PT912751E - Processo para a producao de derivados de d-prolina por meio de microrganismos - Google Patents

Description

"Processo para a produção de derivados de D-proiina por meio de microrganismos" O presente invento refere-se a uma nova enzima com actividade de amidino-hidrolase, a novos microrganismos contendo estas amidino-hidrolases, assim como a um novo processo para a produção de derivados de D-prolina utilizando os microrganismos ou as amidino-hidrolases.

Os derivados de D-prolina são produtos intermediários importantes para o fabrico de produtos farmacêuticos (J. Org. Chem., 1994, 59, 7496 - 7498). A produção de aminoácidos e derivados de aminoácidos por meio de microrganismos ou enzimas é já conhecida. Assim, por exemplo, em US-A-3 806 420 descreve-se o fabrico de sarcosina através da separação de ureia, de creatinina, utilizando uma amidino-hidrolase, por exemplo proveniente de Pseudomonas. Em JP-A-6062880 descreve-se a produção de 4-hidroxi-L-prolina a partir de 4-hidroxi-L-ornitina por meio de microrganismos, por exemplo dos géneros Pseudomonas, Agrobacterium ou Arthrobacter por meio de ciclização enzimática.

Também se conhecem vários processos para a produção de D-prolina. Em JP-A 92183399 descreve-se um processo para a produção de D-prolina por meio de microrganismos do género Candida ou Trichospora, que parte de (DL)-prolina. Este processo tem o inconveniente de a transformação levar muito tempo e de se obter a D-prolina com um rendimento reduzido. Em JP-A 07127354 descreve-se um processo para a produção de D-prolina por meio de microrganismos da espécie Proteus mitajiri, que parte de ornitina. Um inconveniente deste processo é, por um lado, o facto do aducto ornitina ser muito caro e, por outro lado, de se obter a D-prolina com mau rendimento. Além disso, em JP-A 07289275 descreve-se um processo para a produção de D-prolina que parte de L-prolina. Neste processo, a L-prolina é racemizada por meio de microrganismos do género Escheríchia que possuam actividade de racemase, em (DL)-prolina, a qual é a seguir cultivada com microrganismos degradadores de L-prolina para se obter D-prolina. Um inconveniente deste

2 85 288 ΕΡ Ο 912 751/ΡΤ processo é a necessidade de continuar a purificar a D-prolina obtida neste processo e de isto implicar elevadas perdas de rendimento. O problema a resolver pelo presente invento é o de disponibilizar uma amidino-hidrolase, ou então microrganismos contendo esta enzima, que possam ser utilizados num processo não dispendioso para a produção de derivados de D-prolina em que a D-prolina seja obtida com um bom rendimento. Este problema é resolvido com os microrganismos de acordo com a reivindicação 1, a amidino-hidrolase de acordo com a reivindicação 4, assim como com o processo de acordo com a reivindicação 5.

Os microrganismos de acordo com o invento podem ser isolados de amostras de solo, de lodo ou águas residuais, por meio de técnicas microbiológicas usuais. De acordo com o invento, o isolamento dos microrganismos é realizado cultivando estes mesmos num meio contendo um derivado de ácido guanidinovalérico de fórmula geral

V em que R1 significa hidrogénio ou hidroxi e R2 um átomo de halogéneo ou -NH2, como única fonte de azoto, com uma fonte de carbono apropriada. Os derivados de ácido guanidinovalérico de fórmula geral V apropriados são, p.ex., ácido L-a-cloro-ô-guanidinovalérico, ácido D-a-cloro-ô-guanidinovalérico, ácido (DL)-a-cloro-ô-guanidinovalérico, ácido L-a-bromo-ô-guanidinovalérico, ácido D-a-bromo-ô-guanidinovalérico, ácido (DL)-a-bromo-ô-guanidinovalérico, ácido L-a-cloro-y-hidroxi-ô-guanidinovalérico, ácido D-a-bromo-y-hidroxi-ô- guanidinovalérico, L-, D- ou (DL)-arginina.

Da cultura obtida são então seleccionados, convenientemente, os microrganismos que utilizam o ácido L-a-cloro-ô-guanidinovalérico (R1 = H, R2= Cl) ou L-arginina (R1 = H, R2 = NH2) como única fonte de azoto. 3 85 288 ΕΡ Ο 912 751/ΡΤ A fonte de carbono apropriada que os microrganismos utilizam como substrato de crescimento pode ser, por exemplo, açúcar, aldóis ou ácidos dicarboxílicos.

Como açúcares, podem ser utilizadas hexoses como, por exemplo, glucose. Como aldoíl, pode ser utilizado, por exemplo, glicerol. Como ácido dicarboxílico pode ser utilizado, p.ex., succinato. Além disso pode utilizar-se, como fonte de carbono, arginina, agmatina (4-aminobutilguanina), glutamina ou ácido glutâmico.

Como meio de selecção e cultura podem ser utilizados os que são utilizados habitualmente pelos peritos como, por exemplo, o que está descrito na tabela 1. De preferência, utiliza-se o que está descrito na tabela 1.

Durante a cultura e a selecção, são induzidas convenientemente, as enzimas activas dos microrganismos. Como agente indutor das enzimas pode utilizar-se, por exemplo, o ácido a-cloro-6-guanidinovalérico, L-arginina, guanidina, cloridrato de guanidina ou acetato de guanidina. No entanto, a indução das enzimas activas pode ser realizada também num meio completo como, p.ex., com "Nutrient Yeast Broth" (NYB), no caso de este conter um dos agentes indutores.

Usualmente, a cultura e a selecção são realizadas a uma temperatura de 20 a 40°C, de preferência de 25 a 40°C, e a um valor de pH entre pH 5 e pH 9,5, de preferência entre pH 8 e pH 9,5.

Como microrganismos são isolados, de preferência, microrganismos que utilizam ácido cc-cloro-ô-guanidinovalérico, do género Pseudomonas, Arthrobacter, Agrobacterium ou Klebsiella, especialmente microrganismos das espécies Agrobacterium radiobacter, Pseudomonas cepacia, Klebsiella pneumoniae DSM 10593, Pseudomonas aeruginosa DSM 10581 ou Arthrobacter sp. DSM 10582, assim como suas variantes e seus mutantes funcionalmente equivalentes. As estirpes Klebsiella pneumoniae, Arthrobacter sp. e Pseudomonas aeruginosa foram depositadas, de acordo com o tratado de Budapeste, a 11-03-1996 na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschroderweg Ib, D-38124 Braunschweig. 85 288 ΕΡ Ο 912 751/ΡΤ 4

Por "variantes e mutantes funcionalmente equivalentes" entendam-se microrganismos que possuam essencialmente as mesmas características e funções que os microrganismos originais. As variantes e os mutantes deste género podem-se formar casualmente, p.ex., por irradiação com raios ultravioleta ou pela acção de produtos químicos mutagénicos.

Descrição taxonómica de Klebsiella pneumoniae (DSM 10593) Características da estirpe

Forma celular bastonete ADH Largura em pm 1,0 - 1,2 LDC Comprimento em μιτι 1,2 - 2,0 ODC Mobilidade - VP + Reacção Gram - Indol Lise provocada por KOH a 3% + Formação de H2S Aminopeptidase (Cerny) + Citrato de Simmons + Esporos - Urease + Oxidase - Vermelho de metilo Catalase + Hidrólise de Crescimento anaeróbio + gelatina Gás a partir de glucose 4- ADN Ácido a partir de (ASS) Tween 80 glucose + Frutose + Xilose + Abreviaturas: Eritritol - ASS: ácido acetilsalicílico Adonitol - ONPG: o-nitro-fenilgalactosidase D-manose + ADH: alcooldesidrogenase L-ramnose + LDC: lactatodescarboxilase Inositol + ODC: ornitinadescarboxilase Sorbitol + VP: Voges Proskauer a-metil-D-glucósido + Celobiose + Maltose + Lactose + D-arabitol + ONPG +

85 288 ΕΡ Ο 912 751 /ΡΤ 5

Descrição taxonómica de Arthrobacter sp. (DSM 10582)

Caracterização Bastonetes corinomorfos gram-positivos, em culturas mais velhas cocóides; estritamente aeróbios; não há formação de ácido ou gases a partir de glucose

Mobilidade

Esporos

Catalase + Ácido /neso-diaminopimélico na parede celular: não Tipo de peptidoglicano: nb A amidino-hidrolase de acordo com o invento pode ser obtida dos microrganismos descritos anteriormente e consegue separar ureia de derivados de ácido guanidinovalérico, seleccionados de compostos de fórmula geral V.

Convenientemente, a amidino-hidrolase é obtida dos microrganismos do género Klebsiella, Pseudomonas, Agrobacterium ou Arthrobacter, especialmente dos microrganismos das espécies Agrobacterium radiobacter, Pseudomonas cepacia, Klebsiella pneumoniae DSM 10593, Arthrobacter sp. DSM 10582 ou Pseudomonas aeruginosa DSM 10581.

Para a obtenção da amidino-hidrolase de acordo com o invento, estes microrganismos são cultivados da maneira habitual num meio de cultura aquoso contendo uma fonte de carbono, de azoto, sais minerais e uma fonte de vitaminas. Os microrganismos são cultivados, convenientemente, a uma temperatura de 20 a 40°C e a um valor de pH de 5 a 8. As amidino-hidrolases podem então ser isoladas, após a lise das células dos microrganismos, p.ex., através dos métodos de ultra-sons, french-press ou de lisozima, segundo métodos de purificação de enzimas em princípio já conhecidos.

Convenientemente, a amidino-hidrolase possui as propriedades seguintes: a) um pH óptimo de pH 8,5 ± 1, b) uma temperatura óptima de aprox. 37°C a um pH entre 7 e 8, c) um valor de KM para o substrato ácido L-a-cloro-ô-guanidinovalérico, de 85,2 mM ± 5 (tampão de fosfato 100 mM; 37°C),

85 288 ΕΡ Ο 912 751/ΡΤ 6 e, além disso, a propriedade de d) ser induzida através de ácido L-a-cloro-ô-guanidinovalérico, L-arginina, cloridrato de guanidina, guanidina e/ou acetato de guanidina, e) ser inibida por ácido L-a-cloro-ô-guanidinovalérico e f) hidrolisar os substratos arginina, ácido L-a-cloro-ô-guanidinovalérico e ácido L-a-bromo-ô-guanidinovalérico no respectivo derivado de ácido L-aminovalérico.

Para a produção de acordo com o invento de derivados de D-prolina, transforma-se convenientemente, numa primeira etapa do processo, um derivado de L-arginina ou um seu sal, de fórmula geral H.

II em que R1 tem o significado mencionado, de modo em princípio habitual, num derivado de ácido L-guanidinovalérico ou um seu sal, de fórmula geral

H,N

III em que R1 tem o significado mencionado e R3 significa um átomo de halogéneo. Neste processo é formado, como produto intermediário, o respectivo sal de diazónio.

Como derivado de L-arginina pode ser utilizada L-arginina ou L-y-hidroxi-arginina.

Como sais do derivado de L-arginina e do derivado de ácido L-guanidinovalérico podem ser utilizados os seus cloridratos ou bromidratos.

85 288 ΕΡ Ο 912 751/ΡΤ 7 A diazotação na primeira etapa é realizada, usualmente, com uma solução de nitrito ou com ácido nítrico. Como solução de nitrito pode utilizar-se uma solução de nitrito de sódio ou de potássio. De preferência utiliza-se ácido nítrico, especialmente ácido nítrico de 50 a 65%. A transformação na primeira etapa é realizada, usualmente, na presença de um halogeneto de hidrogénio. Como halogeneto de hidrogénio podem ser utilizados ácido clorídrico ou ácido bromídrico, de preferência utiliza-se o ácido clorídrico. É conveniente que a transformação na primeira etapa seja realizada a uma temperatura de -10°C a 100°C, de preferência de 0°C a 80°C.

Na segunda etapa do processo de acordo com o invento, o derivado de ácido L-guanidinovalérico (fórmula III) é hidrolisado por meio de uma amidino-hidrolase de acordo com a reivindicação 4, por meio de microrganismos de acordo com a reivindicação 1 e/ou extractos enzimáticos dos mesmos, num derivado de ácido L-aminovalérico de fórmula geral

R' RJ H,N L

OH

IV em que R1 e R3têm os significados mencionados.

Em princípio, a hidrólise microbiológica é possível não apenas com as amino-hidrolases já descritas como também com os microrganismos e extractos enzimáticos já descritos. São particularmente apropriados para a hidrólise os microrganismos descritos anteriormente, do género Pseudomonas, Arthrobacter, Agrobacterium ou Klebsiella, especialmente os microrganismos das espécies Klebsiella pneumoniae DSM 10593, Pseudomonas aeruginosa DSM 10581, Arthrobacter sp. DSM 10582, Agrobacterium radiobacter ou Pseudomonas cepacia, assim como suas variantes e seus mutantes funcionalmente equivalentes. 85 288 ΕΡ Ο 912 751 /ΡΤ 8

A hidrólise microbiológica pode ser realizada após uma cultura dos microrganismos com células em fase estacionária (células que não se encontram em crescimento, já não necessitando de fonte de carbono nem de energia) ou com células em crescimento. De preferência, a hidrólise é realizada com células em fase estacionária.

Para a hidrólise microbiológica podem ser aplicados meios usualmente utilizados pelos peritos como, por exemplo, tampões de fosfato ou Hepes de baixa molaridade, meios completos como, p.ex., "Nutrient Yeast Broth" (NYB) ou o meio descrito na tabela 3. De preferência, a hidrólise é realizada num tampão de fosfato ou Hepes de baixa molaridade.

Convenientemente, a hidrólise é realizada sob adição, de uma só vez ou contínua, do derivado de ácido L-guanidinovalérico, de’ modo a que a * concentração não exceda os 20% em peso, de preferência 1 % em peso.

Na terceira etapa, o derivado de ácido L-aminovalérico (fórmula geral IV) é ciclizado no produto final de fórmula geral R:

0 em que R1 tem o significado mencionado.

Convenientemente, o intervalo de pH do meio é escolhido de modo a realizar a segunda e a terceira etapa sem isolamento do derivado de ácido L-aminovalérico (fórmula IV). Nesta concretização preferida, o pH do meio é ajustado a um valor de pH 5 a pH 13, de preferência de pH 7 a pH 9,5. Neste intervalo a ciclização do derivado de ácido L-aminovalérico (fórmula IV) na D-prolina ocorre espontaneamente. Convenientemente, a ciclização e a hidrólise são realizadas a uma temperatura de 10 a 60°C, de preferência de 30 a 40°C.

Em princípio, a produção dos derivados de D-prolina de fórmula I pode ser realizada também hidrolisando o derivado de L-arginina de fórmula II ou seus

85 288 ΕΡ Ο 912 751 /ΡΤ 9

sais, directamente com os microrganismos, extractos enzimáticos ou amidino-hidroiases já descritos anteriormente, em compostos de fórmula VI

H„N

V! em que R1 tem o significado mencionado e R4 significa -NH2, transformando seguidamente estes compostos, como supra descrito, e passando pela etapa intermediária de um sal de diazónio, num derivado de ácido L-aminovalérico de fórmula IV e ciclizando este último nos derivados de prolina procurados. No entanto, este método é menos preferido.

Exemplos:

Exemplo 1

Isolamento dos microrganismos Klebsiella pneumoniae , Pseudomonas cepacia, Agrobacteríum radiobacter e Arthrobacter sp.

Amostras de terra provenientes de composto de jardim ou da instalação de tratamento de águas residuais LONZA (Visp) foram incubadas no seguinte meio mínimo, a 37°C sob agitação. Glucose ou glicerol foram oferecidos como fonte de carbono, em concentrações de 1-20 g/l. Como fontes de azoto e/ou indutores utilizaram-se L-arginina, ureia, (NH4)2S04 e ácido L-a-cloro-δ-guanidinovalérico, em concentrações de 0,25 - 20 mM. Como suplemento foi adicionado extracto de levedura em concentrações de 0,1-1 g/l.

Tabela 1: A) Meio líquido

MgCI2 x 6H20 0,4 g/l

CaCI2 x 2H20 0,014 g/l

FeCI3 x 6H20 2,8 mg/l

Na2S04 0,1 g/l

Na2HP04 2 g/l KH2P04 1 g/l

NaCI 2 g/l

Solução de vitaminas 1 ml/l

Solução de oligoelementos 1 ml/l pH 6,8-8,0 85 288 ΕΡ Ο 912 751 /ΡΤ 10

Β) Meios sólidos 20 g/l de ágar, em adição a A)

Os microrganismos cresceram durante um período de incubação de 2 a 30 dias nos respectivos meios. Foram inoculados 1-3 vezes em meios frescos e colocados individualmente em meios sólidos.

Suspensões celulares dos microrganismos isolados foram examinadas quanto à sua actividade (compare-se o exemplo 3). Foram isolados os seguintes microrganismos: Klebsiella pneumoniae DSM 10293, Arthrobacter sp. DSM 10582, Pseudomonas cepacia e Agrobacterium radiobacter.

Exemplo 2

Selecção de mutantes espontâneos A Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) do tipo selvagem PA01 (Holloway, B. W., Bacteriol. Rev., 1959, 33, 419 - 443) foi incubada em meio sólido ou líquido como descrito no exemplo 1, com ácido L-a-cloro-δ-guanidinovalérico como única fonte de azoto e glicerol ou glucose como fonte de carbono, durante 1 - 30 dias a 37°C. Passado este tempo, cresceram nos meios sólidos 11 colónias iguais, ligeiramente acastanhadas. As colónias individuais foram mais uma vez espalhadas e, a seguir, cultivadas num meio mínimo líquido adequado. Suspensões celulares de células deste género foram examinadas quanto à sua actividade enzimática respectiva. Desta maneira foi isolada uma Pseudomonas aeruginosa (DSM 10581) que exprimia uma hidrolase do género procurado. De acordo com uma tipificação com fagos e identificação da estirpe por meio de Test API (20 NE bio Merieux SA, França), a estirpe era ainda idêntica à Pseudomonas aeruginosa do tipo selvagem, PA01, distinguindo-se essencialmente do tipo selvagem pela sua capacidade de expressar uma amidino-hidrolase para o ácido L-a-cloro-ô-guanidinovalérico.

Exemplo 3

Indução e biotransformação com células em fase estacionária, com as estirpes bacterianas Klebsiella pneumoniae DSM 10593 e Pseudomonas aeruginosa DSM 10581

Os microrganismos isolados descritos nos exemplos 1 e 2, foram cultivados em 100 ml de meio líquido A) com glicerol ou glucose como fonte de

85 288 ΕΡ Ο 912 751 /ΡΤ carbono e ácido L-a-cloro-ô-guanidinovalérico como indutor e fonte de azoto, a uma temperatura de 37°C. Depois de terem atingido a fase estacionária do crescimento (OD650 de 0,8-1,5), as células foram recolhidas através de centrifugação e colocadas, 10-20 vezes mais concentradas, na solução de biotransformação. A solução de biotransformação tinha a composição seguinte: tampão de fosfato ou Hepes 10-100 mM, ácido a-cloro-ô-guanidinovalérico. 10Ι 50 mM, pH 6,8-11). A biotransformação foi realizada a 37°C sob ligeira agitação. Em intervalos foram retiradas amostras e analisadas através de cromatografia em camada fina ou HPLC. O ácido L-a-cloro-ô-guanidinovalérico foi transformado quantitativamente neste processo em D-prolina, num espaço de tempo de 5 a 24 h, conforme a concentração, ficando o valor de ee da D-prolina acima de 96% (segundo HPLC).

Exemplo 4

Indução e biotransformação com a estirpe bacteriana Arthrobacter sp. DSM 10582 A cultura nos meios seguintes permitiu a indução da amidino-hidrolase: NYB (Difco); NYB e ácido L-a-cloro-Ô-guanidinovalérico 1-10 mM; meio (A) com glicerol 25 mM e L-arginina 1-10 mM, como fonte de azoto. As células foram cultivadas durante 24 h a 37°C em 100 ml de meio e recolhidas e utilizadas para a biotransformação como se descreve no exemplo 3. Após a lavagem das células, a biotransformação foi realizada em tampão de fosfato ou Hepes 10-200 mM (pH 5-10). O ácido L-a-cloro-ô-guanidinovalérico foi transformado quantitativamente em D-prolina neste processo, num espaço de tempo de 5 a 24 h, conforme a concentração, ficando o valor de ee da D-prolina acima de 96% (segundo HPLC).

Exemplo 5

Indução e biotransformação com Pseudomonas aeruginosa DSM 10581 A estirpe foi cultivada num balão de Erlenmeyer de 100 ml com chicanas, a 37°C e sob agitação, nos meios seguintes: meio mínimo (A) com os aditivos descritos na seguinte tabela 2, assim como meio completo NYB contendo Trypton a 10 g/l, "Meat extract" a 5 g/l, NaCI a 5 g/l). As células foram preparadas para a biotransformação como se descreve no exemplo 3.

85 288 ΕΡ Ο 912 751/ΡΤ 12

Tabela 2

Fonte de C Mm Fonte de N mM Indutor mM Extracto de levedura g/i OD650 24 h Taxa de biotransformação em % Gluc 20 - Cl-Arg 2 0,2 - 25 Gluc 20 Arg 1 Cl-Arg 4 1,7 100 Gluc 20 Arg 1 Cl-Arg 3 0,2 - 25 Gluc 20 NIV 1 ! Cl-Arg 2 0,2 j - ! 25 Gluc 20 NH4+ 1 j Cl-Arg 4 0,2 | 25 Gluc 20 Arg 2 Cl-Arg 2 0,1 1,6 30 Gluc 20 Ornit 1 Cl-Arg 1 0,1 1 10 Gluc 20 Citrul 1 Cl-Arg 1 0,1 0,9 6 Gly 20 Arg 2 Cl-Arg 2 0,1 1 30 Gly 20 Ornit 1 Cl-Arg 1 0,1 0,9 20 Gly 20 Citrul 1 | Cl-Arg 1 0,1 0,75 30 Gly 10 Arg 10 j Cl-Arg 0,5 0,1 30 Gluc 20 Guanin 5 - i 0,4 23 Gluc 20 Guanin 5 Arginina 1 1,1 20 Gluc 20 Acetato de guanidina 5 - 0,5 20

Fonte de C mM Fonte de N | Indutor mM j mM DO 24 h Taxa de biotransformação em % Glu 10 | Cl-Arg 5 0,6 10 Glu 20 - Cl-Arg 5 0,8 30 Gluc 20 Glu 10 Cl-Arg 5 1,2 70 Gin 10 - Cl-Arg 5 0,3 10 Gin 20 - Cl-Arg 5 0,5 10 Gluc 10 Betaína 10 Cl-Arg 5 1,2 70 Arg 10 - Cl-Arg 5 0,5 70 Gluc 10 Arg 1 Cl-Arg 5 0,8 70 Agmatin 10 - Cl-Arg 5 0,2 20

Gluc= glucose, Arg= arginina, Gly= glicerol, Glu= ácido glutâmico, Gin = glutamina

Cl-Arg= ácido L-a-cloro-ô-guanidinovalérico, Ornit = ornitina, Citrul = citrulina O ácido L-a-cloro-Ô-guanidinovalérico foi transformado quantitativamente em D-prolina neste processo, num espaço de tempo de 5 a 24 h, conforme a concentração, ficando o valor de ee da D-prolina acima de 96% (segundo

85 288 ΕΡ Ο 912 751/ΡΤ 13 HPLC). Desta maneira formaram-se 13 g/l de D-prolina (segundo HPl!C)fOs melhores resultados foram obtidos, no meio mencionado, com os aditivos Gluc 20 mM, Arg 1 mM e Cl-Arg 4 mM (compare-se com a tabela 2).

Exemplo 6

Produção de ácido L-a-cloro-Ô-guanidinovalérico

Para este efeito dissolveram-se 100 g (0,475 mol) de monocloridrato de L-arginina em 150 ml de ácido clorídrico concentrado e aqueceu-se a 65°C. Em 30 minutos adicionaram-se, gota a gota, 75 ml de HN03 a 65%, sendo a adição acompanhada, desde o início, por uma violenta formação de gás, e a solução reaccional límpida, ligeiramente amarelada, foi concentrada sob vácuo. O resíduo obtido foi ainda colocado duas vezes, de cada vez em 200 ml de HCI concentrado, e concentrado sob vácuo até à secura. Obtiveram-se 112,2 g de um sólido ligeiramente amarelado. O sólido foi dissolvido em 750 ml de HCI concentrado a 60°C, e cristalizado através de arrefecimento da solução até 0°C. 0 precipitado foi filtrado, lavado duas vezes, de cada vez com 100 ml de HCI 6 N frio e a seguir foi seco sob vácuo. Obtiveram-se 72,9 g de um sólido cristalino incolor, o que corresponde a um rendimento de 66,7%.

Ponto de fusão: 149°C aD25 (c= 10% em H20) = -7,87° ^-RMN em ppm (400 MHz, em D20): 4,55 (dd, 1H, H-1); 3,25 (t, 2H, H-4); 2,15-1,95 (m largo, 2H); 1,8-1,7 (m largo, 2H).

Teor: 100,8%.

Exemplo 7

a) Produção de D-prolina no fermentador de 3,5 I Células da estirpe Pseudomonas aeruginosa (DSM 10581) foram inoculadas com o meio descrito na tabela 3 com 10% de pré-cultura e cultivadas durante 24 h até uma OD600 de 13. A biomassa foi separada por centrifugação, lavada com Hepes 10 mM, pH 8,5 e ressuspensa no mesmo. A biotransformação foi realizada num fermentador Applikon de 1 I, sob controlo do pH que foi mantido num valor constante de pH 8,5, a 37°C, e a densidade celular era de 10-20 de OD600. A concentração de ácido a-cloro-δ-guanidinovalérico encontrava-se, durante a biotransformação, sempre acima de 25 mM. No total, foram adicionados 110 mM de substrato. Após 40 h, tinham

85 288

ΕΡ Ο 912 751/PT 14 sido formados 106 mM de D-prolina, com um valor de ee de 98,3% (segundo HPLC) (figura 1).

Após 40 h, as células foram separadas por centrifugação. A solução bruta foi purificada através de Celite 535: após uma precipitação da proteína por meio de ácido perclórico e neutralização subsequente com KOH, a solução de biotransformação foi submetida a um tratamento com carvão activado e separada por filtração através de Celite 535. O produto foi concentrado até à secura. b) Produção de D-prolina com extracto isento de células

As células de Pseudomonas aeruginosa (DSM 10581) foram lisadas através de prensa francesa ("french-press") (3 vezes; 120 Mpa). A 1 ml de extracto isento de células foi adicionado 1 ml de ácido L-a-cloro-Ô-guanidinovalérico 50 mM em tampão de fosfato 100 mM (pH 7-8) e a mistura foi incubada a 37°C. A título de comparação, o mesmo foi também realizado com células intactas. Foram retiradas amostras e estas foram analisadas através de HPLC. Verificou-se que a actividade do extracto isento de células era superior ao dobro da actividade das respectivas células não lisadas (figura 2).

Tabela 3: 0,8 g/l 0,16 g/l 20 mg/l 1 ml/l 1 ml 10 g/l ("G/ucose-feed" até 30 g/l) 2 g/l 1 g/l 2 g/l ácido a-cloro-6-guanidinovalérico 10 mM (re-alimentação) (NH4)2S04, 3,1 g/l

MgCI2 x 6H20 CaCI2 x 6H20 Fe04 x 7H20

Solução de oligoelementos sem EDTA Polipropilenoglicol Glucose Na2HP04 KH2P04 NaCI Indutor

Fonte de N c) Derivatização de D-proiina em D-Z-prolina

Dissolveram-se 4,6 g de D-prolina isolada como supra descrito em 20 ml de H20. A um pH constante de 11,5-1 2 (NaOH 4 N) foi adicionado, gota a gota,

85 288 ΕΡ Ο 912 751 /ΡΤ 15 cloroformato de benzilo (Z-CI). Adicionaram-se, no total, 9,3 g de Z-CI. Após a reacção, a mistura foi neutralizada com HCI. Esta solução foi extractada com acetato de butilo. As fases orgânicas foram rejeitadas. Através da adição de mais HCI à fase aquosa, o pH foi ajustado a 2 e repetiu-se a extracção com acetato de butilo. As fases orgânicas foram reunidas e concentradas. O produto foi cristalizado a partir de uma solução em 2,5 ml de acetato de etilo e 1,5 ml de hexano. Obtiveram-se 3,6 g de Z-D-prolina.

Ponto de fusão: 68,5°C Teor: 97,86% [aD20] (c = 2 em ácido acético glacial) = +55,766° [a54620] (c = 2 em ácido acético glacial) = +66,251° ee (segundo HPLC): 95,4% 1H-RMN (400 MHz, em CD30D); δ em ppm: 7,35 (m, 5H); 5.1 (m, 2H); 4.3 (m, 1 H); 3,6 - 3,4 (m, 2H); 2.3 - 2,2 (m, 1H); 2.1 - 1,9 (m, 3H).

Exemplo 8

Purificação da enzima Células de Pseudomonas aeruginosa DSM 10581 foram cultivadas como descrito no exemplo 1. As mesmas foram recolhidas na fase tardia de crescimento exponencial, através de centrifugação, e lavadas com NaCI a 0,85% ou tampão Hepes 30-200 mM, pH 7-9. As células foram lisadas através de prensa francesa (3 vezes; 120 MPa). O extracto celular foi separado por centrifugação de 30 min a 30 000 g. O sobrenadante isento de células foi filtrado (0,4 .um) e purificado através de uma coluna MonoQ-FPLC (Pharmacia). Como fase móvel utilizou-se tampão Hepes 10 mM, pH 8. Foi preparado um gradiente com Na2S04, para eluir a enzima da coluna. A enzima eluiu da coluna a uma concentração do sal de 120 mM. 25 mM de ácido L-a-cloro-δ-guanidinovalérico foram transformados com a enzima enriquecida, durante a noite, em D-prolina.

I I 16 85 288 ΕΡ Ο 912 751/ΡΤ

As fracções activas provenientes da purificação em MonoQ-FPLC foram reunidas e continuaram a ser purificadas com uma coluna de fenilsefarose (Pharmacia). Como fase móvel foi utilizado tampão Hepes 50 mM, pH 8, (NH4)2S04 1,7 Μ. A hidrolase foi eluída da coluna com tampão Hepes 50 mM, pH 8. A enzima purificada transformou ácido L-a-cloro-ô-guanidinovalérico 25 mM totalmente, em de 24 h, em ácido L-á-cloro-ô-guanidinovalérico, o qual ciclizou subsequentemente, devido à basicidade no meio, em D-prolina.

Exemplo 9

Caracterização da enzima A caracterização da enzima foi realizada com células inteiras de Pseudomonas aeruginosa (DSM 10581). A densidade óptica da suspensão celular era, neste caso, de OD600= 1 7. A influência da temperatura foi determinada em tampão de fosfato 100 mM (pH 7-8), a uma concentração do substrato, ácido L-a-cloro-ô-guanidinovalérico, de 25 mM. Verificou-se, neste caso, que a actividade obtida a 37°C era 40% mais elevada do que a 30°C. A influência do valor de pH foi determinada no mesmo tampão, à mesma concentração de substrato e a uma temperatura de 37°C. Foi medida a actividade a pH 7; pH 7,5; pH 8,0 e pH 8,5. Verificou-se neste caso que o pH óptimo era pH 8,5. Através da aplicação de concentrações diferentes de ácido L-a-cloro-ô-guanidinovalérico foi determinado o valor de KM e a Vmax a uma temperatura de 37°C, em tampão de fosfato 100 mM (pH 8,5). O valor de KM era de 85,2 mmol/l e a Vmax 0,38 mmol/l/min (figura 3).

Através de adição de concentrações diferentes de ácido L-a-cloro-ô-aminovalérico (produzido a partir de ornitina, em analogia ao exemplo 6) pôde ser verificada uma inibição. Como se vê na figura 4, ocorre uma inibição total, a uma concentração de 50 mM.

Lisboa, 29. uZ. 2GCU

Por LONZA AG - O AGENTE OFICIAL -

DÁ CUNHA FEKREIKA

Ag. Of. Pr. Ind.

Rcsa das Flores, 74 - 4.°

ieeo LISBQA

Claims (11)

1. 85 288 ΕΡ Ο 912 751/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Microrganismos, caracterizados por serem capazes de utilizar, como única fonte de azoto, um derivado de ácido guanidinovalérico seleccionado dos compostos de fórmula geral

   em que R1 significa hidrogénio ou hidroxi e R2 um átomo de halogéneo ou -NH2, assim como extractos enzimáticos dos mesmos.
2. 2. Microrganismos de acordo com a reivindicação 1, do género Klebsiella, Pseudomonas, Agrobacterium ou Arthrobacter.
3. 3. Microrganismos de acordo com a reivindicação 1 ou 2, das espécies Klebsiella pneumoniae DSM 10593, Arthrobacter sp. DSM 10582, Agrobacterium radiobacter, Pseudomonas cepacia ou Pseudomonas aeruginosa DSM 10581, assim como suas variantes e seus mutantes funcionalmente equivalentes.
4. 4. Enzima com actividade de amidino-hidrolase, obtenível de microrganismos de acordo com uma das reivindicações 1 a 3 e capaz de cindir ureia, a partir de derivados de ácido guanidinovalérico seleccionados de entre compostos de fórmula geral

   V em que R1 significa hidrogénio ou hidroxi e R2 um átomo de halogéneo ou -NH2, assim como suas variantes e seus mutantes funcionalmente equivalentes. 85 288 EPO 912 751/PT 2/3
5. 5. Processo para a produção de derivados de D-prolina de fórmula geral R1

   O em que R1 significa hidrogénio ou hidroxi, caracterizado por se hidrolisar um derivado de ácido L-guanidinovalérico ou um seu sal, de fórmula geral H,N

   III em que R1 tem o significado mencionado e R3 significa um átomo de halogéneo, com um microrganismo ou extracto enzimático de acordo com a reivindicação 1, ou com uma amidino-hidrolase de acordo com a reivindicação 4, num derivado de ácido L-aminovalérico, de fórmula geral

   OH em que R1 e R3 têm o significado mencionado, e por se ciclizar este para o produto final de fórmula I.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5, no qual se produz o derivado de ácido L-guanidinovalérico de fórmula III ou um seu sal, numa primeira etapa, através de transformação de um derivado de L-arginina ou de um dos seus sais, de fórmula geral

   II 85 288 ΕΡ Ο 912 751 /ΡΤ 3/3 em que R1 tem o significado mencionado.
7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 6, no qual se realiza a transformação do derivado de L-arginina ou de um dos seus sais a uma temperatura de -10 a 100°C.
8. 8. Processo de acordo com uma das reivindicações 5 a 7, no qual se realiza a hidrólise do derivado de ácido L-guanidinovalérico de fórmula III ou dos seus sais por meio de microrganismos do género Klebsiella, Pseudomonas, Agrobacterium ou Arthrobacter.
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 8, no qual se realiza a hidrólise por meio de microrganismos das espécies Klebsiella pneumoniae DSM 10593, Arthrobacter sp. DSM 10582, Agrobacterium radiobacter, Pseudomonas cepacia ou com Pseudomonas aeruginosa DSM 10581, ou com suas variantes e seus mutantes funcionalmente equivalentes.
10. 10. Processo de acordo com uma das reivindicações 5 a 9, no qual se realiza a hidrólise a um valor de pH 5 a 1 3.
11. 11. Processo de acordo com uma das reivindicações 5 a 10, no qual se realiza a ciclização sem isolamento do derivado de ácido L-aminovalérico de fórmula IV. Lisboa, 29. CL 20u0 Por LONZA AG - O AGENTE OFICIAL -