PT91877A

PT91877A - PROCESS OF PREPARATION OF CR2 REACTIVE POLYPEPTIDES FOR INHIBITION OF EPSTEIN-BARR VIRUS INFECTION (EBV)

Info

Publication number: PT91877A
Application number: PT9187789A
Authority: PT
Inventors: Glen R Nemerow; Neil R Cooper
Original assignee: Scripps Clinic Res
Priority date: 1988-10-03
Filing date: 1989-10-02
Publication date: 1990-04-30
Also published as: AU4341189A; WO1990004176A1; GR890100631A; EP0436626A1

Description

-2- 69 96569-95

Patente N2. 91 S77 âmbito Técnico 0 presente invento refere-se à região de ligação CR2 do vírus de Epstein — Barr (VEB) e aos polipéptidos que se ligam ao CR2 e inibem a infecção de uma célula B por VEB.Patent N2. The present invention relates to the CR2 binding region of Epstein-Barr virus (EBV) and polypeptides which bind to CR2 and inhibit EBV-B infection of a B cell.

Antecedentes 0 vírus de Epstein - Barr (VEB) , um vírus de herpes humano, é o agente causador da infecção mononucleose (Henle, B., et al, Proc. Nat1. Acad. Sei.. 59:94-101, 1968) , uma doença limfoproliferativa benigna. Sob certas condições, a infecção por VEB pode -facilitar o desenvolvimento de doenças malignas incluindo carcinoma nasofaríngico (HENLE, W., Science 157:1064-1065, 1967, Raab-Traub, N., et al, Int. 3. Câncer 39:25—29. 19SS7) , lin-Foma de Burkitt (Be—The, B., et al, Advances in Comoarative Leukemia Research. Eds., B.S. Yohn e J.R. Blakeslee, Elsevier, NY, 1981) e o síndroma lin-foproliferativo ligado a X (Harada, S., et al, J. Immunol. 129:2532—2535, 1932). O VEB é também um patogénio oportunista frequentemente associado com pacientes imunocomprometidos recebendo alo-enxertos ou com o síndroma da imuno-def ici5?ncia adquirida (SIBA) (Pelicci, P.S., et al, J. Exp. Med. 164:2049—2060, 1986 e Yarchoan, R., et al, J. 01in. Invest. 78:439-447, 1986 e Montagníer, L., et al, Science 225:63-66. 1984). 0 VEB é único, entre os vírus de herpes humano, no seu tropismo selectivo pelos linfócitos B e células epiteliais. Isto é largamente devido à expressão na membrana destas células, de um receptor específico de VEB, o qual tem mostrado ser antigénicamente, estruturalmente e funcionalmente idêntico à glicoproteína que liga os fragmentos complementares C3d/CSdg (Fingeroth, J.B., et al, Proc. Natl. Acad. Sei.. USA 81:4510-4516, 1984 e Nemerow, G.R., et al, J. Virol. 55:347-351, 1985 e Frade, R., et al, proc. Natl. Acad Sei.. USA 82:1490-1493, 1985 e Mold, C., et al, J. Immunol. 136:4140-4145, 1986). Esta estrutura,Background Epstein-Barr virus (EBV), a human herpes virus, is the causative agent of mononucleosis infection (Henle, B., et al., Proc Natl Acad Sci., 59: 94-101, 1968) , a benign limphroproliferative disease. Under certain conditions, EBV infection may-facilitate the development of malignancies including nasopharyngeal carcinoma (HENLE, W., Science 157: 1064-1065, 1967, Raab-Traub, N. et al., Int. : 25-29, 19SS7), Burkitt's Lin-Foma (Be-The, B., et al, Advances in Leukemia Research Eds., BS Yohn and JR Blakeslee, Elsevier, NY, 1981) and lin- X-linked (Harada, S., et al., J. Immunol., 129: 2532-2535, 1932). EBV is also an opportunistic pathogen frequently associated with immunocompromised patients receiving allografts or acquired immunodeficiency syndrome (SIBA) (Pelicci, PS, et al., J. Exp. Med. 164: 2049-2060 , 1986 and Yarchoan, R., et al., J. Invincible 78: 439-447, 1986 and Montagnier, L., et al., Science 225: 63-66, 1984). EBV is unique among human herpes viruses in their selective tropism by B lymphocytes and epithelial cells. This is largely due to the expression on the membrane of these cells of a specific EBV receptor which has been shown to be antigenically, structurally and functionally identical to the glycoprotein binding the C3d / CSdg complementary fragments (Fingeroth, JB, et al., Proc. , USA, 81: 4510-4516, 1984 and Nemerow, GR, et al., J. Virol 55: 347-351, 1985 and Frade, R. et al., Proc Natl Acad Sci. USA 82: 1490-1493, 1985 and Mold, C., et al., J. Immunol., 136: 4140-4145, 1986). This structure,

conhecida como CR2 (CB21), é uma glicoproteína de membrana de 145 kBa (lida, K., et al, J. Exd . Med. 158:1021-1033, 1983 e Heis, J.J., et al, Proc. Natl. Acad. Sei.. USA 81:881-885, 1984). A clonagem molecular de CR2 tem revelado que todo o domínio extracelular deste receptor é constituído por um arranjo em tandem de elementos que se repetem, que compartilha uma sequência -3- 69 965known as CR2 (CB21), is a 145 kBa membrane glycoprotein (see, K., et al., J. Med. 158: 1021-1033, 1983 and Heis, J., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 881-885, 1984). Molecular cloning of CR2 has revealed that the entire extracellular domain of this receptor is comprised of a tandem array of repeating elements, which shares a sequence

Patente Ν2. 91 S77 significativamente similar à de várias outras proteínas da membrana e do plasma de ligação ao complemento e ao não complemento (Moore, M.P., et al, Proc, Natl. Acad. Sei., USA 84:9194-9198, 19S7 e Weis, J.J., et al, 3, E;<p. Med. 167 : 1047-1066, 1988) .Patent Ν2. 91 S77 significantly similar to that of several other membrane and complement-binding and non-complement-binding proteins (Moore, MP, et al, Proc Natl Acad Sci USA 84: 9194-9198, 19S7 and Weis, JJ, et al., 3, E; < p. Med. 167: 1047-1066, 1988).

Em adiçSo à sua dupla função de ligação ao ligante, o CR2 está envolvido na via de activação das células B (Nemerow, B.R., et al, Supra, 19S5 e Chagelian & Fearnon, 3 . Exp. Med. 163:101- -115, 1986 e Wilson, et al, Blood 66:884-889, 1985, e Frade, R., et al, Proc. Natl. Acad. Sei.. USA 88:1490-1493, 1985, e Melchers, et al, Nature 317:864-867, 1985). Esta propriedade pode desempenhar um papel crucial na preparação da célula para transformação por VEB. A principal proteína do envelope do VEB, designada por gp350/SS0, é o alvo primário do anticorpo neutralizante, no homem e em primatas sub-humanos (Thorley-Lawson & Geilinger, PNA5 77:5307-5311, 1980). A Gp350/SS0 é também o ligante que intervem na união do vírus a ORE, nas células B (Nemerow, 6., et al, 3. Virol. 61:1416-1480, 1987 e Tanner, 3., et al, Cell 50:803-813, 1987) e como tal representa uma das poucas gl icoproteínas do vírus do herpes humano para as quais foi identificada uma função de ligação ao receptor. A ligação do VEB, via gp350/SS0, a CRE é seguida de endocitose do vírus, retirada do envelope e transformação (Nemerow, 6.R., et al, Víroloav 138:186-198, 1984 e Tedder, T.F., et al, 3. Immunol. 137:1387-1391, 1986 e Tanner, et al, Supra, 1987). A comparação das sequências de aminoácidos de gp350/S80 (Beisel, C,, et al, 3. Virol. 54:665-674, 1985 e Baer, R., et al, Nature 310:807-811. 1984) e C3dg (Be-Bruijn, M.H.L., et al, Proc. Natl. Acad. Sei.. USA 88:708-718, 1985) mostra que contêm duas regiões de resíduos de aminoécido altamente similares (Nemerow, G.R., et al, Supra, 1987, e Tanner, et al, Supra, 1987). A primeira região consiste em cinco aminoácidos idênticos, enquanto que a segunda compreende uma região em C3d (LYNVEA) que foi referida (por Lambris, 3.D., et al, Proc. Natl. Acad. Sei.. USA 88:4835-4239, 1985) como estando envolvida na ligação de CR2 por meio de C3d (Nemerow, 6.R., et al, Supra, 1987).In addition to its dual binding function to the linker, CR2 is involved in the pathway of activation of B cells (Nemerow, BR, et al, Supra, 19S5 and Chagelian & Fearnon, 115, 1986 and Wilson, et al., Blood 66: 884-889, 1985, and Frade, R., et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 1490-1493, 1985, and Melchers et al. , Nature 317: 864-867, 1985). This property may play a crucial role in preparing the cell for transformation by EBV. The major envelope protein of the EBV, designated gp350 / SS0, is the primary target of the neutralizing antibody in man and in subhuman primates (Thorley-Lawson & Geilinger, PNA577: 5307-5311, 1980). Gp350 / SS0 is also the ligand that mediates the binding of the virus to ORE in B cells (Nemerow, 6., et al, 3. Virol. 61: 1416-1480, 1987 and Tanner, 3., et al., Cell 50: 803-813, 1987) and as such represents one of the few glycoproteins of the human herpes virus for which a receptor binding function has been identified. EBV binding, via gp350 / SS0, to CRE is followed by virus endocytosis, envelope withdrawal and transformation (Nemerow, 6.R. et al., Viroloav 138: 186-198, 1984 and Tedder, TF, et al. , 3. Immunol. 137: 1387-1391, 1986 and Tanner, et al., Supra, 1987). Comparison of the amino acid sequences of gp350 / S80 (Beisel, et al, 3. Virol 54: 665-674, 1985 and Baer, R. et al., Nature 310: 807-811, 1984) and C3dg (Be-Bruijn, MHL et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 708-718, 1985) shows that they contain two regions of highly similar amino acid residues (Nemerow, GR, et al., Supra, 1987 , and Tanner, et al., Supra, 1987). The first region consists of five identical amino acids, while the second comprises a region at C3d (LYNVEA) which has been reported (by Lambris, 3.D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4835- 4239, 1985) as being involved in the binding of CR2 by means of C3d (Nemerow, 6.R., et al., Supra, 1987).

DESCRIC30 SUMARIA D0 INVENTO 0 presente invento refere-se à preparação de polipéptidos -4- 69 965SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to the preparation of polypeptides

Patente N2. 91 S77 reactivos a CR2, que correspondem a resíduos de aminoácidos na região amino-terminal da gp350/220 e à truncagem e substituição de análogos destes polipéptidos. Um polipéptido reactivo a CR2 compreende não mais do que cerca de 50 resíduos amino e incluí uma sequência de resíduos de aminoácidos que corresponde, pelo menos, a cerca de 5 resíduos, contíguos, da sequência linear da gp350/220 de VEB e incluí pelo menos um dos resíduos 21-24 (EDP6) ou 25-27 (FFN). □s agregados polipeptídicos reactivos a CR2, compreendendo polipéptidos reactivos a CR2 unidos entre si ou a um veículo, ligam-se a CR2 no sítio de ligação do VEB, inibindo a infecção das células B por VEB. Os agregados, como ligantes de CR2, também encontram utilização como imunopotenciadores para aumentar a activação das células B. São também proporcionados processos de diagnóstico e de tratamento.Patent N2. 91 S77 which correspond to amino acid residues in the amino-terminal region of gp350 / 220 and truncation and substitution of analogs of these polypeptides. A CR2-reactive polypeptide comprises no more than about 50 amino residues and includes a sequence of amino acid residues corresponding to at least about 5 contiguous residues of the linear sequence of VEB gp350 / 220 and includes at least one of residues 21-24 (EDP6) or 25-27 (FFN). CR2-reactive polypeptide aggregates, comprising CR2-reactive polypeptides attached to one another or to a carrier, bind to CR2 at the EBV binding site, inhibiting EBV B-cell infection. Aggregates, such as CR2 ligands, also find use as immunopotentiators to increase B cell activation. Diagnostic and treatment methods are also provided.

DESCRIgãO SUMARIA DOS DESENHOS A FISURA 1 é um desenho que ilustra a sequência primária e a estutura secundária prevista para a região N-terminal de gp350/220. (Painel superior) Os resíduos de aminoácidos enquadrados indicam os aminoácidos similares aos de C3dg. As lacunas na sequência de gp350/220 -foram inseridas para maximizar a similaridade. (Painel inferior) A hidrofilicidade e hidrofobicidade relativa a cada resíduo é indicada pelo comprimento e direcção das barras verticais, A estrutura secundária prevista para a região N-terminal de gp350/220 (Chou-Fasman), foi obtida por um programa gerado por computador (UWGCG). A FIGURA 2 é um gráfico que ilustra a ligação de CR2 purificado a péptidos reactivos a CR2. Os péptidos sintéticos possuindo graus variados da similaridade de sequência (resíduos sublinhados) com a C3dg foram revestidos em placas de 96 cavidades. A ligação a CR2 das cavidades revestidas com péptidos foi determinada por ELISA. A FIGURA 3 é um gráfico que ilustra a inibição da ligação de CR2 a VEB, por péptidos sintéticos. O VEB purificado, ou como controlos, R-MuLV ou BSA foram revestidos em cavidades ELISA. Avaliou-se por ELISA a ligação de CR2 isolado 69 965SUMMARY OF THE DRAWINGS Fissure 1 is a drawing illustrating the primary sequence and the secondary structure provided for the N-terminal region of gp350 / 220. (Top panel) Framed amino acid residues indicate amino acids similar to those of C3dg. Gaps in the gp350 / 220-sequence were inserted to maximize similarity. (Lower panel) The hydrophilicity and hydrophobicity relative to each residue is indicated by the length and direction of the vertical bars. The secondary structure predicted for the N-terminal region of gp350 / 220 (Chou-Fasman) was obtained by a computer-generated program (UWGCG). FIGURE 2 is a graph illustrating the binding of purified CR2 to CR2-reactive peptides. Synthetic peptides having varying degrees of sequence similarity (underlined residues) with C3dg were coated onto 96-well plates. The CR2 binding of the peptide coated wells was determined by ELISA. FIGURE 3 is a graph illustrating the inhibition of binding of CR2 to EBV by synthetic peptides. Purified EBV, or as controls, R-MuLV or BSA were coated in ELISA wells. The binding of CR2 isolated 69 965

Patente N2. 91 377 sózinho ou de CRS que tenha sido pré-incubado com 500 nM de péptidos sintéticos. A FIGURA 4 é uma série de seis gráficos que mostram que as microesferas fluorescentes revestidas com os péptidos reactivos a CRS e com gp350/SE0 se ligam às células Raji CRS- positivas mas não às células B95-8 CRS-negativas. A ligação das microesferas comportando IHLTGEDPGFFNVE (Painel A,B) , gp350/EE0 recombinante (Painel C,D) ou LT5GTP5GCENISGA (Painel E,F), a células B Raji CRS-positivas (A,C,E) ou células B95-S CRS-negativas ÍB,D,F>, foi determinada por citometria de fluxo. A FIGURA 5 é uma série de dois gráficos que mostram que o complexo albumina-péptido sintético reactivo a CRS inibe a ligação das microesferas fluorescentes, comportando gp350/SSG ou C3dg, às células B Raji. As células B Raji foram pré--incubadas com quantidades variáveis de complexosPatent N2. 91 377 alone or CRS that has been preincubated with 500 nM of synthetic peptides. FIGURE 4 is a series of six graphs showing that the fluorescent microspheres coated with the CRS and gp350 / SE0 reactive peptides bind to CRS-positive Raji cells but not to CRS-negative B95-8 cells. Binding of the microspheres comprising IHLTGEDPGFFNVE (Panel A, B), recombinant gp350 / EE0 (Panel C, D) or LT5GTP5GCENISGA (Panel E, F) to CRS-positive Raji B cells (A, C, E) or B95- S CRS-negative Î »B, D, F >, was determined by flow cytometry. FIGURE 5 is a series of two graphs showing that the CRS-reactive synthetic albumin-peptide complex inhibits binding of the fluorescent microspheres, bearing gp350 / SSG or C3dg, to the Raji B cells. Raji B cells were preincubated with varying amounts of complexes

HTLGEDPGFFNVEC-BSA (._.) ou KCKWTLTSGTPSGCE-BSA (Δ-------Δ) , antes da adição das microesferas fluorescentes revestidas com gp350/SE0 (Painel A) ou das microesferas revestidas com C3dg (Painel B). A ligação às células foi quantificada por citometria de fluxo. A FIGURA 6 é um gráfico que mostra que o complexo albumina-péptido reactivo a CRS inibiu a transformação das células B do sangue periférico (PBL) . As PBL humanas foram pré-incubadas com 0,1, 1,0 ou 10,0 J*g do conjugado péptido-BSA antes da adição de VEB. As células foram então lavadas e cultivadas na presença de ciclosporina A durante 14 dias, antes de enumerar o número de células B transformadas.HTLGEDPGFFNVEC-BSA (._.) Or KCKWTLTSGTPSGCE-BSA (Δ ------- Δ) prior to the addition of the gp350 / SE0 coated panels (Panel A) or the C3dg coated microspheres (Panel B). Binding to the cells was quantified by flow cytometry. FIGURE 6 is a graph showing that the CRS-reactive albumin-peptide complex inhibited the transformation of peripheral blood B cells (PBL). Human PBLs were preincubated with 0.1, 1.0 or 10.0æg of peptide-BSA conjugate prior to the addition of EBV. The cells were then washed and cultured in the presence of cyclosporin A for 14 days, before enumerating the number of transformed B cells.

DESCRIÇÃO DETALHADA DQ INVENTO A região de ligação a CRS do Vírus de Epstein Barr (VEB) foi agora determinada. A região de ligação ao receptor tem sido localizada nos resíduos S1-S7 (EDGGFFN). Contudo, foi também determinado que os polipéptidos que correspondem substãncialmente a 5 resíduos contíguos na sequência linear de gp350/SS0 e que incluem pelo menos um dos resíduos S1-S4 (EDPG) ou dos resíduos S5-S7 (FFN), e seus análogos, também se ligam ao receptor. Os agregados polipeptídicos reactivos a CRS, compreendendo pelo menos -6- 69 965DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The Epstein Barr Virus (EBV) CRS binding region has now been determined. The receptor binding region has been localized at residues S1-S7 (EDGGFFN). However, it has also been determined that polypeptides which substantially correspond to 5 contiguous residues in the linear sequence of gp350 / SS0 and which include at least one of the residues S1-S4 (EDPG) or residues S5-S7 (FFN), and the analogs thereof, also bind to the receptor. The CRS-reactive polypeptide aggregates, comprising at least -6- 69 965

Patente N2. 91 S77 S polipéptidos reactivos a GRE unidos entre si ou a um veículo, ligam-se a CRE no sítio de ligação de VEB, inibindo a infecção das células B por VEB. Proporcionam-se composições e métodos baseados na aptidão dos péptidos de se ligarem a CRE e a estimularem, e de mimetizarem o sítio de ligação do VEB.Patent N2. Polypeptides reactive to GRE bound to one another or to a carrier bind to CRE at the EBV binding site, inhibiting B cell infection by EBV. Compositions and methods based on the ability of the peptides to bind to CRE and to stimulate and mimic the EBV binding site are provided.

Todos os resíduos de aminoácidos aqui identi-ficados estão na configuração natural L. Be acordo com a nomenclatura Standard dos polipéptidos, 3. Biol. Chem.« £43:3557-59 (1969), as abreviaturas dos resíduos de aminoácidos são como se mostra na seguinte Tabela de Correspondência:All amino acid residues identified herein are in the natural L configuration. According to the standard nomenclature of the polypeptides, 3. Biol. Chem., 43: 3557-59 (1969), the abbreviations of the amino acid residues are as shown in the following Correspondence Table:

TftBELA BE CORRESPONDÊNCIA _SIMBQLO_ _AMINOACIDQ 1- Y Tir L—t irosina 6 Bli glicina F Fen L—fenilalanina M Met L—metionina A Ala L-alanina S Ser L-ser i na I Ile L-isoleucina L Leu L-leucina T Tre L-treonina V Vai L-valina P Pro L-prolina K Lis L-lisina H His L-histidina Ω Gin L-glutamina E Glu L-écido glutêmico W Tri L-triptofano R Arg L-arginina B Asp L-Acido Aspártico N Asn L-asparagina C Cis L-cisteínaTFTBELA BE CORRESPONDENCE _SIMBQLO_ _AMINOACIDQ 1- Y Tir L-trososine 6 Bli glycine F Fen L-phenylalanine M Met L-methionine A Ala L-alanine S Ser L-serine I Ile L-isoleucine L Leu L-leucine T Tre L-threonine V Go L-valine P Pro L-proline K Lys L-lysine H His L-histidine Ω Gin L-glutamine E Glu L-glutamic acid W Tri L-tryptophan R Arg L-arginine B Asp L-Aspartic Acid N Asn L-asparagine Cys L-cysteine

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Polipéptidos Reactivos a CREReactive Polypeptides to CRE

Um polipéptido reactivo a CRE do presente invento contêm pelo menos 5 resíduos de aminoácidos e não ma is do que cerca de 50, mais usualmente menos do que cerca de 35 e de preferência menos do -7- 69 965A CRE-reactive polypeptide of the present invention contains at least 5 amino acid residues and not more than about 50, more usually less than about 35, and preferably less than about 69, 965

Patente N2. 91 S77 que cerca de 25 resíduos de aminoácidos. Apesar da limitação dos tamanhos menores dos polipéptidos ser importante para alcançar as propriedades funcionais do polipéptido, a limitação dos tamanhos maiores não é funcional. Melhor dizendo, o limite é uma questão de conveniência que providencia a síntese mais simples dos péptidos por técnicas químicas. Em adição, um polipéptido do presente invento é caracterizado pelas suas sequências de resíduos de aminoácidos e por novas propriedades funcionais.Patent N2. 91 S77 than about 25 amino acid residues. Although limiting the smaller sizes of the polypeptides is important to achieve the functional properties of the polypeptide, limiting the larger sizes is not functional. In other words, the limit is a matter of convenience that provides the simplest synthesis of peptides by chemical techniques. In addition, a polypeptide of the present invention is characterized by its amino acid residue sequences and novel functional properties.

Um polipéptido reactivo a CR2 incluí uma sequência de resíduos de aminoácidos que corresponde substancialmente a pelo menos cerca de 5, mais usualmente 7, resíduos contíguos da sequência linear de gp350/220 de VEB e que inclui pelo menos um dos resíduos 21-24 (EDPG) ou 25-27 (FFN) de gp350/220. Numa das concretizações preferidas, o polipéptido reactivo a CR2 corresponde substancialmente a uma sequência de resíduos de aminoácidos, representada por uma fórmula seleccionada do grupo constituído por: IHLTBEDPBFFNAE; IHLTGEDPGFFNVQ; IHLTBEDPBFFN; IHLTGEDPG; e EDPBFFN.A CR2-reactive polypeptide includes a sequence of amino acid residues corresponding substantially to at least about 5, more usually 7, contiguous residues of the EBV gp350 / 220 linear sequence and which includes at least one of residues 21-24 (EDPG ) or 25-27 (FFN) of gp350 / 220. In one preferred embodiment, the CR2-reactive polypeptide substantially corresponds to a sequence of amino acid residues, represented by a formula selected from the group consisting of: IHLTBEDPBFFNAE; IHLTGEDPGFFNVQ; IHLTBEDPBFFN; IHLTGEDPG; and EDPBFFN.

Noutra concretização preferida, o polipéptido reactivo a CR2 corresponde, substancialmente, a uma sequência de resíduos de aminoácidos representada por uma fórmula seleccionada do grupo constituído por: IHLTGEBPSFFNAE; IHLTGEDPGFFNVQ; IHLTGEDPGFFN5 EBPGFFN; DPGFFNVEIPE; PBFFNVEIPE; PFFNVEIPE; GFFNVEIPE; e FNNVEIPE. Noutra concretização, os polipéptidos correspondem a uma sequência representada pelas seguintes fórmulas: IHLTGEDPGFFNVEIPE; IHLTGEDPGFFNVE; IHLTGEBPGFFNAE; IHLTBEDPGFFNVQ; IHLTGEDPGFFN; IHLTGEDPG; EDPGFFN; EDPGFFNVE; EDPGFFNVEIPE; DPGFFNVEIPE; PGFFNVEIPE; PFFNVEIPE; GFFNVEIPE; e FNNVEIPE.In another preferred embodiment, the CR2-reactive polypeptide substantially corresponds to a sequence of amino acid residues represented by a formula selected from the group consisting of: IHLTGEBPSFFNAE; IHLTGEDPGFFNVQ; IHLTGEDPGFFN5 EBPGFFN; DPGFFNVEIPE; PBFFNVEIPE; PFFNVEIPE; GFFNVEIPE; and FNNVEIPE. In another embodiment, the polypeptides correspond to a sequence represented by the following formulas: IHLTGEDPGFFNVEIPE; IHLTGEDPGFFNVE; IHLTGEBPGFFNAE; IHLTBEDPGFFNVQ; IHLTGEDPGFFN; IHLTGEDPG; EDPGFFN; EDPGFFNVE; EDPGFFNVEIPE; DPGFFNVEIPE; PGFFNVEIPE; PFFNVEIPE; GFFNVEIPE; and FNNVEIPE.

Verificou-se que uma série de análogos dos resíduos 16-32 de gp350/220 <IHLTGEDPGFFNVEIPE) exemplares de truncação e substituição se ligavam a CR2, como descrito em detalhe nos exemplos. Estes estudos localizaram a região de ligação ao receptor de VEB gp350/220 em sete aminoácidos, os resíduos 21-27 (EDPGFFN).A series of analogs of the truncation and substitution residues 16-32 of gp350 / 220 were found to bind to CR2, as described in detail in the examples. These studies located the gp350 / 220 EBV receptor binding region in seven amino acids, residues 21-27 (EDPGFFN).

Os resíduos de aminoácidos presentes num polipéptido do invento, além de uma sequência correspondente a uma sequência aqui -8- β9 965The amino acid residues present in a polypeptide of the invention, in addition to a sequence corresponding to a sequence herein -9- 965

Patente Ν2. 91 877 descrita anteriormente, podem ser quaisquer resíduos que não afectem materialmente as caracteristicass básicas e novas de um polipéptido, como irá ser discutido aqui a seguir. Tais resíduos adicionais são usualmente adicionados a um ou a ambos os terminais de um polipéptido descrito e podem incluir repetições e repetições parciais de uma sequência polipéptidica ou de resíduos contíguos da sequência proteica de gp350/220.Patent Ν2. 91 877 described above may be any residues which do not materially affect the basic and novel characteristics of a polypeptide, as will be discussed hereinafter. Such additional residues are usually added to one or both ends of a described polypeptide and may include partial repeats and repeats of a polypeptide sequence or residues contiguous with the gp350 / 220 protein sequence.

Uma sequência polipéptidica reactiva a CR2, do presente invento, possuí uma sequência de resíduos de aminoácidos que corresponde a uma porção da sequência de resíduos de aminoácidos de gp350/220. Assim, um polipéptido reactivo a CR2 do presente invento não precisa de ser idêntico à sequência de resíduos de aminoácidos de gp350/220. Apesar de os análogos péptidicos possuindo substituições que reduzem substSncialmente a ligação a CR2, poderem induzir anticorpos que são úteis nas aplicações de diagnóstico, usualmente os análogos péptidicos reterão a actividade de ligação a CR2. Portanto, um polipéptido reactivo a CR2 pode ser sujeito a várias modi-ficações, tais como inserções, deleções e substituições, quer conservativas quer não conservativas, proporcionando tais modificações certas vantagens no seu uso e manutenção dos atributos funcionais, importantes para um uso part icular«A CR2 reactive polypeptide sequence of the present invention has an amino acid residue sequence corresponding to a portion of the amino acid residue sequence of gp350 / 220. Thus, a CR2-reactive polypeptide of the present invention need not be identical to the amino acid residue sequence of gp350 / 220. Although peptide analogues having substitutions that substantially reduce binding to CR2 may induce antibodies that are useful in diagnostic applications, usually peptide analogs will retain CR2 binding activity. Therefore, a CR2 reactive polypeptide may be subject to various modifications, such as insertions, deletions and substitutions, whether conservative or non-conservative, such modifications providing certain advantages in their use and maintenance of functional attributes, important for particular use «

As substituições conservativas são aquelas em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo biologicamente similar. Exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo hidrofóbico tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro, ou a substituição de um resíduo polar por outro tal como, entre a arginina e a lisina, entre os ácidos glutãmico e aspártico ou entre a glutamina e a asparagina e semelhantes. O termo "substituição conservativa" inclui também o uso de um aminoácido substituído, no lugar de um aminoácido parente não substituído, desde que um tal polipéptido também exiba a requerida actividade de ligação.Conservative substitutions are those in which one amino acid residue is replaced by another biologically similar residue. Examples of conservative substitutions include the replacement of a hydrophobic residue such as isoleucine, valine, leucine or methionine on the other, or the substitution of a polar residue for another such as, between arginine and lysine, between glutamic and aspartic acids or between glutamine and asparagine and the like. The term " conservative substitution " also includes the use of a substituted amino acid, in place of an unsubstituted parent amino acid, so long as such a polypeptide also exhibits the required binding activity.

Quando um polipéptido do presente invento possuí uma sequência que não é idêntica a uma porção da sequência de gp350/220 devido a terem sido feitas uma ou mais eliminações, inserções ou substituições conservativas ou não conservativas, usualmente não -9- 69 965When a polypeptide of the present invention has a sequence that is not identical to a portion of the sequence of gp350 / 220 because one or more conservative or non-conservative deletions, insertions or substitutions have been made, usually non-

Patente NS. 91 877 mais que cerca de 20% e mais usualmente não ma is do que 10% dos resíduos de aminoácidos diferem. Como utilizado aqui, sequências que “correspondem substêncialmente" a uma sequência específica são aquelas que possuem não mais do que 10% de eliminações, inserções ou substituições. Claro que os resíduos adicionais podem ser adicionados em ambas as extremidades. Como descrito préviamente, os resíduos adicionais podem corresponder a resíduos contíguos na sequência linear de gp350/SS0, a repetições da sequência ou podem não estar relacionados com gp350/S20.Patent NS. 91 877 more than about 20% and more usually not more than 10% of the amino acid residues differ. As used herein, sequences which "substantially correspond " to a specific sequence are those having not more than 10% deletions, insertions or substitutions. Of course additional waste can be added at both ends. As previously described, the additional residues may correspond to contiguous residues in the gp350 / SS0 linear sequence, to repeats of the sequence or may be unrelated to gp350 / S20.

Um ou mais resíduos podem ser adicionados, usualmente na extremidade carboxilo, com o propósito de providenciar um “ligante" através do qual os polipéptidos deste invento possam estar operativa e convenientemente ligados uns aos outros ou a outro polipéptido, compreendendo um polipéptido epitopo de uma célula T ou um veículo. Os veículos e os polipéptidos epitopos da célula T que encontram uso com os polipéptidos deste invento são de seguida descritos. Os ligantes dos resíduos de aminoácidos são usualmente pelo menos um resíduo e podem ser 40 ou mais resíduos, mais geralmente 1 a 10 resíduos. Os resíduos de aminoácidos típicos usados para a ligação são tirosina, cisteína, lisina, ácido aspártico e glutêmico, ou semelhantes. Em adição, uma sequência polipéptidica deste invento pode diferir da sequência natural, efectuando—se a modificação por acilação do terminal ΝΗε, por exemplo, acetilação, carboxilamidação, por exemplo, amónia, metilamina, etc.One or more residues may be added, usually at the carboxyl end, for the purpose of providing a " whereby the polypeptides of this invention may be operably and conveniently attached to one another or to another polypeptide, comprising a T-cell epitope polypeptide or a carrier. The T-cell epitope vehicles and polypeptides that find use with the polypeptides of this invention are described below. Binders of the amino acid residues are usually at least one residue and may be 40 or more residues, more generally 1 to 10 residues. Typical amino acid residues used for binding are tyrosine, cysteine, lysine, aspartic and glutamic acid, or the like. In addition, a polypeptide sequence of this invention may differ from the native sequence, the modification being effected by acylation of the εε terminal, for example, acetylation, carboxylamidation, for example, ammonia, methylamine, etc.

Como descrito nos exemplos, uma série de péptidos sintéticos reactivos a CR2 correspondendo a regiões de gp350/220 homólogas a C3dg, foi usada em diversos sistemas de ensaio independentes para determinar o seu papel potêncial na ligação a CR2. Os estudos demonstraram que o péptido IHLTGEDPSFFNVE se ligou a CR2 purificado num ensaio ELISA. Na forma solúvel, o péptido inibiu parcialmente a interacção de CR2 purificado e VEB. Pérolas fluorescentes comportando o péptido, interactuaram com células B Raji, expressando CR2 com as mesmas características de ligação que gp350/220 recombinante. A ligação a células CR2-negativas incluindo células B95-S e células HSB-2 não foi observada. A interacção do péptido com células B Raji foi inibida por VEB e por fragmentos -10- 69 965As described in the examples, a series of CR2-reactive synthetic peptides corresponding to regions of gp350 / 220 homologous to C3dg was used in several independent assay systems to determine their potential role in binding to CR2. The studies demonstrated that the peptide IHLTGEDPSFFNVE bound to purified CR2 in an ELISA assay. In the soluble form, the peptide partially inhibited the interaction of purified CR2 and EBV. Fluorescent beads harboring the peptide, interacted with Raji B cells, expressing CR2 with the same binding characteristics as recombinant gp350 / 220. Binding to CR2-negative cells including B95-S cells and HSB-2 cells was not observed. The interaction of the peptide with Raji B cells was inhibited by EBV and fragments -10-69 965

Patente N°. 91 S77Pat. 91 S77

Fab 'e de anticorpos policlonais para CRS, mas não -foi inibida por um vírus não relacionado ou anticorpo Fab/e não imune. Os estudos demonstram que os polipéptidos se ligam especificamente a CRS.Fab 'and polyclonal antibodies to CRS, but was not inhibited by an unrelated virus or Fab / non-immune antibody. Studies demonstrate that the polypeptides bind specifically to CRS.

Os polipéptidos reactivos a CRS encontram uso como um análogo gp35Q/SS0 de VEB em diagnósticos ou como um ligando para ligar e purificar CRS. Guando unidos a um polipéptido epitopo de uma célula T, os péptidos estimulam a produção de anticorpos para a região do ponto de ligação a CRS de VEB. Guando dois ou ma is péptidos reactivos a CRS estão unidos uns aos outros ou a um veículo para formar um agregado deste invento, os péptidos encontram uso para se ligarem e estimularem CRS. Os agregados péptidicos inibem também a infecção dos linfócitos B por VEB.CRS-reactive polypeptides find use as a gp35Q / SS0 analog of EBV in diagnoses or as a ligand to bind and purify CRS. Together with an epitope polypeptide of a T cell, the peptides stimulate the production of antibodies to the region of the binding site to EBV CRS. Where two or more CRS-reactive peptides are attached to one another or to a carrier to form an aggregate of this invention, the peptides find use to bind and stimulate CRS. Peptide aggregates also inhibit EBV B lymphocyte infection.

ftareaados Rolipéotidicos Reactivos a CRSRoadside Reps

Verificou-se que os agregados polipéptidicos reactivos a CRS, mas não monómeros péptidicos, são eficazes para bloquear a infecção de células B por VEB. Em adição à inibição da transformação de células B induzida por VEB, os agregados agem como imunopotenciadores por estimulação das células B através do receptor CRS. Um agregado polipéptidico reactivo a CRS deste invento compreende pelo menos S, normalmente 3, mais usualmente 4 e não mais que cerca de 50, vulgarmente menos de 85, mais vulgarmente 10 ou menos, polipéptidos reactivos a CRS operativamente ligados. Por "operativamente ligados” entende-se que o polipéptido reactivo a CRS está ligado por ligação covalente, vulgarmente no seu terminal carboxílico, a outro polipéptido. Enquanto alguma reactividade CRS pode ser alcançada ligando um péptido no seu terminal amino, verificou—se que a orientação em que está ligado é importante para a actividade do péptido.CRS-reactive polypeptide aggregates, but not peptidic monomers, have been found to be effective in blocking EBV B-cell infection. In addition to inhibition of EBV-induced transformation of B cells, the aggregates act as immunopotentiators by stimulation of B cells via the CRS receptor. A CRS-reactive polypeptide aggregate of this invention comprises at least S, usually 3, more usually 4 and not more than about 50, usually less than 85, more commonly 10 or less, operably linked CRS-reactive polypeptides. By " operably linked " it is meant that the CRS-reactive polypeptide is covalently linked, usually at its carboxyl terminus, to another polypeptide. While some CRS reactivity can be achieved by attaching a peptide to its amino terminus, the orientation in which it is linked is found to be important for peptide activity.

Os agregados polipéptidicos reactivos a CRS podem possuir uma pluralidade dos mesmos ou de diferentes polipéptidos reactivos a CRS, em que os péptidos estão ligados uns aos outros ou a um veículo. Para fins terapêuticos, os polipéptidos reactivos a CRS estão preferivelmente ligados a um veículo imunogénico ou não imunogénico, vulgarmente um veículo não imunogénico. Quando se usa um veículo não imunogénico, o agregado péptidico compreende de preferencia não mais que cerca de S0 polipéptidos reactivos a CRS, mais preferivelmente menos que cerca de 10 polipéptidos, ainda mais -11- 69 965CRS-reactive polypeptide aggregates may have a plurality of the same or different CRS-reactive polypeptides, wherein the peptides are linked to each other or to a carrier. For therapeutic purposes, CRS-reactive polypeptides are preferably attached to an immunogenic or non-immunogenic carrier, commonly a non-immunogenic carrier. When a non-immunogenic carrier is used, the peptide aggregate preferably comprises no more than about 10 CRS reactive polypeptides, more preferably less than about 10 polypeptides, even more preferably 69 965

Patente N2. 91 877 preferivelmente 6 a 8 polipéptidos. Adicionando um número limitado de polipéptidos reactivos a CR2, é mantido o reconhecimento do veículo pelo hospedeiro. 0 veículo pode ser uma proteína de um animal hospedeiro, convenientemente uma proteína que está presente em elevadas quantidades no soro do hospedeiro. Eiesta maneira, quantidades relativamente elevadas do agregado podem ser administradas sem induzir uma resposta imune. Para usos terapêuticos, são preferidos 6-8 polipéptidos CR2 unidos a albumina de soro humano (HSA).Patent N2. 91 877 preferably 6 to 8 polypeptides. By adding a limited number of reactive polypeptides to CR2, recognition of the carrier by the host is maintained. The carrier may be a protein of a host animal, conveniently a protein which is present in high amounts in the host serum. In addition, relatively high amounts of the aggregate can be administered without inducing an immune response. For therapeutic uses, 6-8 CR2 polypeptides bound to human serum albumin (HSA) are preferred.

Como descrito nos exemplos, os agregados polipéptidicos reactivos a CR2 inibiram a ligação de C3dg e gp350/22G a células B, de forma dependente da dosagem aplicada, e bloquearam a infecção por VEB de células B do sangue periférico e central, in vitro. Os agregados polipéptidicos reactivos a CR2 nSo inibiram a ligação de outro ligando CR2, demonstrando que o agregado não inibe a ligação de VEB e C3dg por impedimento estéreo, mas antes que compete pelo mesmo epitopo. Além disso, a capacidade dos agregados polipéptidicos deste invento para inibirem 80% da ligação de gp350/220 e aproximadamente 100% da ligação de VEB, demonstra que a região é o epitopo principal responsável pela adsorção do vírus por células B via CR2.As described in the examples, CR2-reactive polypeptide aggregates inhibited binding of C3dg and gp350 / 22G to B cells in a dose-dependent manner, and blocked EBV infection of peripheral and central blood B cells in vitro. CR2-reactive polypeptide aggregates did not inhibit the binding of another CR2 ligand, demonstrating that the aggregate does not inhibit EBV and C3dg binding by stereo impediment, but rather competes for the same epitope. In addition, the ability of the polypeptide aggregates of this invention to inhibit 80% of the binding of gp350 / 220 and approximately 100% of EBV binding demonstrates that the region is the major epitope responsible for adsorption of the virus by B cells via CR2.

Os agregados polipéptidicos reactivos a CR2 encontram uso para dois fins terapêuticos, como ligandos CR2 e para inibirem a infecção por VEB. Como ligandos CR2 os agregados agem como imunopotenciadores. Uma descrição da activação das células B sem proliferação, que ocorre na ligação do ligando a CR2, é realizada em Masucci, et al, Eur. J. Immunol. 17:815-820 (1987) e incluí a estimulação da secreção de anticorpos e a produção de LIF. 0 uso de agregados para inibirem a infecção por VEB através da sua ligação ao receptor CR2 é descrita seguidamente.CR2-reactive polypeptide aggregates find use for two therapeutic purposes, such as CR2 ligands and to inhibit EBV infection. As CR2 ligands the aggregates act as immunopotentiators. A description of the activation of non-proliferating B cells, which occurs in binding of the ligand to CR2, is performed in Masucci, et al, Eur. J. Immunol. 17: 815-820 (1987) and includes stimulation of antibody secretion and LIF production. The use of aggregates to inhibit EBV infection through its binding to the CR2 receptor is described below.

Formulações Terapêuticas dos Agregados Polpéptidicos Reactivos a CR2 e Seus UsosTherapeutic Formulations of CR2 Reactive Polysptides and Their Uses

As composições contêndo agregados polipéptidicos administradas, tomam vulgarmente a forma de soluções ou suspensões. A concentração do ingrediente activo pode variar largamente, dependendo do fim do tratamento. Em particular, a administração de uma quantidade de agregado que proporcione uma concentração de pelo 69 965The polypeptide-aggregated polypeptide-containing compositions usually take the form of solutions or suspensions. The concentration of the active ingredient may vary widely, depending on the end of the treatment. In particular, the administration of an amount of aggregate that provides a hair concentration of 69,965

Patente Nfi. 91 B?7 -lP- me nos cerca de 100 de agregado por ml de sangue do paciente, á suficiente para actuar como um imunopotênciador em pacientes sem imunidade, tais como aqueles que sofrem de agamaglobulinemia ou outras imuno deficiências. Quando se usa o agregado na prevenção da infecção por VEB, são preferidas concentrações mais elevadas. é vulgarmente administrada uma concentração de pelo menos cerca de 1,0 mg de agregado por ml de sangue do paciente. Para qualquer fim terapêutico, são aceitáveis concentrações tão elevadas como 10 mg/ml, ou seja o valor elevado da gama de concentração normal para HSA, ou algo mais elevado. A preparação de uma composição terapêutica que contem polipéptidos como ingredientes activos é bem compreendida na especialidade. Tipicamente, tais composições são preparadas sob formas injectáveis, quer como soluções quer suspensões líquidas, contudo, podem também preparar-se formas sólidas adequadas para formulação em solução ou suspensão num líquido antes da injecção. A preparação pode também ser emulsionada. Q ingrediente terapêutico activo é muitas vezes misturado com excipientes que são farmacêuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente activo, como é bem conhecido. São excipientes adequados, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol, ou semelhantes e combinações derivadas. Em adição, se desejado, a composição pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes emulsionantes ou molhantes, ou agentes tampão de pH que realçam a eficácia do ingrediente activo.U.S. Pat. 91 to about 100 of aggregate per ml of patient's blood is sufficient to act as an immunopotentiator in patients without immunity such as those suffering from agammaglobulinemia or other immuno-deficiencies. When the aggregate is used in the prevention of EBV infection, higher concentrations are preferred. a concentration of at least about 1.0 mg aggregate per ml of the patient's blood is commonly administered. For any therapeutic purpose, concentrations as high as 10 mg / ml, that is to say the high value of the normal concentration range for HSA, or something higher, are acceptable. The preparation of a therapeutic composition containing polypeptides as active ingredients is well understood in the art. Typically such compositions are prepared in injectable forms either as solutions or as liquid suspensions, however, solid forms suitable for formulation in solution or suspension in a liquid prior to injection may also be prepared. The preparation can also be emulsified. The active therapeutic ingredient is often mixed with excipients which are pharmaceutically acceptable and compatible with the active ingredient, as is well known. Suitable excipients are, for example, water, saline, dextrose, glycerol, ethanol, or the like and combinations thereof. In addition, if desired, the composition may contain minor amounts of auxiliary substances such as emulsifying or wetting agents, or pH buffering agents which enhance the efficacy of the active ingredient.

Uma composição polipéptidica pode ser formulada numa composição terap^itica, na forma de sal farmacifc.iticamente aceitável neutralizado. Os sais farmacêuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácidos (formados com os grupos amino livres do polipéptido) que são formados com ácidos inorgênicos tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou ácido fosfórico, ou ácidos orgênicos tais como acético, tartárico, mandélico e semelhantes. Os sais formados com os grupos carboxilicos livres podem também ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou ferro, e de bases orgânicas tais como, isopropilamina, trimetilamina, S-etilaminoetanol, histidina, procaína e semelhantes. -13- 69 965A polypeptide composition may be formulated into a therapeutic composition in the form of a neutralized pharmaceutically acceptable salt. Pharmaceutically acceptable salts include the acid addition salts (formed with the free amino groups of the polypeptide) which are formed with inorganic acids such as, for example, hydrochloric acid or phosphoric acid, or organic acids such as acetic, tartaric, mandelic and similar. The salts formed with the free carboxylic groups may also be derived from inorganic bases such as, for example, sodium, potassium, ammonium, calcium or iron hydroxides and organic bases such as isopropylamine, trimethylamine, S-ethylaminoethanol, histidine, procaine and the like. -13- 69 965

Patente Nfi. 91 877U.S. Pat. 91 877

As composições terapêuticas contêndo polipêptidos são convencionalmente administradas intravenosamente, por exemplo por injecção de uma dose unitária. □ termo "dose unitária" quando usado em referência a uma composição terapêutica do presente invento, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como unidades de dosagem para humanos, cada unidade contêndo uma quantidade pré-determinada de material activo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o diluente requerido, isto é, veículo.Therapeutic compositions containing polypeptides are conventionally administered intravenously, for example by injection of a unit dose. □ term " unit dose " when used in reference to a therapeutic composition of the present invention, relates to physically discrete units suitable as human dosage units, each unit containing a predetermined amount of active material calculated to produce the desired therapeutic effect in association with the diluent vehicle.

As composições são administradas de uma maneira compatível com a dosagem da formulação, e numa quantidade terapêuticamente eficaz. Apesar de geralmente as gamas das quantidades úteis estarem especifiçadas, deve ser recordado que a quantidade a ser administrada também depende do sujeito a ser tratado, da capacidade do sujeito em utilizar o ingrediente activo, e do grau desejado de inibição da ligação receptor-ligando. As quantidades precisas requeridas de ingrediente activo a administrar, dependem do julgamento do administrador e são peculiares a cada indivíduo. São também variáveis os regimes adequados para a administração inicial e reforços, mas são tipificados por uma administração inicial seguida de doses repetidas administradas todas as 4 a 48 horas, de preferência 6 a 8 horas por uma injecção subsequente ou outra administração. Alternativamente, são contempladas infusões contínuas intravenosas, suficientes para mantêr as concentrações terapêuticamente eficazes no sangue.The compositions are administered in a manner compatible with the dosage of the formulation, and in a therapeutically effective amount. While generally the ranges of the useful amounts are specified, it should be remembered that the amount to be administered also depends on the subject being treated, the subject's ability to utilize the active ingredient, and the desired degree of inhibition of the receptor-ligand binding. The precise amounts required of the active ingredient to be administered depend on the judgment of the administrator and are peculiar to each individual. Also suitable are the regimens suitable for initial administration and boosters, but are typified by an initial administration followed by repeated doses administered every 4 to 48 hours, preferably 6 to 8 hours by a subsequent injection or other administration. Alternatively, continuous intravenous infusions, sufficient to maintain therapeutically effective concentrations in the blood, are contemplated.

Um método de aumentar a secreção de anticorpos num paciente compreende os seguintes passos. Uma quantidade de um agregado polipéptidico reactivo a CR2 eficaz para estimular a secreção de anticorpos é administrada ao paciente. Como préviamente estabelecido, a quantidade de agregado diferirá dependendo de o agregado ser usado como um imunopotênciador num paciente não imune ou para inibir a infecção por VEB das células B. Quando usado para inibir a infecção por VEB, o agregado é administrado substêncialmente concorrentemente quer com recorrência da infecção num paciente crénico infectado quer por exposição inicial a VEB, tal como na recepção de tecido de um doador VEB-seropositivo.One method of increasing secretion of antibodies in a patient comprises the following steps. An amount of a CR2 reactive polypeptide aggregate effective to stimulate secretion of antibodies is administered to the patient. As previously established, the amount of aggregate will differ depending on whether the aggregate is used as an immunopotentiator in a nonimmune patient or to inhibit EBV infection of B cells. When used to inhibit EBV infection, the aggregate is administered substantially concurrently with either recurrence of infection in an infected chronic patient either by initial exposure to EBV, such as in tissue reception of an EBV-seropositive donor.

Polipêptidos Compostos -14- 69 965Polypeptides Compounds -14- 69 965

Patente N2. 91 877Patent N2. 91 877

Numa outra concretização, um polipéptido deste invento está ligado operativamente a um polipéptido epitopo de uma célula T e é usado num diluente aquoso farmacêuticamente aceitável para formar um inóculo que, quando administrado numa quantidade eficaz, é capaz de induzir anticorpos que imunoreajam com a região do sítio de ligação a CRE de gp35G/EE0. O epitopo particular da célula T pode variar largamente, dependendo do fim da indução de anticorpos. Quando a produção de anticorpos anti-VEB per se é desejada, tal como para uso em diagnósticos ou para imunização passiva, o polipéptido epitopo de uma célula T pode ser vulgarmente usado em veículos imunogénicos, tais como os usados para imunizar cabras, coelhos, ratos, saguins ou semelhantes.In another embodiment, a polypeptide of this invention is operatively linked to a T-cell epitope polypeptide and is used in a pharmaceutically acceptable aqueous diluent to form an inoculum which, when administered in an effective amount, is capable of inducing antibodies that immunoreact with the CRE-binding site of gp35G / EE0. The particular T cell epitope can vary widely, depending on the end of antibody induction. When production of anti-EBV antibodies per se is desired, such as for use in diagnostics or for passive immunization, the epitope polypeptide of a T cell can be commonly used in immunogenic vehicles, such as those used to immunize goats, rabbits, rats , marmosets or the like.

Quando se obtêm uma resposta imune anti-VEB para prevenir a infecção nos animais imunizados, ê preferido um polipéptido epitopo de uma célula T de VEB. São bem conhecidos na especial idade os veículos úteis para a indução de anticorpos, e são geralmente eles próprios proteínas. Exemplos destes veículos são hemocianina de lapa do género Fissurela (KLH), edestina, tiroglobulina, albuminas tais como albumina de soro bovino (BSA) ou albumina de soro humano (HSA), globulos vermelhos tais como eritrocitos de ovelha (SRBC), tóxoide do tétano, tóxoide da cólera bem como ácidos poliamino tal como poli (D-lisina: D-ácido glutêmico), e semelhantes.When an anti-EBV immune response is obtained to prevent infection in the immunized animals, an EBV T-cell epitope polypeptide is preferred. Useful vehicles for the induction of antibodies are well known in the art, and are generally proteins themselves. Examples of such carriers are keyhole limpet hemocyanin (KLH), edestin, thyroglobulin, albumins such as bovine serum albumin (BSA) or human serum albumin (HSA), red blood cells such as sheep erythrocytes (SRBC), tetanus, cholera toxoid as well as polyamino acids such as poly (D-lysine: D-glutamic acid), and the like.

Exemplos de polipéptidos epitopos de uma célula T de VEB compreendem EBNA E e LMP. Moss, et al, Nature 331:719-751 í1988) descreve a região de EBNA E contendo epitopos de uma célula T e Thorley Lawson, et al, Proc. Natl. Acad. Sei.. USA 84:5384-5388 (1987) descreve a localização do epitopo de uma célula T de LMP, como resíduos 43 a 53 (VMSDWTGGALL) . O polipéptido VEB ou as sequências de resíduos de aminoácidos correspondendo à sequência contendo epitopo de uma célula T, podem ser usados. 0 epitopo de uma célula T está ligado operativamente ao polipéptido reactivo a CRE. Para fins de indução de uma resposta imune, o péptido reactivo a CRE será unido ao polipéptido epitopo de uma célula T, de forma que seja proporcionado o auxilio da célula T no reconhecimento do péptido reactivo a CRE. Geralmente o péptido estará ligado por uma ligação covalente ao péptido -15- 69 965Examples of EPV T cell epitope polypeptides comprise EBNA E and LMP. Moss et al., Nature 331: 719-751 (1988) describes the EBNA E region containing epitopes of a T cell and Thorley Lawson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5384-5388 (1987) describes the location of the epitope of a T cell of LMP as residues 43 to 53 (VMSDWTGGALL). The VEB polypeptide or sequences of amino acid residues corresponding to the epitope-containing sequence of a T cell can be used. The epitope of a T cell is operably linked to the CRE-reactive polypeptide. For purposes of inducing an immune response, the CRE-reactive peptide will be attached to the epitope polypeptide of a T cell, so that the T cell aid is provided in the recognition of the CRE-reactive peptide. Generally the peptide will be attached by a covalent attachment to the peptide

Patente N2. 91 S77 epitopo da célula T. Contudo, a encapsulação do polipéptido reactivo a CRE num liposoma ou outro veículo pode também encontrar uso. A orientação do polipéptido reactivo a CRE em relação ao polipéptido da célula T, dependerá do epitopo particular da célula T usado e será designada para optimizar a indução de anticorpos na região do sítio de ligação CRE.Patent N2. However, encapsulation of the CRE-reactive polypeptide in a liposome or other vehicle may also find use. The orientation of the CRE-reactive polypeptide to the T cell polypeptide will depend on the particular T-cell epitope used and will be designed to optimize the induction of antibodies in the CRE-binding site region.

Como já foi notado, um ou mais resíduos de aminoácidos podem ser adicionados aos terminais amino ou carboxílico dos polipéptidos para ajudar na ligação operativa dos polipéptidos. Os resíduos de Cisteína adicionados aos terminais dos polipéptidos são particularmente úteis na formação de conjugados via ligações dissulfureto. Contudo, outros métodos, bem conhecidos na especialidade, para a preparação de conjugados podem também ser utilizados. Os procedimentos de ligação adicional exemplares incluem o uso de produtos da reacção de adição de Michael, di-aldeidos tal como glutaraldeído, Klipstein, et al, J«Infect. Pis.. 147, 318-236 (1903) e semelhantes, ou o uso da tecnologia da carbodiimida, tal como na utilização de uma carbodiimida solúvel em água, para formar ligações amido para o veículo. Para uma revisão da conjugação ou acoplamento de proteínas através de grupos funcionais activados, ver Aurameas, et al, Scand. J. Immunol.. Vol. S, Supp-i. 7, 7-E3 (197S).As already noted, one or more amino acid residues may be added to the amino or carboxylic termini of the polypeptides to aid in the operative linkage of the polypeptides. Cysteine residues added to the polypeptide terminals are particularly useful in the formation of conjugates via disulfide bonds. However, other methods, well known in the art, for the preparation of conjugates may also be used. Exemplary additional attachment procedures include the use of Michael addition reaction products, di-aldehydes such as glutaraldehyde, Klipstein, et al., J. Infect. Pis., 147, 318-236 (1903) and the like, or the use of the carbodiimide technology, such as in the use of a water soluble carbodiimide, to form amido bonds for the carrier. For a review of the conjugation or coupling of proteins through activated functional groups, see Aurameas, et al., Scand. J. Immunol. Vol. S, Supp-i. 7, 7-E3 (197 S).

Inóculos A palavra "Inóculo", nas suas várias formas gramaticais, é aqui usada para descrever uma composição contendo um polipéptido deste invento como um ingrediente activo, usada na preparação de anticorpos. 0 presente Inóculo contem uma quantidade imunogénica eficaz de um polipéptido composto deste invento. A quantidade eficaz do polipéptido ou proteína por unidade de dosagem depende, entre outras coisas, das espécies dos animais inoculados, do peso do corpo do animal e do regime de inoculação escolhido, como é bem conhecido na especialidade. Os inóculos contem tipicamente concentrações de polipéptidos ou de proteínas de cerca de 10 microgramas a cerca de 500 miligramas por inoculação (dose), de preferencia cerca de 50 microgramas a cerca de 50 miligramas por dose. 0s inóculos são preparados tipicamente, a partir do -16- 69 965Inoculums The word " Inoculum " in its various grammatical forms is used herein to describe a composition containing a polypeptide of this invention as an active ingredient used in the preparation of antibodies. The present Inoculum contains an effective immunogenic amount of a compound polypeptide of this invention. The effective amount of the polypeptide or protein per dosage unit depends, among other things, on the species of the inoculated animals, the weight of the animal body and the inoculation regime chosen, as is well known in the art. The inocula typically contain polypeptide or protein concentrations of about 10 micrograms to about 500 milligrams per inoculation (dose), preferably about 50 micrograms to about 50 milligrams per dose. The inocula are typically prepared, from -16- 69 965

Patente NS. 91 877 conjugado polipéptidico sólido seco, dispersando o conjugado polipéptidico num diluente ou veículo fisiológicamente tolerável (aceitável) tais como a água, solução salina ou solução salina tamponada com fosfato, para formar uma composição aquosa. Tais diluentes são bem conhecidos na especialidade e são discutidos, por exemplo, em Reminaton/s Pharmaceutical Sciences. 16th Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1980) nas páginas 1465-1467.Patent NS. 91 877 solid polypeptide conjugate, dispersing the polypeptide conjugate in a physiologically tolerable (acceptable) diluent or carrier such as water, saline or phosphate buffered saline to form an aqueous composition. Such diluents are well known in the art and are discussed, for example, in Reminaton / s Pharmaceutical Sciences. 16th Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1980) pages 1465-1467.

Os inóculos podem também incluir um adjuvante como parte do diluente. Adjuvantes tais como adjuvante de Freund completo (CFA), adjuvante de Freund incompleto (IFA) e alumén são materiais bem conhecidos na especialidade, e estão comercialmente disponíveis a partir de diversas origens.The inocula may also include an adjuvant as part of the diluent. Adjuvants such as complete Freund's adjuvant (CFA), incomplete Freund's adjuvant (IFA) and alum are materials well known in the art, and are commercially available from various sources.

Anticorpos e Composições de AnticorposAntibodies and Antibody Compositions

Composições de Anticorpos O termo "Anticorpo" nas suas várias formas gramaticais é aqui usado para referir as moléculas de imunoglobulina e as porções imunológicamente activas das moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contenham um sítio de combinação de anticorpos ou paratopo. Exemplos de moléculas de anticorpos são, moléculas de imunoglobulina intactas, moléculas de imunoglobulina substancialmente intactas e as porções de uma molécula de imunoglobulina que contenham o paratopo, incluindo as porções conhecidas na especialidade como Fab, Fab/,Fíabí)fi e Fív).Antibody Compositions The term " Antibody " in its various grammatical forms is used herein to refer to the immunoglobulin molecules and the immunologically active portions of the immunoglobulin molecules, i.e., molecules which contain an antibody combining site or a paratope. Examples of antibody molecules are intact immunoglobulin molecules, substantially intact immunoglobulin molecules, and portions of an immunoglobulin molecule containing the paratopo, including those portions known in the art such as Fab, Fab / Fabry, Fab, and Fv).

Um "sítio de combinação de anticorpos" é aquela porção estrutural de uma molécula de anticorpo constituída por regiões variáveis e hipervariáveis de cadeias pesadas e leves que especificamente se ligam a (imunoreagem com) antigénios. 0 termo "imunoreage" nas suas várias formas significa a ligação entre uma molécula cont@ndo um determinante antigénico e uma molécula cont@ndo um sítio de combinação ao anticorpo tal como uma molécula de anticorpo completa ou uma porção derivada. “Determinante Antigénico" refere-se à porção estrutural real do antigénio que está ligada imunológicamente por um sítio de combinação ao anticorpo. O termo é também usado intermutávelmente como "epitopo".An " antibody combining site " is that structural portion of an antibody molecule comprised of variable and hypervariable regions of heavy and light chains that specifically bind to (immunoreact with) antigens. The term " immunoreage " in its various forms means the linkage between a molecule containing an antigenic determinant and a molecule con- taining a combination site to the antibody such as a complete antibody molecule or a derivative moiety. "Antigenic determinant " refers to the actual structural portion of the antigen which is immunologically bound by a combination site to the antibody. The term is also used interchangeably as " epitope ".

Uma composição de anticorpo do presente invento é caracterizada como contendo moléculas de anticorpo que imunoreagem —17— 69 965An antibody composition of the present invention is characterized as containing antibody molecules which immunoreact

Patente N°. 91 S77 com pelo menos um polipéptido específico deste invento. Os anticorpos estão substancialmente livres da reacção com as sequências de resíduos de aminoácido representadas pelas fórmulas: EIDIECIMEDGEISG e AWPNNTETDFKCKWT, pg350/ES0 resíduos E06-ESO e 353-367.Pat. 91 S77 with at least one specific polypeptide of this invention. Antibodies are substantially free of reaction with the amino acid residue sequences represented by the formulas: EIDIECIMEDGEISG and AWPNNTETDFKCKWT, pg350 / ES0 residues E06-ESO and 353-367.

Uma composição de anticorpos do presente invento é tipicamente produzida imunizando um mamífero com um inóculo do presente invento e por isso induz no mamífero moléculas de anticorpos possuindo a imunoespecificidade polipéptidica apropriada. As moléculas de anticorpo sSo então recolhidas do mamífero e isoladas na extensão desejada, por técnicas bem conhecidas tais como, por exemplo, pelo uso de DEAE Sephadex para obter a fracção IgG.An antibody composition of the present invention is typically produced by immunizing a mammal with an inoculum of the present invention and thereby induces mammalian antibody molecules having the appropriate polypeptide immunospecificity. Antibody molecules are then harvested from the mammal and isolated to the desired extent by well known techniques such as, for example, by the use of DEAE Sephadex to obtain the IgG fraction.

Para realçar a especificidade da composição de anticorpos, os anticorpos podem ser purificados por cromatografia de imunoafinidade, usando péptidos reactivos a CR2 fixos em fase sólida. A composição de anticorpos é posta em contacta com polipéptidos reactivos a CRE fixos em fase sólida durante um período de tempo suficiente para que os polipépt idos reajam com CRE para formar um complexo fixo em fase sólida. Os anticorpos ligados são separados do complexo por técnicas Standard. Desde que os anticorpos reconheçam o sítio de ligação CRE de VEB, o método pode também ser usado para purificar uma composição contendo CRE.To enhance the specificity of the antibody composition, the antibodies may be purified by immunoaffinity chromatography using solid phase fixed CR2 reactive peptides. The antibody composition is contacted with solid phase fixed CRE-reactive polypeptides for a period of time sufficient for the polypeptides to react with CRE to form a fixed solid phase complex. Bound antibodies are separated from the complex by standard techniques. Provided the antibodies recognize the EBV CRE binding site, the method may also be used to purify a CRE-containing composition.

Composições de Anticorpos MonoclonaisMonoclonal Antibody Compositions

Uma composição de anticorpos monoclonais é também contemplada pelo presente invento. A frase "composição de anticorpos monoclonais" nas suas várias formas gramaticais refere--se a uma população de moléculas de anticorpos que contân apenas uma espécie de sítio de combinação de anticorpos, capaz de imunoreagir com um antigénio particular. Uma composição de anticorpos monoclonais exibe assim tipicamente uma afinidade de ligação única por qualquer antigénio com o qual imunoreage.A composition of monoclonal antibodies is also contemplated by the present invention. The phrase " monoclonal antibody composition " in its various grammatical forms refers to a population of antibody molecules which contain only one kind of antibody combining site, capable of immunoreacting with a particular antigen. A monoclonal antibody composition thus typically exhibits a single binding affinity for any antigen with which it immunoreacts.

Uma composição de anticorpos monoclonais é tipicamente constituída por anticorpos produzidos por clones de uma única célula chamada hibridoma que segrega (produz) apenas um tipo de molécula de anticorpo. A célula hibridoma é formada, por fusão de uma célula produtora de anticorpos e de um mieloma ou outra linha -18- 69 965A monoclonal antibody composition is typically comprised of antibodies produced by single cell clones called a hybridoma that secretes (produces) only one type of antibody molecule. The hybridoma cell is formed by fusion of an antibody-producing cell and a myeloma or other line -18-69 965

Patente N2. 91 S77 celular auto-reprodutora. A preparação de tais anticorpos foi primeiro descrita por Kohler e Milstein, Nature 256:495-497 (1975) , descrição essa que é aqui incorporada em referencia. Outros métodos de produção de anticorpos monoclonais são também bem conhecidos. O sobrenadante do hibridoma pode ser analisado quanto à especificidade para um péptido reactivo a CRB ou quanto á inibição da ligação de VEB a CRB.Patent N2. 91 S77 cellular self-reproducing. The preparation of such antibodies was first described by Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975), which disclosure is incorporated herein by reference. Other methods of producing monoclonal antibodies are also well known. The hybridoma supernatant may be analyzed for specificity for a CRB-reactive peptide or for inhibition of EBV binding to CRB.

As composições de anticorpos deste invento podem ser usadas em, inter alia, métodos e sistemas de diagnóstico do presente invento para detecção de VEB ou para imunização passiva. Quando usadas para a imunização passiva, a preparação e concentração dos anticorpos usados não diferem dos usados para tratar ou evitar outras infecções virais. Em particular, a imunogenicidade da preparação de anticorpos será usualmente minimizada antes da administração. As formulações terapêuticas para administração de anticorpos não diferem das usadas na administração de polipétidos e foram já anteriormente descritas.The antibody compositions of this invention may be used in, inter alia, methods and diagnostic systems of the present invention for detecting EBV or for passive immunization. When used for passive immunization, the preparation and concentration of the antibodies used do not differ from those used to treat or prevent other viral infections. In particular, the immunogenicity of the antibody preparation will usually be minimized prior to administration. Therapeutic formulations for administration of antibodies do not differ from those used in the administration of polypeptides and have been previously described.

Sistemas de Diagnóstico e Métodos de AnáliseDiagnostic Systems and Methods of Analysis

Um conjunto de diagnóstico de acordo com o presente invento, incluí, numa quantidade suficiente pelo menos para uma análise, um polipéptido, uma composição de anticorpos ou uma composição de anticorpos monoclonais, na forma de reagentes embalados separadamente. Incluem-se também tipicamente, as instruções para uso dos reagentes embalados.A diagnostic kit according to the present invention includes, in an amount sufficient for at least one analysis, a polypeptide, an antibody composition or a composition of monoclonal antibodies, in the form of separately packaged reagents. Also included are the instructions for use of the packaged reagents.

As "instruções de uso" incluem típicamente uma expressão compreensível, descrevendo a concentração de reagente ou pelo menos um parâmetro do método de análise, tal como as quantidades relativas de reagente e amostra a misturar, os períodos de tempo de validade para as misturas reagente/amostra, a temperatura, as condições de tamponização, etc.The " instructions for use " typically include a comprehensible expression, describing the reagent concentration or at least one parameter of the method of analysis, such as the relative amounts of reagent and sample to be admixed, the shelf life periods for the reagent / sample mixtures, the temperature, the buffering conditions, etc.

Numa concretização, um conjunto de diagnóstico para testar a presença ou quantificar anticorpos anti—VEB numa amostra, como sangue ou plasma, compreende uma embalagem compreendendo pelo menos um péptido reactivo a CR2, de acordo com o presente invento. Noutra concretização, um conjunto de diagnóstico de acordo com o presente invento, para testar a presença ou quantificar o VEB, compreende uma embalagem contendo uma composição de anticorpos de acordo com -19- 69 965In one embodiment, a diagnostic kit for testing the presence or quantitation of anti-EBV antibodies in a sample, such as blood or plasma, comprises a package comprising at least one CR2-reactive peptide in accordance with the present invention. In another embodiment, a diagnostic kit according to the present invention for testing the presence or quantification of EBV comprises a package containing an antibody composition according to the invention.

Patente Ν2. 91 877 ο presente invento.Patent Ν2. 91 877 of the present invention.

Nas concretizações preferidas, um conjunto de diagnóstico de acordo com o presente invento incluí ainda um marcador ou meios indicadores capazes de assinalar a formação de um complexo contendo uma molécula de anticorpo ou polipéptido de acordo com o presente invento.In preferred embodiments, a diagnostic kit according to the present invention further includes a label or indicator means capable of signaling the formation of a complex containing an antibody or polypeptide molecule in accordance with the present invention.

Tal como aqui utilizados, os termos ,,marcador“ ou "meios indicadores" nas suas diversas formas gramaticais, referem-se a átomos e moléculas simples que estão directa ou indirectamente envolvidos na produção de um sinal detectável para indicar a presença de um complexo. A ligação de marcadores, isto é, a marcação de polipétidos e proteínas é bem conhecida na especialidade. As técnicas de conjugação ou acoplamento de proteínas por meio de grupos funcionais activados, são particularmente adequadas. Veja-se por exemplo, Aurameas, et al, Scand 3. Immunol.. Vol. S Supl. 7:7-23 Í197SÍ, Rodwell, et al, Biotech.. 3:889-894 (1984) e a Patente U.S. N2. 4,493,795.As used herein, the terms, " marker " or " indicator means " in their various grammatical forms, refer to simple atoms and molecules that are directly or indirectly involved in the production of a detectable signal to indicate the presence of a complex. Ligand binding, i.e., labeling of polypeptides and proteins is well known in the art. Protein conjugation or coupling techniques by activated functional groups are particularly suitable. See, for example, Aurameas, et al, Scand. Immunol. Vol. S Suppl. 7: 7-23 (1977), Rodwell, et al., Biotech., 3: 889-894 (1984) and U.S. 4,493,795.

Os conjuntos de diagnóstico podem também incluir, preferivelmente numa embalagem separada, um agente ligante específico. Um "agente ligante específico" é uma entidade molecular capaz de ligar selectivamente uma espécie reagente de acordo com o presente invento mas não é ela própria um produto de expressão de proteínas, um polipéptido ou molécula de anticorpo de acordo com o presente invento. Qs agentes ligantes específicos exemplares são moléculas de anticorpos, proteínas de complementos ou seus fragmentos de proteína A e semelhantes. Para a detecção de VEB, o agente ligante específico pode ligar a molécula de anticorpo do presente invento quando ela se encontra presente como parte de um complexo. Na detecção de anticorpos anti-VEB em pacientes, usam-se convenientemente anticorpos anti-Fc humanos.The diagnostic kits may also include, preferably in a separate package, a specific binding agent. A " specific binding agent " is a molecular entity capable of selectively binding a reactant species in accordance with the present invention but is not itself a protein expression product, an antibody polypeptide or molecule in accordance with the present invention. Exemplary specific binding agents are antibody molecules, complement proteins or their protein A fragments and the like. For the detection of EBV, the specific binding agent may bind the antibody molecule of the present invention when it is present as part of a complex. In the detection of anti-EBV antibodies in patients, human anti-Fc antibodies are conveniently used.

Nas concretizações preferidas, o agente ligante específico é marcado. No entanto, quando o sistema de diagnóstico incluí um agente ligante específico que não é marcado, o agente é tipicamente usado como meio de amplificação ou reagente. Nestas concretizações, o agente ligante específico marcada é capaz de ligar específicamente os meios amplificadores quando os meios -20- 69 965In preferred embodiments, the specific binding agent is labeled. However, where the diagnostic system includes a specific binding agent that is not labeled, the agent is typically used as the amplification medium or reagent. In these embodiments, the specific binding agent labeled is capable of specifically binding the amplifying means when the media 695

Patente Nfi. 91 877 amplificadores estão ligados a um complexo contendo a espécie reagente. □s conjuntos de diagnóstico de acordo com o presente invento podem ser utilizados num formato "ELISA" para detectar a presença ou quantificar VEB ou anticorpos anti-VEB numa amostra de fluído orgânico como soro, plasma ou urina, contendo anticorpos. 0 termo “ELISA" refere-se a um teste de imunosorvente ligado a enzima que emprega um anticorpo ou antigénio ligado a uma fase sólida e um conjugado enzima-antigénio ou enzima—anticorpo para detectar e quantificar a quantidade de um antigénio ou anticorpo presente numa amostra. Uma descrição da técnica ELISA pode ser encontrada no Capitulo EE da 4â Edição de Basic and Clinicai Immunoloav por B.P. sites et al, publicado por Lange Medicai Publications of Los Altos, CA em 19SE e nas Patentes U.S. Nfi. 3,654,090j Nfi. 3,850,75E; e Nfi. 4,016,043, publicações estas que são aqui incorporadas como referencia. Assim, nas concretizações preferidas, o polipéptido reactivo a CRE, ou molécula de anticorpo de acordo com o presente invento, pode ser fixado a uma matriz sólida para formar um suporte sólido que é separadamente embalado nos conjuntos de diagnóstico. 0 reagente é tipicamente fixado à matriz sólida por adsorção de um meio aquoso, apesar de se poderem utilizar outros processos de fixação, bem conhecidos pelos especialistas na matéria.U.S. Pat. 91 877 amplifiers are attached to a complex containing the reactant species. The diagnostic kits according to the present invention may be used in an " ELISA " to detect the presence or quantification of EBV or anti-EBV antibodies in a sample of organic fluid such as serum, plasma or urine containing antibodies. The term " ELISA " refers to an enzyme-linked immunosorbent assay employing an antibody or antigen bound to a solid phase and an enzyme-antigen or enzyme-antibody conjugate to detect and quantitate the amount of an antigen or antibody present in a sample. A description of the ELISA technique can be found in Chapter EE of the 4th Edition of Basic and Clinical Immunology by B.P. et al., Published by Lange Medical Publications of Los Altos, CA in 19SE and U.S. Pat. 3,654,090; 3,850,75E; and Nfi. 4,016,043, which publications are hereby incorporated by reference. Thus, in preferred embodiments, the CRE-reactive polypeptide or antibody molecule according to the present invention may be attached to a solid matrix to form a solid support which is separately packaged in the diagnostic assemblies. The reactant is typically attached to the solid matrix by adsorption of an aqueous medium, although other attachment processes well known to those skilled in the art may be used.

As matrizes sólidas úteis são bem conhecidas na especialidade. Esses materiais incluem o dextrano reticulado disponível sob a marca registada SEPHABEX da Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ) ; agarose; pérolas de poliestireno com cerca de 1 micron a cerca de 5 milímetros de diâmetro, disponíveis de Abbot Laboratories of North Chicago, IL; cloreto de polivinilo, poliestireno, poliacrilamida reticulada, tecidos à base de nylon ou nitrocelulose como folhas, tiras ou almofadas; ou tubos, placas ou as cavidades de uma placa de microtítulo como as feitas a partir de poliestireno ou cloreto de polivinilo. A espécie reagente, agente ligante específico marcado ou reagente amplificador de qualquer dos conjuntos de diagnóstico aqui descritos, pode ser proporcionada em solução, na forma de dispersão -21- 69 965Useful solid matrices are well known in the art. Such materials include the crosslinked dextran available under the trademark SEPHABEX from Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ); agarose; polystyrene beads of about 1 micron to about 5 millimeters in diameter, available from Abbot Laboratories of North Chicago, IL; polyvinyl chloride, polystyrene, crosslinked polyacrylamide, nylon or nitrocellulose based fabrics such as sheets, strips or cushions; or tubes, plates or the wells of a microtiter plate such as those made from polystyrene or polyvinyl chloride. The reagent species, labeled specific binding agent or amplifying reagent of any of the diagnostic kits described herein may be provided in solution as dispersion -21- 69 965

Patente N2. 91 877 líquida ou na forma de um pó substancialmente seco, por exemplo, em forma liofilizada. Quando o meio indicador é um enzima, o substrato do enzima pode também ser proporcionado numa embalagem separada de um sistema. Podem também incluír-se um suporte sólido, como a placa de microtitulo anteriormente descrita, e um ou mais tampóes, como elementos embalados separadamente, neste sistema de teste de diagnóstico.Patent N2. 91 877 liquid or in the form of a substantially dry powder, for example in lyophilized form. When the reporter medium is an enzyme, the enzyme substrate may also be provided in a separate package of a system. A solid support, such as the microtiter plate described above, and one or more buffers, as separately packaged elements, may also be included in this diagnostic test system.

As embalagens aqui discutidas em relação a conjunto de diagnóstico, são as usualmente utilizadas em conjuntos de diagnóstico. Essas embalagens incluem nomeadamente, invólucros de plástico laminado, invólucros de folha de plástico laminado e garrafas e frascos de vidro e plástico (por exemplo; polietileno, polipropileno e policarbonato), e semelhantes. Métodos de Análise 0 presente invento contempla qualquer método que resulte na detecção de VEB ou de anticorpos anti-VEB usando anticorpos ou péptidos de acordo com o invento. Assim, apesar de se descreverem aqui os métodos exemplares, o invento não fica limitado aos mesmos. A presença de anticorpos anti-VEB num fluido orgânico contendo anticorpos é indicativa da infecção provocada por VEB no animal hospedeiro. Geralmente, um aumento de quatro vezes no titulo de anticorpos entre uma amostra aguda e outra tomada cerca de 4 a 6 semanas depois, é indicativo de infecção pelo virus particular. No entanto, uma vez que a infecção por VEB tem um tempo de vida longo (vitalício) a detecção de anticorpos anti-VEB indica infecção por VEB.The packages discussed here in relation to the diagnostic set are those usually used in diagnostic sets. Such packages include, in particular, laminated plastic shells, laminated plastic sheet shells and glass and plastic bottles and jars (for example, polyethylene, polypropylene and polycarbonate), and the like. Methods of Analysis The present invention contemplates any method which results in the detection of EBV or anti-EBV antibodies using antibodies or peptides according to the invention. Thus, although exemplary methods are described herein, the invention is not limited thereto. The presence of anti-EBV antibodies in an organic fluid containing antibodies is indicative of EBV-induced infection in the host animal. Generally, a four fold increase in antibody titre between an acute sample and another taken about 4 to 6 weeks later is indicative of infection by the particular virus. However, since EBV infection has a long lifetime (lifetime) the detection of anti-EBV antibodies indicates EBV infection.

Para detectar a infecção por VEB num paciente, coloca-se em contacto um fluido orgânico do paciente, contendo anticorpos, com polipéptidos reactivos a CR2 fixos em fase sólida, durante um periodo de tempo suficiente para formar um imuno-complexo fixo em fase sólida. A presença do imuno-complexo fixo em fase sólida é indicativa da infecção por VEB, como estabelecido previamente. Q complexo pode ser detectado como descrito anteriormente.To detect EBV infection in a patient, an antibody-containing patient fluid is contacted with solid phase fixed CR2 reactive polypeptides for a period of time sufficient to form a fixed solid phase immuno-complex. The presence of solid-phase fixed immuno-complex is indicative of EBV infection as previously established. Q complex can be detected as described above.

Para determinar a quantidade de VEB numa amostra, a amostra é posta em contacto com os anticorpos fixos em fase sólida deste invento, durante um período de tempo suficiente para formar um imuno-complexo fixo em fase sólida. A quantidade de imuno-complexo -22- 69 965To determine the amount of EBV in a sample, the sample is contacted with the fixed-phase fixed antibodies of this invention for a period of time sufficient to form a fixed solid-phase immuno-complex. The amount of immuno-complex -22- 69 965

Patente NS. 91 877 fixo em fase sólida é indicativa da quantidade de VEB na amostra.Patent NS. 91 877 is indicative of the amount of EBV in the sample.

As condições biológicas de análise são as que mantêm a actividade biológica das moléculas de anticorpos e moléculas de polipéptido deste invento e as plaquetas ligadas a fibrinogénio, a analisar. Essas condições incluem um intervalo de temperatura entre cerca de 4°C e cerca de 45eC, preferivelmente cerca de 37eC, uma gama de valores de pH de cerca de 5 a cerca de 9, preferivelmente cerca de 7 e uma força iónica variando entre a da água destilada e a de uma solução de cloreto de sódio um molar, preferivelmente próxima da do meio salino fisiológico. Os métodos de optimização destas condições são bem conhecidos na especialidade.The biological conditions of analysis are those that maintain the biological activity of the antibody molecules and polypeptide molecules of this invention and the fibrinogen-bound platelets to be analyzed. Such conditions include a temperature range of about 4 ° C to about 45 ° C, preferably about 37 ° C, a range of pH values of about 5 to about 9, preferably about 7, and an ionic strength ranging from that of distilled water and that of a 1 molar sodium chloride solution, preferably close to that of the physiological saline medium. Methods of optimizing these conditions are well known in the art.

Construções de ExpressãoExpression Constructions

Nos organismos vivos, a sequência de resíduos de aminoácidos de uma proteína ou polipéptido está directamente relacionada, por meio do código genético, com a sequência do ácido desoxiribonucleíco ÍADN) do gene estrutural que codifica para a proteína e com o mARN do qual é traduzida. Assim, uma sequência de nucleótidos pode ser definida em termos da sequência de resíduos de aminoácidos, isto é, proteína ou polipéptido, para a qual codifica.In living organisms, the amino acid residue sequence of a protein or polypeptide is directly related, by means of the genetic code, to the deoxyribonucleic acid sequence (DNA) of the structural gene encoding the protein and the mRNA from which it is translated. Thus, a nucleotide sequence may be defined in terms of the sequence of amino acid residues, i.e., protein or polypeptide, to which it encodes.

Uma caracteristica importante e bem conhecida do código genético é a sua redundância. Isto é, para a maioria dos aminoácidos usados para preparar proteínas, mais do que um tripleto de nucleótidos codificantes ícodSo) pode codificar, ou designar um resíduo particular de aminoácido. Portanto, uma série de sequências diferentes de nucleótidos pode codificar para uma sequência particular de resíduos de aminoácidos. Essas sequências de nucleótidos são consideradas funcionalmente equivalentes já que podem resultar na produção da mesma sequência de resíduos de aminoácidos em todos os organismos. Ocasionalmente, uma variante metilada de uma purina ou pirimidina pode ser incorporada numa dada sequência de nucleótidos. No entanto, essas metilações não afectam de maneira nenhuma a relação de codificação.An important and well-known feature of the genetic code is its redundancy. That is, for most of the amino acids used to prepare proteins, more than one triplet of coding nucleotides (codon) can encode, or designate a particular amino acid residue. Therefore, a series of different nucleotide sequences may encode a particular sequence of amino acid residues. Such nucleotide sequences are considered functionally equivalent since they may result in the production of the same amino acid residue sequence in all organisms. Occasionally, a methylated variant of a purine or pyrimidine may be incorporated into a given nucleotide sequence. However, such methylations do not affect the coding relationship at all.

Uma sequência de nucleótidos do presente invento codifica uma sequência de polipéptidos reactivos a CR2 do presente invento. A sequência incluirá nucleótidos codificando pelo menos cerca de -23- 69 965A nucleotide sequence of the present invention encodes a CR2-reactive polypeptide sequence of the present invention. The sequence will include nucleotides encoding at least about -23-69,965

Patente Nfí. 91 S77 10 resíduos de aminoácidos, usualmente pelo menos cerca de 20 resíduos de aminoácidos, mais usualmente pelo menos 50 resíduos de aminoácidos. Numa concretização preferida, a sequência de nucleótidos codificará adicionalmente resíduos de aminoácidos que correspondem substancialmente a resíduos contíguos de aminoácidos na sequência gp350/220. A sequência codificada incluirá usualmente pelo menos um quarto da sequência de gp350/220, mais usualmente cerca de metade da sequência de gp350/220 e menos da totalidade da sequência. A sequência pode ser homóloga, preferivelmente idêntica, a uma porção da sequência de resíduos de aminoácidos de gp350/220, à qual o péptido corresponde.N-patent. 91 S77 10 amino acid residues, usually at least about 20 amino acid residues, more usually at least 50 amino acid residues. In a preferred embodiment, the nucleotide sequence will further encode amino acid residues that correspond substantially to contiguous amino acid residues in the gp350 / 220 sequence. The encoded sequence will usually include at least a quarter of the gp350 / 220 sequence, more usually about half of the gp350 / 220 sequence and less than the entire sequence. The sequence may be homologous, preferably identical, to a portion of the amino acid residue sequence of gp350 / 220, to which the peptide corresponds.

Um segmento de ADN do presente invento que codifica uma sequência de resíduos de aminoácidos reactivos a CR2, pode ser facilmente sintetizado por técnicas químicas, por exemplo, pelo método ^Fosfotriester de Matteucci, et al, J. Am. Chem. Soc.. 103:3185 (1981). Evidentemente, por síntese química da sequência de codificação, quaisquer modificações desejadas podem ser efectuadas simplesmente por substituição das bases apropriadas pelas que codificam a sequência de resíduos do aminoácido nativo.A DNA segment of the present invention encoding a sequence of CR2 reactive amino acid residues can be readily synthesized by chemical techniques, for example, by the Phosphotriester method of Matteucci, et al., J. Am. Chem. Soc., 103: 3185 (1981). Of course, by chemical synthesis of the coding sequence, any desired modifications can be made simply by substituting the appropriate bases for those encoding the native amino acid residue sequence.

Os segmentos de ADN consistindo essencialmente em genes estruturais codificando as proteínas relacionadas com gp350/220, podem ser obtidos por digestão de VEB ou a partir de linhas de células transformadas com VEB. Por exemplo, a linha celular da pituitária de ratazana 6H3 19, expressa a forma não fixada de gp350/220 (Whang, et al, 3. Virol. 61:1796-1807 1987).DNA segments consisting essentially of structural genes encoding the gp350 / 220-related proteins can be obtained by either EBV digestion or from EBV-transformed cell lines. For example, the rat pituitary cell line 6H319, expresses the unfixed form of gp350 / 220 (Whang, et al, 3. Virol., 61: 1796-1807 (1987)).

Uma construção de ácido nucleíco do presente invento pode ser produzida ligando operativamente um vector de expressão à sequência de ácidos nucleícos do presente invento. Por "ligação operativa" significa-se que a sequência de nucleótidos é ligada ao vector de forma que a sequência fica sob o controle de transcrição e tradução do vector de expressão e pode ser expressa numa célula hospedeira adequada. Tal como aqui utilizado, o termo "vector" refere-se a uma molécula de ADN capaz de replicação autónoma numa célula e ao qual se pode ligar operativamente outra sequência de nucleótidos de forma a originar replicação do segmento ligado. Os vectores capazes de dirigir a expressão de genes codificando sequências de aminoácidos reactivos a CR2, são aqui referidos como -24- 69 965A nucleic acid construct of the present invention may be produced by operably linking an expression vector to the nucleic acid sequence of the present invention. &Quot; operative link " it is meant that the nucleotide sequence is attached to the vector so that the sequence is under the control of transcription and translation of the expression vector and can be expressed in a suitable host cell. As used herein, the term " vector " refers to a DNA molecule capable of autonomous replication in a cell and to which another nucleotide sequence can be operatively linked so as to cause replication of the attached segment. Vectors capable of directing expression of genes encoding CR2 reactive amino acid sequences are referred to herein as -24-69 965

Patente N2. 91 877 "vectores de expressão". Assim, uma molécula de ADN recombinante (rADN) é uma molécula de ADN híbrida, compreendendo pelo menos duas sequências de nucleótidos que não são normalmente encontradas em conjunto na natureza. A escolha do vector ao qual se liga operativamente um segmento de ADN do presente invento depende directamente, como é bem sabido na especialidade, das propriedades funcionais desejadas, por exemplo, expressão de proteínas e da célula hospedeira a transformar, sendo estas limitações inerentes à arte de construção de moléculas de ADN recombinante.Patent N2. 91 877 " expression vectors ". Thus, a recombinant DNA molecule (rDNA) is a hybrid DNA molecule, comprising at least two nucleotide sequences which are not normally found together in nature. The choice of the vector to which a DNA segment of the present invention is operably linked depends, as is well known in the art, on the desired functional properties, for example, expression of proteins and the host cell to be transformed, these limitations being inherent in the art of building recombinant DNA molecules.

Os vectores de expressão que são relativamente inofensivos num animal hospedeiro, incluindo primatas, são bem conhecidos e são usados para induzir uma resposta imune para o polipéptido estranho expresso, incluído no vector. Tipicamente, esses vectores são proporcionados contendo sítios de restrição convenientes para inserção do segmento de ADN desejado. Um exemplo típico desses vectores são os vectores do vírus vacina.Expression vectors which are relatively harmless in a host animal, including primates, are well known and are used to induce an immune response to the expressed foreign polypeptide included in the vector. Typically, such vectors are provided containing restriction sites suitable for insertion of the desired DNA segment. A typical example of such vectors are vectors of the vaccine virus.

Desenvolveram-se diversos métodos para ligar operativamente o ADN a vectores via terminais coesivos complementares. Por exemplo, os tractos de homopolimeros complementares podem ser adicionados ao segmento de ADN a ser inserido e ao vector ADN. 0 vector e segmento de ADN são então unidos por ligações de hidrogénio entre as caudas homopoliméricas complementares, para formar moléculas de ADN recombinante.Various methods have been developed to operably link the DNA to vectors via complementary cohesive terminals. For example, complementary homopolymer tracts may be added to the DNA segment to be inserted and to the DNA vector. The vector and DNA segment are then joined by hydrogen bonds between the complementary homopolymer tails, to form recombinant DNA molecules.

Os ligantes sintéticos contendo um ou mais sítios de restrição proporcionam um método alternativo para unir o segmento de ADN a vectores. 0 segmento de ADN, gerado por digestão com endonuclease de restrição, como descrito previamente, é tratado com ADN polimerase do bacteriofago T4 ou com ADN polimerase I de E. coli. enzimas que removem terminais 3’ de cadeia simples, salientes, com as suas actividades exonucleolíticas e preenchem os terminais 3’ recolhidas com as suas actividades polimerizantes. A combinação destas actividades gera portanto segmentos de ADN com extremidades romba. Os segmentos de extremidade romba são então incubados com um grande excesso molar de moléculas ligantes, na presença de um enzima capaz de catalisar a ligação das moléculas de ADN com extremidades rombas, -25- 69 965Synthetic linkers containing one or more restriction sites provide an alternative method for attaching the DNA segment to vectors. The DNA segment, generated by restriction endonuclease digestion, as previously described, is treated with bacteriophage T4 DNA polymerase or with E. coli DNA polymerase I. enzymes which remove protruding 3 'single-stranded termini with their exonucleolytic activities and fills the 3' ends collected with their polymerizing activities. The combination of these activities therefore generates blunt-ended DNA segments. The blunt end segments are then incubated with a large molar excess of linker molecules in the presence of an enzyme capable of catalyzing the binding of blunt-ended DNA molecules,

Patente N2. 91 877 tal como ADN ligase do bacterió-fago T4. Assim, os produtos da reacção são segmentos de ADN comportando sequências de ligante polimêrico nas suas extremidades. Estes segmentos de ADN são então clivados com o enzima de restrição apropriado e ligados a um vector de expressão que foi clivado com um enzima que produz terminais compatíveis com os do segmento de ADN.Patent N2. 91 877 such as bacteriophage T4 DNA ligase. Thus, the reaction products are segments of DNA bearing sequences of polymeric binder at their ends. These DNA segments are then cleaved with the appropriate restriction enzyme and ligated to an expression vector which has been cleaved with an enzyme that produces endpoints compatible with those of the DNA segment.

Os ligantes sintéticos contendo diversos sítios de endonuclease de restrição encontram-se comercialmente disponíveis a partir de uma série de fontes, incluindo International Biotchnologies, Inc., New Haven, CT. São também contemplados pelo presente invento os ARN equivalentes das moléculas de ADN recombinante acima descritas. Uma vez que os polipéptidos reactivos a CR2 são prontamente sintetizados, as estruturas de expressão encontram uso principalmente na imunização de animais hospedeiros e não tanto como fonte dos péptidos per se.Synthetic linkers containing various restriction endonuclease sites are commercially available from a number of sources, including International Biotechnology, Inc., New Haven, CT. Equivalent RNAs of the recombinant DNA molecules described above are also contemplated by the present invention. Since CR2-reactive polypeptides are readily synthesized, expression structures are found to be primarily used in the immunization of host animals and not so much as a source of the peptides per se.

EXEMPLOSEXAMPLES

Os exemplos que se seguem pretendem ilustrar, mas não limitar, o presente invento.The following examples are intended to illustrate, but not limit, the present invention.

Exemplo 1Example 1

Ligação específica de CR2 ao terminal N de um péptidoSpecific binding of CR2 to the N-terminus of a peptide

sintético OP-35Q/2SQsynthetic OP-35Q / 2SQ

Utilizou-se uma análise ELISA para detectar a ligação de péptidos sintéticos gp350/220 imobilizados, a CR2 purificado. 0 CR2 e os ligantes de CR2 foram preparados como se segue. 0 receptor de VEB/C3d (CR2) foi isolado de lisados detergentes de células linfoblastóides B de Raji, por cromatografia de afinidade como descrito préviamente (Nemerow, B.R., et al. J. Virol. 58:709-712. 19S6). 0 C3dg foi purificado a partir de plasma humano activado (envelhecido) com Mg®*EDTA (Vike, D.P., et al, J. Immunol. 134:2571-2579, 1985). A linha de células de pituitária de rato CH3 19 que expressa a forma não fixada de gp350/220 (Whang, Y., et al, J. Virol. 61:1796-1807, 1987) foi gentilmente providenciada pelo Dr. Elliot Kieff (Harvard Medicai School, Boston, MA). Isolou-se gp350/220 recombinante a partir de sobrenadantes de cultura esgotados, por cromatografia de imuno-afinidade (Nemerow, S.R., et al., Supra, 1987) usando o anticorpo monoclonal anti-gp350/220 -26- 69 965An ELISA was used to detect binding of immobilized gp350 / 220 synthetic peptides to purified CR2. CR2 and the CR2 linkers were prepared as follows. The EBV / C3d (CR2) receptor was isolated from Raji B lymphoblastoid cell detergent lysates by affinity chromatography as previously described (Nemerow, B.R., et al., J. Virol 58: 709-712, 19S6). C3dg was purified from activated (aged) human plasma with Mg + EDTA (Vike, D.P., et al., J. Immunol., 134: 2571-2579, 1985). The rat pituitary CH3 cell line expressing the unfixed form of gp350 / 220 (Whang, Y., et al, J. Virol. 61: 1796-1807, 1987) was kindly provided by Dr. Elliot Kieff ( Harvard Medical School, Boston, MA). Recombinant gp350 / 220 was isolated from depleted culture supernatants by immuno-affinity chromatography (Nemerow, S.R., et al., Supra, 1987) using the anti-gp350 / 220 -26-69-96 monoclonal antibody

Patente Nfi. 91 S77 BOS-1 ou 2L10 (veja-se abaixo) « A pureza de CR2 e gp350/220 foi determinada por SDS-PASE e coloração com prata (Morrissey, J.H., Anal. Biochem. 117:307-310, 1981). As estimativas da concentração de proteínas foram determinadas por análise da composição de aminoácidos. 0 VEB foi isolado da linha celular B95-S como préviamente descrito (Nemerow, 6.R., et al, Supra, 1981). O virus da leucemia de murino Rausher (R-MuLV) foi gentilmente providenciado pelo Dr. John Elder, (Research Institute of Scripps Clinic, La Jclla, CA).U.S. Pat. The purity of CR2 and gp350 / 220 was determined by SDS-PASE and silver staining (Morrissey, J.H., Anal. Biochem 117: 307-310 (1981)). Estimates of protein concentration were determined by analyzing the amino acid composition. EBV was isolated from the B95-S cell line as previously described (Nemerow, 6.R., et al., Supra, 1981). Rausher murine leukemia virus (R-MuLV) was kindly provided by Dr. John Elder, (Research Institute of Scripps Clinic, La Jolla, CA).

Os anticorpos monoclonais e policlonais usados foram os seguintes. Um anticorpo monoclonal para gp350/220, éo B0S-1, que foi préviamente descrito (Nemerow, S.R., et al, Supra, 1987). 0 anticorpo 2L10 anti-gp350/220 foi gentilmente providenciado pelo Dr. Elliott Kieff. 0 anticorpo HB5 anti-CR2, pelo ATCC (Rockville, MD). 0 antisoro policlonal anti-CR2 foi originado em coelhos como se segue. Aproximadamente 2Fg de receptor purificado por afinidade, em adjuvante completo de Freund., foram injectados subcutanSamente num coelho ΝΒΞ. Após 10 dias, o coelho recebeu nova injecção de 2í*g de CR2 em adjuvante incompleto de Freund e seguidamente novas injecções com intervalos de 2 semanas. 0 soro foi obtido entre a quarta e a sexta imunização e analisado relativamente à presença de anticorpos anti-CR2 por uma análise ELISA e por imunoprecipitação. As fracções Fab'8 de IgS de soros policlonal anti-CR2 e pré-imune, foram providenciadas pelo Dr. John Bohnsack (University of Utah College of Medicine, Salt Lake City, UT).The monoclonal and polyclonal antibodies used were as follows. A monoclonal antibody to gp350 / 220, is B0S-1, which was previously described (Nemerow, S.R., et al., Supra, 1987). Anti-gp350 / 220 2L10 antibody was kindly provided by Dr. Elliott Kieff. Anti-CR2 HB5 antibody, by ATCC (Rockville, MD). Polyclonal anti-CR2 antiserum originated in rabbits as follows. Approximately 2æg of affinity purified receptor in complete Freund's adjuvant, were injected subcutaneously into a coelho rabbit. After 10 days, the rabbit received a further injection of 20æg of CR2 in incomplete Freund's adjuvant and then further injections at intervals of 2 weeks. Serum was obtained between the fourth and sixth immunizations and analyzed for the presence of anti-CR2 antibodies by ELISA and immunoprecipitation. IgS Fab'8 fractions of polyclonal anti-CR2 and preimmune sera were provided by Dr. John Bohnsack (University of Utah College of Medicine, Salt Lake City, UT).

Os péptidos sintéticos e os conjugados péptido-albumina foram preparados como se segue. Os péptidos gp350/220 foram sintetizados pelo método de sínteses múltiplas simultan@as (T-bâg) (Houghten, R.A., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 82:5131-5135, 1985), ou alternativamente, usando um sistema manual de síntese de péptidos FMOC (RAMPS, E.I., dupont deNemours e Co., Boston, MA). Todos os péptidos foram amidados no terminal-C para mimetizar regiões internas de proteínas nativas. Os péptidos foram caracterizados por HPLC em fase inversa numa coluna C1S (Vydac, Hesparia, CA). Os péptidos sintéticos obtidos pelos dois métodos de síntese mostraram, por este critério, uma homogeneidade de 80-90%. As análises da composição dos animoácidos foram também obtidas —27— 6-9 965The synthetic peptides and the peptide-albumin conjugates were prepared as follows. The gp350 / 220 peptides were synthesized by the simultaneous multiple syntheses (T-bâg) method (Houghten, RA, Proc Natl Acad Sci USA 82: 5131-5135, 1985), or alternatively, using a system FMOC peptide synthesis manual (RAMPS, EI, DuPont de Nemours and Co., Boston, MA). All peptides were amidated at the C-terminus to mimic native protein native regions. The peptides were characterized by reverse phase HPLC on a C1S column (Vydac, Hesparia, CA). The synthetic peptides obtained by the two synthesis methods showed, by this criterion, a homogeneity of 80-90%. Analyzes of the composition of the animáácidos also were obtained -27- 6-9 965

Patente N2. 31 S77 em diversos péptidos de -forma a confirmar a pureza destes reagentes. Os péptidos de gp35Q/220 HLTGEDFGFFNVEC e KCKWTLTSGTP5GCE foram acoplados a albumina de soro bovino ífracção V, Sigma) com éster de m-maleimidabenzoí1-N-hidroxisuccinimida (Pierce, Rockford, IL) como préviamente descrito ÍGoldbard, B.S., et al, Nature 322?641-644, 19S6). Nalguns casos os péptidos contendo cisteína não foram desprotegidos com acetato de mercúrio antes da conjugação a B5A de forma a pesquisar o possivel efeito dos reagentes usados no processo de acoplamento sobre as actividades funcionais do complexo. Os complexos péptido-albumina foram analisados em geles de SDS-PAGE a 12,5%. Estes estudos indicaram que se acoplaram aproximadamente 6-S moléculas de péptido desprotegido por molécula de albumina enquanto que se acoplaram apenas 1-2 moléculas de péptidos não desprotegidos por molécula de BSA, como determinado pela diferença de mobilidade electroforética dos conjugados péptido-albumina em relação a albumina não derivatizada. 0 acoplamente ineficaz de péptidos não desprotegidos a BSA foi seguramente devido à desprotecção ineficaz dos resíduos de cisteína com TFA durante a clivagem do péptido da resina de síntese. A análise ELISA para detecção da ligação de péptidos sintéticos gp35G/220 a CR2 foi efectuada como se segue. Acoplaram-se quantidades variáveis de péptidos sintéticos a placas de 96 cavidades (Immulon II, Dynatech) em tampão bicarbonato de sódio 0,1 M, pH 9,6. A ligação não específica foi bloqueada por adição de 1% de leite magro seco (blotto) durante 60 minutos a 22°C. As cavidades revestidas com péptidos foram então incubadas com 100-200 ng de CR2 purificado durante 60 minutos, a 22Ϊ e em seguida incubadas com iMg/cavidade de HB-5 monoclonal anti-CR2, durante 60 minutos, a 22°C. As cavidades foram lavadas 3 vezes com blotto 0,1% em PBS e em seguida incubadas com 100 Ml de uma diluição 1:1000 de IgG anti-ratinho biotinilado (Vector Labs, Burlingame, CA) durante 60 minutos, a 40°C. As cavidades foram novamente lavadas e então incubadas com 100 Ml de uma diluição 1:500 de Streptavidina-HRP ÍAmersham Corp., Arlington Heights, IL) durante 30 minutos, a 22°C. Após uma série final de lavagens, as reacções foram desenvolvidas pela adição de substrato cromogénico (Nemerow, 6.R., et al, Supra, —28— 69 965Patent N2. 31 S77 in various peptides in order to confirm the purity of these reagents. The gp35Q / 220 peptides HLTGEDFGFFNVEC and KCKWTLTSGTP5GCE were coupled to bovine serum albumin (fraction V, Sigma) with m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (Pierce, Rockford, IL) as previously described (Gilbard, BS, et al, Nature 322 641-644, 19S6). In some cases the cysteine-containing peptides were not deprotected with mercury acetate prior to conjugation to B5A in order to investigate the possible effect of the reagents used in the coupling process on the functional activities of the complex. The peptide-albumin complexes were analyzed on 12.5% SDS-PAGE gels. These studies indicated that approximately 6-S deprotected peptide molecules were coupled per albumin molecule whereas only 1-2 non-deprotected peptide molecules per BSA molecule were coupled as determined by the difference in electrophoretic mobility of the peptide-albumin conjugates in relation the non-derivatized albumin. The ineffective coupling of non-deprotected BSA peptides was undoubtedly due to the ineffective deprotection of the cysteine residues with TFA during the cleavage of the peptide from the synthetic resin. ELISA analysis for detection of the binding of synthetic peptides gp35G / 220 to CR2 was performed as follows. Variable amounts of synthetic peptides were pooled to 96-well plates (Immulon II, Dynatech) in 0.1 M sodium bicarbonate buffer, pH 9.6. Non-specific binding was blocked by addition of 1% dry skimmed milk (blotto) for 60 minutes at 22 ° C. The peptide coated wells were then incubated with 100-200 ng of purified CR2 for 60 minutes at 22 ° C and then incubated with iMg / well of anti-CR2 monoclonal HB-5 for 60 minutes at 22 ° C. The wells were washed 3 times with 0.1% blotto in PBS and then incubated with 100 μl of a 1: 1000 dilution of biotinylated anti-mouse IgG (Vector Labs, Burlingame, CA) for 60 minutes at 40 ° C. The wells were again washed and then incubated with 100 μl of a 1: 500 dilution of Streptavidin-HRP (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) for 30 minutes at 22 ° C. After a final series of washes, the reactions were developed by addition of chromogenic substrate (Nemerow, 6.R., et al., Supra, -28-69- 965

Patente N2. 91 877 1986) . A absorvãncia a A405 foi determinada num leitor ELISA Titertek II (Flow Labs, liaclean, Va) . A inibição das análises ELISA •foi realizada como se segue: Distribuiu-se o VEB purificado, aproximadamente IxlO6, ou R-MULV ou 20 Fg de BSA para placas de 96 cavidades, em tampão bicarbonato. Depois de bloquear os sítios de ligação não específica nas cavidades, com blotto. adicionou-se CR2 isolado ou CR2 pré-incubado com 50 FPI de péptidos sintéticos, às cavidades revestidas com ligando. Após incubação durante 90 minutos a 22^, a detecção do CR2 ligado às cavidades revestidas com vírus foi determinada como descrito acima.Patent N2. 91 877 1986). Absorbance to A405 was determined on a Titertek II ELISA reader (Flow Labs, liaclean, Va). Inhibition of the ELISA assays was performed as follows: Approximately Ix106 or R-MULV or 20 Fg of BSA was distributed to 96 well plates in bicarbonate buffer. After blocking the nonspecific binding sites in the wells, with blotto. CR2 isolated or CR2 preincubated with 50 FPI of synthetic peptides was added to the ligand-coated wells. After incubation for 90 minutes at 22Â °, detection of CR2 bound to the virus coated wells was determined as described above.

Nestes estudos, os péptidos sintéticos correspondentes à região N-terminal de gp350/22Q com similaridade de sequência com C3dg (Fig.l) foram examinados relativamente à reactividade com CR2. Como se mostra na Figura 2, apenas um péptido IHLTSEDFSFFNVE (resíduos 16-29, os resíduos sublinhados denotam os aminoácidos idênticos ou semelhantes aos de C3dg> exibiu uma ligação dependente da dose, a CR2 purificado. Outros péptidos gp350/220 relacionados, sem resíduos de aminoácidos nas posições 28, 29 e 25-29 na região semelhante a C3dg não conseguiram ligar-se ao receptor (Fig. 2). Não se observou qualquer reacção na ausência de CR2. Os péptidos gp350/220 de comprimento comparável, representando a outra região semelhante a C3dg (LTSSTFSGCENISBA) não conseguiram ligar-se a CR2 no ensaio ELISA.In these studies, the synthetic peptides corresponding to the N-terminal region of gp350 / 22Q with C3dg sequence similarity (Fig. 1) were examined for reactivity with CR2. As shown in Figure 2, only one peptide IHLTSEDFSFFNVE (residues 16-29, the underlined residues denoting amino acids identical or similar to those of C3dg > exhibited a dose-dependent, purified CR2 binding. Other gp350 / 220 related peptides, lacking residues amino acids at positions 28, 29 and 25-29 in the C3dg-like region were unable to bind to the receptor (Fig 2) No reaction was observed in the absence of CR2 Peptides gp350 / 220 of comparable length, another region similar to C3dg (LTSSTFSGCENISBA) failed to bind to CR2 in the ELISA assay.

Exemplo 2Example 2

Os péptidos reactivos CR2 inibiram a licação de CR2 a VEB De forma a examinar a especificidade e significado da ligação de péptidos a CR2, observada no ensaio ELISA, examinou-se a capacidade do péptido IHLT6EDFGFFNVE para bloquear a ligação de VEB a CR2 purificado. Estudos de competição ELISA, efectuados como se descreveu no Exemplo 1, usando VEB purificado imobilizado, mostraram que o péptido IHLTBEDFSFFNVE bloqueou aproximadamente 50% da ligação de CR2 purificado ao VEB imobilizado, enquanto que um péptido intimamente relacionado, mas sem os resíduos de aminoácidos 28 e 29, apresentou uma actividade inibidora mínima (Fig. 3).CR2 reactive peptides inhibited the binding of CR2 to EBV. In order to examine the specificity and significance of peptide binding to CR2 observed in the ELISA, the ability of the peptide IHLT6EDFGFFNVE to block the binding of EBV to purified CR2 was examined. ELISA competition studies, performed as described in Example 1, using immobilized purified EBV, showed that the peptide IHLTBEDFSFFNVE blocked approximately 50% of the binding of purified CR2 to the immobilized EBV, whereas a closely related peptide, but lacking the amino acid residues 28 and 29, showed minimal inhibitory activity (Fig. 3).

Exemplo 3Example 3

Um péptido reactivo a CR2 liaa-se a células comportando CrS -29“ 69 965A CR2-reactive peptide was linked to cells bearing CrS-29, 69, 965

Patente Νδ. 91 877Patent δδ. 91 877

Outros estudos exploraram a relevância fisiológica da região N-terminal de gp350/220 na mediação da ligação de CR2. Os péptidos sintéticos ou recombinantes gp350/220 foram acoplados a microesferas fluorescentes as quais foram então reagidas com células linfoblastoides Raji CR2-positivas ou B95-8 B CR2--negativas. A ligação do ligando foi quantificada por citometria de fluxo como a seguir se descreve.Other studies have explored the physiological relevance of the N-terminal region of gp350 / 220 in mediating CR2 binding. The synthetic or recombinant gp350 / 220 peptides were coupled to fluorescent microspheres which were then reacted with CR2-positive or CR2-negative B95-8 B Raji lymphoblastoid cells. Binding of the ligand was quantified by flow cytometry as described below.

De forma breve, os péptidos sintéticos foram acoplados a microesferas fluorescentes carboxiladas de 0,8 um (Pandex. Chicago, IL) usando l-etil-3~(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (Sigma, St. Louis, MO) como recomendado pelo fabricante. 0 gp350/220 recombinante (100-200 ng) ou C3dg purificado (400-800 ng) ou anticorpos monoclonais (1-2 ug) foram conjugados a 10 ul de uma suspensão a 1% de microesferas fluorescentes de 0,9 um não derivadas (Pandex). As microesferas revestivas com ligando foram subsequentemente incubadas com BSA a 2% para bloquear as interacções celulares não específicas. Para a análise directa da ligação do ligando CR2, incubaram-se 1x10^ células linfoblastóides B de Raji CR2 positivas ou células B de sagui B95-8 CR2-negativas ou células linfoblastóides T HSB-2, como controlos, com 10 ul de microesferas .revestidas com ligando, em 100 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS), 2% de BSA, a 4QC durante 60 minutos. As microesferas não ligadas foram então separadas das microesferas associadas a células, por centrifugação num meio de 6¾ de BSA em PBS. As células foram então fixadas com 1% de para-formaldeido e examinadas por citometria de fluxo usando um analisador FACS IV (Becton Dickinson). A inibição da ligação de péptidos sintéticos pelos ligandos naturais CR2 foi verificada pela pré-incubação de 6 7 1x10 células B de Raji com aproximadamente 1x10 VEB purificados (Nemerow, G.R., et al, Supra, 1981) ou com uma quantidade equivalente de virus da leucemia de murino Rausher (R-Mulv), durante 60 minutos a 42C. As células foram lavadas e em seguida incubadas com microesferas revestidas com péptidos, como descrito acima. Em estudos paralelos, as células foram pré-incubadas com 10 ug da fracção Fab*2 anti-CR2 polivalente ou Fab’2 normal de IgG de coelho. As células foram então lavadas por centrifugação a baixa velocidade antes de serem incubadas com microesferas revestidas com -30- 69 965Briefly, the synthetic peptides were coupled to 0.8 um carboxylated fluorescent microspheres (Pandex Chicago, IL) using 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (Sigma, St. Louis, MO) as recommended by manufacturer. Recombinant gp350 / 220 (100-200 ng) or purified C3dg (400-800 ng) or monoclonal antibodies (1-2æg) were conjugated to 10 μl of a 1% suspension of non-derivatized 0.9 μm fluorescent microspheres (Pandex). The ligand-backed microspheres were subsequently incubated with 2% BSA to block non-specific cellular interactions. For the direct analysis of CR2 ligand binding, 1x10 5 CR2-positive Raji B lymphoblastoid cells or CR2-negative B95-8 sagit B cells or HSB-2 T lymphoblastoid cells were incubated as controls with 10 μl of microspheres. coated with ligand in 100 Âμl of phosphate buffered saline (PBS), 2% BSA, at 4Â ° C for 60 minutes. The unbound microspheres were then separated from the cell-associated microspheres by centrifugation on a 6% BSA medium in PBS. The cells were then fixed with 1% para-formaldehyde and examined by flow cytometry using a FACS IV (Becton Dickinson) analyzer. Inhibition of binding of synthetic peptides by the natural CR2 ligands was verified by preincubation of 6 x 10â »Â¹ Raji B cells with approximately 1x10 VEB purified (Nemerow, GR, et al, Supra, 1981) or with an equivalent amount of virus Rausher murine leukemia (R-Mulv) for 60 minutes at 42 ° C. The cells were washed and then incubated with peptide coated microspheres as described above. In parallel studies, the cells were preincubated with 10æg of the polyvalent anti-CR2 Fab * 2 fraction or normal rabbit IgG Fab'2. Cells were then washed by centrifugation at low speed before being incubated with microspheres coated with -30-69 965

Patente N2. 91 877 péptido. A inibição da ligação de gp350/220 ou da ligação de C3dg a células Raji, pelos péptidos, foi efectuada pela pré-incubação de 1x10 células Raji com varias quantidades de péptido isolado, conjugados péptido-albumina ou albumina isolada, durante 60 minutos a 42C, antes da adição das microesferas revestidas com ligando, como descrito acima.Patent N2. 91 877 peptide. Inhibition of gp350 / 220 binding or binding of C3dg to Raji cells by peptides was effected by preincubating 1x10 5 Raji cells with various amounts of isolated peptide, peptide-albumin conjugate or isolated albumin for 60 minutes at 42C , prior to the addition of the ligand-coated microspheres, as described above.

Como se mostra na Figura 4, as microesferas fluorescentes comportando o péptido gp350/220 IHLTGEDPGFFNVE apresentaram uma ligação significativa a células Raji (47,8¾), mas apenas uma ligação mínima a células B95-8 CR2-negativas (10,8¾). 0 nível de ligação de péptidos sintéticos a células Raji (Painel A) foi semelhante ao observado com gp350/220 recombinante (Painel C). As microesferas fluorescentes comportando um péptido sintético correspondente à outra região semelhante a C3d do gp350/220, LTSGTPSGCENISGA. não se ligaram a células Raji (Painel E). A especificidade da ligação dos péptidos a células CR2 positivas foi examinada pré-incubando células Raji, quer com VEB quer com anti--CR2 policlonal antes da adição das microesferas revestidas com péptido. Os resultados estão ilustrados na Tabela 1. TABELA 1As shown in Figure 4, fluorescent microspheres carrying peptide gp350 / 220 IHLTGEDPGFFNVE showed significant binding to Raji cells (47.8%), but only minimal binding to CR2-negative (10.8%) B95-8 cells. The level of binding of synthetic peptides to Raji cells (Panel A) was similar to that observed with recombinant gp350 / 220 (Panel C). The fluorescent microspheres carrying a synthetic peptide corresponding to the other gp350 / 220-like region C3d, LTSGTPSGCENISGA. did not bind to Raji cells (Panel E). The specificity of peptide binding to CR2 positive cells was examined by preincubating Raji cells with either EBV or polyclonal anti-CR2 prior to the addition of the peptide coated microspheres. The results are shown in Table 1. TABLE 1

ESPECIFICIDADE DA LIGAÇÃO DE PÉPTIDOS gp350/220 A CÉLULAS BSPECIFICITY OF PEPTIDE BINDING gp350 / 220 B CELLS

Ligando3 Comoetidor5 ¾ Ligação Ra.ii jCEAçsjl B95-8 IHLTGEDPGFFNVE Nenhum 47,7 10,8 LTSGTPSGCENISGA Nenhum 14,6 6,1 IHLTGEDPGFFNVE VEB 12,2 N.D. II R-MuLV 37,3 N.D. II F(ab)'2 anti~CR2 9,7 N.D. " F(ab)*2 NRS 38,8 N.D. gp350/220 recombinante Nenhum 53,4 10,0 II VEB 14,2 N.D. a Acoplaram-se 100 pg de péptido ou 100 ng de gp350/220 recombinante purificado a microesferas fluorescentes carboxiladas ou não derivadas, respectivamente.Ligand3 Linker5 ¾ Connection Ra.ii jCEA§sjl B95-8 IHLTGEDPGFFNVE None 47.7 10.8 LTSGTPSGCENISGA None 14.6 6.1 IHLTGEDPGFFNVE VEB 12.2 ND II R-MuLV 37.3 ND II F (ab) CR2 9.7 ND " F (ab) * 2 NRS 38.8 ND recombinant gp350 / 220 None 53.4 10.0 II VEB 14.2 ND a 100 pg of peptide or 100 ng of purified recombinant gp350 / 220 were coupled to carboxylated fluorescent microspheres or not derived, respectively.

Os resíduos sublinhados indicam resíduos semelhantes aos -31- 69 965Underlined residues indicate residues similar to -31- 69 965

Patente Ν2. 91 S77 encontrados em C3dg. b As microes-feras -fluorescentes revestidas com ligando -foram reagidas, quer com 1x10* células B de Raji quer com células B B95-S isoladas ou com células que tinham sido pré-incubadas com vírus ou anticorpos anti-CR2, antes da análise de citometria de -fluxo (FACS) «Patent Ν2. 91 S77 found in C3dg. b Ligand-coated fluorescent microspheres were reacted either with 1x104 Raji B cells or with isolated B95-S B cells or with cells that had been preincubated with virus or anti-CR2 antibodies prior to analysis flow cytometry (FACS) «

Como se mostra na Tabela 1, essa pré-incubação de células Raji abrogou a ligação do péptído IHLTGEDFGFFNVE a células B, enquanto a incubação comparável com R-MuLV ou com Ig Fab'B não imune como controlos não inibiu a ligação dos péptidos. Em conjunto, estes estudos demonstram que a região N-terminal de gp350/220 está envolvida na ligação do VEB a CR2.As shown in Table 1, such Raji cell preincubation abrogated binding of the IHLTGEDFGFFNVE peptide to B cells, whereas incubation comparable to R-MuLV or with non-immune Fab'B Ig as controls did not inhibit peptide binding. Taken together, these studies demonstrate that the N-terminal region of gp350 / 220 is involved in binding of EBV to CR2.

Exemplo 4 Q sitio de ligação de CR2 do qp350/220 é EBP6FFN Examinaram-se diversos análogos de mutilação e substituição do péptido gp350/220 IHLTGEDFGFFNVE relativamente á ligação a células B CR2-positivas usando citometria de fltixo. Os resultados encontram-se ilustrados na Tabela 2. TABELA 2 ACTIVIDADE RELATIVA DE LIGAÇSO DOS PÉPTIDOS REACTIVOS A CR2 Péotido* Y* Lioação Ra j i (FACS) HSB-2 Experiência 1 IHLTGEDPGFFNVEIPE 4S.0 O.S IHLT6EDP6FFNVE 51.2 1.1 IHLTGEDPGFFN 55.2 0.6 IHLTGEDPS 25.7 H*» O TGEDPGFFNVE 46.5 1.4 EDPGFFNVE 41.3 0.9 Experiência 2 IHLTGEDPGFFNVE 40.3 5.5 IHLTGEBGGFFNVE 26.1 4.0 a Acoplaram—se 100 J*g de cada péptido a microes-feras fluorescentes carboxiladas, antes da análise FACS, com células B de Raji ou HSB-2 T 1infoblastóides.Example 4 The qp350 / 220 CR2 binding site is EBP6FFN. Several mutagen analogues and substitution of the peptide gp350 / 220 IHLTGEDFGFFNVE were examined for binding to CR2-positive B cells using fltixo cytometry. The results are shown in Table 2. TABLE 2 RELATIVE ACTIVITY OF REAGENT PEPTIDES LINK TO CR2 Peptide * Y * Raia Lyophilization (FACS) HSB-2 Experiment 1 IHLTGEDPGFFNVEIPE.0.0 IHLTGEDP6FFNVE 51.2 1.1 IHLTGEDPGFFN 55.2 0.6 IHLTGEDPS 25.7 H The TGEDPGFFNVE 46.5 1.4 EDPGFFNVE 41.3 0.9 EXPERIMENT 2 IHLTGEDPGFFNVE 40.3 5.5 IHLTGEBGGFFNVE 26.1 4.0 a 100 Âμg of each peptide was coupled to carboxylated fluorescent microspheres prior to FACS analysis with either Raji B or HSB-2 T cells 1infoblastóides.

Como se mostra na Tabela 2, o péptido de referência -35- 69 965As shown in Table 2, the reference peptide -35-69 965

Patente Nfi. 91 877 IHLTGEDFGFFNVE acoplado a microesferas fluorescentes, demonstrou uma ligação significativa a células B de Raji mas não á linha celular T CRS-negativa HSB-E. As eliminações de resíduos de aminoácidos N-terminais neste péptido até, mas sem incluir a região semelhante a C3dg, resultaram apenas numa ligeira diminuição da actividade de ligação de CRS. A eliminação dos resíduos C-terminais vali na e ácido glutSmico (VE> não reduziu a ligação de CRS. Em contraste, a mutilação adicional dos resíduos C-terminais fenilalanina, fenilalanina, asparagina ÍFFN) abrogou aproximadamente metade da actividade de ligação celular. 0 aumento do comprimento do terminal C deste péptido por adição de isoleucina, prolina, ácido glutãmico (IPE) não alterou significativamente a ligação de CRS. Uma vez que uma previsão, realizada por computador, da estrutura secundária do terminal amino do gp350/ES0 indicou uma provável volta <5 hidrofílica formada pelos resíduos EDP6 (Fig. 1) os quais poderiam potencialmente formar epítopos estruturais para interacçãc com receptores, efectuou-se uma investigação mais detalhada desta região. Um péptido gp350/SS0 contendo uma glicina em substituição da prolina na posição E4, possuía uma actividade de ligação de CRS substancialmente inferior à do péptido natural (Tabela S), sugerindo que a volta β formada pela região EBP6 participa na ligação de CRS. Em conjunto, estes estudos indicam que EDFGFFN representa o domínio funcional mínimo de ligação de CRS do GP350/SS0.U.S. Pat. 91 877 IHLTGEDFGFFNVE coupled to fluorescent microspheres demonstrated a significant binding to Raji B cells but not the HSR-E CRS-negative T cell line. Eliminations of N-terminal amino acid residues in this peptide up to but not including the C3dg-like region resulted in only a slight decrease in CRS binding activity. In contrast, further mutilation of the C-terminal residues phenylalanine, phenylalanine, asparagine (FFFN) abrogated approximately half of the cell-binding activity. The elimination of the C-terminal residues of valine and glutamic acid (VE>) did not reduce CRS binding. Increasing the C-terminal length of this peptide by addition of isoleucine, proline, glutamic acid (IPE) did not significantly alter the binding of CRS. Since a computer prediction of the secondary amino terminal structure of gp350 / ES0 indicated a probable < 5 hydrophilic back formed by EDP6 residues (Fig. 1) which could potentially form structural epitopes for interaction with receptors, effected a more detailed investigation of this region. A gp350 / SS0 peptide containing a glycine replacing the proline at the E4 position, had substantially lower CRS binding activity than the natural peptide (Table S), suggesting that the β loop formed by the EBP6 region participates in the binding of CRS. Taken together, these studies indicate that EDFGFFN represents the minimal functional domain of CRS binding of GP350 / SS0.

Exemplo 5Example 5

Os péptidos reactivos a CRS multiméricos inibem a lidaçãoThe multimeric CRS-reactive peptides inhibit the binding

de gp350/SS0 recombinante a CRS A capacidade dos péptidos reactivos a CRS sintéticos para bloquear directamente a ligação do gp350/SS0 recombinante e de C3dg derivado de plasma a células B de Raji foi seguidamente examinada. Os péptidos monoméricos solúveis não inibiram a ligação de gp350/SS0 ou de CSdg a células CRS-positivas mesmo a concentrações molares de péptido muito elevadas (100—330 nM> . Efectuaram-se outras experiências de competição com formas multiméricas de péptidos gp350/SS0 obtidas por acoplamento dos péptidos a albumina. 0 péptido gp350/SS0 N-terminal foi sintetizado com um resíduo de cisteína C-terminal e, assim como o péptido KCKWTLTSGTPS6CE que -33- 69 965of recombinant gp350 / SS0 to CRS The ability of synthetic CRS-reactive peptides to directly block the binding of recombinant gp350 / SS0 and plasma-derived C3dg to Raji B cells was then examined. Soluble monomeric peptides did not inhibit the binding of gp350 / SSO or CSdg to CRS-positive cells even at very high molar concentrations of peptide (100-330 nM). Further competition experiments were performed with gp350 / SS0 peptide multimeric forms obtained by coupling of the peptides to albumin. The N-terminal peptide gp350 / SS0 was synthesized with a C-terminal cysteine residue and, as well as the peptide KCKWTLTSGTPS6CE that -33- 69 965

Patente Nfí. 91 377 possuí um resíduo de cisteína na penúltima posição, foi acoplado por ligação covalente a albumina. Os resultados são apresentados na Tabela 3. TABELA 3N-patent. 91 377 had a cysteine residue in the penultimate position, was coupled by covalent attachment to albumin. The results are shown in Table 3. TABLE 3

Inibição da Ligação de gp350/220 a Células B por conjugados CR2-Albumina Reactivos com PéptidoInhibition of Gp350 / 220 Binding to B Cells by CR2-Albumin Conjugates Reagents with Peptide

Exp.# Ligando CR2 Inibidor % Ligação 1 Recomb. gp350/220 Nenhum 37.1 II BSA 35.6 li (B)HLTGEBPGFFNVEC-BSA 43.9 il (NB)HLTGEBPGFFNVEC-BSA 72.3 II IHLTGEBPGFFNVE 36.9 2 Recomb. gp 350/220 Nenhum 60.2 II (B)HLTGEBPGFFNVEC-BSA 38.9 II ÍB)KCKWTLTSGTPSGGE—BSA 56.5 Mab HB5 Nenhum 97.9 II ÍB)HLTGEBPGFFNVEC-BSA 97.3 II (B)KCKWTLTSGTPSGCE-BSA 93.9Exp. # Connecting CR2 Inhibitor% Connection 1 Recomb. gp350 / 220 None 37.1 II BSA 35.6 li (B) HLTGEBPGFFNVEC-BSA 43.9 il (NB) HLTGEBPGFFNVEC-BSA 72.3 II IHLTGEBPGFFNVE 36.9 2 Recomb. gp 350/220 None 60.2 II (B) HLTGEBPGFFNVEC-BSA 38.9 II (B) KCKWTLTSGTPSGGE-BSA 56.5 Mab HB5 None 97.9 II (B) HLTGEBPGFFNVEC-BSA 97.3 II (B) KCKWTLTSGTPSGCE-BSA 93.9

As células Raji foram pré-incubadas com 10 mg de BSA, péptido-BSA desprotegido (B) ou péptido—BSA não desprotegido (NB) ou péptido apenas, antes da incubação com microesferas revestidas com ligando CR2.Raji cells were preincubated with 10 mg of BSA, deprotected BSA-peptide (B) or non-deprotected BSA-peptide (NB) or peptide only, prior to incubation with CR2 ligand coated microspheres.

Como se mostra na Tabela 3, 10 í*g de péptido HLTGEDPSFFNVE desprotegido, acoplado a albumina íaproximadamente lnM de péptido) bloquearam 50-30% da ligação de microesferas fluorescentes comportando gp350/220 recombinante, a células linfoblastóides B de Raji; nem o péptido monomérico (3,3 nM) isolado nem a BSA reduziram a ligação de VEB a células Raji. Um péptido com uma sequência idêntica, que não tinha sido desprotegido (NB) antes da conjugação a BSA apresentou uma actividade inibidora mínima (Tabela 3) . Um péptido gp350/220 duplicando o outro domínio semelhante a C3dg, KCKWTLTSGTPSSCE complexado com albumina, não inibiu a ligação de microesferas fluorescentes revestidas com gp350/220 a CR2 (Tabela 34- 69 965As shown in Table 3, 10æg of unprotected HLTGEDPSFFNVE peptide coupled to albumin (approximately 1æM peptide) blocked 50-30% binding of fluorescent microspheres containing recombinant gp350 / 220 to Raji B lymphoblastoid cells; neither isolated monomeric peptide (3.3 nM) nor BSA reduced EBV binding to Raji cells. A peptide with an identical sequence, which had not been deprotected (NB) prior to conjugation to BSA had minimal inhibitory activity (Table 3). A gp350 / 220 peptide duplicating the other C3dg-like domain, KCKWTLTSGTPSSCE complexed with albumin, did not inhibit binding of gp350 / 220-coated fluorescent beads to CR2 (Table 34-69 965

Patente N2. 91 877 3). 0 conjugado HLTGEDPGFFNVEC-BSA, mas não o complexo KCKWTLTSGTPSGCE-BSA mediou a inibição dependente da dose da ligação de gp350/220 recombinante e de C3dg a células linfoblastóides B de Raji (Fig. 5, painéis A e B). Nesta experiência, foram requeridos aproximadamente 0,3 nM e 0,6 nti de péptido acoplado a albumina para bloquear 50¾ da ligação de gp350/220 e C3dg, respectivamente, a células Raji. Em contraste com estes resultados, o conjugado HLTGEDPGFFNVEC-BSA. em doses comparáveis, não inibiu a ligação de pérolas fluorescentes comportando o anticorpo rnonoclonal anti-CR2 HB5 para células linfoblastóides B de Raji (Tabela 3),Patent N2. 91 877 (3). The HLTGEDPGFFNVEC-BSA conjugate, but not the KCKWTLTSGTPSGCE-BSA complex mediated the dose-dependent inhibition of recombinant gp350 / 220 and C3dg binding to Raji B lymphoblastoid cells (Fig. 5, panels A and B). In this experiment, approximately 0.3 nM and 0.6 nM peptide coupled to albumin were required to block 50% of the binding of gp350 / 220 and C3dg, respectively, to Raji cells. In contrast to these results, the conjugate HLTGEDPGFFNVEC-BSA. in comparable doses, did not inhibit the binding of fluorescent beads carrying the anti-CR2 HB5 monoclonal antibody to Raji B lymphoblastoid cells (Table 3),

Exemplo.....6Example ..... 6

Os péptidos Reactivos a CR2 Multiméricos Bloqueiam a Infeccão por VEB......de Células.......B.Multimeric CR2 Reactive Peptides Block EBV Infection of Cells ....... B.

Uma vez que o conjugado péptido HLTGEDPGFFNVEC-BSA bloqueou eficazmente a ligação de pérolas revestidas com gp350/220 e com C3dg a células B, efectuaram-se experiências adicionais para examinar a possível interferência deste conjugado na infecção por VEB.Since the peptide conjugate HLTGEDPGFFNVEC-BSA effectively blocked the binding of gp350 / 220 and C3dg coated beads to B cells, additional experiments were performed to examine the possible interference of this conjugate in EBV infection.

Os conjugados BSA-péptido sintético foram analisados relativamente à sua capacidade para inibir a infecção por VEB de células B de sangue periférico de adultos. Incubaram-se células 5 mononucleares de sangue periférico, não separadas, 6x10 , com quantidades variáveis de conjugados BSA-péptido em RPMI 1640 contendo 10¾ de FCS, durante 60 minutos a 42C. Adicionaram-se então trezentos microlitros de sobrenadante contendo VEB derivado de células B95-8 e continuou-se a incubação durante mais 60 minutos a 42C. As células foram então lavadas duas vezes por centrifugação 5 em meio e colocadas em placa com 2x10 células por cavidade, em cavidades em triplicado, em placas de cultura de tecido estéreis com 96 cavidades (Costar, Cambridge, MA). Adicionou-se cicloesporina A (Sigma, St. Louis, MO), 0,1 pg/ml a cada cavidade, para permitir a excrescência de células B infectadas com VEB (Bird, A.G., et al) Nature 289:300-301, (1981). As cavidades foram examinadas para avaliar a excrescência das células B transformadas com VEB e para estimular a síntese de ADN 10-14 dias após a infecção, como previamente descrito (Nemerow, G.R., et al, Virology 132:186-198, 1984). -35- 69 965Synthetic BSA-peptide conjugates were analyzed for their ability to inhibit EBV infection of adult peripheral blood B cells. Non-separate, 6x10 peripheral blood mononuclear cells were incubated with varying amounts of BSA-peptide conjugates in RPMI 1640 containing 10¾ FCS for 60 minutes at 42Â ° C. Three hundred microliters of EBV-containing supernatant derived from B95-8 cells were then added and incubation was continued for an additional 60 minutes at 4 ° C. Cells were then washed twice by centrifugation in media and plated at 2x10 4 cells per well in triplicate wells in 96 well sterile tissue culture dishes (Costar, Cambridge, MA). 0.1æg / ml cycloesporin A (Sigma, St. Louis, MO) was added to each well to allow the outgrowth of EBV-infected B cells (Bird, AG, et al) Nature 289: 300-301, (1981). The wells were examined to evaluate the outgrowth of EBV-transformed B cells and to stimulate DNA synthesis 10-14 days post infection as previously described (Nemerow, G.R., et al, Virology 132: 186-198, 1984). -35- 69 965

Patente NS. 91 S77Patent NS. 91 S77

Em experiências paralelas, os complexos péptido-BSA foram também testados relativamente à sua capacidade de bloquear a incorporação de ^-timidina induzida por VEB, em células mononucleares de sangue central como préviamente descrito (Nemerow, S.R., et al, Supra, 1981)« As células de sangue central (6x10*) foram reagidas com quantidades variáveis de péptido-BSA seguindo-se a incubação com VEB, como descrito acima, com excepção de não se ter utilizado cicloesporina A nestes ensaios. A proliferação de células B foi medida pela incorporação de *H-timidina no dia 4, como préviamente descrito (Nemerow, 6.R., et al, Supra, 1981). As células mononucleares de sangue periférico foram pré-incubadas com quantidades variáveis do HLTGEDPGFFNVEC-BSA. ou só com BSA antes da incubação com sobrenadantes contendo VEB. Como se mostra na Figura 6, 1,0 e 10,0 Mg (0,12 nM e 1,2 nM de péptido, respectivamente) do conjugado péptido gp350/220, como o terminal N desprotegido-BSA aboliram a excrecência de células B transformadas com VEB. O péptido KCKWTLTSGTR3GÇE ^°gp350/220 representando o outro domínio semelhante a C3dg, também conjugado com BSA, não inibiu a infectabilidade de VEB, em doses comparáveis. 0 complexo péptido N-terminal não desprotegido-BSA inibiu a infectabilidade de VEB apenas em doses em superiores de 100 Mg. TABELA 4In parallel experiments, peptide-BSA complexes were also tested for their ability to block EBV-induced Î ± -thymidine incorporation in central blood mononuclear cells as previously described (Nemerow, SR, et al., Supra, 1981). Central blood cells (6x10 4) were reacted with varying amounts of peptide-BSA following incubation with EBV, as described above, except that cyclopesporin A was not used in these assays. B cell proliferation was measured by incorporation of Î²-H-thymidine on day 4, as previously described (Nemerow, 6.R., et al., Supra, 1981). Peripheral blood mononuclear cells were preincubated with varying amounts of HLTGEDPGFFNVEC-BSA. or only with BSA prior to incubation with EBV-containing supernatants. As shown in Figure 6, 1.0 and 10.0 Mg (0.12 nM and 1.2 nM peptide, respectively) of the peptide gp350 / 220 conjugate, as the N-terminal unprotected-BSA abolished the B cell outgrowth transformed with EBV. The peptide KCKWTLTSGTR3GC03 gp350 / 220 representing the other C3dg-like domain, also conjugated to BSA, did not inhibit EBV infectivity at comparable doses. The non-deprotected N-terminal peptide-BSA complex inhibited EBV infectivity only at doses in excess of 100 Mg. TABLE 4

Inibição da Proliferação de Células B Induzida por VEB, por Péptidos Reactivos a CR2-AlbuminaInhibition of EBV-Induced B Cell Proliferation by CR2-Albumin Reactive Peptides

Inibidor* Absorção ®H-TdR VEB ♦/. Inibição Nenhum + 61,884+11,339 Nenhum -· 758+ 447 0.5 Mg HLTGEBPGFFNVEC-BSA + 58,615+ 4,640 5.1 5.5 Mg li + 3,398+ 1,487 94.6 1.5 Mg KCKWTLTGTPSGCE-BSA + 59,453+ 4,410 3.0 15.0 Mg II + 53,579+ 3,023 13.4 a Pré-incubaram-se 6x10® células mononucleares de sangue central com quantidades variáveis de complexos péptido-BSA, antes da exposição ao VEB. As células foram -36- 69 965Inhibitor * Absorption ®H-TdR VEB ♦ /. Inhibition None + 61.884 + 11.339 None - 758 + 447 0.5 Mg HLTGEBPGFFNVEC-BSA + 58.615 + 4.640 5.1 5.5 Mg + 3.398 + 1.487 94.6 1.5 Mg KCKWTLTGTPSGCE-BSA + 59.453 + 4.410 3.0 15.0 Mg II + 53.579 + 3.023 13.4 a Pre 6x10 6 central blood mononuclear cells were incubated with varying amounts of peptide-BSA complexes prior to exposure to EBV. Cells were -36- 69 965

Patente Nfí. 91 S77 cultivadas durante 4 dias e em seguida pulsadas com ^-i— -timidina. fa Os valores representam a média +BP.N-patent. 91 S77 cultured for 4 days and then pulsed with Î²-thymidine. fa The values represent the mean + BP.

Concentrações comparáveis do complexo péptido com o terminal N desprotegido-BSA <0,18-1,9 nM de péptido) também inibiram a incorporação, induzida por VEB, de “H-timidina em células de sangue central em mais de 90¾ (Tabela 4) . 0 outro conjugado péptido gp350/220 semelhante a C3d-BSA nSo apresentou estes resultados. Estes estudos demonstraram que o complexo péptido reactivo a CRS multimérico-BSA aboliu a infecção por VEB i_n vitro.Comparable concentrations of the peptide complex with the deprotected N-terminal BSA <0.18-1.9 nM peptide) also inhibited EBV-induced incorporation of "H-thymidine into central blood cells by more than 90" (Table 4). The other peptide gp350 / 220-like conjugate to C3d-BSA did not present these results. These studies demonstrated that the multimeric CRS-reactive peptide-BSA complex abolished EBV infection in vitro.

Exemplo 7Example 7

Os Polipéptidos Reactivos a CRS Detectaram Anticorpos Humanos Anti-VEB num Ensaio ELISA. E-fectuou-se um ensaio ELISA como descrito no Exemplo 1 usando gp350/220 e o polipéptido IHLT6EBF6FFNVE como antígénio fixos em fase sólida. A reactividade dos antigéníos de cápsula virai foi testada para cada soro como controlo. Os resultados encontram-se listados na Tabela 5.CRS Reactive Polypeptides Detect Anti-EBV Human Antibodies in an ELISA Assay. An ELISA assay was performed as described in Example 1 using gp350 / 220 and the IHLT6EBF6FFNVE polypeptide as a solid phase fixed antigen. The reactivity of the viral capsule antigens was tested for each serum as a control. The results are listed in Table 5.

Tabela 5Table 5

Betecção de Anticorpos para Péptidos Reactivos a CR2 no soro humanoBlotting of Antibodies to CR2 Reactive Peptides in Human Serum

Reactividade de Antigéníos Reactividade ELISA <AW) Soro * de Cápsula Virai <ACV) gp350/220 ILHT6EDPGFFNVE J.E. + 1.598 0.256 J.F. + 2.215 0.313 S.J. + 2.051 0.319 S.H. + 1.435 0.321 K.C. + 1.617 0.100 R.C. + 1.066 0.087 D.P. - 0.014 0.081 A.T. — 0.097 0.049 a Os soros de adultos normais foram testados relativamente a anticorpos para gp350/220 recombinante e péptido reactivo a CRS, num ensaio ELISA para a reactividade do antígénio —37_ 69 965Antigen Reactivity ELISA Reactivity <AW) VCI Capsule Serum <ACV) gp350 / 220 ILHT6EDPGFFNVE J.E. + 1,598 0.256 J.F. + 2.215 0.313 S.J. + 2.051 0.319 S.H. + 1.435 0.321 K.C. + 1.617 0.100 R.C. + 1.066 0.087 D.P. - 0.014 0.081 A.T. 0.097 0.049 a Normal adult sera were tested for antibodies to recombinant gp350 / 220 and CRS-reactive peptide in an ELISA for antigen reactivity -379,965

Patente Nfi. 91 877 de cápsula virai EB por coloração imunofluorescente de células produtoras de VEB.U.S. Pat. 91 877 EB capsule by immunofluorescent staining of EBV-producing cells.

Como se pode observar na Tabela 5, -Foram detestados cinco em seis soros positivos usando o péptido reactivo a CRE, usando 0,100 como -fundo. Não se observaram -falsos positivos.As can be seen in Table 5, Five out of six positive sera were used using the CRE-reactive peptide, using 0.100 as a background. No positive fallows were observed.

Como demonstrado nos exemplos, os polipéptidos reactivos a CRE deste inventa, mimetizam a região do sítio de ligação de CRE de VEB, actuando como ligando de CRE e estimulando o receptor ao mesmo tempo que inibem a in-fecção de células B por VEB.As shown in the examples, the CRE-reactive polypeptides of this invention, mimic the region of the EBV CRE binding site, acting as a CRE ligand and stimulating the receptor while inhibiting EBV-B-cell infection.

Todas as publicações e pedidos de patentes são aqui incorporados como referencia, na mesma extensão em que cada uma das publicações ou pedidos de patente individuais foi específica e individualmente indicado para ser incorporado como referencia.All publications and patent applications are hereby incorporated by reference to the same extent that each of the individual publications or patent applications has been specifically and individually indicated to be incorporated by reference.

Neste invento, agora totalmente descrito, será óbvio para os entendidos na especialidade que se poderão efectuar muitas mudanças e modificações sem saír do espírito e âmbito das reivindicações co-pendentes.In the now fully described invention, it will be obvious to those skilled in the art that many changes and modifications may be made without departing from the spirit and scope of the co-pending claims.

Claims

-38- 69 965 EPG.11-SCRF 166-0 REIVINDICACOES 1 - Processo de preparação de um polipéptido reactivo a CR2 com não mais de 50 resíduos de aminoácidos, compreendendo uma sequência de resíduos de aminoácidos correspondente a uma sequência representada por uma fórmula seleccionada do grupo constituído por= IHL.TGEDPGFFNAE; IHLTGEDPGFFNVQ; IHLTGEDPGFFN; IHLTGEDPG; EDPGFFN; DPGFFNVEIPE; PGFFNVEIPE; PFFNVEIPE, GFFNVEIPE; e FNNVEIPE caracterizado por a) se proporcionar a sequência de nucleótidos adequada à expressão, b) transformação de uma célula hospedeira adequada com a referida sequência de nucleótidos, e c) expressão do polipéptido desejado reactivo a CR2 pela referida célula hospedeira.A method of preparing a CR2-reactive polypeptide having not more than 50 amino acid residues, comprising an amino acid residue sequence corresponding to a sequence represented by a selected formula of the group consisting of = IHL.TGEDPGFFNAE; IHLTGEDPGFFNVQ; IHLTGEDPGFFN; IHLTGEDPG; EDPGFFN; DPGFFNVEIPE; PGFFNVEIPE; PFFNVEIPE, GFFNVEIPE; and FNNVIPE characterized by a) providing the nucleotide sequence suitable for expression, b) transforming a suitable host cell with said nucleotide sequence, and c) expressing the desired CR2-reactive polypeptide by said host cell.

2 - Processo de preparação de um agregado de polipéptidos reactivos a CR2, caracterizado por se ligarem operativamente pelo menos dois polipéptidos reactivos a CR2, sendo um polipéptido reactivo a CR2 constituído por não mais de 50 resíduos de aminoácidos e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácidos correspondente a pelo menos 5 resíduos contíguos da sequência linear de gp350/220 de EBV e incluindo pelo menos um dos resíduos 21-24 ou 25-27.A process for preparing an aggregate of CR2-reactive polypeptides, characterized in that at least two CR2-reactive polypeptides are operably linked, a CR2-reactive polypeptide being comprised of not more than 50 amino acid residues and including a sequence of amino acid residues corresponding to at least 5 contiguous residues of the EBV gp350 / 220 linear sequence and including at least one of residues 21-24 or 25-27.

3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por os referidos polipéptidos reactivos a CR2 serem operativamente ligados a um veículo.3. The method of claim 2, wherein said CR2 reactive polypeptides are operably linked to a carrier.

4 - Processo de preparação de um polipéptido compósito, caracterizado por se ligar operativamente um polipéptido epítopo de uma célula T a um polipéptido reactivo a CR2, sendo o referido polipéptido reactivo a CR2 constituído por não mais de 50 resíduos de aminoácidos incluindo uma sequência de resíduos de aminoácidos correspondente a pelo menos 5 resíduos contíguos da sequência linear de gp350/220 de EBV e incluindo pelo menos um -39- 69 965 EPG.11-SCRF 166.0 dos resíduos 21-24 ou 25-27,A process for the preparation of a composite polypeptide, characterized in that an epitope polypeptide of a T cell is operably linked to a CR2-reactive polypeptide, said CR2-reactive polypeptide being comprised of not more than 50 amino acid residues including a residue sequence amino acid sequence corresponding to at least 5 contiguous residues of the EBV gp350 / 220 linear sequence and including at least one of the residues 21-24 or 25-27,

5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido polipéptido epítopo de célula T corresponder à sequência de resíduos de aminoácidos de um epítopo de uma célula T de EBV.A method according to claim 4, wherein said T cell epitope polypeptide corresponds to the amino acid residue sequence of an epitope of an EBV T cell.

6 - Processo de preparação de um inoculo, caracterizado por se associar um diluente fisiologicamente aceitável a um polipéptido compósito de acordo com a reivindicação 4, numa quantidade eficaz para estimular a produção de anticorpos.A method of preparing an inoculum, characterized in that a physiologically acceptable diluent is associated with a composite polypeptide according to claim 4 in an amount effective to stimulate the production of antibodies.

7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido polipéptido epítopo de célula T corresponder à sequência de resíduos de aminoácidos de um epítopo da célula T de E8V.A method according to claim 6, wherein said T cell epitope polypeptide corresponds to the amino acid residue sequence of an E8V T cell epitope.

8 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido polipéptido epítopo de célula T ser constituído por não mais de 50 resíduos de aminoácidos e incluir uma sequência de resíduos de aminoácidos correspondente à sequência representada pela fórmula! VMSDWTGGALL8. The method of claim 6, wherein said T cell epitope polypeptide is comprised of not more than 50 amino acid residues and includes an amino acid residue sequence corresponding to the sequence represented by the formula: VMSDWTGGALL

9 - Processo de preparação de uma construção de expressão, caracterizado por se ligar operativamente um vector de expressão a uma sequência de nucleótidos codificando uma sequência de resíduos de aminoácidos consistindo em não mais de metade dos resíduos de aminoácidos de gp350/220, sendo um polipéptido reactivo a CR2 constituído por não mais de 50 resíduos de aminoácidos e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácidos correspondente a pelo menos 5 resíduos contíguos da sequência linear de gp350/220 de EBV e incluindo pelo menos um dos resíduos 21-24 ou 25-27.A method of preparing an expression construct, characterized in that an expression vector is operably linked to a nucleotide sequence encoding a sequence of amino acid residues consisting of not more than half of the amino acid residues of gp350 / 220, a polypeptide CR2-reactive agent consisting of not more than 50 amino acid residues and including an amino acid residue sequence corresponding to at least 5 contiguous residues of the EBV gp350 / 220 linear sequence and including at least one of residues 21-24 or 25-27 .

10 - Processo de preparação de uma composição, caracterizado por compreender associar um diluente fisiologicamente aceitável, a uma construção de expressão de acordo com a reivindicação 9.A method of preparing a composition comprising combining a physiologically acceptable diluent with an expression construct according to claim 9.

11 - Processo de produção de um sistema de diagnóstico na forma de conjunto para determinar se um paciente foi infectado -40 69 965 EP(3.11~SCRF 166.0 com EBV, caracterizado por se embalar em quantidade suficiente para, pelo menos um ensaio, um polipéptido reactivo a CR2 consistindo em não mais de 50 resíduos de aminoácidos e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácidos correspondente a pelo menos 5 resíduos contíguos da sequência linear da gp350/220 de EBV e incluindo pelo menos um dos resíduos 21-24 ou 25-27.A method of producing a diagnostic system in the form of a set to determine whether a patient has been infected with an EBV characterized in that at least one assay is packed into a polypeptide CR2-reactive agent consisting of no more than 50 amino acid residues and including an amino acid residue sequence corresponding to at least 5 contiguous residues of the EBV gp350 / 220 linear sequence and including at least one of residues 21-24 or 25-27 .

12 - Processo de produção de um sistema de diagnóstico na forma de conjunto, para a detecção de EBV numa amostra, caracterizado por se embalar, como reagente separado uma quantidade suficiente para pelo menos um ensaio de anticorpos que reagem com uma sequência de resíduos de aminoácidos correspondente a pelo menos 5 resíduos contíguos da sequência linear de gp350/220 de EBV e que inclui pelo menos um dos resíduos 21-24 ou 25-27 e que não reagem com sequências de resíduos de aminoácidos representadas pelas fórmulas EIDIECIMEDÔEISQ e AWPNNTETDFKCKWT.A method of producing a set-up diagnostic system for the detection of EBV in a sample, characterized in that a sufficient amount is packed as a separate reagent for at least one antibody assay which reacts with a sequence of amino acid residues corresponding to at least 5 contiguous residues of the linear sequence of EBV gp350 / 220 and which includes at least one of residues 21-24 or 25-27 and which do not react with sequences of amino acid residues represented by the formulas EIDIECIMEDOEISQ and AWPNNTETDFKCKWT.

13 - Processo de detecção de infecção por EBV num paciente, caracterizado por compreender: a - o contacto de um fluido corporal contendo anticorpos do referido paciente com polipéptidos reactivos a CR2 fixados em fase sólida, consistindo um polipéptido reactivo a CR2 em não mais de 50 resíduos de aminoácidos e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácidos correspondente a pelo menos 5 resíduos contíguos da sequência linear de gp350/220 de EBV e incluindo pelo menos um dos resíduos 21-24 ou 25-27, durante um período de tempo suficiente para formar um complexo imune, fixado em fase sólida; e b - a detecção da presença desse complexo imune, fixado em fase sólida como indicativo da infecção do referido paciente por EBV.A method of detecting EBV infection in a patient comprising: a - contacting a body fluid containing antibodies of said patient with solid phase fixed CR2-reactive polypeptides, consisting of a CR2-reactive polypeptide in not more than 50 amino acid residues and including a sequence of amino acid residues corresponding to at least 5 contiguous residues of the linear sequence of EBV gp350 / 220 and including at least one of residues 21-24 or 25-27, for a period of time sufficient to form an immune complex, fixed in solid phase; and b - detecting the presence of this immune complex, fixed in solid phase as indicative of EBV infection of said patient.

14 - Processo para remover selectivamente CR2 de uma composição contendo CR2, caracterizado por compreender: a - o contacto da referida composição com os polipéptidos reactivos a CR2 fixados em fase sólida, consistindo um polipéptido 41- 69 965 EPG.ll-SCRF 166.0 reactivo s CR2 em não mais de 50 resíduos de aminoácidos e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácidos correspondente a pelo menos 5 resíduos contíguos da sequência linear de gp350/220 de EBV e incluindo pelo menos um dos resíduos 21-24 ou 25-27, durante um período de tempo suficiente para o CR2 reagir com os referidos polipéptidos fixados em fase sólida para formar um complexo fixado em fase sólida; e b - a separação de CR2 do referido complexo fixado em fase sólida. Lisboa, “2. QUT. 1989 Por SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION - 0 AGENTE OFICIAL -A method for selectively removing CR2 from a CR2 containing composition comprising: a - contacting said composition with the solid phase fixed CR2-reactive polypeptides, consisting of a polypeptide consisting of a 41-69 polypeptide EPG.ll-SCRF 166.0 reactive s CR2 in not more than 50 amino acid residues and including a sequence of amino acid residues corresponding to at least 5 contiguous residues of the linear sequence of EBV gp350 / 220 and including at least one of residues 21-24 or 25-27, for one period of time sufficient for the CR2 to react with said solid phase fixed polypeptides to form a solid phase fixed complex; and b - separating CR2 from said solid phase fixed complex. Lisbon, "2. QUT. 1989 By SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION - 0 OFFICIAL AGENT -