PT86678B

PT86678B - Processo de preparacao de extracto de proteina de tecido animal de elevada solubilidade em agua

Info

Publication number: PT86678B
Application number: PT8667888A
Authority: PT
Original assignee: James John Gordon; Mclean Kirk William
Priority date: 1987-01-31
Filing date: 1988-02-01
Publication date: 1992-04-30
Also published as: EP0280415A1; PT86678A; WO1988005633A1; GB8702171D0; AU1180088A

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Este invento refere-ss ao processamento e z z proteina substancialmente solúvel e inodora, extracção de uma adequada a utili zação em processamento alimentar a partir de tecidos animais, incluindo a extracção de desperdícios de peixe tais como cabeça , cauda e esqueleto assim como a partir de peixe inteiro de refugo” que tenha sido destripado, especialmente peixe que não e adequado a escoamento por venda a retalho.

É geralmente reconhecido que existe uma considerável z z quantidade de proteina potencialmente disponível nos vastos bancos de peixe inexplorados do cessamento que restam explorado.

extracção de proteina te de proteina que pode ter aplicação na indústria alimentar e que possui um valor nutricional elevado para consumo do Homem ou do animal. Adicionalmente, mar e dos desperdícios de pro. remover o lombo de peixe É portanto desejável desenvolver processos para a dessas fontes para proporcionar uma fon.

z depois de z

se e desejável que o processo estima-se

É possível converter desperdícios de peixe refugo, por meio de vários processos industriais, de peixe ou concentrado proteico de peixe (FPC) e que cerca de 50/o da captura total, vertida em FPC e farinha de peixe.

A Z ·.

tem um valor bioquímico e nutricional baixo devido as condi anual, de peixe seja conNo entanto, estes produtos

Λ çães de operação processual usadas que em geral promovem a des. naturação e baixa solubilidade da proteina extraída. Alem disso, os produtos de farinha de peixe tem um teor elevado de lipidos insaturados que são susceptiveis de oxidação provocando

Z A odor e sabor desagradavel. Por consequência, a farinha de pei.

A xe e o FPC são pouco adequados ao consumo humano e tem uma eficacia pobre como fontes de proteina para alimentação animal.

Um procedimento alternativo que esta a ganhar aceitação crescente e a preparação de hidrolisado proteico de peixe (FPH). No entanto, a produção de preparações de proteina de

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JTS/KS elevada qualidade, a partir de desperdícios de peixe é de peixe de re, fugo,qaresenta vários problemas no que concerne ao odor, sabor, valor nutricional, propriedades funcionais tais como emulsionação, capacidade espumante, retenção de agua, etc. Em geral, o procedimento relaciona-se com a utilização de catalisadores biologicos (protease ou enzimas proteoliticas) para catalisar z z a hidrólise de proteínas com extracção de fragmentos de protei. na, incluindo proteínas substancial ou parcialmente hidrolisa. das, i.e., fragmentos de polipeptidos e/ou proteínas de baixo peso molecular, de tecidos complexos. Devido a estes probleΛ z mas, os produtos FPH conhecidos tem geralmente caracteristiz cas funcionais pobres que os excluem de utilização na industria alimentar. 0 produto final contem assim, geralmente, uma elevada proporção de peptidos de baixo peso molecular com propriedades funcionais pobres incluindo um sabor amargo desa. gradavel e uma baixa solubilidade. Em segundo lugar, □ proble ma do apodrecimento devido a contaminação bacteriana necessita geralmente da introdução de equipamento dispendioso ou da uti. lização de métodos (p.e. ebulição) que afectam também adversa mente essas propriedades funcionais. Em terceiro lugar, a remoção da gordura e o evitar de produtos da oxidação da gordura que provocam odor necessita da utilização de solventes e técnicas que diminuem ainda mais as caracteriscticas funcionais necessárias ao produto final.

É um objectivo do presente invento evitar ou minimizar uma ou mais das desvantagens anteriores.

Foi agora descoberto pelos inventores que a partir de

Z Z tecidos animais se podem obter extractos de proteina solúvel z z com boas caracteristicas funcionais, por hidrólise controlada de tecido, suficiente apenas para libertar dele proteina soluvel evitando, ao mesmo tempo, qualquer hidrólise substancial da proteina no decurso da sua libertação ou apos a sua libertação. Isto é conseguido, inter-alia, usando enzimas endoproz z teoliticas substancialmente livres de enzima exo-proteolitica

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JTS/KS para minimizar clivagem de ligação peptidica produtora de ami. noacidos livres; usando sistemas enzimaticos de pequeno espeq z z tro para facilitar a libertação da proteína solúvel com clivagem no mínimo de centros e minimizar qualquer clivagem adiz * ^z cional para alem da necessária para libertar proteína do te cido, clivagem adicional que resultaria na produção de fragmen. tos de polipeptido menores e com pesos moleculares mais baixos; e usando períodos de hidrólise curtos, apenas suficientes z z para libertar proteína de tecidos sem qualquer hidrólise adiz z cional significativa da proteína libertada. Na pratica verifi cou-se que são preferíveis períodos de não mais de 40 minutos. Convenientemente, periodos de hidrólise de tecido de 5 a 30 p.e., de 10 a 20 minutos são suficientes para libertar do tecido quantidades substanciais de proteína solúvel.

para

Assim o presente invento proporciona um processo de proteína, compreende os proteínas subs_ preparar,a partir de tecido animal^um extracto z z substancialmente solúvel em agua, processo que passos de: proporcionar tecido tancialménte- não desnaturadas, co compreendendo um sistema de animal contenda seleccionar um meio enzimatiz enzimas endoproteolicas de espectro pequeno, substencialmente z z liticas, para hidrólise limitada dução substancial de aminoacidos isento de enzimas exo-proteo. do referido tecido sem proe/ou de fragmentos de peptido de baixo peso molecular; aquecer rapidamente o referido

Z % Ά z tecido ate a temperatura a qual o referido meio enzimatico tem actividade proteolitica substancial; adicionar o referido meio enzimatico ao tecido num meio aquoso; e manter a mistura z

a um pH num intervalo no qual o referido meio enzimatico tem actividade proteolitica substancial, durante um período de tempo limitado, suficiente para hidrolisar o tecido de modo a libertar proteínas e/ou fragmentos de polipeptido de elevado peso molecular, sem redução substancial a aminoacidos livres ou peptidos com caracteristicas indesejáveis; separar qualquer oleo e/ou componentes solidos substanciais; e remover e/ou

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desactivar □ referido meio enzimatico de modo a evitar subse. quente hidrólise da proteína e/ou polipeptido.

Com o processo do presente invento pode obter-se um extracto de proteina com elevada solubilidade e com outras propriedades funcionais boas, tornando-o bastante adequado pa_ ra utilização na industria de processamento alimentar.

Para maximizar a extracção de proteína solúvel sem pre. judicar as suas caracteristicas funcionais pode usar-se mais do que um tipo de enzima endo-proteolitica. No entanto, de z

acordo com o presente invento, essas enzimas endo-prateoliticas adicionais são preferivelmente usadas em etapas de hidroli se de tecido separadas de modo a libertar mais proteína solúvel libertavel por esse tipo de enzima adicional, que não foi libertada pelo tipo de enzima utilizado antes, com o mínimo grau de hidrólise desta proteina solúvel adicional. É também possivel usar em cada etapa mais do que uma enzima endoprotec) litica desde que o numero de tipos diferentes esteja limitado a um numero muito pequeno, p.e. 2 ou possivelmente 3, de modo a evitar tanto 'quanto possivel a hidrólise de qualquer proteí na libertada do tecido.

De acordo com o presente invento usa-se um sistema de enzimas endoproteoliticas com um espectro de actividade peque, no, isto e uma ou mais enzimas que catalisem a clivagem de poucas ligações peptidicas diferentes, mais ou menos distantes das extremidades das cadeias de proteina - distintas das enzimas exo-proteoliticas que clivam progressivamente as ligações peptidicas nas extremidades livres das cadeias de proteinas ou peptido. Deste modo pode evitar-se a produção de aminoacidos livres e de fragmentos de polipeptido de baixo peso molecular. Pode referir-se que, pelo contrario, as preparações de

Z Z A Z proteases disponíveis no comercio contem geralmente varias ou mesmo muitas enzimas diferentes possuindo actividades proteoliticas e/ou hidroliticas variadas. Assim, na pratica, o uso x A destas preparações tera como resultado a ocorrência de muitas reacções hidroliticas diferentes o que tera um efeito importan.

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te na natureza do produto final. Assim, seleccionando, de z

acordo com o presente invento, um sistema enzimatico como o definido acima, os problemas relaccionados com a hidrólise relativamente incontrolada que ocorre com os sistemas enzima, ticos usados convencionalmente, poderão ser substancialmente evitados.

De acordo com o presente invento podem usar-se endo-proteasas com qualquer especificidade desejada para ligação peptidica bem como mais do que uma protease com especificidade diferente, embora, como ja se mencionou o processo comple to de extracção de polipeptido ou proteína envolva a utiliza, ção apenas de um numero pequeno de proteases com especifícida z

des diferentes para ligação peptidica. Com vantagem, o processo z

do presente invento envolve a utilização de um meio enzimatico com não mais de 5, preferivelmente não mais de 3, especif icida. des diferentes, para ligação peptidica.Quando os meios enzimaticos usados tem mais do que uma especificidade para ligação z z z z peptidica, então a hidrólise da ligação peptidica e, desejável, mente, efectuada em mais de uma etapa. Neste caso, e preferível que a protease ou proteases usada (s) em cada etapa de hidroli. se de ligação peptidica seja(m) inactivada(s) e, se desejado, . . z z removida (s) antes de se efectuar a hidrólise de ligação pepti. dica seguinte (usando uma protease com especificidade para li gação peptidica diferente). A utilização de meios enzimaticos com especificidades para ligação peptidica diferentes e mais do que uma protease com especificidade para ligação peptidica de acordo com o processo do invento, permite que a extracção de proteina e polipeptido de vários tecidos seja maximizada ao mesmo tempo que evita, substancialmente, mais hidrólises e a produção de aminoácidos livres e fragmentos de polipeptido de

Assim, se, por exemplo, o tecido a ser processada e principalmente constituído por cabeças, peles e caudas de peixe sera então desejável usar uma ou mais proteases possuindo actividades proteolitica elevada contra

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X em colagenio, p.e. colagenase, inteiro ou pedaços mais carnudos ou mais proteases possuindo acti contra tecido conjuntivo.

tecidos epidérmicos com base ao passo queseseusa õ peixe r * e então preferível usar uma vidade proteolitica elevada

Tipos particulares de proteases que podem ser usadas de acordo com o presente invento incluem serina-proteases e tiol-proteases, bem como endo-proteinases dos qrupos acido podem men.

cionar-se incluem

Serina-proteases: tripsina, quimotripsina, elastase, subtilisina;

Tiol-proteases:

papaina, bromelaina, ficina

Metalo-endo-proteases: colagenase

Reciprocamente, os meios enzimaticos usados devem ser substancialmente isentos de exo-proteinases nos grupos acido-protease e metalo-protease bem como carboxipeptidases (p.e. Α,Β,Ρ e Y) e peptidases (incluindo aminopeptidase) em geral.

Acidentalmente, pode referir-se que enzimas proteoliticas do mesmo tipo ou especificidade podem ser obtidas de varias fontes diferentes, p.e. especies bacterianas diferentes, de modo que enzimas de fontes diferentes, cada uma das quais actua, contudo, na mesma ligação peptidica, constituem ainda um unico tipo de enzima proteolitica de acordo com o presente invento.

processo do presente invento proporciona um extracx X X to de proteína que, por um lado, não e apenas dispersavel

X Z Z em aguas mas altamente solúvel em agua sem necessidade de força ionica elevada, i.e., adição de sais, ou necessidade de pH alto ou baixo, i.e. adição de alcali ou acido. Por outro z

lado o extracto de proteína do invento não apresenta sabor amargo ou apresenta um ligeiro sabor amargo que não necessita de mascaramento e mantém uma proporção elevada de teor de ami noacidos essenciais da proteica fonte.

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-aDe acordo com o presente invento, podem usar-se vários materiais proteicos de partida, incluindo tecidos animais de

A Z Z ocorrência natural, contendo proteínas, especialmente vários tipos de peixe e carne ainda que seja desejável que a fonte de proteínas seja uma fonte relativamente homogenea. É tamz z z bem desejável que se use uma fonte de proteina contendo uma proporção elevada dos aminoácidos essenciais ou seja os amino. ácidos que não podem ser sintetizados pelo metabolismo humano.

z

Assim, prefere-se particularmente o peixe que contem uma gran. de proporção de proteina miofibrilhar.

De acordo com o presente invento, verificou-se que é importante que a fonte de proteina seja substancialmente não desnaturada, em particular, não desnaturada quimicamente, como por exemplo, por processos de extracção com solvente para produção de concentrados de proteina, ou desnaturada térmicaz mente por cozimento, e uma fonte de proteina particularmente preferida e tecido animal fresco especialmente peixe fresco, embora se possa também usar peixe congelado e peixe marinado.

No processo do invento podem usar-se quaisquer condições de hidrólise adequadas. Em geral estas serão as que proporcionem um comportamento optimo do sistema enzimatico parti, cular usado em especial no que diz respeito à taxa de hidroli se e velocidade de obtenção do grau desejado de hidrólise de tecido de modo a minimizar a hidrólise de proteina não desejada e outras reacções secundarias. Em geral, deve notar-se que e desejável que os vários passos do processo, pelo menos antes do processamento final, sejam realizados tão depressa quanto possível para se evitar hidrólise, desnaturação e/ou reacções secundarias indesejáveis em excesso, conducentes a tingidura, etc.

z

Em geral, a hidrólise de acordo com □ presente invento e realizada de modo a quebrar o minimo de ligações peptidicas necessárias para se conseguir a solubilização, sem ao mesmo

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tempo ter como resultado sabor amargo significativo e/ou perz z ca de função do teor de aminoacido da proteina. 0 grau de hidrólise optimo dependera dos tipos de ligações quebradas que por sua vez dependerão das enzimas usadas. Alem disso deve z z notar-se que um grau de hidrólise maior do que □ minimo pode ser conseguido sem afectar significativamente as propriedades do hidrolisado desde que □ grau de hidrólise seja limitado de moda a evitar perda de capacidade de emulsionamento, sabor amrgo, capacidade de espumificação etc. Isto pode ser facilmente determinado para quaisquer sistema enzimatico e condições de hidrólise desejados por experimentação laboratorial de rotina.

No caso de hidrólise de peixe usando sistemas enzimaticos como os descritos com maior detalhe adiante verificouz

-se que um extracto de proteina consistindo essencialmente em polipeptidos com peso molecular no intervalo de 15 Kilodaltons a 125 Kilodaltons tem solubilidade elevada, boas caracteristi z

cas, funcionais e propriedades relativas ao paladar aceitáveis. É evidente que sistemas enzimaticos específicos diferentes podem proporcionar hidrolisados com espectros e distribuições de peso molecular de polipeptidos diversos sem prejudicarem substancialmente a qualidade do extracto.

Embora o peixe seja uma fonte de proteina relativamentepu ia contem no entanto pequenas quantidades de outras substancias, e o presente invento proporciona também, numa concretização preferível, meios para a sua remoção e purificação do extracto z z z de proteina obtido apos hidrólise catalisada por protease_?de modo a proporcionar um produto ainda melhor, A reacção dos con. taminantes com proteina solúvel pode também ser evitada crian. do condições que sejam desfavoráveis a realização das reacções laterais ou, quando não se possam evitar as reacções laterais, por inactivação ou remoção das substancias potencialmente reaç. tivas.

No passado geralmente tentou resolver-se os problemas

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-10de remoção de odor, cor e gordura usando solventes orgânicos para extrair os compostos responsáveis por estes problemas. Esta aproximação embora sendo razoavelmente eficaz para o seu objectivo imediato, tem efeitos gravemente prejudiciais em propriedades funcionais do produto,importantes. Deve notar-se que a proteina solúvel de peixe, extraida, e geralmente uma emulsão solúvel entre lipidos de peixe e proteina de peixe e que os métodos grosseiros de remoção de gordura, tais como a

Λ extracção com solvente orgânico, provocam geralmente danos irreparáveis na capacidade de emulsão da proteina extraida, reduzindo assim uma das suas caracteristicas funcionais mais importantes que e particularmente significativa nas proteínas de grau alimentar com elevada qualidade.

A purificação pode ser efectuada, de acordo com o presente invento, por intermédio de diversas técnicas fisicas adequadas, conhecidas na especialidade, para a purificação de proteínas incluindo, por exemplo, centrifugação a baixa temperatura, ultra-filtração, permuta ionica, dialise e filtração preparativa em gel, mas que não foram anteriormente uX X sadas na preparação de extractos de proteina de peixe e análogos. Os meios de separação usados eliminarão geralmente as fracções com um peso molecular (quando a separação e feita com base na dimensão e/ou peso molecular) inferiores (cut-off) aos da gama de 5000 a 20000 daltons, p.e. da ordem de 10000 daltons. Mais detalhes de procedimentos adequados serão fornecidos adiante numa descrição detalhada do processo.

Como se referiu anteriormente as preparações enzimatiX X cas disponíveis no comercio consistem geralmente em misturas de muitas enzimas especificas diferentes. Assim, numa outra

X concretização preferível, o presente invento inclui o passo preliminar de purificação da preparação convencional de protease de modo a remover exo-proteinases e outras enzimas que catalisam reacções que causam uma diminuição da qualidade fi nal do produto acabado e a proporcionar preparações de endo

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-11-proteinases com especificidade pequena preferivelmente não contendo mais do que 3, mais preferivelmente um,l, tipo de enzima. É desejável que a endo-protease purificada não contenha mais do que 10%, preferivelmente mais do que 5%, e mais preferivelmente não contenha mais do que 1% em peso de exo-proteinase. Vantajosamente a preparação enzimatica purificada deve ser substancialmente homogenea e compreender pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90% em peso de uma unica endo-proteinase. A purificação de fontes enzimaticas comerciais pode ser facilmente conseguida usando filtração em gel, tendo em atenção o facto de a maioria das endo-proteases de interesse terem geralmente valores de peso molecular na gama de 15000 a 28000. Geralmente, é possivel purificar a preparação enzimatica numa operação so com um passo, recolhendo as fracções de protease requeridas, concentrando-as e em seguida usando-as directamente na etapa de hidrólise. Parece que pelo menos algumas preparações de endo-proteinase purificadas podem ser menos estáveis do que as preparações não purificadas e deste modo e desejável usar as enzimas purificadas mais ou menos um dia depois da purificação. As condições exactas da purificação são determinadas especificamente para cada protea. se individual e variam com a disposição e operação do equipamento de filtração em gel. E evidente que também se podem usar outros métodos de purificação de proteases e que a purificaz ção de proteases não esta restrita aos procedimentos de filtração em gel.

Num outro aspecto, o presente invento proporciona um extracto de proteínas, muitíssimo solúvel em agua, de tecido animal contendo proteina não desnaturada, preferivelmente de z

peixe, que consiste em polipeptidos com um peso molecular na gama de 25 a 125 Kilodaltons. Preferivelmente o hidrolisado de tecido contem uma proporção elevada de aminoacidos essenciais presentes na referida proteina não desnaturada.

Dutras caracteristicas e vantagens preferidas do inven-

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JTS/KS to serão evidentes da seguinte descrição detalhada apresenta.

z da a titulo de exemplo.

Extracção de Proteína de Peixe

Na primeira etapa, cominui-se peixe inteiro e/ou desperdícios de peixe usando equipamento padrão que se destina a cortar o peixe em pedaços pequenos, com um volume de cerca de 2 a 3 cm . Em seguida, adiciona-se aos pedaços solidos um volume igual de água a 15-20^eC e agita-se a mistura lentamente (10-20 rpm) num tanque. A mistura é agitada durante 10 miz nutos e em seguida escorrida através de um peneiro grosseiro (dimensão do furo 100 j-im) no fundo do tanque. 0 material soz lido fica retido no tanque. A primeira solução de lavagem liquida (PLL) contem proteína solúvel e e transferida para um tanque de retenção antes do processamento subsequente. Ao material solido e adicionado mais um volume de agua contendo 1% p/v de NaCl a 20-25²C. Apos agitação durante 15 minutos a mistura e escorrida como anteriormente. A segunda solução de la-r vagem liquida (5LL) contém mais proteínas solúveis e a SLL é encaminhada para o tanque de armazenamento contendo a PLL. Ao material solido, no tanque de reacção, e em seguida adicionado 0,05 volumes de agua e a mistura é rapidamente aquecida até 45^SC. Em seguida adiciona-se subtilisina de bacillus ligai forme (uma enzima serina-endoprotease) a mistura agitada suavemente (cerca de 20-40 rpm) a um nivel de 0,2 g por Kg (peso húmido) do material de peixe, a agitação e mantida a um nivel de 20-40 rpm durante 15 a 30 minutos ate que a mistura seja convertida num material com uma consistência do tipo sopa espessa e as espinhas tenham assentado no fundo do tanque.

Adiciona-se um volume igual de agua, a 5^0, ao conteú do misturado por agitação suave durante 10 minutos.

A mistura é em seguida escorrida através de um peneiro grosseiro no furi do do tanque.

As espinhas ficam retidas no peneiro e são removidas , secas e armazenadas.

A mistura contendo a proteína e a seguir passada através de um crivo fino para reter material

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-13particulado e separa-se uma fracção liquida. Alternativamente a mistura proteica e separada numa centrífuga,a baixa velocidade (2500 g). 0 extracto liquido da primeira etapa (EPE) e encaminhado para um tanque de armazenamento antes de processarnento ulterior. 0 material solido volta ao tanque reaccional e adiciona-se um volume igual de agua a 45²C. 0 conteúdo e misturado, mantido a 45²C e agitado a 20-40 rpm durante 10 minutos. Adiciona-se então bromelaina (uma terceira endo-protease) a um nivel de 0,05 g por Kg (peso húmido) de material particulado. A mistura e agitada a 20-40 rpm durante 30 minutos em seguida a mistura e arrefecidajde 45^SC para 10²C,usando um permutador de calor. A mistura e adicionado acido de grau ali z ^z z z * ^z mentar (p.e. acido clorídrico, acido citrico ou acido fosfori co) para baixar o pH da mistura,de pH 6,5 para pH 4,0.

A mistura e então encaminhada para uma centrífuga e centrifugada a 2500 g durante 20 minutos a 10²C. 0 sobrenadan. te liquido representa o extracto da segunda etapa (ESE).

Assim que cada extracto e recolhido, qualquer actividade enzimatica residual deve ser interrompida para evitar a deterioração do produto. Pode conseguir-se isto por um de vários métodos. Logo que o extracto e recolhido ele pode ser ra pidamente submetido a um tratamento por calor,adequado, p.e. aquecendo a 90²C durante 10 a 15 segundos seguido de arrefecimento rápido a 20-25²C ou aquecendo rapidamente ate 70²C, mantendo esta temperatura durante 5 minutos antes do arrefecimento rápido a 20-25²C. Alternativamente, pode usar-se uma inactivação com acido, p.e. reduzindo o pH da fracção para pH 3,5 (por exemplo adicionando acido clorídrico ou outro acido de grau alimentar adequado).

Pode ocorrer alguma precipitação de complexos de lipidos depois do passo de inactivação das enzimas, podendo estes ser removidos por filtração através de um leito de papeis Whatman N² 12 e papeis Whatman GFC2. Alternativamente, o material precipitado pode ser removido por centrifugação a

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-14X

4000 g durante 15 minutos a baixa temperatura, p.e. 5²C, a r A A qual os lipidos tem tendencia para coalescer,para formarem um complexo insolúvel. A solução resultante deve ficar substancial, mente limpida e e usualmente ligeiramente amarelada.

A

Assim, obtem-se do processa descrito acima, quatro extractos de proteina; primeira solução de lavagem liquida (PLL), segunda solução de lavagem liquida (SLL), extracto da primeira etapa (EPE) e extracto da segunda etapa (E5E). Estes podem ser reunidos ou podem ser tratados separadamente nos passos adicio. nais de purificação que se seguem.

A purificação adicional pode ser realizada para remover vários contaminantes de baixo peso molecular usando uma combinação nova de técnicas de permuta ionica e de ultrafiltra. ção. 0 procedimento empregue e novo por se poderem usar materiais de permuta tanto cationica como anionica simultaneamente com ultrafiltração para permitir a remoção num único passo de uma vasta gama de contaminantes. Em adição, o sistema emprega um crivo de peso molecular para impedir que as proteínas de elevado peso molecular, desejáveis, se liguem ao material de permuta ionica. Tipicamente, os permutadores ionicos usados são SP-Sephadex G50 e QAF-Sephadex A-50 misturados em pro. porções iguais. Estes estão contidos num saco de dialise ou aprisionados em esferas de alginato de sodio a 4% para distinguir a proteina e polipeptido de elevado peso molecular dos z

materiais de permuta ionica, permitindo ao mesmo tempo que os

X z contaminantes passem através do material de permuta ionica e z z fiquem ai retidos. Esta combinação de permuta ionica e lavagem por ultrafiltração reduz o tempo global necessário a purificação, o que e particularmente vantajoso ja que em geral a extensão e em particular a duração de qualquer processamento de purificação e desejavelmente minimizada quanto possível < z de modo a limitar qualquer possível desnaturação de proteina z z ou polipeptido. A fase de lavagem e geralmente continuada durante cerca de 2 a 4 horas para/permitir que se efectue

-1567 333

JTS/K5 a remoção substancial dos contaminantes.

Z

Mais detalhadamente, a solução de extracto de proteina e feita circular através de um dispositivo, como o ilustrado

Λ no desenho anexo, que compreende uma camara de tratamento de

X Λ permuta ionica 1 e uma camara de ultrafiltração 2,ligadas por

Λ dois tubos 3,4 para transferencia de avanço e de retorno da

X solução de extracto de proteina 5, entre elas, e provida de

A.

uma bomba 6 para fazer circular a solução entre as camaras

X

1,2. Adicionalmente proporcionam-se agitadores magnéticos «K Λ X

7,8 a camara de permuta ionica 1, assim como meios de fornecimento de agua 9 para manter a diluição da solução de extrac.

XX ^x to de proteina,porque a agua transportando contaminantes e retirada 10 na camara de ultrafiltração 2. É conveniente que a bomba 6 esteja provida de um pre-filtro 11.

A ultrafiltração remove as moléculas que conferem odor, como amoniaco, metanotiol, dimetilamina, trimetilamina, etil amina, etc. 0 tratamento de permuta ionica remove materiais conferindo cor, de muito baixo peso molecular, como os produ tos da quebra da melamina, mioglobina, hemoglobina etc.

sistema de ultrafiltração usado tera qeralmente um uma ”cut-off nominal, em peso molecular, de 10000, p.e./membrana

Amicon YM de Amicon Co. e um equipamento de grande escala ade_ quado para trabalhar valores da ordem de 100 a 200 litros de

X X Z solução por hora. A membrana de dialise também devera ter um cut-off em peso molecular de 5000-10000 daltons. A membrana

X Λ X devera ser, de preferencia, hidrofilica com propriedades de ligação de proteina não especificas excepcionalmente baixas.

z

Como alternativa os materiais de permuta ionica podem ser aprisionados em esferas de alginato de sodio a 4% e as esferas adicionadas directamente a solução agitada.

z

Depois da purificação,a solução purificada e desejável mente concentrada por solução contendo ate, ultrafiltração para proporcionar uma por exemplo, 60 a 70% p/v de proteina ou polipeptido. Isto pode ser efectuado, de modo conveniente,

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com o dispositivo descrito anteriormente, desligado simplesmente o fornecimento de agua 9. Finalmente, a solução concenX trada pode ser facilmente seca de modo a obter-se um po, usan do qualquer processo adequado, por exemplo secagem em tambor □u vacuo.

Geralmente, e preferível substituir o permutador ioniz z co por permutador ionico fresco apos uma hora, sendo então o permutador ionico usado, lavado e recarregado para permitir a sua nova utilização.

Como se disse anteriormente, podem usar-se no processo do invento enzimas com 2 ou mais especificidades diferentes. Em geral, prefere-se usar em primeiro lugar uma tiol-proteina se seguida, apos a sua inactivação, por uma serina-proteinase.

No entanto pode usar-se	qualquer combinação e/ou	Λ ! sequencia de.
sejadas de etapas de hidrólise com exo-proteinas	e, dependendo
das caracteristicas func	ionais desejadas para o	produto final.
Usando um process	o como o descrito acima	obteve-se um
produto tendo a seguinte	constituição:
Humidade	1,29%
Proteína	39,0%
Cinzas	5,6%
Óleo	inferior a 50 ppm
Azoto sem ser de
proteína e hidra.
to de carbono
(por diferença)	4,2%

Analise de Aminoacidos da	z Prote ina
	%		%
Leucina	7,4	Histidina	1,3
Lisina	9,2	Alamina	7,1
Fenilalanina	3,1	Aspartato	10,4
Metionina	2,7	Cis tina	0,1

-1767 333

JT5/K5

Analise de	Aminoacidos da Proteína (Cont.)
	%		%
T reonina	4,2	Glutamato	16,8
Triptofano	1,1	Glicina	9,9
Valina	4,7	Prolina	3,6
Arginina	6,8	Serina	4,9
Isole ucina	3,7	Tirosina	1,6
0 produto anterior	pode ser usado como	suplemento	ali-
mentar sem	paladar e sem	cor, com uma vida em	prateleira	lon-

ga e e aceitavel no mercado de suplementos alimentares por possuir boas propriedades espumantes, de ligação e emulsionantes. É util inter alia como reforçador de carne e confere caracteristicas de textura suaves a produtos de peixe,por exemplo, aumentando a capacidade de retenção de a'gua de pasta e mousse. Tem também utilidade quando usado em alimentos de dieta devido as suas baixas calorias mas elevado conteúdo nutricional.

Podem ser feitas modificações e melhoramentos sem se sair do espirito deste invento.

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JTS/KS

Claims

1- . - Processo de preparação de um extracto de protei-

Z z na de tecido animal, substancialmente solúvel em agua . proces. so caracterizado por compreender os passos de : proporcionar tecido animal contendo proteínas essencialmente não desnaturai das, seleccionar um meio enzimatico compreendendo um sistema de enzima endo-proteolítica de pequena espectro, substancialZ z mente isento de enzimas exo-proteoliticas, para hidrólise limitada do referido tecido, essencialmente sem produção de ami. noacidos e/ou de fragmentos de péptidos de baixo peso molecuz s lar; aquecer rapidamente o tecido ate uma temperatura a qual o referido meio enzimatico tem uma actividade proteolitica substancial; adicionar □ referido meio enzimatico ao tecido num meio aquoso; e manter a mistura a um pH num intervalo em z z que o referido meio enzimatico tenha uma actividade proteolitica substancial, durante um periodo de tempo limitado, sufiz ciente para hidrolisar o tecido, de modo a libertar proteínas e/ou fragmentos de polipeptido de elevado peso molecular, essencialmente sem redução a aminoacidos ou péptidos livres z z Z com caracteristicas indesejáveis; separar quaisquer oleos substanciais e/ou componentes solidos substanciais e remover e/ou desactivar o referido meio enzimatico de modo a evitar z z . S subsequente hidrólise de proteina e/ou de polipeptido.

2- . - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac- z

terizado por se usarem pelo menos duas enzimas endo-proteoliticas, possuindo especificidades para a ligação peptidica diferentes nas etapas sucessivas de hidrólise do tecido e inactivando-se as respectivas enzimas e recuperando-se a proteina solúvel assim removida do tecido, em cada etapa antes da etapa seguinte.

3- . - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2,

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JTS/KS caracterizado por se usarem duas possuindo especificidades para a numa etapa

4^a.

X enzimas endo-proteoliticas, z

ligação peptidica diferentes, da hidrólise do tecido.

- Processo de acordo com qualquer uma das reivindi.

cações 1 a 3, caracterizado por se usarem enzimas endo-proteoliticas não contendo mais do que 10% em peso de exo-proteinase.

5^a.

das reivindica- Processo de acordo com qualquer caracterizado per se usar na etapa de hidrólise ou em cada uma das etapas, uma enzima endo-proteo.

lítica essencialmente homogenea, não contendo mais do que

20% em peso de enzima endo-proteolitica com diferente especi.

ficidade para a ligação peptidica.

6- . - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado por se usar uma enzima endo-proteo. lítica seleccionada de entre os grupos das serina-proteases, tiol-proteases e metalo-endo-proteases.

7- . - Processo de acordo com a reivindicação 6 quando dependente da reivindicação 3, caracterizado por se usar uma serina-protease numa etapa de hidrólise do tecido e uma tiol-proteínase numa etapa subsequente de hidrólise de tecido.

8^a. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por a etapa de hidrólise de tecido, ou cada uma das etapas, se prolongar por 5 a 30 minutos.

9~. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado por incluir o passo preliminar de cominuiçao do tecido.

10^a. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizado por incluir o passo preliminar de purificação de uma preparação enzimatica de modo a proporcio. nar o referido sistema de enzima endo-proteolitica de pequez no espectro essencialmente livre de enzimas exo-proteoliticas.

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JTS/KS

11- . - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizado por incluir o passo de purificação do extracto de proteína por um processo de fraccionamento físico .

12- . - Processo de acorda com a reivindicação 11, caracterizado por o extracto de proteína ser submetido a ultra, -filtração de modo a remover os contaminantes, possuidores de cor, de baixo peso molecular.

13- , - Processo de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado por o extracto de proteína ser submetido a permuta ionica, com analise da proteína e/ou polipéptido solúveis do material de permuta ionica, de modo a remover os contaminan. tes, possuidores de odor, de baixo peso molecular.

143. _ Processo de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 13, caracterizado por incluir o passo de remoção de lipido por pelo menos uma das operações, filtração e centrifu gação a baixa temperatura.

15⁹. _ Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por incluir o passo de pasteurização do extracto de proteína.

16^â. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por o meio enzimatico ser inaç. tivado termicamente ou por acidificação com um acido de grau alimentar.