 64 ATPfllF ATP / 21FT ATP / 22RB 64 initial denaturation: 95øC, 12 min. H ATPf12R ATP / 23FB ATP / 24RT 64 initial denaturation: 95øC, 12 min. H ATle5f2F AT1 / 5FT AT1 / 6RB 64A ATle5f4R AT1 / 7RB 64 ATle / ATF / ATF / ATF / ATF AT1 / ATF / ATF AT1 / AT1 / 23RT64 AT1-spec. 1 ATR / 1F ATR / 3aF ATR / 2R 40 matched temp .: 63 ° C ATl-spec. 2 ATR / 1F ATR / 2R ATR / 4cF 40 matched temp .: 63 ° C A

Todos os produtos de PCR (excepto os fragmentos ACEDI, ATl-spec. 1 e ATl-spec. 2) foram submetidos a sequenciação em fase sólida, de acordo com o protocolo comercialmente disponível de Pharmacia Biotech. As reacções de sequenciação são realizadas com um iniciador de sequenciação tendo uma sequência complementar à sequência "Cauda" anteriormente descrita na Tabela 2. A sequência nucleotídica do iniciador de sequenciação 51 foi 5'-CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3' e o iniciador foi marcado com fluorescência com uma molécula Cy-5- no nucleótido 5'. As posições contendo uma variação genética foram identificadas por determinação da sequência nucleotídica, utilizando o sistema ALFexpress™ comercialmente disponível de Pharmacia Biotech. A detecção do fragmento ACEDI foi realizada por análise dos tamanhos dos fragmentos amplificados, por electroforese em gel, em que a presença de um produto de PCR mais curto (192 pares de bases) indicou o alelo D e um produto PCR mais longo (479 pares de bases) indicou o alelo I. A presença de ambas as bandasAll PCR products (except the ACEDI, ATl-spec.1 and ATl-spec.2 fragments) were subjected to solid phase sequencing according to the commercially available protocol from Pharmacia Biotech. Sequencing reactions are performed with a sequencing primer having a sequence complementary to the sequence " Tail " previously described in Table 2. The nucleotide sequence of the sequencing primer 51 was 5'-CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3 'and the primer was fluorescently labeled with a Cy-5- molecule at the 5' nucleotide. Positions containing a genetic variation were identified by nucleotide sequence determination using the commercially available ALFexpress ™ system from Pharmacia Biotech. Detection of the ACEDI fragment was performed by amplified fragment size analysis by gel electrophoresis, where the presence of a shorter PCR product (192 base pairs) indicated the D allele and a longer PCR product (479 pairs of bases) indicated the allele I. The presence of both bands

indicou um heterozigótico para os dois alelos. A detecção da reacção específica para um alelo da posição AT1-1271 foi realizada pela realização separada de duas reacções de PCR paralelas sobre a mesma amostra e pela comparação dos tamanhos dos fragmentos amplificados. Deve estar sempre presente um produto de PCR com 501 pares de bases, como um controlo, em ambas as separações paralelas, enquanto que a presença de um produto de PCR com 37 8 pares de bases na reacção designada como ATl-spec. 1, indicou a presença de um A nesta posição. A presença de um produto de PCR com 378 pares de bases na reacção designada como ATl-spec. 2, indicou um C nesta posição. Se estava presente, em ambas as reacções, o produto de PCR mais curto, o indivíduo é um heterozigótico para A e C.indicated a heterozygous for the two alleles. Detection of the specific reaction for one allele of the AT1-1271 position was accomplished by the separate accomplishment of two parallel PCR reactions on the same sample and by comparison of the sizes of the amplified fragments. A 501 base pair PCR product should always be present as a control in both parallel separations while the presence of a PCR product with 378 base pairs in the reaction designated as AT1-spec. 1, indicated the presence of an A in this position. The presence of a 378 base pair PCR product in the reaction designated as AT1-spec. 2, indicated a C in this position. If the shorter PCR product was present in both reactions, the individual is a heterozygous for A and C.

Resultados: A análise descrita acima resultou na identificação de posições polimórficas dentro de segmentos reguladores e e codificantes/intrão dos genes humanos codificando a ACE, AGT e ATI. As posições polimórficas, os nucleótidos variantes 52 encontrados em cada uma das posições e o fragmento de PCR no qual o polimorfismo foi identificado são apresentadas na Tabela 6 abaixo. São, igualmente, apresentadas as frequências de cada genótipo numa população de 90 indivíduos, expressas como a percentagem da população de estudo que tem aquele genótipo. São, igualmente, indicados os polimorfismos que resultaram em aminoácidos alternativos na ACE, no AGT ou no ATI. Como aqui utilizado, abaixo, as designações "AGR", "ACR" e "ATR" referem-se, respectivamente, às regiões reguladoras dos genes do AGT, da ACE e do ATI humanos; e as designações "AGT", "ACE" e "ATI", referem-se às regiões codificante dos genes da AGT, ACE e ATI.Results: The analysis described above resulted in the identification of polymorphic positions within regulatory and coding / intron segments of the human genes encoding ACE, AGT and ATI. The polymorphic positions, the variant nucleotides found in each of the positions and the PCR fragment in which the polymorphism was identified are shown in Table 6 below. The frequencies of each genotype are also presented in a population of 90 individuals, expressed as the percentage of the study population that has that genotype. Also, polymorphisms that result in alternative amino acids in ACE, AGT or ATI are also indicated. As used herein, the designations " AGR ", " ACR " and " ATR " refer respectively to the regulatory regions of the AGT, ACE and human ITA genes; and the designations " AGT ", " ACE " and " ATI ", refer to the coding regions of the AGT, ACE and ATI genes.

Tabela 6 (continuação)Table 6 (continued)

Gene Posição Genótipo descrito Variação Genética Frequência (percentagem) Alteração nos aminoácidos Fragmento Referência (se existente) AGR 395 T TT-TA-AA 88-11-1 Nenhuma ANPflF ANPf5R AGR 412 C CC-CT 99-1 Nenhuma ANPflF ANPf5R Gene Posição Genótipo descrito Variação Genética Frequência (percentagem) Alteração nos aminoácidos Fragmento Referência (se existente) AGR 432 G GG-GA 81-19 Nenhuma ANPflF ANPf5R AGR 449 C TT-TC 92-8 Nenhuma ANPflF ANPf5R AGR 692 C CC-CT 81-19 Nenhuma ANPÍ2F ANPf6R AGR 839 G GG-GA 93-7 Nenhuma ANPf3F ANPf7R AGR 1007 G GG-GA 81-19 Nenhuma ANPÍ4F ANPf7R AGR 1072 G GG-GA 89-11 Nenhuma ANPÍ4F ANPf7R AGR 1204 C CC-CA-AA 67-33 Nenhuma ANPÍ4F “ 53 (continuação)Gene Position Genetic Variation Frequency (percentage) Amino Acid Change Reference Fragment (if any) AGR 395 T TT-TA-AA 88-11-1 None ANPflF ANPf5R AGR 412 C CC-CT 99-1 None ANPflF ANPf5R Gene Position Genotype (if any) AGR 432 G GG-GA 81-19 None ANPflF ANPf5R AGR 449 C TT-TC 92-8 None ANPflF ANPf5R AGR 692 C CC-CT 81-19 None ANPf2R AGP 839 G GG-GA 93-7 None ANPf3R ANPf7R AGR 1007 G GG-GA 81-19 None ANPf4R ANPf7R AGR 1072 G GG-GA 89-11 None ANPF4R ANPf7R AGR 1204 C CC-CA-AA 67-33 None ANPÍ4F "53 (cont'd)

Gene Posição Genótipo descrito Variação Genética Frequência (percentagem) Alteração nos aminoácidos Fragmento Referência (se existente) ANPf8R AGR 1218 A AA-AG-GG 14-55-31 Nenhuma AN P f 4 F ANPf8R Inuoe, I et. al. J. C. I. (1997) 99: 1786-1789. AGT 273 C CC-CT 99-1 Nenhuma ANGe2f1F ANGe2 f5R AGT 620 C CC-CT 80-20 Thr-Met ANGe2 f3F ANGe2 f7R JeunmaitreX, et al. Cell (1992) 71: 69-180 AGT 803 T TT-TC-CC 35-52-13 Met-Thr ANGe2f4F ANGe2f8R JeunmaitreX, et al. Cell (1992) 71: 69-180 AGT 912 c CC-CT 99-1 Nenhuma ANGe3F ANGe3R AGT 997 G cc 100 Glu-Gin - AGT 1116 G GG-GA-AA 87-12-1 Nenhuma ANGe3F ANGe3R AGT i3 49 Numeração de acordo com a SEQ ID N° 4 A AA-AG 80-20 None ANGe3F ANGe3R AGT 1174 c CC-CA 99-1 Leu-Met ANGe4F ANGe4R Gene Posição Genótipo descrito Variação Genética Frequência (percentagem) Alteração nos aminoácidos Fragmento Referência (se existente) ACR 5106 C CC-CT 98-2 Nenhuma ACPf2F ACPf6R ACR 5349 A AA-AT-TT 35-46-19 Nenhuma ACPDF ACPf7R Villard, E. et al. Am. J. Hum. Genet. (1996) 58: 1268-1278 ACR 5496 T TT-TC-CC 35-46-19 Nenhuma ACPf4F ACPf8R Villard, E. et al. Am. J. Hum. Genet. (1996) 58: 54 (continuação)Gene Position Genetic Variation Frequency (percentage) Amino Acid Change Reference Fragment (if any) ANPf8R AGR 1218 A AA-AG-GG 14-55-31 None AN Pf 4 F ANPf8R Inuoe, I et. al. J. C. I. (1997) 99: 1786-1789. AGT 273 C CC-CT 99-1 None ANGe2f1F ANGe2 f5R AGT 620C CC-CT 80-20 Thr-Met ANGe2 f3F ANGe2 f7R JeunmaitreX, et al. Cell (1992) 71: 69-180 AGT 803 T TT-TC-CC 35-52-13 Met-Thr ANGe2f4F ANGe2f8R JeunmaitreX, et al. Cell (1992) 71: 69-180 AGT 912 c CC-CT 99-1 None ANGe3 F ANGe3R AGT 997 G cc 100 Glu-Gin-AGT 1116 G GG-GA-AA 87-12-1 None ANGe3F ANGe3R AGT i3 Numbering according to SEQ ID NO: 4 AA-AG 80-20 None ANGe3F ANGe3R AGT 1174 c CC-CA 99-1 Leu-Met ANGe4F ANGe4R Gene Position Genetic Variation Frequency (percentage) Amino Acid Change Reference Fragment existing) ACR 5106 C CC-CT 98-2 None ACPf2R ACPf6R ACR 5349 A AA-AT-TT 35-46-19 None ACPDF ACPf7R Villard, E. et al. Am. J. Hum. Genet. (1996) 58: 1268-1278 ACR 5496 T TT-TC-CC 35-46-19 None ACPf4F ACPf8R Villard, E. et al. Am. J. Hum. Genet. (1996) 58: 54 (continued)

Gene Posição Genótipo descrito Variação Genética Frequência (percentagem) Alteração nos aminoácidos Fragmento Referência (se existente) 1268-1278 ACE 375 A CC 100 Nenhuma ACEe2R - ACE 582 C CC-CT 94-6 Nenhuma ACEe4F - ACE 731 A AA-AG 96-4 Tyr-Cys ACEe5R - ACE 1060 G GG-GA 97-3 Gly-Arg ACEe7F - ACE 1215 C CC-CT-TT 35-42-23 Nenhuma ACEe8R Villard, E. et al. Am. J. Hum. Genet. (1996) 58: 1268-1278 ACE 2193 G GG-GA-AA 20-57-23 Nenhuma ACEel5R Villard, E. et al. Am. J. Hum. Genet. (1996) 58: 1268-1278 ACE 1451 DD-DI-II 29-54-20 None ACEDI Villard, E. et al. Am. J. Hum. Genet. (1996) 58: 1268-1278 ACE 2328 A AA-AG-GG 20-57-23 Nenhuma ACEel7R Villard, E. et al. Am. J. Hum. Genet. (1996) 58: 1268-1278 ACE 2741 G TT 100 Gly-Val ACEel9F - ACE 3132 C CC-CT 99-1 Nenhuma ACEe2IR - ACE 3387 T TT-TC-CC 20-57-23 Nenhuma ACEe24F - ACE 3503 c GG 100 Ala-Gly ACEe25F - ACE 3906 G GG-GA 91-9 Nenhuma ACEe26R - ATR 1427 A AA-AT-TT 77-22-1 Nenhuma ANPf1F ANPf6R ATR 1756 T TT-TA-AA 75-24-1 Nenhuma ANPf3F ANPf8R ATR 1853 T TT-TG-GG 82-11-1 Nenhuma ANPf3F ANPf8R ATR 2046 T CC-CT-TT 46-46-8 Nenhuma AN P f 4 F ANPf9R 55 (continuação)Gene Position Genetic Variation Frequency (percentage) Amino Acid Change Reference Fragment (if any) 1268-1278 ACE 375 A CC 100 None ACEe2R - ACE 582 C CC-CT 94-6 None ACEe4F - ACE 731 AA-AG 96- 4 Tyr-Cys ACEe5R-ACE 1060 G GG-GA 97-3 Gly-Arg ACEe7F-ACE 1215C CC-CT-TT 35-42-23 No ACEe8R Villard, E. et al. Am. J. Hum. Genet. (1996) 58: 1268-1278 ACE 2193 G GG-GA-AA 20-57-23 No ACEel5R Villard, E. et al. Am. J. Hum. Genet. (1996) 58: 1268-1278 ACE 1451 DD-DI-II 29-54-20 None ACEDI Villard, E. et al. Am. J. Hum. Genet. (1996) 58: 1268-1278 ACE 2328 A AA-AG-GG 20-57-23 No ACEel7R Villard, E. et al. Am. J. Hum. Genet. (1996) 58: 1268-1278 ACE 2741 G TT 100 Gly-Val ACEel9F-ACE 3132 C CC-CT 99-1 None ACEe2IR-ACE 3387 T TT-TC-CC 20-57-23 No ACEe24F-ACE 3503 and GG 100 Ala-Gly ACEe25F-ACE 3906 G GG-GA 91-9 None ACEe26R-ATR 1427 A AA-AT-TT 77-22-1 None ANPf1F ANPf6R ATR 1756 T TT-TA-AA 75-24-1 None ANPf3F ANPf8R ATR 1853 T TT-TG-GG 82-11-1 None ANPf3R ANPf8R ATR 2046 T CC-CT-TT 46-46-8 None AN P f 4 F ANPf9R 55 (continued)

Gene Posição Genótipo descrito Variação Genética Frequência (percentagem) Alteração nos aminoácidos Fragmento Referência (se existente) ATR 2354 A AA-AC-CC 73-26-1 Nenhuma AN P f 5 F ANPf10R ATR 2355 G GG-GC-CC 73-26-1 Nenhuma AN P f 5 F ANPf10R ATR 2415 A AA-AG 75-24-1 Nenhuma ANPf11F ANPf12R ATI 449 G GG-GC 99-1 Ser-Thr AT 1e 5 f 2 F ATle5f6R ATI 678 T CC-CT-TT 31-48-21 Nenhuma ATle5f3F ATle5f7R Rolfs A, et. al. Eur. Heart. J. (1994) 15: Suppl. D, 108-112. ATI 1167 A AA-AG 92-8 Nenhuma ATle5f4F ATle5f9R Rolfs A, et. al. Eur. Heart. J. (1994) 15: Suppl. D, 108-112. ATI 1271 A AA-AC-CC 50-40-10 Nenhuma ATl-spec Bonnardeaux, A. et al. Hypertension (1994) 24: 63-69.ATR 2354 A AA-AC-CC 73-26-1 None AN P f 5 F ANPf10R ATR 2355 G GG-GC-CC 73-26 (a) ATR 2354 A Genetic Variation Genetic Variation Frequency (percentage) -1 None AN P f 5 F ANPf10R ATR 2415 A AA-AG 75-24-1 None ANPf11F ANPf12R ATI 449 G GG-GC 99-1 Ser-Thr AT 1e 5 f 2 F ATle5f6R ATI 678 T CC-CT-TT 31-48-21 None ATle5f3F ATle5f7R Rolfs A, et. al. Eur. Heart. J. (1994) 15: Suppl. D, 108-112. ATI 1167 A AA-AG 92-8 None ATle5f4F ATle5f9R Rolfs A, et. al. Eur. Heart. J. (1994) 15: Suppl. D, 108-112. ATI 1271 A AA-AC-CC 50-40-10 None ATl-spec Bonnardeaux, A. et al. Hypertension (1994) 24: 63-69.

Foi, depois analisado um subconjunto destas posições polimórficas, em 187 indivíduos adicionais. A tabela 7 apresenta as posições polimórficas, a sequência nestas posições e as frequências do genótipo para cada posição, numa população de 277, como descrito no Exemplo 1, acima. 56A subset of these polymorphic positions was then analyzed in 187 additional subjects. Table 7 shows the polymorphic positions, the sequence at these positions and the genotype frequencies for each position, in a population of 277, as described in Example 1, above. 56

Tabela 7Table 7

Gene Posição Variação genética Frequência (percentagem) AGR 395 TT-TA-AA 87-12-7 AGR 432 GG-GA-AA 78-21-1 AGR 449 TT-TC-CC 94-5-1 AGR 692 CC-CT-TT 78-21-1 AGR 839 GG-GA 96-4 AGR 1007 GG-GA-AA 78-21-1 AGR 1072 GG-GA 76-24 AGR 1204 CC-CA-AA 3-27-70 AGR 1218 AA-AG-GG 16-50-34 AGT 620 CC-CT-TT 75-23-2 AGT 803 TT-TC-CC 34-50-16 AGT 1116 GG-GA-AA 83-15-2 ACR 5349 AA-AT-TT 37-44-19 ACR 5496 TT-TC-CC 38-43-19 ACE 1060 GG-GA 96-4 ACE 1215 CC-CT-TT 34-46-20 ACE 2193 GG-GA-AA 22-53-25 ACE 2328 AA-AG-GG 23-52-25 ACE 3387 TT-TC-CC 24-53-23 ACE 3906 GG-GA-AA 86-13-1 ATR 1427 AA-AT-TT 72-26-2 ATR 1756 TT-TA-AA 72-25-3 ATR 1853 TT-TG-GG 73-25-2 ATR 2046 CC-CT-TT 47-41-12 ATR 2354 AA-AC-CC 72-26-2 ATR 2355 GG-GC-CC 71-27-2 57 (continuação)Gene Position Genetic variation Frequency (percentage) AGR 395 TT-TA-AA 87-12-7 AGR 432 GG-GA-AA 78-21-1 AGR 449 TT-TC-CC 94-5-1 AGR 692 CC- TT 78-21-1 AGR 839 GG-GA 96-4 AGR 1007 GG-GA-AA 78-21-1 AGR 1072 GG-GA 76-24 AGR 1204 CC-CA-AA 3-27-70 AGR 1218 AA- AG-GG 16-50-34 AGT 620 CC-CT-TT 75-23-2 AGT 803 TT-TC-CC 34-50-16 AGT 1116 GG-GA-AA 83-15-2 ACR 5349 AA-AT- TT 37-44-19 ACR 5496 TT-TC-CC 38-43-19 ACE 1060 GG-GA 96-4 ACE 1215 CC-CT-TT 34-46-20 ACE 2193 GG-GA-AA 22-53-25 ACE 2328 AA-AG-GG 23-52-25 ACE 3387 TT-TC-CC 24-53-23 ACE 3906 GG-GA-AA 86-13-1 ATR 1427 AA-AT-TT 72-26-2 ATR 1756 TT-TA-AA 72-25-3 ATR 1853 TT-TG-GG 73-25-2 ATR 2046 CC-CT-TT 47-41-12 ATR 2354 AA-AC-CC 72-26-2 ATR 2355 GG- GC-CC 71-27-2 57 (continued)

Gene Posição Variação genética Frequência (percentagem) ATR 2415 AA-AG-GG 73-25-2 ATI 678 CC-CT-TT 26-51-23 ATI 1167 AA-AG 88-12 ATI 1271 AA-AC-CC 55-36-9Gene Position Genetic variation Frequency (percentage) ATR 2415 AA-AG-GG 73-25-2 ATI 678 CC-CT-TT 26-51-23 ATI 1167 AA-AG 88-12 ATI 1271 AA-AC-CC 55-36 -9

Exemplo 2: Correlação entre os padrões Polimórficos e a Doença CardiovascularExample 2: Correlation between Polymorphic patterns and Cardiovascular Disease

As posições polimórficas identificadas como no Exemplo 1 foram correlacionadas com os seguintes marcadores do estado cardiovascular, presentes na população de estudo: enfarte do miocárdio (MI); acidente vascular cerebral; e pressão sanguínea elevada. São apresentados abaixo os padrões polimórficos, i. e., combinações de sequências em posições polimórficas particulares, que apresentam uma correlação estatisticamente significativa com um ou mais destes marcadores. ACR 5349 A/T, AGR 1218 A Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 3 7 3 5 17 % dentro do grupo 3 co LO 8,1 12,8 58 ACR 5496 C, AGR 1204 A/C Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 2 7 3 2 13 % dentro do grupo 2 5, 8 8,1 5,1 ACR 5496 C/T, AGR 1218 A, AGT 620 C/T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 4 13 1 3 21 % dentro do grupo 4 10, 8 2,7 7,7 ACE 2193 A, AGR 1204 C, ACE 2328 G Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 0 11 3 3 16 % dentro do grupo 0 9,2 8,1 7,7 59 ACE 2193 A, AGR 1204 A/C Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 1 1 0 1 3 % dentro do grupo 1 0, 8 0 2, 6 ACE 3387 T, AGR 1218 A Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 2 4 1 3 10 % dentro do grupo 2 3,3 2,7 7,7 ACE 3387 T, AGT 620 C/T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 1 10 3 2 15 % dentro do grupo 1 8,3 8,1 5,1 60 AGR 1204 A/C ATI 678 C/T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 5 23 5 6 37 % dentro do grupo 5 19,2 13,5 15,4 AGR 1204 A/C, ATI 1271 A/C Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 3 17 3 4 26 % dentro do grupo 3 14,2 8,1 10,3 ACE 1215 C, AGR 1204 A/C Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 3 13 5 6 25 % dentro do grupo 3 10, 8 13,5 15,4 61 AGR 1204 A/C, ATI 1167 A, ACE 3906 A/G Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 0 5 1 0 6 % dentro do grupo 0 4,2 2,7 0 AGR 1204 A, AGT 620 C, ATI 1271 A, ATI 1167 A, AGR 395 A/T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 1 4 5 3 11 % dentro do grupo 1 3,3 13,5 7,7 AGR 1204 A/C, AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A, AGR 395 T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 3 13 3 2 20 % dentro do grupo 3 10, 8 8,1 5,1 62 AGR 1204 A/C, AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A/G, AGR 395 T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 0 2 0 1 3 % dentro do grupo 0 1,7 0 2, 6The polymorphic positions identified as in Example 1 were correlated with the following cardiovascular status markers present in the study population: myocardial infarction (MI); stroke; and high blood pressure. The polymorphic patterns, i. i.e. combinations of sequences at particular polymorphic positions, which have a statistically significant correlation with one or more of these markers. ACR 5349 A / T, AGR 1218 A Healthy (100) MI (120) Stroke (37) PS High (39) Total (n) # of events 3 7 3 5 17% within group 3 co LO 8.1 12.8 58 ACR 5496 C, AGR 1204 A / C Healthy (100) MI (120) Stroke (37) PS High (39) Total (n) # of events 2 7 3 2 13% within group 2 5 , 8 8.1 5.1 ACR 5496 C / T, AGR 1218 A, AGT 620 C / T Healthy (100) MI (120) Stroke (37) PS High (39) Total # 13 1 3 21% within group 4 10.8 8 2.7 7.7 ACE 2193 A, AGR 1204 C, ACE 2328 G Healthy (100) MI (120) Stroke (37) PS High (39) Total ( n) # of events 0 11 3 3 16% within group 0 9.2 8.1 7.7 59 ACE 2193 A, AGR 1204 A / C Healthy (100) MI (120) Stroke (37) High PS (39) Total (n) # of events 1 1 0 1 3% within group 1 0, 8 0 2, 6 ACE 3387 T, AGR 1218 A Healthy (100) MI (120) Stroke (37) High PS (39) Total (n) # of Events 2 4 1 3 10% within group 2 3.3 2.7 7.7 ACE 3387 T, AGT 620 C / T Healthy (100) MI (120) Stroke (37) PS High (39) Total (n) # of events 1 10 3 2 15% within group 1 8.3 8.1 5.1 60 AGR 1204 A / C ATI 678 C / T Healthy (100) MI (120) Stroke (37) High PS 39) Total (n) # of events 5 23 5 6 37% within group 5 19.2 13.5 15.4 AGR 1204 A / C, ATI 1271 A / C Healthy (100) MI (120) Stroke (37) PS High (39) Total (n) # of events 3 17 3 4 26% within group 3 14.2 8.1 10.3 ACE 1215 C, AGR 1204 A / C Healthy (100) MI (120 ) Stroke (37) PS High (39) Total (n) # of events 3 13 5 6 25% within group 3 10, 8 13.5 15.4 61 AGR 1204 A / C, ATI 1167 A, ACE 3906 A / G Healthy (100) MI (120) Stroke (37) PS High (39) Total (n) # of events 0 5 1 0 6% within group 0 4.2 2.7 0 AGR 1204 A , AGT 620 C, ATI 1271 A, ATI 1167 A, AGR 395 A / T Healthy (100) MI (12 0) Stroke (37) PS High (39) Total (n) # of events 1 4 5 3 11% within group 1 3.3 13.5 7.7 AGR 1204 A / C, AGT 620 C / T , ATI 1271 A / C, ATI 1167 A, AGR 395 T Healthy (100) MI (120) Stroke (37) PS High (39) Total (n) # of events 3 13 3 2 20% within group 3 10, 8 8.1 5.1 62 AGR 1204 A / C, AGT 620 C / T, ATI 1271 A / C, ATI 1167 A / G, AGR 395 T Healthy (100) MI (120) Stroke (37 ) PS High (39) Total (n) # of events 0 2 0 1 3% within the group 0 1,7 0 2, 6

Sumário dos três padrões polimórficos anteriores (os quais envolvem as mesmas posições polimórficas):Summary of the three previous polymorphic patterns (which involve the same polymorphic positions):

Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 4 19 8 6 34 % dentro do grupo 4 15, 8 21, 6 15,4 AGR 1204 A, ATI 678 C, ATI 1167 A, AGR 395 A/T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 1 2 2 1 5 % dentro do grupo 1 1,7 5,4 2, 6 63 AGR 1204 A/C, ATI 678 C/T, ATI 1167 A, AGR 395 T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 3 18 5 4 28 % dentro do grupo 3 15, 0 13,5 10,3Healthy (100) MI (120) Stroke (37) PS High (39) Total (n) # of events 4 19 8 6 34% within group 4 15, 8 21, 6 15.4 AGR 1204 A, ATI 678 C, ATI 1167 A, AGR 395 A / T Healthy (100) MI (120) Stroke (37) High PS (39) Total (n) # of events 1 2 2 1 5% within group 11, (5) A (b) (b) (b) (b) (b) (b) and (c) # of events 3 18 5 4 28% within the group 3 15, 0 13.5 10.3

Sumário dos dois padrões polimórficos anteriores:Summary of the two previous polymorphic patterns:

Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 4 20 7 5 33 % dentro do grupo 4 16, 7 18, 9 12,8 64 AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A, AGR 395 T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 2 8 1 2 13 % dentro do grupo 2 6,7 2,7 5,1 AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A/G, AGR 395 T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 0 2 0 1 3 % dentro do grupo 0 1,7 0 2, 6 AGT 620 C, ATI 1271 A, ATI 1167 A, AGR 395 A/T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 1 4 5 3 11 % dentro do grupo 1 3,3 13,5 7,7 65Healthy (100) MI (120) Stroke (37) PS High (39) Total (n) # of events 4 20 7 5 33% within group 4 16, 7 18, 9 12.8 64 AGT 620 C / T, ATI 1271 A / C, ATI 1167 A, AGR 395 T Healthy (100) MI (120) Stroke (37) PS High (39) Total (n) # of events 2 8 1 2 13% within the group 2 6.7 2.7 5.1 AGT 620 C / T, ATI 1271 A / C, ATI 1167 A / G, AGR 395 T Healthy (100) MI (120) Stroke (37) Total (n) # of events 0 2 0 1 3% within the group 0 1,7 0 2, 6 AGT 620 C, ATI 1271 A, ATI 1167 A, AGR 395 A / T Healthy (100) MI (120) Accident (37) PS High (39) Total (n) # of events 1 4 5 3 11% within the group 1 3.3 13.5 7.7 65

Sumário dos três padrões polimórficos anteriores:Summary of the three previous polymorphic patterns:

Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 3 14 6 6 27 % dentro do grupo 3 11,7 16, 2 15,4 AGT 620 C, ATI 678 A, ATI 1167 A, AGR 395 A/T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 1 2 2 1 5 % dentro do grupo 1 1,7 5,4 2, 6 AGT 620 C/T, ATI 678 C/T; ATI 1167 A, AGR 395 T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 3 15 4 4 24 % dentro do grupo 3 12,5 10,8 10,3 66Healthy (100) MI (120) Stroke (37) PS High (39) Total (n) # of events 3 14 6 6 27% within group 3 11.7 16, 2 15.4 AGT 620 C, ATI 678 A, ATI 1167 A, AGR 395 A / T Healthy (100) MI (120) Stroke (37) High PS (39) Total (n) # of events 1 2 2 1 5% within group 11, 7 5.4 2.6 AGT 620 C / T, ATI 678 C / T; ATI 1167 A, AGR 395 T Healthy (100) MI (120) Stroke (37) PS High (39) Total (n) # of events 3 15 4 4 24% within group 3 12.5 10.8 10 , 3 66

Sumário dos dois padrões polimórficos anteriores:Summary of the two previous polymorphic patterns:

Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 4 17 6 5 29 % dentro do grupo 4 14,2 16, 2 12, 9 ACE 2193 A, AGR 1218 A, AGT 803 A Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 2 5 1 3 11 % dentro do grupo 2 4,2 2,7 7,7 67 ACE 2193 A, AGT 620 C/T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 1 11 3 2 16 % dentro do grupo 1 9,2 8,1 5,1 ACE 2328 G, AGT 620 C/T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 1 11 3 2 16 % dentro do grupo 1 9,2 8,1 5,1 ACE 3387 T, AGR 1204 A/C Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 0 10 3 3 15 % dentro do grupo 0 8,3 8,1 7,7 68Healthy (100) MI (120) Stroke (37) PS High (39) Total (n) # of events 4 17 6 5 29% within group 4 14.2 16.2 12.9 ACE 2193 A, AGR 1218 A, AGT 803 A Healthy (100) MI (120) Stroke (37) PS High (39) Total (n) # of events 2 5 1 3 11% within group 2 4.2 2 7 7, 7 67 ACE 2193 A, AGT 620 C / T Healthy (100) MI (120) Stroke (37) PS High (39) Total (n) # of events 1 11 3 2 16% within group 1 9.2 8,1 5.1 ACE 2328 G, AGT 620 C / T Healthy (100) MI (120) Stroke (37) PS High (39) Total (n) # of events 1 11 3 2 16% within the group 1 9.2 8.1 5.1 ACE 3387 T, AGR 1204 A / C Healthy (100) MI (120) Stroke (37) PS High (39) Total (n) # of events 0 10 3 3 15 % within the group 0 8.3 8.1 7.7 68

Exemplo 3: Correlação Entre vim Padrão Polimófico Especifico e a Resposta ao TratamentoExample 3: Correlation Between Vim Specific Polymorphic Pattern and Response to Treatment

Foi realizado o seguinte estudo, para definir padrões polimórficos nos genes da ACE, AGT, e/ou ATI humanos que prevejam a eficácia de tratamentos para a doença cardiovascular.The following study was carried out to define polymorphic patterns in human ACE, AGT, and / or ATI genes that predict the efficacy of treatments for cardiovascular disease.

Foram estudados dois grupos de doentes hipertensos, 41 no primeiro grupo e 20 no segundo grupo. Os grupos foram analisados independentemente e em combinação.Two groups of hypertensive patients were studied, 41 in the first group and 20 in the second group. The groups were analyzed independently and in combination.

Cada um dos doentes desta população foi tratado com um dos seguintes cinco inibidores da ACE: Captopril, Trandolapril, Lisinopril, Fosinopril ou Enalapril. Foi quantificado o efeito dos fármacos sobre a pressão sanguínea arterial média. A pressão sanguínea arterial média foi definida como 2/3 da pressão sanguínea diastólica + 1/3 da pressão sanguínea sistólica. Os indivíduos, foram, igualmente, classificados como "respondentes elevados," i. e., os que apresentam uma redução superior a 16 mm de Hg durante o tratamento com um fármaco inibidor da ACE e "respondentes baixos," i. e., os que não apresentam uma redução superior a 16 mm de Hg.Each of the patients in this population was treated with one of the following five ACE inhibitors: Captopril, Trandolapril, Lisinopril, Fosinopril or Enalapril. The effect of the drugs on the mean arterial blood pressure was quantified. Mean arterial blood pressure was defined as 2/3 of diastolic blood pressure + 1/3 of systolic blood pressure. Individuals were also classified as " elevated respondents, " i. i.e., those exhibiting a reduction of greater than 16 mmHg during treatment with an ACE inhibitor drug and " low responders " i. i.e., those which do not show a reduction greater than 16 mm Hg.

Um padrão polimórfico particular, ACE 2193 A/G, AGR 1072 G/G, ATI 1167 A/A, o qual se encontrava presente em 51% da primeira população de estudo, discriminou entre respondentes elevados e respondentes baixos. No segundo grupo de 20 doentes, o modelo foi menos prevalecente (25%), mas foi evidente a correlação com a pressão sanguínea abaixada. Os indivíduos que apresentavam este padrão polimórfico (designado "1", abaixo), evidenciaram uma maior redução na pressão sanguínea do que os 69 que não apresentavam este padrão polimórfico (designado "0" abaixo).A particular polymorphic pattern, ACE 2193 A / G, AGR 1072 G / G, ATI 1167 A / A, which was present in 51% of the first study population, discriminated between high respondents and low respondents. In the second group of 20 patients, the model was less prevalent (25%), but correlation with lowered blood pressure was evident. Individuals exhibiting this polymorphic pattern (designated " 1 ", below), evidenced a greater reduction in blood pressure than 69 individuals who did not have this polymorphic pattern (designated " 0 " below).

Padrão Observações Alteração Média S .D. Polimórfico da P.S. (mm Hg) 0 36 \—1 \—1 1 8,6 1 25 \—1 oo \—1 1 9,7Default Remarks Change Mean S.D. Polymorphic of P.S. (mm Hg) 0 36 \ -1 \ 8 1 8.6 11 25 -1 -1 9.7

Para além disso, a distribuição dos respondentes elevados e dos respondentes baixos (como definidos acima) foi como se segue:In addition, the distribution of the high respondents and the low respondents (as defined above) was as follows:

Padrão polimórfico % de respondentes baixos % de respondentes elevados 0 80,1 19, 4 1 24,0 76, 0Polymorphic pattern% of respondents low% of respondents high 0 80.1 19, 4 1 24.0 76.0

No seu conjunto, os resultados dos dois grupos indicam que a presença deste padrão polimórfico está em correlação com uma redução incremental de 6,4-7,3 mm de Hg, em relação a indivíduos que não apresentam este padrão polimórfico. A prevalência deste padrão polimórfico foi de 41% nesta população hipertensa. Isto sugere que o teste para este padrão polimórfico em doentes hipertensos, seguido da prescrição de inibidores da ACE, apenas aos doentes que apresentam este padrão polimórfico, possa aumentar a taxa de resposta de 43% (numa população hipertensa em geral), para 76%, na população hipertensa seleccionada, de acordo com os métodos da invenção. 70Taken together, the results of the two groups indicate that the presence of this polymorphic pattern correlates with an incremental reduction of 6.4-7.3 mm Hg, in relation to individuals who do not present this polymorphic pattern. The prevalence of this polymorphic pattern was 41% in this hypertensive population. This suggests that the test for this polymorphic pattern in hypertensive patients, followed by prescription of ACE inhibitors, only in patients with this polymorphic pattern, may increase the response rate of 43% (in a hypertensive population in general) to 76% , in the selected hypertensive population, according to the methods of the invention. 70

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Meadowland Business Partners AB <120> Métodos para Avaliar o Estado cardiovascular e Composições para a Sua Utilização <130> 72254/09 <140> EP 98908252.4 <141> 1998-04-01 <160> 11 <170> Patentln versão 3.0SEQUENCE LISTING < 110 > Meadowland Business Partners AB < 120 > Methods for Assessing Cardiovascular Status and Compositions for Its Utilization < 130 > 72254/09 < 140 > EP 98908252.4 < 141 > 1998-04-01 < 160 > 11 < 170 > Patentln version 3.0

<210> 1 <211> 1278 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 1 ccagacaagt gatttttgag gagtccctat ctataggaac aaagtaatta aaaaaatgta 60 tttcagaatt tacaggccca tgtgagatat gattttttta aatgaagatt tagagtaatg 120 ggtaaaaaag aggtatttgt gtgtttgttg attgttcagt cagtgaatgt acagcttctg 180 cctcatatcc aggcaccatc tcttcctgct ctttgttgtt aaatgttcca ttcctgggta 240 atttcatgtc tgccatcgtg gatatgccgt ggctccttga acctgcttgt gttgaagcag 300 gatcttcctt uctgtccctt cagtgcccta ataccatgta tttaaggctg gacacatcac 360 cactcccaac ctgcctcacc cactgcgtca cttgtgatca ctggcttctg gcgactctca 420 ccaaggtctc tgtcatgccc tgttataacg actacaaaag caagtcttac ctataggaaa 480 ataagaatta taaccctttt actggtcatg tgaaacttac catttgcaat ttgtacagca 540 71 taaacacaga acagcacatc tttcaatgcc tgcatcctga aggcattttg tttgtgtctt 600 tcaatctggc tgtgctattg ttggtgttta acagtctccc cagctacact ggaaacttcc 660 agaaggcact tttcacttgc ttgtgtgttt tccccagtgt ctattagagg cctttgcaca 720 gggtaggctc tttggagcag ctgaaggtca cacatcccat gagcgggcag cagggtcaga 780 agtggcccGG gtgttgccta agcaagactc tcccctgccc tctgccctct gcacctccgg 840 cctgcatgtc. cctgtggcct cttgggggta catctcccgg ggctgggtca gaaggcctgg 900 gtggttggcc tcaggctgtc acacacctag ggagatgctc ccgtttctgg gaaccttggc 960 cccgactcct gcaaácttcg gtaaatgtgt aactcgaccc tgcaccggct cactctgttc 1020 agcagtgaaa ctctgcatcg atcactaaga cttcctggaa gaggtcccag cgtgagtgtc 1080 gcttctggca tctgtccttc tggccagcct gtggtctggc caagtgatgt aaccctcctc 1140 tccagcctgt gcacaggcag cctgggaaca gctccatccc cacccctcag ctataaatag 1200 ggcctcgtga cccggccagg ggaagaagct gccgLtgttc tgggtactac agcagaaggt 1260 aagccggggg ccccctca 1278< 210 > 1 < 211 > 1278 < 212 > DNA < 213 > Homo sapiens < 4 0 0 > 1 ccagacaagt gatttttgag gagtccctat ctataggaac aaagtaatta aaaaaatgta 60 tttcagaatt tacaggccca tgtgagatat gattttttta aatgaagatt tagagtaatg 120 ggtaaaaaag aggtatttgt gtgtttgttg attgttcagt cagtgaatgt acagcttctg 180 aggcaccatc tcttcctgct ctttgttgtt cctcatatcc aaatgttcca ttcctgggta 240 atttcatgtc tgccatcgtg gatatgccgt ggctccttga acctgcttgt gttgaagcag 300 gatcttcctt uctgtccctt cagtgcccta ataccatgta tttaaggctg gacacatcac 360 cactcccaac ctgcctcacc cactgcgtca cttgtgatca ctggcttctg gcgactctca 420 ccaaggtctc tgtcatgccc tgttataacg actacaaaag caagtcttac ctataggaaa 480 ataagaatta taaccctttt actggtcatg tgaaacttac catttgcaat ttgtacagca 540 71 taaacacaga acagcacatc tttcaatgcc tgcatcctga aggcattttg tttgtgtctt 600 tcaatctggc tgtgctattg ttggtgttta acagtctccc cagctacact ggaaacttcc 660 agaaggcact tttcacttgc ttgtgtgttt tccccagtgt ctattagagg cctttgcaca 720 gggtaggctc tttggagcag ctgaaggtca cacatcccat gagcgggcag cagggtcaga 780 agtggcccGG gtgttgccta agcaagactc tcccctgccc tctgccctct gcacctccgg 840 cctgcatgtc. cctgtggcct catctcccgg ggctgggtca gaaggcctgg cttgggggta 900 gtggttggcc tcaggctgtc acacacctag ggagatgctc ccgtttctgg gaaccttggc 960 cccgactcct gcaaácttcg gtaaatgtgt aactcgaccc tgcaccggct cactctgttc 1020 agcagtgaaa ctctgcatcg atcactaaga cttcctggaa gaggtcccag cgtgagtgtc 1080 gcttctggca tctgtccttc tggccagcct gtggtctggc caagtgatgt aaccctcctc 1140 tccagcctgt gcacaggcag cctgggaaca gctccatccc cacccctcag ctataaatag 1200 ggcctcgtga cccggccagg ggaagaagct gccgLtgttc tgggtactac agcagaaggt 1260 aagccggggg ccccctca 1278

<210> 2 <211> 1347 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2 gtccatctcc tcatctcctc ttctcataag gacacaggtc atattagatc agggctcacc 60 ctcatggcct cattttaact taatcatctc tttaaagatc ctgtctccaa ataatggtca 120 cattctaggt cctggggttt aggacttcaa cacgggcatt atggccgttg gggaggtagg 180 acataattca gctgatattg tgcattttgc acttggatca tgtagatatt ttccatggag 240 ctttgaatcc atttcttctt ttttttgtag acatgaatga tttattctgg gctaaatggt 300 gacaggaata ttgagacaac gaaagatctg gttagatggc acttaaaggt cagttaataa 360 ccacctttca ccctttgcaa aatgatattt caggtatgcg gaagcgagca ccccagtctg 420 agatggctcc tgccggtgtg agcctgaggg ccaccatcct ctgcctcctg gcctgggctg 480 gccõggctgc aggtgaccgg gtgtacatac accccttcca cctcgtcatc ca caatgaga 540 gtacctgtga gcagctggca aaggccaatg ccgggaagcc caaagacccc accttcatac 600 72 ctgctccaat tcaggccaag acatcccctg tggatgaaaa ggccctacag gaccagctgg 660 tgctagtcgc tgcaaaactt gacaccgaag acaagttgag ggccgcaatg gtcgggatgc 720 tggccaactt cttgggcttc cgtatatatg gcatgcacag tgagctatgg ggcgtggtcc 780 atggggccac cgtcctctcc ccaacggctg tctttggcac cctggcctct ctctatctgg 840 gagccttgga ccacacagct gacaggctac aggcaatcct gggtgttcct tggaaggaca 900 agaactgcac ctcccggctg gatgcgcaca aggtcctgtc tgccctgcag gctgtacagg 960 gcctgctagt ggcccagggc agggctgata gccaggccca gctgctgctg tccacggtgg 1020 tgggcgtgtt cacagcccca ggcctgcacc tgaagcagcc gtttgtgcag ggcctggctc 1080 tctatacccc tgtggtcctc ccacgctctc tggacttcac agaactggat gttgctgctg 1140 agaagattga caggttcatg caggctgtga caggatggaa gactggctgc tccctgatgg 1200 gagccagtgt ggacagcacc ctggctttca acacctacgt ccacttccaa ggtaaggcaa 1260 acctctctgc caggccttgg tggctctggc agatgggcag cctaggactt ggggcag agtatccatg tgtagctgag atcagccagt 1320 1347 <210> 3< 210 > 2 < 211 > 1347 < 212 > DNA < 213 > Homo sapiens < 400 > 2 gtccatctcc tcatctcctc ttctcataag gacacaggtc atattagatc agggctcacc 60 ctcatggcct cattttaact taatcatctc tttaaagatc ctgtctccaa ataatggtca 120 cattctaggt cctggggttt aggacttcaa cacgggcatt atggccgttg gggaggtagg 180 acataattca gctgatattg tgcattttgc acttggatca tgtagatatt ttccatggag 240 ctttgaatcc atttcttctt ttttttgtag acatgaatga tttattctgg gctaaatggt 300 gacaggaata ttgagacaac gaaagatctg gttagatggc acttaaaggt cagttaataa 360 ccacctttca ccctttgcaa aatgatattt caggtatgcg gaagcgagca ccccagtctg 420 agatggctcc tgccggtgtg agcctgaggg ccaccatcct ctgcctcctg gcctgggctg 480 gccõggctgc aggtgaccgg gtgtacatac accccttcca cctcgtcatc ca caatgaga 540 gtacctgtga gcagctggca aaggccaatg ccgggaagcc caaagacccc accttcatac 600 72 ctgctccaat tcaggccaag acatcccctg tggatgaaaa ggccctacag gaccagctgg 660 tgctagtcgc tgcaaaactt gacaccgaag acaagttgag ggccgcaatg gtcgggatgc 720 tggccaactt cttgggcttc cgtatatatg gcatgcacag tgagctatgg ggcgtggtcc 780 atggggccac cgtcctctcc ccaacggctg tctttggcac cctggcctct ctctatctgg 840 g agccttgga ccacacagct gacaggctac aggcaatcct gggtgttcct tggaaggaca 900 agaactgcac ctcccggctg gatgcgcaca aggtcctgtc tgccctgcag gctgtacagg 960 gcctgctagt ggcccagggc agggctgata gccaggccca gctgctgctg tccacggtgg 1020 tgggcgtgtt cacagcccca ggcctgcacc tgaagcagcc gtttgtgcag ggcctggctc 1080 tctatacccc tgtggtcctc ccacgctctc tggacttcac agaactggat gttgctgctg 1140 agaagattga caggttcatg caggctgtga caggatggaa gactggctgc tccctgatgg 1200 gagccagtgt ggacagcacc ctggctttca acacctacgt ccacttccaa ggtaaggcaa 1260 acctctctgc caggccttgg tggctctggc agatgggcag cctaggactt ggggcag agtatccatg tgtagctgag atcagccagt 1320 1347 < 210 > 3

<211> 377 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 cctgcccctg tcttgggtga ctcttccctc cctgtctcct gtctgatttc agggaagatg 60 aagggcttct ccctgctggc cgagccccag gagttctggg tggacaacag cacctcagtg 120 tctgttccca tgctctctgg catgggcacc ttccagcact ggagtgacat ccaggacaac 180 ttctcggtga ctgaagtgcc cttcactgag agcgcctgcc tgctgctgat ccagcctcac 240 tatgcctctg acctggacaa ggtggagggt ctcactttcc agcaaaactc cctcaactgg 300 atgaagaaac tgtctccccg gtagagccct cccggtctcc cctggaatgt gggagccaca 360 ctctcctgac ccaggct 73< 211 > 377 < 212 > DNA < 213 > Homo sapiens < 400 > 3 cctgcccctg tcttgggtga ctcttccctc cctgtctcct gtctgatttc agggaagatg 60 aagggcttct ccctgctggc cgagccccag gagttctggg tggacaacag cacctcagtg 120 tctgttccca tgctctctgg catgggcacc ttccagcact ggagtgacat ccaggacaac 180 ttctcggtga ctgaagtgcc cttcactgag agcgcctgcc tgctgctgat ccagcctcac 240 tatgcctctg acctggacaa ggtggagggt ctcactttcc agcaaaactc cctcaactgg 300 atgaagaaac tgtctccccg gtagagccct cccggtctcc cctggaatgt gggagccaca 360 ctctcctgac 73 ccaggct

<210> 4 <211> 273 <212> ADN <213> Homo sapiens <4Ο0> 4 cctctgggag agccctcact gtgtggcctg gagccttcct aactgtgcat catctcccca 60 ggaccatcca cctgaccatg ccccaactgg tgctgcaagg atcttatgac ctgcaggacc 120 tgctcgccca ggctgagctg cccgccattc tgcacaccga gctgaacctg caaaaattga 180 gcaatgaccg catcagggtg ggggaggtat ttaccttcct tgcctacctg gtccattgca 240 caggtgagca tgattaagga aaagagctat ggt 273< 210 > 4 < 211 > 273 < 212 > DNA < 213 > Homo sapiens < 4Ο0 > 4 cctctgggag agccctcact gtgtggcctg gagccttcct aactgtgcat catctcccca 60 ggaccatcca cctgaccatg ccccaactgg tgctgcaagg atcttatgac ctgcaggacc 120 tgctcgccca ggctgagctg cccgccattc tgcacaccga gctgaacctg caaaaattga 180 gcaatgaccg catcagggtg ggggaggtat ttaccttcct gtccattgca tgcctacctg 240 273 GGT caggtgagca tgattaagga aaagagctat

<210> 5 <211> 945 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 agcccaccgc cggccctcta gccctcacga ccctgggtca cccatgcgcc ctcagaatga 60 tcctgatcct gatgtctggt cctttgcagg tgctgaacag catttttttt gagcttgaag 120 cggatgagag agagcccaca gagtctaccc aacagcttaa caagcctgag gtcttggagg 160 tgaccctgaa ccgcccattc ctgtttgctg tgtatgatca aagcgccact gccctgcact 240 tcctgggccg cgtggccaac ccgctgagca cagcatgagg ccagggcccc agaacacagt 300 gcctggcaag gcctctgccc ctggcctttg aggcaaaggc cagcagcaga taacaacccc 360 ggacaaatca gcgatgtgtc acccccagtc tcccaccttt tcttctaatg agtcgacttt 420 gagctggaaa gcagccgttt ccccrtggtc taagtgtgct gcatggagtg agcagtagaa 480 gcctgcagcg gcacaaatgc acctcccagt ttgctgggtt tattttagag aatgggggtg 540 gggaggcaag aaccagtgtt tagcgcggga ctactgttcc aaaaagaatt ccaaccgacc 600 agettgtttg tgaaacaaaa aagtgttccc ttttcaagtt gagaacaaaa attgggtttt 660 aaaattaaag tatacatttt tgcattgcct tcggtttgta tttagtgtct tgaatgtaag 720 aacatgacct ccgtgtagtg tctgtaatac cttagttttt tccacagatg cttgtgattt 780 ttgaacaata cgtgaaagat gcaagcacct gaatttctgt ttgaatgcgg aacaatagct 840 ggttatttct cccttgtgtt agtaataaac gtcttgccac actaagcctc caaatttact 900 ctttattaga cgccaacaga tgtatacatt cagccagata gactg 945< 210 > 5 < 211 > 945 < 212 > DNA < 213 > Homo sapiens < 400 > 5 agcccaccgc cggccctcta gccctcacga ccctgggtca cccatgcgcc ctcagaatga 60 tcctgatcct gatgtctggt cctttgcagg tgctgaacag catttttttt gagcttgaag 120 cggatgagag agagcccaca gagtctaccc aacagcttaa caagcctgag gtcttggagg 160 tgaccctgaa ccgcccattc ctgtttgctg tgtatgatca aagcgccact gccctgcact 240 tcctgggccg cgtggccaac ccgctgagca cagcatgagg ccagggcccc agaacacagt 300 gcctggcaag gcctctgccc ctggcctttg aggcaaaggc cagcagcaga taacaacccc 360 ggacaaatca gcgatgtgtc acccccagtc tcccaccttt tcttctaatg agtcgacttt 420 gagctggaaa gcagccgttt ccccrtggtc taagtgtgct gcatggagtg agcagtagaa 480 gcctgcagcg gcacaaatgc acctcccagt ttgctgggtt tattttagag aatgggggtg 540 gggaggcaag aaccagtgtt tagcgcggga ctactgttcc aaaaagaatt ccaaccgacc 600 agettgtttg tgaaacaaaa aagtgttccc ttttcaagtt gagaacaaaa attgggtttt 660 aaaattaaag tatacatttt tgcattgcct tcggtttgta tttagtgtct tgaatgtaag 720 aacatgacct ccgtgtagtg tctgtaatac cttagttttt tccacagatg cttgtgattt 780 ttgaacaata cgtgaaagat gcaagcacct gaatttctgt ttgaatgcgg aacaatagct 840 ggtta tttct cccttgtgtt agtaataaac gtcttgccac actaagcctc caaatttact 900 ctttattaga cgccaacaga tgtatacatt cagccagata gactg 945

<210> 6 <211> 5590 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 6 cagcgttgta caaccatcac tactaatgtc agaacatttc actaccccta aaagaaaccc 60 cataccacag attccgatgc cgccgggagc cctgtcatgc catgtcacat atattatagt 120 atatatatgc ccagccatgg tcaacccacc gtgttctttg acatcaccat caacagcaag 180 cccttgggcc acgtctcctt caagctgttt gcagacaagt ttccaaagac ggcagaaaac 240 tttcctgctc tgagcactgg agagaaaggg tttggttata agagttcctg ctttcacaga 300 attattccag ggtttatgtg tcagggtggt gacttcacac accataatgg cactggtgtc 360 aagtccatct atggggagaa atttgatgat gagaacttca ttctgaagca tacaggtcct 420 ggcatctttt ccatggcaaa tgctggaccc aacacaaatg gttcccagtt ttgcaactgc 480 actgccaaga ctgcgtggtt ggatggcatg catgtggtcc ttggccaagt gaaagaaggc 540 atggatattg cggaggctat ggagcgcttt gggtccagga afcggcaagac cagcaagaag600 attaccattg ccgactgtgg acaactctac taagtttgac ttgtgtttta tcttaaccac 660 cagatcattc cttttgtagc tcaggagagc accctccacc tcatttgctc accgtagcct 720 ctaatctttg tgccatctct cagttccctt tgggttccat gtttgcctta ttctcctcca 780 tgcctagctg gatttcagag ttaagtttat 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gcagacaagt ttccaaagac ggcagaaaac 240 tttcctgctc tgagcactgg agagaaaggg tttggttata agagttcctg ctttcacaga 300 attattccag ggtttatgtg tcagggtggt gacttcacac accataatgg cactggtgtc 360 aagtccatct atggggagaa atttgatgat gagaacttca ttctgaagca tacaggtcct 420 ggcatctttt ccatggcaaa tgctggaccc aacacaaatg gttcccagtt ttgcaactgc 480 actgccaaga ctgcgtggtt ggatggcatg catgtggtcc ttggccaagt gaaagaaggc 540 atggatattg cggaggctat ggagcgcttt gggtccagga afcggcaagac cagcaagaag600 attaccattg ccgactgtgg acaactctac taagtttgac ttgtgtttta tcttaaccac 660 cagatcattc cttttgtagc tcaggagagc accctccacc tcatttgctc accgtagcct 720 ctaatctttg tgccatctct cagttccctt tgggttccat gtttgcctta ttctcctcca 780 tgcctagctg gatttcagag ttaagtttat gattatgaga taaaaactaa ataacaattg 840 caaaaaaata aaataaaa g aaagaagagg ctgggagcgg tggctcactc ctctaatccc 900 agcactttgg gaggccgagg tgggcctacc aaaggtcagg agatcgagac caccctggct - 960 aacacggtga aatcccatgt ctactaaaaa tacaaaaaaa attagccagg cgtcgtggcg 1020 tgcctgcggt cccagctact cggaaggctg aggcagagga 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<210> 7 <211> 4020 <212> ADN <213> Homo sapíens <400> 7 gccgagcacc gcgcaccgcg tcatgggggc cgcctcgggc cgcegggggc cggggctgct 60 gctgccgctg ccgctgctgt tgctgctgcc gccgcagccc gccctggcgt tggaccccgg 120 gctgcagcccggcaactttt ctgctgacga ggccggggcg cagctcttcg cgcagagcta 180 caactccagc gccgaacagg tgctgttcca gagcgtggcc gccagctggg cgcacgacac 240 caacatcacc gcggagaatg caaggcgcca ggaggaagca gccctgctca gccaggagtt 300 tgcggaggcc tggggccaga aggccaagga gctgtatgaa ccgatctggc agaacttcac 360 ggacccgcag ctgcgcagga tcatcggagc tgtgcgaacc ctgggctctg ccaacctgcc 420 cctggctaag cggcagcagt acaacgccct gctaagcaac atgagcagga tctactccac 480 cgccaaggtc tgcctcccca acaagactgc cacctgctgg tccctggacc cagatctcac 540 caacatcctg gcttcctcgc gaagctacgc catgctcctg tttgcctggg agggctggca 600 caacgctgcg ggcatcccgc tgaaaccgct gtacgaggat ttcactgccc tcagcaatga 660 agcctacaag caggacggct tcacagacac gggggcctac tggcgctcctggtacaactc 720 78 780 ccccaccttc gaggacgatc tggaacacct ctaccaacag ctagagcccc tctacctgaa cctccatgcc ttcgtccgcc gcgcactgca 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<210> 8 <211> 1856 <212> ADN <213> Homo sapiens <4Ο0> 8 gtgagagctc atgtgcaggc tgagtgagag gcgagggctg ggactggcat ggggcccggg 60 ggtgctgggt gagagcacag agttgggctc ccctcgctct tggggtcagc gtgcccagga 120 aatgcccttt cttgttttcc acgagggggg cttctctgcc cactgagagc cggcacctac 180 ttcataccat gccccgatca gctgcccctc cctcagaacc gccctctgct taagggtgtc 240 cactctctcc tgtcctctct gcatgccgcc. cctcagagcagcgggatctc aaagttatat 300 80 ttcatgggct tggactccaa atggggggaa ctcggggaca ctagctcccc ccggcctcct 360 ttcgtgaccc tgcccttgac ttcctcacct tctctgtctt tcctgagccc ctctcccagc 420 atgtgactga taaggaaatt gagtcacaca gcccctgaaa gcgccagact agaacctgag 480 cctctgattc ctctcacttc cctcccctac cctgccactt cctactggat agaagtagac 540 agctcttgac tgtcctcttt tctccccact ggctggtcct tcttagcccc agcccgtttg 600 aaagagctca cccccgacac aaggacccgc acacagatac ctcccagctc cctctcaacc 660 caccctttcc agggttggag aacttgaggc ataaacattc ttccatgagg aatctccacc 720 cagaaatggg tctttctggc ccccagccca gctcccacat tagaacaatg acaaatagaa 780 ggggaaatgg aaaataaaca ggagaaacgg ttttcccagg acagggtttg gcctacaagt 840 tgtggatgtg ggtacccatg ccaagtgtga ggggaggctg gccgggtgtg gtggctcatg 900 ctctaatccc agcactttgg gaggccaagg tgagtagatc acttgaggcc gggagtttga 960 gaccagcctg gccaácatgg tgaaacccca tctgtactaa aaatacaaaa gttagctggg 1020 cgtggtggta gatgcctgta gtcccagcta cttgggaggc tgaggcatga gaatcgcttg 1080 agcccagcca gggcaataca gcaagacccc gtctctacaa ataaaataca aaaaattagt 1140 tggatgtggt ggtgcatgcc tgtagtccta gctgctaggg aggctgagat ggaaggattg 1200 cttgagcctg ggaggtcaag gctgcagtga gccgagatgg cgccactgca ctccagcctg 1260 ggcaacagag tgagaccctg tctcagaaag aaaaaaaaaa aaaaaggaga ggagagagac 1320 tcaagcacgc ccctcacagg actgctgagg ccctgcaggt gtctgcagca tgtgcccagg 1380 ccggggactc tgtaagccac tgctggagac cactcccatc ctttctccca tttctctaga 1440 cctgctgcct atacagtcac tttttttttt tttttgagac ggagtctcgc tctgtcgccc 1500 aggctggagt gcagtggcgg gatctcggct cactgcaacg tccgcctccc gggttcacgc 1560 cattctcctg cctcagcctc ccaagtagct gggaccacag cgcccgccac tacgcccggc1620 taattttttg tatttttagt agagacgggg tttcaccgtt ttagccggga tggtctcgat 1680 ctcctgacct cgtgatccgc ccgcctcggc ctcccaaagt gctgggatta caggcgtgat 1740 acagtcactt ttatgtggtt tcgccaattt tattccagct ctgaaattct ctgagctccc 1800 cttacaagca gaggtgagct aagggctgga gctcaagcca ttcaaccccc taccag 1856< 210 > 8 < 211 > 1856 < 212 > DNA < 213 > Homo sapiens < 4Ο0 > 8 gtgagagctc atgtgcaggc tgagtgagag gcgagggctg ggactggcat ggggcccggg 60 ggtgctgggt gagagcacag agttgggctc ccctcgctct tggggtcagc gtgcccagga 120 aatgcccttt cttgttttcc acgagggggg cttctctgcc cactgagagc cggcacctac 180 ttcataccat gccccgatca gctgcccctc cctcagaacc gccctctgct taagggtgtc 240 cactctctcc tgtcctctct gcatgccgcc. cctcagagcagcgggatctc aaagttatat 300 80 ttcatgggct tggactccaa atggggggaa ctcggggaca ctagctcccc ccggcctcct 360 ttcgtgaccc tgcccttgac ttcctcacct tctctgtctt tcctgagccc ctctcccagc 420 atgtgactga taaggaaatt gagtcacaca gcccctgaaa gcgccagact agaacctgag 480 cctctgattc ctctcacttc cctcccctac cctgccactt cctactggat agaagtagac 540 agctcttgac tgtcctcttt tctccccact ggctggtcct tcttagcccc agcccgtttg 600 aaagagctca cccccgacac aaggacccgc acacagatac ctcccagctc cctctcaacc 660 caccctttcc agggttggag aacttgaggc ataaacattc ttccatgagg aatctccacc 720 cagaaatggg tctttctggc ccccagccca gctcccacat tagaacaatg acaaatagaa 780 ggggaaatgg aaaataaaca ggagaaacgg ttttcccagg acagggtttg gcctacaagt 840 tgtggatgtg ggtacccatg ccaagtgtga ggggaggctg gccgggtgtg gtggctcatg 900 ctctaatccc agcactttgg gaggccaagg tgagtagatc acttgaggcc gggagtttga 960 gaccagcctg gccaácatgg tgaaacccca tctgtactaa aaatacaaaa gttagctggg 1020 cgtggtggta gatgcctgta gtcccagcta cttgggaggc tgaggcatga gaatcgcttg 1080 agcccagcca gggcaataca gcaagacccc gtctctacaa ATAA aataca aaaaattagt 1140 tggatgtggt ggtgcatgcc tgtagtccta gctgctaggg aggctgagat ggaaggattg 1200 cttgagcctg ggaggtcaag gctgcagtga gccgagatgg cgccactgca ctccagcctg 1260 ggcaacagag tgagaccctg tctcagaaag aaaaaaaaaa aaaaaggaga ggagagagac 1320 tcaagcacgc ccctcacagg actgctgagg ccctgcaggt gtctgcagca tgtgcccagg 1380 ccggggactc tgtaagccac tgctggagac cactcccatc ctttctccca tttctctaga 1440 cctgctgcct atacagtcac tttttttttt tttttgagac ggagtctcgc tctgtcgccc 1500 aggctggagt gcagtggcgg gatctcggct cactgcaacg tccgcctccc gggttcacgc 1560 cattctcctg cctcagcctc ccaagtagct gggaccacag cgcccgccac tacgcccggc1620 taattttttg tatttttagt agagacgggg tttcaccgtt ttagccggga tggtctcgat 1680 ctcctgacct cgtgatccgc ccgcctcggc ctcccaaagt gctgggatta caggcgtgat 1740 acagtcactt ttatgtggtt tcgccaattt tattccagct ctgaaattct ctgagctccc 1800 cttacaagca gaggtgagct aagggctgga gctcaagcca ttcaaccccc 1856 taccag

<210> 9 <211> 2720 <212> ADN <213> Homo sapiens 81 <4 Ο Ο> 9 aagcttgctg gggttttgat agagattttç tttaacctgt agatcatttg aagattaatg 60 ccattgtaac gatattaaat ctttcaatcc aagaacatgg aatgtcattc catttattta 120 ggtctacctt atttcaacaa ttctttttgt ttgttttcag actacaagtt ttagatcctt 180 ttgttaaatt tatttcttag ggtttttttt gttttgtttt gttttgttgg ttggttggtt 240 tgttttgaga tggagtctca ctctgtcacc caggctggag tgcagtggca caatctcagc 300 * tcacagcaac ctctacctcc tggg-tcaag cgattattct gcctcagcct cctcctcctg 360 agtagctgga actacaggca tgcaccacca cgcctggcct tttttttttt tttttctttt 420 gcatttttag tagagacagg gtttcacgat gttggccagc ctggtctcga atccctgacc 480 ttgtgattca cceacctcgg cctcccaaag tgctgagatt acaggagtga gccactacac 540 eaggteattt cttgatattt ttactetttt gatctatagt aagtaaaatt gtttttatct 600 ttgaattttt aaatttttaa cacacjttcaa atcagtgtgt ctgatttcat ctccttctct 660 aacaaaccag ggtgccagaa ctgcttcagt ttctctgcct tctctttgtc tatgatgact 720 aatgtatgaa ggtatctgct gcatcaaact ttaaacttca cattatcctt atttctcttg 780 accttgacag atctggcatc 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cttgatattt ttactetttt gatctatagt aagtaaaatt gtttttatct 600 ttgaattttt aaatttttaa cacacjttcaa atcagtgtgt ctgatttcat ctccttctct 660 aacaaaccag ggtgccagaa ctgcttcagt ttctctgcct tctctttgtc tatgatgact 720 ggtatctgct gcatcaaact ttaaacttca aatgtatgaa cattatcctt atttctcttg 780 accttgacag atctggcatc ttttcacctg gtcgtaagca gaaagtcctt Cat. 840a ctttttgag gcatggcagc atgtgaggca gggagaggac acagacccac acagcaagtg 900 gtgagaagcc aacagtggaa ttgttttctt aattccattt gttgattgtt tattgctagt 960 gtatagaaat acaactgatt tttgtatatt gatettgtat tctaaaaact tgctcaactt 1020 gtttcttagt tctaatagtt aattaattga ttccttaggg ctttttaata caagatcatg 1080 tcatctacaa utagaaattg ttttactttc tttctaatct ggatgccatt tatctttttt 1140 tcttgtecaa ttgccctcac tagaaccttt agtac aaagt taaatagaaa tgggaagact 1200 agacattttg tcttgttcct gatcttagac ataaaaacgt tgtcttccgt tattatgtgt 1260 gatattagtt aagttaagtt tttcataaat aaacttcaca gtttgaggaa gttcctattc 1320 ctaatttgtt gagtgttagc atgaaaaagt gttgaatttt gtccaagagt ttttaaaaat 1380 ttttttaaac aatcatgtag qctttqtcca tttcttactt ctttaaattt attttatttg 1440 atacacaata gatgtacact ttttaggtac atgcaataat ttaatgcccc tcactataaa 1500 ttcggagctg cctcctcgcc gatgattcca gcgcctgaca gccaggaccc caggcagcag 1560 cgagtgacag gactttttag gtacatgcaa taatttaatg cattcatata aagatcaaat 1620 cagtgcaatt ggcatatcca tcaccttaaa tatttgtctt tttcttcatg ctagaaacat 1680 tcaagttatt ttctcctagc tactctgaaa tatacaatag attactgtaa actacagtca 1740 ccctactcac ctatctaaca ttaattgatt tttggtaaac taatctaatc ttgctttctg 1800 gcatcaacct cacttgacca tggtgtatag tccctttcat atgttattgg attcaatttg 1860 cctacatttt gttgagaatt tttatctata ctcttaagaa atattgatct gtagtctcgt 1920 82 gatgtcttta tctggttttg ttatcagggt gatactggcc tcatagcatg agttgggaga 1980 tcatccttac tcttctattt tttggaagag tttgtgaaga attgatatta tttcttcttt 2040 aaatatttat tgggttttta aaatacattt ttaaaatgca acttgggtag catgtccaat 2100 aggaacaaat gagtgtccac ccttgaattt cataaccctc ggaattaatc catgtaatct 2160 atgatccaca actgtattac caaagttcga gttactcata ggaaagagaa agaagttctc 2220 taattcgtcc ttaaaagttt tccaagttca gaaaaaaaaa atgttgaaga acacgaactc 2280 ccgcaggaaa tgatactcct gtacccccag ctcgctctcc ctcacgaccc ctcgctaggc 2340 ggggttcggg accaggtgaa cgctgatctg atagttgaca cgggacgact gtggcatcat 2400 ccttgctgcc gtcaatatec cgagagggag gaggttgggc cgggagggtc tccggggcgg 2460 ggcggaggag gagggaatgc aaaacagagc ctcgtccccg the gaacccaaga gcagcaacg 2520 cccctcacta taaattcgga gctgcctcct cgccaatgat tccagcgcct gacagccagg 2580 accccaggca gcagegagtg acaggacgtc tggaccggcg cgccgctagc agctctgccg 2640 ggccgcggcg gtgatcgatg gggagcggct ggagcggacc cagcgagtga gggcgcacag 2700 ccgggacgcc gaggcggcgg 2720

<210> 10 <211> 480 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 10 gaattctcag agctggcgaa acagtctggt ccaagcagcc tctcagcagt gcctttcagc 60 ctcccctctc tgagtctttc caccccttgc tggtacttta gfcttcttcca cttctagcac 120 cacgtgtagt ttcccaattt ctcttaccca aatttgctca cagggaaaaa aataaattaa 180 attagccatt tacaccacag tgtgaactta ataacaccaa caaaagttcc aaagctctag 240 ggtctcatag cacctccaga tccatgatct cattcggtgt ttccaacaat gttttgcacc 300 aaactggaca catgcttgct acttcatcat cctcatcgtg aacattatta ttattatcat 360 cattttccag atgaagaaaa tgaatcacaa gtcaactgac agtccaaagg ctccacagct 420 cagaggaggt aaatcatgtg cttaattcag aacttttggc tcccatcact atgctcttcc 480 83 <210> 11 <211> 2685< 210 > 10 < 211 > 480 < 212 > DNA < 213 > Homo sapiens < 400 > 10 gaattctcag agctggcgaa acagtctggt ccaagcagcc tctcagcagt gcctttcagc 60 ctcccctctc tgagtctttc caccccttgc tggtacttta gfcttcttcca cttctagcac 120 cacgtgtagt ttcccaattt ctcttaccca aatttgctca cagggaaaaa aataaattaa 180 attagccatt tacaccacag tgtgaactta ataacaccaa caaaagttcc aaagctctag 240 ggtctcatag cacctccaga tccatgatct cattcggtgt ttccaacaat gttttgcacc 300 catgcttgct acttcatcat cctcatcgtg aaactggaca aacattatta ttattatcat 360 cattttccag atgaagaaaa tgaatcacaa gtcaactgac agtccaaagg ctccacagct 420 cagaggaggt aaatcatgtg cttaattcag aacttttggc tcccatcact atgctcttcc 480 83 < 210 > 11 < 211 > 2685

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 11 accccaggca gcagcgagtg acaggacgtc tggaccggcg cgccgctagc agctctgccg 60 ggccgcggcg gtgatcgatg gggagcggct ggagcggacc cagcgagtga gggcgcacag 120 ccgggacgcc gaggcggcgg gcgggagacc cgcaccagcg cagccggccc tcggcgggac 180 gtgacgcagc gcccggggcg cgggtttgat atttgacaaa ttgatctaaa atggctgggt 240 ttttatctga ataactcact gatgccatcc cagaaagtcg gcaccaggtg tatttgatat 3ÒÕ agtgtttgca acaaattega cccaggtgat caaaatgatt ctcaactctt ctactgaaga 360 tggtattaaa agaatccaag atgattgtcc caaagctgga aggcataatt acatatttgt 420 catgattcct actttataca gtatcatctt tgtggtggga atatttggaa acagcttggt 480 ggtgatagtc atttactttt atatgaagct gaagactgtg gccagtgttt ttcttttgaa 540 tttagcactg gctgacttat gctttttact gactttgcca ctatgggctg tctacacagc 600 tatggaatac cgctggccct ttggçaatta cctatgtaag attgcttcag ccagcgtcag 660 tttcaacctg tacgctagtg tgtttctact cacgtgtctc agcattgatc gatacctggc 720 tattgttcac ccaatgaagt cccgccttcg acgcacaatg cttgtagcca aagtcacctg 780 catcatcatt tggctgctgg caggcttggc cagtttgcca gctataatcc atcgaaatgt 840 atttttcatt gagaacacca atattacagt ttgtgctttc cattatgagt cccaaaattc 900 aacccttccg atagggctgg gcctgaccaa aaatatactg ggtttcctgt ttccttttct 960 gatcattctt acaagttata ctcttatttg gaaggcccta aagaaggctt atgaaattca 1020 gaagaacaaa ccaagaaatg atgatatttt taagataatt atggcaattg tgcttttctt 1080 tttcttttcc tggattcccc accaaatatt cacttttctg gatgtattga ttcaactagg 1140 catcatacgt gactgtagaa ttgcagatat tgtggacacg gccatgccta tcaccatttg 1200 tatagcttat tttaacaatt gcctgaatcc tcttttttat ggctttctgg ggaaaaaatt 1260 taaaagatat tttctccagc ttctaaaata tattccccca aaagccaaat cccactcaaa 1320 cctttcaaca aaaatgagca cgctttccta ccgcccctca gataatgtaa gctcatccac 1380 caagaagcct gcaccatgtt ttgaggttga gtgacatgtt cgaaacctgt ccataaagta 1440 attttgtgaa agaaggagca agagaacatt cctctgcagc acttcactac caaatgagca 1500 ttagctactt ttcagaattg aaggagaaaa tgcattatgt ggactgaacc gacttttcta 1560 aagctctgaa caaaagcttt tctttccttt tgcaacaaga caaagcaaag ccacattttg 1620 cattagacag atgacggctg ctcgaagaac aatgtcagaa actcgatgaa tgtgttgatt tgagaaattt tactgacaga aatgcaatct ccctagcctg cttttgtcct gttatttttt atttccacat aaaggtattt agaatatatt aaatcgttag aggagcaaca ggagatgaga gttccagatt gttctgtcca gtttccaaag ggcagtaaag ttttcgtgcc ggttttcagc tattagcaac tgtgçtacac ttgcacctgg tactgcacat tttgtacaaa gatatgctaa gcagtagtcg tcaagttgca gatctttttg tgaaattcaa cctgtgtctt ataggtttac actgccaaaa caatgcccgt aagatggctt atttgtataa tggtgttact aaagtcacat ataaaagtta aactacttgt aaaggtgctg cactggtccc aagtagtagt gtcctcctag tatattagtt tgatttaata tctgagaagt gtatatagtt tgtggtaaaaagattatata tcataaagta tgccttcctg tttaaaaaaa gtatatattc tacacatata tatatatgta tatctatatc tctaaactgc tgttaattga ttaaaatctg gcaaagtt< 212 > DNA < 213 > Homo sapiens < 400 > 11 accccaggca gcagcgagtg acaggacgtc tggaccggcg cgccgctagc agctctgccg 60 ggccgcggcg gtgatcgatg gggagcggct ggagcggacc cagcgagtga gggcgcacag 120 ccgggacgcc gaggcggcgg gcgggagacc cgcaccagcg cagccggccc tcggcgggac 180 gtgacgcagc gcccggggcg cgggtttgat atttgacaaa ttgatctaaa atggctgggt 240 ttttatctga ataactcact gatgccatcc cagaaagtcg gcaccaggtg tatttgatat 3oo agtgtttgca acaaattega cccaggtgat caaaatgatt ctcaactctt ctactgaaga 360 tggtattaaa agaatccaag atgattgtcc caaagctgga aggcataatt acatatttgt 420 catgattcct actttataca gtatcatctt tgtggtggga atatttggaa acagcttggt 480 ggtgatagtc atttactttt atatgaagct gaagactgtg gccagtgttt ttcttttgaa 540 tttagcactg gctgacttat gctttttact gactttgcca ctatgggctg tctacacagc 600 tatggaatac cgctggccct ttggçaatta cctatgtaag attgcttcag ccagcgtcag 660 tttcaacctg tacgctagtg tgtttctact cacgtgtctc agcattgatc gatacctggc 720 tattgttcac ccaatgaagt cccgccttcg acgcacaatg cttgtagcca aagtcacctg 780 catcatcatt tggctgctgg caggcttggc cagtttgcca gctataatcc atcgaaatgt 840 atttttcatt gaga acacca atattacagt ttgtgctttc cattatgagt cccaaaattc 900 aacccttccg atagggctgg gcctgaccaa aaatatactg ggtttcctgt ttccttttct 960 gatcattctt acaagttata ctcttatttg gaaggcccta aagaaggctt atgaaattca 1020 gaagaacaaa ccaagaaatg atgatatttt taagataatt atggcaattg tgcttttctt 1080 tttcttttcc tggattcccc accaaatatt cacttttctg gatgtattga ttcaactagg 1140 catcatacgt gactgtagaa ttgcagatat tgtggacacg gccatgccta tcaccatttg 1200 tatagcttat tttaacaatt gcctgaatcc tcttttttat ggctttctgg ggaaaaaatt 1260 taaaagatat tttctccagc ttctaaaata tattccccca aaagccaaat cccactcaaa 1320 cctttcaaca aaaatgagca cgctttccta ccgcccctca gataatgtaa gctcatccac 1380 caagaagcct gcaccatgtt ttgaggttga gtgacatgtt cgaaacctgt ccataaagta 1440 attttgtgaa agaaggagca agagaacatt cctctgcagc acttcactac caaatgagca 1500 ttagctactt ttcagaattg aaggagaaaa tgcattatgt ggactgaacc gacttttcta 1560 aagctctgaa caaaagcttt tctttccttt tgcaacaaga caaagcaaag ccacattttg 1620 cattagacag atgacggctg ctcgaagaac aatgtcagaa actcgatgaa tgtgttgatt tgagaaattt tactgacaga aatgca ATCT ccctagcctg cttttgtcct gttatttttt atttccacat aaaggtattt agaatatatt aaatcgttag aggagcaaca ggagatgaga gttccagatt gttctgtcca gtttccaaag ggcagtaaag ttttcgtgcc ggttttcagc tattagcaac tgtgçtacac ttgcacctgg tactgcacat tttgtacaaa gatatgctaa gcagtagtcg tcaagttgca gatctttttg tgaaattcaa cctgtgtctt ataggtttac actgccaaaa caatgcccgt aagatggctt atttgtataa tggtgttact aaagtcacat ataaaagtta aactacttgt aaaggtgctg cactggtccc aagtagtagt gtcctcctag tatattagtt tgatttaata tctgagaagt gtatatagtt tgtggtaaaaagattatata tcataaagta tgccttcctg tttaaaaaaa gtatatattc tacacatata tatatatgta tatctatatc tctaaactgc tgttaattga ttaaaatctg gcaaagtt

Lisboa, 9 de Novembro de 2006 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2268 85Lisbon, November 9, 2006 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2268 85

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES 1. Método para avaliação da capacidade de resposta a um regime de tratamento cardiovascular num indivíduo humano, em que o método compreende a comparação de um padrão polimórfico, estabelecido numa ou mais posições polimórficas, dentro de um ou mais dos genes da ACE, AGT ou ATI, do referido indivíduo, com um padrão polimórfico das mesmas posições polimórficas, de humanos que têm uma resposta conhecida ao regime de tratamento cardiovascular, em que são comparadas a identidade ou a semelhança dos respectivos padrões polimórficos, para determinar se o referido indivíduo apresenta ou não , um padrão polimórfico correlacionado com a capacidade de resposta ao referido regime de tratamento.A method for evaluating the responsiveness to a cardiovascular treatment regimen in a human subject, wherein the method comprises comparing a polymorphic pattern established at one or more polymorphic positions within one or more of the ACE, AGT or ATI of said subject with a polymorphic pattern of the same polymorphic positions of humans having a known response to the cardiovascular treatment regimen in which the identity or similarity of the respective polymorphic patterns is compared to determine if said individual exhibits or not, a polymorphic pattern correlated with the ability to respond to said treatment regimen. 2. Método, como definido na reivindicação 1, em que o referido regime de tratamento é uma alteração da dieta, do estilo de vida e/ou do exercício; uma técnica cirúrgica invasiva ou não-invasiva; ou uma intervenção farmacêutica.A method as defined in claim 1, wherein said treatment regimen is a change in diet, lifestyle and / or exercise; an invasive or non-invasive surgical technique; or a pharmaceutical intervention. 3. Método, como definido na reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o referido regime de tratamento diz respeito ao enfarte do miocárdio, hipertensão, aterosclerose ou acidente vascular cerebral.A method as defined in claim 1 or claim 2, wherein said treatment regimen relates to myocardial infarction, hypertension, atherosclerosis or stroke. 4. Método, como definido na reivindicação 1, em que o referido regime de tratamento é uma intervenção farmacêutica.A method as defined in claim 1, wherein said treatment regimen is a pharmaceutical intervention. 5. Método, como definido na reivindicação 4, em que o referido regime de tratamento compreende a administração de um fármaco cardiovascular, seleccionado do grupo consistindo de inibidores da ACE, antagonistas do receptor da 1 diuréticos, angiotensina II, diuréticos, antagonistas do alfa-adrenorreceptor, glicósidos cardíacos, inibidores da fosfodiésterase, antagonistas do beta-adrenorreceptor, bloqueadores do canal de cálcio, inibidores da redutase de HMG-CoA, bloqueadores do receptor da imidizolina, bloqueadores do receptor da endotelina e nitritos orgânicos.A method as defined in claim 4, wherein said treatment regimen comprises administering a cardiovascular drug selected from the group consisting of ACE inhibitors, diuretic receptor antagonists, angiotensin II, diuretics, alpha- adrenoreceptor, cardiac glycosides, phosphodiesterase inhibitors, beta-adrenoceptor antagonists, calcium channel blockers, HMG-CoA reductase inhibitors, imidizoline receptor blockers, endothelin receptor blockers and organic nitrites. 6. Método, como definido na reivindicação 5, em que as referidas posições polimórficas compreendem ACE 2193, como numerada no N° de acesso J04144 do GenBank, AGT 1072, como numerada no N° de acesso X15323 do GenBank e ATI 1167, como numerada, quando a sequência codificante da proteína com o N° de acesso S80239 do GenBank foi processada para a posição 288 do N° de acesso S77410 do GenBank.A method as defined in claim 5, wherein said polymorphic positions comprise ACE 2193, as numbered in GenBank Accession No. J04144, AGT 1072, as numbered in GenBank Accession No. X15323 and ATI 1167, as numbered , when the coding sequence of the protein with GenBank Accession No. S80239 was processed to position 288 of GenBank Accession No. S77410. 7. Método, como definido na reivindicação 6, em que o referido padrão polimórfico compreende ACE 2193 A/G, AGT 1072 G/A e ATI 1167 A/G.A method as defined in claim 6, wherein said polymorphic pattern comprises ACE 2193 A / G, AGT 1072 G / A and ATI 1167 A / G. 8. Método, como definido na reivindicação 1, em que o referido regime de tratamento consiste na administração de um inibidor da ACE, em que o método compreende a comparação do padrão polimórfico estabelecido pela determinação da sequência (a) do gene da ACE na posição 2193 da região codificante, como numerada no N° de acesso J04144 do GenBank; (b) do gene do AGT na posição 1072 da região reguladora, como numerada no N° de acesso X15323do GenBank; e (c) do gene do ATI na posição 1167 da região codificante, como numerada, quando a sequência codificante de proteína com o N° de acesso S80239 do GenBank foi processada para a posição 288 do N° de acesso S77410 do GenBank, com os 2 mesmos padrões polimórficos de humanos que apresentam respostas diferentes ao referido inibidor da ACE.A method as defined in claim 1, wherein said treatment regimen consists in administering an ACE inhibitor, wherein the method comprises comparing the polymorphic pattern established by determining the sequence (a) of the ACE gene at the position 2193 of the coding region, as numbered in GenBank Accession No. J04144; (b) of the AGT gene at position 1072 of the regulatory region, as numbered in GenBank Accession No. X15323; and (c) the ATI gene at position 1167 of the coding region, as numbered, when the GenBank Accession No. S80239 protein coding sequence was processed to GenBank Accession No. 288, with the 2 same polymorphic patterns of humans that present different responses to said ACE inhibitor. 9. Método, como definido na reivindicação 8, em que o referido padrão polimórfico compreende ACE 2193 A/G, AGT 1072 G/A, ATI 1167 A/G.A method as defined in claim 8, wherein said polymorphic pattern comprises ACE 2193 A / G, AGT 1072 G / A, ATI 1167 A / G. 10. Método, como definido na reivindicação 1, em que a referida posição polimórfica é seleccionada do grupo consistindo das posições da região reguladora da ACE numeradas como 5106, 5349 e 5496, como numeradas no N° de acesso X94359 do GenBank; nas posições da região codificante da ACE, numeradas como 375, 582, 731, 1060, 1215, 2193, 2328, 2741, 3132, 3387, 3503 e 3906, como numeradas no N° de acesso J04144do GenBank; posição 1451 do gene da ACE, como numerada no N° de acesso X62855do GenBank; as posições na região reguladora do AGT, numeradas como 395, 412, 432, 449, 692, 839, 1007, 1072, 1204 e 1218, como numeradas no N° de acesso X15323 do GenBank; as posições da região codificante do AGT, numeradas como 273, 620, 912, 997, 1116 e 1174, como numeradas quando as sequências codificantes de proteína com os N°s de acesso M24686, M24687, M24688, M24689 do GenBank são processadas em conjunto; a posição 49 do gene AGT, como numerada no N° de acesso M24688 do GenBank; as posições da região reguladora do ATI, numeradas como 1427, 1756, 1853, 2046, 2354, 2355 e 2415, como numeradas no N° de acesso U07144 do GenBank; as posições da região codificante do ATI, numeradas como 449, 678, 1167 e 1271, como numeradas quando a sequência codificante de proteína com o N° de acesso S80239 do GenBank foi processada para a posição 288 do N° de acesso S77410 do GenBank; e combinações de qualquer das anteriores. 3A method as defined in claim 1, wherein said polymorphic position is selected from the group consisting of the positions of the ACE regulatory region numbered 5106, 5349 and 5496, as numbered in GenBank Accession No. X94359; at the positions of the coding region of ACE, numbered as 375, 582, 731, 1060, 1215, 2193, 2328, 2741, 3132, 3387, 3503 and 3906, as numbered in GenBank Accession No. J04144; position 1451 of the ACE gene, as numbered in GenBank Accession No. X62855; the positions in the AGT regulatory region, numbered as 395, 412, 432, 449, 692, 839, 1007, 1072, 1204 and 1218, as numbered in GenBank Accession No. X15323; the positions of the AGT coding region, numbered as 273, 620, 912, 997, 1116 and 1174, as numbered when the protein coding sequences with the GenBank accession numbers M24686, M24687, M24688, M24689 are processed together ; position 49 of the AGT gene, as numbered in GenBank Accession No. M24688; the positions of the regulatory region of the ATI, numbered as 1427, 1756, 1853, 2046, 2354, 2355 and 2415, as numbered in GenBank Accession No. U07144; the positions of the ITA coding region, numbered as 449, 678, 1167 and 1271, as numbered when the GenBank Accession No. S80239 protein coding sequence was processed to GenBank Accession No. 288, position 288; and combinations of any of the foregoing. 3 11. Método, como definido na reivindicação 10, em que os referidos padrões polimórficos são seleccionados do grupo consistindo de: ACE 5349 A/T, AGT 1218 A; ACE 5496 C, AGT 1204 A/C; ACE 5496 C/T, AGT 1218 A, AGT 620 C/T; ACE 2193 A, AGT 1204 C, ACE 2328 G; ACE 2193 A, AGT 1204 A/C; ACE 3387 T, AGT 1218 A; ACE 3387 T, AGT 620 C/T; AGT 1204 A/C, ATI 678 C/T; AGT 1204 A/C, ATI 1271 A/C; ACE 1215 C, AGT 1204 A/C; AGT 1204 A/C, ATI 1167 A, ACE 3906 A/G; AGT 1204 A, AGT 620 C, ATI 1271 A, ATI 1167 A, AGT 395 A/T; AGT 1204 A/C, AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A, AGT 395 T; AGT 1204 A/C, AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A/G, AGT 395 T; AGT 1204 A, ATI 678 C, ATI 1167 A, AGT 395 A/T; AGT 1204 A/C, ATI 678 C/T, ATI 1167 A, AGT 395 T; AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A, AGT 395 T; AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A/G, AGT 395 T; AGT 620 C, ATI 1271 A, ATI 1167 A; AGT 395 A/T; AGT 620 C, ATI 678 A, ATI 1167 A, AGT 395 A/T; AGT 620 C/T, ATI 678 C/T; ATI 1167 A, AGT 395 T; ACE 2193 A, AGT 1218 A, ACE 2193 A, AGT 620 C/T; ACE 2328 G, AGT 620 C/T; ACE 3387 T, AGT 1204 A/C; ACE 2193 A, ACE 2328 G, AGT 1204 C; e ACE 2193 A/G, AGT 1072 G/A, ATI 1167 A/G.A method as defined in claim 10, wherein said polymorphic patterns are selected from the group consisting of: ACE 5349 A / T, AGT 1218 A; ACE 5496 C, AGT 1204 A / C; ACE 5496 C / T, AGT 1218 A, AGT 620 C / T; ACE 2193 A, AGT 1204 C, ACE 2328 G; ACE 2193 A, AGT 1204 A / C; ACE 3387 T, AGT 1218 A; ACE 3387 T, AGT 620 C / T; AGT 1204 A / C, ATI 678 C / T; AGT 1204 A / C, ATI 1271 A / C; ACE 1215 C, AGT 1204 A / C; AGT 1204 A / C, ATI 1167 A, ACE 3906 A / G; AGT 1204 A, AGT 620 C, ATI 1271 A, ATI 1167 A, AGT 395 A / T; AGT 1204 A / C, AGT 620 C / T, ATI 1271 A / C, ATI 1167 A, AGT 395 T; AGT 1204 A / C, AGT 620 C / T, ATI 1271 A / C, ATI 1167 A / G, AGT 395 T; AGT 1204 A, ATI 678 C, ATI 1167 A, AGT 395 A / T; AGT 1204 A / C, ATI 678 C / T, ATI 1167 A, AGT 395 T; AGT 620 C / T, ATI 1271 A / C, ATI 1167 A, AGT 395 T; AGT 620 C / T, ATI 1271 A / C, ATI 1167 A / G, AGT 395 T; AGT 620 C, ATI 1271 A, ATI 1167 A; AGT 395 A / T; AGT 620 C, ATI 678 A, ATI 1167 A, AGT 395 A / T; AGT 620 C / T, ATI 678 C / T; ATI 1167 A, AGT 395 T; ACE 2193 A, AGT 1218 A, ACE 2193 A, AGT 620 C / T; ACE 2328 G, AGT 620 C / T; ACE 3387 T, AGT 1204 A / C; ACE 2193 A, ACE 2328 G, AGT 1204 C; and ACE 2193 A / G, AGT 1072 G / A, ATI 1167 A / G. 12. Ácido nucleico isolado correspondendo, homologamente ou complementarmente ao gene humano codificando a enzima conversora da angiotensina (ACE), em que o referido ácido nucleico compreende uma posição polimórfica e, em que a sequência na referida posição polimórfica encontra-se na região reguladora e é 5106T, como numerada no N° de acesso X94359 do GenBank; e/ou a sequência na referida posição polimórfica encontra-se na região codificante e é seleccionada do grupo consistindo de 375C, 582T, 731G, 1060A, 2741T, 3132T, 3387C, 3503G e 3906A, como numeradas 4 no N° de acesso J04144 do GenBank; e combinações de qualquer das anteriores.An isolated nucleic acid corresponding, homologously or in addition to the human gene encoding the angiotensin converting enzyme (ACE), wherein said nucleic acid comprises a polymorphic position and wherein the sequence in said polymorphic position is in the regulatory region and is 5106T, as numbered in GenBank Accession No. X94359; and / or the sequence at said polymorphic position is in the coding region and is selected from the group consisting of 375C, 582T, 731G, 1060A, 2741T, 3132T, 3387C, 3503G and 3906A, as numbered 4 in accession no. J04144 of the GenBank; and combinations of any of the foregoing. 13. Sonda com 10 a 100 Pares de bases de comprimento, as quais hibridam, sob condições de restringência elevada, com uma posição polimórfica ou com uma sequência imediatamente adjacente a uma posição polimórfica, como definida na reivindicação 12.A probe having 10 to 100 base pairs in length, which hybridizes under high stringency conditions to a polymorphic position or to a sequence immediately adjacent to a polymorphic position as defined in claim 12. 14. Ácido nucleico isoladamente, correspondendo homologamente ou complementarmente ao gene humano codificando o angiotensinogénio (AGT), em que o referido ácido nucleico compreende uma posição polimórfica e em que a referida sequência da posição polimórfica se encontra na região reguladora e é seleccionada do grupo de 412T e 1072A, como numeradas no N° de acesso X15323 do GenBank; e/ou a referida sequência da posição polimórfica encontra-se na região codificante e é seleccionada do grupo consistindo de 273T e 997C, como numeradas quando as sequências codificantes de proteínas com os N°s de acesso M24686, M24687, M24688, M24689 do GenBank são processadas em conjunto e G na posição 49 do N° de acesso M24688 do GenBank; e combinações de qualquer das anteriores.A nucleic acid alone, correspondingly or complementarily to the human gene encoding angiotensinogen (AGT), wherein said nucleic acid comprises a polymorphic position and wherein said polymorphic position sequence is in the regulatory region and is selected from the group of 412T and 1072A, as numbered in GenBank Accession No. X15323; and / or said polymorphic position sequence is in the coding region and is selected from the group consisting of 273T and 997C, as numbered when the protein coding sequences with GenBank accession numbers M24686, M24687, M24688, M24689 are processed together and G at position 49 of GenBank Accession No. M24688; and combinations of any of the foregoing. 15. Sonda com 10 a 100 pares de bases de comprimento, a qual híbrida, sob condições de restringência elevada, com uma posição polimórfica ou com uma sequência imediatamente adjacente a uma posição polimórfica, como definido na reivindicação 14.A probe of 10 to 100 base pairs in length which hybridizes under high stringency conditions to a polymorphic position or to a sequence immediately adjacent to a polymorphic position as defined in claim 14. 16. Ácido nucleico isolado, correspondendo homologamente ou complementarmente ao gene humano codificante do receptor da 5 angiotensina II de tipo I (ATI), em que o referido ácido nucleico compreende uma posição polimórfica em que a sequência na referida posição polimórfica se encontra na região reguladora e é seleccionada do grupo consistindo de 1427T, 1756A, 1853G, 2046C, 2354C, 2355C e 2415G, como numeradas no N° de acesso U07144 do GenBank; e/ou a sequência na referida posição polimórfica se encontra na região codificante/intrão e é 449C, como numerada quando a sequência codificante de proteína com o N° de acesso S80239 do GenBank foi processada para a posição 288 do N° de acesso S77410 do GenBank.An isolated nucleic acid corresponding to or complementarily to the human gene encoding the type I angiotensin II receptor (ITA), wherein said nucleic acid comprises a polymorphic position in which the sequence in said polymorphic position is in the regulatory region and is selected from the group consisting of 1427T, 1756A, 1853G, 2046C, 2354C, 2355C and 2415G, as numbered in GenBank Accession No. U07144; and / or the sequence at said polymorphic position is in the coding / intron region and is 449C, as numbered when the protein coding sequence with GenBank Accession No. S80239 has been processed to position 288 of Accession No. S77410 of GenBank. 17. Sonda com 10 a 100 pares de bases de comprimento, a qual híbrida, sob condições de restringência elevada, com uma posição polimórfica ou com uma sequência imediatamente adjacente a uma posição polimórfica, como definido na reivindicação 16.A probe of 10 to 100 base pairs in length which hybridizes under high stringency conditions to a polymorphic position or to a sequence immediately adjacent to a polymorphic position as defined in claim 16. 18. Biblioteca de ácidos nucleicos, compreendendo, cada um dos quais, uma ou mais posições polimórficas dentro do gene da ACE humana, em que a sequência na referida posição polimórfica se encontra na região reguladora e é seleccionada do grupo consistindo de 5106T, 5349T e 5496C, como numeradas no N° de acesso X94359 do GenBank; e/ou a sequência na referida posição polimórfica se encontra na região codificante e é seleccionada do grupo consistindo de 375C, 582T, 731G, 1060A, 1215T, 2193A, 2328G, 2741T, 3132T, 3387C, 3503G e 3906A, como numeradas no N° de acesso J04144 do GenBank e uma eliminação dos nucleótidos 1451-1783, como numerados no N° de acesso X62855 do GenBank. 6A nucleic acid library, each comprising one or more polymorphic positions within the human ACE gene, wherein the sequence at said polymorphic position is in the regulatory region and is selected from the group consisting of 5106T, 5349T and 5496C, as numbered in GenBank Accession No. X94359; and / or the sequence at said polymorphic position is in the coding region and is selected from the group consisting of 375C, 582T, 731G, 1060A, 1215T, 2193A, 2328G, 2741T, 3132T, 3387C, 3503G and 3906A, as numbered in the of GenBank accession J04144 and a deletion of nucleotides 1451-1783, as numbered in GenBank Accession No. X62855. 6 19. Biblioteca de ácidos nucleicos, compreendendo, cada um dos quais, uma ou mais posições polimórficas dentro do gene do AGT humano, em que a sequência na referida posição polimórfica se encontra na região reguladora e é seleccionada do grupo consistindo de 395A, 412T, 432A, 449T, 692T, 839A, 1007A, 1072A, 1204A, 1218G, como numeradas no N° de acesso X15323 do GenBank; e/ou a sequência na referida posição polimórfica se encontra na região codificante e é seleccionada do grupo consistindo de 273T, 620T, 912T, 997C, 1116A, 1174A, como numeradas quando as sequências codificantes de proteínas com os N°s de acesso M24686, M24687, M24688, M24689 do GenBank são processadas em conjunto e G na posição 49 do N° de acesso M24688 do GenBank.A nucleic acid library, each comprising one or more polymorphic positions within the human AGT gene, wherein the sequence at said polymorphic position is in the regulatory region and is selected from the group consisting of 395A, 412T, 432A, 449T, 692T, 839A, 1007A, 1072A, 1204A, 1218G, as numbered in GenBank Accession No. X15323; and / or the sequence at said polymorphic position is in the coding region and is selected from the group consisting of 273T, 620T, 912T, 997C, 1116A, 1174A, as numbered when the protein coding sequences with accession Nos. M24686, M24687, M24688, M24689 of GenBank are processed together and G at position 49 of GenBank Accession No. M24688. 20. Biblioteca de ácidos nucleicos, compreendendo, cada um dos quais, uma ou mais posições polimórficas dentro do gene do ATI humano, em que a sequência na referida posição polimórfica se encontra na região reguladora e é seleccionada do grupo consistindo de 1427T, 1756A, 1853G, 2046C, 2354C, 2355C e 2415G, como numeradas no N° de acesso U07144 do GenBank; e/ou a sequência na referida posição polimórfica se encontra na região codificante e é seleccionada do grupo consistindo de 449C, 678C, 1167G e 1271C, como numeradas quando a sequência codificante de proteína com o N° de acesso S80239 do GenBank foi processada para a posição 288 do N° de acesso S77410 do GenBank.A nucleic acid library, each comprising one or more polymorphic positions within the human ATI gene, wherein the sequence at said polymorphic position is in the regulatory region and is selected from the group consisting of 1427T, 1756A, 1853G, 2046C, 2354C, 2355C and 2415G, as numbered in GenBank Accession No. U07144; and / or the sequence at said polymorphic position is in the coding region and is selected from the group consisting of 449C, 678C, 1167G and 1271C, as numbered when the protein coding sequence with GenBank Accession No. S80239 was processed for position 288 of Genbank Accession No. S77410. 21. Biblioteca de alvos para fármacos cardiovasculares, compreendendo, cada um dos referidos alvos, um péptido isolado derivado do polipéptido da ACE, compreendendo uma 7 ou mais posições polimórficas na sequência do polipéptido da ACE, em que as referidas posições polimórficas são codificadas por nucleótidos seleccionados do grupo consistindo em posições nucleotidicas na região codificante da ACE, tendo a sequência 731G, 1060A, 2741T e 3503G, como numeradas no N° de acesso J04144 do GenBank.A target library for cardiovascular drugs, each of said targets comprising an isolated peptide derived from the ACE polypeptide, comprising a 7 or more polymorphic positions in the ACE polypeptide sequence, wherein said polymorphic positions are encoded by nucleotides selected from the group consisting of nucleotide positions in the ACE coding region, having the sequence 731G, 1060A, 2741T and 3503G, as numbered in GenBank Accession No. J04144. 22. Biblioteca de alvos para fármacos cardiovasculares, compreendendo, cada um dos referidos alvos, um péptido isolado derivado do polipéptido do AGT, compreendendo uma ou mais posições polimórficas no polipéptido do AGT, em que as referidas posições polimórficas são codificadas por nucleótidos seleccionados do grupo consistindo de posições nucleotidicas tendo a sequência 620T, 997C e 1174A, como numeradas quando a proteína codificando as sequências com os N°s de acesso M24686, M24687, M24688, M24689 do GenBank são processadas em conjunto.A target library for cardiovascular drugs, each of said targets comprising an isolated peptide derived from the AGT polypeptide, comprising one or more polymorphic positions in the AGT polypeptide, wherein said polymorphic positions are encoded by nucleotides selected from the group consisting of nucleotide positions having the sequence 620T, 997C and 1174A, as numbered when the protein encoding the sequences of GenBank Accession Nos. M24686, M24687, M24688, M24689 are processed together. 23. Alvo para fármacos cardiovasculares, compreendendo, o referido alvo, um péptido isolado derivado do polipéptido do ATI, compreendendo uma ou mais posições polimórficas no polipéptido do ATI, em que a referida posição polimórfica é codificada por um nucleótido tendo a sequência 449C, como numerada quando a sequência codificante de proteína com o N° de acesso S80239 do GenBank foi processada para a posição 288 do N° de acesso S77410 do GenBank.A target for cardiovascular drugs, said target comprising an isolated peptide derived from the ATI polypeptide, comprising one or more polymorphic positions on the ATI polypeptide, wherein said polymorphic position is encoded by a nucleotide having the sequence 449C, as numbered when the protein coding sequence with GenBank Accession No. S80239 was processed to position 288 of GenBank Accession No. S77410. 24. Kit para avaliar a capacidade de resposta de um indivíduo a um regime de tratamento para uma síndrome cardiovascular, compreendendo, o referido kit (i) iniciadores determinadores da sequência e (ii) reagentes determinadores da sequência, em que os referidos iniciadores são seleccionados do grupo consistindo de iniciadores que hibridam com posições polimórficas nos genes da ACE, AGT ou ATI humanos; e os iniciadores que hibridam imediatamente adjacente a posições polimórficas nos genes da ACE, AGT ou ATI humanos, em que as posições polimórficas são predictivas da capacidade de resposta de um indivíduo a um regime de tratamento cardiovascular de uma sindrome cardiovascular, em que as referidas posições polimórficas são seleccionadas do grupo consistindo de posições na região reguladora da ACE, numeradas como 5106, como numeradas no N° de acesso X94359 do GenBank; posições na região codificante da ACE, numeradas como 375, 582, 731, 1060, 2741, 3132, 3387, 3503 e 3906, como numeradas no N° de acesso J04144 do GenBank; posição 1451 no gene da ACE, como numerada no N° de acesso X62855 do GenBank; posições na região reguladora do AGT, numeradas como 412 e 1072, como numeradas no N° de acesso X15323 do GenBank; posições na região codificante da AGT, numeradas como 273 e 912, como numerada quando a sequência codificante de proteína com o N° de acesso S80239 do GenBank foi processada para a posição 288 do N° de acesso 577410 do GenBank; posição 49 do gene da AGT, como numerada no N° de acesso M24688 do GenBank; posições na região reguladora do ATI, numeradas como 1427, 1756, 1853, 2046, 2354, 2355 e 2415, como numeradas no N° de acesso U07144 do GenBank; posições na região codificante do ATI, numeradas como 449, como numeradas quando a proteína codificando a sequência com o N° de acesso S80239 do GenBank foi 9 processada, para a posição 288 do N° de acesso S77410 do GenBank; e combinações de qualquer das anteriores.A kit for evaluating the responsiveness of an individual to a treatment regimen for a cardiovascular syndrome, said kit comprising (i) sequence determining primers and (ii) sequence determining reagents, wherein said primers are selected of the group consisting of primers which hybridize to polymorphic positions in human ACE, AGT or ATI genes; and primers that hybridize immediately adjacent to polymorphic positions in human ACE, AGT or ATI genes, wherein polymorphic positions are predictive of an individual's ability to respond to a cardiovascular treatment regimen of a cardiovascular syndrome, wherein said positions polymorphic polypeptides are selected from the group consisting of positions in the ACE regulatory region, numbered as 5106, as numbered in GenBank Accession No. X94359; positions in the coding region of the ACE, numbered as 375, 582, 731, 1060, 2741, 3132, 3387, 3503 and 3906, as numbered in GenBank Accession No. J04144; position 1451 in the ACE gene, as numbered in GenBank Accession No. X62855; positions in the regulatory region of the AGT, numbered as 412 and 1072, as numbered in GenBank Accession No. X15323; positions in the AGT coding region, numbered as 273 and 912, as numbered when the protein coding sequence with GenBank Accession No. S80239 was processed to GenBank Accession No. 577410; position 49 of the AGT gene, as numbered in GenBank Accession No. M24688; positions in the regulatory region of the ITA, numbered as 1427, 1756, 1853, 2046, 2354, 2355 and 2415, as numbered in GenBank Accession No. U07144; positions in the ITA coding region, numbered as 449, as numbered when the protein encoding the sequence with GenBank Accession No. S80239 was processed to position 288 of GenBank Accession No. S77410; and combinations of any of the foregoing. 25. Kit para avaliar o estado cardiovascular, compreendendo o referido kit um ou mais anticorpos específicos para uma posição polimórfica dentro de polipéptidos da ACE, AGT ou ATI humanos, em que as referidas posições polimórficas são codificadas por um nucleótido seleccionado do grupo consistindo de posições nucleotídicas da região codificante da ACE, tendo a sequência 731G, 1060A, 2741T e 3503G, como numeradas no N° de acesso J04144 do GenBank; posições nucleotídicas da região codificante do AGT, tendo as sequências 620T, 997C e 1174A, como numeradas quando as sequências codificantes de proteína com os N°s de acesso M24686, M24687, M24688, M24689 do GenBank, são processadas em conjunto; posições na região codificante do ATI tendo a sequência 449C, como numerada quando a sequência codificante de proteína com o N° de acesso S80239 do GenBank foi processada para a posição 288 do N° de acesso S77410 do GenBank; e combinações de qualquer das anteriores. Lisboa, 9 de Novembro de 2006 10A kit for evaluating cardiovascular status, said kit comprising one or more antibodies specific for a polymorphic position within human ACE, AGT or ATI polypeptides, wherein said polymorphic positions are encoded by a nucleotide selected from the group consisting of nucleotide sequences of the ACE coding region, having the sequence 731G, 1060A, 2741T and 3503G, as numbered in GenBank Accession No. J04144; nucleotide positions of the AGT coding region, having sequences 620T, 997C and 1174A, as numbered when the protein coding sequences with GenBank Accession Nos. M24686, M24687, M24688, M24689, are processed together; positions in the ITA coding region having the sequence 449C as numbered when the protein coding sequence with GenBank Accession No. S80239 was processed to position 288 of GenBank Accession No. S77410; and combinations of any of the foregoing. Lisbon, November 9, 2006 10