PT87065B - Processo para a preparacao de uma vacina contra a pasteurelose - Google Patents

Description

BAD ORIGEM.

j : arneiros e jaèo . ovino . ,;e irscuentemente rode conduzir à ₍ norte, -articularmente no caso ;e animai3 jovens, e deste . modo a prevenoão 2 ? controlo desta ioenoa assumem grande ii importância para os agricultores cue 3e d-dicam à criação le carneiros e gado bovino. '^To caso los carneiros a doença Si aparece coco ue estado de nneumonia ou um estado de septl|i cernia, consoante a idade lo animal infectado e a estirpe [i lo organismo infeccioso, enauanto mu no gado a doença surge Í! primeiramente como ama pneumonia eu regiões coe clixas temperados. ''oram identificados 2 biotipos la haemolytlca,

I , o biotipo A geralv.ente associado com septicemias em cordeiros jovens e pneumonias em carneiros mais velhos, e o biotipo ~ associado geralmente a septicemias em carneiros adultos, e dentre destes 2 biotipos foram identificados 15 sorotipos diferentes (11 sorotipos ”A^W e 4 ^nrH). 0 sorotipo A2 é particularmente importante em relação aos carneiros e o Al em relação ao gado.

F em sido um problema aperfeiçoar a antigenicidade de vacinas comerciais contra a paateurelose. As vacinas para carneiros compreendem varias estirpes de , haemolytica., representando 03 mais importantes dos biotipos e doa seus sub— i

tipo3. À3 vacinas para o gado compreendem também 7. multocij lâ· ‘ s^ecificacào le natente europeia 36 995 A (5orden ~abs.'· 'escreve uma vacina viva de aateurella haeaoly! e muitoeida, atenuada oa^a a tornar menos patogenica j cultivando-a em caídas contendo um composto de acridínio.

'a s: peci.^icnnnc ’.o patente britârlea 2 C2?

i ’’' oechst uma vacir.: ccr/ra ''asteurella haemolytica con! tóm anti_c-n.cs gve se :.'iz starem associados com a cánsula <’a bactéria, ~rerara -ee nr .vrracto deste antigene anuecen— :o a centrifu.-anuo a cul^xura ·? recolhendo o nobrenadante.

I ' .3 células recitítacas não esterilizadas lavadas. ”’anto

BAD ORIG'NAL o sobrenadante como as οβ’Ίββ ~“o ‘ncluPas :ia /acina.

’· patente 'rancesa 13? 5O9A . ellcome) ou a correspondente ratente ^vritânica 1 Ml m, descrevem um com— nonente de vacina το arado α partir le naemolytica ou multocida extraindo uma estrutura de células globais, o lisado, ou um meio de cultura isente le células, cot um alcanol inferior ou uma alcuilcetona inferior ou salting out com um sal, tal como sulfato le auónio para precipitar endotoxinas. \ endotoxina é um componente le lipopolissacarídeo orosente na eársula lo organismo. sobrenadante isanuo le endotoxina é tratado le novo com o lissolvente ou o oal ^coro anteriormente) em elevada concentrado para precipitar a substância antirénica para utilização como componente de vacina.

Outra tentativa de aperfeiçoamento e descrita na patente americana 346 C74 ou na sua eruivalente europeia 2035613 ('lational Oesearch levelopment 'orporation). Tstas patentes referem-se a uma vacina compreendendo como comnonente essencial o extracto capsular, especialmente extracto de sallcilato de sódio, 'o sorotipo Al em combinado com células semi-rortas lo sorotipo A2. o orocesso de extracção as células bacterianas são centrifugacas, pitadas em solução de salicilato de sodio e em seguida ce.ntrifuçadas de novo, e o sobrenadaste é concentrado -or iialise.

ara ura ranorâmica recente sobre vacinacao contra pasteurelose consulte-se ilmour e ^onachie em ''cien ce and ualitv lamb ''roductlon*’ search .'ouncil, ^rTW, 1985) oávs.

oãc fel··as referencias rior depois ^r’c ”cumário l.-.v-⁵ texto não seria claro.

Mrricu.lt'Tal and 'ood e.-*/·» <-* Λ — .-J í > >uicioaais á técnica antemão·; : oue o seu conbad original

4. Ο< Ή 4'

-·| ,ι . ., J.—jj .^3cocrij-se ^.;ora ·;:ΐ5 caanlo ;asteii~ ii rglla são cultivados eu. co.vilrões ie re3tri?ão ’.e ferro, _;j isto é, toruições iie restringem a disponibilidade de ferro ji ao orgar.ismo em menos lo -ue ele recuere rara o rormal cres: cimento ia vitro, a txtracoão da .exorana exterior ou .lo i Usado ie celul-s totais da origem um perfil proteico liji forsnto lo cue e obtido condições de crescimento normal ! in vitro, uue um tal cxtracto e mais ixuno.qênico do oue um i

< 0 o rres oondente extracto de memorana exterior do organismo | cuativado na3 referi-as condições normais ie crescimento, oue esta imunogenicidade melhorada está associada a um roduto proteico produzido om condições de restrição de erro mas não nas referidas condições normais le crescimen— 0. ~ste produto proteico 2 0 produto celular qie 0 contém ”rovaram ter ;rande importância na vacinação le animais contra laateurella, especialmente aaemolytica, rslo menos do mesmo sorotiro. ' novo ^roduto proteico é novo no sentido de ser detectável quando 0 orqanismo é cultivado em condições de restrição do ferro, tas não -uando sle é cultivado condioÕea torrais, isto é, em. condioões de plenitude de ferro, in vitro. ~ imunogénico no 3entido de reagir num enj saio de manc.ua de Imunidade contra □ soro le um animal con- . I í valescente ™.ue cenna recumerado le uma infecoão ror asteu— * ------------------------- i relia lo mesmo sorotipo.

j ' novo rroduto roteioo rode compreender uma ou mais moléculas individuais 2 pode ser uma proteína livre ou uma oroteina limada, tal corno uma ;licorroteina, ? o temo p produto mroteico”, cal como é aoui usado, deverá ser toi ( j mado em sentido lacto como oualauer rroduto cue d? orlge™ a bandas de peotíàeo cor electroforese cm gel ao extracto de membrana exterior sue 0 conte’®. ' novo produto proteico é conveniente.r.entâ designado aaui como ama proteína de resbad original (( trição de ferro** ou ^TP.^T”*.

Ίί

I De acordo cot um asrecto ímortants da j-ivenrao ( revela-se nor conseuilnt® uma mro^elna ’e estrição Is ferro Íi ^de '--aa te tire 11a, eeneclalnent? ⁿ. aemolptlca, como sendo um i produto nroteíco nreeente ''e isolável de'* em ^astcnrella i cultivada ea condições de restrição de “‘erro, iras não isolá( vel de asteurella cultivada em 'Or.dioóes -ormais 'não res— !' tritas em ferro) tr. vltro, e ue rec e num ^nsaio de mancha ij de imunidade contra soro de um animal convalescente cue ( tenha recunerado ie uma infeccão oo” ^asteurella do mesmo sorotlpo.

stão abrangidas rela Invenção células totais inac— tivadas de asteurella cultivadas »m condições de restrição de ferro, inc uindo ''bacterina, com □ objectivo de preparação de uma vacina.

A invenção revela adicionalmente uma vacina morta contra asteurella, esoecialmente Ά haeaolytica, comnreen— dendo uma proteina de restrição de ferro como definida acima e um adjuvante.

ambém ee enauadram dentro do âmbito da invenção anticorpos, especialmente anticorros rnonoclonais, incluindo anticorpos anti-idiotlno.

”os países c”· ~ue tal proteccào seja permitida, es— pecialmente os “ζά'οπ ”nidos, a .'.ustrálla e a Nova '-'elândia, a invenção revela rar.bec um. método de vacinação de um animal contra as^eurella, especialmente haemolytica, o í rual compreende a administração a um animal susceptível de [ infeccão *όγ asteurella :e j.ma quantidane proxilaticament· ( eficaz de u:. produto ;roteíco ou ie na vacina» tal como i( foram definidos -ci a. invenção inclui ainda um método (i de imunita^ãc ;a*ci-za ao --al são administrados ao animal anticorpos ao rc.dor Lio /roiutu proteico.

BAD ORIGINAL ; fescri^ão adicional · . técnica antericr

I ^: fabe-se ^r'U3 a Bactéria difsrenta scherichia coli ί se.Tega nroteinas ”ue a'arece.T num extrncto 'e membrana ex- terior ’.e coli cultivada e.m condições d? restrição de ij ferro» mas r.ão e~ condições normais de presença de ferro, Π in vidro. cor.dicoes 13 restrição le farro o organismo i; parece convertar-se num -?ne 'le-repress) normalmente repri— mido, nue exprime uma roteina na sua membrana exterior que ( auxilia a cantação de ^;’?rro. termos simules, cuando a i célula da bactéria ·.' ie3 provida lo seu nróprio fornecimento de ferro, reage para tentar aumentar o seu fornecimento produzindo uma proteína ?ue actua como receptor para um captador le ferro (conhecido por sideróforo) tal como enteroquelina. As condições de restrição de ferro podem ser criadas artificialxente adicionando um bom quelante de ferro, tal como X,Λ-biniridilo (também designado -x ,o(—iipiridllo) ao meio de creocimento las células, sendo deste modo a célula estimulada para produzir a nroteina receptora de ferro. Ver por exemplo 7. Griffiths et al, picrobiology letter

16, 95-99.(1933) a Tnfectlon an Inr.unitv 17, 303-313 (1935). A introdução na -eferência menciona al puns outros organismos nue se sabem segregar enteroquelina em condições de restrição le ferro, incluindo uma espécie galmonella que produz novas nroteinas d? membrana exterior. ~speculou-se na referência ^?7 3 -ue is proreinas receptoras de ferro de membrana exterior podem ictuar co;. o factores de virulência no .entido ^qe auxiliarem uma bact?ria patogénica a adquirir ferro de modo cue sobrevii-aria por lon.;o tempo no hospedeiro e prolongaria l-ste ,:;odo infecqào. 3 escobriu-se que V coli patopênica, recuperada le çobaias infectadas letalmente, continham 3 proteir.u.s .1? 'estrição le ferro como componentes principais !o extract: de membrana ?xcerior. 3^ro no entanto evidência le cue outras bactérias nroàuzam novas proteínas

BAD ORIQINAk i de membrana exterior -”n res-oe**! ò. restrição de ferro^ ’ ou cue estas orotelr.as tenhatr -ualorer valor como comronenh tes de 7acina.

ii De zcordo com . Λ. ;olin et al, infection and <; Immunity 5^ 'n$. ô) 1229-1242 'Faio de 1937) o rapei de i ??.’Γ3 regulados ror ferro :e ~. ooli coro antigenes protectl703 nâo ''ai ieterminado “reviamer.te. 3tes autores referem rie a imunização pasriva com anticozoos contra c: Ps regula— ¹ ji tos or *erro protegeram 'eru3 contra septicemia de P. coll.

^Tma panorâmica dos métodos de produção de bactérias restritas em Perro foi dado por '. Stevenson e 2. driffitbs na secção ae .etodologia de he Tirulence of lachericnia coli, 'd. -.. Suesoan» Society for General Ίcrobiology Special uolicatlon na. 13, Academic hcess (1985) páge. 413 a 417.

A. orovlst et al. > Yicrobiol. Letters 4,

I 71-75 '1'73) relatam que a carência de 'erro de 5eisseria gonorrhoeae produz novas bandas de proteína em electroforeae em gel de um extracto de membrana exterior.

t 'atente mericana 1 5?1 751 (’ietzner et al,) depositada em 21 de Tuibo de 1937 descrave uma proteína crinclpal regulada 'cr ^rerro de ~. gonorrhoeae e o seu uso como constituinte ie vacina. ' 3eu peso molecular é de cerca e 37 ‘cfal e é oroduziia “ela acção Io detergente catiónico Prometo ie cetil-trimetilamc'lo p.ra eolubilizar aelectiva— rente ο ΙΡΓ das membranas do gonococo.

ieDois de e fazer passar faeteurella multocida muitas vezes (mais de .? ¹ .um ~eio deficiente em ferro no— tou-se mie tinha diminuído a sua virulência (sic) quando medida peio valor em ratos, e num doe casos também uma ciminuição de imunogenicidade, ver flosemann et al, eitschrift fiir Àllgemeine ikrobiologie 24, 231-237 '1954). fsca referência parece poie fornecer um caso negaBAD ORIGINAL

- 3 I tivo em relação à invenção. Em oualquer dos casos a invenção não se refere à atenuação por passagens repetidas.

J. Gentry et al, Amer. J. Vet. 3ea. 47, 1919! -1923 (1935) estudaram i orodução ie cltotoxina nor haemo· I lytica Al em vários meios contendo compostos ^errosos e compostos surcertívels de Uxar ferro, e concluíram oue uma certa uoncentracão mínima Ie ferro, bem como a nresenca de uma molécula veicular anro^riada fsideróforo) rodem ser críticos rara a rroducào eficiente le citotoxinas por . hae—

I molytlca.

\ T-and et il, Tnfection and Tmmunity 43, 35-39 (1935) cultivaram bactérias ;ram-negativas isoladas de urina humana em condições lo suficiência le ferro e restrição de ferro, oxtrairam proteínas da membrana exterior (0'tys) e compararam js seu3 perfi3 por electroforese em gel. Algumas CfEs de alto peso olecular estavam presentes apenas quando se usaram condieões le restrição de ferro. Eram fracamente imunogénicas nuando ensaiadas em mancha de imunidade contra soro lo paciente, ira 2 los organismos, TLebsiella pneumoniae ? roteus mirabilis, estas *3 exclusivas 'e condições le restrielo lo ferro foram determinadas também nas mesmas bactérias, suando cultivadas em urina de pacientes que sofriam de infecções do tracto urinário.

. Anwar et al, ITfS icrobiology Letters 29, 225-230 (1935) mostraram cue quando se cultiva seudomonaa aeruginosa em condiçoes de exaustão de ferro encontram-se pelo menos 5 proteicas de alto peso olecular no perfil de 0’E? que em geral não estão presentes. ^r’m paciente sofrendo de queimaduras e, coo consequência, de infeccao aguda por ?. aeruginosa produziu anticorpos 01Ps, incluindo uma destas proteínas de membrana e . restrição de ferro. artigo refere que se estas descobertas foram confirmadas nor investigações posteriores, noderão ter importância no projecto de vacinas

BAD ORIGINAL coe proteínas protectoras e na inunoterapia d· pacientas com queimadura» infectados por P. aeruginosa.

Breve descrição dos desenhos anexos

A fig. 1 é uma secção através de uma estrutura de parede celular de Γ. haemolytica mostrando a membrana exterior, a fig. 2 mostra perfis de electroforese em gel corados, de oroteinas obtidas a partir de extractoe de membrana. exterior de Έ haemolytica sorotipo A2, cultivadas ea condições normais e condições de restrição de ferro, a fig. 3 mostra um teste de mancha de iaunidade de proteínas de baemolytica A2 a partir d- um gel seaolhanto à fig. 2 contra soro de cordeiros convalescentes infectados com P. haemolytica A2, a fig. 4 mostra perfis de electroforese em gel corados de proteinae obtidas a partir de extractos de membrana exterior de 5 sorotipos diferentes de P. haemolytica;

as figs. 5 e 6 são análogas às figs. 2 e 3 respecti▼aaente, maa referem-se a ~L multocida, e a fig. 7 é um teste de mancha de iaunidade de una IRP de acordo com a invenção contra soros de cordeiros convalescentes, não infectados e vacinados.

Descrição ias variantes preferidas

X invenção é anlicável a organienoe P. haemolytica do biotipo Λ ou ”, mas o biotipo A é o mais importante epideaioloqicamente. Dentro do biotiro A o sorotipo A2 é.o aais importante na vacinação de carneiros e o Al na vacinação do gado bovino, resentemente nropõe-se formular a vacina para

BAD ORIGINAL

- 10 uso com o sorotipo homólogo, isto é, um IRP derivado do. sorotipo A2 deverá ser usado para proteger contra infecções i por A2. Crê-ee com confiança que dentro de um determinado I sorotipo uma LRP derivada de uma estirpe protege contra infecções pela outra estirpe. Deste modo a invenção inclui uma vacina polivalente contra IPPs de todos os sorotipo* patologicamente importantes de Pasteurella. ^ra os carneiros esta inclui pelo menos o sorotipo A2 e também preferivelmente pelo menos Al» A6, A7 e A9. Para o gado bovino inclui pelo menos o sorotipo Al s de preferência também pelo menos A2 e Γ. Lultocida.

A principal IRP para 7. haemolytica sorotipo A2 tem um peso molecular de aproximadamente 70 000 Daltons, determinado por electroforese em gel. 0 peso molecular do IRP principal para os outros aorotipoe A de haemolytica e de ?. arultocida parece eer da mesma ordem de grandeza.

Outra TRP tem um peso molecular de cerca de 30 a quilodaltons e é aoui designada abreviadamente como pro teina 35 kDaltons·. outras IBPs minoritários com outros pesos moleculares incluídas no âmbito da invenção.

\ exigência principal para a vacina é aue ela contenha pelo menos uma TRP de um organismo Pasteurella. A TPP pode ser fornecida em mui'as formulações diferentes· Por exemplo, pode ser formulada uma vacina de células totais na qual as células de ^rasteurella cultivada em condições de restrição de ferro são mortas por tratamentos com formallna (formaldeído aquoso) ou calor, por exemplo a 60°C durante 20 minutos, ou (a título de precaução) por ambos os métodos. É particularmente preferida uma preparação de bacterina (bacterlnas 3ão células totais mortas ccm formallna conjuntamente com toxoides associados). Como alternativa pode ser utilizado qualquer método le ^xtracção por meio do oual se isoleis oroteinas de membranas exteriores. Pm método simples

BAD ORIGINAL

- 11 β extrair os invólucro· celulare· que contêm a membrana exterior. Eatee invólucro· pode· ser isolados submetendo as células a ultrassons. Uta método preferido de extracção é a extracqão capsular, que extrai a cápsula do organismo.incluindo a membrana exterior. Um método útil de extracção capsular é anuele no qual se usa ealicilato de sódio: ver Patente Americana 4 346 074 ou Patente Puropeia 20356B referidas anteriormente.

\ título de explicarão da terminologia utilisada para descrever o organismo ^steurella, ver a flg. 1 dos desenhoa anexos, mostrando uma secção transversal esquemática através da parede celular do organismo. Com referência ao desenho:

l^w indica a cápsula de polissacarídeos, ”2· indica a membrana exterior incorporando lipopolissacarídeoe (LPS·);

^w3 indica a camada de -»eptldoglicanos rígidos ligados à membrana exterior através da llpoproteina (ⁿLP*) e de proteína (*), *4 indica a membrana interna incorporando fosfolípidos (PI”), indica o invólucro,

6· indica o citoplasma.

*’m extracto capsular contém na prática mais do que a cápsula 1. Deste modo, por exemplo, um extracto de salicilato de sódio (33Σ) extrai a cápsula 1, a membrana exterior 2 e a camada de peptidoglicano 3.

evidentemente uossível isolar a IR? e usá-la tal qual, por exemplo preparando um anticorpo monoclonal (KCA) para ela, por tecnoloria de hibridoma convencional, por exem pio utilizando fusão de células de baço de rato-mieloma de

BAD ORIGINAL

- 12 rato* e ut 111«ando subsequentemente o L'CA (imobilizado sobro usa coluna) para Isolar & TRP do extractos celulares, e recuperando em seguida a IRP da coluna·

Também podem ser produsidos anticorpos contra os anticorpos monoclonais ou pollclonals à IRP e estos anticorpos são conhecidos como anticorpos anti-ldiotipo o podo· ser oleo próprios monoclonais ou pollclonals. Os anticorpos anti-ldiotipo são escolhidos do modo a terem propriedades imunogénlcas semelhantes às do uma ou mals das TRPs originais.

Ao formular a vacina o produto proteico pode sor combinado com qualquer dos adjuvantes usuais em vacinas veterinárias, tipicamente os que são baseados em compostos de alumínio. 0 adjuvante de gel de hidróxido de alumínio Alhydrogel (que se crê ser uma marca registada em alguns países) é especialmente apropriado. De preferência o produto antigénico é absorvido sobre o Alhydrogel* e a suspensão resultante é eventualmente emulsionada com um óleo apropriado· tal como Bayol F contendo preferivelmente 10$ do Arlacel A”. Os termos ”Bayol^w e Arlacel crêem-se sor marcas registadas. A vacina pode também incluir outros componentes, por exemplo um conservante.

A concentração do produto antigéaieo na vacina pode ser variada como pretendido· por exemplo de acordo com a taxa de dosagem da vacina, e a este respeito a dose normal usada está geralmente compreendida entre cerca de 1 a 2 ml. Geralmente cada dose de vacina compreende 0,1 a 20 mg do pro duto antigénico, especialmente de 0,5 mg até 10 mg, por exe» pio cerca de 5 ag» do produto antigénico de cada sorotlpo incluído na vacina.

Para prevenção e controlo da pastourelose· por exom pio, para utilização em manutenção de animais da agricultura, as vacinas de acordo com a invenção são administradas

PA D ORIGINAL a anisais adultos ou jovens, por exemplo.carneiros ou gado bovino* geralmonte na forma de uma lnjecção subcutânea. Os animais podem ser vacinados imediatamente após o nascimento para proporcionar aos animais protecção contra a pasteurelose nas fases iniciais da sua vida. A vacinação pode também eer realizada em períodos particulares do ano para conferir protecção contra surtos sezonals correntes de Pasteurelose. Por exemplo, rebanhos de carneiros podem ser vacinados no fim da primavera ou nos dias próximos com vacinas ds acordo com a invenção compreendendo produto antigénico de sorotipo A de P. haemolytica para conferir protecção contra surtos de pasteurelose pneuaónica que ocorrem correntemente em rebanhos de carneiros durante o verão. As ovelhas prenhes também podem ser vacinadas.

Também é possível a imunização passiva por anticorpos a IRPs* particularmente quando ocorre ou se espera um surto da doença.

A invenção revela adicionalmente um processo para a preparação de um componente de vacina que consiste* ou inclui* uma IRP, compreendendo o referido processo a cultura de Pasteurella num meio nutriente desprovido de ferro disponível* fazendo-ae deste modo o crescimento das bactérias a uma velocidade mais lenta do qus a normal* e eventualmente lnactivando-se a bactéria ou extraindo das células produto compreendendo proteínas de membrana exterior.

A proteína com 70 kDal pode ser isolada de lisados de células totais ou de extractos de membrana exterior. A proteína com 35 kDal, no entanto, só foi isolada de células totais, mas deverá ser possível isolá-la de um extraoto apropriado. Também deverá ser possível preparar estas proteínas por um método de DHTA recombinante, utilizando anticorpos monoclonais para detectar a sua translacção de mRWA* e identificar deste modo clones de cDITA· A invenção engloba estas proteínas por si só» quer sejam preparadas ou sinteti sadas» química ou blo tecnologicamente» isoladas ou fundidas conjugadas ou complexadae com outras proteínas compatíveis» e isoladas de qualquer modo» mas preferivelmente do modo que estejam isentas do associações com produtos celulares vivos.

As células podem ser cultivadas em qualquer seio apropriado para o crescimento normal de ^aateurella mas que tenha sido tornado deficiente em ferro. Os exemplos destes meios de crescimento normal são caídas com base em digeridos de carne, tal como GTBCO ηβ. 2, OaOID, infusão cérebro-coração ou calda de tripticase-soja. -ara tornar o meio deficiente em ferro pode ser usado qualcuer nuelante ou aglutinante de ferro desde que seja cc-ratível com o cresci· mento de bactérias Pasteurella em cultura. Oa exemplos de quelantes de ferro apropriados são alfa, alfa-bipiridilo de fórmula:

ácido nitrilo-triacético de fórmula certos compostos do ácido etilenodiamino-acético tal como o ácido dietileno triamino pentaacético (DP^r”^A.) de fórmula

BAD ORIGINAI.

N-CH«CH--1í-CH_oCE,-!f / I \ hoocch₂ ch₂cooh ch₂cooh e desferrioxasina de fórmula

HO O O HO O O HO O

HO O (í ob sais ou derivados de qualquer destes compostos que não interfiras com a sua acção quelante). 0 o» tanoesulfonato de desferrioxasina existe coserclalmente coa a sarça Desferal* (crê-se ser uma marca comercial registada) da Ciba-Geigy AG, coso um antídoto para o envenenamento por ferro.

Deve no entanto ter-se cuidado para não utlllear um agente quelante que ligue outros elementos essenciais à sobrevivência da bactéria coa preferência ao ferro. 0 EDTA, por exemplo, é desaconselhado sob este ponto de vista. 0 agente quelante correntesente preferido é o alfa» alfa-blplridilo.

As proporções do agente quelante a usar deves ser cuidadosamente controladas. Utaa concentração desasiado elevada deixa as bactérias tão desprovidas de ferro que não cresces em absoluto. Uisa quantidade insuficiente persito crescimentos merasente normais. Em tersos genéricos a taxa óptiaa de crescimento.que se deverá procurar é aquela em que há usa multiplicação da cultura de bactérias de pelo menos 10C veses a concentração inicial em 6 horas quando é incubada a 37°C em agitador. Na ausência de um agente de restrição de ferro usa multiplicação típica nestas condições deverá situar-se em aproximadasente 1C00 veses. A conBAD ORIGINAL ‘

- 15 ' centração óptima do agente quelante pode aer determinada rapidamente por ensaios simples com base nestes critérios. Para o alfa, alfa-bipiridilo está compreendida entre 80 e ; 200 mlcromolar, preferivelmente entre 100 e 200 micromolar.

Para o DEPTA situa-se em cerca de 25 e 500 micromolar, de preferftncla de 50 a 200 micromolar.

Como é óbvio, pode ser empregue qualquer outro meio de provocar escassez de ferro, não havendo necessidade de usar um agente quelante no meio no qual a bactéria é culί tivada, Por exemplo, o meio poderia ser tratado previamente para remover ferro por meio de um permutador de iõee, por exemplo Chelex 100* da Biorad, e adicionar-se uma concentração baixa bem definida de ferro ao meio»

Outra possibilidade é usar um meio de crescimento de bactérias natural que já contenha proteínas que ligam ferro. Deste modo, poderá ser utilisado um soro do mamífero, tal como soro de cavalo, adequadamente diluído se necessário.

As células podes ser cultivadas de qualquer modo em condições normais aplicáveis a Paateurella, por exemplo ao ar, sem agitação, a uma temperatura compreendida entre 25 e 41°C, preferivelmente cerca de 37°C.

A invenção é aplicável a muitas espécies diferentes de Paeteurella, incluindo P. haemolytica, multoclda, P. piscicida e P. anatipestifer. A vacina pode ser utilisada para a profilaxia de qualquer das doenças associadas com Paeteurella, por exemplo, qualquer das seguintes doenças causadas por P. haemolytica: pneumonia em carneiros, gado bovino, veados e cabras, septicemias.em muitas espécies de animai·, qualquer das seguintes doenças causadas por P. multocida: pneumonias em porcos e boia, rinite atrófica em i porcos, cólera de aves em galinhas, perus e patos, encefalo' mielite no búfalo, e dificuldades respiratórias e pneumonias ¹ em pequenos mamíferos tais como hamsters, coelhos e martas;

BAD ORIGINAL

- 17 bem como doenças em patos, causadas por u, anatipostifer e em peixes causadas por 7. piscicida. Em cada caso deverá ser usada normalmente uma IRP da espécie e tipo homólogos.

Os exemplos seguintes ilustram a invenção.

Exemplo 1

Preparação de extractos em salioilato de sódio

Cultivou-ee ?. naemolytica A2 em cultura estacionária durante 6 horas a 37°C em GIBCO JTutrient Broth n®. 2 (um digerido em tripsina de coração de vaca) cçm · sem a adição de alfa, alfa-bipiridilo numa concentração do 150 micromolar. A concentração final das célula· era do cerca de 10 células/ml no caso do croecimonto normal, e 10 células/ml no caso de crescimento em restrição do forro, no meio contendo alfa, alfa-bipiridilo. As célula· foram aglutinadas por centrifugação e eliminou-se.o líquido sobrenadante. As célula· foram lavada· em solução do cloreto do sódio tamponizada por fosfato, pH 7,4 (PBS^W) poetas do novo em suspensão num décimo do volume de salioilato de sódio aquoso 1 M, agitou-se vigorosamente 3 horas a 37°C, cen— trifugou-se e removeram-se os resíduos celulares. 0 extracto resultante em salioilato de sódio (*SSE*) foi concentrado por ultrafiltração através de uma membrana de exclusão que permitia a passagem de produtos de baixo peso molecular (de p.m. 100 000 Daltons ou inferior), ffesta fase a IKP estava na forma de agregados que foram retidos pela membrana. 0 produto retido foi concentrado 10 vezes, por exemplo de 300 ml até 30 ml. 7oi depois dialisado contra PBS e depois contra água destilada a 4°C. 0 produto foi liofilisado, obtondo-ee um sólido branco leve.

^reparação da vacina e experiência

Foram preparadas vacinas do seguinto modo. 0 lio

BAD ORIGINAL

- 18 filisado de SSE de Γ. haemolytlca cultivada com e sem restrição de ferro, preparada coco descrito acima, foi homogeneizado com uma parte igual em peso de Alhydrogel* adjuvante e com água destilada até uma concentração de 2,5 mg de SSE/ml de vacina· Vacinaram-se cordeiros do 3 semanas do idade especificamente livres de patogénicoe (SP?) no dia 0 e foram revacinados no dia 28, de cada vez com uma doso de 1 ml de vacina, seguidamente foram infectados lntratraqnealmento e intranasalmente com virue de gripe tipo 3 (PI3) (10^ TCIDjjq/íbI) no dia 35 e um aeroeol de estirpe P. haomolytica A2 x 205 A (aproximadamente 4 x 10? cfu/1) no dia 42. Usaram-se outros cordeiros SP? do 3 semanas de idade como controlos não vacinados· (PT3 é um indutor bem conhecido de P, haemolytlca experimentalmente)·

Os cordeiros foram observados durante 6 dias (dias 43-48) depois da exposição ao aerosol de ?· haemolytlca e registaram-se as avaliações clínicas do grau de doença sofrida. Dos 28 cordeiros, 13, 6 no grupo de SSE sem restrição de ferro, o 7 não vacinados, morreram ou foram mortos por causa de doença eevera dentro de 6 dias ou ameaça· Os cordeiros restantes foram mortos por ordem indeterminada no dia 49 e examinaram-se os pulmões de todos oe cordeiros.

Os resultados obtidos são indicados adianto no quadro 1. Como se pode ver os resultados foras excelentes, sendo conferido aos cordeiros um notável grau de protecção pela vacina de acordo com a invenção.

BAD ORIGINAL

7«. de cordeii Crupo	9«. de roa cordeiros mortos	9«. de cordeiros com lesões pulmonares	99. de cordeiros com pulmões infectados
SSE IRP (de acordo com a invenção)	3	0	0	0
SSE (comparação)	13	6	9	3
Controlos não vacinados	7	7	7	7
Exemplo 2
C efeito	de	restrição de ferro sobre a	antigeniei-

dade de P. haemolytica A2 foi examinada por SDS-PACE e mancha de imunidade. Cultivaram-se células de ⁿ. haemolytica (eatirpe x 205) em calda nutriente GIBCO n®. 2 (9b) contendo •Besferal, em 9b contendo ,^-bipiridilo (AABP) e em 80¼ de soro de cavalo/20% de BPS, como descrito no exemplo 1. Preparam-se a partir das células bacterianas invólucros (material da parede celular contendo proteinas de membrana exterior) pondo-as de novo em suspensão em água destilada e submetendo-as a ultrassons durante 6 x 30 segundos num aparelho MSE Sonicator. As células nào desagregadas foram removidas por centrifugação a 2000 g durante 20 minutos. 0 sobrenadante foi centrifugado a 40 000 g durante 45 minutos para aglutinar os invólucros» que foram depois lavados 2 veses em água destilada·

Para fins comparativos foram obtidas célulss da mesma estirpe ?. haemolytica A2 cultivadas in vivo· a partir do líquido da pleura de cordeiros especificamente isentos de patogénios (SPP) que tinham sido expostos a um aeroBAD ORIGINAL sol da mesma estirpe A2 e que tinham desenvolvido pneumonia com exsudado da pleura. 0 fluido da pleura foi removido do tórax aberto com uma pipeta esterilizada de 25 ml e puderam obtsr-ββ aasim entre 10^r e 1000 ml do fluido. Este fluido foi depois centrlfugado a 1000 g durante 10 minutos para, remover glóbulos vermelhos sanguíneos o outras partículas indesejáveis no fluido. As células bacterianas foram aglutinadas por centrifugação a 3000 g durante 20 minutos. Estas células foram lavadas 3 vazes em soro fisiológico isotónioo e guardadas a -20°C.

As diversas preparações foram submetidas a SDS-PAGE utilizando um gel aglutinante a 3% de acrilamida e um gel de separação a 12,5$ de acrilaalda. 0 gel foi corado com o corante asul de Coomassie.

tra são

Reforindo-nos agora à fig. 2 dos desenhos que moe— IR? nova da invenção. As pistas o gel, a seta indica a as seguintes:

Invólucros de células

A2 cultivadas in vivo.

3.

4.

Invólucros de (comparação).

Invólucros de a 80$.

células células células

A2

A2 cultivadas cultivadas

Invólucros de te + AA3P ('OO micromolar)

A2 cultivadaa em em em calda nutriente soro de cavalo calda nutrienInvólucros de células A2 cultivadas te + Desferal (2 mg/ml).

em calda nutrien·

Yarcador de pesos moleculares do acordo com o quadro adiante.

Oa marcadores de peeo molecular foram os seguintes:

Número	Componente	^eao molecular
1	-galac t os idase	116 000
2	Posforilase b	97 000
3	Ovotransferrina	76-30 000 (banda larga)
4	Albumina	65 250
5	Ovalbumina	45 000
6	Cuiaotripsinogénio	A 25 700
7	kioglobina	17 200
3	Cltocroma C	12 300

^ode ver-se que a IRP aparece nas pistas 3» 4 e 5» onde as células foram cultivadas em condições de restrição de ferro» e que há usa banda esbatida na pista 1 (nota: a banda a cerca de 30 000 Daltons nas pistas 1 a 5 não é evidentemente a IRP 35 kDal referida acima e nos exemplos 5 e 6).

Para o ensaio em mancha de imunidade foram obtidos soros convalescentes de cordeiros SPF que tinham sido expostos aos 2' aerosoie da mesma estirpe Â2, com um intervalo de 4 semanas entre estes contágios. Os soros foram tomados uma semana depois da 2*. exposição. Provaram ter títulos elevados de anticorpos contra P. haemolytica A2 num ensaio imunosorvente ligado a enzima específico (ELISA).

Ae bandas de gel, como as referidas acima para a fig. 2, foram transferidas para uma membrana de nltrocelulose por electro-absorção. 0 filtro de membrana do nitrocelulose com as proteínas a ele ligadas foi cortado em tiras e levado a reagir com os soros convalescentes diluídos a 1 para 40 em tampão (blot wash buffer) (TBSA^^YN 80/EDTA/ /NaCl). Λ interacção antigene-anticorpo foi detectada lavando as tiras no tampão» embebendo-as em TgG de coelho

12*5 anti-carneiro marcada com T, lavando em blot wash buffer e autoradlografla. Referlndo-nos agora à fig. 3 na

I qual as pistas correspondem às pistas 1 a 5 da fig. 2, vd-ee i que a IPP reagiu positivamente em todas as pistas relevantes i (1» 3, 4 e 5) mas não reagiu na pista de comparação 2. Isto i Índica que a TPP está associada com a alta antigenicldade das preparações de acordo com a invenção.

Exemplo 3

PtiUsando o processo do exemplo 2, preparam-se invólucros celulares de ?. haemolytica sorotlpos Al, A2, A6, A7 e A9 cultivadas em calda nutriente· com e sem x^<-blpiridilo (AABP). Foi também incluída uma amostra de A2 *ln vivo*» preparada como no exemplo 2. Realizou—ae SDS-PAGE como no exemplo 2 para produzir os geles mostrados na flg.

4. A ssta aponta a banda principal de ΙΉΡ e a Identificação das pistas é a seguinte:

1. Marcadores de peso molecular como no Exemplo 2.

2.	Invólucros	de	células	A2	cultivadas	in	vivo.
3.	Invólucros	de	células	A9	cultivadas	em	calda	nutri-
	ente + AA3P.
4.	Invólucros	de	células	A9	cultivadas	em	calda	nutri-
	ente.
5.	Invólucros	de	células	A7	cultivadas	em	calda	nutri-

ente + AA3P

6.	Invólucros de células ente.	A7 cultivadas em	calda	nutri—
7.	Invólucros	de	células	A6	cultivadas	em	calda	nutri-
	ente + AABP.
3.	Invólucros	de	células	A5	cultivadas	em	calda	nutri-
	ente.
9.	Invólucros	de	células	A2	cultivadas	em	calda	nutri-

ente + AABP

- 23 ιί

I

10.	Invólucros ente.	de células	A2 cultivadas	em calda nutri-
11.	Invólucros	de	células	Al	cultivadas	em	calda	nutri-
	ente + AABP.
12.	Invólucros	de	células	Al	cultivadas	er	calda	nutri-

ente.

13. ''arcadores de peso molecular como no exemplo 2.

Pode ver-se que o peso molecular da IR? é aproximadamente o mesmo em todas as pistas que representam células cultivadas em condições de restrição de ferro (pistas 3, 5» 7, 9 e 11) e também ocorrem na pista 2 de A2 in vivo* teste de mancho, de imunidade pelo processo do exemplo 2, mas contra soro convalescente apenas do sorotipo A2, mostrou que apenas a IR? de A2 reagiu. Isto sugere que embora as TRPs principais tenham aproxixaadamente o mesmo peso molecular. 3ão específicas do sorotipo.

Exemplo 4

Este exemplo mostra oue as IRPs também são produzidas por 2 sorotipos ” de ?. haemolytica.

reparam-se invólucros celulares pelo processo do exemplo 2, a partir de haemolytica TIO cultivada em soro de cavalo a 30$/20^ de e em calda nutriente GT3CO n®. 2 (Nb) contendo 2 mg/ml de ”?esferal, e a partir de ?. haemolytica T15 cultivada er 30* de soro de cayalo/20% de e em Nb contendo A.A3P a 200 uM de concentração. Realizaram-se SDE-^ACE e a coloração como no exemplo 2, conjuntaasnte com uma preparação de invólucro de células A2 do exemplo 2. As amostras do tipo ” arresentavam bandas novas ou significativamente mais densas na r- ião de peso molecular 70 kDal.

0AD ORIGINAL

- 24 Exemplo 5

Cultivou-ee a estirpe ^fcsteurella multocida tipo A em 50 ml de calda nutriente* com e sem AABP 150 micromolar, durante 13 h a 37°C. Ae células foram recolhida· por centrifugação, lavadas uma ves ea TBS, pH 7,4» poeta· d· novo es suspensão em água destilada e submetidas a ultrassons. As células completas ainda restantes depois do tratamento ultrassónico foram aglutinadas por centrifugação a 2300 g e o sobrenadante foi centrifugado a 40 000 g para aglutinar os invólucros celulares. Os invólucros celulares foram ajustados a 1 mg/ml de proteína e separados por SDS-PAGB em geles de resolução a 12,5^ de acrilamida. Depois da electroforese uma parte do gel foi corada com azul de Coomassie, enquanto a outra porção foi submetida a T/estern-blott para transferir as proteínas para papel de nitrocelulose. 0 material transferido foi submetido à reacção com soros de ratos qu· tinham cápsulas contendo ?. multocida tipo A viva implantadas na sua cavidade peritoneal a fim de estimular anticorpos às células de multocida cultivadas in vivo.

A fig. 5 mostra os geles electroforéticos para marcadores de pesos moleculares (tal como se fes no exemplo 2) na pista 1, a preparação obtida a partir de P. multocida cultivada em calda nutriente (cultivada sem AABP) na pista e a preparação de multocida cultivada com AABP na pista 3. A pista 3 mostrou uma banda fracamente corada na região de 70 kDal presente na pista de Invólucros celulares cultivados com AABP, mas nao presentes no mesmo grau na pista dos invólucros de células cultivadas em calda nutriente. ensaio de mancha de imunidade de invólucros cultivados em ΑΛ3Ρ como se mostra na fig. 5, com as pistas 2 e correspondentes às pietas 2 e 3 da fig. 5, e diferentes marcadores de pesos moleculares na pista 1, apresentou na mesma região de peso molecular, cerca de 70 kDal, ua du

BAD ORIGINAL blsto com Intensa reacção imune, não presente na pista dos invólucros cultivados em calda nutriente. Estes são atribuii dos a IRPs. Este resultado e semelhante aos obtidos para ?. haeaolytica A2. Uma banda manor, a cerca do 35 kDal, também é exclusiva do ensaio de mancha de imunidade para invólucros cultivados em AA3P, isto é, não está presente nos perfis de invólucros cultivados em calda nutrientf. Isto é considerado como sendo a IRP minoritária da invenção, ue é descrita como tendo pesos moleculares de cerca de 30 a cerca de 35 kDal.

Exemplo 6

Este exemplo refere-se à identificação· axtracção e análise antigénica da proteina 35 kDal em células de ?. haemolytica cultivadas em condições de restrição do ferro.

Células de P. haemolytica 12 (estirpe T 510) foram cultivadas em calda nutriente GIBCO n®. 2 com e se* a adição do AABP.150 micromolar. As células foram recolhidas pçr centrifugação é lavadas em PBS (pH 7,4) antes da utilização na vacinação.

P.ealizou-se. a i o dação das células totais com iodo radioactivo em condições que favorecem a lodação das proteínas superficiais· isto é, a baixa temperatura· com tempo de reacção curto o utilizando células log phase* lntactas. Deste modo fizeram-se reagir 5 minutos à temperatura ambiente uma Pierce Iodobead (cloramina 7 imobilizada sobre uma fase sólida) 1 ml de células de ?. haeaolytica e 2 miliCurieii de iodo-125, removeu-se o líquido, adicionaram-se 250 microlitros de 2-mercaptoetanol 50 nanomolar e depois dè se esperar 1 minuto adicionaram-se solução de iodsto do potássio a 1^ p/v e PBS. 0 produto de proteina resultante foi lavado I 3 vezes com ^BS.

BAO ORIGINAL

- 26 . Lisados de células totais separados «a SDS PA GE e corados, para revelareis a proteína total, com azul de j Coomassie, apresentava· uaa configuração corada complexa i característlca que é semelhante em células cultivadas ea i condiçoes de alto e baixo teor e· ferro. A autoradiografia de proteínas celulares iodadas separadas por SDS-PAGE identifica como reproductibilidade um subconjunto de algumas 20 proteínas que estão possivelmente associadas à aurerfície das células.

As configurações autoradiográficas de células cultivada· em condições de suficiência ou restrição do forro diferem nitidamente nas suas configurações de ^Sandas. As células cultivadas em condições do restrição de ferro exibem bandas adicionais a aproxlmadaaente 35, 70 e 100 kDal.

'ara purificar estas proteínas tendo em vista a sua utilização em vacinação, Usados de células totais solubilizados em cloridrato de guanidina 6M foram fraccionados a 30°C por líPLC em fase reversa. À coluna utilizada era uaa coluna de Polypore PLRP-S-100A-5»u. Os dissolventes usados foram ácido trifluoracétlco (~PA) a 0,1$ em água, e TFA a 0,1$ em acetonitrilo. Pgou-ee um gradiente de dissolvente partindo-ee de 99$ de PA a 0,1$ em água/l$ de OPA a 0,1$ em acetonitrilo para os primeiros 5 minutos, seguidamente 95$ de TPA a 0,1$ em água/5$ de TFA a 0,1$. em acetonitrilo para os 5 minutos seguintes, e uma diminuição gradual da proporção de ΓΡΑ a 0,1% em água (95 até 5>) e um aumento da | proporção de TFA a C,l% em acetonitrilo para os restantes ΐ 160 minutos. 0 débito foi de 1 ml/minuto. A cromatografia l foi acompanhada por espectroscopicamente com referência ao espectro de absorção TV a 230 nm. A comparação dos perfis de eluiçao A28C demonstrou uma nítida diferença num pico iso lado que era bastante maior em células cultivadas em condições de restrição de ^erro. A análise das fraeções correspon dentes a este pico por SDS TA CE e por electroforese a duas :í

Ί

BAD ORIGINAL dimensões mostrou que o componente principal deste pico é uma proteína a 35 kDal coe uni pequeno número de proteínas contaminastes· Isolaram-se quantidades significativas desta proteína de 35 kDal purificada grosseiramente. Dtea ves que as proteínas contaminantes minoritárias neste produto são bastante diferentes da proteína principal de 35 kDal noa seus pesos moleculares* a proteína de 35 kDal pode ser purificada até uma homogeneidade substancial por filtração por gel.

Um ensaio Testem blotting provou claramente qpe a proteína de 35 kDal indus uma resposta imune numa infecção natural em carneiros. A fig. 7 dos desenhos e uma fotografia de um gel (7a) e da mancha (7b) semelhantes às das figo. 2 e 3 e obtidas de modo idêntico. ^Preparações de célula· totais cultivadas em meio com abundância e com carência de ferro foram separadas por SDS-PAGE» foram transferidas para papel de nitrocelulose e ensaiadas com soro de cordeiros ST?* como se descreve no exemplo 2* excepto pelo facto de a interseção anticorpo-antigene ser detectada por peroxidaso de rábano silvestre (HRP) conjugada com IgG de macaoo anti12«

-carneiro* em vee de IgG de porco anti-carneiro com T. A fig. 7a é um gel corado com astul de Coomaasie para visualizar o antigene, enquanto que a fig. 7b é um ensaio Western blot do gel da fig. 7a com antlssoros de cordeiros convalescentes. A band' a 35 kDal está indiccda por uma sota em cada uma das figuras. As pistas são:

1. células totais de P. haemolytica A2 cultivadas em calda nutriente.

2. Células totais de ?, haemolytica A2 cultivadas em calda nutriente + AABP (150 micromolar).

Claims (16)

1. £ I 7 I í D I C A Ç Ò 2 S

   1?. - Processo para a preparação de una vacina contra a paateureloee, caracteriaado pelo facto de ae obter o produto proteico isolado de Pastourolla cultivada ew condições de restrição de ferro mas não de Pastenrella cultivada em condições normais in vitro· e que num ensaio de mancha de humidade reage contra o soro de un animal convalescente que tenha recuperado de uma infecção por Pasteurella do meamo sorotipo.
2. 2^Λ. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto da o produto proteico sor isolado de um extracto de membrana exterior do Pasteurella.
3. 3*. - Processo de acordo con a reivindicação 1» caracterizado pelo facto de o produto proteico aor isolado de um Usado de célula total de Pastourella»
4. 4*. - ^ocer.-o de acordo coa as reivindicações 1» 2 ou 3, caracterizado pelo facto de o produto proteico ter us peso molecular, quando determinado por eleetroforeso os gel, igual a cerca de 70 quilodalton.
5. 5*. - ^-ocesso de acordo con as reivindicações 1 ou 3, caracterizado pelo facto de o produto proteico ter ua peao molecular, quando determinado por eleetroforeso em gel, compreendido entre cerca de 30 e 35 quilodalton·

   5^. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a Pasteurella ser Pasteurella haemolytica ou Pasteurella Multocida.
6. 7^p. - Processo de acordo con a reivindicação 6,

   ΒΑΠ ORIGINAL

   - 29 caraeterizado pelo facto de a asteurella ser Pasteurella haemolytica do biotipo A.

   3^a. - Processo de acordo com a reivindicação 7» caraeterizado pelo facto de a Pasteurella haemolytica ser de sorotipo Al ou A2.
7. 9^a. - Proeesso de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caraeterizado pelo facto de as condições de restrição de ferro serem as que se obtfm quando a Pasteurella é cultivada num meio nutritivo que oontém um agente quelante de ferro compatível com o croscinonto da referida Pasteurella no meio de cultura.
8. 10^fi. - Processo de acordo com a reivindicação 9» caraeterizado pelo facto de o referido agente quelante do ferro sor cx.a-bipiridilo.

   119. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caraeterizado pelo facto de a concentração de <x,o<-bipiridilo estar compreendida entre cerca de 50 e 200 microaolar.
9. 12£. - Processo de acordo com a reivindicação 9· caraeterizado pelo facto de o agente quelante do ferro sor ácido dietilenotriaminopentacético, ácido nitrilotriacático ou desferrioxamina, ou uma proteína capas do fixar o ferro presente no soro.
10. 13^a. - Processo caraeterizado pelo faeto de se obte rem células totais mortas de Pasteurella cultivadas em condições de restrição de ferro para utilização na formulação de uma vacina contra a pasteurelose.
11. 14*. - Processo de acordo com a reivindicação 13*

    BAD ORIGINAL caracterizado pelo facto de a Pasteurella ser definida como nas reivindicações 5, 7 ou 3.
12. 15«. - rocesao de acordo com as reivindicações

    13 ou 14» caracterizado pelo facto de as condições de restrição de ferro serem as definidas nas reivindicações 9» 10, 11 ou 12.

    164. - Processa para a preparação de vacinas contra Pasteurella, caracterizado pelo facto de se misturar um produto proteico tal coao é definido em qualquer das reivindicações anteriores com uma subetAneia ou mistura de suba tâncias auxiliares fanzaceuticamente aceitáveis.
13. 17*. - Procssso de acordo coa a reivindicação 16» caracterizado pelo facto de compreender misturarem-secélu— las globais mortas ds Pastsurslla cultivadas em condições de restrição de ferro» com um adjuvante farmaceuticamente aceitável.

    13*. - TTocesso de acordo com a reivindicação 17» caracterizado pelo facto de coapreender misturarmos bactérias de células de Paeteurella cultivada· ea condições do restrição de ferro, conjuntamente com um adjuvante farmaceuticamente aceitável.
14. 19» «i - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de compreender misturar—se um extracto da membrana exterior de ~aateurella cultivada em condições de restrição de ferro com um adjuvante faruaceuticamente aceitável.

    BAD ORIGINAL

    - 31
15. 20’. - Ptocesso para a preparação de anticorpos para um produto proteico reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 12.
16. 21’. - Processo para a preparação de anticorpos de acordo com a reivindicação 20, caracterizado polo faets de estas ssrem monoclonais.