PT96359A - Processo para a preparacao de um novo composto de benzantraceno e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

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Descrição referente ã patente de invenção de HOECHST JAPAN LIMITED, japonesa, industrial e comercial, com sede em 10--16, 8-chome, Akasaka, Minato -ku, Tokyo, Japão, (inventores: Shunji Senda e Haruo Se-to, residentes no Japão), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM NOVO COMPOSTO DE BENZANTRACENO E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM".

DESCRIÇÃO Âmbito da invenção A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de um novo composto de benzantraceno útil como antibiótico anti-tumores.

Antecedentes da invenção Técnica anterior

Existem vários antibióticos de benzantraceno jconhecidos, por exemplo, X-14881 D [J. of Antibiot 35:1627 | (1982); (1985) com a seguinte fórmula estrutural, SF 2315 B. [J. o£ Antibiot. £1:835, 843 (1988), e produtos semelhantes . N. 1

Objectivos da Invengão 0 objectivo da presente invenção é proporcionar um processo para a preparação de um novo composto de benzan traceno diferente dos antibióticos acima mencionados, que é tam bém útil como agente anti-tumor.

Resumo da Invenção

Os inventores descobriram agora, com surpresa, que a estirpe específica que pertence ao género da estreptomi-ces produz uma substância que inibe a proliferação das células da leucemia do rato L-1210. Os inventores conseguiram isolar o componente activo do referido produto para estudos posteriores e identificaram-no como um novo composto de antraceno possuindo a seguinte fórmula estrutural 1:

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e designaram-no como Composto 683. A Figura 1 mostra o espectro IR(KBr) do Composto 683. A Figura 2 mostra o espectro de ressonância 2 - 1 nuclear magnética H-RNM (em DMSO-dg) (sulfoxido de dimetilo) do Composto 683. A Figura 3 mostra o espectro de ressonância - 13 nuclear magnética C-RNM (em DMS0-6g) do Composto 682.

As propriedades fisico-químicas do composto 683 da presente invenção são as seguintes: (1) Cor e forma: pó branco; (2) Análise elementar: C, 67,04%; H, 5,71%; N, 0%; (3) Peso molecular: 356; (4) Fórmula molecular: C2oH20°6' (5) Ponto de fusão: 204-206°C (decomposição); (6) Rotação específica: +170° (c=0,023, metanol); (7) Espectro UV \ max em metanol: 282 nm (£ 7,430), 295 nm (largura, £ 6,500); (8) Espectro IV: representado na Fig. 1; (9) Espectro ^H-RNM: representado na Fig. 2; 13 (10) Espectro C-RNM: representado na Fig. 3.

Os espectros de RNM do Composto 683 são semelhantes aos do composto acima descrito X-14881 D, sugerindo que o Composto 683 tem a mesma estrutura de X-14881 D. Contudo, os dados de 1H-RNM de X-14881 D mostram a presença de picos a 2,47 ppm (12a-H) e 4,10 ppm (6a-0H), enquanto que no Composto 683 is so não acontece. Além disso, não se encontra um pico a 48,2 ppm 13 (C-12a) em dados de C-RNM do Composto X-14881 D no Composto 683, observando-se no entanto um único pico a 67,6 ppm para o Composto 683. A partir destes dados assumiu-se que o Composto 683 e o derivado epoxi de X-14881 D. A estrutura completa do Composto 683 foi investigada com base nos vários tipos de análise de RNM e verificou-se que tinha a fórmula 1 acima referida. A presente invenção refere-se a um processo para a preparação do Composto 683, que compreende cultivar-se o 3 1

microorganismo que produz o Composto 683 pertencendo ao género estreptomices, e recuperar-se o Composto 683 da cultura. Pode ser utilizada qualquer estirpe como microorganismo de produção de Composto 683 de acordo com o presente processo que ele seja susceptível de produzir uma quantidade suficiente do Composto 683 para se recuperar da cultura.

Um exemplo. de microorganismo susceptível de produzir o novo Composto antibiótico 683 da presente invenção é a estirpe Y-83.30683 pertencente ao género streptomices. As pro priedades microbiolõgicas da estirpe são as seguintes: (1) Propriedades Morfológicas O micélio de substracto cresce bastante. O micélio aéreo cresce bem em farelo de aveia -agar, glicerolasparagina-agar, e produtos semelhantes, e a es-porulação é abundante. As cadeias de esporos do micélio aéreo são substancialmente lineares. (2) Crescimento em vários meios:

Os valores do crescimento da estirpe Y-83.30683 em vários tipos de meios são apresentados na tabela seguinte. Médio_Crescimento Micélio Aéreo Pigmento Solúv.

Levedura-Malte s- -Agar (ISP No.2) Normal Farelo de aveia- -Agar (ISP NQ3) Bom Amido-Sal mineral -Agar (ISP NQ4) Bom Glicerol-Asparagina . -Agar (ISP N°5) Bom

Normal

Abundante

Abundante

Abundante ++ + + ++ - 4 -

Fraco Fraco +

Peptona-Levedura -Ferro-Agar (ISP NQ6)

Normal Normal ++

Tirosina-Agar (ISP Nõ7) (3) Propriedades Fisiológicas: 1 - Temperatura de crescimento: A estirpe Y-83-30683 cresce a uma temperatura que varia de 20°C a 40°C em meio de amido-sal mineral-agar, e cresce bem entre 27°C e 37°C. Ela não cresce de 15°C a 50° ! c. 2 - Liquefação em gelatina: positiva 3 - Hidrólise do amido: positiva 4 - Redução de um nitrato: negativa 5 - Peptonização de leite desnatado: positiva

Coagulação do leite desnatado: negativa 6 - Formação de pigmento do tipo de melanina: positiva (4) Utilização da fonte de carbono (em Meio Basal de Pridham e Gottlieb):

As fontes de carbono utilizáveis são a D-gli-cose, L-arabinose, glicerol, L-Ramnose, D-xilose, D-manitol, Rafinose, d-frutose. A sacarose e o i-inositol não são utilizáveis. A estirpe Y-83-30863 acima mencionada foi depositada no "Fermentation Research Institute of Agency of Industrial Science and Technology" e foi-lhe atribuído o número • de acesso Bikoken-kinki NS 11146 (FERM P-11146) . 5

A estirpe Y-83.30863 e os seus mutantes (mu-tantes espontâneos, e mutantes artificialmente obtidos por exposição à luz ultravioleta, raios-X, substâncias químicas como por exemplo nitrosoguanidina, e produtos semelhantes), bem como quaisquer outras estirpes que pertençam ao género estreptomices e que sejam susceptíveis de produzir o Composto 683 da presente invenção podem ser utilizadas na presente invenção.

Neste processo pode ser cultivado qualquer dos microorganismos produtores de Composto 683 num meio convencional contendo nutrientes que os referidos microorganismos pos sam utilizar. As fontes de carbono que podem ser mencionadas in cluem glicose, xarope de amido, glicerol, dextrina, sacarose, amido, molasses, óleos animais e vegetais, etc. As fontes de azoto adequados são extractos de carne, peptona, extracto de levedura, sais de amónio, sais de nitrato, ureia e produtos se-jmelhantes. Além disso, os sais animais susceptíveis de produzir iões como por exemplo os sais de sódio, potássio, cálcio, magné sio, ferro, manganês, cobalto, cobre, cloreto, fosfato, sulfato ou outros iões podem também ser adicionados se necessário.

Este processo pode ser conduzido em condições aerõbicas convencionais, como por exemplo, culturas de agitação !reciprocante ou rotativa, culturas de agitação com arejamento, culturas sólidas, e semelhantes. Se for necessário evitar a for mação de espuma durante a cultura, podem ser adicionados agentes anti-espumantes, como por exemplo óleo de silicone, agentes ten sioactivos, etc., habitualmente numa concentração de 0,1 a 0,01% em peso. A incubação é conduzida habitualmente a 20-37°C, preferivelmente a 26-30°C. A acumulação máxima do Composto 683 des ta invenção na cultura pode ser atingida habitualmente passados 2 a 10 dias de cultura nos casos de cultura de agitação e cultu ras de agitação com arejamento, dependendo do tipo de meio e da temperatura utilizada. O Composto 683 pode ser isolado e purificado » • da cultura e do micélio assim obtido, por processos convencio- 6

nais como por exemplo extracção com um solvente, cromatografia de coluna, recristalização, etc. 0 Composto 683 da presente invenção, bem como o composto estruturalmente relacionado X-14881 D, foi ensaiado para determinar o efeito inibidor na proliferação de células de leucemia de rato L-1210 (1 x 10^ células/ml). Os seus valores de concentração inibitória de 50% são os seguintes. —50- Ouq/ml)

Composto 683 3 X-14881 D >100 A partir dos dados acima referidos, é evidente que o Composto 683 possui uma excelente actividade anti-tu-mor. O composto da presente invenção pode ser utilizado como agente anti-tumor, isoladamente ou em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável, ou num complexo que possui um an-ti-corpo, um polímero, et., a ele ligado.

Exmeplo A invenção é ainda ilustrada, mas não é de qualquer forma limitada, pelo seguinte Exemplo:

As composições do meio de inoculação e do meio de produção utilizados são apresentadas nas Tabelas 1 e 2, res-pectivamente. O valor do pH do meio individual foi ajustado a 7,3 antes da esterilização.

Tabela 1

Composição do meio de inoculação

Farinha de soja 1 % Glucose 2 % Estearato de levedura 0\0 in O - 7 -

Cloreto de sódio 0,5 %

Carbonato de cálcio 0,2 % KH2P04 0,05 %

MgS04 · 7H20 0,025 %

FeS04* 7H20 0,002 %

ZnS04*7H20 0,001 %

MnS04 · H20 0,0005 %

CuS04 · 5H20 0,0002 %

CoCl2 · 6H20 0,0001 %

Tabela 2

Composição do Meio de Produção

Glicerol 1,5 % Glucose 1 % Tripton 0,5 % Cloreto de sódio 0,5 % Carbonato de cálcio 0,2 % kh2po4 0,05 % MgS04 · 7H20 0,025 % FeS04 - 7H2° 0,002 % ZnS04 · 7H20 0,001 % MnS04 · h2o 0,0005 % CuSO. · 4 5H20 0,0002 % CoCl2 · 6H20 0,0001 % (NH4)2Mo04 · «2° 0,00001 %

Foi esterilizado durante 20 minutos a 121°C, um frasco de Erlenmeyer de 500 ml contendo 100 ml do meio de incubação acima referido, e foi inoculado com 1-2 aros de plati na de uma cultura de estirpe Y-83-30683 que foi cultivada duran te 4 dias a 27°C com agitação, para se obter uma cultura de ino culação. Foram utilizados 200 ml da cultura de nucleação para se inocular um recipiente fermentador de 7 1 do meio de produção que tinha sido previamente esterilizado a 121° C durante 20 minutos, e efectuou-se a cultura a 200 rpm e a um caudal de are 8

jamento de 5 1/min a uma temperatura de 27°C, com a adição ocasional de um agente anti-espuma Desmophen (Hoechst, A. G. República Federal da Alemanha, tipo 36001, se necessário. Passados 5 dias de cultura, a cultura assim obtida foi centrifugada para separar o micélio do caldo da cultura.

Os micélios assim obtidos foram extraídos com uma mistura de acetona-metanol 1:1 por imersão nela durante 24 horas e em seguida filtração. O extracto assim obtido foi concentrado em vazio, e o valor do pH do resíduo foi ajustado a 6,5 e extraído com acetato de etilo. 0 extracto de acetato de etilo foi concentrado em vazio e o resíduo resultante foi deixa do em repouso ã temperatura ambiente durante 24 horas para se obter um precipitado. 0 precipitado foi recolhido por filtração dissolvido em sulfóxido de dimetilo, diluído com uma mistura de metanol-água 1:1 e submetido a cromatografia líquida de alto rendimento preparativa em coluna Unisil Q Cl8 [Gasukuro Kogyo Ltd., Tóquio, Japão, 22,2 x 300 mm, tamanho de partícula 5 jum]. As fracções contendo o componente activo foram combinadas e con centradas em vazio até ã secura para se obterem aproximadamente 80 mg do Composto 683 purificado. A estirpe Y-83.30683 foi redepositada de acor do com o Tratado de Budapeste com o Número de Acesso FERM BP--3139 no Fermentation Research Institute (FRI), 1-3, Higashi 1--chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan.

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Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES - 13 - Processo para a preparação de um composto de benzantraceno com a fórmula 1

   caracterizado por se efectuar a cultura de um microorganismo que pertence ao género Strptomyces e que é susceptível de produzir o composto de benzantraceno acima referido, e recuperar--se o referido composto da cultura. - 2ã - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um composto quando preparado de acordo com a reivindicação 1 em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável. A requerente reivindica a prioridade do pedido japonês apresentado em 27 de Dezembro de 1989, sob o número 1-336256. Lis- 10

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