PT95685A - Ensaio enzimatico e estojo de ensaio para medir a activacao celular - Google Patents

Description

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invento

Antecedentes do Âmbito do invento 0 presente invento no campo da imunologia, da biologia celular e da. medicina, diz respeito a testes enzi má ticos e a estojos para testes destinados á medição da activação celular, em especial de células sanguíneas tais como linfòcitos, por meio de substâncias activadoras das células, tais como os antigénios aos quais os linfòcitos são especificamente reactivos.

Descrição da técnica anterior A medida das respostas imunolôgicas específicas ou de uma reactivida.de geral do sistema, imunitário é um instrumento valioso para o diagnóstico e para o estudo de um grande número de ooenças xmp*ort-an&es. Uriginslmente, estes c-estes esc-svs.m ximitO.— dos a técnicas in vivo tais como testes sobre a pele para se detectar a presença de hipersensitivida.de imediata ou retardada. i

Desde os anos 60 foram levados a cabo numerosos testes in vi iro servindo como formas correlacionadas de respostas de imunidade in vivo. Muitos destes biotestes basearam—se no facto das células do sistema imunitário, isto é os linfòcitos, reconhecerem estruturas químicas a que respondem, como por exemplo os antigénios {·“* íííi 1 * &£ os que. i s são espec í f i cos. r espos ta, os 1 inf òc i tos são activados e "blastos", dividem- ”ía0 Θ/ OU diferenciam-se. sobretudo para.

Deste modo, as medições da blastogénese dos linfòcitos ou da proliferação dos .linfòcitos na presença de antigénios devidamente apresentados que a. eles se contrapõem têm servido de medida da resposta imunológica específica, sobretudo para a

J! 'T

classe dos linfócitos Γ. Eeacções semelhantes induzidas num maior número de linfócitos por activadores policlonais, que estimulam classes inteiras de linfócitos (em lugar de apenas ρ u ρ u 1 a. ç ó e s antigeno—especλf icas), permx ti γβπϊ aos ίϊί Ο d .i c o s e aos investigadores aferir a. rea.ctivida.de geral das populações de linfócitos. A activação policlonai é induzida por uma variedade de substâncias, tais como lecfcinas mitogénieas derivadas de plantas (por exemplo, concanavalina A, fiio-hemaglutinina, mitogénio de "pokeweed"), produtos bacteríamos Cpor exemplo, 1 ipo-pol issacarí-deos, substâncias da parede celular, enterotoxinas), e vários produtos químicos ou bioquímicos (por exemplo, ésteres de forboi, de sódio, >5 & t* cà 1 f Immunolog Fa 1 c orno Sei o corr activação ou est medição do crescimento celular (i.e. a proliferação) por incorporação de precursores radioactivos do DMA, mais especificamente da '“Ή-timidina ou da ‘íododeo.xiuridina, em células proliferantss. Estes testes são tecnicamente exigentes, requerendo condições estéreis para a cultura celular e um fraccionamento em várias etapas das amosx-ras sanguíneas o que os torna rexativamente dispendiosos. Além disso, estes testes dão origem a desperdícios mar radioactivos o que está a tornar-se um problema preocupante nos Estados Unidos. 0 facto talvez mais importante é que estes testes requerem geralmente 3 a 7 dias e os resultados podem ser muito variáveis, especialmente se a diferença na resposta (por exemplo, entre um paciente e um controlo saudável) for modesto, embora significativo, em lugar de ser "tudo ou nada". Por outro lado, para se medirem respostas de uma série de es ti muras, os tesx-es correntemente praticados requerem números

relativament© grandes de linfócitos, o que constitui um problema quando se submetem aos testes pacientes linfopénicos ou leucopé-nicos <por exemplo, apôs terem sido submetidos a quimioterapia, transplantação da medula ou em casos de doenças com imunodef.1 ciência, tais como a SIDA).

Por esse motivo, um teste de activação dos linfócitos que seja rápido, simples, requeira pouco sangue por amostra e evite o uso de radio-isôtopos será de uma grande utilidade. Para fins laboratoriais e clínicos seria importante que tais testes.’ (1> se tornassem facilmente de rotina, requerendo a menor manipulação de células possível; C2) fossem automatizados e <3) fornecessem resultados mais susceptíveis de serem reproduzidos do que os dos actuais testes de proliferação celular.

Uma tentativa para um teste mais rápido seria a de medir um acontecimento que ocorresse num momento precoce apôs o estimulo inicial para a activação celular, que precedesse a síntese do DMA e a proliferação celular. ft "activação" das enzimas intracelulares ou associadas â membrana, é um tipo de acontecimento que ocorre precocemente, apôs a membrana celular ter sido "provocada" por um sinal, tal como um antigênio contactando um linfócito específico <Sell, Immunology

Immunopatho1oay and Immunitv. Elsevier, 1987). A activação ou a capacidade de resposta de tais enzimas pode ser facilmente orientada utilizando reaccâes do substrato enzimático com substratos cromogénicos ou com outros reagentes ou produtos fisicamente detectáveis.

Landegren, U. (J. Immunol. Heth., 67;379-388 <1984)), um serviu-se de uma enzima lisossómica ubíqua, a hexosamidinase, s desenvolveu um ensaio para quantificar o número de células presentes numa cavidade de uma microplaca. Foi usado

substrato cromogénico para esta enzima, a p-nitro-fenol-N-acetil--B-D-glucosaminida, para criar um produto de reacção colorido que foi medido como a absorção a 405 nm {·Α^^Γ) usando um leitor de P1a c as colo r i mé t r i co. Quando o subs t r a to f o i ad i ci ©nado às células na cultura, a quantidade de cor gerada (i.e. o produto de rsacção formado) era directamente proporcional ao número de células para um ciado tempo de reacção. Este método foi aplicado pa r a medir a proli fer ação dos j. nfóc i tos em resposta aos f ac to res d© c r esc iment o, a aderência ,4 N·. s c é1u1as a uma superfíc i e e a <Hl d © Γ 'έ1 n C í <Hl O cl 3 células a p 1 **..**· ·*** ,·«* a «(.. as Γ evestidas c om ant i c o rpos. tíss im, mu i to embora fornecce sse possi V© 1mente um subs t i tu to ú t i1 para 03 radio -isótopo s usados em tes tes de prolif: eração de linfóci tos, O métod o, ta1 c omo f o i aqui apre sentado, nS o serviria para medi r a act ivação precoce dos 1i nf ôc i. tos , uma vez que a en zima ©3 tava. apa psntemente ac t iva e di sponível relativameni e a O- 3 ubstr ato ©Í:í qua Iquer momento. Um oui ro probl ema era a pres: r· a d es ta ©Π2! x ma no soro, | * H do uma i ntensa lavagem das c élu J. «s» 3an gui neas par a 3© p ©mov©r a. enzima assoe iad a ao soro ante 3 cia 3 ua. i n cubacão in v i t r o. 0 teste desc r i t o por L andegren (sup v* a foi mod ificado P*o P Alei na.; A. ; © t ai. C •J. lííirotíín o1. Heth. 105 * i _ J 8 < í 987) > para det ectar a viabil idade e a cies ir ui cão de paras i ta 3 inira célula- res. Mosmarm , T. CJ. Jmmuno1 . Meth. 65;55 -6-3 ( 1 983 ) ) c r i ou um t ©3 t © seme1han te usand o o sal de ieirazóli o M TT í brom et-o de 3~C 4,5-di meti 1tia 2101 ""jí!*™ X 1 )~2,5~di f ©n i 1 fc© t r ©.2!Ó I io) que é modi f i~ cad !o pe 1 a s enzima s de-hid ν’· o © na 3 © m i t o c ònd rica de mo do a. f ormar um produt o azul Q© forfil azano, cuja absorção PO de ser m©d x da. espe c t ro f o tome i r i c smen te a 57unm. wuma certa gama qs números de células este substrato deu origem a uma relação linear entre o número de células e a cor que se formou. 0 método tem sido útil d

na medicâo do esumuio ao crescimento de certas linnas de 1 i n fó-eitos através de factores de crescimento. Outros modificaram o método de Mosmann para medir a s.obrevivência das células em testes de citotoxicidade CGreen L-M. , et ai., (J. 1mmunoI. Me th. 70;257-268 (1984)). A íosfatase alcalina á uma enzima que se sabe estar associada com as superfícies de secreção e absorção de vários tipos de linfócitos normais e leucémicos (Neuman, H., et ai.,

Pv-bc ........MM......Acad. „ Sei. USA Z3í Í423 (1976); Culvenor, J.6., et al. , (J. immunoi. 126;1974 (1981)). Gareia-Rozas, C., et aí. (J. Immuno 1. .129'52-55 (1982)) testou fosfatas® alcalina em linfócitos de rato cultivados in vitro com vários miiogénios, usando p-nitrofeni1fosfatase como substrato. Antes do teste as células foram fixadas com glutaraldeído e tratadas com detergente, após o que se adicionou o substrato, e a cor da reacção foi lida direc-tamente das placas {-A4{-5C.) usando um leitor de placas. Concluiu™ -se que a fosfatase alcalina estava associada particularmente a linfócitos 8. A activida.de enzimática foi significativamente elevada nas células B "activadas" durante 3 dias com lipossacari-deo (LPS) ou com mitogénio de "pokeweed <líPW) e foi associada a células "folastos" aumentadas.

Hashimoto, N. , st al,., 1J Immunol,,, JjstPn. 90137-103 <1986)) modi f icou o teste de Garc ia-Rozas et a1. Csupra, adic io- nando o substrato em detergente directamente ás mierocavidades contendo células B estimuladas (após uma lavagem das células). 0 teste permitiu a medição da proliferação das células B após 3 dias de estimulação com LPS e í~2 dias de subsequente estimulação de factores derivados de células T. 0 ensaio foi vantajoso na 9 medida em que, contrastando com a medição da absorção da “H-timi-dina, ele podia detectar selectivamente a proliferação das células B mesmo na presença de números elevados de células Γ \ "coniamxnantes", e podia medir células no meio ΗΑΓ (usado geral-mente para ssiecc.ionar hibridomas). Não houve prova que indicasse qualquer "activação" de enzimas antes de decorridos 3 dias e o limiar da. activida.de enzimática deiectável de células B frescas P, parecia requerer 10’“ ou mais células. A Publicação da EPO 016S50S C2 de -Janeiro de 1985) apresenta, um processo de detecção quantitativa da fosfata.se alcalina através da separação cromatográfica e do teste colorimé- “f·, trico, em que .2 x 10 " unidades de activida.de enzimática deram um sinal detectáível . No entanto, o sistema do teste e os estojos divulgados nesta publi cação destinam-se a ser usados com enzimas parcialmente purificadas e não com células inteiras.

Chan, K. M. , et ai . , C Ana 1 . Eiiochem. 157 375-380 ¢1986)), descreveu um teste colorimétrico para medir a actividade da *.>«* -j- ATPase Ca -estimulada, sobre preparações de membrana de plasma de adipócito ou microssomas de fígado. 0 teste dependia do acoplamento de uma reacção cromogénica ao produto P. gerado a partir do

X substrato ΑΓΡ. A enzima foi medida apenas nos extractos celulares e não foi sugerida, a sua utilização'com células inteiras. A Publicação da EPO 0122028 ÍÍ7 de Outubro de 1384) divulga um teste colorimétrico útil para detectar uma enzima num espécime biológico. Um substrato é absorvido numa superfície tal como a de uma mecha, que é posta em contacto com o espécime contendo a enzima para produzir uma reacção de cor na superfície. Este sistema de teste é puramente qualitativo e não quam*ita.i*ivo e destinou—se particularmente à detecção da. presença de bactérias numa amostra. U sistema do teste destinou—se a. detectar a. presença de um ou mais tipos de bactérias numa amostra mergulhando uma mecha, onde um ou mais substratos tinham sido absorvidos, 8 detectando a reaccão da cor na na amostra contendo a bactéria e mecha.

Sumário do invento 0 presente invento baseia-se na observação de que, após a activação ds células, tais como células sanguíneas, com substâncias de activação celular, tais como antigénios específicos, certas enzimas celulares são a.ctivadas ou então tornam-se disponíveis para reagirem com um substrato. 0 inventor apresentou um teste rápido, simples e reproduzível para. medir esta reaccão, em que se converte um substrato num produto detectâvel ou num produto que é associado a uma outra reaccão fornecendo um produto detectâvel. 0 invento refere-se a um método para detectar a activa-ção de uma c él ula através de uma dada substância activadora celular, do modo que se seguei Ca) pôr a célula em contacto com uma substância activadora celular durante um intervalo adequado, em que a substância: activadora celular faz com que uma enzima da célula se torne disponível para a reacção,’ <b> fornecer um substrato enzimàtico capaz de reagir com a enzima,' s Cc) detec-iar a. activação da célula medindo o produto da reacção do substrato enz i má t i c o. 0 invento refere-ss ainda ao uso de um tal teste para detectar a presença de linfôcitos específicos para. um dado anti génio ou anti génios do modo que se seguei Ca.) pôr os linfóci-tos em contacto com um aniigénio ou a.ntigénios durante um intervalo adequado, em que a interseção com os antigénios faz com que uma enzima dos linfôcitos se torne disponível para. a. reacçãoί Cb> fornecer um substrato enzimàtico capaz de reagir com a enzima; 1

C} reacção do substrato enzimático. 0 invento fornece um método para detectar a sensibili-zação imunológica a um antigénio num sujeito do modo que se segue* lai fornecer cê 1 uIas sanguíneas do sujeito ao antigénio; Cb) incubar as referidas células com o antigénio durante um período suficiente para permitir que as células sofram activação, o que faz com que a enzima das células se torne disponível para a reacção; Cc) fornecer um substrato enzimático capaz de reagir com a enzima; <d> e detectar a sensibilização imunológica medindo um produto da reacção enzimática. © T © r © *~ “SS X Π d 0. <3 L-JíTr ©t O j O P <á Γ 0. Γ» © Ο X Γ a ,s! tais como células sa inSUÍneSSí 85 XO J O 85 ;S8 stância d> e activação célula r, ta1 c omo * (Λ*. Ufif uma ma tv 3. de supor te, s um 3uiasx·rat.*o pai*1 a. a

Descrido dos mo dos de realiz a c ã o p i * e f e r i do 0 teste do invento compreende incubar as células a. serem testadas com uma substância oe acc-ivacao celular que ?oi ou adi cionada s i mu11aneamente c om as c é 1 u 1 SS ; o u ligada p f © viam© π t e a uma matriz de suporte com a qua 1 as Cél ul 0.3 são dep O X s POS ta. s ©m contacto. Deixam se as cé lula s e ; a s ub stânc ia ac tivador a int eragir du rante um espaço de tempo s u f i c i en . X· © pc& 1** S per m i i i r s act ivaçSo de uma ©π.*?* x ma ou enz i mas Π3 cél ul <3 · A maio n * vanta se m do presente invento é a r apid »·*·-. »rr om que ac tivaçã o p ode se r med i da < r esu ltado óptimo, c 0 Γ C O. de 3 ho r as ) , Um subst 11 «s o par â a enz ima activ ada é ad i c i onad O C ΟΓΠ «fcS cél u 1 a s OU ! depois da ac ti va «n 3¾ 0 ter pro g i‘ ed i uo, sob r e el © a c tua ndo 3 enzima a c t x v* a o u 0 \

disponível, ο que dá origem a um produto de reacção detect que s i na 1 i za a ac i i vaç ão das células. 1C*. *·! cf Ί

Pelo termo "subsiânc ia dé activação da célula" entende--se uma substância que, devido ao facto da célula possuir recep-tores, ou outras estruturas de ligação, ou mecanismos de absorção e/ou o mecanismo metabólico apropriado, pode provocar uma reacção na célula.

No que respeita ás células do sistema imunitário, tais como linfôeitos e monôcitos/macrófagos, as substâncias actívado-ras celulares incluem antigénios específicos. 0 antigénio pode ser um peptídeo, um glicopeptídeo, uma lipoproteina ou um hapteno. Incluída entre estes antiogénios está a classe particular conhecida por alergénios, muitos dos quais são haptenos. As substâncias activadoras celulares para as células do sistema imunitário i nc .1 uem também c omp 1 sxos i mun i tá r i os, c omponen tes c omp 1 emen ta res, moléculas de imunogiobulina ou fragmentos, iinfoquinas e outras eitoquinas (por exemplo, IL1, IL2, IL4, etc,). Os alergénios servem como agentes de activação para linfócitos específicos, ou para basófilos contendo anticorpos específicos IgE na sua superfície. As substâncias alimentares, que também podem ser aiergénios, podem igualmente servir como substâncias activadoras celulares tal como aqui se prevê, do mesmo modo que uma variedade de produtos químicos ambientais. Para um estudo sobre a activação das células do sistema .imunitário ver, por exemplo, . Roitt, I. , êl ai . , Immunology, C.V. Mosby Co. í .1. 383) , que é aqui mencionado a títu1o de referência.

Uma lista das substâncias que podem activar as células sanguíneas, tal como foi cletsctado através do teste do presente invento, ê apresentada no Quadro 1 a seguir referido. Esta lista não pretende ser exaustiva, e um técnico da especialidade seria

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capaz de seleccionar agente· no p r ©sente in vento. ac t i vs ç fáo c e 1 u 1 a r do reacçao juntamente com

Os antigénios ou agentes de presente invento podem ser adicionados s

Cou imediatamente apôs) as células deixar-se o agente activador ligar-se A11e r nati vamente, â matriz de suporte? POCHS? quer por simples pré-incubação, quer por da técnica da especialidade. Num agente de aciivação pode ser ligado 1i gaç ão qu im ic a outro modo de bem conhec r ea1xzaçao, o ou incorporado em, lipc somas é apresentado à célula sob est forma..

As essencxaxs, células gordas podem pór â c i do a raqui dôn i c o r activadas por ácidos gordos e seus metabolitos, ou por g.1 i cér .idos . ,-ras

Os precursores das células eritrôides ou de ac c· x vados ροr meio de meie* ambiente, incluindo os me tab i ssu .1 f i tos, etc. produtos sa i s de células sanguíneas podem ser guiϊϊί.1 coque se encontram no me r cúr i o e su1f itos, tai s c orno

As cél ui as oo 1* xgado p*odem ser acx*xvadas por meie* oe ácido araquidónico, ácidos gordos essenciais e por uma variedade de xenobiôticos.

Us polímeros oe glucose ό Tosfat*o podem ser acx*ivados por meio de uma variedade de células e deiectar a deficiência ou a hiperactividade da da-hidrogena.se do glucose-6-fosfa.to.

Uma granoe variecísde cíe células pode ser accivaos por meio de hormonas ou de factores de crescimento. Mários tipos de cé 1 u 1 as e várias moieclas bxoiogicas ou xenobxôticos cap^azes de >e c i a. 1 i da.de (ve r as activar são bem conhecidos na. técnica

Sm i th, E. Biachemisi nado a t£ i L. et al., Principies ^ ? S í o f S i o c hem i s t r y; Mamma1i an :íT, 7iedi ς So, Mc G raw-Hi11, <1983), que é aqui menc c io~ :-ulo de referência.

QUADRO Γ

SUBSTÂNCIAS PARA A DETERMINAÇÃO DA HIPERSENSIBILIDADE IMUNQLÓÕICA POR MEIO DO TESTE DE ACTIVAÇÃO CELULAR CATEGORIA ΑΝΤΊ GÉNIO (OU EXTRACTO?

A. ALIMENTOS .1.Crustáceos/ caranguejo, lagosta, camarão, amêijoas, vieiras Moluscos , Produtos lácteos . Pe i :«:es manteiga, queijo, leite, caseina, iogurte ancHos/a, perca, lsmpireia, bacalhau, arenque, cavala, ruivo, salmão, sardinha, 1 .i nguado/ sol ha/ha x ibute, peixe espada, truta, atum, .rodovalho/pescsda c 1 a r a de o vo, goma de DV o, f range ga.ns o, pa to, perú macS, a 1 pe r c e , ban , f ruto s de L*aga c amo r a, m i r t i lo, g ros elha. f r amb , mo· **ang o) C 0 P 0 J a ; n 0·* n 0 tãma ra, f i go , u va í to r a n j a, F k .1 Ur i } 1 i mâ'o; x x m a, na, m SnyS t me lã o, (cantalu pe; ητ01 oa; melan cia); ne c ta r i na ; 1 .L Cí ran j a, pí 3pai a/ Psêss0go; pera, anan- ás, ame i xa í tamari ndo ama r a nto, cev ada, t r i mo up i s c , f milho j Γϊί 1 1 h o miúdo ia, ar ro z ( Hln A L.' ! CX nco > n m t } «:*. i < :',32 ζ es C U P o) .* 4. Ave csposxra 5.Frutos 6.Cereais

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/.Csrns boi/vitela, carneiro/foorrego, porco, veado, c os1ho . Nozes/ Sementes alfafa, amêndoa, anis, nos do E·1 ras.il, acaju, castanha, aveII, amendoim, pinhão, nogueir a ped, pistachio, sementes de papoila, de abóbora, de sésamo, de girassol, noz 9.óleos de fígado de bacalhau, de milho, de semente de algodao, de avela, óleo hidrogenado, óleo de linhaça, azeite, óleo de amendoim, de prímula, de a ca. frio, de sésamo, de girassol, de noz 10.Espe ci a r i a· mistura de especiarias, araruta, semente de a1car âv ia, pi men tio, c anela, cr av i nho, c a r i1, funcho, gengibre, noz moscada, mostarda, oreglo, colorau, salsa, pimenta (preta, de Cayenne, branca 1, hortell, rosmaninho, sal va/basi 1 i cao, hortela verde, tomilho, baunilha ί

ί1.Legumes -__ aicach of r a, espar 3O) c&VOC ado, fei j Ses ( Τ Γ Θ.ΟΘ ; preto, br anco, ai farroba, grão de b i c o, soja) í beierr aba , brôcul O ; C OUV© de Brux elas, c ouve c omum, CÊ noura, c ouve™* f 1 o r, a x po, m x .1 ho ; P0P i ΠΟ t beringela , a 3. ho, lentilha , a 1 τ a. c e , cogumelo, azsi to na i cebola, sa1sa, c h ?a r ί, v x 'a , p i me nta ve r me1 ha., pimenta verde, P x men to, baiai a (comum, doce), ra banete, rubarbo, abóbora , nabo , as ri ão 12 . Μ χ sc& 1 ê.r,so c a τ 0; cdC8.iiij cola; gin t, oa.ga.^ barri 1 na /ai ga rr» a r 11 ϊ n’ía; si lio. r o s ó 1 i o; t* a ρ i o c b. j chá, fermento ( de E*a.k*er, de E*rewer) 1 d A d i. t i vos a1 gas ( ssp i r u i. i na /; de zimbro), lúpulo, r["ib. 11-s; semente de p· iaòaco, tofu/miso, aspartame, BHT/BHA, corantes alimentara tares e sacarina, benzoato, sul f i to/metabissul f i to preservativos -¾ X 1 Γΐ!®ί“ι*~" 14.Produtos a C 0 tíSfi! Í VIO f ΘΠ ; B 1 CÍ0 X QO f Ο Γ Π?0 .1 d0 X GO ) ; PÓ CÍ0 químicos e fermento, bicarbonato de sódio, cafeína, medicamentos carbamatos, alcatrão, detergentes, pesticidas halogenados, cataiisaciores metálicos (Ni, Cd, Hg, etc.), nitratos, orgsnofosfatos, fenol, produtos secundários do petróleo (solventes), sa.licx.laio, sabões (sulfato de dodecilo de sódio) ·· 16

Pele· termo "activação enzimática·'’ entende-se um qual- •s. quer número de alterações que resultam num aumento mensurável da activids.de enzimática quando anteriormente a uma tal activsçao havia pouca ou nenhuma activida.de enzimática detectávei. Assim, uma substância activadora celular, ao reagir com uma célula, pode provocar um certo número de ocorrências celulares que resultam na alterado de uma enzima que passa de uma forma inactiva para uma forma quimicamente activa, por exemplo, por fosforilação ou desfosforilaçâo, ou por alterações alostáricas no local activo, Alternativamente, as enzimas podem ser transferidas de um . local inacessível ao substrato para um local acessível ao substrato, por exemplo, do citoplasma para a superfície da célula. As alteraçâes intracelulares na localização de uma enzima, como por exemplo, do interior de uma estrutura vesicular de uma membrana para o exterior, pode tornar uma enzima disponível relativamente a um substrato que se encontra no citoplasma. A activaçáao enzimática, tal como é usada no presente invento, inclui também tornar-se a enzima, disponível relativamente ao substrato em virtude de uma alteração na célula, permitindo que o substrato entre e fique em contacto com a enzima como parte do processo da activação celular. Tais alteraçâes na actividade enzimática, localização e permeabi .1 idade da célula ou absorção dos materiais do substrato são bem conhecidas dos técnicos da especialidade e encontram-se descritas em Alberts, 8. et ai., Molacular Bio1ogy of ihe Cell, (21· edição), 6'arland Publishing Inc. , 1389, mencionada aqui a título de referência.

Pelo termo "substrato" entende-se.' Ci> um substrato sobre o qual a enzima em causei acíua direc tamente, a. fim de produzir um produto detectávei (por exemplo, um cromôforo),’ (2) uma combinação de um primeiro substrato e de uma segunda substância, em que o primeiro substrato produz um produto que, quando .17 .17

acoplado a uma segunda reacção enzima/substrato, ou quando acoplado com um segundo corante (tal como um corante diazo); fornece um produto que é detectávbel e reflecte a actividade da enzima, em causa. A segunda substância pode ser um precursor de uma co-enzima mais um precursor cromogénico, em que a enzima em questão reage com o precursor da co-enzima, tal como,, por exemplo, o fosfato dinueleotidico de nicotinamida adenina (MADP>, em condi cães adequadas para produzir o ÍMAD, que é então empregado numa série de reacções químicas cíclicas, formando um catalisado’,— "gerador que actua de forma a produzir um produto detectávei a partir de um precursor (tal como um precursor cromogénico). 0 catalisador-gerador pode ser uma outra enzima, por exemplo, a diaforase, como catalisador de redução. A absorção de um cromô-foro assim gerado é medida por técnicas coloriméiricas convencionais. A Publicação EPO 0058533 (publicada em 25 de Agosto de 1382) divulga uma reacção cíclica NAD/NADH com diferentes catalisadores de oxidação-redução para a determinação da fosfatase.

Os precursores de cromóforos úteis parai o presente invento incluem os sais de tetrazólio tais como o cloreto de 2-(p-iodof eni 1>, 3-Cp-ni trof eni 1 >-5-f eni 1-tetrs.zól io ( INí> ; b r orne to de 3-(4,5-d i me i i11 i azo1-2-i1)-2,5-d i f en i1-tet r azô1i o (MTO; cloreto de 2,2'5,5'-tetra-(p-nitrofeni1>-3,3'-(3,3'-dime-ioxi-4,4'™difenile no >-di fen.il tetrazólio (TNST); cloreto de 2,2'-d i(p~n it r o f en i1>-5,5'-d i f en i1> ~3,3'-< 3,3'~d i me tox i-4,4'~d i-f eni .1 eno > di f eni 1 tetrazõl io (ímBT>; cloreto de 2,2-d.if eni leno-™3,3'5,5'-tetrafenil ditetrazólio (cloreto de neotetrazólio ou NT>; cloreto de 2,3-S-trifeni1tetrazólio (TT>; e outros.

Estes precursores de cromóforos podem actuar em vários locais distantes da reacção enzimática que interessa. Por exemplo, s ac ti vioade cl3. de Hxdrogenase isc tic® í. L.DH) , ns presen— ca de lactato, provoca a redução do NAD para NADH, o que pode reduzir um sal de iefcrazõlio, tal como aqueles atrás foram usícritos, a um formazaoo reduzxdo, que pode ser dstectsdo colorimetricamente no comprimento de onda apropriado. A quantidade de formazano formado constitui uma medida da activida.de de LDH.

Alternativamente, a actividade da. fosfaiase alcalina resulta na criação de NAD a partir de NADP. 0 NAD pode acoplar--se à rsecção do LDH atrás descrita e dar origem a uma idêntica formação de formazano, que neste caso constituiria uma medida da actividade da fosfatase alcalina.

Como é evidente, em células intactas, essas reacções enzimáticas desenvolvem-se concomitantemente e, com substâncias de activação celular apropriadamente seleccionadas e precursores de cromôforos, podem interagir de modo a aumentar a sensibi1 idade do teste.

Us ésteres de forboí são particularmente oem adequados tanto como substâncias activadoras generalizadas de células, como substratos para esterases, tal como a fosfoíipase. Conjugando os precursores de cromôforos com ésteres de forbol, tal como o acetato de miristato de forbol (PMA), o composto simples fornece o sinal activador e é subsequentemente clivado pela enzima activada para. produzir um produto cromogénico que pode ser detectado. Nos testes de hipersensibi1 idade aos alimentos e aos antigénios químicos ambientais, o conjugado de éster de forbol, 12~retinoai,o-3.3-acstaf,o de forbol, serve de "controlo positivo". csíular e que

As enzimas que são activadas em condições de activação são testadas neste xnvento xncxuemí arx J. —biorolases, ι t w·' ta i s como aril-sul exemp1o, fos f as tase dase i , peptidases e ses, o x i d a s e s (t a i < pn p exemplo, LDH). u 11 atrases j

19 qU Ϊ PiS^eS } 1 1 p3.3e, T 03 T a X-3.3e"3 1 por ), este rases g!icosidases, hexoamini- (por exemplo-, QNase xidases mistas) ou

KiMase), esi-era-!es~h i d r ogenases

Os substratos para estas evir;imas que contêm ou rótulos detectáveis tais como os cromôforos, ou que estão acoplados a reagentes adicionais, encontram-se enumerados no Quadro 2 a seguir apresentado, que na.o pretende ser uma lista jl imi tativa ou exs us t i va os s e riz i mas e suos t r a t os u t e i s a o p vi ese η τ·e i n ven t o.

As fracçdes produzindo cor que são usadas para deriva™ tizar os substratos atrás mencionados incluem; « e i3 naftilo, « e β alcoxinaf ti lo <por exemplo, e β 4-metoxi naftilo), σ. e B •in- 6-bromonaftilo, o-ni'trofenol, p-nitrofenol, S-bromo-4-clor dolil, bromotimol-ftaleina, fenolftaleina, 4-metilumbeliferil, f .1 uo pesc e i na e ou t r os .

QUADRO £n z i ma í Substrato ar i 1- hi.drola.se h i drocar bone tos subs t i tu í dos ar i Is y 1 í t <&3 Sr su .1 f a tos ss ter ase ácidos car fooxí1icos ramificado: 1i near, sa turados e/ ou insatur, variáveis de C, e se us sa i s (p< buti rato, acetato, c aproa to, c- mi. rista to, 1 surss t*D; píHi .1fi? 1 t<s to valerato, etc.), ést eres de fo qu i na se adenos ina, t r i fos f a t o de adeno: cíclico de adenos i. na. , difosfati m ο η o f o s f a t o cíclico o 0 pi y η o 'íHí £ tetrazôlio de f os f o t £ ros i n«s o.Z/ 1 i pas 0 conj yssdo de ácidos gordos de < de for boi, 3~ fosfato de ti.midi.na , ácidc po1i inos í ni c o- po ϊ ί c i t i d í 1 i c o, á £ j QO po1i aden í1i co- pol iur idí 1 i co ox i dase N,N-dime t i1-p~ • f en i1eno d i am i na HC1 peptida.se oligómeros de am i noác i. dos ta. i s como di- ou t r i ~pep t í deos, na f t i1am i das de am i noác i dos 21

Alguns dos sistemas de substrato enzimático (por exemplo, aminopeptidases) requerem compostos de acoplamento diazo para converter o produto da reacção num cromóforo. Esses corantes diazo adequados incluem ; o sal de 4~amino-2,5-dimeioxi-nitro-azobenzeno diazónio; a o-dianisidina tetraazotizada; o sal do cloreto de 4‘-amino-2',5'-dietoxibenzanilida de zinco diazotizado,' o produto diazotizado do cloreto de 4 benzoilamino-2,5-dimetoxi-anilina de zinco; o sal o-aminoazotolueno diazónio; o cloreto de antraquinona-l-diazónio; o sal de N,N'-dieti 1-4-metoximeta.nilamina diazónio; o sal de 2-am i ηο-4-metox i benzam i da diazónio; a diazo-S-cloro-o-anisidina.; o cloreto de hemizinco do cloreto de S-cloro-2-toluidinodiazònio; o cloreto de hemizinco do cloreto de 5~cloro-4-benzamidO“2-metilbenzeno diazónio; o cloreto de 6-ben-zamido-5-metoxi-m-toIuidina diazónio e outros sais de diazónio conhecidos da técnica da especialidade.

Os modos de realização alternativos do presente invento destinam-se a diferentes maneiras de medir a ocorrência da reacção enzimética, que serve como um índice da activação celular. Num modo de realização preferido, a enzima em causa actua sobre um substrato cromogénico de modo a dar origem a um substrato colorido, que pode ser medido como uma queda na absorção do comprimento de onda adequado do plasma ou meio em que a reacção se efectua. As alteraçSes típicas em 35 /„! 1 de plasma rico em células contendo 30.000 ± 5.000 dê células sanguíneas são um decréscimo na absorção de 0,100 ±0,005 unidades na presença de um agente activador, comparado com um decréscimo de base de 0,001 ±0,0005 unidades (com base numa. absorção de 0,150 unidades) . Esta medição é efectuada, de preferência, usando um leitor de placas padrão com 36 cavidades.

Juntamente com a baixa na. absorção do plasma ou meio de reacção verifica-se um aumento na absorção intracelular devido â criação de um produto de reacçãí A me d i ç ã o da a 1 i- e r a. ç ã o de cor intracelular pode ©fettuar-se juntamenie com a medição atrás referida do fluido da reacção, ou pode efectuar-se como um modo de realização alternativo. A absorção intracelular ê medida, de preferência, explorando cerca de 1000 células numa cavidade com uma "Hitachi Videomicroprobe" CInoue, 8., Videomicroscopy, Plenum Press, »Ί. Y. , 18870 que emite um raio .taser cuja transmissão é bloqueada pela presença de um produco de reacção colorioo no interior da célula. Assim, neste modo de realização, as células "positivas" podem ser enumeradas e efectuadas comparações para diferentes tipos de células, diferenx-es agentes de activação, etc .

Em outros modos de realizaçãoo a activação celular é medida como! uma aIteraçao volumétrica, que nas cèiuias ssnsui neas é tipicamente de cerca de 1 ±0,035'ju; uma alteração detec-tâvel no potencial eléctrico z, medida pela alteração em potencial eléctrico Cem mV) à medida que a particuia se move entre placas de referência apropriadamente carregadas,* uma alteração no campo magnético ou sinal de.s células, medida em minigauss, uma alteração na viscosioade das células medida em unidaoes SveofoergJ ou uma alteração na resistência celular ã "iysis", medida como resistência à disrrupção hipertônica ou hipotônica das membranas celulares Cem mi Iiomoles). .As medições de tais alterações são bem conhecidas da técnica da especialidade. Ver, por exemplo, Methods iη Biochemistry, Vo1umes I-CLII, EIsevier, C1352-1383>. A matriz de suporte a que a substância activadora da célula está ligada pode ser o material de que o recipiente de reacção é constituído. Isto é, o próprio recipiente de reacção, por exemplo, uma placa de microtitulação modificada com 48 ou 98 cavidades pode servir como matriz de suporte, estando a substância activadora ligada ao fundo Ce paredes! da cavidade. Os ^ 2 2?· Λ \ ~~ ~ ·>. ν* 1.' νί Λ ν' materiais de que a matriz de suporte pode ser constituída incluem, mas não se limitam a, estireno òpt-ico virgem, poliestirenos substituídos, acrilonitrilos tais como acrilonitrilo substituído íSAN), policarbonato/ polipenteno ou óxido de sil.ícone. Num outro modo de realização preferido, a matriz de suporte pode ser adicionada separadamente ao recipiente de reacção e compreende materiais que incluem, mas não se limitam a, nutrocelulose, celulose·?, poliestireno, estireno, SAN, pol i carbonato, polipenteno, di vini.1 benzeno ou óxido de si li cone. 0 material constituído por óxido de silicone que é útil para o presente invento é vidro ou quartzo triplamente siliconizado. Uma matriz de suporte preferida ê o poliestireno ópiico virgem que serve como veiculo de reacção. 0 recipiente de reacção em que o teste é efectuado é importante para o êxito do método de ensaio. 0 recipiente deve destinar-se a opiimizar O controlo fisiológico da reacção. Deve permitir uma permuta adequada de gases tais como o oxigénio e o GO..,, um equ ilíbrio s uf i c ienteme n te rápido do pH t un>a OÍ f USão adequada das molécula Cf j uma amf* 1 ci d ! ssipação Cf o ca I o r ΡΓ oveniente de f Ο Π v iS S is? xó 0 n s OU de reac r ôes endôqe nas. As F laças de m i c r otitulaç «w HoUi ciJ ΘΓίί piástiC O ; C o ff» yt* c a vida ide 55 ; òiHrff? conhec i- das da técni ca da. espec i a.l idade, for θ. fil J LA Ϊ Sei das 1 Π ade cío.s para a pr ática d o present e invento, sob r 0 t*udo devi dO i ci al T..ura Od55 paredes late rais. 0 presente i nv ento des f. i na —S0 POV* í· ante 1 t ambém a apresen tar um recipiente de reacção com as seguintes caracfcerístieas; 1) A razão da superTicie (em mml para o volume da reacção (em ,υ 1 > deve ser superior a, ou igual a Õ,í. Assim, por exemplo, prefere-se uma cavidade de microplaca com um diâmetro de 6 mm e um volume de amostra de 30 ;jí .

ião baixas quanto possível. Por exemplo, uma razão entre a. altura do recipiente e a altura da mistura da reacção de 1,1 a 5 é aceitável, sendo preferida uma razão de cerca de 2. (3> o diâmetro da cavidade preferido é de cerca de 6 mm e a 1 r.ura da parede preferida e de cerca de v, o a cerca de 6 mm. Prefere-se sobretudo uma altura de cerca de 1-2 mm.

Num dos modos de realização, o veiculo de reacção tem a configuração de uma placa de microtitulação padrão com 96 cavidades. Num modo de realização preferido o recipiente de reacção tem 48 cavidades (configuração de 8 por 6), equivalente em configuração a metade da placa de microtitulação padrão com 96 cavidades.

Estas configuraçôes de veículos de reacção são particularmente úteis para medir reacçães cromogénicas, uma vez que uma ou duas das placas do presente invento podem ser colocadas em cima de uma placa de 96 cavidades, de qualidade óptica padrão de forma a que a reacção da cor possa ser observada através de um leitor espectrofotométrico ou (colorimétrico) de placas típico, próprio para receber placas de microtituIação padrão com 96 cavidades.

IsãO de c é1u 2 as a SB r em usa das no uma i preparação θ ma π i pu 3. ação m i π i ma. é Xr 1VB. ç ão de var ias 0 nz .1 mas a i· r aves de a na fase de pr SP«i Γ ac ão. Por empl o, a ·*· v» — «s vés da a c t ivaç da s qui vias es QO CJi p r e s e n t e te evitar - zz '„·<r.·.cx *_ cr j. »~h ca £ ícx ! can»»zr uc: çeíj—<»i <at„iau . ·. *«· * ίΖΓ.··*.ίζ·!πι-· λ *_* j ca -^}' ' ‘ ção do sangue, que uma activação adicional no componentes complementares, dos factores de Hageniann, etc., podem conduzir ã libertação de factores que podem activar as enzimas e elevar níveis de base tais que uma activação adicional no teste

não produza um aumento· mensurável na aciivida.de ensimática. Por isso, é importante evitar a coagulação do sangue. 0 contacto excessivo célula-célula causado por centrifugação, calor, ou incubação conduzindo a uma tensão oxidativa vai também interferir no êxito do teste. Assim, é preferidas uma preparação de um só passo de plasma rico em células, tal como o descreve Jaffe, R., e t a1. <J. C1i η.Invest. 53!874-883 <1974)). «4

Uma vez que o invento acabou de ser descrito dê uma. forma genérica, o mesmo sera mais facilmente compreendido recorrendo—se aos exemplos que se seguem, os quais são tornecidos titulo de ilustração, mas não se destinam a ser limitativos presente invento, a não ser que t-al seja espec ΐτ içado.

Exemp 1 o .1

Trataram—se amostras de sangue* com 1 íio de volume de citrato tri-sádico a 3,8% ou com citrato de K, Mg, Na contendo um composto eno—diol, ascorbato, para manter o potencial de oxidação*--redução celular,'a fim de se evitar a coagulação. A totalidade 0 Ό sangue ant i coagulado foi ce nirifug ado pa ra 50 O bte r um total cíe 380 gmin ”. 0 pia SFFf-S r i C O ©FVf cél ulas (C Ci 11* % Kr } fo •í ». í“' A «K » pi rado usa ndo um pi peia de t-Γ cx VI sf e V1 ê^VíC X c?. em piásti CO . 0 substrato enz imá tico, a zu1 de te traz ôli O ntííOiíS gam ík Q0 C ο Π c © nir a cão entre 100 10.000 pmoies, em pia sma com pouca s c ©1 t/í x 0.5} j foi ad i c ionado em 0, .1 a 100 ,ul (concl uiu- se q íJr*~ qXfí<s ntidade Ópt i ma cr * cx de 10 °1 > Pransfe r x rairrse par t es aliquo v 0.3 de 35 ,u 1 de CRP para P= 1 a cas mi c rot i tulaoas d e es i i r eno ópt i co vi rgem com 48 C cã V idades tal c o mo trás foi descr T *«*s I C-O i â.S qbío X S ss t, i nham 1 i ga do previ amente os antigénios.

As células foram incubadas durante períodos de tempo compreendidos entre 2 e 24 a 35° (concluiu-se que 3 horas era o

tempo de recção óptimo para a maioria dos testes). A activação celular foi calculada como actividade enzimética medida como uma quebra na cor do plasma. A absorção foi lida a 34-0 nm ou a 340/3-30 nm num leitor de placas BíoRad Modelo 1500.

Os resultados apôs 3 horas de incubação a 35 ±1° foram os seguintes; A. A absor ζ* Í3 U intracelular méd i a í; '^340 '* de .1 i nf Cinclui ndo células NK, , células T €04 -pos i tivas, cél u 1 as nul- outros Iinfôcitos) aun Dentou de uma base ± 0,008 f·* 1,954 ± 0,051 unidades. B. A absorção do meio reactívo decresceu de cerca de 0,115 unidades <de 1,500 ± 0,001 para 1,385 ±0,002 unidades) durante esta incubação. 0 volume celular aparente para iinfôcitos Ϊ CD4~positi 0 : 00 í ) vos aumentou de 6,4 ±0,2 u para 7,9 ±0,22 ..u (M = 400, p

Exemp1o 2 A fim de se determinar que as células numa. amostra de plasma rico em células respondiam directamente ao reagente activador e para se concluir quais as células que contrxbuirsm para a. resposta, isolaram-se Iinfôcitos humanos de sangue completo, usando uma centrifugação iso-osmótica, isopínica, sobre stractan ' (arabinosi1-galactose) utilizando técnicas de sedimentação de gradiente padrão.

As c e1* U i f o r a m c e n t r i f uga da s Λ 15.000 gm i n a 4 °C i í ugad õ Γ cii rotativa de ângulo fi;< ;θ . As células recupe- m >93% cfe 1infôc itos puros (com Ufií monôc i to ocasiona1). 27

Os linfácitos foram re-suspensos s» 5 ml da maio de Ea.g 1 e e submetidos a um segunda centrifugação de gradiente straetan"fi\

As células foram incubadas nas condições descritas no Exemplo 15 (1) 36 ,ul de suspensão de células contendo 30.000 ± 5.000 células, em meio de Eagle suplementado quer com soro fetal de vitelo a 10%, quer com albumina humana. (2) ISO min de incubação a 35°C, numa placa microtitulada de esiireno óptico virgem com 48 cavidades <3> adicionaram-se ao substrato 10 ;.rl de azul de tetrazôlio 0,1M.

Ubservou-se uma activação enzimatics tanto sob a fopoíS. de aumento no volume aparente oas células, como uma quebra*, eta absorção do meio de incubação. Esc-es resultados indicam que os linfácitos do sangue e não os componentes do soro ou outros tipos de células, foram os responsáveis pela reacção enzimética.

Exemplo 3

Incorporaram—se no teste, tax corno atras se descreveu, anticorpos específicos para várias classes de linfácitos, para permitir a determinação dos tipos de células reactivas. Este modo de proceder baseou-se na observação de que os anticorpos espec í f icos para um tipo par ticu1ar de célula podiam inibi r selectivamente a activação dessa célula, permitindo muito embora a activação de outras células presentes. Usaram-se anticorpos monoclonais comerciais padrão de marcadores dos linfácitos C02, CD3, CD4, CD8, CD.t.1 e CD12. Adicionando o anticorpo â reacção Λ f. »>. das células, o agente activador e o substrato, foi determinado que as respostas de aciivaçSo enzimáiica podiam ser invocadas em células auxi 1 iares *.í..·04v), células .assassinas naturais ’'· *— 0 1 .-..4-.* e

célu 1 A <5 T .1 í "nulas" ( Cí D3+, CD4-, CD8 j CD 11 resu 1iados indicam i que cer t-ÃS cias 303 de célu 1B3 assa ss i nas naturai s f o ram lar game nte resp onsa. V0 í: da p opulaçSo total de célu 1 as 1infoid es a O 03 iinv n i os , tal como se mos t- ra n o Qu adro 1, a le ctinas ! c orno PHA e PWM e s ter de f o r b ol. As cal ulai e r i i róc .i io··; 3 0 ΐδ S? P1B 5^: ueia s n So c onir i bu i Γ S íii PB ? P i. B.3ftíB j OS s resp o s t a s observadas. Exemplo 4 íSQ Γ o 4 ·. 1 na i de te c c âo :0 fcar d ia, 03 resul i- DV ' io •í* t eit·: los suje A fim de se determinar a actividade e especificidade presumíveis do teste em que sSo usaoos alergèmos alimentares e químicos (tal como foram enumerados no Quadro 1) hipsrsensibi1 idade retardada ou de fase tardia, foram determinados de acordo com o relatório feii da frequência oos sintomas usando um questionério paorso de sintomas (Cornei 1 Medicai Ϊndex/CMl'' / 1947, 1962, 1977). fal como a seguir se pode ver, os sujeitos com poucos sintomas tiveram poucas reacçdes. Com F!rogressivamente mais sintomas, notaram-se no teste nómero e xniensioade cada V8Z maiores das reacçdes. i, >t

N2 de sintom i7?. 5 ReacçSes posi t i vas ΟΓ CHI) c em 187 agente S 0 0,6 •f fj. c; i - 10 d ? t ± 0,9 .11 ” 20 Π O *H.‘ / W 4-11 .4« .1 ; Λ 21 - 30 9,2 4· i o > 31 18,4 ± 3,4 o f ara se dei ermin fix F a ef icâc 1 cl dO uso des 4* jjj. 7. }»‘hÍ| em cond içSes c 1 £nicas , e f ec tu ou- SS - um est UdO C ΟΠ t i nua do de p Í. Zí& nu»? grupo de 34 s u j e i tos sm qu es tes foram repe 4· 4 .4 v 3. Lt OS C Offl inte rva lo s cie 6 me ;S0S . No Cl {íi mSíHí ios re p©tidos cor r ela Cl OnO u-ss a redução d o número ΟΘ subst ânc i as a que o indi V 2. QUO reag iu COíVí (jíilta melh o r .i a sv idencia da pe 1 a F& duç U G o intens idade d j~5Ci Ci i ntom F 0 T 0 v* i dos pelo su dei to. Es tes resu J. ΐ· ciCíOS i nci i c am uma for n O **2 © .1 ís ç ísí O ent r e a ΓΘ ac çâ'o a t· ímulos a Π11gé nicos 1 {3 Λ iment a r es ou s~j Ljí 3. fil i cos no teste do p S £5 nte in : ven to cr G Γί’ί Ρ'-τ). râmet- ΓΟ cl i ?? i camen νθ útil.

Exemplo 5 A. Modos de proceder

Rsx*a enêílise inclui dedos de um tox-al de 4-x pe.cienx*es repeti çao de xes x*es Us pac i entes a.os t i ve— submetidos a 102 testes individuais com espalhados por um período de 7-a 32 meses, ram-se do contacto com agentes alimentares e químicos aos quais, nos ensaios iniciais, χ·i verar*; respOsta ρο3itiva . Uhx*ivev^am—se os seguintes dados relativos a cada paciente; momento do teste, género, .idade, número de reacçôes fortes, número de reacçôes i nx>er medi as, número x*ox*al oe reaccdes e resuix*aoos do teste forte, médio, sem reacç&o) para caoa um qos 130 alimenx-os e 30

produi ios qui mi c os. A info rr nação sobre a me • lho p i a du w w. f <TA nfc 0 OS? meses de obs 0 P V í?. Ç iii o consist ii j na diferenç a no o de r 0a cçôes fortes, inie r ui c? d x a. s e totai s para C Cl O cr. 1 Π dividuo sn tr s*5 cX P Γ X m 0 x p a e a última que os testes foram e f e c t uados . Fo i t ambém fôXcxfft X V "•.ada a f Γ 0 :-j L-í έ;1 V*» C 1¾ CÍO a par ec imen vO de ag en te •s de f. d y. ^ especific os, a fim de se idei "5 ti f i car.e co locar PO tn f or dem i*i Cl i tems produros com o maior número de reacçSes. B. Resultados y ç So o i, oba 1 r?ié d i a nas reacçSes posi ti vas entγθ o fc i mo t*03t*0 1 revelou ‘iliíS o número de reacedes rort^es primeiro e o foi reduzido de uma média de 62%. Inicialmente o número médio de reacçSes fortes foi de 23 (em 180). Na. repetição do teste o a 1 i . Π número médio ;ra 18, •*7« .c. ; o Ή0 POOS f o p i :-es se i P ansfor- a.n te s de d esap arecer. :nd o o pa cie nte mudou a !o do ma X Ο Γ número de quase do 1 3 ter ç os do cm a.! r ea c ç Ses i noe r mèd i a s número total de reacçSes fortes (p < 0,00S). Estes resultados provam que se pode esperar uma redução significativa no número de reacçSes fortes por parte dos pacientes que retiram da sua. dieta ou do seu meio amoiente aquelas subsç-âncias a que iniczalmente reagiam positivamente. 0 número total de reacçSes foi também reduzido. Ocorreram frequentemente melhorias clinicas sintomáticas antes da alteração detectâvel na resposta de activação do sis tema i muni tá r i o. A fim de se proceder a um exame das alterações ao longo do tempo, os pacientes que modificaram a sua dieta/meio ambiente foram agrupados em três catagorias,1 os que repetiram os testes entre 7 e 12 meses, entre 13 e 18 meses e passados 13 meses. Us testes repetidos no espaço de 6 meses revelaram essencialmente as mesmas reacções; uma redução modesta (3%) no número total de reacções positivas observadas na repetiçSao do teste. Isto é consistente com a elevada, reproduzibi 1 idade do processo de ensaio do presente invento. A mudança de um estado de hipersensibi1 idade em que as células do sistema imunitário responderam positivamente no teste a antigénios específicos, a um estado de nSo-reactividade a esses antigénios, pareceu requerer vários meses. Us pacientes deste estudo tinham tido tipicamente 3 a 20”"' anos de funções diminuídas <i.e. de hipersensibi1 idade) e múltiplas respostas marginais ou mal sucedidas ao tratamento. 8So necessários estudos mais detalhados e controlados antes de se fazerem afirmações pertinentes àcerca do desaparecimento total das reacções ao longo do tempo. Dados preliminares indicam que a maioria das reacções pode ser completamente eliminada »_om ume. cuidadosa modificação da dieta/meio ambiente do paciente.

Finalmente, as reacções a alimentos e produtos químicos específicos foram classificadas relativamente à frequência das reacções nesta amostra de pacientes. Os alimentos que são mais comuns na nossa dieta e que sSo mais intensamente processados sâ‘o aqueles em relacSao- aos quais as pessoas ficam com frequência sensibilizadas. Os artigos tais como produtos á base de milho, chocolate/cacau, beiadona, açúcar, café e fermento provocam reacções positivas cerca de 70% do tempo. Os produtos lácticos de vaca, incluindo o leite de vaca pasteurizado, a caseína, o queijo e a manteiga provocaram reacções cerca de 30¾ do tempo. A 32

carece dos reagentes imunológicos da sua origem bovina. Pensa-se que a proteína reactiva e não a gordura nos produtos lácticos é a responsável pela bipersensibi1 idade. Também digna de nota foi a frequência de 60% das reacçSes positivas ao fungo Candida alblcans que é conhecida como sendo cUnicamente imunodepressora e tem estado recentemente implicada em várias doenças crónicas. C. Cone .1 usões 0 uso do teste do presente invento permite uma aferição quantitativa consistente dos alimentos e produtos químicos que provocam reacçSes de hiperssnsibi.lida.de em indivíduos sensíveis. Os resultados desse ensaio podem ser traduzidos numa inversão cUnicamente bem sucedida destas reacçSes através da modificação apropriada da dieta/meio ambiente. Os resultados sugerem que estas reacçSes parecem ser adquiridas e estar relacionadas com uma digestão incompleta e um aumento da permeabi1 idade da parede intestinal associados ao consumo repetido e não sio, na maioria dos casos, genéticos. Estes resultados trazem, por isso, esperança àqueles cuja saúde foi afectada adversamente por reacçSes de hipersensibi1 idade aliadas a doenças crónicas e a defesas imuno-lógicas diminuídas.

Muito embora o presente invento tenha sido descrito tendo em mente modos de realização específicos do mesmo, torna-se evidente que ele é susceptível de ulteriores modificações. Este pedido de patente destina-se a proteger quaisquer variaçQes, usos ou adaptaçSes do invento seguindo, em regra, os princípios do mesmo e incluindo os desvios da presente descrição que estejam englobados na prática conhecida ou usual da técnica da especialidade a que o invento pertence e tal como podem ser aplicados ás

Claims (2)

1. ;Q X REIV1NDICAÇÕES cê.IU13 !£· - Método para detectar a activacâo de uma intacta, caracterizado por compreender! Ca> contactar a referida célula com uma substância activadora da célula durante um intervalo adequado, c ti vac tora da célula f <s.z c om se t orne d i spon ive1 par B B reaccSo (b) fornecer um subsx-rato enzimâtico capas de reagir com a reterioa ensima em c*u na rererioa célula incacc-aj e (c) detectar a activacâo da referida célula medindo o produto da referida reacçâo enzima^substrac-Oi. 2§ -· Método para detectar a a.ctivaçâo de um linfôcito intacto por meio de um antigénio especifico, caracterizado por compreender! Ca) contactar o referido linfôcito com o referido antigénio durante um per iodo de tempo suficiente para permitir que ocorra a referida activacSo, em que a referida activaçâo faz com que uma enzima do referido· linfôcito se torna disponível para a reaccãoi <b> fornecer um substrato enzimâtico capaz de reagir com a referida enzima no referido linfôcito intacto,' e (c) detectar a referida a.ciivaçao medindo o produto da referida reacçfto .enzima-substrato. •..'si “ Método para detsctar a sensibilização ιmuno 1 ogica a um antigénio num sujeito, caracterizado por compreender; (a? contactar sujeito com o ciente para sofram a.cti células snaguíneas intactas do referido referido antigénio durante um período sufi-permitir que as referidas células sanguíneas c Ho, em que a referida activacão faz com que uma. enzima, das referidas células se torne disponível para a reacção,* (b> fornecer um substrato enzimático capaz de reagir com a referida enzima nas rereridas células sanguíneas incaccas· e íc) detectar a referida sensibilização imunológica medindo o proouto oa reierxda rea.cçé.c* enzima.' suostrato. 4*«· MíHrt-OdO Gfô SCOrdo C QFíi ^t,·/S. 1 Γ LífFfS dc%3 í*'»Í0X VXrídl Ccfc çSes 1 a do pcHiSSO 3, caracterizado por compreender adicionalmente, antes lai, um passe* em que se liga a referida substância ou antigénio activadores da célula, a uma matriz de suporte. ΕΛ Método de acordo com a Reivindicação 4, aracte- rizado por a referida matriz de suporte ser seleccionada entre o grupo constituído por estireno ôptico virgem, acrilonitrilo substituído, policarbonato, polipenteno, nitrocelulose, celulose e óxido de silício. rizado por virgem. 6ã - Método de acordo com a Reivindicação 5, caracte-referida matriz de suporte ser o estireno ôptico ΓΝ A fS \ -•"o, " vV Ϊ ^ ^ -, .·· Método de acordo Reivindica-’ 7s - Método de acordo com qualquer uma das vSes 1 a 4, carac teri.za.do por a referida enzima ser seleccionada entre o grupo constituído por ari 1-hidrolase, quina.se, lipa.se, fosfatase, bexosam i n i oe.se, p£?px.£ de.se e nuclease. ya “ ríé todo de aco rdo com qualquer uma nas Reivindica c Qes 1 B. 4, caract eri,sado por os ref eridos PB. P es de snz i ma-subs t.· Γ a t.·5 ? sei -em selecc ionados ent re o gr upo cor sti tuí do p or! (a) aril-hidr olase ; hidrocarbo neto sc bst i tu ♦* .mi* 2. UV ; < b) quinase i di fosfato de aden os i na.! (c) quinase trifosfato de a de nos i Π& ; (d) quinase ! monofosfat o de adenosina cí cli C B. j i, ,3 quinase mono f osf a. t o de gu a. nos i na c i c .1 i C â ! < f > ϊ fosfoser in a; (g) quinase ; fosfoti ros I Há (h ? lipase ; conjugado de ácido gordo gl i r s~: 'f oi; ( i ) estera.se Ϊ íâ? ™ *£* ΐΞ? í* íJc forboi; 3 > (. k ) Cl> coes 1. peptidase í oligómero de aminoãeidoj nuclease I ácido pol i inõsínico-pol ici tidí i ico,‘ nuc 1 ease : ác i do po 1 i aden í 1 i c o~po 1 i ur idílico. Sjâ - Método de acordo com qualquer uma das Reivindica-4, caractsrizado por o referido substrato anzimâtico ser cromogenico. lOâ — Método de acordo com a Reivindicação 3, caracte-rizado por o reterzdo substrato enzimax-ico ser cxoret-o oe neotetrazólio. íí.f· - Método de acordo com a Reivindicação í, caracte-rizado por e referida célula ser procariôtica. & C-. ..... ^ nt/ ^ í? η \ V* acordo com a Reivindicação fia sá r eucariótica. 13! - Método de acordo com a Reivindicação 1, caracte rizado por e referida célula ser uma célula sanguínea. 14ã “· Método de acordo com a Reivindicação 13, caracte rizado por e referida célula sanguínea ser um monócito. 15! " Método de acordo com a Reivindicação 13, caracte rizado por e referida célula sanguínea ser um basófilo. ISâ - Método de acordo com a Reivindicação 4, caracte rizado por a referida célula ou linfóciio ser imobilizada sobre referida matriz de suporte. 17! - Método de acordo com qualquer uma das Reivindica çSes 1 a 4, caracterizado por a referida medição ser colorimétri ca, polarimétrica, electrométrica, volumétrica ou potencioméiric 18! - Método de acordo com a. Reivindicação 17, caracte rizado por a referida medição ser colorimétrica. 13! ~ Estojo para oetec&ar a scc-ivsção celular, carac terizado por ser compartimentado para receber em estreito confi namento um ou mais recipientes, e por compreender Ca) um ou mais primeiros recipientes contendo cada um uma substância de activação celular diferente,' Cb> um segundo recipiente contendo um substrato snzimâtico; Cc) uma. matriz de supor te J e Cd) paio menos um vaso de reat çSo. lular, carac r. Γ Í t*0 confi 21)5, Estojo para det-ect-ar a activaçêo cs 1 u 1 a.r, terizado por ser compartimentado para receber em e namenio um ou mais recipientes, e por compreender =‘ Ca) um ou mais primeiros recipientes contendo cada um uma. ma traz de suporte a q u e uma ou mazs substancias actzvadora celulares est-So ligadas! Cfo) um segundo recipiente contendo um substrato enzimâtico,’ Cc) pelo menos um vaso de reaeção.
2. 211 - Estojo de acordo com as Reivindicações 13 ou 20, caracterizado por a referida matriz de suporte compreender um vaso de rsecção. O 4¾ Ήϊ Re i v i nd i c a."· i C X «?. ac tivadora !o pi or éster de 22§ ~ Estojo de acordo com qualquer ur çSes 13 a 21, caracterizado por a referida substância celulav1 ser seleccionaoa entre o grup'O constxx·?. forbol, fito-hemaglutinina, gluteno e sulfito. cacdes 13 231 Estojo de acordo a 21, c a. r a c te r i zado po r com qualquer uma. das Reivindi-a referida substância activado- r«i um antigénio. 24§ — Estojo de acordo com a Reiivindicação 23, carac~ terizado por o referido antigénio ser seleccionado entre o grupo constituído por um peptídeo, um glicopeptideo, uma lipoproteina e um hapteno. Ξ5§ - Estojo de acordo com a Reivindicação 23, caracte-rizado por o referido antigénio ser um alergénio. 26·-! ~ Estojo de acordo com qualquer uma das Reivindicações .13 a 21, caracierizado por o referido substrato enzimático ser seleccionado entre o gupo constituído por hidrocarboneto substituído, difosfato de adenosina, trifosfato de adenosina, monofosfato cíclico de adenosina, monofosfato cíclico de guano-sina, fosfoserina, fos.fotirosina, conjugado de ácido gordo g1i c er o1, és te r de f or bo1, o1i góme ro de am i noâ c i do, âc i do po1i-i nosIn i c o-policiíid í1i c o e á c i do po1i aden í1i c ο-ρο1i u r i d £ 1i c o. 27! - Estojo de acordo com a Reivindicação 26,. caracte-r.izado por o referido substrato enzimático ser monofosfato cíclico de guanosina. 23! - Estojo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 13 a 21, caracterizado por a referida, matriz de suporte ser seleccionada entre o grupo constituído por estireno õpfcico v i rgem, ac r i 1 on i fc r i 1 o subs t i tu ído, po 1 i carbonato, po 1 i psn i-eno, nitrocelulose, celulose e óxido de silício. 23ã - Estojo de acordo com a Reivindicação 28, caracterizado por a referida matriz de suporte ser estireno ôptico virgem. 30s - Estojo de acordo coro qualquer úma das Reivindicações 1.3 a 21, caracterizado por o referido vaso de reacção compreender uma placa-de microtitulação. 31-1 - Placa plástica de micro ti tu 1 ação, útil para executar o método de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 4, caracterizada por compreender depressões com um diâmetro de 40 ^ .= s ο Γ. :;· \ - >- * .«v cerca de e 6 mm. r i zada p>: constitua e po 1 i c a.v rizada p>: Lisboa, 6 mm e com paredes com uma altura entre cerca de 0,5 mm ?r o • .-I Placa de acordo com a Reivindicação 31, caracte- referido plástico ser seleccionado entre grupo [do por estireno ôptico virgem, acrilonitrilo substituído oonac-o. ·." ir.: *“* Placa oe acovido com a Reivindicação dz1, caracte™ r o r e f e r i do piás t i c o ser ss t i r eno óp t i c o v i r gem. í5 de Outubro de 1930

   J. PEREIRA DA CRÚ2 Agente Oficial da Propriedade Industrial BUA VICTOR CORDON, 10-A 3? ,1200 LISBQA