PT91725B

PT91725B - Processo de preparacao de medicamentos a base de interleuquina-6 e/ou interferao

Info

Publication number: PT91725B
Application number: PT91725A
Authority: PT
Inventors: Martin Lotz; Bruce Zuraw; Dennis A Carson
Original assignee: Scripps Clinic Res
Priority date: 1988-09-14
Filing date: 1989-09-14
Publication date: 1995-05-31
Also published as: DK115390A; JPH03501262A; PT91725A; AU4310889A; IE892946L; DK115390D0; DE68914653T2; DE68914653D1; US5271931A; WO1990002570A1; EP0408677B1; EP0408677A1; FI902401A0; EP0408677A4

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo Técnico presente invento refere-se ao processo de preparação de um medicamento à base de interferão humano e/ou interleu quina-6, util para aumentar as concentrações de inibidor Cl intravasculares em pacientes quer exibindo quer em riscos de exibirem deficiências em inibidor ClAntecedente inibidor Cl (ClINH) é um inibidor da serina-protease envolvido na regulação de vários sistemas proteoiíticos do plasma Incluindo os sistemas do complemento, contacto, coagu lação e fibrinolíticos . Davis et al, Ann. Rev. Immunol. 6:595^_528 (1988). 0 ClINH é conhecido por regular aqueles sistemas por formação de complexos covalentes com os componen tes da serina-protease específicos de cada sistema.

Têm sido identificadas várias serina-protease específicas cujas activldades são directamente reguladas pelo inibidor Cl. Por exemplo, o C1INH e o único Inibidor conhecido de Clr e Cis ambos os quais são fragmentos activados do componente do sist£ ma do complemento Cl·

Adicionalmente, a arte ensina que 0 ClINH é o inibidor mais importante do sistema do contacto porque o ClINH é o inibidor principal quer da caiicreína quer das formas activadas do factor de coagulação XII, incluindo o factor Xlla e o facto' Xllf (factor de Hageman). Proud et al, Ann. Rev. Immunol., 6:49-83 (1988).

As deficiências em ClINH são conhecidas por causarem doen ças graves e potencialmente ameaçadoras da vida. 0 exemplo me lhor caracterizado de uma deficiência em ClINH e encontrado em indivíduos com angioedema hereditário (HAE), também conheci^ do como doença angioneurótica hereditária, causado por uma deficiência hereditária na capacidade para produzir ClINH. Os indivíduos com sintomas de HAE exibem edema recorrente, agudo, localmente circunscrito da pele ou mucosa, prIncipalmente nas extremidades, face, laringe e tracto gastrointestinal. Davis et al, Ann. Rev. Immunol·., 6:595-628 (1988).

BAD ORIGINAL &

945 SCRF 156.0

-3Um outro tipo distinto de deficiência em ClINH, denomina do deficiência em ClINH adquirida, ocorre em indivíduos que sintetizam quantidades normais de ClINH, mas nao são capazes de manter concentrações suficientes do Inibidor por causa do seu catabolismo aumentado· Os indivíduos com deficiência em ClINH adquirida exibem os sintomas de HAE. Enquanto que quer o HAE quer a deficiência em ClINH adquirida exibem o perfil de laboratorio típico de níveis diminuídos quer do ClINH quer dos componentes do sistema do complemento C4 e C2 , so são diminuídos os níveis do componente do sistema do complemento Clq na doença adquirida.

Presentemente, têm sido propostos três mecanismos distintos que criam uma deficiência em ClINH adquirida- Primeiro, pode ser adquirida uma deficiência em ClINH quando a quantidade de ClINH normalmente disponível é consumida por uma quantidade excessiva de activação do sistema do complemento e/ou do sistema do contacto. Alguns dos componentes actlvados de cada um dos sistemas do complemento e contacto podem-se ligar e ina ctivar o ClINH. Adicionalmente, os componentes do sistema do contacto actlvados podem clivar o ClINH em fragmentos inactivos . Zuraw et al, J. Clln ._Invest., 73:567-575 (1986).

Segundo, pode ser adquirida uma deficiência em ClINH como o resultado de uma reacção autoimune anti-ClINH. Num tal caso, 0 ClINH é sintetizado, mas os auto-anticorpos anti-ClINH ligam-se ao inibidor e previnem assim a sua capacidade para regular a actividade da serina-protease. Terceiro, pode ser adquirida uma deficiência em ClINH como um resultado do ClINH sendo ligado por complexos auto-imunes contendo complemento que são rapidamente retirados da circulação.

Do que antecede, pode ser observado que um processo para aumentar o nível intravascular de ClINH seria util para o trata mento da doença causada por deficiências em ClINH. Um processo para aumentar as concentrações de ClINH intravasculares seria t d particularmente util como um tratamento profilático para o consumo de ClINH devido à activação do sistema do complemento e/ou contacto agudo .

Presentemente, não é (são) conhecido(s) o(s) mecanismo(s) fisiológico(s) específico(s) de controlo da concentração

X'

945 SGF.F 156.0

-4sanguínea de C1INH. 0 local principal de síntese do C1INH durante a reacção de fase aguda para o trauma sanguíneo tem sido proposto ser o fígado. Davis et al, Ann. Rev. Immunol. 6 :595-628 (1988); Johnson et al, Science, 1'3-553-554 (1971). Adicionalmente, os resultados de um estudo in vitro sugerem que os hepatocitos em cultura sintetizam C1INH em resposta ao interferão gama. Zuraw et al, Comp1 eme nt, 4:244, A319 (1987).

Em contraste, a fonte de C1INH em resposta à inflamação não-traumática localizada parecem ser as células da linhagem monociclo/macrofago· Por exemplo, vários estudos in vitro têm z

sugerido que os monocitos em cultura podem ser estimulados pa ra sintetizarem C1INH por tratamento com interferão gama. Ver, Hamilton et al, Biochem. J 242 :809-815 (1987); Lotz et al,

J · Immunol . , 139:3382-3387 (1987); Lotz et al, «3 . Allerg. Clln . Immunol., 79:194, A280 (1987); e Lappin et al, Complement, 4: :184, Al60 (1987). Adicionalmente, os resultados de um estudo in vitro sugerem que os hepatocitos em cultura sintetizam C1INH em resposta ao interferão gama. Zuraw et al, Complement, 4:244, A319 (1987) · z

Contudo, como e bem conhecido na arte, os resultados dos estudos in vitro obtidos com o interferão gama não indicam de modo prognosticável que serão obtidos os mesmos resultados in z

vivo Por exemplo, o tratamento de monocitos em cultura com interferão gama resulta num aumento do nível de expressão do ar_ tigénio HLA-DR na superfície dos monocitos. Em contraste, a administração de interferão gama a um paciente diminuiu o nível de expressão do antigénio KLA-DR pelos monocitos no paciente Fi_ restein et al, Arthrlt. Rheum., 3O:S115> E13 (1987).

Até à data não tem havido nenhum estudo dos efeitos de interferão gama nos níveis de C1INH in vivo. Isto não é surpreen.

z dente tendo em vista o facto de que o interferão gama, como e presentemente compreendido, ser descrito como um imunomodulador z Z que regula a activaçao e crescimento das células imuno especificas .

Breve Sumario do Invento

Verificou-se agora que a administração de interferão gama e/ou interleuquina-6 (IL-6) aumenta a concentração intravascular de Inibidor Cl.

BAD ORIGINAL vk

945 SCHF 156.0

-5Por consequência, o presente invento contempla um tratamejn to paliativo para o trauma sanguíneo num paciente, processo que compreende a administração a um paciente de uma quantidade aumentada de concentração de inibidor Cl, de interferão e/ou IL-6.

Numa outra concretização, o presente invento contempla um processo terapêutico em que o sangue de um paciente circula atra vés de um dispositivo prostético, processo que inclui a administração de uma quantidade aumentada de concentração de inibidor Cl de interferão e/ou IL-6 a um paciente substancialmente e concorrentemente, com exposição do sangue do paciente a uma superfí_ cie prostetica no dispositivo· z z

Ξ também contemplado um tratamento paliativo para o trauma sanguíneo cirurgicamente induzido, tratamento que compreende a administração de uma quantidade aumentada de concentração de Ini bidor Cl de interferão a um paciente substancialmente e concorrentemente, com realização de um procedimento cirúrgico invasor no paciente.

É ainda contemplado um processo para aumentar a concentração intravascular de inibidor Cl num paciente exibindo um sintoma clínico de deficiência em inibidor Cl, processo que inclui a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente efectiva de interferão e/ou IL-6.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 é um gráfico ilustrando o efeito dependente da dose in vitro da estimulação do interferão gama na secreção do ClINH. As células HepG2 foram estimuladas pela adição ao meio de cultura de quantidades variáveis, de 1 unidade internacional (UI) por ml (IFN1) a 100 UI por ml (IFN lOO), de Interferão gama, como descrito no Exemplo 3A. Foi mantida uma cultura de controlo a qual não recebeu interferão gama. As amostras de sobrenadante de cultura foram removidas nos dias indicados e foi determinado o nível de ClINH secretado pelo ensaio de ELISA e exprimi do como nanogramas de ClINH por mililitro médio (ng/ml).

A Figura 2 é um gráfico de barras ilustrando que duas linhas de células de hepatoma diferentes aumentam a secreção de ClINH a seguir à estimulação do interferão gama. Ambas as linhas de células HepG2 e Hep 3B, foram cultivadas com 100 UI por ml (Ul/ml)

BAD ORIGINAL ft

945 SGRF 156.0

-6de interferão gama como descrito no Exemplo 3A· Um conjunto paralelo de culturas de células HepG2 e Hep 3B recebeu interleu quina-6 (IL-6) em vez de interferão gama. Foi também mantida uma cultura de controlo a qual não recebeu estimulação· Ag amos tras de sobrenadantes de cultura foram removidas no dia 1 e dia 3 e foi determinado 0 nível de ClINH secretado em cada sobrenadante de cultura pelo ensaio ELISA e exprimido como ng de ClINH por ml médio {ng/ml).

A Figura 3 é um gráfico ilustrando o efeito dependente da dose in vitro da estimulação da interleuquina-6 (IL-6) na secreção de ClINH. As células HepG2 foram estimuladas pela adição ao meio de cultura de quantidades variáveis, desde nenhum estimulan te (Controlo) até 100 unidades internacionais por ml (U/ml), de IL-6 como indicado, ou pela adição de 100 unidades internacionais por ml de interferão gama (IFN), como descrito no Exemplo 33. As amostras de sobrenadante de cultura foram removidas nos dias indicados e foi determinado o nível de ClINH secretado pelo ensaio ELISA e exprimido como ng/ml.

A Figura 4 é um gráfico ilustrando o efeito aditivo que uma combinação de interferão gama mais IL-6 tem sobre a secreção de ClINH in vitro. As células HepG2 foram cultivadas com interferão gama às concentrações indicadas como unidades internacionais por ml (u/ml). Um conjunto paralelo de culturas de células HepG2 re cebeu IL-6 a 100 unidades internacionais (U/ml) adiclonalmente ao interferão gama adicionado· Ambos os conjuntos de amostras de sobrenadante de cultura resultantes foram removidos passados 6 dias e foi determinado o nível de ClINH secretado pelo ensaio

ELISA como descrito no Exemplo 3B e exprimido como ng de ClINH por ml (ng/ml).

A Figura 5 θ um auto-radiografia ilustrando que o ClINH é sintetizado in vitro a seguir à estimulação do interferão gama como descrito no Exemplo 3B- Ag células HepG2 foram cultivadas com interferão gama a 100 Ul/ml (IFN) ou sem qualquer interferão gama (Controlo) e foram marcadas em cultura com ^^S-metionina du rante 24 horas. Subsequentemente, os sobrenadantes de cultura foram colhidos e imunoreagidos com pérolas de Sepharose 43 conjugadas com anti—ClINH monoclonal. As proteínas presentes nas

945 SGRF I56.O

-7pérolas imunoreagidas sofreram depois electroforese sobre geles de poliacrilamida a 7,5% θ visualizadas por auto-radiografia.

A proteína C1INH marcada migra como uma banda a cerca de 110 quilodaltons (K), em peso molecular.

Descrição Detalhada do Invento presente Invento contempla as novas utilizações para o interferão e a IL-6 nascidas da descoberta de que a administração de interferão de cada um deles ou de ambos aumenta a quanti dade de inibidor Cl(ClINH) presente no sangue do paciente.

Assim, o presente invento contempla um processo para alivi_ ar ou prevenir o trauma sanguíneo num paciente compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade aumentada de concen. tração de inibidor Cl de interferão de preferência interferão gama, ou IL-6, ou ambos·

Como aqui utilizada, a frase trauma sanguíneo refere-se ao estado fisiologico em que o sistema do complemento e/ou o sistema de contacto do sangue de um paciente são activados até um grau clinicamente significativo· i.e·, ate um grau que produz tipicamente sintomas secundários tais como inflamação aguda ou crónica, edema pulmonar, hipotensão vascular e semelhantes.

São bem conhecidos na arte os processos para a determinação da presença de um grau clinicamente significativo de activa ção do sistema do complemento no sangue de um paciente. Aqueles processos ensaiam tipicamente a quantidade de um componente do sistema do complemento activado· Por exemplo, a presença no sangue de uma proporção de fragmento do complemento activado C4D para componente do complemento não-activado C4 num excesso de 1,2, Indica a presença de trauma sanguíneo, i.e., um grau clinicamente significativo de activação do sistema do complemen. to· Ver Mitsche et al, Am. J. Clin. Path., 75^;679-684 (1981). (As doutrinas da arte aqui citada são incorporadas por referência .)

Adicionalmente, a activação do sistema do complemento pode ser determinada por detecção das concentrações intravasculares aumentadas dos componentes do complemento activados Cls, C3a ou C5a. Num processo, o nível intravascular de Cls e medido por

Γ

BAD ORIGINAL

945 SCRF 156.0 — 8— detecção da quantidade de complexo Cls:ClINH presente numa amos tra de sangue como descrito por Lockshin et al, Arthrltls Rheum., 29:1467-1472 (1986). A activação do sistema do complemento é considerada clinicamente significativa se o nível intravascular de complexo Cls:ClINH excede os 12 nanomoles por mililitro (ml) de sangue.

Os dois produtos de activação do complemento, C3a e 05^a» são de particular importância patofisiológica. 0 C3a e o C5a actlvam os neutrofilos, monócitos e basófilos para produzirem radicais oxigénio, metabolitos do ácido araquidónico e histamina. Nos monocitos, o C3a e o 05^a estimulam a síntese das inter leuquinas 1 e 6 (IL-1 e IL-6) resultando em febre e na resposta de fase aguda hepática. Por consequência o G3a β o C5a são mediadores críticos dos sintomas clínicos ocorrendo como o resultado do trauma sanguíneo·

Os níveis intravasculares de C3^a e 05^{a aa}° medidos por radioimunoensaio como descrito por Hugli et al, Techniques and Significance of C3a e C5a Measurement, em Immunoassays: Clinicai Laboratory Techniques for the 1980s., Nakamura et al, eds., Alan R. Liss, New York, pgs. 443-460 (1980)· Um conjunto de etí saio baseado no protocolo de Hugli esta comercialmente disponível no Upjohn Diagnostica (Kalamazoo, ΚΙ). A activação do sistema do complemento é considerada clinicamente significativa se os níveis intravasculares de C3a ou C5a excedem os 200 ng por ml ou os 30 ng por ml, respectivamente, quando ensaiados utilizando o protocolo de Hugli (supra) como discutido por Chenoweth et al, N. Engl. J. Med. 304:497-503 (1981).

A activação do sistema do contacto refere-se ao processo em que os componentes do sistema do contacto, tais como os facto, res de coagulação XI, XII e pré-calicreína, se tornam activados.

A activação do sistema dó contacto resulta na produção de poten. tes péptidos vasoactivos, tais como a bradiquinina, que servem de mediadores nas reacções inflamatórias, e controlam o fluxo sanguíneo e a pressão sanguínea. 0s três componentes activados importantes do sistema do contacto, a calicreína e os factores de coagulação Xla e Xlla são gerados quando os seus precursores não-activados, a pré-calicreína e os factores de coagulação XI

BAD ORIGINAL A

945 SCRF 156.0

-9e XII, respectivamente, são expostos a uma superfície activante do sistema do contacto tal como, por exemplo, as superfícies das membranas basais endoteliais ou as superfícies aniónicas ma cromoleculares tais como as encontradas nas superfícies prostéticas sintéticas. Ver, por exemplo Proud et al, Ann. Rev. Immunol», 6:49-83 (1988); e Kozin et al, The Gontact Activation Sys. tem of Plasma, em Inflammation: Basic Principies and Clinicai Correlates, Gallin et al, eds., Raven Press, Ltd · , P101-120 (1988) .

São bem conhecidos os ensaios para a determinação da presen ça de componentes do sistema do contacto activados no sangue de um paciente, e portanto a presença da activação do sistema do contacto· Por exemplo, os complexos inibidor Cl- calicreína podem ser detectados pelo ensaio imunosorvente ligado a enzima (ELISA) como descrito por Lewin et al, J. Biol . Chem., 258:6415-6421 (1983)· A activação do sistema do contacto é considerada clinicamente significativa quando o nível intravascular de complexo ClINH-callcreína excede os cerca de 5 nanomolar (nM).

Similarmente, os complexos inibidor Cl-factor Xlla podem ser detectados no sangue de um paciente utilizando o ELISA como descrito por Kapian et al , Blood, 60:636-641 (1985)· A activação do contacto e considerada clinicamente significativa quando o nível intravascular de complexo ClINH-factor Xlla é superior a 5 · Alternativamente, a clivagem do quininogénio de elevado peso molecular (QEPil) para formar um produto clivado de menor peso molecular pode ser controlada por monitor no sangue do pac_i ente pelo procedimento de imunomancha de Berrettlni et ai, Biood, 68:455-462 (1986). Porque a clivagem do QEPK ocorre pela acção da calicreína, componente do sistema do contacto activado, a pre_ sença do produto clivado Indica a activação do sistema do contac to· Adicionalmente, o processamento do inibidor Cl para uma for ma modificada do sangue de um paciente é indicativo da activação do sistema do contacto· Uma proteína inibidor 01 modificada de . z t

000 daltons e detectável no sangue de um paciente por meio de um processo de imunomancha descrito por Zuraw et al, J. Clin. Invest·, 78:567-575 (1986).

Alternativamente, a activação do sistema do contacto pode

BAD ORIGINAL

945 SGRF I56.O

-10ser determinada pela medição da actividade coagulante do factor XI activado (p.e. Xla) utilizando o ensaio amidolítico descrito por Scott et al, BIood, 63:42-50 (1984). Naquele ensaio, uma unidade internacional (UI) de factor Xla e a quantidade suficiente para hidrolisar 0,49 micromoles do substrato sintético PyrGlu-Pro-Arg-p-nitroanalido (S-2366) por min por ml. A actlvação do sistema do contacto é considerada clinicamente signifi_ cativa quando o nível intravascular de factor Xla excede as 1,5 UI por ml.

Adicionalmente, a activação do sistema do contacto pode ser indicada pelos sintomas clinicamente apresentados por um pa ciente. Por exemplo, a activação de componentes do sistema do contacto tem sido relacionada com as condições clínicas tais co mo reacções alérgicas, artrite, coagulação intravascular disseminada e choque· Para uma descrição daqueles sistomas, ver Saito, Semln ._Thromb. Hemostatis, 13=36-49 (1987)· termo 'Interferão como aqui utilizado refere-se às formas alfa, beta e gama do Interferão humano, excepto quando de outro modo especificado, quer seja isolado a partir de uma fo£ te humana, quer preparado utilizando um sistema de ADN recombi. nante para a expressão de uma proteína interferão· Por exemplo, a preparação de um Interferão gama humano, recombinante e os processos para a determinação da actividade específica da compo sição preparada, são conhecidos na arte· Ver, por exemplo,

Gray et ai_, Nature, 295^:5O3~5O8 (1982) e Lotz et al, J · Immunol . , 136:3636-3642 (1986). 0 interferão gama recombinantemente produzido está também disponível nos vendedores comerciais tais como Genetech (San Francisco, CA) e Amgen (Thousand Oaks, CA).

Adicionalmente, a preparação de interferões alfa e beta humanos e os processos para a determinação da actividade específica das composições preparadas, são bem conhecidos· Ver, por exemplo Zoon et al_, Proc₂__Natl·· Acad. Scl., USA, 76:5601-5606 (1979); Knight et_ al_, Science, 207=525-526 (19θθ); Stein et al^, Proc· Natl. Acad. Scl., USA, 77=5716-5719 (198o); Armstrong,

Appl· Klcroblol♦, 21:723-725 (1971); Havell et ai, Antlmlcrob . Agents and Chemother., 2:476-484 (1972); e Gray et al, supra.

É também bem conhecida a preparação do interferão alfa e beta humano recombinante· Ver Goeddel et al , Nucleic Aclds 7es.,

BAD ORIGINAL

94-5 SGEF 156.0

-118 · 4-057-4-073 (19So); e Hitzeman et al, Nature, 293=717-722 (1931), para os processos exemplificatIvos da produção recombinante do interferão alfa e beta humano, respectivamente· interferão alfa humano recomblnantemente produzido está também disponível nos vendedores comerciais tais como Schering Gorp. (Madison, NJ), Amgen, Hoche Laboratories (Nutley, NJ) e Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN). 0 interferão beta humano recombinantemente produzido esta também disponível nos vendedores comerciais tais como Cetus (Emeryville, GA).

As frases quantidade aumentada de concentração de inibidor Cl e quantidade terapeuticamente efectiva, referem-se a uma quantidade de interferão ou IL-6 suficiente para aumentar de modo mensurável a concentração do inibidor Cl intravascular do sujeito, de preferência em pelo menos cerca de 10 por cento, de preferência em pelo menos cerca de 50 Por cento e de preferência em pelo menos cerca de 100 por cento- 0 interferão e/ou a IL-6 são tipicamente administrados como uma composição farmacêutica na forma de uma solução ou suspensão- Contudo, como é bem conhe eido, quer o interferão quer a IL-6, podem também ser formulados para administração terapêutica, quer sozinhos quer em mistura, como um comprimido, pílula, cápsula, aerosol, formulação de desprendimento sustida ou péA preparação de composições terapêuticas contendo interferão e/ou IL-6 como ingredientes activos é bem compreendida na arte. Tipicamente, tais composições são preparadas como injectaveis, quer como soluções líquidas quer como suspensões, contu do podem também ser preparadas formas sólidas adequadas para sc> lução ou suspensão em líquido antes da injecção. A preparação pode também ser emulsionada. 0 interferão e/ou a IL-6 são frequentemente misturados com excipientes inorgânicos e/ou orgânicos os quais são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente activo (interferão e/ou IL-6). São excipientes adequados, por exemplo, a água, solução salina, dextrose, glicerol ou semelhantes e suas combinações. Adicionalmente, se desejado, a composição pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes humedecedores ou emulsionantes, agentes tamponantes do pH que elevam a eficiência do Ingrediente activo·

BAD ORIGINAL

945 SCRF 156.0

-12Como aqui utilizada, a frase farmaceuticamente aceitavel refere-se às entidades moleculares e composições que não produ* zem uma reacçao alérgica ou uma reacçao adversa similar, tal co z / mo distúrbio gástrico, vertigem e semelhantes, quando administradas a um humano.

interferão e/ou a IL-6 são convencionalmente administrados subcutâneamente, como, por exemplo, por Injecção de uma dose unitaria. 0 termo dose unitária como aqui utilizado refere-se às unidades fisicamente descontínuas adequadas como dosagens unitárias para humanos, contendo cada unidade uma quantida de predeterminada de interferão e/ou IL-6 calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o excipiente requerido.

interferão é administrado de uma maneira compatível com a formulação de dosagem, e numa quantidade terapeuticamente efectiva. Os processos de administração contemplados incluem injecção, infusão, implante e semelhantes. A quantidade a ser administrada depende da capacidade do sujeito para utilizar o interferão e/ou a IL-6, e do aumento desejado de Inibidor Cl na concentração sanguínea· As quantidades exactas de interferão e/ou IL-6 requeridas para serem administradas dependem do julga mento do médico e são peculiares para cada indivíduo· Contudo, as gamas de dosagem de interferão adequadas são da ordem das

1x10 unidades internacionais (UI) a 10x10 UI por metro quadra _z do (il ) de area superficial do corpo por dia, de preferência 6 6 2'

1x10 UI a 4x10 Ul/M de area superficial do corpo por dia, e dependem da via de administração. As gamas de dosagem da IL-6 4· 6 2' adequadas são da ordem das lxlíj a 1x10 UI/ÍÍ de area superfi- 5 5 ciai do corpo por dia, de preferencia cerca de lxlO⁷ a 6x10 , e 5 2 ' de preferência cerca de 3x10^ Ul/tó de area superficial do cor po .

Como é bem conhecido na arte, a frase unidade internacional (também conhecida na arte como unidade de referência internacional) quando utilizada relativamente ao interferão é uma medida da capacidade de uma preparação de interferão para inibir o efeito citopático devido a infecção virai num ensaio internacionalmente normalizado. A quantidade de unidades internacionais presentes numa dada preparação de interferão aqui » .

BAD OFUG^lNAL &

945 SCRF 156.0

-13descrita é determinada por comparação da actividade naquela pre paração à actividade presente numa amostra padrão internacional da mesma forma de interferão disponível no National Institute of Allergy and Infections Diseases (NIAID), Research Resources Branch (Bethesda, MD, 20205) quando medida por um processo tal como aquele descrito por Lotz et al, J. Immunol. 156:5056-3642 (1986) .

As preparações de interferão gama substancialmente puras exibem tipicamente uma actividade de cerca de 20x10^ UI por miligrama (mg) de proteína interferão· As doses unitárias terapeuticamente efectivas de interferão gama estão por consequência na gama de cerca de 5 microgramas ( /^g) a cerca de 0,5 mg, de preferencia de cerca de 5θ /g ^a cerca de 200 /^g, por K de área superficial do corpo por dia.

As preparações de interferão alfa ou interferão beta substancialmente puras exibem cada uma, tipicamente, uma actividade de cerca de 2x10 UI por mg de proteína interferão. As doses unitárias terapeuticamente efectivas de cada uma destas formas de interferão estão por consequência na gama de cerca de 0,5 y/g a cerca de 50 /g» de preferência de cerca de 5 ^a cerca de 20 ^g, por de área superficial do corpo por dia.

Uma quantidade terapeuticamente efectiva de interferão pode também ser exprimida como uma concentração plasmática. Por exemplo, nas concretizações preferidas do presente invento, o interferão e administrado para alcançar uma concentração plasmática intravascular na gama de cerca de 0,5 UI a cerca de 500 UI por ml, de preferência de cerca de 10 UI a cerca de 50 UI por ml.

A interleuqulna 6 ou IL-6 refere-se à interleuquina humana 6, quer seja Isolada a partir de uma fonte humana, quer preparada pela utilização de um sistema de ADN recombinante para a expressão de uma proteína IL-6. A preparação da IL-6 isolada e os processos para a determinação da actividade específica da composição preparada são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Muraguchi et al , J. Immunol ♦, 127:412-416 (1981), em que a IL-6 é referida como factor de reposição da célula-T ou TRF- A IL-6 isolada esta também disponível nos vendedores comerciais tais como Genzyme (Boston, MA) e Amgen (Thousand Oaks, CA).

BAD ORIGINAL

945 SCRF 156.0

-14Uma medida da quantidade de IL-6 para ser utilizada no pre sente invento é exprimida em unidades internacionais (UI). Uma UI de IL-6 é a quantidade que dá 50 por cento de estimulação má xima de secreção de IgG pela linha de células linfoblastoldes humanas GESS quando medida passados 4 dias da cultura de 5<lC^ células GSSS em 200 microlitros de meio de cultura numa cavidade de uma placa de cultura de microtitulação de cavidade-96 como descrito por Liuraguchi et al, supra. As células GESS podem ser obtidas a partir da American Type Gulture Collection (ATCC; Rockville, MD) e têm o numero de matrícula TIB 190·

Os processos para a determinação da concentração de inibidor Gl no plasma são bem conhecidos na arte, sendo um processo preferido aquele descrito no Exemplo 3· Os processos típicos incluem um ensaio imunosorvente ligado a enzima (ELISA) descrito por Lotz et al, J. Immunol., 139:3332-3387 (1987) e um ensaio de imunoelectroforese de rocket (RIE) descrito por Nitsche et al, Am._J . Cl in . Pathol . , 75 ^: 679-684 (1981). As prepara_ ções de anticorpo anti-inibidor Cl adequadas para utilização nos processos acima para determinar as concentrações de inibidor Cl no plasma podem ser preparadas pelas técnicas imunológicas padrão utilizando proteína inibidor Gl purificada, tal como descri, to no Exemplo 2, ou podem ser obtidas nas fontes comerciais.

Numa outra concretização, 0 presente invento contempla um processo terapêutico no qual o sangue de um paciente é exposto a uma superfície activante do sistema do contacto tal como, por exemplo, como ocorre quando o sangue é feito circular através de um dispositivo prostético· 0 processo inclui a administração de uma quantidade aumentada de concentração (sanguínea) intravascular de inibidor Cl de Interferão, de preferência interferão gama, e de preferência interferão gama em combinação com interferão al_ fa e/ou interferão beta. A administração do interferão é realizada substancialmente e concorrentemente com exposição do sangue do paciente à superfície activante do sistema do contacto, tal como, por exemplo, exposição do sangue do paciente a uma superf£ cie prostética num dispositivo prostético.

dispositivo prostético refere-se a uma prostese vascular biológica ou sintética que é inserida na vasculatura de forma a facilitar o transporte do sangue de um ponto da vasculatura

BAD ORIGINAL Q

/7

945 SORF 156.0

-15do paciente para outro· Uma ''superfície prostética, ou super fície luminal, e a parte do dispositivo prostético que está exposta e em contacto com o sangue transportado·

São bem conhecidos na arte os dispositivos prostéticos tendo uma superfície exposta ao sangue dos pacientes quando eficazmente inseridos no sistema circulatório de um pacienteVer Biological and Synthetic Vascular Prostheses, J. Stanley» ed., Grune e Stratton, Ν.Ύ. (1982).

Os dispositivos prostéticos típicos incluem próteses arte riais, Stents arteriais, corações artificiais, válvulas cardíacas artificiais, derivações artério-venosas, dispositivos terapêuticos ex vivo, e semelhantes. As derivações artério-venosas são tipicamente secções de tubagem não-endotelizada, normalmente construídas de um material polimérico, que são uti llzadas para transportar sangue arterial até uma veia, quer di rectamente quer atravessando primeiro um dispositivo prostético ex vivo· Oa dispositivos prostéticos ex vivo exemplificati. vos incluem os dispositivos de hemodiálise, os dispositivos de derivação cardiopulmonar, e semelhantes- Nas concretizações preferidas, a administração do interferão e realizada antes da exposição do sangue circulante do paciente a uma superfície activante do contacto, de preferência enquanto a concentração intravascular de inibidor Cl é aumentada em pelo menos cerca de 10 por cento, de preferência em pelo menos cerca de 5θ Por cento e de preferência em pelo menos cerca de 100 por cento quando comparada à sua concentração antes da administração do interferão gama. Contudo, são também contemplados os processos em que a administração da quantidade terapeuticamente efectiva de interferão e a exposição do sangue circulante do paciente à superfície activante do contacto são realizadas substancialmente e concorrentemente e em que a exposição e realizada antes da administração.

Por substancialmente e con cor^entemente pretende-se dizer que a administração do interferão e/ou IL-6 ocorre no período de tempo entre 24o horas antes, de preferência 12o horas antes, e 72 horas após o sangue do paciente ser primeiro exposto a superfície activante do contacto· Gontudo, nas concretiza.

BAD ORIGINAL

L.

945 SCRF 156.0 // </

-16çÕes preferidas, a administração do interferão é realizada num período de tempo de 4 a 48 horas, de preferência 8 a 24 horas, antes da exposição do sangue do paciente à superfície activante do contacto ou realização da cirurgia invasiva. Noutras concretizações preferidas, são dadas ao paciente administrações em série de interferão e/ou IL-6 a intervalos de cerca de 24 ho ras, tais como a 72, 48 e 24 horas, antes da exposição do sangue dos pacientes a uma superfície actlvante do contacto ou rea lização de cirurgia invasiva.

A administração de uma quantidade terapeuticamente efectiva de interferão, de preferência interferão gama, é também um tratamento efectivo para um sintoma clínico num paciente devido a uma deficiência em inibidor Cl. São bem conhecidos na arte os processos para diagnosticar a presença de deficiência em ini bidor Cl num paciente (sujeito humano)· Ver Kalter et al, J. Infect . Pis., 1511019-1027 (1985)· Aqueles processos incluem as medições directas das concentrações de inibidor Cl no plasma pelos processos ELISA e RIE aqui descritos.

Alternativamente, os processos indirectos podem indicar ao medico diagnosticante a presença de deficiência em Inibidor Ci · Por exemplo, o sangue de pacientes tendo deficiência em inibidor Cl adquirida contem níveis diminuídos ou não detectáveis dos componentes do complemento Cia, Cl, C4 e C2. Davis et al, Ann. Rev· Immunol., 6:595“628 (1988). Por consequência z

os ensaios que medem os niveis destes componentes do complemeri to no sangue, têm a capacidade de indicarem a presença de uma deficiência em inibidor Cl.

Adicionalmente, pode ser indicada uma deficiência em inibidor Cl pelos sintomas clinicamente apresentados por um paclz ente. Por exemplo, os pacientes com angloedema hereditário exibem sintomas característicos conhecidos por serem causados por uma deficiência genetica em inibidor Ci. Para uma descrição daqueles sintomas ver Gelfand et al, Medicine, 58'-321~328 (1979)^: θ Frank et ai, Ann. Int. Med · , 84:580-593 (1976).

A administração de uma quantidade aumentada de concentração de inibidor Cl de interferão é também um auxiliar terapeuticamente efectivo para realizar a cirurgia invasiva. 0 termo

BAD ORIGINAL

L..

945 SGPF 156.0

-17cirurgia invasiva como aqui utilizado não inclui a mera punção da pele do paciente, p.e., por uma agulha hipodértnica, não sendo realizado apos isso um procedimento medico assistente substancialmente e concorrentemente.

Os procedimentos médicos assistentes exemplificativos são os procedimentos de cirurgia invasiva que penetram a derme e expõem o sangue do paciente e outros fluidos corporais e tecidos aos materiais estranhos, dispositivos, prósteses, cateteres e semelhantes. Tais procedimentos cirúrgicos incluem mas não estão limitados à hemodiálise, derivação cardiopulmonar, catete rizações tais como angioplastia, assistência arterial por balão e transplante de órgãos.

Numa concretização o contemplado no procedimento de cirurgia invasiva e a infusão, tal como por cateterizaçãc, de meios de contraste radiográfico (KCr?) para fins de diagnóstico· Diz-se que as infusões de ECR resultam na activação do sistema do complemento /~Arroyave et al, J. Immunol., 117:1866-1869 (1976); Fareed et al , Sem. Thromb. Hemostasis, IC :306-528 (1984_7 e na activação do sistema do contacto /~Zuraw et al, Ai 1 erg. 011 n . Immunol., 81:225; A218 (1988)_7· Assim, esta concretização co_n templa a administração de uma quantidade aumentada de concentra ção de inibidor Cl de interferão como um auxiliar para realizar uma infusão de EOR.

presente invento contempla ainda composições farmacêuticas, de preferência estéreis e contendo de preferência um excipiente farmaceuticamente aceitável, que pode ser administrado, com ou sem diluição, para produzir um aumento na concentração de C1INH, de preferência um aumento de peio menos 10%, num sujeito humano· Uma tal composição contém interferão gama rnistu rado num excipiente farmaceuticamente aceitável com interferão alfa e/ou interferão beta em que o Interferão é o único ingred^ ente biologicamente activo. De preferência cada interferão es tá presente numa concentração de peio menos cerca de 10 OCO Ul/ /ml, de preferência de pelo menos cerca de 100 000 Ul/ml.

Uma outra composição farmacêutica do presente invento contém IL-6 em combinação (mistura) com interferão, de preferência interferão gama, em que o interferão e a IL-6 são os únicos ingredientes biologicamente activos e estão ambos presentes numa

BAD ORIGINAL

945 SCRF 156.0

-18concentração que permite, pelo menos, a administração terapêutica. Nas concretizações preferidas, a IL-6 e cada interferão presente estão presentes numa concentração de pelo menos cerca de 10 000 Ul/ml, de preferência de pelo menos cerca de 100 000 Ul/ml.

Exemplos

0s exemplos seguintes destinam-se a ilustrar, mas não a limitar, c presente invento.

1. Isolamento da Proteína Inibidor Cl

A 400 mililitros (ml) de plasma citrado foram misturados os seguintes, para produzirem as concentrações finais indicadas nos parêntesis: aprotinina (353Ul/ml), benzamidina (0,1 mg/ml), 1,10-fenantrolina (C,0lmí-'), e fluoreto de fenilmetilsulfonilo (lmil·)· A proteína ClINH foi então isolada a partir da mistura plasmatica de acordo com os processos de Salvesen et al, J. Blol. Chem., 260:2432-2436 (1985), cuja revelação é por este meio incorporado por referência, para formar cerca de 5 ^mS óe proteína ClINH purificada que migra como uma banda substancialmente pura de cerca de 110 000 daltons de peso mol£ cular quando analisada por electroforese em gel de pollacrilamlda na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE).

2. Preparação de Anticorpos Antl-CIINH

Foram imunizadas cabras utilizando a proteína C1INH purificada preparada como descrito no Exemplo I por utilização das s

técnicas bem conhecidas na arte. 0s antisoros de cabra resultantes foram colhidos para formar antisoros anti-CUNH humanos.

A imunoglobulIna IgG foi isolada a partir dos antisoros por precipitação com sulfato de amónio. Foi preparado um precipitado de sulfato de amonlo a 4o/ e foram recuperados os anti. corpos IgG precipitados para render os anticorpos IgG anti-CUNH.

A proteína ClINH purificada, preparada como descrito no Exemplo 1, foi conjugada com a CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Upsala, Sweden) utilizando quantidades e processos recomendados pelo fabricante para formar inibidor conjugado com Sepharose. 0s anticorpos IgG anti-CUNH foram misturados com o inibidor conjugado com a Sepharose e mantidos durante um perío. do de tempo suficiente para formar um complexo anticorpo-inlbidor · Os anticorpos anti—C1INH presentes no complexo anticorpoBAD ORIGINAL fi

94-5 SCRF 156.0

Z-l

Λ'

-19-inibidor foram então recuperados por subsequente tratamento recomendado da Sepharose conjugada contendo complexo ligado pa ra produzir os anticorpos anti-ClINH purificados por afinidade3· Secreção de Inibidor Cl pelas Células do Fígado In Vitro

A. Detecção do Inibidor Cl Produzido pelas Linhas de Celulas do Hepatoma Tratadas com Interferão

As linhas de células do hepatoma HepG2, Hep3B e Alexander PLC obtidas a partir da American Type Culture Collection (HB 8065, HB 8o64 e CRL 8024, respectivamente; ATCC, Rockville, MD) foram cada uma cultivadas em meio de RPMI 1640 contendo soro bo vino fetal a 10$, L-glutamina, e antibióticos. Quando as cultu ras destas linhas de células alcançaram, a confluência, os meios de cultura foram removidos, e foram adicionados a cada cultura meios frescos contendo 0,01 a 10 Ul/ml de interferão gama. Foi colhida uma amostra de meio (sobrenadante de cultura) de cada z

cultura aos vários tempos indicados na Figura 1 e foram congela das a menos 20 graus C. A quantidade de inibidor Cl nas amostras de meio colhidas foi então determinada utilizando o ensaio Imunosorvente ligado a enzima (ELISA) descrito abaixo·

Foram adicionados cerca de 100 microlitros (^1. ) de uma solução de revestimento contendo anticorpo anti-ClINH humano, de cabra purificado por afinidade, preparado como descrito no Exem pio 2 e a uma concentração de 2,5 microgramas (jip) por ml de s£ lução salina tamponada com fosfato (PBS) às cavidades das placas de microtitulação de cavidade-96 de fundo chato (Immulon 2; Dynatech Laboratories Chantilly, VA). As placas foram então mantidas durante 6 horas a 4 graus C para permitir aos anticorpos adsorverem em direcção às paredes das cavidades. A solução de revestimento foi então removida por inversão e agitação.

Foram então adicionados a cada cavidade cerca de 100 1 de solução de bloqueio /~5 mg/ml de gama globulina de bovino, 1 mg/ /ml de seroalbumina de bovino (BSA), 1 mg/ml de gelatina em PBS contendo 0,05$ de Tween 20_7. A solução de bloqueio foi mantida nas cavidades durante 16 horas a 4 graus 0 para bloquear o exce_s ligação da proteína e depois removida por inverAs cavidades foram então lavadas com uma solu(PBS)) contendo 0,05$ de Tween ²°)’ ^{três veZes} so de locais de são e agitaçãoção de lavagem

EJML· orilGINAL

L

945 SGRF I56.C

-20para remover qualquer proteína não-ligada.

Foram adicionados duzentos jM de amostra de meio colhida, diluída a 9:1 em tampão de soro /~0,0ΐΧ de tampão fosfato contendo 1 mg/ml de gelatina, 0,82/ de NaCl, 0,1 mg/ml de timesoral , 1 mg/ml de BSA, e 0,05/ de Tween 2o_7 às cavidades bloque, adas para formar misturas imunoreactivas. As cavidades foram então mantidas durante 16 horas a 4 graus G para permitir a ocorrência de uma imunoreacção· Subsequentemente a amostra de meio colhida foi removida das cavidades imunoreagidas por inver são e agitação e as cavidades foram lavadas três vezes como anteriormente .

Foi preparado um anticorpo anti-ClINH monoclonal como descrito por Zuraw et al, J . Allergy ._Gl_ln _Immunql., 73:155 (1934).

Foram misturados cerca de 100 ytl de uma solução contendo anticor po anti-ClINH monoclonal a uma concentração de 2/g/ml em tampão anti-íg /~0,011. de tampão fosfato contendo 0,82'· de NaCl , 0,1 mg/ml de timesoral, 5 mg/ml de BSA, e 0,05^’ de Tween 20__7 ^a cada cavidade imunoreagida, e as cavidades foram mantidas durante 3 horas à temperatura ambiente com agitação· A solução de anticorpo monoclonal· foi então removida por inversão e agitação e as cavidades foram lavadas três vezes como anteriormente.

Foram adicionados cerca de 100 /1 de uma solução contendo conjugado de peroxidase de rabano silvestre de cabra IgC-anti-ratinho (Cal Tag Laboratories, S-F·, GA) diluída e 1:4000 em tampão anti-Iga cada cavidade e as cavidades foram mantidas à temperatura ambiente durante 2 horas com agitação. Subsequente, mente o conjugado de peroxidase de rábano silvestre foi removido por inversão e agitação e as cavidades foram então lavadas três vezes como anteriormente, seguidas por duas lavagens com PBS .

Foram adicionados, cerca de 100 ^1 de uma solução de substrato cromogenico contendo acido 2,2'-azino-di-3-etilbenzot iazol ina-6-su lf oni co (Sigma Ghemical Go · , St. Louis, i»10 -) a uma concentração de 1 mg/ml em solução tampão (94 mX de 53 mil de ácido cítrico, pK 4,6, 0,005/ de H2O2), a cada cavidade e as cavidades foram mantidas durante 20 a 60 minutos à temperatura ambiente com agitação para permitir a ocorrência de um bad original £

945 SCRF 156.0

-21produto de reacção formando

A densidade optica da solução em cada cavidade foi então lida com um Leitor de iíicroplacas MP600 (Dynatech, Alexandria, VA) para determinar a quantidade de produto de imunoreacção contendo 01INH formado e proporcionar assim uma medida da presença de 01INH em cada amostra de meio de cultura .

Os resultados do ensaio ELISA acima são mostrados na Figura 1. A quantidade de C1INH detectada é exprimida como uma concentração em nanogramas (ng) por ml, calculada por comparação aos valores de densidade optica obtidos para as amostras contendo quantidades conhecidas de proteína 01 INH purificada. Todas as medições ELISA são exprimidas como a media das determinações em duplicado. A todas as concentrações de interferão gama testado, incluindo 0,1 Ui/ml e 0,01 Ul/ml, a quantidade de 01INH secretado pelas células HepG2 foi mais elevada do que a quantida de espontaneamente secretada em culturas não estimuladas. Os re sultados deste estudo demonstram que a adição de interferão gama _Λ z as células HepG2 em cultura estimulou um aumento dependente da dose na quantidade de ClINH secretado pelas células.

Utilizando amostras de meio colhidas das células HepqB esti_ muladas com interferão gama, foram obtidos resultados similares no ensaio ELISA acima. Gomo mostrado na Figura 2, o interferão gama aumentou a quantidade de 01INH secretado pelas células HeppB ·

Utilizando amostras de meio colhidas obtidas das células Alexander PLC estimuladas com interferão gama, foi observado um aumento na secreção de ClINH no ensaio ELISA acima. Contudo, o nível de 01INH secretado após cultura com interferão gama a 100 Ul/ml durante 3 dias produziu uma concentração de ClINH acumulativa de 13θ ng/ml, em comparação com um nível· constitutivamente produzido de 95 ng/ml quando cultivadas na ausência de interferão gama. Estes resultados demonstram que quer as células Hep3B quer as células Alexander PLC aumentam a secreção de ClINH quando estimuladas com interferão gama.

z

B. Detecção do Inibidor 01 Produzido Pelas Linhas de_Qel_uJ_ã.g. do Hepatoma Tratadas_com Interferão e IL-6 .

Um~aumento similar mas inferior na secreção de 01 INH foi estimulado quer nas células Hep3B quer nas células HepG2 quando

BAD ORIGINAL C/

945 SCRF I56.O

-22foi adicionada interleuquina-6 (IL-6; obtida da Osaka University, Osaka, Japan) a 100 UI por ml às culturas em vez do interfe rão gama adicionado como descrito no Exemplo 3A. Ver Figura 2.

Uma sensibilidade, à dose para a secreção de ClINH por estimulação com IL-6 foi também demonstrada pela adição de 1 UI/ /ml a 100 Ul/ml de IL-6 em vez do interferão gama às culturas de HepG2 e medição do ClINH secretado pelo ensaio ELISA descrito no Exemplo 3A. como mostrado na Figura 3» a IL-6 estimula um aumento dependente da dose na quantidade de ClINH secretado pelas células HepG2.

Foi produzido um efeito aditivo na secreção de ClINH pela administração simultânea quer do interferão gama quer da IL-6 a uma cultura de células HepG2 . A seguir ao procedimento do Exemplo 3A para a estimulação das células HepG2, as culturas de células foram estimuladas com meios frescos contendo quer (1) quantidades variadas de interferão gama de 0 a 1000 UI por ml, quer (2) uma quantidade constante de IL-6 a 100 UI por ml. Foi então determinada a quantidade de inibidor Cl nas amostras de meio colhidas utilizando o ensaio ELISA descrito no Exemplo 3A· Como mostrado na Figura 4, os resultados indicam que a IL-6 adicionada aumenta o nível de secreção de inibidor Cl numa quantidade relativamente constante de cerca de 4o ng por ml , lndepen. dente da dosagem dointerferão gama.

Assim, nas concretizações preferidas, os processos do presente invento incluem a administração de uma quantidade aumentada de concentração de Inibidor Cl de IL-6 em conjunção com a administração da quantidade terapeuticamente efectiva de interf erão·

C. Detecção do Inibidor Cl Produzido pelos Hepatócitos Humanos Primários Tratados com Interferão 0u. outras Citoqulnas

Oa hepatócitos humanos primários foram isolados a partir de uma biópsia do fígado fresco, e foram estabelecidas as culturas primarias. Às culturas foram então estimuladas com variadas ciz toquinas e os sobrenadantes de cultura foram colhidos apos as culturas serem mantidas pelos períodos de tempo indicados na Tabela 1. Foi então determinada a quantidade de inibidor Cl secre tada em cada sobrenadante de cultura utilizando o ELISA descrito

BAD ORIGINAL

945 SCRF 156.0

-23no Exemplo 3A· Os resultados deste estudo sào mostrados na Tabela 1 e Indicam que 0 ClINH foi secretado pelos hepatócitos primários estimulados com interferão gama apos cerca de 44 horas e subsequentemente o nível de ClINH continuou a aumentar com 0 tempo· Adicionalmente, os resultados indicam que a secre ção de ClINH pelos hepatócitos primários foi estimulada pela IL-6 e pelo factor alfa da necrose Tumoral (TNF).

Tabela 1

Secreção de ClINH pelos Hepatócitos Humanos Primários In Vltro^

Se cr e ção de ClINH

S s t ímu10	11 hr	18 hr	44 hr	Dia 3	Dia 4
Nenhum	0	0	0	0	0
IFN	0	0	1 ,07	1,51	3,98
IL-6	0	0	0	0,45	0,69
LPS	0	0	0	0	0
IL-1	0	0	0	0	0
TNF	0	0	0	0,42	1,21
—	—	—
1 . A secreção	de ClINH	pelos	hepatócitos	z prImar ios	e exprimida

como uma concentração de proteína em ng/ml.

OIFN indica o interferão gama adicionado a 50 Ul/ml. 0 IL-6 In dica a interleuqulna-6 adicionada a 50 Ul/ml. 0 LPS indica o lipopollssacárido (Sigma) adicionado a 100 ng/ml. 0 IL-1 indi ca a interleuquina-1 obtida do Dr. C. Dinarello (Tufts Univers_i ty, Boston, MA), adicionada a 20 ng/ml. 0 TNF indica o factor alfa da necrose tumoral, obtido do Dr . H. Shepard (Genetech), adicionado a 20 ng/ml.

D. Radioimunopreclpltaçao do Inibidor Cl.

C controlo e as células HepG2 tratadas com interferão gama a 100 Ul/ml, cultivadas como descrito no Exemplo 3A, foram lava.

das três vezes com PBS para remover o meio de cultura. Ambas as culturas foram então posteriormente cultivadas em meio de cultura livre de metionina contendo 2/ de PBS e 4o uCi/ml de z c / ^S-metionina (NEG-009T, New England Nuclear, Boston, MA) durante 24 horas. Subsequentemente, o meio foi recolhido e

Γ

BAD ORIGINAL

945 SCHF 156-0

-24centrifugado, e foi retido o sobrenadante de cultura marcado.

Uma amostra do anticorpo anti-ClINH monoclonal, preparada como descrito no Exemplo 3A foi conjugada com pérolas de Sepha rose 43 (Pharmacia) utilizando cs processos recomendados pelo fabricante. Foram misturados cem ou duzentos e cinquenta ^Al de sobrenadante de cultura marcado com 4c ^íaI de uma suspensão a 50% (v/v) das pérolas conjugadas com Sepharose em solução sa lir.a tamponada com fosfato (PBS), e mantidos durante 1 hora à temperatura ambiente com suave agitação contínua num Tommy àíT-300 para formar as pérolas imunoreagidas. (Peninsula Laboratories, Belmont, CA).

A seguir a esta imunoreacção, as pérolas foram então lava das 10 vezes com PBS-Tween (PBS contendo 0,05% de Tween 2o) pa ra remover todas as proteínas não-absorvidas - As pérolas foram então ressuspendidas em tampão amostra Ζ~Ο,Ο625 M de Tris, pH 6,8, 3% de SDS, 10% de glicerol, e azul de bromofenol_7> e z Z as pérolas ressuspendidas foram mantidas num banho de agua fer vente durante 5 minutos. As pérolas ressuspendidas foram então centrIfugadas e foram retidos os sobrenadantes resultantes. Os sobrenadantes foram então aplicados a geles em placas de po llacrilamlda a 7,5% θ sofreram electroforese de acordo com os processos de Laemmlí et al, Nature, 227:680-685 (1970) para separar as proteínas imunoabsorvidas. A seguir à electrofore se, os geles foram secos para remover o excesso de humidade e expostos a filme de raio X para formar auto-radiografias.

As auto-radiografias resultantes são mostradas na Figura 5 ^e demonstram a migração do Cl INH como uma proteína de cerca de 110 quilodaltons (K) em peso molecular, que foi secretada por células HepG2 tratadas com uma quantidade aumentada do Inibidor Cl de interferão gama. Se bem que as células de controlo tenham mostrado secretar um nível muito baixo de C1INH, só detectável passados 7 dias, as células tratadas com interferão gama secretaram ClINH em grandes quantidades passadas menos de 24 horas de tratamento. Estes dados indicam que o interferão gama estimula as células HepG2 para sintetiza rem ClINH in vitro .

4. NÍvels de C1INH no Soro em Pacientes com Resposta de Fase

Aguda

Foi obtido soro de 38 pacientes e cada um deles foi filtrado bad original

945 SGRF 156.0

-25pelo procedimento de laboratório clínico normalizado e habitual denominado o Perfil de Electroforese de proteínas do Soro (SPEP). Dezanove dos soros filtrados por SPSP exibirem níveis de inlbidor da alfa^-proteínase aumentados indicativos de uma resposta de fase aguda clássica e os restantes 19 soros exibiram níveis de inlbidor da alfa^-proteínase normais.

Estes mesmos 38 soros foram também filtrados para determl nar os seus níveis de ClINH pelo procedimento de imunoelectroforese de rocket (IE) descrito por Nitsche et al, Amer. J.

Cl in. Path., 76:5 (1981). Os anticorpos IgG anti-CUNH preparados como descrito no Exemplo 2 foram diluídos a 10:1 em tampão de barbital /~0,04 K de barbital , 0,05% be azida de sódio, 10 mil de acido etilenodiaminotetraacetico (EDTA), pH 8,6_7 e misturados a 1:1 com uma solução de agarose a 1,8% (p/v) em tampão de barbital para formar placas de agarose contendo anti corpo de acordo com os processos de Nitsche et al· (supra) .

Uma amostra de soro de paciente foi diluída a 3^;1 em tampão de barbital, foram adicionados dez ^1 da amostra diluída às cavidades perfuradas nas placas de antlcorpo-agarose e a amostra sofreu electroforese.

Foi determinada a área contida no arco (rocket) precipi. tado resultante na placa de RIE que sofreu electroforese por planimetria utilizando um planímetro polar compensador modelo L-20 (Los Angeles Scientific Instrument Company, Los Angeles, CA) ·

Foi então determinada a concentração de ClINH numa amostra de soro pela medição da area do rocket, por comparação à área do rocket obtida utilizando uma diluição em série de uma solução contendo as quantidades conhecidas de inlbidor Cl purificado preparado como descrito no Exemplo 1. 0 nível médio de ClINH foi significativamente superior para a média dos 19 soros de pacientes com uma resposta de fase aguda (/~C1INH_7 média igual a 35 ,1+5*6 mg/decilitro /~dl_7) quando comparado ao nível médio de ClINH determinado para a média dos 19 soros normais (/~C1INH_7igual a 26,3+4,1 mg/dl) .

Estes resultados indicam que os níveis de proteína ClINH correlacionam—se com os níveis de inlbidor da alfa^—proteínase .

BAD ORIGINAL

Porque o Inibidor da alfa^-proteínase e um componente da resposta de fase aguda, esta correlação indica que ele mesmo uma proteína de fase aguda.

5· Aumentos In Vivo de Inlbldor Cl por administração

945 SCRF 156·0

-26β*⁴' principal o C1INH é de Interferão gama.

Os pacientes com doença granulomatosa crónica (CGD) recebe ram 2 milhões de UI de interferão gama recombinante (Genetech) por injecção subcutânea a intervalos de 24 horas- Foram obtidas amostras de plasma dos pacientes Imediatamente antes da pr_i meira Injecção e também acs tempos indicados na Tabela 2 após a primeira Injecção. As amostras de plasma foram também obtidas a partir de um dador de controlo que não recebeu injecções.

As amostras de plasma obtidas a partir de um dos pacientes com CGD (Paciente A) e de um dador de controlo foram então analisadas para determinar a concentração de ClINH utilizando a imunoelectroforese de rocket (RIE) como descrito no Exemplo 4 exceptuando que foram adicionadas amostras de plasma não diluído às cavidades perfuradas das amostras de soro diluídas.

São mostrados na Tabela 2 os resultados de uma análise de RIE do plasma do paciente A e do dador de controloTabela 2

Analise de RIE do Efeito do Interferão
Gama no Inibidor Cl In	Vitro
z z

Amostragem	Niveis Plasmaticos de	Cl INH
tempo	Paciente A	Controlo
2 Antes	10c	237
18 hora	137	251
48 hora	166	231
20 hora	199	p NT^

Os niveis plasmaticos sao exprimidos como uma percentagem da quantidade detectada no paciente A ao tempo de amostragem antes

Antes indica que a amostra foi obtida imediatamente antes da primeira injecção com interferão gama.

BAD ORIGINAL L__

945 SCRF L56.C

-27' M.T. indica amostra não testada.

Como pode ser observado da Tabela 2, os níveis de CllfH z

plasmaticos para o paciente A aumentam continuamente a seguir às injecções enquanto que o nível de ClINH no plasma do dador de controlo permanece relativamente constante. Os resultados demonstram a capacidade in vivo do interferão gama do paciente para aumentar uma concentração intravascular de C1INH.

As amostras de plasma dos pacientes com CGD foram também analisadas para o C1INH pelo ensaio ELISA descrito no Exem pio 3A, exceptuando que as amostras de plasma foram primeiro diluídas a 8000:1 em tampão de soro antes de serem adicionadas às cavidades bloqueadas. São mostradas na Tabela 3 os r sultados da análise ELISA das amostras de plasma de pacie tes com CGD <x> I d

Tabela 3

Análise ELISA do Efeito In vivo do

Interferão Gama

Amostragem

Tempo

Antes 14 hora dia dia dia 7 dia

no Cl INH	Intravascular
NÍveis	, 1 Plasmaticos de Cl INH no
	Paciente
A^	3 Controlo
98	103 140 177
105	193
106
150

129

Os dados são exprimidos como a concentração emy^g/ml de Cl INH presente no plasma2 antes indica que a amostra foi obtida imediatamente antes da primeira injecção com interferão gama.

A é o mesmo paciente recebendo a mesma marcha de terapia com interferão gama como descrito na Tabela 2.

Oa resultados demonstram que a seguir à administração de interferão gama por injecção subcutânea o C1INH intravascular aumentou nos pacientes com CGD·

BAD ORIGINAL S

945 SCRF I56.O

-28A quatro pacientes com artrite reumatóide foram dadas 2 milhões de UI do interferão gama recombinante (Amgen) uma vez por semana por injecção subcutânea· Foram tiradas amostras de plasma dos pacientes imediatamente antes da primeira injec. ção e foram também tiradas a cerca de 2 a 4 semanas apos a primeira injecção dependendo do paciente. As amostras de pla.s ma foram então analisadas por RIE como descrito acima para o plasma dos pacientes com CGD·

São mostrados na Tabela 4 os resultados obtidos utilizando amostras de plasma dos quatro pacientes com artrite reumatóide ·

Tabela 4

Analise de RIE do Efeito In vivo do Interferão Gama no Inibidor Cl em Pacientes com

Artrite Reumatóide

Amostra

Tempo '“V’

Antes

Após¹

Niveis Plasmátlcos de ClINH^ A B G

1,546 1,458 1,055

2,154 1,705 1,702

D

1,581 1,689

Z Z

Os numeros indicam a area superficial de um rocket de PIE como medida por um planímetro para as amestras de plasma obtidas dos pacientes de A até D aos tempos indicados .

Antes” indica que a amostra foi tomada imediatamente antes da injecção com interferão gama.

' Apos indica que a amostra foi tomada às 2 ou 4 semanas após a primeira injecção de interferão gama dependendo do paciente .

Os resultados indicam que todos os pacientes tratados por injecção subcutânea com interferão gama exibem um aumento nas concentrações de inibidor Cl intravasculares.

que antecede destina-se a ser ilustrativo do presente invento mas não limitante. Podem ser efectuadas numerosas variações e modificações sem afastamento do verdadeiro espírito e âmbito do invento.

BAD ORIGINAL <

945 SCRF 156*0

Claims

1-· - Processo de preparação de um medicamento para tratamento dos sintomas clínicos de deficiência em inibidor Cl, caracterizado por compreender a mistura de um excipiente farmaceuticamente aceitável com uma quantidade de interferão gama suficiente para proporcionar uma dosagem de 1x10° a lQxlO⁸Ul/m de area superficial do corpo, ou com uma quantidade de interleuquina-6 suficiente para proporcionar uma dosagem de 1x10^ a lxio Ul/m de area superficial do corpo, ou com ambas as quantidades de interferão gama e interleuquina-6.

25. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido excipiente farmaceuticamente aceitável ser um 1íquido·

3-· - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por 0 referido líquido incluir agua.

4?. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida quantidade de interferão gama ser sufici

662 — ente para proporcionar 1x10° a 4xlo Ul/m .

55. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida quantidade de Lnterleuquina-6 ser sufici^ ente para proporcionar 1x10^ a 6x10° Ul/m ·

65. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por estarem presentes no medicamento o referido interferão gama e a referida interleuquina-6 .