PT914440E - Vacinação com áçido nucleico contra infecções parvovirais - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "VACINAÇÃO COM ÁCIDO NUCLEICO CONTRA INFECÇÕES PARVOVIRAIS" O campo geral da invenção consiste num método para a vacinação de animais com ácido nucleico, para os proteger contra infecções parvovirais. Esta invenção refere-se, mais particularmente, à preparação e utilização de ADN parvoviral e à sua administração a cães, gatos e martas, de forma a induzir uma resposta imunitária que possa proteger estes animais de doença causada por parvovírus virulento. Os imunogénios de ácido nucleico são concebidos para incluir as porções antigénicas do genoma parvoviral, os quais são incorporados em plasmídeos bacterianos. Estes plasmídeos produzem o produto génico parvoviral pretendido, quando introduzidos em células hospedeiras por transfecção. As células hospedeiras transfectadas com plasmídeos expressando o imunogénio parvoviral, produzem um fluxo de proteínas antigénicas, para as quais o sistema imunitário hospedeiro irá estabelecer uma resposta imunitária protectora.

Os parvovírus são uma família de pequenos vírus de ADN, infimamente relacionados, compostos por uma cápsula proteica contendo ADN em cadeia simples. Os parvovírus causam várias doenças em várias espécies de mamíferos. O vírus da panleucopenia felina, o vírus da enterite da marta e o parvovírus canino são variantes de gama de hospedeiro do subgrupo do parvovírus felino e partilham uma homologia de ADN superior a 98% (Martyn et al., J. Gen. Virol. 71 (1990) 2747- 1 2753) . 0 parvovírus canino é um agente patogénico relativamente novo de todos os canideos, tendo sido inicialmente identificado no final dos anos 7 0 como o agente causador de uma pandemia mundial de gastroenterite altamente fatal. Pensa-se que este virus seja um mutante de gama de hospedeiro do parvovirus felino. Quando foram comparadas as sequências nucleotidicas de parvovirus felino e canino, foram identificadas modificações em 31 bases, resultando em modificações em apenas 9 aminoácidos (Martyn et al., 1990). Seis destas modificações de aminoácido situaram-se nos genes principais da cápsula VP1 e VP2. O epitopo antigénico especifico canino é determinado pela diferença num único aminoácido do virus da panleucopenia felina. O mapeamento genético adicional confirmou recentemente o momento da origem do parvovirus canino, reforçou a teoria da sua origem a partir do parvovirus felino e indicou uma evolução contínua do vírus nas estirpes de campo que estão a ser agora isoladas (Truyen et al., J. of Virology 69 (8) (1995), 4702-4710).

As duas proteínas da nucleocápsula, VP1 e VP2, são expressas a partir do mesmo ARN, resultando a VP2 de um codão ATG, na grelha de leitura correcta, dentro da grelha de leitura aberta da VP1. A VP2 é expressa em níveis quase 10 vezes mais elevados do que a VPl, indicando que o codão de iniciação interno é reconhecido mais eficientemente, como tal, pelo aparelho de tradução (Turiso et al., J. Geri. Virol. 72 (1991), 2445-2456). As experiências de mapeamento do epitopo demonstraram que todos os epitopos antigénicos que produzem anticorpos neutralizantes se situam dentro da VP2 (Turiso et al., 1991, loc. cit.). Estes incluem os 16 primeiros aminoácidos da VP2 (Langeveld et., J. of Virology 68 (7) (1994), 4506-4513;

Casal et al., J. of Virology 69 (11) (1995), 7274-7277). 2 A imunização permanece o principal mecanismo pelo qual os humanos e as espécies animais são protegidos contra o flagelo das doenças infecciosas. A tendência recente da concepção de vacinas se afastar de agentes vivos atenuados, devido à preocupações de segurança devido a "surtos de vacina", atenuação incompleta, reversão ou amplificação em doentes imunossuprimidos, verificou, também, uma redução associada da duração e eficácia da vacina. A utilização de agentes mortos, proteínas ou péptidos recombinantes clonados requer grandes dosagens e a presença de adjuvantes. No entanto, os efeitos a longo prazo desses adjuvantes não foram investigados e estes foram recentemente envolvidos como agentes causadores de sarcomas induzidos por vacinas em gatos (Hendrick et al., J. Am. Vet. Med. Assoe. 205 (1994), 1425-1429). Para além disso, a localização extracelular do antigénio injectado levanta questões sobre a via pela qual estes antigénios são apresentados ao sistema imunitário e a sua adequação para produzir protecção contra infecções de ocorrência natural.

As práticas de imunização actuais para o parvovirus canino são marginais (Schultz, RD. (1994), The Challenge of Controlling a Newly Recognized Disease: Canine Parvovirus Vaccines, IBC International Symposium, 27-28 de Outubro, 108) . As vacinas consistindo em organismos atenuados ou mortos, devem ser administradas repetidamente para criar imunidade e a imunização em presença de titulos de anticorpos maternos circulantes não ocorre normalmente. Este problema é complicado pela capacidade dos anticorpos maternos inactivarem a vacina ao mesmo tempo que ficam reduzidos para niveis que não são protectores, originando "uma janela de vulnerabilidade" (Pollock e Carmichael, J. Am. Vet. Med. Assoe. 130 (1982), 37-42). A clonagem do parvovirus canino originou o desenvolvimento de duas estratégias de vacina 3 distintas. A primeira consistiu na introdução da sequência completa da VP2 num sistema de expressão de baculovirus. 0 produto proteico foi recolhido e utilizado para imunizar cães com sucesso (Turiso et al., J. of Virology 66 (5) (1992), 2748- 2753) . A segunda estratégia envolve a subclonagem ou a sintese de epitopos peptídicos, os quais são utilizados para imunizar cães. Estes péptidos utilizaram a sequência amino terminal da VP2 (Casal et al., 1995, loc. cit.), os quais resultaram na imunização de cães com sucesso. As vacinas desenvolvidas utilizando estas estratégias foram, também, testadas com o virus de enterite da marta, outra variante de gama de hospedeiro, intimamente relacionada de parvovírus. A administração, quer de proteina recombinante, quer de péptidos resulta na imunidade protectora a esta doença comercialmente relevante da marta (Langeveld et al., Vaccine 13 (11) (1995), 1033-1037).

No documento EP-A-0647655 e em Turiso et al. (J. General

Virology 72 (1991), páginas 2445 a 2456) foram descritas vacinas contra parvovírus, constituídas por péptidos correspondentes a epitopos antigénicos de proteínas da cápsula parvoviral. Além disso, Langeveld et al., Vaccine, volume 12, (1994), páginas 1473 a 1480, divulga, a titulo de referência, a vacinação de cães utilizando vírus modificado vivo ou material virai inactivado.

As vacinas de vírus vivo modificadas, contra a panleucopenia felina, são eficazes na protecção de gatos adultos, mas podem produzir más-formações em embriões de gato in utero, consequentemente estas não são recomendadas para vacinar gatos fêmea virgens que possam ficar prenhes. Devido às graves limitações das vacinas de vírus vivo modificadas, os investigadores começaram a explorar a possibilidade de 4 transfectar células, in vivo, com genes expressando antigénios de organismos infecciosos (revisto em Donnelly et al., J. Imm. Meth. 176 (1994), 145-152; Fynan et al., Int. J. Immunopharmac. 17 (2) (1995), 79-83; Whalen et al. (1995), DNA Mediated

Immunization to the Hepatitis B Surface Antigen; Activation and Entrainment of the Immune Response in DNA Vaccines, Nova Iorque: Academia das Ciências de Nova Iorque). Esse mecanismo de imunização simula a via da expressão genética virai sem o risco associado colocado por organismos atenuados, contornando a necessidade para adjuvantes típicos. A descoberta inesperada de que a injecção intramuscular de ADN plasmídico "nú" contendo um promotor de mamífero faz com que o ADN seja incorporado e expresso pelas células musculares (Wolff et al., Science 247 (1990) 1465-1468), originou uma expansão dramática do novo campo da vacinação com ácidos nucleicos. Subsequentemente ao estudo original, foram, adicionalmente, definidas e alargadas as condições que afectam a injecção intramuscular do ADN plasmídico (Wolff et al., Biotechniques 11 (1991), 474-485). A eficiência da transferência é relativamente baixa, variando de 1-5%, no entanto, essa eficiência pode ser aumentada até 40 vezes, pela indução da degenerescência muscular antes da injecção do ADN plasmídico (Vitadello et al., Hum. Gene. Ther. 5 (1994), 11-18;

Danko e Wolff, Vaccine 12 (16) (1994), 1499-1502); Davis et al.,

Hum. Gene. Ther. 4 (1993), 733-740). Dois dos agentes mionecróticos mais normalmente utilizados são o anestésico local bupivicaína e cardiotoxina (Danko e Wolff, 1994, loc. cit.; Davis et al., 1993, loc. cit.). Foram utilizadas várias outras técnicas para transferir genes para músculo, incluindo vectores retrovirais, vectores adenovirais e lipossomas. No entanto, a injecção directa de ADN nú parece ser o mais eficiente destes mecanismos de distribuição, na transferência e expressão de ADN exógeno (Davis et al., 1993, loc. cit.). 5

Foram exploradas várias vias de administração, para além da injecção intramuscular. A ausência de uma necessidade de qualquer agente ou vector para facilitar a entrada do ácido nucleico nas células alvo é comum a todas estas vias. A injecção intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, intranasal e subcutânea de plasmideos de ADN resultou na imunização contra a hemaqlutinina do virus influenza (HA) em galinhas (revisto em Pardoll e Beckerkleg, Immunity 3 (1995) , 165-169) . Curiosamente, estes estudos indicaram que a imunização mucosal (intranasal) com ADN não produziu a resposta de IgA esperada, mas antes uma resposta de IgG, como verificado para as injecções intramusculares. Adicionalmente, a imunização intradérmica por bombardeamento com microparticulas de ouro revestidas com ADN demonstrou ser tão eficaz como outros métodos de distribuição de genes em concentrações de ADN 100 a 1000 vezes mais baixas do que os outros métodos. Experiências semelhantes demonstraram que as vias intradérmicas e intravenosas resultam em imunização em murganhos e coelhos (Raz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 (1994), 9519-9523). Acentuando a simplicidade da abordagem, Raz e colegas indicaram que existe o potencial de contornar o equipamento caro e potencialmente complicado necessário para o bombardeamento de tecidos e para a imunização intradérmica, revestindo uma ponta plástica da PPD da tuberculina com ADN e escarifiçando a pele para obter um resultado semelhante ao bombardeamento biolistico. Foi tentada a imunização com ADN, em várias espécies de mamíferos, incluindo bovinos, porcos e primatas não humanos, predominantemente, pela via intramuscular, com êxito variável. 6

Em Erth et al., Virai Immunology, vol. 9, 1996, páginas 1 a 9, pode ser encontrada uma perspectiva geral da imunização genética. A natureza da resposta imunitária aos antigénios presentes após a injecção intramuscular de construções de expressão de ADN, foi descrita como envolvendo tanto os ramos humorais como celulares do sistema imunitário. Quando são injectadas construções de ADN repórter, estas parecem estar contidas dentro de miofibras maduras. Isto é suportado por indícios de que a regeneração muscular parece aumentar a eficiência da expressão plasmidica. A apresentação do antigénio pode ocorrer, por apresentação do MHC da classe I pelas células musculares, por incorporação do antigénio, a partir dos miócitos, pelas células apresentadoras de antigénio derivadas da medula óssea (APC) ou por transfecção directa de ADN pelas APC que estão a migrar através do músculo (revisto em Pardoll e Beckerleg, 1995, loc. cit.; Whalen et al., 1995, loc. cít.). Parece ser improvável que a apresentação de antigénios simples pelos miócitos seja completamente responsável por este fenómeno, por duas razões. A primeira consiste nos indicios crescentes de que a apresentação do antigénio na ausência de sinais co-estimuladores, tais como, B7 e B7-2, resulte na tolerância a antigénios (Chen e Nabavi, Immunity 1 (1994), 147-154). Em segundo lugar, o músculo tem sido descrito como tendo niveis de expressão extremamente baixos do MHC da classe I (Karpati et al., Ann. Neurol. 23 (1988), 64-72). Por isso, parece ser provável que a apresentação de antigénio é realizada por APC profissionais que adquiriram antigénio, quer por limpeza deste, quer através de aquisição directa e expressão do gene transferido (Pardoll e Beckerleg, 1995, loc. cit.; Whalen et al., 1995, loc. cit.). Uma experiência realizada com bombardeamento biolistico de 7 partículas no murganho parece favorecer a última abordagem. Os murganhos foram bombardeados na pínula e a orelha foi cirurgicamente removida, cinco minutos após o bombardeamento. Estes murganhos conservaram a capacidade de formar uma resposta imunitária e essa resposta não se diferenciou, qualitativamente, da induzida pelo bombardeamento apenas. É evidente que uma população de células altamente móveis deve ser responsável por iniciar e manter a resposta imunitária nestes murganhos. Foi proposto que esta célula fosse uma célula dendrítica (Fynan et al., 1995, loc. cit.). Significativamente, o carácter da resposta imunitária induzida pelo bombardeamento de partículas diferencia-se ligeiramente da resposta resultante da injecção intramuscular, com predominância da IgGl nas injecções intramusculares, enquanto a IgG2 predomina nas injecções intradérmicas. A razão principal para esta diferença pode residir nos miócitos, que na imunização intramuscular, continuam a expressar o antigénio durante períodos superiores a um mês (Pardoll e Beckerleg, 1995, loc. cit.). Esta expressão contínua resulta no que foi designado como indução imunitária (Whalen et al., 1995, loc. cit.). 0 resultado prático deste fenómeno consiste na expressão muscular actuar como um reforço contínuo. Frequentemente, os títulos de uma única injecção podem aumentar durante um período de 4 a 8 ou mesmo mais semanas. Foram, também, observadas respostas de intensificação clássicas com injecções de ADN administradas 6 meses após a injecção primária. Curiosamente, as injecções de intensificação de ADN, administradas durante o período de aumento dos títulos de anticorpo, podem não ter qualquer efeito ou podem mesmo reduzir a resposta ao antigénio (Davis et al., "Introduction of systemic and mucosal immunity to HBV with plasmid DNA", International Meeting on Nucleic Acid Vaccines, 5-7 de Fevereiro de 1996, Bethesda, Maryland, EUA). A capacidade de produção de uma resposta imunitária mensurável não é, a priori, suficiente para a vacinação. Pelo contrário, a resposta imunitária deve conter os elementos adequados para proteger o hospedeiro da infecção, invasão e doença. Por isso, a protecção contra a infecção em estudos de desafio permanece única manifestação significativamente convincente da eficácia da vacina. As vacinas baseadas em ADN foram capazes de proteger galinhas contra desafios com virus de influenza letais (Robinson et al., Vaccine 9 (1993), 957-960) e murganhos contra infecção com Mycoplasma pulmonis (Lai et al., DNA and Cell Biology 14 (7) (1995), 643-651). Adicionalmente, os murganhos podem ser protegidos contra o estabelecimento de infecções persistentes com o virus da coriomeningite linfocitária pela imunização com ADN (Martinetes et al., J. of Virology 69 (4) (1995), 2574-2582). A técnica anterior, no que respeita à vacinação com ácidos nucleicos, referente à presente invenção, está resumida nos artigos seguintes: Donnely et al., 1994, loc. cit., Fynan et al., 1995, loc. cit., Whalen et al., 1995, loc. cit. no que respeita à vacinação com ácidos nucleicos e Turiso et al., 1992, loc. cit. e Casal et al., 1995, loc. cit., no que respeita à vacinação parvoviral. A técnica anterior referida acima, apenas testou a resposta imunitária de murganhos à vacinação com ácidos nucleicos. Como é bem conhecido na técnica, os resultados experimentais obtidos com murganhos não podem ser transferidos para animais como gatos, cães e martas devido às diferenças taxonómicas entre estes animais. Uma vez que, por outro lado, a técnica anterior não pode proporcionar quaisquer vacinas adequadas contra 9 infecções parvovirais de canídeos, felídeos e mustelídeos, o problema técnico subjacente à presente invenção consistiu em proporcionar essa vacina. A referida vacina deve proteger, eficazmente, em particular, cães, gatos e martas do efeito potencialmente ameaçador para a vida das infecções com parvovírus. A solução para o problema técnico acima é alcançada, proporcionando as formas de realização caracterizadas nas reivindicações.

Consequentemente, a presente invenção refere-se a uma vacina anti-parvovírus, como especificado nas reivindicações em anexo. A presente descrição descreve, também, uma vacina anti-parvovírus compreendendo moléculas de ácido nucleico codificando, pelo menos, um epitopo específico para parvovírus e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Surpreendentemente, de acordo com a invenção foi agora verificado que a imunização com ADN "nú" que codifica, pelo menos, um epitopo específico para parvovírus, produz uma resposta imunitária que protege o animal vacinado da doença induzida por parvovírus após infecção parvoviral subsequente.

Numa forma de realização preferida da vacina anti-parvovírus da invenção, pelo menos, um dos referidos epitopos específicos para parvovírus é um epitopo de células T. 0 especialista na técnica, quando concebe uma vacina protectora na perspectiva dos ensinamentos da presente invenção, é capaz de conceber uma vacina compreendendo uma sequência de 10 ácido nucleico codificando, apenas, um epitopo de célula T, para ser utilizado na vacina da invenção.

De um modo semelhante o especialista na técnica é capaz de conceber uma vacina compreendendo apenas ADN codificando um epitopo de célula B, para utilização numa vacina de ácido nucleico, de acordo com a presente invenção. Consequentemente, numa forma de realização preferida adicional, a vacina anti-parvovirus compreende, pelo menos, um epitopo de célula B. Alternativamente, podem ser compreendidos na referida vacina, os ácidos nucleicos codificando o referido, pelo menos, um epitopo de célula B, juntamente com ácidos nucleicos codificando, pelo menos, um epitopo de célula T. Os epitopos de célula T e B podem ser codificados pelas mesmas ou por diferentes moléculas de ADN.

Numa forma de realização preferida adicional da vacina anti-parvovirus de acordo com a invenção, as referidas moléculas de ácido nucleico são moléculas de ADN ou moléculas de ARN. 0 termo "moléculas de ADN" é aqui utilizado no seu sentido mais amplo e inclui, e. g. , moléculas de ADNc, ADN genómico, moléculas de ADN sintético e semi-sintético. Do mesmo modo, o termo "moléculas de ARN" é aqui utilizado no seu sentido mais amplo possivel.

Numa forma de realização preferida adicional da vacina anti-parvovirus, de acordo com a invenção, as referidas moléculas de ácido nucleico codificam as proteínas VP1 e/ou VP2 da nucleocápsula parvoviral. 0 genoma parvoviral tem, aproximadamente, 5000 pares de bases de comprimento e contém, aproximadamente, quatro grelhas de leitura aberta. Duas destas grelhas de leitura aberta 11 codificam as principais proteínas da cápsula do parvovírus, VP1 e VP2. A VP2 está contida dentro da VP1 e consiste na totalidade excepto uma porção pequena da extremidade 5' do gene da VP1 ou o terminal amino da proteína VP1. É conhecido que a sequência exclusiva da VP1 codifica um epitopo que é responsável por estimular uma resposta de células T. A sequência comum a VP1 e VP2 codifica, pelo menos, um epitopo que estimula uma resposta de anticorpo. As infecções naturais com parvovírus produzem respostas protectoras significativas no período de uma semana após a infecção. A expressão da totalidade do gene da VP1 ou do epitopo dentro da VP1 (e VP2) resulta, também, em imunidade protectora, tanto através dos ramos celular, como humoral do sistema imunitário.

Consequentemente, o especialista na técnica pode utilizar sequências de ácido nucleico compreendendo, quer a sequência codificando o epitopo VP1 como um representante de um epitopo parvoviral de células T, quer uma sequência de ácido nucleico codificando o epitopo VP2, como um representante de um epitopo parvoviral de células B ou uma combinação de ambos, para a preparação de uma vacina para a imunização de canídeos, felídeos ou mustelídeos.

Numa forma de realização, particularmente preferida, da vacina da invenção, as referidas moléculas de ácido nucleico compreendem a grelha de leitura aberta completa da VP1, i. e., a grelha de leitura que codifica a proteína VP1 da nucleocápsula. No caso do parvovírus canino, o comprimento completo da grelha de leitura aberta é de 2169 pares de bases. A referida orf é, de um modo preferido, expressa sob o controlo de um promotor exógeno adequado. 12 A descrição descreve, adicionalmente, que na vacina da invenção, o referido epitopo é derivado de um genoma de parvovirus, sendo o referido parvovirus capaz de infectar canideos, felideos ou mustelideos e, de um modo preferido, cães, gatos ou martas. Devido à grande homologia global do genoma dos parvovirus que infectam canideos, felideos ou mustelideos, pode ser utilizada uma vacina derivada de um ácido nucleico derivado de canideos, de felideos ou de mustelideos para imunizar, com sucesso, qualquer um dos outros grupos de animais referidos.

Numa forma de realização preferida adicional da vacina da presente invenção, são compreendidas as referidas moléculas de ácido nucleico codificando, pelo menos, um epitopo especifico para parvovirus, num vector de expressão, sendo o referido vector de expressão funcional em células de mamífero.

Encontram-se disponíveis para o especialista na técnica numerosos vectores de expressão, adequados para a realização da presente invenção. Consequentemente, os vectores referidos nos exemplos em anexo, como uma base inicial para o desenvolvimento da vacina da presente invenção, não se destinam, de qualquer modo, a limitar o âmbito da presente invenção. Encontram-se disponíveis vectores adequados adicionais, de sociedades comerciais, incluindo Invitrogen, Vical e Agracetus e podem ser facilmente produzidos pelo especialista na técnica.

Uma forma de realização preferida adicional da invenção refere-se a uma vacina anti-parvovírus, em que a referida vacina compreende ou o referido vector de expressão codifica, pelo menos, um antigénio adicional. 13 0 referido antigénio adicional pode desempenhar a função de intensificar a resposta imunitária contra o epitopo especifico para o parvovirus. No que a isto respeita, o referido antigénio adicional tem a função de uma proteína veículo. Alternativamente, o antigénio diferente pode induzir uma resposta imunitária a um agente patogénico diferente e, deste modo, desempenhar a função de criar uma vacina multivalente. É, também, possível que o antigénio adicional desempenhe ambas as funções.

Existem várias formas de conceber um vector que codifica, pelo menos, um epitopo específico para parvovirus, assim como, pelo menos, um antigénio adicional. Deste modo, por exemplo, o ácido nucleico codificando o antigénio adicional pode ser clonado na sequência de ácido nucleico codificando, pelo menos, um epitopo específico para parvovirus. Se não se encontrar qualquer local de restrição adequado localizado dentro da referida sequência de ácido nucleico codificando o referido epitopo específico para parvovirus, esse local de restrição pode ser produzido, utilizando métodos convencionais. Pelo contrário, a sequência de ácido nucleico codificando o referido, pelo menos, um epitopo específico para parvovirus, pode ser clonada numa sequência de ADN codificando o referido, pelo menos, um antigénio adicional. 0 polipéptido resultante pode ser uma proteína de fusão. Alternativamente, pelo menos, um epitopo específico para parvovirus e, pelo menos, um antigénio adicional podem ser expressos como entidades proteicas distintas.

Resulta evidente das afirmações realizadas no parágrafo anterior que uma forma de realização preferida particular da invenção se refere a uma vacina, em que o referido antigénio adicional é um imunogénio. 14

Um exemplo de um desses imunogénios que se revelou ser eficaz como uma molécula veiculo, é o antigénio da superfície da hepatite B e, de um modo preferido, o antigénio pré-proteina S2 da superfície da hepatite B humana.

Para além disso, a descrição descreve uma vacina compreendendo o vector recombinante pGT36VPl. Compreendendo o referido vector uma molécula de ácido nucleico que representa a grelha de leitura aberta completa da VPl. No Exemplo 2 é descrita a construção detalhada do referido vector.

Numa forma de realização adicional da vacina da presente invenção, particularmente preferida, a referida a molécula de ácido nucleico codificando, pelo menos, um epitopo de célula T é seleccionada a partir do grupo de epitopos codificados pela sequência de ácido nucleico degenerada CCNAARATHTTYATHAAYYTNGCNAARAARAARAARGCNGGC; em que N representa qualquer base, R representa purina, Y representa pirimidina e H representa A, C ou T; e é, de um modo preferido, o epitopo codificado pela sequência de ácido nucleico CCGAAAATATTCATCAACCTGGCTAAGAAGAAGAAAGCTGGC.

Numa forma de realização adicional da vacina da presente invenção, particularmente preferida, as referidas moléculas de ácido nucleico, codificando, pelo menos, um epitopo de célula B 15 são seleccionadas do grupo de epitopos codificados pela sequência de ácido nucleico degenerada TSNGAYGGNGCNGTNCARCCNGAYGGNGGNCARCCNGCNGTNMGN; em que N representa qualquer base, R representa purina, Y representa pirimidina, S representa G ou C e M representa C ou A; e é, de um modo preferido, o epitopo codificado pela sequência de ácido nucleico TCAGACGGTGCTGTACAGCCAGATGGAGGACAACCCGCGGTTCGC.

Numa forma de realização preferida adicional, a vacina da presente invenção compreende uma mistura de ácidos nucleicos codificando epitopos, tanto de célula B como de célula T.

Um exemplo desta forma de realização da invenção é o caso em que qualquer das anteriormente referidas moléculas de ácido nucleico, codificando o referido, pelo menos, um epitopo de células T e B, estão compreendidas em vectores de expressão diferentes.

Numa forma de realização preferida adicional da vacina anti-parvovirus da invenção, a referida vacina compreende, adicionalmente, um adjuvante.

Os adjuvantes para imunização são bem conhecidos na técnica e os adjuvantes adequados podem ser combinados com as sequências de ácido nucleico descritas nas formas de realização anteriormente referidas, para a formulação de uma vacina pelo especialista na técnica. 16

Uma forma de realização da presente invenção, particularmente preferida, refere-se a uma vacina, em que o referido adjuvante é uma molécula de ADN compreendendo motivos CpG não-metilados. É, há muito tempo, conhecido que o ADN contém informação genética que torna cada indivíduo único. Para além deste papel como uma planificação da célula, o Dr. Arthur Krieg descobriu, recentemente, uma porção curta de ADN, denominado motivo CpG, que causa uma activação imunitária potente (Nature (1995), Vol 374, 546). 0 ADN com motivos CpG ("ADN CpG") pode ser sintetizado fácil e economicamente e pode ser utilizado para activar selectivamente o sistema imunitário. As aplicações terapêuticas da activação imunitária mediada por ADN CpG incluem o aumento da eficácia das vacinas, o auxílio ao sistema imunitário na destruição do cancro e prevenção ou tratamento de infecção. 0 ADN é uma parte natural do organismo e pode ser muito mais seguro do que os fármacos presentemente utilizados para intensificar o sistema imunitário; ver pedido de patente U.S com os N°s de Série 08/386063; 08/461036; 08/462799.

Esta invenção combina, pela primeira vez, a utilização de ADN plasmídico como uma vacina, juntamente com CpG contendo oligonucleótidos, funcionando como adjuvante para a vacina à base de ADN.

As propriedades imunológicas superiores desta vacina são descritas nos exemplos em anexo. É, particularmente preferida, uma vacina anti-parvovírus, em que a referida molécula de ADN compreendendo motivos CpG não-metilados é 17 TCCATGACGTTCCTGATGCT.

Numa forma de realização adicional da vacina anti-parvovirus da invenção, particularmente preferida, a referida molécula de ADN que compreende motivos CpG não-metilados compreendem uma estrutura base modificada com fosforotioato. A modificação com fosforotioato é particularmente vantajosa uma vez que parece intensificar adicionalmente as capacidades de adjuvante dos motivos CpG não-metilados; ver, e. g. , Krieg et al., loc. cit.

Com a vacina de acordo com a presente invenção, é possível obter uma imunização eficaz, mesmo se a vacina for apenas aplicada uma vez.

Adicionalmente, a presente invenção refere-se à utilização de uma vacina anti-parvovírus da invenção, para a vacinação de canideos, felideos ou mustelídeos, um método para vacinar canídeos, felideos ou mustelídeos, pela administração de uma dose adequada da vacina da invenção a um animal com necessidade desta, assim como, à utilização dos ingredientes da vacina da invenção aqui referida acima, tais como, ácidos nucleicos especificados em várias formas de realização ou adjuvantes, tais como, os motivos CpG não-metilados ou qualquer sua combinação, para a preparação de uma vacina para imunização de canídeos, felideos ou mustelídeos contra a doença parvoviral.

De um modo preferido, os referidos canídeos, felideos ou mustelídeos são cães, gatos ou martas. 0 especialista na 18 um veterinário está perfeitamente de aplicação que devem ser familiarizado com as várias com o intervalo de tempo e de reforço. técnica, neste caso, consciente de qual a dose e a via aplicadas. Adicionalmente, este está aplicações de vacina, assim como, óptimo entre as vacinações primárias

Numa forma de realização particularmente preferida, a vacina de acordo com a invenção é utilizada num protocolo de vacinação, no qual a vacina é apenas aplicada uma vez e origina uma imunização suficiente ("imunização de dose única"). A vacina da invenção é, de um modo preferido, administrada por uma das vias seguintes: intramuscular por agulha e seringa, intramuscular por Biojector 2000®, intradérmica por agulha e seringa, intradérmica por bombardeamento de partículas, intradérmica por escarificação, intravenosa ou intraperitoneal.

Os exemplos ilustram a invenção.

EXEMPLO 1: SÍNTESE DE EPITOPOS ANTIGÉNICOS DO SUBGRUPO DO PARVOVÍRUS FELINO

Foram produzidos oligonucleótidos desoxirribonucleicos sintéticos com a sequência AATTCCCCGAAAATATTCATCAACCTGGCTAAGAAGAAGAAAGCTGGC e a cadeia complementar

TCGAGCCAGCTTTCTTCTTCTTAGCCAGGTTGATGAATATTTTCGGGG 19 os quais, quando emparelhados entre si, contêm projecções que se irão ligar a um local de restrição Eco RI e Xho I e codificam o epitopo de célula T da VP1, PKIFINLAKKKKAG, na grelha de leitura adequada. Estes oligonucleótidos foram ligados nos locais Eco RI e Xho I, na região pré-S2 do antigénio de Superfície da Hepatite B Humana, no plasmídeo pCMV-S2S (Michel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92 (1995), 5307-5311), eliminando, no processo, a maioria da região pré-S2. A construção resultante foi designada pCMVS-VPle. O transcrito de ARN produzido a partir do promotor CMV nesta construção contém uma grelha de leitura aberta com um codão de iniciação interno (AUG). Quando é utilizado o primeiro ATG, é produzido o epitopo VP1, parte da região pré-S2 e a totalidade da região S, sob a forma de uma única proteína. O AUG interno produz apenas a proteína S. De um modo semelhante, os oligonucleótidos desoxirribonucleicos com a sequência

AATTCAGACGGTGCTGTACAGCCAGATGGAGGACAACCCGCGGTTCGC e a cadeia complementar

TCGAGCGAACCGCGGGTTGTCCTCCATCTGGCTGTACAGCACCGTCTG os quais codificam o epitopo peptídico SDGAVQPDGGQPAVR da VP2, foram clonados no pCMV-S2S da mesma forma do que o epitopo VP1, o plasmídeo resultante foi denominado pCMVS-VP2e. Ambas as sequências de ADN codificando estes epitopos são sequências artificiais e não representam a sequência de ADN dos parvovírus de ocorrência natural. 20

EXEMPLO 2: CLONAGEM DO GENE VP1-VP2 DE PARVOVÍRUS CANINO E CONSTRUÇÃO DE PLASMÍDEOS EXPRESSANDO GENES DE PARVOVÍRUS A totalidade da região codificante da VP1 parvoviral canina (VP1 e VP2) foi clonada por amplificação de sobrenadantes de cultura de tecidos, contendo CPV do tipo 2, por reacção em cadeia da polimerase. Os iniciadores foram localizados imediatamente fora da grelha de leitura aberta da VP1, incluíram locais de restrição Not I (a jusante) e BamH I (a montante) e apresentavam as sequências seguintes: cgg gat ccG AGA CGA CTT GGA TTA AGG TA para o iniciador 5' ou a montante e gtg cgg ccg CTA GTT GAT ATG TAA TAA AC para o iniciador 3' ou a jusante.

0 produto de PCR foi sujeito a restrição, sequencialmente, com Not I e BamH I e foi ligado ao plasmídeo de expressão pGT36 bacteriano, digerido do mesmo modo (Conry et al., Câncer Gene Therapy 2 (1) (1995), 33-38, na orientação de sentido. A orientação e a sequência da VP1 (e da VP2) foram confirmadas por sequenciação de ADN da totalidade da inserção da VP1. Este ADN clonado será designado como pGT36VPl.

EXEMPLO 3: EXPRESSÃO DO GENE VP1-VP2 DE PARVOVÍRUS CLONADO EM CÉLULAS CULTIVADAS

Foi transfectado um fibroblasto murino (NIH 3T3) com o clone pGT36VPl. As células foram, então, examinadas para a presença de proteínas parvovirais caninas imunorreactivas, por 21 ensaio imunofluorescente, com um anti-soro canino contra o parvovirus canino. 0 padrão de coloração foi indistinguível das células infectadas com parvovirus canino, enquanto que os controlos negativos (pGT36, sem ADN) não apresentaram qualquer coloração, indicando que o clone pGT36VPl produziu um produto proteico reconhecido por anticorpos anti-parvovirais. EXEMPLO 4: IMUNIZAÇÃO DE CÃES COM VACINAS DE ÁCIDO NUCLEICO DE PARVOVIRUS (EPITOPO)

Três cachorros com 11 semanas de idade foram imunizados com 150 pg de pCMVS-VPle e 100 pg do oligonucleótido fosforotioato sintético TCCATGACGTTCCTGATGCT (ISO) no músculo quadricipete direito, três cachorros com 11 semanas de idade foram imunizados com 150 pg de pCMVS-VP2e e 100 pg de ISO e três cachorros com 11 semanas de idade foram imunizados com 150 pg de pCMVS-VPle, 150 pg pCMVS-VP2e e 100 pg de ISO. Os cachorros foram reforçados após 3 semanas com doses idênticas e monitorizados para o desenvolvimento de titulos de anticorpo contra a proteina veiculo, antigénio superficial da Hepatite B e epitopos parvovirais caninos. Foi verificada uma resposta de anticorpo significativa, tanto para a hepatite como para o parvovirus canino nos animais nos grupos do pCMVS-VPle mais pCMVS-VP2e e do pCMVS-VP2e. Não era esperada qualquer resposta de anticorpo ao parvovirus canino no pCMVS-VPle, uma vez que este representa um epitopo de célula T. Esta expectativa foi confirmada experimentalmente. A resposta foi mais significativa para pCMVS-VPle mais pCMVS-VP2e, indicando que a vacina multivalente foi mais eficaz. 22

EXEMPLO 5: IMUNIZAÇÃO DE ANIMAIS COM UM ÁCIDO NUCLEICO EXPRESSANDO GENES VP1 E VP2 DO PARVOVÍRUS (a) Um de três murganhos Balb-c imunizados com pGT36VPl apresentou uma resposta imunitária, em particular, de anticorpo, contra o parvovírus canino, uma semana após o bombardeamento de partículas com 1 pg do plasmídeo. (b) Foram imunizados três cães beagle juvenis (com uma idade aproximada de 6 meses) , sem quaisquer títulos de anticorpo anti-parvovírus canino, com 150 pg de pGT36VPl e 100 pg de ISO, no músculo quadricípete direito.

Desenvolveram respostas significativas de anticorpo anti-parvovírus canino, que se iniciaram no período de 2 semanas após a imunização, num animal e continuaram a aumentar durante, pelo menos, 3 semanas na totalidade dos três animais. Um beagle de controlo, injectado com o ADN vector e ISO não apresentou qualquer aumento no título de anticorpo. (c) Foram imunizados seis cães juvenis sem quaisquer títulos de anticorpo anti-parvovírus canino, com 400 pg de pGT36VPl no músculo quadricípete direito. Três destes cães receberam 400 pg de ADN de E. coli adicional, como um adjuvante imunoestimulante, que foi co-administrado com pGT36VPl. A totalidade dos seis cães apresentou resposta de anticorpo anti-parvovírus no período de duas semanas após a imunização, os quais atingiram títulos significativamente acima do reconhecido como protector, ao fim de 3 a 5 semanas. Os três cães que receberam ADN imunoestimulante atingiram títulos de anticorpo mais elevados, mais 23 rapidamente do que os outros cães, indicando um efeito estimulante imunitário positivo do CpG.

EXEMPLO 6: PROTECÇÃO DE CÃES IMUNIZADOS COM UMA VACINA DE ÁCIDO NUCLEICO EXPRESSANDO GENES VP1 E VP2 DE PARVOVÍRUS, DA INFECÇÃO DE DESAFIO COM PARVOVÍRUS CANINO a) Os três cães beagle imunizados no exemplo 5, foram desafiados com uma dose trivalente padrão de parvovírus canino, utilizado em ensaios de vacina parvoviral, através da via intranasal. Nenhum dos cães apresentou qualquer sinal de doença relacionada com parvovírus, indicando protecção contra a doença. Dois cães apresentaram um ligeiro aumento das respostas de anticorpo anti-parvovírus canino, consistente com a tendência pré-desafio, sem libertação fecal de parvovírus, indicando protecção completa contra a infecção. 0 beagle de controlo apresentou sintomas de doença parvoviral após o desafio, acompanhados por um aumento dramático da resposta de anticorpo anti-parvovirus canino. (b) Foram imunizados quatro cães juvenis, sem quaisquer títulos de anticorpo anti-parvovírus canino, intramuscularmente, com doses de pGT36VPl, incluindo 200, 400, 600 e 800 pg de plasmídeo. Todos os cães desenvolveram anticorpos anti-parvovírus canino, no período de uma semana, que atingiram um máximo para títulos protectores, no período de 2 semanas. Um cão de controlo negativo injectado com soro fisiológico não apresentou qualquer anticorpo anti-parvovírus canino. O cão que recebeu 600 pg de ADN plasmídico manteve um título de anticorpo durante 24 mais tempo do que os outros cães. Todos os cães foram re-injectados com a mesma preparação e dose, 16 semanas após a injecção inicial. Todos os cães, excepto o controlo negativo e os da dose de 200 pg, apresentaram uma resposta de anticorpo anamnéstica. Todos os cães excepto o controlo negativo, mas incluindo os da dose de 200 pg apresentaram titulos de anticorpo neutralizante no soro, após a re-injecção considerada protectora. Todos os cães foram desafiados às 24 semanas após a injecção inicial com o virus de rua virulento, contendo três isolados de virus, conhecidos por causarem doença em cães não imunizados. Todos os cães imunizados com a vacina de ácido nucleico pGT36VPl estavam protegidos contra a infecção e doença. O cão de controlo negativo apresentava doença clinica típica do parvovírus canino e libertou vírus nas fezes. Esta experiência demonstra que as doses do pGT36VPl, variando de 200 a 800 pg de plasmídeo, fornecidas como uma injecção primária e reforço estimularam a produção de títulos de anticorpo e protegeram contra o desafio virulento. (c) Foram injectados três cães juvenis, sem quaisquer títulos de anticorpo anti-parvovírus canino, com 150 pg de pGT36VPl mais 150 pg de ADN oligonucleotídico, sintetizado de forma a conter CpG óptimos. Todos os cães desenvolveram anticorpo anti-parvovírus canino e foram protegidos contra o desafio com o vírus virulento. Esta experiência demonstra que a imunização com uma dose mais baixa de pGT36VPl irá conferir imunidade protectora, quando a imunização é amplificada com oligonucleótidos imuno-estimulantes. (d) Foram injectados seis cães juvenis, sem quaisquer títulos de anticorpo anti-parvovírus canino, com uma dose 25 única de 200 ou 800 pg de pGT36VPl. Todos os cães desenvolveram, inicialmente, titulos de anticorpo anti-parvovirus canino, os quais decaíram para níveis não detectáveis às 12 semanas após a imunização. Sem administrar uma imunização de reforço, todos os cães foram desafiados com o vírus virulento e nenhum ficou infectado ou doente. Esta experiência demonstra que a imunidade protectora é alcançada após uma dose única de pGT36VPl e esta protecção é independente da presença de anticorpo anti-parvovirus canino mensurável. Este resultado pode ser interpretado como sendo resultante da imunidade celular conferida por célula T de memória imunológica de vida longa.

Estes estudos demonstram que as sequências de ADN seleccionadas do subgrupo do parvovírus felino, quando inseridas num plasmídeo de expressão de mamífero, podem transfectar células em cultura e em animais. Para além disso, foi demonstrado que os plasmídeos de expressão de ADN dos requerentes podem induzir uma resposta de anticorpo em animais, a qual pode levar à protecção contra o desafio virai virulento. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (B) NOME: Colpan, Metin (B) RUA: Uhland Str. 5 (C) CIDADE: Essen 26 (E) PAÍS: Alemanha (F) CÓDIGO POSTAL: 45219 (ii) TÍTULO DE INVENÇÃO: Vacinação com ácidos nucleicos contra infecções parvovirais (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 14 (iv) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: PC IBM compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA DE COMPUTADOR: Patent In Release #1,0, Versão #1,30 (EPO) (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICA: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 1: CCNAARATHT TYATHAAYYT NGCNAARAAR AARAARGCNG GC 42 27 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICA: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 2: GCGAAAATAT TCATCAACCT GGCTAAGAAG AAGAAAGCTG GC 42 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 45 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICA: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 3: TSNGAYGGNG CNGTNCARCC NGAYGGNGGN CARCCNGGNG TNMGN 45 28 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 45 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICA: SIM (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 4: TCAGACGGTG CTGTACAGCC AGATGGAGGA CAACCCGCGG TTCGC 45 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICA: SIM (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 5: TCCATGACGT TCCTGATGCT 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 29 (A) COMPRIMENTO: 48 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICA: SIM (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 6: AATTCCCCGA AAATATTCAT CAACCTGGCT AAGAAGAAGA AAGCTGGC 48 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 48 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICA: SIM (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 7: TCGAGCCAGC TTTCTTCTTC TTAGCCAGGT TGATGAATAT TTTCGGGG 48 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 30 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 8:

Pro Lys Ile Phe Ile Asn Leu Ala Lys Lys Lys Lys Ala Gly 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 48 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICA: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 9: AATTCAGACG GTGCTGTACA GCCAGATGGA GGACAACCCG CGGTTCGC 48 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 48 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICA: SIM 31 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 10: TCGAGCGAAC CGCGGGTTGT CCTCCATCTG GCTGTACAGC ACCGTCTG 48 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 11:

Ser Asp Gly Ala Vai Gin Pro Asp Gly Gly Gin Pro Ala Vai Arg 1 5 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICA: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 12: CGGGATCCGA GACGACTTGG ATTAAGGTA 29 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 13: 32 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICA: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 13 GTGCGGCCGC TAGTTGATAT GTAATAAAC 29 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICA: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 14 TCCATGACGT TCCTGATGCT 20

Lisboa, 31 de Janeiro de 2007 33

Claims (21)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Vacina anti-parvovírus que protege o animal vacinado contra a doença induzida por parvovírus após infecção parvoviral subsequente, compreendendo moléculas de ácido nucleico compreendidas num plasmideo, sendo o referido plasmideo funcional num mamífero, codificando, pelo menos, um epitopo VP1 e/ou VP2 específico para parvovírus e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o referido parvovírus é capaz de infectar canídeos, felídeos, mustelídeos, cães, gatos ou martas.
2. 2. Vacina anti-parvovírus de acordo com a reivindicação 1, em que, pelo menos, um dos referidos epitopos específicos para parvovírus é um epitopo de célula T.
3. 3. Vacina anti-parvovírus de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que, pelo menos, um dos referidos epitopos, específicos para parvovírus, é um epitopo de célula B.
4. 4. Vacina anti-parvovírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que as referidas moléculas de ácido nucleico são moléculas de ADN ou moléculas de ARN.
5. 5. Vacina anti-parvovírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que as referidas moléculas de ácido nucleico codificam as proteínas VP1 e/ou VP2 da nucleocápsula parvoviral. 1
6. 6. Vacina anti-parvovírus de acordo com a reivindicação 5, em que as referidas moléculas de ácido nucleico compreendem a totalidade da grelha de leitura aberta da VP1.
7. 7. Vacina anti-parvovirus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a referida vacina compreende ou o referido plasmideo codifica, pelo menos, um antigénio adicional.
8. 8. Vacina anti-parvovirus de acordo com a reivindicação 7, em que o referido antigénio adicional é um imunogénio.
9. 9. Vacina anti-parvovirus de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8, em que a referida molécula de ácido nucleico codificando, pelo menos, um epitopo de célula T é seleccionada do grupo de epitopos codificados pela sequência de ácido nucleico degenerada CCNAARATΗT T YAT ΗAAYY TNGCNAARAARAARAARGCNGGC; em que N representa qualquer base, R representa purina, Y representa pirimidina e H representa A, C ou T.
10. 10. Vacina anti-parvovirus de acordo com a reivindicação 9, em que o epitopo codificado pela sequência de ácido nucleico é C C GAAAATAT T CAT CAACC T GGC TAAGAAGAAGAAAGC T GGC.
11. 11. Vacina anti-parvovirus de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 10, em que as referidas moléculas de ácido nucleico codificando , pelo menos, um epitopo de 2 célula B são seleccionadas do grupo de epitopos codificados pela sequência de ácido nucleico degenerada T SNGAYGGNGCNGTNCARCCNGAYGGNGGNCARCCNGCNGTNMGN; em que N representa qualquer base, R representa purina, Y representa pirimidina, S representa G ou C e M representa C ou A.
12. 12. Vacina anti-parvovirus de acordo com a reivindicação 11, em que o epitopo codificado pela sequência de ácido nucleico é TCAGACGGTGCTGTACAGCCAGATGGAGGACAACCCGCGGTTCGC.
13. 13. Vacina anti-parvovirus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 compreendendo uma mistura de ácidos nucleicos codificando epitopos, tanto de células T, como de células B.
14. 14. Vacina anti-parvovirus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 compreendendo, adicionalmente, um adjuvante.
15. 15. Vacina anti-parvovirus de acordo com a reivindicação 14, em que o referido adjuvante é uma molécula de ADN compreendendo motivos CpG não-metilados.
16. 16. Vacina anti-parvovirus de acordo com a reivindicação 15, em que a referida molécula de ADN compreendendo motivos CpG não-metilados é TCCATGACGTTCCTGATGCT. 3
17. 17. Vacina anti-parvovírus de acordo com a reivindicação 15 ou 16, em que a referida molécula de ADN compreende uma estrutura base modificada com fosforotioato.
18. 18. Utilização das moléculas de ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, para a preparação de uma vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, para a vacinação de canideos, felideos ou mustelideos.
19. 19. Utilização de acordo com a reivindicação 18, em que os referidos canideos, felideos ou mustelideos são cães, gatos ou martas.
20. 20. Utilização de acordo com a reivindicação 18 ou 19, em que a referida vacina é administrada através de uma das vias seguintes: intramuscular por agulha e seringa, intramuscular por Biojector 2000®, intradérmica por agulha e seringa, intradérmica por bombardeamento de partículas, intradérmica por escarificação, intravenosa ou intraperitoneal.
21. 21. Utilização de acordo com a reivindicação 18 ou 19, em que a imunização é alcançada por uma aplicação única da vacina. Lisboa, 31 de Janeiro de 2007 4