PT87141B

PT87141B - Processo para a preparacao de composicoes de ascomicetos, esquizomicetos e leveduras transformadas biofisicamente, e de racoes e nutrientes vegetais contendo estas composicoes

Info

Publication number: PT87141B
Application number: PT87141A
Authority: PT
Original assignee: Socop Nahrungsmittel
Priority date: 1987-04-02
Filing date: 1988-03-31
Publication date: 1992-07-31
Also published as: PL157500B1; HUT57269A; WO1988007580A2; DE3711054A1; DD282706A5; DK483789A; EP0286033A2; PL271547A1; DD282706C4; EP0286033A3; YU65588A; JPS63251079A; PT87141A; DK483789D0; HU208040B; WO1988007580A3; DE3711054C2; AU1577188A

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES DE ASCOMICETOS, ESQUIZOMICETOS E LEVEDURAS TRANSFORMADOS BIOFISICAMENTE, E DE RAÇÕES E NUTRIENTES VEGETAIS CONTENDO ESTAS COMPOSIÇÕES

A presente invenção refere-se a uma composição de material celular de ascomicetos ou de esquizomicetos modificadas biofisicamente, e em especial a uma composição de levedura modificada biofisicamente com elevada actividade metabólica, ao processo para a preparação destas composições, bem ccmo a rações animais e nutrientes para plantas contendo as referidas composições, bem como à utilização das composições para o tratamento da pele e para activaçao probiótica.

Sabe-se que organismos vegetais e animais influenciam e podem activar o metabolismo celular. Por esta razão foram já propostos inúmeros métodos para activaçao metabólica. De acorda com a Patente Alemã 1 076 88S são obtidas substâncias activas que promovem a respiração, a partir de células sanguíneas ou células do plasma dialisadas; permitem aumentar a absorção do oxigénio por homogeneizados de fígado de rato. Sao obtidos produtos que promovem o crescimento, de acordo com a Patente Americana 3 937 816, a partir da polpa vermelha do baço de vitelo que por injecção intravenosa em ratos originam, num periodo de tempo relativamente curto, um aumento de peso do baço, Nao foram dadas indicações sobre a actividade respiratória ou a influencia sobre a fosforilação da cadeia respiratória.

Sabe-se também que podem ser enriquecidas numa levedura substancias com eficácia terapêutica (ver também DE-OS 3 341 840).

Nao eram ainda conhecidas até ao presente algas, fungos e leveduras com uma elevada actividade metabólica de tal modo que manifestassem, num homogeneizado de fígado de rato, uma acção de aumento do ritmo respiratório. As leveduras tradicionais, como por exemplo a levedura de cerveja, Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces carlsbergiensis, a levedura do pão (Saccharomyces), Candida, Torula, etc., tinham comportamento inerte relativamente a este homogeneizado. 0 facto de aumento do ritmo respiratório situa-se essencialmente em cerca de uma unidade,

A invenção revela pela primeira vez um preparado com actividade metabólica obtido de material celular de ascomicetos ou de esquizomicetos e, particularmente, um preparado de leveduras que possui actividade de aumento do ritmo respiratório no homogeneizado de fígado de rato standardizado, quando medido pelo processo de Warburg. 0 factor de aumento do ritmo respiratório a 37²C, relativamente a uma correspondente amostra de comparação, é geralmente de pelo menos 2,0 e tem preferivelmente um valor de 2,0 até 10.

A expressão ascomicetos” na presente descrição compreende os fungos em forma de saco com hifas em forma de saco e formação de ascosporos, a que também pertencem as leveduras (Saccharomyces), e os fungos tipo levedura cuja formação de esporos não é ainda conhecida, por exemplo as espécies Candida e Torulopsis. Os esquizomicetos são bactérias tipo leveduras. Na descrição utiliza-se abreviadamente a expressão fungos” para todas as espécies mencionadas acima.

Preparado de leveduras” significa na presente invenção células completas de leveduras, soluçoes de leveduras, suspensões de leveduras, incluindo extractos de leveduras.

factor de aumento do ritma respiratório para os preparados de leveduras com actividade sobre □ metabolismo, da presente invenção, é determinado com base na acção sobre homogeneizados de fígado de rato, de acordo com o método de Warburg, e representa a proporção de oxigénio consumido adicionalmente por respiração do homogeneizado de fígado de rato stan dardizado (em volume) referido a um controle isento do preparado, mantendo-se igual a restante composição.

A medição do aumento da respiração e do factor do aumento do ritmo respiratório são realizados num vaso de Warburg de determinado volume que está cheio com um tampão (de preferencia tampão de Sorensen a pH 7,4) com uma determinada quantidade do homogeneizado de fígado de rato condicionado e com a substancia de ensaio ou a solução de ensaio correspondente a um plano de carga, e no qual a substância de ensaia actua sobre o homogeneizado geralmente durante um período de tempo de 60 minutos a 37²C. Por leitura de um manómetro determina-se o consumo de oxigénio depois de ter sido absorvido quantitativamente o C0₂ formado na respiração. 0 consuma de oxigénio calculado em condições normais, definido pelo consumo de uma amostra de controle sem a substância de ensaio, é uma medida directa do factor de aumento do ritmo respiratório.

Ο aumento de respiração mensurável aos produtos de ascomicetos, esquizomicetos e de leveduras de acordo com a invenção é muito nítido, o que se pode ver no quadro I adiante relativo a um produto de levedura de acordo com o exemplo 1®

QUADRO I

No.	Amostra	Factor de aumento do ritmo respiratório	Aumento centual
1	Solução total	4,4	340
2	Sobrenadante da centrifugação	4,0	300
3	Resíduo da centrifugação	2,8	180
4	Material de partida	1,0	-

É característica dos produtos de ascomicetos, esquizomicetos e de leveduras de acordo com a invenção uma modificação intencional da sua bioquímica, através da qual é fortemente aumentada a sua actividade metabólica. Os critérios para a avaliação da actividade metabólicr reforçada, além do aumento da respiração de homogeneizados de órgãos já mencionados, são uma melhor acção de cura de lesões, a influência positiva sobre o sistema reticuloendotélico e a acção estimulante do crescimento que pode ser verificada em peixes e também em animais de sangue quente. Os preparados de ascomicetos, esquizomicetos e de leveduras de acordo com a invenção, com actividade metabólica, influenciam também positivamente o crescimento de leveduras normais, como se comprova através dos seguintes ensaioss quadro II

Células de levedura Saída

Entrada

Levedura (Células/10 ml) (Células/10 ml) FAC(%) FAC(/c)

a) SabouraudMaltose % da calda de cozedura de levedura normal

2,0 . 1D⁶

1,0 . 10⁹ 500

Levedura ncr mal + 2 % do produto de levedura da invenção

2,0 . 10⁶

1,5 . 10⁹ 750 50

b) SabouraudMaltose % da calda de cozedura

de levedura normal	5,0	m⁶. 10	2,0 . 10⁸	40	-
Levedura nor mal + 2 % do produto de levedura da invenção	5,0	. io⁶	2,6 . 10⁸	52	30

FAC = factor de aumento do crescimento

TAC = taxa de aumento do crescimento

Levedura normal (a) = Saccharomyces cerevisiae

Levedura normal (b) = Saccharomyces carlsbergienais.

Verificou-se também uma influência positiva semelhante sobre o crescimento em bactérias, tais como bactérias das espécies Lactobacillus e Bifidus

Tendo em consideração a bioquímica modificada dos produtos de partida modificados à base de células de ascomicetos, esquizomicetos e leveduras, são importantes os diagramas de cromatografia de camada fina de lípidos, aminoácidos e componentes de ácidos nucleicos obtidos em condiçoes definidas ensaio, em comparação com as células de partida utilizadas para a modificação.

Os diagramas de TLC bidimensionais obtidos prestam-se para a caracterização dos produtos modificados e para a sua diferenciação de outros produtos preparados.

A fig. 1 mostra um diagrama TLC bidimensional para lípidos e outros constituintes de uma levedura modificada. Para isso extraiu-se um grama da levedura modificada com 6 ml de clorofórmio/metanol (2:1).

extracto foi cromatografado:

com o eluente clorofórmio:metanol;água (65:25:4) com o eluente benzenoxéter dietílico:etanol;ácido acético (65:40:1:0).

Para identificação dos constituintes separados, as placas são primeiramente expostas a uma lâmpada de análise de raios ultra-violetas a 366 nm e a 254 nm e marcam-se as manchas. Para identificação dos lipidos as placas são pulverizadas com o reagente primulina e expostas ã lâmpada de análise de ultra-violetas a 366 nm.

Surpreendentemente, na maioria dos preparados de ascomicetos, esquizomicetos e leveduras de acordo com a invenção — 6 -

descobriu-se adicionalmente à sua actividade de aumento da respiração, um factor de inibição que age sobre as oxidases com acção inibitória. Como oxidases citam-se especialmente as aminoácidooxidases /71.4.3,2. ou ,3e as monoaminooxidases /71.4.3.4.7 bem como as diaminooxidases /1.4.3.6 J,

Devido a este efeito é nitidamente inibida ou reduzida a oxidação de L-aminoácidos, que é catalisada por L-aminoácido-oxidase /71.4.3.2._7. A L-aminoácidooxidase existe em muitos sistemas que utilizam os nutrientes, tais como a flora intestinal e culturas do solo. A acção directa deste factor inibidor á em percentagem superior ao consumo do L-aminoácido no nutriente, que á fornecido a um sistema consumidor de nutrientes desta natureza, com o resultado de o animal ou a planta poderem crescer mais rapidamente.

Nao há ainda certeza de este factor inibidor depej) der directamente da actividade respiratória aumentada, ou se pelo menos pode ser correlacionado com aquela.

Sem se pretender aqui estabelecer com precisão um mecanismo, foi possível explicar a acção deste factor de inibição do seguinte modos a L-aminoácidooxidase contêm como grupo proteico FMN (mononucleótido de flavina) ligada solidamente. Na oxidação de L-aminoácidos os seus grupos amino são oxidados de acordo com as seguintes equações químicas»

1) L-AS + H₂0 + Enzima-FMN—> eC-cetoácido + NHg + Enzima-FMN.

2) Enzima-FMN.H₂ + 0₂ ----->Enzíma-FMN + H 0₂ consumo de oxigénio pode ser medido tendo em consideração a quantidade de H₂0₂ formado, visto que o peróxido

de hidrogénio se decompõe em água

Na presença de catalase esta decomposição é espontânea e quantitativa, de modo que a reacção global da oxidação do L-aminoácido correspondente à equação 3:

3) R - CH - COOH + 1/2 0<---> R- CO- COOH + | < 3

NH₂

Se num sistema se inibir ou bloquear, ou imobilizar de qualquer outro modo, a L-aminoácidooxidase, é consumido menos oxigénio do que no caso da ausência deste factor de inibição, de modo que ficam assim disponíveis mais aminoácido e proteína, o que pode conduzir a um consumo de nutriente mais forte e intenso.

Para a determinação do factor de inibição de L-aminoácido-oxidase (Hmf) dos preparados de ascomicetos, esquizomicetos e leveduras de acordo com a invenção, colocam-se num vaso de Warburg, de acordo com um determinado plano de carga, a solução de L-aminoácidooxidase (1 mg/ml), suspensão de catalase, tampão de pH 7,8 (50 ml 0,2 M Na₂P20y + 37,5 ml 0,2 M HC1) , solução de L-fenilalanina (1 mmole/50 ml, tampão a pH 7,8) e solução de ensaio (centrifugado, 10^ g; ou suspensão de leveduras) de modo que as determinações compreendam tanto a reacçao de L-aminoácido-oxidase e L-fenilalanina, como também a reacção do enzima com a solução de ensaio (sem a fenilalanina) e do enzima com a solução de ensaio e fenilalanina. 0 interior das provetas é dotado de tiras de papel de filtro humedecidas com potassa caustica 6l\l. As soluções são equilibradas a 37²C, seguidamente introduz-se a solução do enzima na câmara principal que contém a solução de ensaio ou uma solução para um ensaio branco, para iniciar a reacção. D consumo de oxigénio em pil pede ser então expresso em função do tempo e é uma medida directa do factor de

B inibição se for correlacionado com o consumo de oxigénio do ensaio em branco. Em geral realiza-se a leitura para a determinação do valor Hmf após 60 min.

Para a avaliação traça-se a curva soma das curvas de medida ”L-aminoácidooxidase + fenilalanina e L-aminoácidooxidase + solução de levedura” — a necessidade de oxigénio reduz-se ao aminoácido contido na própria levedura — e traça-se então a surva soma que é uma medida da absorçao de oxigénio teoricamente prevista, relativamente à curva L-aminoácido-oxidase + L-fenilalanina + soluçãode levedura. No caso de preparadas de ascomicetas, esquizomicetos e de leveduras de acordo com a invenção (desagregados biofisicamente) deduz-se um consumo mínimo de oxigénio que exprime o factor de inibição em percentagem (por exemplo 0,42 = 42 % de inibição ou menor consumo de oxigénio)· Em comparação com os materiais celulares de partida utilizados em cada caso, que correspondem na prática à curva soma teórica, o factor Hmf é considerável e alcança valores até 70% ou mesmo 80%.

Uma outra propriedade surpreendente da maioria das composiçoes de ascomicetos, esquizomicetos e leveduras de acordo com a invenção é a sua actividade de cura de feridas, tratados, controle.

que é avaliada pela cura de feridas causadas por corte nos dorsos de ratos. A tensão no ponto da ferida dos animais após 6 dias, era nitidamente maior do que num grupo de Também no caso do ensaio no 21^s dia era ainda visível a supremacia dos animais tratados, face ao grupo de controle.

Neste ensaio ratos macho da raça Wistar com um peso corporal de 210-230 g foram narcotizados, e, sob narcose, foi-lhes tosquiado o pelo do dorso. Seguidamente foi praticado um corte linear de cerca de 4 cm de comprimento ao longa da linha média, que foi depois cosido em 3 pontos distantes entre

- 9 si de 1 cm. Nos 62, 112, 162 _e 21^s dias depois do corte abriu-se a ferida e retiraram-se 3 pequenos discos de pele em ângulo recto relativamente a linha da ferida, compreendendo 1 cm de largura da linha da ferida. Em seguida mediram-se as tensões necessárias para retirar as partes utilizadas.

2,5 ml/kg do sobrenadante de centrifugação da solução de ensaio do exemplo 1 foram administrados no dia'do corte da ferida e depois diariamente. 0 grupo de controle recebeu uma aplicação de 2,5 ml/kg de soro fisiológico, mantendo-se iguais as restantes condições do ensaio. Por cada grupo foram utilizados para cada ensaio 25 animais.

Foi possível observar que as tensões das partes de pele lesionadas no grupo de animais tratados com a solução de ensaia, subiu uniformemente» Para cada ensaio diário os animais tratados apresentavam uma tensão mais elevada das partes dc pele do que o grupo de controle. Na fase inicial, no 62 dia, a diferença relativamente ao grupo de controle era superior a 100% Os resultados estão resumidos no quadro III.

QUADRO III

N⁵. de dias

Grupo de ensaio *

215 + 17

MM

493 + 24

840 + 48 «MW

1659 + 52

Grupo de controle

104 £ 33

390 + 23

730 + 30

1401 + 60 * 0 grupo de ensaio recebeu 2,5 ml da solução de ensaio/kg de peso corporal.

- 10 A cura de feridas nitidamente superior pode ser explicada pelo facto das composiçoes de ascomicetos, esquizomicetos e leveduras, de acordo com a invenção, promoverem a respiração dos tecidas e melhorarem a função metabólica, de modo que os tecidos são regeneradas de forma nitidamente mais acelerada,

Nao só as peles lesionadas mas também as peles sãs nãõ lesionadas são influenciadas favoxávelmente pelas compo siçoes de acordo com a invenção, por exemplo leveduras desagregadas. Por acção de uma composição de levedura desagregada biofisicamente (exemplo 1) normalizou-se o poder de retanção de humidade de uma pele humana e melhorou-se mesmo acentuadamente. Para se comprovar esta acção determinou-se o teor de água da pele antes e depois do tratamento, ao longo de várias horas. Aplicaram-se composições contendo os preparados sobre uma pele seca, portanto sobre uma pele com mau equilíbrio de humidade,. Sobre a mesma pele foi aplicada uma amostra de controle sem o preparado, mas que era igual na restante composição. Como resul· tado provou-se que o teor de água aumentou e que o poder de retenção de humidade da pele práticamante duplicou. Na figura 2 estão representadas curvas para a .pele tratada e a pele nao tratada. No eixo dos X estão indicadas as horas depois do tratamento e no eixo dos Y está indicada a humidade da pele em percentagem.

Como já se explicou com base na acção de cura de feridas, a elasticidade ou a tensão da pele são melhoradas por meio de formulações que contem os preparados de fungos ou de leveduras de acordo com a invenção, o que se pode comprovar muito bem por medições de frequências de ressonância em peles humanas,

Um outro critério para a actividade metabólica reforçada dos preparos de ascomicetos, esquizomicetos e levedu11 -

ras de acordo com a invenção é a influencia positiva sobre □ sistema retículo-endotélico. Devido a esta acção sobre a função do SER dos ratos inibida por azul de trifano, de acordo com o método de vermelho do Congo, pode determinar-se para os novos preparados uma acção de activação do SER. Para o efeito injecta-se por via intravenosa em ratos macho Wistar com um peso corporal de 210-230 g, 1 ml/kg de uma solução a 1 % de vermelho do Congo; passados 4 minutos e passados 60 minutos retira-se sangue, 0 coeficiente do vermelho do Congo obtém-se a partir da relação da extinção por décadas a 500 nm do soro diluido 10 vezes₀ Para inibição da função do sistema SER administraram-se por via intraperitonial 10 ml/kg de solução a 1% de azul de trifano_o Através da medição da extinção por décadas a 650 nm pode calcular-se a inibição como a extinção calculada por décadas a 500 nm. A administração do azul de trifano foi realizada 6,5 horas antes do ensaio do sistema SER com o vermelho do Congo. No teste administrou-se por via intraperitonial, 5 horas antes deste ensaio, 0,5 ml da solução de ensaio (sobrenadante de centrifugação de acordo com o exemplo 1). 0 grupo de controle recebeu uma quantidade adequada de soro fisiológico. Por cada grupo foram ensaiados 25 animais de ensaio de cada vez.

Para o grupo tratado determinou-se em média um coeficiente de vermelho do Congo de 9,4 e para o grupo de controle um coeficiente de vermelho do Congo de 16,1, o que é uma prova directa da acção crescente dos preparados de ascomicetos, esquizomicetos e leveduras de acorda com a invenção sobre a função do sistema SER, visto que a acção de inibição é aumentada pelo azul de trifano,

A forte actividade metabólica verificada nas composiçoes de ascomicetos, esquizomicetos e leveduras de acordo com a invenção é absolutamente surpreendente na medida em que as células de ascomicetos, esquizomicetos e leveduras, e os respec

- 12 tivos preparadas celulares, são tratados apenas por métodos físicos. Este tratamento é aqui genericamente designado por desagregação. As células de ascomicetos, esquizomicetos e leveduras podem ser desagregadas por acção do frio, por raios laser, por acção de ultrassons e outros métodos biofísicos, bem como por um tratamento térmico intenso de relativa curta duração. Nestes casos obtém-se visivelmente uma nítida redução das células e das células de leveduras, preferivelmente a 0,5 vezes ou menor, enquanto que as paredes celulares se tornam mais fortes, de modo que a relação do diâmetro médio das células para a espessura nas paredes celulares é modificada de um factor que se situa preferivelmente no intervalo de cerca de 5 até 20* preparado de material celular de ascomicetos e esquizomicetos contém adicionalmente, de preferencia, uma pequena quantidade de extracto de mitocondrias através da qual pode ser reforçada ainda mais a actividade de promoção do crescimento do preparada.

extracto de mitocondrias é adicionado de preferencia imediatamente antes ou durante o tratamento biofísico. As mitocondrias (também designadas condriosomas) são corpos de protc plasma das células de plantas e animais unicelulares, de forma variável, com cerca de 0,1 até 1 yjm de largura e 1 a 5yjm de comprimento. Existem comercialmente na forma de pós secos isentos de pirogénios, ou na forma de soluçoes, como por exemplo o pó Mitochondyl da firma Widmer AG, Suiça, que possui cerca de 2% de azoto e um teor de substância seca de carca de 50%. Este produto comercial é utilizado nos exemplos. Em geral preparam-se os extractos de nitrocondrias por desagregação das células por centrifugação, predominantemente células de leveduras, e em seguida um passo apropriado de rehidratação, suspensão, lavagem e secagem.

Veja-se por exemplo P. M. blossal, Austral, J. Exp. Biol. Med, Sei. ,31, 583 (1965); M. Merkenschl&ger, K. Schlossmann, W. Kurz, Biochem. Z. 329, 332 (1957). 0 Mitochondyl representa um produto obtido de mitocondrias extraídas de células de leveduras misturadas com substâncias em pó e á utilizado directamente na forma de pó branco, ou por preparação de uma solução convenientemente tamponizada que também contém conservantes. Utiliza-se de preferência uma quantidade do extracto de mitocondrias de cerca de 0,05 até 0,50% em peso, expresso como substância seca e referido à fraeção da substância sólida seca das células a desagregar.

Praticamente já não tem lugar, e também não é desejável, uma multiplicação das células de ascomicetos, 'esquizomicetos e leveduras nas condições indicadas durante o tratamento.

A substância de suporte utilizada de preferencia consiste em:

a) uma pequena quantidade (preferivelmente 0,2 até 5,0 % em peso) de leveduras já desintegradas biofisicamente e/ou de extracto de condriosomas (preferivelmente 0,01 até 0,1 % em peso) obtido das leveduras utilizadas como material de parti da ou de uma outra levedura,

b) glicolatos de celulose, silica-gel pirogénio, tragacante e/ou carragenano,

c) 2 monosacarídeos e/ou disacarídeos fermentescíveis,

d) conservantes

e) oligoelementos tais como manganês, cobalto, zinco, magnásio, na forma de sulfatos ou glicomatos*

A levedura de partida (a) serve como iniciador

para o tratamento, o aditivo (b) promove uma melhor distribuição das leveduras» Os hidratos de carbono (c) protegem de uma fermentação prévia dos hidratos de carbono próprios da célula. Como conservantes fd) servem de preferência parabeno (ésteres alquílicos de ácido 4-hidroxibenzóico) cloreto de sódio e cloreto de cálcio. Protegem o produto final desde início de uma acção de microorganismos. A adição de oligoelementos (e) permite desvios de concentrações desejáveis nas células de levedura ou nas suspensões de células de leveduras.

Também é influenciado positivamente o crescimento de microorganismos, por exemplo Bifidus, lactobacilo, bacilos tipo cocos, bactérias de solo e bactérias intestinais, através dos produtos de ascomicetos, esquizomicetos e leveduras de acordo com a invenção.

Com as composições de ascomicetos, esquizomicetos e leveduras desagregadas biofisicamente de acordo com a invenção, conseguem-se em plantas superiores uma marcada influência sobre o crescimento das plantas, sobre o estado da floração e a formação de frutos. Se se adicionar ã água de rega até 1 % de uma composição líquida de ascomicetos, esquizomicetos e leveduras, preparada de acordo com os exemplos 1 a 6 adiante, plantas decorativas tais como petdnias, lubélias, crisântemos e cravos, crescem durante um período de ensaio de 6 semanas, relativamente a uma amostra de comparação (controle) pelo menos 2 vezes mais rapidamente com uma extraordinária abundância de folhas e flores.

Também se observam melhorias semelhantes em plantas de cultura, como ervilhas, girassol e milho, comprovando-se assim a excelente tendência das composições de acordo com a invenção como aditivos estimulantes do crescimento para soluções de rega e de irrigação» Esta acção manifesta-se na realidade com uma influência favorável sobre a microflora do solo.

Exemplo 1 partes em peso de uma levedura seca a 95 % (Saccharomyces cerevisiae) e 70 partes em peso de uma solução ou suspensão aquosa de uma substância veicular contendo (em percentagem ponderai) 0,5% de uma levedura desagregada biofisicamente, 0,03 % de extracto de condriosomas, 0,6% de glicolato de celulose, 0,1 % de parabeno, 2% de sal, um total de 0,1 % de glucose e sacarose, 0,00001 % de oligoelementos, são irradiados a uma temperatura de 15-252C com um laser de CO^ tradicional. A potência do laser, da ordem de grandesa de 0,3 Watt, é total2 mente suficiente. A sua focagem é realizada a 0,05-5 kW/cm .

Para se submeter a suspensão à irradiação com o laser de C0₂ utiliza-se um dispositivo que consiste em 2 recipientes de tamanho apropriado, que estão ligados entre si pelas extremidades inferiores por meio de um tubo construído em vidro |ja ra radiação infravermelha. Este tubo tem um comprimento de 20 a 50 cm e um diâmetro interno de 3 a 6 mm. Introduzem-se 20 1 de suspensão, por acção da pressão de azoto puro, no recipiente do lado esquerdo do dispositivo, previamente cheio com azoto. Depois de o laser ter sido ajustado com o endoscópio a um ponto.de tamanho correspondente ao diâmetro interno do tubo de ligação, a suspensão é deslocada por meio de pressão de azoto de um recipiente para o outro, sendo também o 22 recipiente utilizado sob pressão de azoto. Para uma potência de 0,3 W e uma velocidade de escoamento da suspensão de 20 a 200 ml/min., prossegue-se o tra tamento atá se atingir a redução das células pretendida, que pode ser provada e comprovada por meio de um microscópio* Em seguida a suspensão é aquecida rapidamente a uma temperatura superior a 50^sC (no máximo 25 minutos) e mantida sob agitaçao à temperatura final. A suspensão, depois de arrefecida a 30-0, é então misturada com 0,1 a 0,2 % em peso de um conservante tal como ácido sórbico e/ou nipagina, para conservação.

ensaio morfológico das células revelou uma redução do diâmetro médio das células em cerca de 50 % e um nítido aumento da espessura das paredes celulares. Tanto o produto global (suspensão) como também as fracções que podem ser obtidas por centrifugação (10000 rpm) isto é, □ sobrenadante e o resíduo da centrifugação, revelam-se num ensaio de Warburg, como metabolicamente activos (em contraste com a levedura de partida) quando, de acordo com o ensaio descrito, se comprova a acção do aumento do ritmo respiratório num homogeneizado de fígado de rato. 0 factor de aumento da respiração do produto global e do resíduo da centrifugação era maior do que 4 (ver Quadro I). Outras actividades foram também verificadas no teste de cura de feridas descrito (Quadro III) e no teste para activação do sistema SER.

Para uma dose de 22/oo o produto global foi ensaiado com leitões vivos e de abate pesando 10 a 35 kg (ver quadros IV e V). A melhoria da absorção diária de ração foi nitidamente superior respectivamente am cerca de 58% e 42%, do que no caso da utilização de preparados comerciais para rações, de modo que resultou uma melhoria do valor da ração de 16,7% e 19,5%. Os resultados estão indicados individualmente nos quadros IV e V a seguir.


	Quadro	[V
Criação de leitões (10 - 35 kg de	peso em vivo)
	Controle	Preparados	comerciais	Preparado
	(sem pro			de ensaio
	duto)	A	B	(2-/oo)
N⁹ de animais/grupo	24	24	24	24
de ensaio
peso inicial (kg)	10,2	10,1	10,3	10,2
duração do ensaio (dias)	35	35	35	35
peso no fim do ensaio
(kg)	25,4	26,7	30,2	34,2
aumento de peso (kg)	15,2	16,6	19,9	24,0
aumento diário (g)	343	474	569	686
diferença relativa (%)	100	109	131	158
aumento da ração/ani-
mal/dia (g)	908	971	1093	1194
gasto de ração/kg de
crescimento	2,09	2,05	1,92	1,74
diferença relativa (%)	100	98	92	83,3
Melhorias:
aumento diário (%)	-	9,21	30,9	57,9
valorização da ração(%)	-	2	8	16,7
* Os preparados comerciais eram:	A: CTC e B:	bayo-nox
(também no Quadro V)
	- 18	-

Quadro V

Ensaio com leitões de abate

(Idade de abatei 21	dias, peso em vivo	5 - 12,5	kg)
	Controle	Preparad	□ s	comerciais Preparado
	(sem pro				de ensaio
	duto)	A		B	(22/oo)
N2 de animais/grupo
de ensaio	24	24		24	24
Peso inicial (kg)	4,93	5,14		5,12	5,06
Duração do ensaio (dias)	20	20		20	20
Peso no fim do ensaio
(kg)	10,2	11		11,9	12,9
Aumenta de peso (kg)	5,23	5,84		6,78	7,45
Aumento diário (g)	262	292		339	373
Diferença relativa (%)	100	112		130	142
Aumento da ração/ani-
mal/dia (g)	429	465		480	492
Gasto da ração/kg de
crescimento	1,64	1,59		1,42	1,32
Diferença relativa (%)	1C0	97		86,3	80,5
Melhorias:
Aumento diário (%)	-	11,7		29,6	42,4
Valorização da ração(%)	-	3		13,7	19,5
	Exemplo	2
100 1 de	uma susp	ensao de	Torulopsis	utilis e
Saccharomyces cerevisiae (mistura 2:8) com	um teor de substância
sólida seca de 20% no total, são	misturados	com uma	mistura que
contém:
	- 19	_IIH1

kg do produto do exemplo 1

0,05kg de extracto de condriosamas

0,1 kg de glicolato de celulose

0,1 kg de goma arábica

0,1 kg de glucose +· manose

0,1 kg de parabeno

1,5 kg de uma mistura de sais compreendendo cloreto de sódio, sulfato de manganês e sulfato de magnésio, e

0,00001 % de oligoelementos.

A suspensão á agitada e tratada a 20^sC com ultrassons e durante o tratamento com ultrassons é aquecida primeiro a 452C e depois rapidamente (2 min.) até 8Q2C.

A suspensão, depois de arrefecida, é seca por pulverização conjuntamente com 200 g de sílica (aerosol 300) e suficiente nipagina (conservante) num dispositivo apropriado (por exemplo, um aparelho BUchi) obtendo-se por hora cerca de 1,5 kg de um produto sólido.

factor de aumento do ritmo respiratório num ensaio sobre a actividade de aumento da respiração num homogeneizado de fígado de rato foi de 5,1, ensaiado com o produto líquido (antes da secagem por pulverização). No ensaio de cura de feridas determinou-se uma vantagem de cerca de 100% relativamente a um grupo de controle quando se mediu, como descrito, a tensão de partes da pele. Em contrapartida, a levedura de partida era inactiva.

A elevada actividade metabólica do preparado manifesta-se em ensaios de crescimento com peixes e galinhas. Mesmo para quantidades muito pequenas do aditivo numa ração normal (adição de menos do que l^s/oo) a composição origina um efeito de crescimento surpreendentemente alto, que se manifesta por uma considerável economia de ração. Os quadros VI e VII apresentam os resultados.

Quadro VI

Ensaio de crescimento em peixe-espada

Controle Aditivo 0,8QS/oo Aditivo Q,95^g/op

Peso mádio dos peixes novos após dias 1,9 3,7 4,1

Na realizaçao do ensaio 60 peixes jovens foram di vididos no 15^s dia em 3 grupos e foram alimentadas 2 vezes por semana numa quantidade total de água de 5 1 a uma temperatura média da tina de 24,5 ^gC. Dois grupos de peixes receberam 0,8 ou 0,95 2/oo do aditivo do preparado do exemplo 2 repartido por 3 administrações por semana.

aumento de peso é extraordinário e comprova o efeito de promoção de crescimento do preparado.

produto seco por pulverização do exemplo 2 foi ensaiado como aditivo de rações em galinhas Harvard. Um grupo de ensaio constituído por 3600 galinhas foi alimentado durante 60 dias com uma ração enriquecida em 0,1 % em peso do aditivo. Um grupo de controle constituído por 3600 galinhas recebeu ração sem aditivo. Determinaram-se os pesos corporais de 20 galinhas d(> • cada grupo e as mortalidades (quadro VII).

Quadro VII

Ensaio de alimentaçao com galinhas

Dia (Nr.:

10 20 30 40 50 60

Peso do grupo de ensaio (g) 34 209

568 1.110 1.590 2.001 2.090

Peso do grupo de controle (□) 39 246 550 1.100 1.510 1.890 1.990

Neste caso verifica-se um consumo de raçao (kg) por kg de peso corporal para □ grupo de ensaio de 2,27, e para o grupo de controle de 2,65. A mortalidade no grupo de ensaio foi de 4,9%, e a do grupo de controle de 7,7%. 0 valor alimentar melnorado correspondeu a uma economia de ração de cerca de 15%.

Exemplo 3 kg de uma massa de levedura (Saccharomyces cerevisiae) são arrefecidos num dispositivo apropriado a uma temperatura inferior a -132C e condicionados durante cerca de 4h a esta temperatura reduzida. Seguidamente adiciona-se ao produto 500 ml de uma suspensão aquosa que contém 15 g de fructose e sacarose, 40 g de sílica (Si0₂) em partículas finas, 50 g do preparado do exemplo 2 (na base de produto sólido seco), 15 g de parabeno e 160 g de cloreto de sódio; a mistura é primeiramente misturada intimamente e levada à temperatura ambiente (cerca de 2320) formando-se deste modo uma mistura líquida na qual as partículas de levedura ficam em suspensão leve. A mistura é depois arrefecida rapidamente de modo que a subida de temperatura seja de 5^s/3 min. A mistura é aquecida até uma temperatura compreendida entre 45 e 752C, sendo agitada continuamente.

Forma-se uma suspensão líquida da levedura com partículas que facilmente são postas em suspensão e que possui quer como solução global, mas também como centrifugado (sobrenadante e resíduo) um factor de aumento do ritmo respiratório de 4,8.

Exemplo 4 kg de uma massa de levedura (Saccharomyces cerevisiae) são arrefecidos a uma temperatura inferior a -152£. Depois de 24 h adicionam-se-lhes: 10 g de parabeno, 5 g de ácido sórbico, 170 g de cloreto de sódio como conservante e 10 g de sacarose, 15 g de silica, 10 g de glicolato de celulose e 0,8 mg de oligoelementos (Mn, Co, Zn, Mg).

Depois de a mistura ter alcançado a temperatura albiente (25²C) coloca-se, sob agitação, no aparelho de raios laser descrito no exemplo 1 e trata-se com raios laser até que as partículas da levedura se tenham reduzido a menos do que 50% do seu diâmetro antes da acção dos raios laser. Em seguida, sempre sob agitação, aquece-se rapidamente (no máximo 20 min.) até uma temperatura compreendida entre 40^e e 802C, factor de aumento do ritmo respiratório deste produto é de 5,1. Depois da conservação da suspensão esta é seca por pulverização, 0 produto pode ser utilizado como a levedura de partida desagregada biofisicamente nos exemplos 1 a 3. 0 produto obtido serviu para os ensaios de rações, tendo a sua actividade de aumento do metabolismo sido comparável à do exemplo 2, quando se ensaiou como aditivo de ração no ensaio com as galinhas Harvard. Esta actividade na prática conduz a uma acentuada econo23

χ· mia da ração e a um período de alimentação consideravelmente encurtado, o que é compensador economicamente, especialmente para ensaios em larga escala.

Também no caso da alimentaçao de animais para produção de pele, como chinchilas, as composições revelaram-se também como bastante úteis. 0 revestimento de pêlo, passado pouco tempo depois da utilização da composição, torna-se mais brilhante e mais liso. A pele de animais de criação mais velhos ainda é utilizável se estes animais tiverem recebido durante algum tempo a composição preparada a partir de leveduras.

Exemplo 5

500 kg de uma levedura a 20% (Saccharomyces) a chamada levedura 20 er, foram misturados a 20²C com 0,2 kg de parabeno, 0,03 kg de ácido sórbico, 2 kg de NaCl, 0,2 kg de sacarose, 0,5 kg de sílica, 0,3 kg de glicolato de celulose, 0,5 kg de extracto de mitocondrias e 10 mg de oligoelementos, e agitados intensamente com um aparelho Ultraturax utilizado como agitador, de modo que a mistura aquecesse rapidamente. Agitou-se ainda a 55² até 60^eC durante cerca de 10 min. e depois arrefeceu-se. Nos ensaios de rações obtiveram-se resultados de ensaio comparáveis aos obtidos nos exemplos 1 e 2.

Exemplo 6 kg da levedura 20 er (Saccharomyces) foram misturados a 20²C com 20 g de glucose e fructose (10:1) 40 g de alginato, 30 g de extracto de mitocondrias, 180 g de cloreto de sódio, 10 g de ascorbato de sódio como conservante e 1,5 mg de oligoelementos e agitaram-se com o aparelho Ultraturrax mediante uma exposição simultânea a ultrassons, aquecendo deste modo a mistura, sem auxílio de aquecimento exterior, a 55²C, e manteve24

-se entre 52 e por um curto período de temjio que, todavia, não foi superior a 20 min. A mistura depois de arrefecida foi utilizada para promover o aumento da produção de iogurte, senda adicionada ã cultura em menos do que 0,1 % em peso, referido ao peso global do meio de cultura. 0 produto era também utilizável para outros fins na indústria de transformação de lacticínios visto acelerar o crescimento da correspondente microflora»

Claims

REIVIN DIC A_Ç_S E_S

- 1§ Processo para a preparação de composições obtidas de material celular de ascomicetos ou esquizomicetos transformado biofisicamente, com actividade de aumento do ritmo respiratório, caracterizado pelo facto de as células de ascomicetos ou esquizomicetos serem tratados, eventualmente com adiçao de uma substância veicular líquida, por acçao de raios laser, liofilização, tratamento com ultrassons, solicitações de pressão de curta duração e/ou osmólise, por um período de tempo suficiente para que as células sejam convertidas numa massa que pode facilmente ser de novo posta em suspensão, e de se submeter a suspensão das células contraídas a um tratamento por choque térmico intenso de curta duração até à eliminação dos gases formados por fermentação.

2Processo para a preparação de urna composição de leveduras transformadas biofisicamente, com actividade de aumento do ritmo respiratório, caracterizado pelo facto de se tratar uma levedura de partida, eventualmente com adição de uma substância veicular líquida, por acção de raios laser, liofilização, tratamento com ultrassons, solicitação de pressão de curta duração e/ou por osmólise, por um período de tempo suficiente para que as células das leveduras sejam convertidas numa massa que possa facilmente ser de novo posta em suspensão, e de se submeter a suspensão das células de leveduras contraídas a um tratamento por choque térmico intenso de curta duração até à eliminação dos gases formados por fermentação» _ 33 _

Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2 caracterizado pelo facto de o tratamento térmico não deixar as células expostas a uma temperatura superior a 4Q2C durante mais do que 25 minutos.

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o tratamento térmico ser originado directamente com um gás quente que se desloca em contra-corrente.

- 5§ Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 caracterizado pelo facto de a desagregação celular biofísica ser realizada simultaneamente com a acção de tratamentc térmico intenso de curta duração.

- 6s -

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 caracterizado pelo facto de se utilizar como substância veicular líquida uma solução ou suspensão aquosa que contém:

1) 0,1 até 0,5 % de uma levedura desagregada biofisicamente que tenha sido obtida ou de uma levedura que serve como material de partida, e/ou a partir de uma outra levedura, e 0,02 até D,4 % de extracto de condriosomas,
2) 0,3 até 5 % de glicolato de celulose, silica pirogénia finamente dispersa, com mais do que 99,8 % de SiO^ e com um diâmetro de partículas de 7 a 25 nm, carragenano, tragacanto ou cargas semelhantes,
3) 0,01 até 0,3 % de monossacarideos e/ou dissacarídeos fermentescíveis,
4) conservantes, tais como parabeno, e sais como cloreto de sódio, em concentração apropriada,
5) oligoelementos como Mn, Co, Zn, Mg, preferivelmente como sulfatos ou gluconatos.

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 caracterizado pelo facto de se utilizar como material celular de partida uma estirpe da família das Saccharomycetaceae,

- BS -

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7 caracterizado pelo facto de se tratar uma levedura seca com um tsor de HT5 de 95 a 98%, conjuntamente com uma quantidade dupla até quádrupla de uma substância veicular líquida.

- 9- -

Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se obter uma composição de material celular de ascomicetos ou esquizomicetos degradados biofisicamente, possuindo uma actividade de aumento do ritmo respiratório que é susceptível de medição num vaso de Warburg no homogeneisado de fígado de rato standardizado, e que é expressa como o volume de oxigénio respirado adicionalmente do homogeneizado.

- 103 _

Processo de acorde com as reivindicações anteriores caracterizado pelo facto de se obterem preparados de levedura desagregados biofisicamente, com actividade de aumento do ritmo respiratório que é susceptível de medição no vaso de Warburg num homogeneisado standardizado de fígado de rato, e que é expressa como o volume de oxigénio respirado adicionalmente do homogeneizado.

- lis -

Processo de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado pelo facto de se obter um preparado cujo factoa· de aumento do ritmo respiratório a 37²C é pelo menos de 2,0 referido ao homogeneizado, mantendo-se iguais as restantes condi28 ções do ensaio

- 12§ Processo de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado pelo facto de se obter um preparado cujo factor de aumento do ritmo respiratório a 37²C é um valor compreendido desde 2,0 até 10 e de preferência um valor desde 2,5 até 5,5.

- 132 _

Processo de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado pelo facto de se obter um preparado que contém adicionalmente um factor de inibição de L-aminoácido-oxidase, o qual pode ser medido no vaso de Warburg numa solução de ensaio standardizado com o enzima e fenilalanina como L-aminoácido, e que é expresso como a proporção de oxigénio consumido com e sem composição de levedura.

- 142 „

Processo de acordo com a reivindicação 13 caracterizado pelo facto de se obter um preparado no qual o factor de inibição de L-aminoácido-oxidase tem um valor situado no intervala de aproximadamente 20 a 80% e de preferência um valor no intervalo de 30 a 60%.

- 152 -

Processo de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado pela facto de se obter um preparado que possui actividade curativa de lesões.

29 - 16s Processo de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado pelo facto de se obter um preparado que manifesta adicionalmente uma acção RES-activadora.

- 17§ Processo de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado pelo facto de se obter um preparado que influencia positivamente o crescimento de leveduras e outros microorganismos, como por exemplo bifidos, lactobacilo, bactérias tipo cocos e bactérias do solo, e consequentemente promove indirectamente, também, o crescimento de plantas superiores e algas.

- 183 -

Processo de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado pelo facto de se obterem preparados que contêm adicionalmente mitocôndrios extraídos de células animais e/ou vegetais.

- 19^s -

Processo para a preparação de rações caracterizada pelo facto de se adicionar a rações convencionais até 1 % em peso de um preparado transformado biofisicamente, com actividade de aumento do ritmo respiratório, preparado por um processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 18.

- 202 -

Processo para a preparação de soluções nutrientes de plantas, caracterizado pelo facto de estas serem obtidas a partir de água e até 2 % em peso de um preparado modificado biofisicamente, obtido por um processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 18.

Foi inventora Anna Wank, geb, Standel, alemã, residente em An der Apostelkirche 5 III, D-1000 Berlin 30, Repdblica Federal Alemã.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã, em 2 de Abril de 1987, sob ο η², p 37 11 054.3.