PT91503B - Processo para a preparacao de uma molecula de adn recombinante capaz de expressar a sub-unidade alfa do lfa-1 ou um seu derivado funcional - Google Patents

Description

Descrição da patente de invenção de DANA FARBER CÂNCER INSTITUTE, instituto de investigação científica, norte-americano, com domicilio 44, Binney Street, Boston, Massachusetts 02115, Estados Unidos da América, (inventores: Timothy Alan Springer e Richard Larson, residentes nos E.U.A.), para:

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA MOLÉCULA DE ADN RECOMBINANTE CAPAZ DE EXPRESSAR A SUB-UNIDADE ALFA DO LFA-1 OU UM SEU DERIVADO FUNCIONAL

DESCRIÇÃO i DOMINIO DA INVENÇÃO

I j

A presente invenção refere-se ao receptor de adesão de leucócitos LFA-1. Para além disso a invenção ί refere-se à clonagem de sequências de ADN que codificam para J a sub-unidade alfa desta molécula. Esta invenção foi em parte feita com o apoio do governo. O governo possui certos i

direitos sobre esta invenção.

DESCRIÇÃO DA MATÉRIA RELACIONADA

O sistema imunitário é responsável pela protecção de um animal dos invasores estranhos, tais como bactérias, virus, etc.. Uma excelente revisão do sistema de defesa é-nos facultada por Eisen, H. W. (in: Mlcroblology, 3^a Ed., Harper & Row, Philadephia, PA (1980), págs. 290-295 e 381-418). A capacidade do sistema imunitário para proteger um animal de invasores estranhos depende, em grande medida, da presença e do funcionamento das células do sangue conhecidas como leucócitos. VerifiI.

cou-se que capacidade dos leucócitos proporcionarem tal 1 protecção requer que estas células adiram a substractos j celulares e extra-celulares.

Por exemplo, os leucócitos tem de ser capazes de se ligarem a células endodeliais de modo a pode! rem migar da circulação para lugares onde a inflamação ocorre, Para além disso, eles devem ligar-se às células de antigene presentes para que assim possa ocorrer uma resposta imunitária, Os leucócitos devem também eer capazes de se ligarem a células alvo adequadas para que assim possa ocorrer a lise das células infectadas pelo virus (ou de ! tumor). Para além disso os leucócitos devem ser capazes ii de se ligarem a diversas proteinas activadas (tal como i iC3b - a forma activada do terceiro componente do complejl , mento) porque assim e-lhes possível efectuar eficientemente ji a fagocrtose e eliminar os resíduos microbianos e celulares. í^: Assim, a adesão dos leucócitos é um requisito do normal

I i funcionamento do sistema de defesa do hospedeiro. A inibii ção deste sistema de defesa é desejável em casos tal como >' a transplantação, porque o hospedeiro vê” 0 tecido transplantado como um estanho e inicia uma resposta imunitária i contra aíjuele tecido. A adesão dos leucócitos é, por conse!5 guinte, envolvida também na rejeição de tecidos e de órgãos transplantados. Por isso, uma compreensão da adesão do leucócito permite-nos o aumento da capacidade de um animal para

lutar contra a infecção a supressão da capacidade de ud animal de rejeitar tecido transplantado,

Recentemente, as moléculas da superfície dos leucócitos envolvidas na mediação da adesão dos leucócitos foram identificadas usando a tecnologia dos hibridomas. Resumidamente, foram identificados os anticorpos monoclonais dirigidos contra células T humanas (Davignon, D., et al., Proc. Natl, Acad. Scl USA 78:4335-4539 (1981) e células de baço de rato (Springer, Ϊ., et al.,

Eur. J. Imunpl. 9:301-306 (1979)) que se ligam às superfícies dos leucócitos e inibem as funções relacionadas com a ligação descritas acima (Springer, 2., et al.. Fed. Proc. 44:2660-2663 (1985)). As moléculas que foram reconhecidas por estes anticorpos compreender um conjunto de receptores de adesão de leucócitos conhecidos como família de Antigene-1 Associado à Função dos Linfócitos (Lypphocyte Function-Associated Antigen-1 family ou a familia LFA-1) de moléculas de receptores de adesão.

A familia LFA-1 de moléculas de receptores de adesão contém três glicoproteínas de superfície celular altamente relacionados. Verificou-se que estas glicoproteínas medeiam as interacções célula-célula na inflamação. As glicoproteínas foram designadas por LFA-1 (antigene-1 associado à função dos linfócitos). Ma e pl5O,95. Enquanto que o LFA-1 é encontrado nas superfícies de muitos leucócitos Springer, T. A., et al., Immunol. Rev. 68:111-135 (1982), o Mac-1 e o pl5O,95 são encontrados essencialmente nos macrófagos, nos granulócitoe e noutros grandes linfócitos granulares (Springer, T.A. et al. Immunol. Rev. 68 11-135 (1982): Keizer, G., et al., Eur. J. Immunol. 15: 1142-1147 (1985)).

A família de glicoproteínas LFA-1 é composta por heterodimeros, contendo cada um uma sub-unidade alfa que não está associada por covalência com a sub- 3 -

-unidade. Tem-se verificado que as sub-unidades alfa da família diferem umas das outras e são designadas por CDlla, CDllb e CDllc respectivamente. As sub-unidades alfa glicosiladas tem aproximadamente 180, 170 e 150 kD. Em contraste verificou-se que a sub-unidade beta da família LFA-1 de reoeptores de adesão é idêntica e tem um peso molecular de 95 kD (Sanchez-Madrid, F., et al.. J. Exper.

Med 158:1785-1805 (1985): Keizer, G. D., et al.. Eur. J. Iamunol. 15:1142-1147 (1985): Springer, T., Fed. Proc.44: 2660:2665 (1985); Sanchez-Madrid, F., et al.. J. Exper.

Med. 158: 586-602 (1985)).

Embora as sub-unidades alfa das glicoproteínas não representem a homologia extensa partilhada pelas sub-unidades beta, análises mais aproximadas das sub-unidades alfa das glicoproteínas revelaram que existem semelhanças substanciais entre elas. São proporcionadas revisões das semelhanças entre as sub-unidades alfa e beta da família de glicoproteínas de molécula de adesão por Sanchez-Madrid, F., et al. (J. Exper. Med. 158:586-602 (1985); J. Exper. Med. 158: 1785-1805 (1985); Miller,

L. J. et al., J. Immun. 158: 2581-2585 (1987)).

A importância da família LFA-1 de receptores foi inicialmente reconhecida em estudos que mostravam a capacidade de anticorpos monoclonais (que eram capazes de ligação com as sub-unidades alfa especificas ou com a sub-unidade beta comum) para inibir as funções de leucocitrias dependentes da adesão (Sanchez-Madrid,

F., et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA 79: 7489-7495 (1982); Beller, D. I., et al., J, Exper. Med. 156:1000-1009 (1982)).

Recentemente foi identificado um grupo de indivíduos que não era capaz de exprimir quantidades normais de qualquer membro da família de proteínas de adesão LFA-1 nas suas superfícies celulares dos leucócitos. Eeta doença foi chamada Deficiência de Adesão de Leucócito

ou LAO* e é caracterizada por infecções crónicas e recorrentes, bem como por outros sintomas clínicos (Anderson, D.C., et al.. Fed. Proc. 44: 2671-2677 (1985); Anderson, D.C., et al., J. Infect. Dis. 152: 668-689 (1985) Os leucócitos de doentes com LAD apresentam in vltro defeitos que eram semelhantes aos observadores quando se antagonizam leucócitos de indivíduos normais por anticorpos específicos para membros da família LPA-1. Verificou-se que os doentes com LAO nSo eram capazes de organizar uma resposta imunitria normal. Verificou-se que esta deficiência era devida a uma incapacidade dos leucócitos dos doentes com LAD para aderirem a substratos celulares e ex.tras celulares (Anderson, D.C., et al., Ped. Proc.44: 2671-2677 (1985); Anderson, D.C., et al.. J. Infect. Pis. 152: 668—689 (1985)). Estes estudos mostram que as reacções inflamatórias são mitigadas quando os leucócitos não são capazes de aderir dam modo normal devido à falta de moléculas de adesão funcional na sua superfície celular.

Assim, em resumo, a capacidade dos leucócitos para manter a saúde e viabilidade de um animal requer que eles sejam capazes de aderir a outras células (tais como células endoteliais) e a proteicas (tais como iC5b). Verificou-se que esta aderência requer contactos que envolvem moléculas de receptor específicas presentes na superfície de leucocitária dos leucócitos.

Verificou-se que estas moléculas de receptor de superfície celular estão altamente relacionadas umas com as outras. Os seres humanos cujos leucócitos não tem estae moléculas de receptor de superfície celular apresentam infecções crónicas e recorrentes, bem como outrosi sintomas clínicos.

Uma vez que a adesão dos leucócitos está implicada no processo através do qual um tecido estranho é identificado e rejeitado, uma compreensão deste

processo é de valor significativo nos domínios da transplantação de órgãos, de enxertos de tecidos, da alergia e na oncologia.

RESUMO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a moléculas de receptor de adesão de superfície celular e, em particular, à clonagem e à expressão da sub-unidade alfa da molécula de receptor LFA-1 através do uso da tecnologia de ADN recombinante. A invenção encontra-se relacionada com a molécula de adesão propriamente dita, com fragmentos funcionais da molécula, com o ácido nucleico (isto é, ADN e especialmente ADNc) capaz de codificar para essas moléculas de receptor e com plasmideos que contém tais sequências de ácido nucleico, A presente in enção adicionalmente refere-se a um processo para a preparação das moléculas de receptor que utiliza tecnolo gia de ADN recombinante.

Em pormenor, a invenção diz respeito à sub-unidade alfa de LFA-1 ou a um seu derivado, substanclalmente livre de contaminantes naturais.

A invenção diz respeito para além disso à sub-unidade alfa de LFA-1 anteriormente referido ou a um seu derivado funcional, que é adicionalmente capaz de se ligar a uma molécula (tal como ICAZI-1 a sub-unidades beta de LFA-1) presente na superfície da célula.

A invenção inclui também a molécula da sub-unidade alfa de LFA-1, molécula que contém pelo menos um polipeptideo seleccionado do grupo constituído por:

a.	P-P-R-A-G-R-H;	h.	G-V-D-V-Q-D-G-E-I-E;
bl	I-I-T-D-G-E-A;	i.	D-I-N-G-D-G-L-V-D-V;
c.	D-W-A-G-G-F-L;	j.	V-K-D-L-E-G-D-G-L-A;
d.	S-Q-V-Q-T-I-H;	k.	T-Y-L-S-G-L;
e.	R-H-G-G-L-S-P;	1.	Y-I-I-G-I-G-K;
f.	H-S-C-T-D-F-S;	m.	I-E-G-T-Q-V-L-S-Q; e
9·	R-L-L-S-R-A-L;	n.	P-S-I-H-N-I-P.

A invenção também inclui uma molécula de ADN recombinante capaz de expressar quer a sub-unidade alfa de LFA-1 quer um seu derivado funcional.

A invenção também proporciona um processo para a recuperação da sub-unidade alfa de LFA-1 numa forma substancialmente pura que compreende as fases de:

(a) solubilizar a sub-unidade LFA-1, a partir de membranas de células, para formar um preparado de sub-unidade alfa de LFA-1 solubilizado, (b) introduzir o preparado de sub-unidade alfa de LFA-1 solubilizado numa matriz de afinidade, contendo a referida matriz um anticorpo imobilizado capaz de ligação à sub-unidade alfa de LFA-1, (c) permitir à sub-unidade alfa de LFA-1 ligar-se ao anticorpo da matriz de afinidade, (d) remover da matriz qualquer composto incapaz de ligação ao anticorpo e (e) recuperar a sub-unidade alfa de LFA-1 numa forma substancialmente pura por eluição da sub-unidade alfa de LFA-1 da matriz.

A invenção também proporciona um método para tratamento da inflamação que resulta duma respos1

í ta do sistema de defesa específico (tal como uma hipersen— sibilidade do tipo retardado; doença de reacçSo de enxerto contra receptor, rejeição de enxerto de decido, rejeição de transplante de órgão, doenças autoimunes tais como i lupus eritematoso, tiroidite autoimune, encefalomielite alérgica experimental (EAE), esclerose múltipla, certas formas de diabetes, síndrome de Heynaud, artrite reumatóide, etc.) num mamífero que compreende proporcionar a um indivíduo com necessidades de tal tratamento uma quantidade t

de agente antiinflamatório suficiente para suprimir a inflamaçao; em que o agente antiinflamatório é seleccionado do grupo constituído por:

sub-unidade alfa de LFA-1 e um derivado funcional da sub-unldade alfa de LFA-1.

I

I ! A invenção inclui para além disso : o método anteriormente referido que compreende adicionali mente a co—administração de um agente seleccionado do grupo constituído por:

a sub-unidade beta de LFA-1 e um derivado funcional da sub-unidade beta de LFA-1.

A invenção também se refere a um i método de supressão de metástases de uma célula de tumor hematopoiético, em que a célula necessitando de um membro i funcional da família LFA-1 para migração, método esse que ' compreende fornecer a um paciente que precisa de um tal traj tamento uma quantidade de um agente antiinflamatório suficiente para suprimir a metástase; em que o agente antiinflamatório é seleccionado do grupo constituido por:

! sub-unidade alfa de LFA-1 e um derivado funcional da sub-unidade alfa de LFA-1.

A invenção também se refere a um método de supressão de crescimento de uma célula de tumor expressa numa sub-unidade alfa de LFA-1 que compreende proporcionar a um doente que necessita de tal tratamento uma

- Θ -

·> '-Xbt S&ííLiisjitt

quantidade de uma toxina suficiente para suprimir o crescimento, sendo a toxina seleccionada do grupo constituido por uma toxina derivada da sub-unidade alfa de LFA-1 e uma coxina derivada de um derivado funcional de um membro de uma alfa sub-unidade de LFA-1.

A invenção também se refere a um método para determinar a presença e a localização de uma inflamação resultante de uma resposta do sistema de defesa específico num mamífero suspeito de ter inflamação que compreende:

(a) administrar ao indivíduo uma composição que contêm uma sub-unidade alfa de LFA-1 marcada dum modo detectável capaz de identificar uma célula que exprime ICAM-1 ou outro ligante natural de LFA-1 e )b) detectar a sub-unidade alfa de LFA-1.

A invenção também se refere a um método para determinar a presença e a localização duma inflamação resultante de uma resposta do sistema de defesa especifico num mamífero suspeito de ter inflamação que com preende:

(a) incubar uma amostra de tecido de um indivíduo com uma composição que contém uma sub-unidade alfa de LFA-1 marcada dum modo detectável capaz de identificar uma célula que exprime ICAM-1 ou outro ligante natural de LFA-1 e (b) detectar a sub-unidade alfa de LFA-1.

A invenção também se refere a um método para determinar a presença e a localização da inflamação resultante de uma resposta do sistema de defesa específico num mamífero suspeito de ter inflamação que com- 9 -

preende:

(a) incubar uma amostra de tecido do lndividuo com uma composição que contém uma molécula de ácido nucleico capaz de ligação a uma molécula seleccionada do grupo constit.ido por uma sequência de

ADN da sub-unidade alfa de LFA-1 e uma sequência de ARNm dum gene para a sub-unidade alfa de LFA-1, sendo a referida ligação capaz de identificar uma célula que exprime ICAM-1 ou outro ligante natural de LFA-1 e (b) detectar a molécula de ácido nucleico.

A invenção também se refere a um método para determinar a presença e a localização da inflamação resultantes de uma resposta do sistema de defesa específico num mamífero suspeito de ter a inflamação que compreende:

(a) incubar uma amostra de tecido de um individuo com uma composição que contém uma auto-unidade alfa de LFA-1 marcada de um modo detectável capaz de identificar uma célula que exprime ICAM-1 ou outro ligante natural de LFA-1 e (b) detectar a sub-unidade alfa de LFA-1.

A invenção também se refere a um método para determinar a presença e a localização de uma célula de tumor que exprime ICAM-1 ou outro ligante natural de LFA-1. num lndividuo suspeito de ter uma tal célula, que compreende:

(a) administrar ao individuo uma composição que contém o ligante de ligação marcado dum modo detectável capaz de se ligar a ICAM-1 ou outro ligante natural de LFA-1. sendo

os ligandos seleccionados do grupo constituído pela sub-unidade alfa de LFA-1 e um derivado funcional da sub-unidade alfa de LFA-1 e (b) detectar o ligado de ligação.

A invenção também se refere a um método para determinar a presença e a localização de uma célula de tumor que exprime ICAM-1 ou outro ligando natural de LFA-1. num indivíduo suspeito de ter tal célula, que compreende;

(a) incubar uma amostra de tecido do indivíduo na presença de uma composição que contém um ligando de ligação marcado dum modo detectável capaz de ligação ao ICAM-1, ou outro ligando natural de LFA-1, sendo os ligandos seleccionados do grupo constituído pela sub-unidade alfa de LFA-1 e um derivado funcional da sub-unidade alfa de LFA-1 e (b) detectar o ligando de ligação que está ligado ao ICAM-1 preaente na amostra de tecido.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra um perfil de separação por HPLC de fase inversa de peptídeos tripticos da sub-unidade alfa de LFA-1. A eluição foi monitorizada por densidade óptica a 280 nm (perfil inferior) e a 214 nm (perfil superior). Os peptídeos indicados por um ponto foram sujeitos a micro-sequenciação de proteínas. A linha através do perfil indica a percentagem de acetonitrilo.

A Figura 2 mostra um mapa de restrição de clones de ADNc da sub-unidade alfa de LFA-1. Os locais de restrição sâo Bal I (Bl), Bam Hl (B), Bgl II (Bg), Cia I (0) Eco RI (R), Hinc II (H), Nru I (N), Pat I

(P), Sca I (Sc) e Saia I (S). Apresentam-se setas indicando a estratégia de sequência.

A Figura 5 aiostra o nucleótido e a sequência de ácidos aminados derivada da sub-unidade alfa de LFA-1. As sequências de aminados derivada da sub-unidade alfa de LFA-1. As sequências de peptídeos trípticos e a região de transoembrana estão sublinhados com uma linha grossa e uma linha sombreada respectivamente. Os locais presumíveis da fosforilaçâo da serina estão rodeados por um rectángulo. Os nucleótidos na região não tradu· zida 3* que estão sublinhados correspondem a uma sequência Alui.

A Figura 4 mostra um alinhamento das repetições internas da sub-unidade alfa de LFA-1. A sequência de consenso adjacente é apresentada acima das repetições alinhadas, enquanto que o local de ligação divalente de consenso e os locais de ligação descritos anteriormente são apresentados abaixo. Um asterisco indica que está envolvido na ligação de catião mais do que um oxigénio.

A Figura 5 mostra com um alinhamento da sub-unidade alfa de LFA-1 humana com os outros membros da família do supergene da integrina e a extremidade N-teroinal da eub-unidade alfa de LFA-1 de murino. Os resíduos comuns a LFA-1 e pelo menos uma integrina estão representados em caixas. A áres de inserção do leucócito é notável. As áreas de ligação das repetições homólogas que contém os locais de ligação de catião divalente sâo indicados com triângulos. 0 local de clivagem por protease nas sub-unidades alfa de receptor sâo indicadas com setas. A região de transmembrana estão sublinhada.

A Figura 6 mostra um alinhamento e a comparação de um domínio L de sub-unidade alfa de LFA-1 com

os domínios homólogos no Factor de von Willebrands (FvW),

Factor B e CMP.

A Figura 7 mostra uma representação esquemática das relações evolucionárias dos domínios homólogos ao domínio L.

DESCRlgÍQ DAS CONCRETIZAÇÕES PKEF5RIDAS

Natureza das Proteínas de Adesão dos Leucócitos da Família de LFA-1

As tres proteínas de adesão dos leucócitos Mac-1. pl5O,95 e LFA-1 diferem em função e em expressão nas subpopulações de leucócitos. A proteína Mac-1 e a proteína pl5O,95 são expressas em neutrófilos e em monócitos (Springer, T.A., et al,. In:

Biochemlstry of Macrophages (CIBA Symposium 118); Pitman, Londres, págs. 102-126 (1986)). Durante a diferenciação dos monócitos do sangue nos macrófagos de tecido, a expressão de pl5O,95 é muito aumentada e a expressão de Mac-1 é reduzida (Schwarting, R., et al. Blood 65:

974-983 (1985); Hogg, N., et al., Eur. J. Immunol. 16: 240-280 (1986)). A proteína pl5O,95 é também expressa em certos tipos de linfócitos T e B activados, mas não é expressa nessas células no sangue (Kaligaris-Cappio,

F., et al., Blood 66:1035-1042 (1985); Miller, L. J., et al., <J. Immunol. 137: 2891-29^0 (1986); Keizer, G. D., et al., J. Immunol. 138; 3130-3136 (1987).

As proteínas Mac-1 e pl5O,95 são expressas num compartimento vesicular intracelular na circulação de neutrófilos e de monócitos que é mobilizada para a superfície da célula por mediadores inflamatórios (Todd, R. F. et al., J. Clin. Invest. 74:1280-1290 (1984); Springer, T. A., et al., In: Biochemistry of Macrophages (CIBA Symposium 118), Pitman, London, pp 102- 13 -

-126 (1986); Lanier, L. L. et al., Eur. J. Immunol. 15: 713-718 (1985); Vancey, K. B., et al.. J. Immunol. 155? 465-470 (1985)). Esta mobolizaçâo correlaciona-se com o aumento da capacidade de adesão (Anderson, D. G., et al.. Ann. Rev. Med. 38: 175-194 (1987)).

Os anticorpos aonoclonais para Mac-1 ou pl5O,95 inibem a agregação dos neutrófilos e a aderência às células endoteliais. a superfícies revestidas de proteínas, a bactérias, a parasitas protozoários e a fungos (Harlan, J. Μ., et al., Blood 66: 167-178 (1985) Springer, Τ. A. et al., in: Blochemistry of Macrophages (CIBA Symposium 118), Pitman. Londres, págs 102-126 (1986); Dana, N., et al., J. Immunol. 157? 3259 (1986); Bullock,

W. D. et al., J. Exper. Med. 165? 195-210 (1987); Mosser,

D. M. et al., J. Immunol. 135? 2785-2789 (1985)).

A proteína ílsc-1 é também um receptor para o campenente de complemento iC3b (Beller, Β. I., et al.. J. Exper. Med. 156: 1000-1009 (1982)). Mostrou-se que as soluções em detergente de Mac-1 e pl5O,95 sâo capazes de ee ligarem n Sepharoee iG3b (Micklem, K. J., et al., Biochem. J. 231:233-236 (1985)).

A proteína LFA-1 está presente em todos os leucócitos excepto num subconjunto de macrófagos. Os estudos de bloqueamento de anticorpos monoclonais mostraram que a LFA-1 é importante na destruição mediada por linfócitos I, nas respostas dos linfócitos T auxiliares. na destruição natural e na destruição dependente de anticorpos (Springer, Τ. A., et al., Ann. Rev. Immunol.5? 223-252 (1987)). A adesão à célula visada é uma fase que é bloqueada por anticorpos contra LFA-1. Estudos funcionais sugeriram que a LFA-1 interactua com vários ligandos, um dos quais é ICAM-1 (Rothleln, R., et al.. J. Immunol.

137? 1270-1274 (1986)).

Verificou-se que alguns clones de j linfocitos T citotóxicos exprimem quantidades semelhantes í de pl5O,95 β de LFA-1. Os anticorpos monoclonais para as sub-unidades alfa de LFA-1 e de pl5O,95 inibem a destruição por estes clones CTL em grau equivalente e são aditivos nos seus efeitos inibidores (Keizer, G. D., et al, J. Immunol i 138: 3130-3136 (1987)). Para além disso, mostrou-se que oe anticorpos para sub-unidades alfa de pl5O,95 inibem a

I ligação dos monócitos ao endotélio (Keizer, G. D. et al., Eur. J. Immunol. 1^^317-1322 (1987)).

II. Clonagem da sub-unidade Alfa de LFA-1 [i Pode usar-se qualquer método de enl· tre vários para clonar o gene de sub-unidade alfa de LFA-1.

ί ii Um tal método é iniciado pela análise de um banco de í

P vectores lançadeira de inserção de ADNc (derivados de uma célula que expressa a sub-unidade alfa de LFA-1) para a i; presença de uma inserção que contém o gene da sub-unidade

I alfa de LFA-1. Uma tal análise pode ser conduzida por transfecção de células com o vector e em seguida analisando para determinar a expressão da sub-unidade alfa de LFA-1.

Um método preferido para olonar o gene da sub-unidade alfa | de LFA-1 inicia-se determinando a sequência de ácidos j aminados da molécula da sub-unidade alfa de LFA-1 ou os peptideos tripticos da molécula. Para realizar este trabalho as moléculas da sub-unidade alfa de LFA-1 são de 'i preferência purificadas a partir das células produtoras por cromatografia de afinidade com um anticorpo monoclonal e são isoladas por electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e electroeluição

J; (Miller, L. J., et al. J. Immunol. 138:2381-2383 (1987) cuja referência é aqui incorporada para :refrência).

' As moléoulas da sub-unidade alfa são fragmentadas como : com brometo de cianogénio ou oom protease tais como papaína, quimotripsina ou tripsina (Oike, Y., et al.,

J. Biol. Chem. 257: 9751-9758 (1982): Liu. C., et al.,

Int. J. Pept. Protein Res. 21: 209-215 (1983). De preferência. a sub-unidade alfa ó digerida por via proteolitica com tripsina. Oa peptidos resultantes são separados por HPLC de fase invertida e submetidos a sequenciação de ácidos aminados. Para realizar este trabalho a proteína é, de preferência, analisar por sequenciadores automatizados. Apesar de ser possível determinar a sequência integral de ácidos aminados da sub-unidade alfa de LFA-1, é preferível determinar a sequência de fragmentos peptídicos da molécula, Uma fonte da sub-unidade alfa de LFA-1 preferível é a linha de células SKW3.

A sequência de resíduos de ácidos aminados num peptídeo é aqui designada quer através do uso das suas designações de três letras comunentes usadas ou pela sua designação de letra única.

Uma lista dessas designações de três letras ou de uma letra única pode ser encontrada em livros de texto tal como Biochemistry, Lehninger, A., Orth Publishere, Nova Iorque, NY (1970). Quando uma tal sequência é listada verticalmente, está definido que o resíduo terminal de amina está no topo da lista e o resíduo terminal de carboxilo de peptídeo está no fim da lista.

De modo semelhante, quando listado horizontalmente está definido que o terminal de amina está na extremidade da esquerda enquanto que o terminal de carboxilo está na extremidade direita.

Os resíduos de ácidos aminados num peptídeo podem ser separados por hífens. Tais hífens são apresentados apenas com a intenção de facilitar a apresentação de uma sequência. Gomo exemplo puramente ilustrativo a sequência de aminoácido designada:

-Gly-Ala-Ser-Phe- 16

indioa que um residuo Ala está ligado ao grupo carboxílico de Gly, e que um residuo Ser está ligado ao grupo carboxilo do resíduo de Ala e ao grupo amina dum resíduo de Phe. A designação indica, para além disso, que a sequência de ácidos aminados contém o tetrapeptideo Gly-Ala-Ser-Phe. A designação não pretende limitar a sequência de ácidos aminados a este único tetrapeptideo, mas pretende incluir (1) o tetrapeptideo que tem um ou mais ácidos aminados ligados a qualquer dos seus terminais amina ou carboxilo, (2) o tetrapeptideo que tem um ou mais resíduos de ácidos aminados ligados a ambos os seus terminais amina e carboxilo e (3) o tetrapeptideo que não tem resíduos de aminoàcido adicionais.

Uma vez que um ou mais dos fragmentos de peptídeos adequados tenham sido sequenciados, examinam-se as sequências de ADN capazes de codificar para estes fragmentos. Devido a que o código genético é degenerado, mais que um codão pode ser usado para codificar para um aminoàcido particular (Wateon, J. D., In: Molecular Biology of the Gene, 3rd Ed., V/. A. Benjamin, Inc., Menlo Park,

GA (1977), pp, 356-357). Os fragmentos de peptideo são analisados para identificar sequências de ácidos aminados que podem ser codificados por oligonucleótidos que tem o mais baixo grau de degenerescência. Isto é realizado de preferência por identificação das sequências que contém ácidos aminados que são codificados apenas por um único codão.

Apesar de que ocasionalmente uma sequência de ácidos aminados pode ser codificada apenas por um único oligonucleótido, frequentemente a sequência de ácidos aminados pode ser codificada por um oligonucleótido qualquer de um conjunto de oligonucleótido semelhante. E importante notar que, enquanto todos os membros deste conjunto contém oligonucleótidos que são capazes de codificar para o fragmento de peptideo e, assim, contém potencial- 17 -

mente a mesma sequência oligonucleótidica que o gene que : codifica para o fragmento de peptideo, apenas um membro do conjunto contém a sequência nucleótidica que é idêntica à sequência nucleótidica do gene. Devido a que este memi bro está presente dentro do conjunto, e é capaz de hibridar com ADN mesmo na presença de outros membros do conjunto, é poesível empregar o conjunto nfio fraccionado de oligonui; cleótidos do mesmo modo que se pode empregar um oligonucleíj tido único para clonar o gene que codifica para o peptideo.

i

Um oligonucleótido, ou um conjunto de oligonucleótidos, adequados que é capaz de codificar para jj um fragmento do gene da sub-unidade alfa de LFA-1 (ou que | é complementar para um tal oligonucleótido ou conjunto de | oligonucleótidos) é identificado (ueando o procedimento l· acima descrito), sintetizado e hibridado por meios bem conhecidos na especialidade, contra uma preparação de ADN j! ou de preferência de ADNc derivada de células humanas que j são capazes de exprimir o gene da sub-unidade alfa de

LFA-1. As técnicas de hibridação de ácido nucleico encontram-se descritas por Maniatis, T., et al. (In: Molecular Cloning, A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982), e por Haymes, l B. D., et al (In: Nuclelc Acid Hibridizatlon, A Fractical (Approach IRL Press, Washington, DC (1985), cujas referências são aqui incorporadas para referência. A origem do ADN í ou do ADNc é de preferência enriquecida em sequência da íí ) sub-unidade alfa de LFA-1. Este enriquecimento pode ser obtido mais facilmente a partir de ADNc obtido por extracção de ARN de células que produzem elevados níveis da sub-unidade alfa de LFA-1.

í Técnicas tais como as descritas acima ou semelhantes possibilitaram com sucesso a clonagem de genes para deidrogenases de aldeído humano (Hsu, L. C., et al ·! Froc. Natl. Acad. Sei USA 82: 5771-3775 (1985)), fibronec• tin (Suzuki, S., et al.. Eur, Mol. Bio. Qrgan. J.

ί 2519-2524 (1985)), ο gene receptor de estrogénio humano (Walter, P._t et al.» Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82; 7889-7893)), activador de plaeminogeno de tipo de tecido (Pennica, D., et al., Nature 501; 214-221 (1983)) e AON complementar de fosfatase alcalina placentária de termo (Kam, W., et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82; 875-8719 (1985)).

í i Usando 0 código genético (Watson, i J. L., In: Molecular Biology of the gene 5 rd Ed., W. A. i Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977)), é possível identificar um ou mais oligonucleótldos diferentes, cada um dos , quais seria capaz de codificar para os peptídeos trípticos ί da sub-unidade alfa de LFA-1. A probabilidade de que um ί

í oligonucleótido particular constitua de facto a sequência que codifica para a sub-unidade alfa de LFA-1 real pode ser estimada considerando relações anormais de emparelhai mento de bases e a frequência com a qual um codSo particular é realmente usado (para codificar para um ácido aminado particular) em células eucarióticas. Tais ”regras [ de uso de codões foram descritas por Lathe. R., et al..

Ϊ J. bolec. Biol. 185: 1-12 (1985). Usando as regras de ⁽ uso de codões de Lathe, identifica-se um oligonucleótido 1 dnico ou um conjunto de oligonucleótidos, que contém a sequência nucleótidáca mais provável teoricamente, capaz j de codificar para as sequências de peptídeo triptico da sub-unioade alfa de LFA-1.

ί^! 0 oligonucleótido ou o conjunto de ί; oligonucleótidos que contém a sequência mais provável” teoricamente capaz de codificar para os fragmentos da sub-unidade alfa de LFA-1 é usado para identificar a sequência ‘ de um oligonucleótido complementar ou de um conjunto de oliií gonucleótidos que é capaz de hidridar com a sequência ou : com o conjunto de sequências mais provável. Um oligonuI cleótido que contém uma tal sequência complementar pode í ser empregue como uma sonda para identificar e isolar o

gene da eub-unidade alfa de LFA-1 (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982).

Assim, em resumo, a identificaçSo real das sequências peptidicas da sub-unidade alfa de LFA-1 permite a identificaçSo de uma sequência de ADN ”mais provável teórica, ou de um conjunto de tais sequências, capaz de codificar para um tal peptídeo. Por construção de um oligonucleÓtido complementar para esta sequência teórica (ou por construçSo de um conjunto de oligonucleótidos complementares para o conjunto de oligonucleótidos mais prováveis), obtem-se uma molécula de ADN (ou um conjunto de moléculas de ADN), capaz de funcionar como uma sonda para identificar e isolar o gene de sub-unidade alfa de LFA-1.

Às moléculas de oligonuc^.eótidos de cadeia simples complementares das sequências que cod.ficam para o peptideo tríptico da sub-unidade alfa de LFA-1 mais provável foram sintetizadas usando técnicas que sSo bem conhecidas dos especialistas de competência normal. (Belagaje, R., et al., J. Biol. Chem. 254:5765-5780 (1979)? Maniatis, T., et al., In: Molecular Mechanisms in the Control of Gene Bxpression,Nierlich, D.P., et al.,

Eds., Acad. Press, NY (1976/; V.-u, R., et al.. Prog. Nucí, Acid. Res, Molec. Biol. 21: 101-141 (1978): Khorana, R. G., Science 205 : 614-625 (1979)). Adicionalmente, a síntese de ADN pode ser conseguida através de sintetizadores automáticos..

Ê possível clonar o gene da sub-unidade alfa de LFA-1 a partir de preparações de ADN eucariótico de que se suspeite de contarem este gene.

Para identificar e clonar o gene que codifica para a proteína da sub-unidade alfa de LFA-1, procede-se a uma busca num banco de ADN, ou de preferência de ADNc, para

seleccionar o ADN que tem a capacidade de hibridar com as sondas de oligonucleótido descritas acima. Preparações l adequadas de ADN (tais como ADN genómico humano) são cindiI das enzimaticamente ou cortadas ao acaso, e ligadas em

I vectores recombinantes. A capacidade destes vectores recombinantes para hibridar para as sondas de oligonucleótidos ' aoima descritas é medida em seguida, Procedimentos para ! hibridaçâo são descritos, por exemplo, em Maniatis,

Molecular Clonlng A Daboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982) ou em Haymes, 3. T., et al., Nucleic Acld Cybridlzatlon a Praticai Approach,

IRL Press, Oxford, Inglate ra (1985). Os vectores que são identificados como capazes de tal hibridaçâo são então analisados para determinar a extensão e a natureza das sequências de sub-unidade alfa de LPA-1 que eles contém. Com base puramente em considerações estatísticas é possível identificar sem ambiguidades um gene como este que codi fica para a molécula da sub-unidade aifa LPA-1 (através de j busca por hibridaçâo) usando uma sonda de oligonucleótido i tendo somente 18 nucleótidos, i

I ! 0 gene da sub-unidade alfa de LPA-1 ί clonado, obtido através do método descrito acima, pode ser ligado operativamente a um vector de expressão e introduzido em células procarióticas ou eucarióticas para pro! duzir a proteína sub-unidade alfa de LPA-1. A9 técnicas ί para estas manipulações encontram-se descritas por Maniatis, ! 1., et a1.. supra, e sâo bem conhecidas na especialidade.

III. A Expressão da sub-unidade Alfa de LFA-1

I

A presente invenção deriva, parcialmen! te, da descoberta da sequência de ADNc que codifica para a í sub-unidade alfa da molécula de LPA-1. Por ligação de modo operacional desta sequência (ou dum fragmento desta sequênI cia) a um promotor funcional, é possível dirigir a expressão da sub-unidade alfa da LPA-1 (ou dum seu derivado funcional)

numa célula, ou num organismo.

Diz-se que uma molécula de ácido nucleioo, tal como ADN, é capaz de expressar um polipeptideo se esta molécula contém sequências nucleotidicas que contém informação de regulação da transcrição e da tradução e ae estas sequências se encontram ligadas operacionalmente a sequências nucleótidicas que codificam para o pep— tídeo. Uma ligação operacional é uma ligação na qual as sequências de ADN de regulação e a sequência de ADN que se prtende expressar se encontram ligadas de um tal modo qúe permita a expressão do gene. A natureza precisa das regiões de regulação necessárias para a expressão de gene pode variar de organismo para organismo, mas incluirão no geral uma região de promotor que, em procariontes, contém tanto o promotor (que dirige o início da transcrição de ABN) como as sequências de ADN que, quando transcritas no ARN, darão o sinal de início da síntese da proteína. As regiães de regulação em células eucarióticas incluirão uma região de promotor suficientes para dirigir o início da síntese de ARN.

Diz que duas sequências de ADN (tais co· mo uma sequência de região de promotor e uma sequência que codifica para a sub-unidade alfa de LFA-1) se encontram ligadas operacionalmente se a natureza da ligação entre as duas sequências (1) não tem como resultado a introdução de uma mutação de alteração de quadro, (2) não interfere com a capacidade da sequência da região de promotor para dirigir a transcrição da sequência que codifica para a sub-unidade alfa de LFA-1, ou (3) não interfere con a capacidade da sequência que codifica para a sub-unidade alfa de LFA-1 para ser transcrita pela sequência da região de promotor, Assim, uma região de promotor será operacionalmente ligada à sequência de ADN se o promotor for capaz de efectnar uma transcrição da sequência de ADN.

A presente invenção diz respeito à expressão da sub-unidade alfa de LFA-1 (ou dum seu derivado funcional) quer em células eucaróticas quer procaróticas. Para expressar a sub-unidade LFA-1 (ou um seu derivado funcional) numa célula procariótica (tal como, por exemplo, E. coll., B. subtllls, Pseudomonas, Streptonyoes, etc.,), é necessário ligar operacionalmente a sequência que codifioa para a sub-unidade alfa de LFA-1 a um promotor procariótico funcional. Tais promotores podem ser quer constitutivos quer, de preferência, reguláveis (isto é. inductável ou reprimível). Exemplos de promotores constituídos incluem o promotor int de bacteriófago , o promotor bla do gene da g -lactamase de p3R522 e o promotor CAT do gene de acetil-transferase de cloranfenicol de pPR525, etc.. Exemplos de promotores procarióticos induotíveis incluem os promotores maiores da direita e da esquerda de bacteriófago λ (P^ β P_R), ⁰⁸ P^r°®otores trp, recA, laoZ, lacl e gal de E, coll, os promotores específicos da oU-amilase (Ulamen, I,. et al., J. Bacteriol.

162: 176-182 (1985)) e de qj -28 de B. subtllls (Gilman,

Μ. Z., et al.42:11-20 (1984)), os promotores dos bacteriófagos de Bacillus (Gryczan, T. J., In: The Molecular Blology of the Bacclll Academic Press, Inc., NY (1982)), e promotores de Streptomyces (Ward, J. M., et al., Mol. Gen. Genet. 205: 468-478 (1986)). Os promotores procarióticos são revistos por Glick, B. R., (J. Ind. Mlcroblal.1:277-282 (1987)); Cenatiempo. Y. (Blochllle 68:505-516 (1986)); e Gottesman, S. (Ann. Rev. Genet. 18: 415-442 (1984)).

A expressão correcta numa célula procariótica regular a presença de um local de ligação ribossomol a montante da sequência que codifica para o gene, Estes locais de ligação ribossomol são descritos, por exemplo, por Gold., L., et al. (Ann. Rev. Mlcroblol. 55: 565-404 (1981)).

Se se deseja a expressão numa célula eucariótica, xal como uma levedura, um fungo, células de mamífero ou células vegetais, então será necessário empregar um promotor capaz de d irigir a transcrição num tal hospedeiro euoarlótico. Os promotores eucarióticos preferidos incluem o promotor do gene do rato metallothionein I (Hamer, D., et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 275-288 (1982): o promotor TK do virus de herpes (McKnight, S., Cell 51: 555-565 (1982)); o promotor precoce de SV40 (Benoist, ι C., et al., Nature (London) 290:504-510 (1981); o promotor do gene ga!4 de levedura (Johnston, S. A., et al., Proc. Natl. Acad. Scl. (USA) 81: 5951-5955 (1984)).

Como é largamente conhecido, a tradução de ARNm eucariótico é iniciada no codão que codifica para a primeira metionina. Por esta razão, é preferível assegurar-se a ligação entre um promotor encariótioo e j a sequência de ADN que codifioa para a sub-unidade alfa ! LFA-1 (ou um seu derivado funcional) não contém incluídos quaisquer codões que sejam capazes de codifioar como resultado quer a formação de uma proteína de fusão (se o codão AUG está no mesmo quadro de leitura que o LFA-1 que co!; dlfica para a sequência de ADN) quer uma mutação de altera| Çâ° do quadro de mudança (se o codão AUG não está no mesmo | quadro de leitura que a sequência que codifica para LFA-1.

De preferência introduz-se uma se¹ quência de ADN que codifica para a proceina LFA-1 (ou un

I ! seu derivado) quando operacionalmente ligada a um promotor funcional numa célula receptora por qualquer meio de entre os vários adequados: transformação, transfecçâç, conjuga! ção, busão de protoplastos, electroporação, et-c..

Podem introduzir-se a sequência que codifica para a sub-unidade alfa de LFA-1 e um promotor operacionalmente ligado numa célula receptora quer sob a forma de uma molécula de ADN que não se replica (ou de ARN),

que pode quer eer uma molécula linear ou, de preferência, uma molécula circular covalente fechada. Apesar de estas moléculas serem incapazes de replicação autónoma, a expressão do polipeptídeo da sub-unidade alfa de LPA-1 pode ocorrer através de expressão transiente da sequência introduzida. Em alternativa, pode ocorrer expressão permanente através da integração da sequência introduzida no cromossoma do hospedeiro.

De preferência, a sequência introduzida será incorporada num plasmídeo ou num vector virai capaz de replicação autónoma no hospedeiro receptor. Para este efeito pode ser empregue qualquer vector de entre uma ampla variedade. Os factores de importância na selecÇâo de um plasmídeo ou vector virai particular incluem: a facilidade com que as células receptoras que contém o vector podem ser reconhecidas e seleccionadas das células receptoras que não contém o vector; o número de cópias do vector que são desejadas num hospedeiro particular; e se é desejável ser capaz de fazer o vector ser transferido entre células hospedeiras de espécies diferentes. Os tfectore procarióticos preferidos incluem plasmídeos tais como os plasmídeos capazes de replicação em E. ooll (tal como, por exemplo, p3R322, ColEl, pSClOl, pACYO 184, nUX. Estes plasmídeos são, por exemplo, apresentados por Maniatis, T. et al. (In: Molecular Cloning, A. Laboratory Manual,

Gold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982). Plasmídeos de Bacillus incluem pC194. pC221, pT127, etc., Estes plasmídeos são descritos por Gryczan, T. (In: The Molecular Biology of the Bacilil, Academic Press, NY (1982), pags. 307-329), Plasmideos de Streptomyoes adequados incluem pIJlOl (Kendall, K. J., et al., J. Baoteriol.

169: 4177-4183 (1987)), e bacteriófagos de estreptomices tais como 0C31 (Chater, X. P., et al._t In: Slxth International Symposium on Aotlnomyceles Biology. Akademiai Kaido Budapest, Hungary (1986), pp. 45-54). Plasmideos de P8eudomonas são revistos por John, J. P., et al., Rev.

Infect. Dia. 8: 693-704 (1986)), Izaki, K. (Jpn. J. Bacteriol, £3: 729-742 (1978)).

Oa plasmídeos eucarióticos preferidos incluem BPV, varíola bovina, SV40. circulo de 2-mícron etc., ou outros derivados. Estes plasmídeus são bem conhecidos na especialidade (Botstein, D., et al.. Miaml Wntr. Symp. 19: 265-274 Broach, J. R. In: The Molecular Biology of the Yeast Saccaromyces: Life Oycle and Inherltance, Gold Spring Harbor Laboratory, Colid Spring Harbor, NY, P. 445-470 (1981); Broach, J. R.. Cell 28: 203-204 (1982); Bolon, B.P., et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10 59-48 (1980); Maniatis, T., In: Cell Biology: A Compreensive Treatl8e, Vol, f. Gene Expresslon, Academic Press ÍÍY, pp. 563-608 (1980)).

IV. Utilização da Sub-unidade Alfa de LFA-1 ou Seus Fragmentos

A presente invenção proporciona sequências de ácidos nucleicos e de proteina da sub-unidade alfa da molécula de receptor de LFA-1. Esta descoberta permite o uso da tecnologia do ADN recombinante para produzir a molécula da sub-unidade alfa de LFA-1. Conforme discutido adiante, uma forma de concretização da presente invenção diz respeito ao uso da sub-unidade alfa de LFA-1 por ela própria, como um agente antiinflamatório. Numa forma de concretização preferida, a sub-unidade alfa da molécula de LFA-1 é usada em combinação com a sua sub-unidade beta. Uma tal combinação pode ser produzida usando uma variedade de métodos. Por exemplo, a sub-unidade beta de LFA-1 pode ser produzida separ-damente da sub-unidade alfa de LFA-1, misturando-se as duas moléculas em conjunto.

E contudo preferível produzir ambas as sub-unidades alfa e beta de LFA—1 na mesma célula, hospedeira a fim de facilitai

JJ TI ι_ ---rx-rr-

a sua própria junção na molécula de receptor de heterodímero de LFA-1. A sub-unidade beta de LFA-1 (que é comum a LFA-1 é a Mac-1) pode ser produzida quer por síntese química quer por técnicas de ADN recombinantes (Kishimoto, T. Κ., et al., Cell 48: 681-690 (1987)). A clonagem da beta sub-unidade de LFA-1 é para além disso apresentada no pedido de patente dos E.U. pendente normalmente especificamente N2 de Série 019 440, depositado em 26 de Fevereiro de 1987, pedido esse que é aqui incorporado por referência.

Um aspecto da presente invenção diz respeito às seguintes sequências de ácido nucleicos e proteica da sub-unidade alfa da molécula de receptor de LFA-1, Esta descoberta permite o uso da tecnologia de ADN recombinante para produzir derivados funcionais da sub-unidade alfa de LFA-1 que podem funcionar como antagonistas da adesão celular. Na presente memória descritiva a expressão antagonista de adesão celular refere-se a qualquue molécula capaz de inibir o processo de adesão célula-célula ou célula-eubstracto. E possível determinar quando um composto particular é um antagonista realizaàdo uma análise de agregação de leucócitos a células endoteliais. Análises adequadas de agregação de leucócitos são apresentadas, por exemplo, em (Rothlein, R. et al. J. Exper.

Med. 165: 1132-1149 (1986)) cuja referência é aqui incorporada por referênca. Os antagonistas de agregação de leucócitos podem ser empregues como agentes an iinflamatórios.

Na presente memória descritiva a expressão derivado funcional da sub-unidade alfa de LFA-1 é um composto que possui uma actividade biológica (funcional ou estrutural) que é substancialmente semelhante a uma actividade biológica da sub-unidade alfa de LFA-1. Exemplos de actividades biológicas incluem a capacidade de ligação a ICAM-1, um outro ligando natural da molécula de LFA-1, ou à sub-unidade β da família LFA de glicoproteínas. Tal ligação inibirá os acontecimentos relacionados

com a adesão tal como a ligação de linfócitos a células endoteliais. a oélulas que apresentam antigene ou a células alvo. Diz-se que uma molécula é substancialmente semelhante a outra molécula ae ambas as moléculas tem estruturas semelhantes ou se ambas as moléculas possuem uma actividade biológica semelhante. Os derivados funcionais da sub-unidade alfa de LFA-1 incluem quer fragmentos quer variantes da sub-unidade alfa. 0 termo fragmento da sub-unidade alfa de LFA-1 significa referlr-se a qualquer sub-conjunto de polipeptídeos desta molécula.

termo variante da sub-unidade alfa de LFA-1 significa uma molécula substancialmente semelhante na estrutura à molécula inteira ou a um fragmento desta desde que a variante tenha pelo menos uma actividade biológica que é semelhante a uma actividade da sub-unidade alfa de LFA-1 ou que é inibitória de uma actividade de LFA-1. Deate modo, conquanto que uma molécula possua pelo menos uma actividade biológica que é quer semelhante a uma actividade de LFA-1 ou inibitória para essa actividade, é considerado uma variante da sub-unidade alfa de LFA-1, de acordo com o significado que é dado a este termo na presente memória descritiva, mesmo se uma das moléculas contém um ou mais resíduos de ácidos aminados que não se encontram na outra, ou mesmo se as seguências de resíduos de ácidos aminados nas duas moléculas não aão idênticas. Deste modo, por exemplo, um composto a que falta (ou que contém) um ou mais resíduos de ácidos aminados que se encontram (ou que não se encontram) na sub-unidade alfa de LFA-1 será considerado ser uma variante da sub-unidade alfa de Lpa-1 se este composto possui uma actividade biológica semelhante a (ou inibitória de) uma actividade biológica da sub-unidade alfa de LFA-1. Entende-se que o termo actividade biológica compreende a actividade catalítica bem como a activlaade estrutural (isto é,a capacidade de ae ligar a uma outra molécula, tal como ICAM-1. a outra ligando natural da molécula de LpA-1, à sub-unidade beta de LFA-1 ou a um anticorpo anti-sub-unidade alfa de LFA-1), etc..

A presente invenção proporciona um processo para a preparação de derivados funcionais da sub-unidade alfa da molécula de LFA-1. Fara obter estes derivados é necessário apenas efectuar uma mutagênese de um ADN, de um ARN ou (de preferência) da sequência de ADNc que codifica para a sub-unidade alfa de LFA-1. A mutagênese pode ser quer ao acaso ou dirigida, especificamente a um local. Para além disso, a mutagênese pode ser quer espontânea quer induzida usando técnicas quimicas, radioactivas ou recombinantes.

âmbito da presente invenção tem a intenção de incluir para além disso derivados funcionais a que faltam determinados resíduos de ácidos aminados ou jque contém resíduos de ácidos aminados alterados, desde que estes derivados exibam a capacidade de aumentar ou de inibir a adesão celular.

Os agentes mutagênicos químicos incluem análogos de bases (tais como, por exemplo, 5-bromouracilo ou 2-aminopurina); agentes de desaminação (tais como, por exemplo, áoido nitroso, hidroxilamina, etc.); agentes de aliqqJLação (tais como, por exemplo, alaranjado de acridina, brometo de etídio, psoraleno, etc.). A mutação induzida por radiação pode ser causada por agentes tais como a luz ultravioleta, gama, raios X, etc. As técnicas de mutagénese das moléculas do ácido nucleico podem ser encontradas em I-liller, J. H. (In: Experimenta in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (I972)), e Silhavy, T. J., et al., (In: Experimente with Get FusionB, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)).

A mutagênese dirigida especificamente a um local pode ser empregue para produzir mutações específicas em locais adequados do ácido nucleico que codifica para a sub-unidade alfa de LFA-1. Em resumo, estes procedimentos na generalidade dão início à sintese de um oligonucleó- 29 -

tido sintético que tem uma sequência de ADN pretendida é definida. Os métodos para sintetizar estes oligonucleótidos são apresentados por Itakura, K., et al.. (Ann.

Rev, Biochem. 53; 323-356 (1984)). Uma molécula de ácido nucleico que codifica para a proteína da sub-unidade alfa de LFA-1 ou para um seu derivado funcional, é geralmente subclonado num vector de cadeia dupla tal como M13,

0X174, etc., cujas cadeias simples podem ser separadas uma da outra. Uma cadeia simples do vector é então incubado na presença de oligonucleótido sintético. Uma vez que o ADN do oligonucleótido é definido dum modo controlável, é possível construir um oligonucleótido capaz de emperalhamento de bases com qualquer região do ácido nucleico que codifica para a sub-unidade alfa do LFA-1. Uma vez que o emparelhamento tenha ocorrido entre o oligonucleótido e o plasmídeo de cadeia simples, é possível alongar o oligonu cleótido usando polimerase de ADN para criar uma molécula de ADN de cadeia dupla que pode então ser fechada é introduzida numa célula, a replicação de ADN semi-conservativa dará como resultado a produção de moléculas precursoras, nas quais a sequência de ADN do fragmento oligonucleotídico foi incorporada nas sequências que codificam para a sub-unidade alfa de LFA-1.

A sub-unidade alfa de LFA-1 da presente invenção, ou os seus derivados funcionais, podem em alternativa ser preparados por métodos de síntese química usando a técnica bem conhecida de Merriefield ou outras técnicas da sintese dos peptideos. Em alternativa, estas moléculas podem também ser preparadas por síntese química das moléoulas de ácido nucleico (usando, por exemplo, técnicas de síntese de diéster fosfórico), as quais, depois da expressão, darão como resultado a sua produção.

Deste modo, se se deseja introduzir uma mutação pontual, e uma sequência de ADN exógeneo num local específico na sequência que codifica para o LFA-1, ou

criar uma supressão de nucleótidos normalmente presentes em tal sequência, poderá projectar-se um fragmento de olli ' gonucleótido que contém (ou não tem) a mutação ou a sequênj cia e em seguida prossegue-se o processo acima descrito.

A fim de introduzir uma tal mutação ou sequência de ADN ' exógeno numa região particular do ácido nucleico que codifica para a sub-unidade alfa de ^FA-l, é necessário rodear a mutação ou a sequência de ADN exógena com sequências de ÁDN flanqueadoras que são complementares para ; a sequência de ADN da região na qual a mutagenese é desejada (Jenkins, F., et al., Bioeseays 5: 244-247 (1986); Doerfler, W., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 23 919-931 (1984); Kaina, B., Biol. Zentralbl. 22:513-531 (1980); Kunkel, Froo. Natl. Acad. Sol (USA) 82:488-492 (1985); Nisj! bet, I. T. et al.. Gene Anal. Tech. 2:23-29 (1985); Hinee, [ J. C. et al.. Gene 11:207-218 (1980); Messing, J. et al·..

I Nucl. Acid. Res. £:3O9 (1981)).

j As mutações podem também ser produ•i zidas através da aplicação de tecnologia de ADN recomblnante. For exemplo, a sequência nucleotídica duma molécula de ácido nucleico que codifica para a sub-unidade alfa de LFA-1 pode ser examinada para identificar locais [ de do oligonucleótido que são reconhecíveis por endunu;! cleases de restrição. Estas endunucleases podem pois ser usadas para cindir especificamente a sequência de ácido nucleico num sitio reconhecido. Usando uma endunuclease ji de restrição que reconhece (e cinde em) duas posições na |!

sequência que codifica para o LFA-1, é possível cortar o fragmento da sequência que codifica para a sub-unidade j alfa de LFA-1, Em alternativa, é possível usar duas endonucleases diferentes com este fim. For incubação das moléculas cindidas na presença de ligase de ADN, é possível ! ligar de novo as sequências que codificam para a sub-unidade alfa de LFA-1 para formar uma sequência única (a que falta o fragmento cortado). Se não existe qualquer local de !j reconhecimento de endonuclease de restrição adequado nas

sequências que codificam para a sub-unidade alfa de LFA-1, então estes locais podem ser introduzidos nas sequências pelo processo da mutagénese dirigida especificamente a um local descrito acima.

As mutações podem em alternativa ser introduzidas cindindo a sequência que codifica para a sub-unidade alfa de Lpa-1 e mordiscando as extremidades livres com uma exonuclease. Por meio de tal tratamento é possível introduzir não apenas supressões, mas também mudanças de quadro e outros tipos de mutações. Esta técnica é, para além disso, capaz de introduzir novos locais de endenocleaee de restrição na sequência que codifica para a sub-unidade alfa de LFA-1. Os métodos para usar as endonucleases de restrição, as ligases de ADN, e as exonucleases são apresentadas por exemplo, por Maniatis,

T., et al. (In: Molecular Cloning, A Laboratory Manual,

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)).

As técnicas de ADN recombinantes podem também ser usadas para produzir proteínas de fusão constituídas pela proteína da sub-unidade alfa de LFA-1 (ou um seu derivado funcional) e por um novo polipeptídeo. Este novo polipeptídeo não está limitado a qualquer polipeptídeo particular e pode ser constituído quer por um único ácido amino quer por qualquer conjunto ou permutação de ácidos aminados. Estas moléculas de fusão podem ser produzidas por ligação da sequência de ADN que codifica para o novo peptídeo a uma sequência de ADN que codifica para a sub-unidade alfa de LFA-1 (ou um seu derivado funcional), dum modo que não introduz uma mutação de alteração de quadro. Exemplos de polipeptídeos preferidos que podem ser fundidos com o gene da sub-unidade alfa de LFA-1 (ou um seu derivado funcional) incluem sequências de sinal eucariótico ou procariótico (Gilbert, M., et al. U.S. Patente N8 4,411,994; Casadaban, M., et al., Proc. Natl. Acad.

i Patent NS 4,411,994; Caaadaban, M., et al., Proc. Natl. Acad. Scl. (USA) 76 4530-4533 (1979)) ou polipeptídeos que aumentam (ou diminuem) a estabilidade, o período de semi-vida biológica, ou a potência da sub-unidade alfa de LFA-1 (ou um aeu derivado funcional(. Uma revisão excelente da metodologia de fusão de genes é proporcionada | por Silhavy, T. J., et al. (In: Experimenta with Gene

Fusione Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984))x

Oa anticorpos (especialmente oa anticorpos monoclonais) pedem ser postos em evidência ί em resposta à imunização com fragmentos da sub-unidade alfa de LFA-1. Estes anticorpos podem ser usados para evitar a ligação de alguns leucócitos a células endoteliais a célula que apresentam antigene ou a célula alvo e deste modo podem ser empregues como agentes antlinflamatórios.

Usando os métodos descritos acima, fragmentos da sub-unidade alfa de -^FA-l podem ser preparados e analisados para determinar se são antagonistas da adesão celular. Fragmentos que se verificou serem antagonistas de adesão celular podem ser empregues como agentes antiinflamatórios de acordo com a presente invenção.

A presente Invenção deriva em parte da descoberta de que a adesão aos leucócitos ao substrato e a aderência dos leucócitos às células endoteliais resultam das interaeções que envolvem o receptor de Lpa-1. Visto que a adesão celular é necessária a fim de que os leucócitos possam migrar para locais de inflamação e/ou levar a cabo várias funções eficazes que contribuem para a inflamação, os agentes que inibem tal adesão oelular atenuam ou evitam a inflamação. A molécula de reeeptor de LFA-1 está presente na superfície das células dos leucócitos. A adesão de estas células a monocamadas de células endoteliais é mediada em parte por LFA-1.

A interacção das moléculas de LFA-1 com os seus ligandos naturais (tais como ICAM-1, etc.) é de importância central na adesão oelular. Através do processo de adesão, os linfócitos são capazes de manter uma vigilância contínua num animal para a presença de antigenes estranhos. Apesar desses processos serem normalmente desejáveis, são também a causa da rejeição de transplantes de órgãos, de rejeição de enxertos de tecido e de muitas doenças autoimunes. Deste modo, qualquer meio capaz de atenuar ou de inibir a adesão celular será altamente desejável em receptores de transplantações de órgãos e de enxertos de tecidos e em doentes autoimunes.

Os agentes capazes de antagonizar estes interseções são altamente adequados como agentes antiinf lamatórios em mamíferos. De modo significativo, estes agentes diferem dos agentes antiinflamatórios gerais na circunstância de serem capazes de inibir seleotivamente a adesão e de não apresentarem efeitos laterais tais como nefrotoxicidade que são encontrados em agentes conveno ionais. Oa agentes capazes de ligação à sub-unidade alfa de LFA-1, ou a ICAM-1, ou a outro ligando natural da moléoula de LFA-1 podem contudo ser usados para evitar rejeições de órgãos ou de tecidos, a doença de reacção de enxerto contra hospedeiro (isto é uma rejeição do tecido do hospedeiro causada por um enxerto de medula óssea ou de outro tecido que contém ou que dá origem a linfócitos) ou para modificar respostas autoimunes por interferência com células ligadas a Lfa-1 sem receio de efeitos secundários (tais como interaeções dos seus ligandos ligados a células, etc . ).

E importante notar que o uso de agentes capazes de reconhecer estas moléculas podem permitir a realização de transplantações de órgãos mesmo entre indivíduos que tenham HLA desemparelhado.

Os agentes que interferem com a capacidade da molécula do receptor de LFA-1 para se ligar ao seu ligando de ligaçSo natural são deste modo capazes de impedir todas as funçBes dependentes de -RFA-l acima descritas. Deste modo estes agentes podem servir como agentes antiinflamatórios de acordo com a presente invençSo.

Estes agentes incluem a sub-unidade alfa de LFA-1, o LFA-1 (sub-unidade alfa e beta) e anticorpos capazes de ligação à sub-unidade alfa de LFA-1 ou a fragmentos daquela sub-unidade. Todos estes agentes podem ser usados de acordo com a presente invençSo. Os agentes antiinflamatórios da presente invençSo sSo capazes de tratar a inflamatSo causada pela reacção do sistema de defesa especifico.

Na presente memória descritiva à expressão sistema de defesa específico” atribuiu-se o significado do componente do sistema imunitário que reage à presença de antigenes específicos. Estes células incluem linfócitos e macrófagos. Diz-se que a inflamação resulta de uma resposta do sistema de defesa especifico se a inflamação é causada por, mediada por, ou associada com uma reacção do sistema de defesa específico. Exemplos de inflamação que resultam duma resposta do sistema de defesa específico incluem a resposta a antigenes tal como o virus da rubéola, doenças autoimunes, resposta de hipersensibilidade de tipo retardando mediada por células T (como se verifica, por exemplo, em indivíduos que dão resultado positivo no teste de Mantaux), rejeição de órgãos ou de tecidos, doenças da reacção de enxerto contra hospedeiro (isto é a rejeição do tecido do hospedeiro causado por um enxerto de medula óssea ou de outro tecido que contém ou que dá origem a linfócitoe)), eto.. A capacidade da sub-unidade alfa de LFA-1 e dos seus derivados funcionais para antagonizar estas reacçBes inflamatórias fornece a base para o seu uso terapeuítico no tratamento de doenças inflama

tórias crónicas e de doenças autoimunes, tais como o lupus eritematoso, tiroidite autoimune, encefalomielite alérgica experimental (EAE), esclerose múltipla, algumas formas de diabetes, síndrome de Reynaud, artrite reumatóide, etc..

Uma vez que o LFA-1 é expresso em células que são capazes de ligação a tecido endotelial, a administração de sub-unidade alfa de LFA-1, ou de LFA-1 (sub-unidades alfa e beta) a um paciente proporciona um meio para obter uma representação ou uma visualização do tecido endotelial. Para além disso, este procedimento proporciona informação de diagnóstico que diz respeito à que lidade e distribuição dos ligandos de ligação da molécula de receptor de LFA-1 que estão presentes no tecido visualizado. Nesta utilização, as sub-unidades alfa de LFA-1 (ou as moléculas de receptor alfa beta de lFA-1) são marcados dum modo detectável, através do uso de radioisótopos, marcadores de afinidade (tais como biotina, avidina, etc.) marcas fluorescentes, átomos paramagnétioos, etc.. Os processos para realizar tal marcação são bem conhecidos na especialidade. Os anticorpos (ou os seus fragmentos) podem ser marcados dum modo detectável através do uso de radioieótopos, de marcas enzimáticas, de marcas fluorescentes, de marcas paramagnéticas, de marcas de densidade de electrão, de marca de toxina, etc.. As marcas de toxina preferidas incluem a toxina de difetria, o ricino e as toxinas de cólera. A administração de tais moléculas marcadas num indivíduo identificará os locais de inflamação. Estas marcas deteotáveis poaem também ser usadas para analisar o estado do sistema imunitário do paciente. A aplicação clínica de anticorpos na representação de diagnóstico foram revistas por Grossman, Η. B., Urol. Clln. North Amer. 15: 465-474 (1986)), Unger, E. C. et al., Science 209; 295-297 (1980))

A capacidade dos leucócitos para migrarem expontaneamente para locais de inflamação depende acima de tudo de LFA-1 (Keizer, G. L., et al., Bur. J. Immunol, 17:1517-1322 (1987)). Tal migração pode ser inibida por ádministração de sub-unidades alfa de LFA-1, ou de LFA-1 (sub-unidade alfa e beta) a um paciente. De modo semelhante, tem-se verificado que a capacidade dos leucócitos para aderirem a células endoteliais é dependente acima de tudo de LFA-1. Qualquer dos agentes antiinflamatórios da presente invenção podem ser empregues para inibir estas acèividades.

Os ICAM,s (tais como ICAM-1) sSo reconhecidos por certos virus humanos (particularmente renovírue do tipo mioritário (que se ligam a IGAM-1)). Estes virus ligam-se a células humanas em virtude deste reconhecimento e desde modo servem de mediadores na infecqão virai. Leste modo, a interacçSo entre estes receptores celulares e o virus constitui uma fase importante na etiologia das doenças virais.

Os agentes que suprimem, que competem com ou que inibem a capacidade de um virus para se ligar a uma molécula de ICAM-1 podem portanto ser utilizados no tratamento de infecçSes virais (e particularmente rinovirais

Um aspecto da presente invenção está deste modo relacionado com a capacidade da sub-unidade alfa de LFA-1 e dos seus derivudos funcionais para interactuarem com IGAM-1 e deste modo para evitarem a fixação célula-vírus e a infecção virai ou para atenuar ou diminuir a gravidade ou a duração desta infecção.

Sâo de especial interesse para a presente invenção os derivados funcionais da sub-unidade alfa de LFA-1 tais como as formas solubilizadas da sub-unidade alfa de LFA-1, os fragmentos da sub-unidade alfa de

L7A-1, etc.. sstes agentes são de preferencia administrados a um paciente sob a forma de um beterodímero contendo a molécula em associação com uma molécula da sub-unidade beta í ''a família GP-18. G objectivo acima descrito do tratamento de infecções virais pode ser efectuado com um agente único ou com uma combinação da vários agentes.

Com o fim de tratar uma infecção virai o(s) agente(s) da presente invenção acima descritos podem ser administrados a um paciente (por exemplo por via intranasal) numa dose suficiente para permitir que o(s) agente (s) suprimam, compitam com ou inibam a capacidade de um virus cara se ligar a uma c-olécula de IC-λ. .-1. G-ta dosagem deve, em geral, ser (para cada agente administrado) de 0,01 Fg/kg ’e pe^o do paciente até 1 mg/kg de peso do paciente, se bem que se possam utilizar quantidades superiores ou inferiores.

Com o fim de tratar uma infecção virai, a administração deste(s) agente(s) pode ser realizada com fins profiláticos ou com fins terapêuticos. Quando administrados com fins profiláticos, os agentes são administrados no início (isto é antes ou um pouco depois) do momento da infecção mas antes de qualquer sintoma da infecção virai. A administração profilática do(s) agente (s) tem por objectivo evitar ou atenuar qualquer infecção subsequente. Qmando administrados terapeuticamente, o(s) agente(_s) são administrados no momento do aparecimento (ou logo em seguida) dos sintomas de uma infecção virai pre·-ente (como, por exemplo, a ocorrência de congestão nasal de indução virai, etc. ou a detecção de vírus nos fluídos orgânicos ou a detecção de anticorpos dirigidos contra os vírus no ;:ro de um paciante infectado, etc.). A administrarão terapêutica serve para atenuar qualquer infecrão e deste podo reduzir a sua gravidade ou duração.

V. Adminástração da Sub-unidade Alfa de LFA-1

Os efeitos terapêuticos da sub-unidade alfa de LF.A-l podem ser obtidos pela administração a um paciente da molécula de receptor ou de qualquer seu derivado funcional terapeut:camente activo. Estas moléculas podem ser obtidas quer oor via sintética quer através do uso de tecnologia de ADN recombinante ou a partir de origens naturais.

Os fragmentos do receptor de LFA-1 ou a sua sub-unidade alfa podem ser adicionalmente obtidas por proteólise. A_s vantagens terapêuticas destas moléculas pedem ser aumentadas através do uso de derivados funcionais que possuem resíduos de ácidos aminados adicionais para aumentar a união ao veículo cu p?ra aumentar a actividade.

A_s moléculas da presente invenção são referidas como sendo substancialmente livres de contaminantes naturais se as preparações que as contém são substancial 'ente livres de materiais com os quais estes produtos são normalmente e naturalmente encontrados.

Ao administrar a um paciente as moléculas terapêuticas da presente invenção, a dose de agentes administrado vai variar dependendo principalmente de factores como a idade do paciente, o peso, a altura, o sexo, a contição médica geral, a história médica anterior, etc.. Em geral, é desejável proporcionar ao paciente uma dose de sub-unidade alfa de LFA-1 (ou de um seu derivado funcional) que esteja ne gama desde cerca de 1 mg/kg até 10 mg/kg (peso corporal do paciente), apesar de poderem ser administradas doses superiores ou inferiores.

As moléculas da presente invenção podem ser administradas aos pacientes por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, entérica ou parenteral. A administração cole ser oor perfusão contínua ou por doses simples ou múltiolas.

Os agj.ares antiinflamatório·' da presente invenção destinam-se a ser proporcionados aos indivíduos receotores numa quantidade suficiente para suprimir a inflamação. Uma quantidade é dita ser suficiente para suprimir a inflamação se a dosagem, a via de administração, etc. do agente são suficientes cara atenuar on suprimir a inflamação. Os agentes antiinflamatórios da presente invenção podem ser proporcionados quer antes do início da inflamação (para deste modo suprimir a inflamação prevista) ou depois do início da inflamação.

Diz-se que a composição é farmacologicamente aceitável se a sua administração pode ser tolerada por um paciente receptor. Um tal agente diz-se ser administrado numa quanticade cerepauticamente efectiva se a quantidade administrada é fisiologicamente significativa. Um agente é fisiologicamente sijnificativo se a sua presença tem como resultado uma modificação detectável na fisiologia dum paciente receptor.

A_g moléculas da presente invenção podem ser formuladas c7- acordo com métodos conhecidos para preparar composições aceitáveis farmaceuticamente aceitáveis, sendo esses matEriais, ou os seus derivados funcionais, combinados em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável. Os veículos adequados e a sua formulação, incluindo com outras proteínas humanas, por exem.olo com albumina do soro humano, são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences (lóth ed.), Osol, A., ed,.

Uack, Saston, PA (1980). No sentido de formar uma composição eficaz farmaceuticamente adequada para administração eficaz, estas composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz de sub-unidade alfa de LFA-1 ou os seus fragmentos ou derivados funcionais, juntos com uma quantidade adequada de veículo.

P_odem ser utilizados métodos farmaceuticamente adicionais para controlar a duração da acção. P_odem

ser conseguidas preparações de libertação controlada através do uso de polímeros para complexar ou absorver a sub-unidade alfa de LFA-1 ou os seus fragmentos ou derivados funcionais. A libertaçSo controlada pode ser exeroida seleccionando macromoléculas apropriadas (por exemplo, poliéster, ácidos poliaminicos, polivinil-pirrolidona, etileno/acetato de vinilo, metilcelulose, carboximetilcelulose ou sulfato de protamina) e a concentração de macromoléculas bem oomo os métodos de incorporação no sentido de controlar a libertação. Outro método possível de controlar a duração da acção por preparações de libertação controlada consiste em incorporar as moléculas da sub-unidade alfa de LFA-1, oe seus fragmentos ou os seus derivados funcionais, em partículas de um material polimêrico tal como poliésteres, ácidos poliamínioos, hidrógéis, poli-(ácido láctico) ou copolímeros de etileno/acetato de vinilo. Em alternativa, em vez de incorporar esses agente s em partículas poliméricas, é possível encerrar essas moléculas em miorocápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de acumulação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilceluloee ou de gelatina e microcápsulas de poli-(metilaorilato), respectivamente, ou em eistemas de distribuição de produtos coloidais, por exemplo, liposomas, mioroesferas de albumina, microemuleõee, nanopartículas e nanocépsulas em macroemulsões, Estas técnicas são apresentadas em Remington’8 Pharmaoeutical Sciences (1980).

Tendo agora descrito a invenção dum modo geral, a mesma será mais rapidamente compreendida através da referência aos seguintes exemplos que são proporcionados como ilustração e não como a invenção de limitar a presente invenção a menos que seja especificado.

:[ Purificação da sub-unidade Alfa de Lfa-1 ii '1

LFA-1 é expresso nas superfícies ί de linfooitos SKW3. A molécula da sub-unidade alfa de LFA-1 |i foi purificada a partir de células 5KW3 por cromatografia de afinidade de anticorpos monoclonais utilizando o método { de Miller, L. J., et al.. (J. Immunol. 157:2891-2900 i (1987) cuja referência é aqui incorporada por referência).

anticorpo monoclonal TSl/22, que é dirigido contra a i sub-unidade alfa de LFA-1, foi purificado e acoplado (utilizando brometo de cianogénio) a Sepharose CL-4B ΐ (Pharmacia) a 2 mg de ACM por ml de leito. As células ! SKW3 (42,2 g) obtidas a partir da colecçSo de culturas i MIT foram lisadas em 300 ml de tampão de lise (Kurzinger

K. et al., J. Blol. Chem. 257:12412-12418 (1982)) e o lisado i foi em seguida centrifugado a 16 000 x g durante 2 horas, j 0 sobrenadante foi em seguida sequenciadoamente passado

I: através de uma pré-coluna de Sepharose CL-4B activada e enxaguada e em aeguida numa coluna de Sephrose TSl/22.

A coluna de Sepharose TSl/22 foi lavada sequencialmente (Kurzinger, X. et al.« J. Biol. Chem. 257:12412-12418 (1982)1 e a sub-unidade alfa de LFA-1 foi eluída com trietilamina 50 mM, NaCl 0.5 14, Triton X-100 a 0.1 %, de iodaoetamida 1 mM, aprotina a 10 U/ml e de NaN^ a 0,025 % a pH 11,5 e o pH foi imediatamente neutralizado, As fracções conten! do sub-unidade alfa de LFA-1 foram reunidas, liofilizadas í e precipitadas em 5 volumes de etanol a -20°C de um dia para o outro.

A proteína purificada foi reduzida e alquilada (Law, S. K. A. et.al., EMBO J, 6:915-919 (1987))

I' e submetida a electroforese em gel de poliacrilamida SLS. ί! A banda correspondente à sub-unidade alfa de LFA-1 foi ‘ visualizada com KC1 1 M, retirada por corte e electroeluida (Pellegrino, M. A. et al., Clln. Imunnol. Immunopath 3:

j »ί j; 324-333 (1975)). A sub-unidade alfa purificada foi lio! filizada e precipitada eo 4 volumes de etanol a -20°C ί de um dia para o outro. 0 sólido foi ressuspenso e digej rido com de tripsina a 1 % (Wong, W. W. et al.. Proo, ! Natl. Acad. Sol. (U.S.A.) 82;7711-7715 (1985)). Os frag! mentos tripitiooe foram em seguida isolados por HPLC (Beckman) numa coluna de fase invertida C4 (Vydac). Os peptídeos foram eluidos com um gradiente de acetonitrilo de 0 a 60 0 em ácido trifluoroacético a 1 Vários picos foram recromatografados isocraticamente em concentração de acetonitrilo determinada pela equàçSo:

P = (0,9 E) - 2 d

í ! em que F é a percentagem em volume de acetonitrilo sob condições isocráticas para um peptídeo que é eluido na percentagem E durante o gradiente linear (Lathe, R.

i et al.. J. Molec. Biol 185; 1-12 (1985)). Foram recolhidos í picos em tubos de polipropileno de 1,5 ml e concentrados a menos de 50 ^jul. Oito picos foram submetidos a microsequenciação. A sequência de um peptídeo, L64, foi

1' utilizado para sintetizar um único oligonucleótido de acorda com as Bugestões de Lathe, R. et al. J. Molec. Biol. 185*

1-12 (1985)):

i

5’ - GGGATGTTGTGGTCATGGATGGTGGGCTCAAT - 5’ í Em resumo, o LFA-1 foi inicialmente isolado a partir de SKW5, uma linha de células de linfoma T, e foi lisado por cromatografia de afinidade com um anticorpo monoclonal utilizando um anticorpo dirigido contra ¹ a sub-unidade ít . As fracções de SLS-PAGE apresentavam as sub-unidades cc e $ . A sub-unidade cy foi purificada ’! adicionalmente por SLS-PAGE preparativa, a sub-unidade purificada foi digerida com tripsina e os peptídeos foram isolados por HPLC de fase invertida. A sequência de peptídeos de nove picos foi determinada por micro-ee- 43 I

A ^àrineaS2i®»aSiS£Hlí

C..

quenciaçSo (Figura 1). A sequência de peptídeos que possuía a redundância de codão mais baixa foi utilizada para especificar uma sequência, oligonucleótidica única que utiliza os codões humanos que ocorrem com mais frequência (Lathe, R. et al J. Moleo. Biol. 183:1-12 (1985). As sequências dos peptídeos trípticos da sub-unidade alfa de LFA -1 sâo apresentados no quadro 1.

Quadro I

SEQUÊNCIAS LOS PEPTILOS TRÍPTICOS LE sub-unidade alfa de LFA-1

Residuos

95-107

199-210

254-260

405-413

494-503

541-554

564-576

803-817

929-946

Sequência de ácidos aminados

X X L Q (N) Η M L L L

Υ I I G I G

V L L F Q E

G E A I T A

I E G T Q V X (1) E (G) K V Ε M L K I (E/Q) P S

T Y L S G L

T N T F G A

K

X Q G

L T X I

L S G I Q X L (V/G) L A Ρ H S Ε I X

I Η N I Ρ X (Ε) Y L F I

F G

L V A V G A E

V S (T)

L E A V X G

Os parêntesis indicam ambiguidades na sequência. Os resíduos sublinhados foram utilizados para gerar uma sonda oligonucleotídica.

EXEMPLO 2

Clonagem de ALNc

Inocularam-se em placas recombinantes (5 x 10 ) de um banco de gt 10 seleccionados para in44 -

serções de ADNc maiores de 2 kb e produzidos a partir de células HL-6O induzidas por DMA (Phorbol Myristic Acid)(Corbi, A. et ai.. EMBO J. 6:4025-4028 (1987)) numa densidade de 50 000 recombinantes por placa de 150 mm. Ampliou-se o banco (Woo, S.L.C., Met. Enzymol. 68:589-595 (1979)) e processaram-se filtros de nitrooelulose de acordo com as instruções de Benton e Davis (Benton, W. D. et al.. ScAence 196:180-182 (1977)). Os filtros foram pré-hlbridadoe em 6 x SSC /~NaCl 0.6 M, citrato de sódio 0,06 M__/ fosfato de sódio e pirofosfato de sódio a 0,05 ?£, SDS a 0,5 solução de Denhardt 1 x e 100 _zug/ml de ADN de esperma de salmSo durante a noite a 42°C. 0 oligonucleÓtido de sequência simples (sequência apresentada acima) foi marcado com /l -52p-ATP utilizando quinase de polinucleótido. Os filtros foram hibridados durante a noite no tampão de pré-hibridação a 42°C e em seguida foram lavados sequencialmente em 6 x SSC, pirof osfato de sódio a 0,05 $ durante 15 minutos a 50°C. Os filtros foram expostos sobre filme XAR-5 pré-expostos a uma lâmpada relâmpago de 6 a 20 horas. Os fagos que deram sinais em filtros em duplicado foram purificados na placa e as suas inserções de ADNc foram separadas por dimensão por electroforese em gel de agarose.

A sonda oligonucleotidica de 52 bases foi utilizada para isolar vinte clones de um banco de ADNc de gtlO seleccionada por dimensão construida a partir de células meelóides estimuladas por PUA (Corbi, A. et al.. EMBO J. 6:4025-4028 (1987)). Anteriormente tinha já sido demonstrado que estas células sintetizam a sub-unidade alfa de LFA-1 (Miller, L. J. et al., 5, Immunol. 159: 842-847 (1987)). A dimensão da inserção foi determinada e o clone mais longo, /\ 5L5, foi mapeado por restrição (Figura 2). Este olone continha a sequência nucleótidica correspondente à sonda oligonucleótidica (85 % idêntico à sonda mais provável). A sequencianucleótidica codifocava também para o peptídeo triptioo que foi determinado por microesequenciaçfio (16 de 16 resíduos) que inoluia e que

se prolongaga para lá da sonda oligonucleotídica. No entanto, este clone nSo codificava para a proteína inteira uma vez que nem todas as sequências do pept ídeo tríptico estavam presentes no quadro de leitura livre. 0 fragmento

EcoRi 5* de 1,0 kb de / 5L5 foi utilizado para efectuar 5 uma nova busca de outros 5 x 10 recombinantes. Foram identificados 14 clones adicionais e o clone 3R1 possuia um papa de restriçSo idêntico nas regiões de sobreposição e continha um fragmento 5’ de 1,0 kb. A sequência nucleotídica deste fragmento adicional foi determinada (Figura 2).

EXEMPLO 5

Mapeaçgo de restriçSo e sequenciação de nucleótidoB

Foram determinados os mapas de restriçSo dos clones seleccionados através de digestão dupla ou parcial (Maniatis et al. (In: Molecular Clonlng, A. Laboratory Manual, Colde Spring Harbor Laboratory, Cold Spring harbor, NY (1982)). Os fragmentos de restriçSo foram subclonados em Ml3mpl8 ou em M13mpl9 (Messing, J. Met. Enzymol. 101:20-78 (1983)) ou pGEM-3Z, 4Z ou 7Z (Promega). Foram efectuadas supressões dos fragmentos em pGEM utilizando exonucleaee III e SI (Henikoff, S. Gene 28: 351-359 (1984)). A sequênciação foi levada a cabo pelo método de terminação didesoxi (Sanger, F. et al. Proc. Natl. Acad. Scl. (U.S.A. 74:5463-5467 (1977)). A sequência de codificação e as regiões não traduzidas 5' e 3* foram determinadas a 100%, 83,1% e 33,7% em ambas as orientações, respectivamente .

Os clones de ADN em sobreposição contém 5139 nucleótidos (Figura 3). Há um quadro de leitura aberto de 3510 nucleótidos, uma região não traduzida 5* de 94 nucleótidos e uma região não traduzida 3’ de 1535 nucleótidos que contém um local de poliadenilação de 15 nucleótidos antes do apendice de poli(A+). Dentro da região não traduzi- 46 -

da 3’ existe uma reptição típica Alui constituída por duas regiões relacionadas em série, cada uma terminada por um segmento rico em A (Hardman, N., Blochem. J. 234: 1-11 (1986)). A sequência Alu tem o comprimento de 304 nucleótidos e é em 78.8 # idêntica a sequência familiar Alu comum.

EXEMPLO 4

Mancha de Southern e Northern

A mancha de Southern foi realizada tal como descrito por Corbi, A. et al. (J. Exper. Med.

167: 1597-1607 (1988)). Submeteram-se a electroforese 20 _zug/ml do produto isolado de ARN celular total de qualquer das células SKW3. U937, IB4 ou EJ numa gel de formaldeído a 1.0 % e transferiram-se para nitrocelulose (In: Current Protocols In Molecular Biology, Green Publishlng Associates and Wiley-Interscience, Nova Iorque). A membrana de nylon (sonda Zeta (Biorad) foi pré-hibridada em 2 x SSC, x solução de Lenhardt, SDS a 0,1 e 10 ug/ml de ADN de esperma de arenque. Uma sonda de 1,8 kb de EooRI da extremidade 5’ do clone de ADNc, 3R1 foi marcada por translacçâo de encaixe e foi utilizada como sonda.

A análise de mancha de Northern demcosstrou uma mensagem de 5,5 kb em células SKW3, U937 e IB4 mas não foi detectado qualquer sinal em células EJ. As distribui· ções de células estão em boa concordância com a dimensão do clone de ADNc e a expressão da superfície celular de LFA-1. A análise da mancha de Souther utilizando o fragmento EcoRI-BaaHI do olone Λ 2L2 hibridou com os dois fragmentos de 10 e de 8 kb (Corbi, A., et al.. J. Exper. Med. 167: 1597-1607 (1988)). Um clone genómico isolado a partir de um banco de cosmideos possui estes dois fragmentos de 10 e de 8 kb (Corbi, A., et al.. J. Exper, Med. 167: 1597-1607 (1988)). Um clone genómico isolado a partir de um banco de cosmídeos possui estes dois fragmentos de oompri- 47 -

mento identco. Estes fragmentos sSo contíguos e demonstram que o gene de LFA-1 é um gene cópia única.

EXEMPLO 5

Análise computacional ι

A procura de homologia e de alinhamento de sequência foi efectuada utilizando inicialmente o programa Microgenie DNA (Bekman), FASTP (Milbur and Sigmann) nas bases de dados NBRF e NEW (National Biomedical ί _s ι Research Foundation, Washington, DC). e FASTP utilizando a base de dados SWISS-PROT (Bionet). Estés alinhamentos foram em seguida optlmizados utilizando ALIGN (NBRF) ' (5585) e GENALIGN (Bionet).

A hidrofobicidade foi determinada j utilizando o programa Microgenie DNA bem como PEP-PILOT | (5792) (Universidade de Wiscosin Genetica Computer Group).

As análises de hidrofobicidade da sequência de ácidos aminados mostrou que a sub-unidade /1 de LFA-1 é uma proteína de transmembrana típica com uma sequência de sinal de , hidrofobicidade, um domínio extracelular, uma região de transmembrana hidrofóbica e um pequeno apendice oitoplasmático. 0 resídno N terminal de LFA-1 humano foi identificado por homologia com o N terminal de LFA-1 murino (Figura 5).

LFA-1 humano possui 55% de identidade com o LFA-1 murino nos primeiros 20 ácidos aminadoe. Um peptídeo de sinal clás! sico com uma sequência de consenso (Ala-X-Ser/Pro) para • a peptidase de cisão precede a sequência N terminal. Existem três locais presumíveis de inicio de tradução a montante (ATG) em concordância de quadro. 0 uso do primeiro j local de início na posição do nucleótido 89 é em geral ! favorecido (Kozak, M. Nuol. Acid. Res. 12:857-872 (1984) e ' dá como resultado uma sequência de sinal de vinte e cinco resíduos com vários grupos polares perto dos resíduos N terminais que é tipicamente encontrada em sequências de einal (von Heijne, G., J. Molec. Biol. 173: 243-251 (1984)).

Verificou-se que todos os 117 ácidos aminados determinados por microssequenciaçSo de peptldeos trípticos se encontravam no quadro de leitura abert-c traduzido, confirmando a autenticidade dos clones de ADNc. Tomadas am conjunto estas descobertas demonstram que a sub-unidade de LFA-1 possui uma sequência de sinal de 29+ ácidos aminados N termina, um domínio extracelular de 1063 resíduos, um domínio de tranemembrana de 29 ácidos aminados e um apêndice citoplasmátioo C terminal de 53 ácidos aminados.

Bentro do domínio extracelular enconi tram-se sete repetições de 49 a 63 ácidos aminados. 0 grau de identidade interna e a significancia estatística entre estas repetições internas é maior entre as últimas três —2 —6 repetições 24 a 33% com p < 10“ a < 10 .A regiSo central das três últimas repetições tem homologia com vários looais de ligação de catiões divalentes (Figura 4). Uma vez que estudos anteriores mostraram que o catiSo Mg^ isoladamente ou a concentrações mais baixas em conjunçSo

2+ com Ga é necessário para a integridade da proteína (Rothlein R. et al., J. Éxperi. Med. 163: 1132-1149 ' (1986/). A homologia das três repetições em série com í

locaisde ligaçfio de catiões divalentes sugere que o LFA-1 se liga a catiões divalentes. Nas repetições I a IV está atente o local de ligaçSo de catiões divalentes ceneensual mas sSo conservadas as regiões de flanco. Estas ' semelhantes estruturais suscitam a probabilidade de que eetas repetições tenham surgido por um fenómeno de duplicação.

I li j A proteína madura possui uma Mr = 126

193 e doze looais de glicosilaçSo ligados por N (Asn-X-Thr/ ) /Ser) estão localizados no domínio extracelular. Estudos anteriores demonstram que pelo menos cinco destes locais sSo glicosilados e possuem oligossacaríadeos com uma Mr = 5 000 a 10 000 Daltons, o que é típico para hidratos de carbono ligados por N complexos (Lahms, Ν. M. et al..

- 49 J. Immunol. 134 :5978-5986 (1985)). Assim o uso de 5 a 10 destes locais de glicosilaçSo faria prever um peso molecular de aoordo com o peso molecular determinado por SDS-PAGE.

A determinação do terminal N de

LFA-1 murino (Girma, JP. et al. Blood 70j 605-611 (1987)) e da estrutura primária da sub-unidade comum a LFA-l/ /Mac-l/pl50, 95 sugeriu que a sub-unidade de LFA-1 é um membro da superfamílla das Integrinas. A sub-unidade de

LFA-1 possui uma homologia marcada (35% de identidade) em relação com as sub-unidades ^de pl5O,95 e de Mac-1 e, cu em menor parte, em relação com as sub-unidades dos receptores de ECM (25 % de identidade). Por outro lado os FNR, VNR e Ilb são idênticos entre si em 40%. Além disso as integrinas leucooitárias contém também uma inserção de aproximadamente 200 ácidos aminados perto da região N terminal da proteína que não está presente nos três receptores de ECM sequenciados (Figura 5). Além disso a região onde ocorre um local de cisão da protease no VNR, FNR e SpIIb/lIIa está ausente do LFA-1 bem como as sub-unidades

4^ de pl5O,95 e de Mac-1 e correlacionam-se com a falta de processamento proteolítico das sub-unidades da família LFA-1. Em conjunto, estas características estruturais definem duas subfamílias das integrinas da sub-unidade as integrinas leucooitárias e as integrinas de ECM.

Todas as sub-unidades da família das integrinas tem repetições em série semelhantes ao LFA-1 que contém locais de presumível ligação de catiões divalentes (Corbi, A. et al., EIBO J. 6:4025-4028 (1987), Poncz,

M. et al.. J. Boll, Chem. 262:8476-8482 (1987), Suzuki,

S. et al.. Proc. Natl, Acad. Scl, (U.S.A.) 83: 8614-8618 (1986), Argraves, M. S. et al., J. Cell Biol. 105: 1183-1190 (1987), Ruoslathi, E. et al.. Science 258: 491-497 (1987)). No entanto apenas três das repetições em LFA-1 e pl50 contém locais de ligação presumível de metal en- 50 -

quanto que todos as quatro repetições em receptores de EGM contém locais de ligação de metal. Os locais de ligação de catião divalente presumíveis de LFA-1 e as outras integrinas encontram-se relacionadas mas não são identioas a locais de ligação de catiBes divalentes de proteínas de membrana integral já descritos. Existem vários tipos de locais de ligação de catiões divalentes. 0 primeiro conjunto de tipos de locais possui uma estrutura alternada de D-X-D(N)-X-D(N). Estes locais encontram-se na troponina C, na parvalbumina (5256) e na proteína de ligação de galactose entre outras. Estes locais formam uma estrutura em ciclo EF e possuem 6 a 7 locais de quelaçâo. Os locais de ligação presumíveis em LFA-1 e as outras integrinas possuem também uma estrutura primária D-X-D(N)-X-3(N) com um número de resíduos G entre os resíduos de quelaçâo sendo conservados. No entanto o resíduo na posição —Z é substituido por um resíduo hidrfobo. Além disso a hélice ce antes e depois do local de ligação de cálcio parece estar ausente dos locais da integrina (Corbi,

A. et al. ΕΙΊΒΟ J. 6.: 4023-4028 (1987)). 0 significado desta mudança é desconhecida mas pode em parte ter a ver com a preferência destes locais para Mg2+.

A busca dos bancos de dados NBRF e Swisse-Protein revelou que o domínio especiífico desta família LFA-1, que nós passaremos a referir como domínio L”, possui uma homologia significativa com o domínio Al do vWF humano, complemento humano do factor B e proteína da matriz de colagénio de galinha. Estas semelhanças prolongam—se sobre todo o comprimento do domínio *'L. Uma vez que vWF possui três domínios A repetidos (Al, A2, A3) (5790) o domínio no factor complementar B é análogo a um domínio semelhante ao componente 2 do complemento (C2) (5789() e o CPM possui duas repetições (5778), o domínio L de LFA-1 foi comparado contra todos estes domínios utilizando o programa ALIGN. Com excepção de C2 todos estes alinhamentos foram significativos estatisticamente (Figura 6).

- 51 Estas semelhantas implicam um possível domínio funcional para o LFA-1. Primeiro o domínio Al do vWF liga-se à glicoproteina Ib e à hiparina (5446) enquanto ambos os domínios Al e A3 estão envolvidos na ligação a colagénio. Segundo, o domínio homólogo no factor B está localizado no lado C terminal do local de cisão no qual o factor B é cindido para factor Bb e no lado N terminal da protease de serina (Mole, J. E. et. al., J. Biol. Chem. 259: 3407-3412 (1984), Bently, D.R. Biochem. J. 239:

339-345 (1986)). Este domínio encontra-se, assim, localizado na região que se experaria que interactuasse com o eeu ligando G3b. A estrutura da proteína da matriz de colagénio foi parcialmente determinada e tem duas repetições separadas por uma sequência semelhante a faotor de crescimento de epiderme (Argraves, M. W. et. al., Proo. Natl. ^Ácad. ^óoi. (U.S.A. 84: 864-868 (1987)). 0 CMP interactua com ambos os colagénios (Argraves, W. S. et.al.. Proc.

Natl. Acad. Scl (U.S.A.)84:464-468 (1987)) e proteoglicano de oartilhagem (Figura 7) (Paulsson, M. et. al.. Collagen Rei. Res. 4: 219-229 (1984)).

As proteínas LFA-1, Mac-1 e pl5O,95 foram recentemente localizadas no cromossoma 16pll (Corbi,

A. et al., J. Exper. Med. 167: 1597-1607 (1988)). A semelhan ça estrutural e a proximidade dos genes que codificam para as sub-unidades C6 de integrina leucocitária sugerem que um gene primordial se duplicou e deu origem a pelo menos dois ramos de sub-unidade cc de integrina, as integrinas leucocitáriae e as integrinas SCM. Um domínio de 180 ácidos aminados tornou-se inserido no gene primordial da sub-unidade da integrina leucooitária e em seguida o gene duplicou-se e deu origem a LFA-1, Mac-1 e pl5O,95. A semelhança destes domínios com o domínio L da família LFA-1 sugere que este domínio L pode ser um domínio funcional.

Além disso estas homologias implicam que um drmínio primordial se tornou inserido em diversas proteínas e em seguida envolveu diversas funçSes de reconhecimento na hemostase,

na activação oomplementar e na resposta imune.

Estas diferenças estruturais entre os dois grupos de integrina da sub-unidade Cu estSo relacionadas com a diferença no local de reconhecimento dos domínios funcionais uma vez que os peptídeos contendo RGD bloquearão a ligação do PNR e gpllb/llla aos seus respectivos ligandos (Ruoslahti, E. et al·.. Science 258: 491-497 (1987)) enquanto que os peptídeos RGDS não inibirá a Interacção do LAF 1 com ICAM 1. Ao contrário dos ligandos das integrinas ECM. o próprio ICAM 1 não tem uma sequência de peptídeos RGD e é um membro da superfamília do gene de imunoglobultina. Tanto os dados estrurais como funcionais sugerem que a superfamília das integrinas pode ser dividida em duas subfamílias de sub-unidadeB . Estas propriedades estruturais e funcionais das sub-unidades cu associadas com /3 2 podem, no entanto, não ser especificas para a sua sub-família uma ver que várias outras sub-iànidades cu de integrinas podem possuir caracteristicas semelhantes à família LPA-1 tal como a falta de um local para cisão proteolitica (Charo, I.F. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 85: 8551-8555 (198b)).

escralecimento da estrutura da sub -unidade cu de LFA-1 revelou novos relacionamentos evolucionários entre as sub-unidades cu de integrina e sugeriu um possível domínio funcional, e demonstrou que a sub-unidade cu de LFA-1 pertence à superfamília das integrinas mas possui um domínio adicional. Este domínio L e domínios homólogos constituem uma família de domínios proteicos, a qual possui importância funcional. Uma vez que o local de reconhecimento de LFA-1 não é RGD, o domínio L pode possuir um significado funcional na sub-unidade cu LVA-1 bem como as outras integrinas leucocitárias, Mac-1 e pl5O,95. No entanto uma vez que 0 LFA-1 está envolvido num grande número de funções leucocitários e pode ter mais do que um ligando (Rothlein, R., et al·., J. Immunol.

- 53 1270-1274 (1986)), é possível que exista mais do que um domínio funcional na sub-unidade de α de LFA-1. É também provido de interesse examinar as interacções que o apêndice citoplasmático terá com o citoesqueleto e que papel desempenha esta interacçao na sinalização. A disponibilidade dos clones de ADNc para as sub-unidades α e β permite que estas relações estrutura-função sejam examinadas.

Embora a presente invenção tenha sido descrita em associação com as suas formas concretizações específicas, deverá ser entendido que é susceptível de outras modificações e que esta aplicação cobre quaisquer variações, usos ou adaptações da presente invenção seguindo, em geral, os princípios da presente invenção e incluindo modificações da presente invenção como as que são possíveis no âmbito da prática conhecida ou habitual da técnica à qual a presente invenção pertence e tal como podem ser aplicadas às características essenciais apresentadas anteriormente tal como se segue no âmbito das reivindicações anexas.

Claims (23)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 . Processo para a preparação de uma molécula de ADN recombinante capaz de expressar a sub-unidade alfa do LFA-1 ou um seu derivado funcional caracterizado por compreender pelo menos uma das seguintes fases:

   (a) análise de um banco de inserções em vectores lançadeira de ADNc derivado de uma célula que expressa a sub-unidade alfa do LFA-1 para determinar a presença de uma inserção que contém o gene da sub-unidade alfa do LFA-1;

   (b) exame das sequências de ADN capazes de codificar para fragmentos adequados de peptideos;

   (c) identificação de um oligonucleótido ou um conjunto de oligonucleótidos que possui a capacidade de codificar para um fragmento do gene da sub-unidade alfa do LFA-1 (ou que é complementar deste oligonucleótido ou conjunto de oligonucleótidos);

   (d) utilização do oligonucleótido ou conjunto de oligonucleótidos que contém a sequência teoricamente mais provável capaz de codificar para os fragmentos da sub-unidade alfa do LFA-1 a fim de identificar uma sequência de um oligonucleótido ou conjunto de oligonucleótidos que é capaz de hibridar com a sequência ou conjunto de sequências mais provável;

   (e) obtenção de uma molécula de ADN ou conjunto de moléculas de ADN capaz de funcionar como sonda para identificar e isolar o gene da sub-unidade alfa do LFA-1 por construção de um oligonucleótido complementar da sequência teórica ou conjunto de oligonucleótidos complementares do conjunto de sequências mais provável;

   (f) ligação funcional desta sequência ou de um fragmento desta sequência a um promotor funcional de modo a dirigir a expressão da sub-unidade alfa do LFA-1 ou de um seu derivado funcional numa célula ou num organismo.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a referida sub-unidade alfa do LFA-1 ou o seu derivado funcional conter adicionalmente pelo menos um polipeptídeo seleccionado de entre o grupo constituído por:

   a. P-P-R-A-G-R-H; h. G-V-D-V-Q-D-G-E-I-E; b. I-I-T-D-G-E-A; i . D-I-N-G-D-G-L-V-D-V; • c . D-W-A-G-G-F-L; j · V-K-D-L-E-G-D-G-L-A; • • - 55 -

   d. S-Q-V-Q-T-I-H; k. T-Y-L-S-G-L; e. R-H-G-G-L-S-P; 1. Y-I-I-G-I-G-K; f . M-S-C-T-D-F-S; m. I-E-G-T-Q-V-L-S-Q; e g- R-L-L-S-R-A-L; n. P-S-I-H-N-I-P.
3. 3. Processo para a preparação da sub-unidade alfa do LFA-1 ou de um seu derivado funcional sob forma substancialmente livre de contaminantes naturais caracterizado por se provocar a expressão de uma molécula de ADN preparada de acordo com o processo de qualquer das reivindicações 1 ou 2 numa célula ou num organismo adequados.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por a referida sub-unidade alfa do LFA-1 ser adicionalmente capaz de ligação a uma molécula presente sobre a superfície de uma célula.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por a referida molécula presente sobre a superfície da referida célula ser ICAM-1 ou outro ligando natural do LFA-1.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por a referida molécula ser capaz de associação com uma sub-unidade beta de LFA-1 a fim de formar um heterodímero de LFA-1.
7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por o referido heterodímero ser capaz de ligação a ICAM-1 ou a outro ligando natural do LFA-1.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por a molécula da sub-unidade alfa do LFA-1 preparada conter adicionalmente pelo menos um polipeptideo seleccionado de entre o grupo constituído por:

   a. P-P-R-A-G-R-H; h. G-V-D-V-Q-D-G-E-I-E;

   b. I-I-T-D-G-E-A;

   c. D-W-A-G-G-F-L;

   d. S-Q-V-Q-T-I-H;

   e. R-H-G-G-L-S-P;

   f. M-S-C-T-D-F-S;

   g. R-L-L-S-R-A-L;

   i. D-I-N-G-D-G-L-V-D-V;

   j . V-K-D-L-E-G-D-G-L-A;

   k. T-Y-L-S-G-L;

   l. Y-I-I-G-I-G-K;

   m. I-E-G-T-Q-V-L-S-Q; e

   n. P-S-I-H-N-I-P.

   com

   Processo de acordo com a reivindicação por se obter um derivado funcional que é sub-unidade alfa do LFA-1.

   4 caracterizado um fragmento da
9. 10. Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por se obter um derivado funcional que é um variante da sub-unidade alfa do LFA-1.
10. 11. Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por se obter um derivado funcional que é um análogo da sub-unidade alfa do LFA-1.
11. 12. Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por se obter um derivado funcional que é um derivado químico da sub-unidade alfa do LFA-1.
12. 13. Processo para a preparação de uma composição farmacêutica útil para o tratamento de inflamação resultante de uma resposta do sistema de defesa específico num mamífero ou para a supressão de metásteses de uma célula tumoral hematopoiética que necessita um membro funcional da família do LFA-1 para migração caracterizado por se princípio seleccionado sub-unidade incorporar como anti-inflamatório constituído por:

    activo um de entre o alfa do LFA-1 agente grupo ou um quando derivado funcional da sub-unidade alfa do LFA-1 preparados de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 12, numa quantidade suficiente para suprimir a referida inflamação ou as referidas metásteses.

    A
13. 14. Processo de acordo com a reivindicação 13 caracterizado por adicionalmente se incorporar a sub-unidade beta do LFA-1 ou um derivado funcional da sub-unidade beta do LFA-1.
14. 15. Processo de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por a referida sub-unidade alfa do LFA-1 ser preparada por expressão de uma molécula de um ácido nucleico recombinante e por a referida sub-unidade alfa do LFA-1 estar associada com a referida sub-unidade beta para formar deste modo um heterodímero.
15. 16. Processo para a preparação de uma composição farmacêutica útil para o tratamento de infecções virais caracterizado por se incorporar como princípio activo uma quantidade eficaz da sub-unidade alfa do LFA-1 ou um seu derivado funcional quando preparados de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 12.
16. 17. Processo para a preparação de uma composição farmacêutica útil para a supressão do crescimento de uma célula tumoral que expresse a sub-unidade alfa do LFA-1 caracterizado por se incorporar como princípio activo uma toxina seleccionada de entre o grupo constituído por: uma toxina derivada da sub-unidade alfa de LFA-1 e uma toxina derivada de um derivado funcional de um membro da sub-unidade alfa do LFA-1 quando preparados de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 12, numa quantidade de suficiente para suprimir o referido crescimento.
17. 18. Utilização de uma composição que contém uma sub-unidade alfa de LFA-1 marcada, quando preparada de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 12, capaz de identificar uma célula que expressa ICAM-1 ou outro ligando natural de LFA-1 e detectar a referida sub-unidade alfa de LFA-1 caracterizado por se destinar à determinação da presença e da localização de uma inflamação que seja resultado de uma resposta do sistema específico de defesa de um mamífero que se suspeite sofrer desta inflamação.
18. 19. Processo para a determinação da presença e da localização de uma inflamação que seja resultado de uma resposta do sistema específico de defesa de um mamífero que se suspeite sofrer desta inflamação caracterizado por compreender as fases de:

    (a) incubar uma amostra de tecido do referido indivíduo com uma composição que contém uma molécula de ácido nucleico capaz de ligação a uma molécula seleccionada de entre o grupo constituído por uma sequência de ADN da sub-unidade alfa de LFA-1, quando preparada de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, e uma sequência de ARNm de um gene para a sub-unidade alfa de LFA-1, sendo a referida ligação capaz de identificar uma célula que expressa ICAM-l ou outro, ligando natural de LFA-1 e (b) detectar a referida molécula de ácido nucleico.
19. 20. Processo de acordo com a reivindicação 19 caracterizado por a referida molécula de ácido nucleico codificar para pelo menos um polipeptídeo seleccionado de entre o grupo constituído por:

    a. P-P-R-A-G-R-H; h. G-V-D-V-Q-D-G-E-I-E; b. I-I-T-D-G-E-A; i . D-I-N-G-D-G-L-V-D-V; c. D-W-A-G-G-F-L; j · V-K-D-L-E-G-D-G-L-A; d. S-Q-V-Q-T-I-H; k. T-Y-L-S-G-L; e. R-H-G-G-L-S-P; 1. Y-I-I-G-I-G-K; f. M-S-C-T-D-F-S; m. I-E-G-T-Q-V-L-S-Q; g· R-L-L-S-R-A-L; n. P-S-I-H-N-I-P.
20. 21. Processo para a determinação da presença e da localização de uma inflamação que seja resultado de uma resposta do sistema específico de defesa de um mamífero que se: - 59 suspeite sofrer · desta inflamação caracterizado por compreender as fases de:

    (a) incubar uma amostra de tecido do referido indivíduo com uma composição que contém uma molécula de ácido nucleico capaz de ligação a uma sub-unidade alfa de LFA-1 e uma sequência de ARNm de um gene para a sub-unidade alfa de LFA-1 marcada de forma detectável capaz de identificar uma célula que expressa ICAM-1 ou outro ligando natural de LFA-1 e (b) detectar a referida sub-unidade alfa de LFA-1.
21. 22. Processo de acordo com a reivindicação 21 caracterizado por a referida sub-unidade alfa de LFA-1 se encontrar ligada a ICAM-1 na referida amostra de tecido.
22. 23. Utilização de uma composição que contém um ligando de ligação marcado de forma detectável capaz de se ligar ao referido ICAM-1 ou o referido outro ligando natural de LFA-1, sendo os referidos ligandos seleccionados de entre o grupo constituído pela sub-unidade alfa de LFA-1 e um derivado funcional da sub-unidade alfa de LFA-1 e detectar o referido ligando de ligação caracterizado por se destinar à determinação da presença e da localização de uma célula tumoral que expressa ICAM-1 ou outro ligando natural de LFA-1 num indivíduo que se suspeite ter destas células.
23. 24. Processo para a determinação da presença e da localização de uma célula tumoral que expressa ICAM-1 ou outro ligando natural de LFA-1 num indivíduo que se suspeite ter destas células caracterizado por compreender as fases de:

    (a) incubar uma amostra de tecido do referido indivíduo na presença de uma composição que contém um ligando de ligação marcado de forma detectável capaz de se ligar ao referido-ICAM-1 ou um outro ligando natural de LFA-1, sendo os referidos Iigandos seleccionados de entre o grupo constituído pela sub-unidade alfa de LFA-1 e um derivado funcional da sub-unidade alfa de LFA-1 e (b) detectar o referido ligando de ligação que se encontra ligado ao referido ICAM-1 presente na referida amostra de tecido.

    A requerente reivindica as prioridades dos pedidos norte-americanos apresentados em 23 de Agosto de 1989 e em 9 de Março de 1989, sob os números de série 07/235,227 e 321,017, respectivamente.

    Lisboa, 22 de Agosto de 1989