PT86377B

PT86377B - Processo para a preparacao de conjugados de imunoglobulinas com um difluoronucleosideo acilado

Info

Publication number: PT86377B
Application number: PT86377A
Authority: PT
Inventors: William Leonard Scott; Gary Allen Koppel; George Davon Kennedy; Henry Kenneth Armour
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1986-12-24
Filing date: 1987-12-16
Publication date: 1990-11-20
Also published as: KR880007531A; HU205135B; PT86377A; AU590462B2; ZA879473B; MX9847A; JPS63166897A; NZ222981A; EP0272891A2; IE873450L; IL84842A0; RU1787160C; DK665187A; HUT45547A; DK665187D0; CN87108348A; AU8265987A; EP0272891A3; CN1018649B

Description

Este invento relaciona-se com novas drogas uteis para o tratamento de tumores, drogas essas que são conjugados de difluoronucleosidos com imunoglobulinas, com a preparação das drogas e com os intermediários para a sua preparação, e métodos e composições para a sua utilização.

A apresentação da patente Europeia No.184.365 descreve a utilização de certos difluoronucleosideos para o tratamento de neoplasias em mamíferos. A utilização antiviral de alguns destes mesmos nucleosidos e métodos para a sua preparação são apresentados na patente dos E.U.A. No. 4.526.988 e no pedido de patente Britânica GB 2172287. Verificou-se que estes compostos possuíam uma acti. vidade útil contra uma série de sistemas tumorais em ratinhos .

O presente invento proporciona conjugados de imunoglobulina de alguns destes difluoronucleosidos. Embora seja geralmente conhecido o conceito geral de drogas de conjugação para anticorpos, por exemplo, o pedido de patente Europeia No.88695, a bibliografia reconhece claramente a maneira e os meios por meio dos quais se realiza a conjugação a qual é de importância critica para se obterem conjugados possuindo propriedades biológicas uteis. Por exemplo, quando um composto ou droga possuem mais do que um grupo funcional reactivo, a ligação através de uma funcionalidade pode proporcionar um conjugado com uma actividade biológica significativamente maior ou menor em comparação com a conjugação através de um grupo funcional diferente. Nalguns casos, obtem-se uma melhor actividade biológica por meio de ligação covalente directa do composto ϊ

e do anticorpo enquanto que noutros casos um grupo de ligação especifica entre as duas metades dá origem a uma actividade superior. Assim, na maior parte dos casos, não existe qualquer meio de predizer se um determinado modo de conjugação vai proporcionar um conjugado útil.

gados de imunoglobulina Im é uma imunoglobulina cerca de 1-10, e Q é um

O presente invento proporciona conjuj com a fórmula geral (Q) -Im em que ou fragmento de imunoglobulina, n é difluoronucleosido acilado com a fórmula

R^ é hidrogénio, C^-C^alquilo, -COR^, ou -COXCO-; R£ é hidrogénio ou -COXCO-; R^ é hidrogénio, C^-C^-alquilo, amino, bromo, fluoro, cloro, ou iodo; R^ é hidrogénio ou C^-C^alquilo; X é uma ligação, C^-C^palquileno de cadeia linear ^C2^-Cio alquileno ramificado, ^c ₂ ^-C10 ^al^<3^uen:’-l^eno · Cg-C^galquinileno, C^-Cg cicloalquileno, fenileno, ou C^-C^galquileno

-6substituido em hidroxi, e A é N ou C-R^; contanto que um e apenas um entre R^ e R2 seja -COXCO-.

São também proporcionados por este invento intermediários com a fórmula Q-OH, isto é, compostos com a fórmula

0. R-NHR

(III) em que Rg é hidrogénio, ^c^~^c ₄ alquilo, -COR₃ ou -COXCOOH; R^ é hidrogénio ou -COXCOOH; contanto que um de entre Rg e R_? seja -COXCOOH.

Compostos com a fórmula III são uteis como intermediários para os conjugados deste invento, e possuem também uma actividade anti-tumoral util.

O presente invento proporciona também formulações farmacêuticas compreendendo como um ingrediente activo um conjugado com a fórmula I, associado com um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis para esse fim.

O presente invento proporciona ainda um processo para preparar conjugados com a fórmula I compreendendo a reacção de um composto com a fórmula

0. R—NHR

(VII)

em que R_g é hidrogénio, ^cj_-^c ₄ alquilo, -COR_g ou -COXCOZ;

Rg é hidrogénio ou -COXCOZ; contanto que um e apenas um de entre R_g e R_g seja -COXCOZ; Z é um grupo de activaçao com a imunoglobulina ou fragmento de imunoglobulina.

Este invento proporciona conjugado formados pela reacção de um ácido com a fórmula (III) sob uma forma activada (VII) com um ou mais grupos amino da molécula da imunoglobulina, por exemplo, grupos amino derivados de resíduos da lisina.

Os conjugados preferidos são aqueles em que R^ é hidrogénio e -R-NH-é um radical 4-amino-2-oxo-l-pirimidinilo. Grupos X preferidos são metades alquileno, particularmente as que contêm 2-4 átomos de carbono. Outros conjugados preferidos são aqueles em que R2 é hidrogénio e é -COXCO-; e aqiÉLes em que n é cerca de 4-8.

Os intermediários preferidos são aqueles que têm a fórmula III em que R_g é -COXCOOH.

É reconhecido que os ribosidos difluoro com as fórmulas I e III podem existir sob as formas quer ·?/ - quer β Este invento proporciona conjugados possuindo ribosidos sob a forma quer racémica, quer individuais cZ- ou de preferência

Os ácidos com a fórmula III são preparados a partir de nucleosidos com a fórmula IV,

IV

em que ' tem os significados de exceptuando -COXCO, por meio de técnicas padrão. Evidentemente, deve ser hidrogénio se o grupo de ligação estiver colocado no 5'-meta, nol.

Em geral, o grupo de ligação é col£ cado no seu lugar permitindo que uma amina com a fórmula IV reaja com o diácido mono activado com a fórmula ZCOXCOOH (V) A porção Z é um grupo de activação de carboxi tal como os bem conhecidos na técnica química e em particular os que são usados na quimica dos peptidos. Esses grupos são discutidos por exemplo, na sintese dos peptidos por M.Bodanszky, et al., 2nd Edition, (1976) John Wiley & Sons, especialmente páginas 85-136. Assim esses valores de Z, incluem um grupo azida (-N^) , um grupo halo, por exemplo bromo e especialmente cloro, um grupo aciloxi com a fórmula R^COO em que R^ é um residuo alifático ou aromático tal como C^-C^alquilo, um grupo alcoxi, de preferência C^-C^alcoxi ou um grupo ariloxi, um grupo metanossulfoniloxi, tosiloxi, ou benzenossulfoni loxi, um radical imidazolilo, ou o resíduo de um derivado N-acil hidroxilamina, por exemplo em que Z é um succinimidoxi ftalimidoxi ou benzotriazoliloxi. Alternativamente, pode ser utilizado em vez de V, um anidrido ciclico com a fórmula VI:

Este processo quimico é bem conhecido na técnica , por exemplo, para acilação de porções álcool numa molécula, ver, por exemplo, a Patente dos E.U.A. No.4.596.676 e o pedido da patente Britânica No.2.137.210. Em geral, os compostos IV e V (ou VI) são de preferência, feitos reagir num solvente

não-reactivo tal como éteres, por exemplo tetra-hidrofurano, éter dietilico, dioxano, etc. cetonas, tais como acetona, metil-etil-cetona, etc., hidrocarbonetos, tais como hexano, ciclo-hexano, tolueno, etc., ou hidrocarbonetos clorados, tais como cloreto de metileno. Alternativamente, ou em adição aos solventes, a reacção pode ser realizada quer na presença de um agente de eliminação de ácidos não-reactivo tal como piridina, trietilamina, etc. É aconselhável utilizar um excesso substancial do reagente com a fórmula V ou VI, particularmente quando o produto desejado tem o grupo de ligação no 5'-metanol. São desejáveis quantidades em excesso variando entre 2X-6X, particularmente cerca de 4X.

A reacção do nucleosideo com a fórmula IV com o reagente de acilação produz uma mistura de produtos. O grupo amino é acilado mais rapidamente,mas o 5'-metanol oxigénio e o 3'-hidroxi oxigénio são também reactivos. Assim, são formados não apenas produtos monoacilados mas também produtos bis- e tris-acilados. Os vários produtos são separados por meio de técnicas cromatograficas que são apresentadas em detalhe nos exemplos a seguir.

Pensa-se que o grupo de ligação no 5'-metanol é a mais estável das três posições com capacidade de serem aciladas. Consequentemente, o intermediário com a fórmula III em que Rg é -COXCOOH pode ser isolado sob uma forma completamente pura clivando quaisquer grupos acilo não desejados do azoto aminico e do oxigénio 3'-hidroxi, como por simples exposição de uma solução aquosa ao calor. Esses isolamentos são também indicados a seguir nos exemplos.

Os compostos III assim formados podem ser então feitos reagir com a imunoglobulina escolhida. A conjugação é realizada activando em primeiro lugar o grupo ácido de III com uma funcionalidade(função) Z tal como foi pre viamente descrito. De novo, esses métodos para preparar ha10letos de ácidos, azidas, ésteres activados, anidridos mistos, I i etc. são bem conhecidos na técnica. De particular importância são os grupos de activação derivados tais como succinimidoxi e haleto de ácido, especialmente cloreto de acido. Estes ácidos activados são preparados por meio de técnicas padrão bem conhecidas na técnica sendo então usados para ligação com a imunoglobulina. A reacção da imunoglobulina ’ e da forma activada de III é utilizada de melhor modo num meioi aquoso e a uma temperatura de cerca de 5-25°C e com um pH de cerca de 7-10. O processo resulta na união por ligação covalente de um ou mais difluoronucleosidos modificados atra vés de grupos ácidos para formar amidas com os grupos amino livres da molécula de imunoglobulina. O numero de residuos ligados dependerá da concentração dos reagentes, da duração da reacção, e da imunoglobulina especifica, mas o numero médio é usualmente de aproximadamente 1-10.

Ao efectuar- a conjugação de III activado e da imunoglobulina, um solvente apropriado tal como dimetilformamida é usado como um veiculo para introduzir o ácido activado numa solução tamponada de imunoglobulina em, por exemplo, tampão borato 0,34M com um pH 8,6. O conjugado é isolado por filtração em gel com uma solução salina tamponada com fosfato com pH 7,4 como o solvente. Alternativamente o conjugado pode ser armazenado num refrigerador a 4°C ou congelado a, por exemplo, -20°C.

Os nucleosidos com a fórmula IV são conhecidos na técnica. Os reagentes V e VI ou estão comercializados ou são conhecidos na bibliografia, ou podem ser preparados por me£odos conhecidos na técnica.

O outro componente para os novos conjugados é uma imunoglobulina e, desta classe, de preferên cia um anticorpo monoclonal (MoAb) , que é uma gama globulina tal como uma IgG ou uma IgM. A classe preferida de imunoglc> bulinas é constituída por aqueles que são reactivas com anti-11-

com antigénios sobre a superfície de células não desejadas; isto é, são capazes de reconhecer antigénios; possuem propriedades de reconhecimento do antigénio.

São bem conhecidas as técnicas para a produção dessas imunoglobulinas a partir do soro de animais imunizados ou fazendo culturas de hibridomas que segreguem produtos monoclonais. 0 tipo preferido de anticorpo para utilização no invento é constituído por uma imunoglobulina que seja uma gamaglobulina. São particularmente preferidas as subclasses IgG, IgA, IgE, e IgM. Algumas imunoglobulinas representativas são como se segue, anticorpos mono- ou policlonais em relação a (i) antigénios associados a tumores do homem ou do animal;

(ii) antigénios das células-B e-T humanos;

(iii) antigénios Ia humanos;

(iv) antigénios virais, fúngicos e bacterianos; e (v) células envolvidas em reacções humanas inflamatórias ou alérgicas.

Entre os anticorpos preferidos em relação a antigénios associados a tumores do homem ou do animal podem ser mencionados;

(i) Ig de cabras ou carneiros imunizados com antigénio carcino-embriónico;

(ii) Ig do soro do coelho anti leucemia linfoblástica aguda;

(iii) Ig de vários anti-soros de primatas formados contra leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloblastica aguda, leucemia linfoblástica crónica e leucemia granulocitica crónica;

(iv) Ig de cabras e de carneiros imunizados com células de carcinoma do pulmão, ou fracções celulares;

(v) Ig monoclonal a partir de hibridomas de ratinho que segreguem anticorpos anti carcinoma colo-rectal humano;

(vi) Ig monoclonal a partir de hibridomas de ratinho que segreguem anticorpos anti melanoma humano;

(vii) Ig monoclonal a partir de hibridomas de ratinho que segreguem anticorpos reagindo com células de leucemia humana;

(viii) Ig monoclonal a partir de hibridomas de ratinho que segreguem anticorpos que reajam com células de neuroblastoma humano;

(ix) Ig monoclonal a partir de hibridomas de ratinho que segreguem anticorpos que reajam com antigénios do cancro da mama humano;

(x) Ig monoclonal a partir de hibridomas de ratinho que segreguem anticorpos que reajam com células de carcinoma do ovário humano;

(xi) Ig monoclonal a partir de hibridomas do ratinho que segreguem anticorpos que reajam com células do osteosarcoma humano, com células do carcinoma pancreático humano com células do carcinoma prostático humano, etc.;

(xii) Ig monoclonal a partir de hibridomas de ratinho que segreguem anticorpos em relação a adenocarcinomas incluindo pulmão, rim, mama e pâncreas;

(xiii) Ig monoclonal a partir de hibridomas do ratinho que segreguem anticorpos que reajam com células do carcinoma escamoso humano;

(xiv) Ig monoclonal a partir de hibridomas humanos (hibridomas que segreguem anticorpos em relação ao antigénio associado aos tumores humanos incluindo, mas não sendo limitados por esses monoclonais atrás referidos;

(xv) qualquer anticorpo ou seu fragmento que contenha hidrato de carbono na cadeia quer ligeira quer pesada;

(xvi) Ig monoclonal do rato, hamster (criceto), ou outra espécie de mamíferos não mencionada atrás especificamente, a partir de hibridomas que segregam anticorpos em relação a antigénios associados a tumores humanos incluindo, mas não sendo limitados por, os atrás mencionados.

Tal como foi ôtrás indicado, o cori jugado pode também ser formado com fragmento de imunoglobuli. na Ig¹ que são também referidos como Fab, Fab', FÍab'^ θ monómero IgM derivado de um anticorpo, por exemplo, digestão proteolítica por enzima ou alquilação redutiva. São também formados conjugados úteis com anticorpos monoclonais quiméricos e anticorpos bifuncionais. Esses materiais e métodos de preparação são bem conhecidos e pode ser mencionado que os enzimas proteolíticos preferidos são a pepsina e a papaina. Ver geralmente Parham, J.Immunology, 131, 2895 (1983); Lamoyi et al., J.Immunological Methods, 56, 235 (1983); Parham, id., 53, 133 (1982); and Matthew et al., id.,50, 239 (1982).

Existem MoAbs específicos que são reactivos contra vários tumores; essas imunoglobulinas que reconhecem antigénios sobre a superfície de, ou de qualquer outro modo associados com células tumoraís, incluem mas não se limitam aos seguintes: .

QUADRO I

Tumor

MoAb

Referência

Pulmão		KS1/4	N. m. Varki, et al., Câncer Res. 44:681, 1984
		534,F8;604A9	F. Cuttitta, et al., in: G. L. Wright (ed) Monoclonal Antibodies and Câncer, Mareei Dekker, Inc., N.Y., p. 161, 1984.
Onero de Escamosas	Células do Pulmão	G1, LuCa2, LuCa3, LuCa4 PF 1/D	Kyoizumi et al., Câncer Res., 45:3274, 1985 Fernstein, et al., Câncer Res., 46:2970, 1986
		Ll-KS, L2-KS and L4-KS	Starling, et al,, Second Int'l. Conf. on Monoclonal Anti-, body Immunoconjugates for Câncer, San Diego, Mar. 12-14, 1987
Cancro de Células Pequenas do Pulmão	TFS-2	Okabe et al., Câncer Res. 45:1930, 1985
Colon		11.285.14 14.95.55	G. Rowland, et al., Câncer Immunol.
			Immunother., 19:1, 1985.

NS-3a-22,NS-10 NS-19-9,NS-33a NS-52a,17-1A

Z. Steplewski, et al., Câncer Res., 41:2723, 1981.

-15Melanoma

Neuroblastoma

Glioma

I

Mama

I

Sarcoma

Osteogénico

Leucemia

9.2.27	T. F. Bumol and R. A. Reisfeld, Proc. Natl. Acad. Sei., (USA), 79:1245, 1982
p97	K. E. Hellstrom, et al. Monoclonal Antibodies and Câncer, loc. cit. p. 31.
R24	W. G. Dippold, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 77:6114, 1980.
PI 153/3	R. H. Kennet and F. Gilbert, Science, 203:1120, 1979.
MIN 1	J. T. Kemshead in Monoclonal Antibodies and Câncer, loc. cit. p. 49.
UJ13A	Goldman et al., Pediatries, 105:252, 1984
BF7,GE2,CG12	N. de Tribolet, et al., in Monoclonal Antibodies and Câncer, loc. cit. p. 81.
B6.2,B72.3	D. Colcher, et al., in Monoclonal Antibodies and Câncer, loc. cit. p. 121.
791T/48, 791T/36	M. J. Embleton, ibid, p. 181
CALL 2	C. T. Teng, et al., Lancet, 1:01, 1982.

anti-idiotipo

OC 125

R. A. Miller, et al., N. Eng. J. Med., 306:517, 1982.

Ovário

R. C. Bast, et al., J. Clin. Invest., 68:1331, 1981.

Próstata

D83.21, P6.2,

Turp-27

Renal

A6H, D5D

J. J. Starling, et al., in Monoclonal Antibodies and Câncer, loc. cit.

p. 253.

P. H. Lange, et al. , Surgery, 98:143, 1985.

Os conjugados preferidos são os preparados a partir de anticorpos monoclonais, especialmente os que reconhecem as células cancerosas humanas tais como as do adenocarcinoma, carcinoma de células cancerosas hu manas tais como as do adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células transicionais, melanoma, neuroblastoma, carcinoma de células pequenas, leucemia, linfoma e sarcoma.

Os exemplos que se seguem são ilustrativos dos conjugados em intermediários deste invento, Estes exemplos são apenas ilustrativos e não têm como finalidade limitar de qualquer modo o invento.

17Exemplo 1

5^{* 1 * * 4}-0-(3-Carboxi-l-oxopropil)-2'-desoxi-2¹,2¹-difluorocitidina

2¹-desoxi-2' , 2 ¹-difluorocitidina (311 mg) seca foi adicionada a etanol seco e levada a refluxo. Adicionou-se fraccionadamente anidrido succínico (2,5g) durante um periodo de meia hora e a mistura foi submetida a refluxo durante mais 1/2 hora adicional. A mistura foi concentrada in vacuo e o produto crú resultante foi colocado sobre uma coluna de gel de silica fazendo-se a eluição com um gradiente escalonado de 5%, 20% e 50% de metanol em cloreto de metileno. O produto desejado foi isolado no lavado de 50% de metanol em cloreto de metileno que continha 148 mg i do material. Este produto foi combinado com produto de uma experiência semelhante proporcionando um total de 253 mg de material. Este material foi misturado com até 8 ml de solução de acetato de amónio Ο,ΟΙΜ. O pH foi ajustado com hidróxido de amónio para 8,6 e a solução foi colocada numa coluna de permuta aniónica mono-Q recentemente embalada (Pharmacia

Inc., 800 Centenial Avenue, Piscataway, New Jersey 08854). As fracções desejadas foram combinadas, congeladas e liofili-j zadas. O residuo foi dissolvido em água destilada, congelado, e liofilizado mais algumas vezes, sendo então dissolvido numa pequena quantidade de metanol e benzeno, congelado e li£ filizado proporcionando 60 mg do produto do titulo desejado. Os espectros de RMN de protões revelaram estar de acordo com a estrutura do produto desejado:

cÍ7,68, dupleto, 1H (C6 , =CH-N) ; cf 6,24 , tripleto, 1H (Cl', 0-CRH-);CÍ 6,13, dupleto, 1H(C5, C =CH- ) ; cí 4,78 , singeleto, 4 protões permutáveis (-0H, -NH); 4,2-4,7 multipleto, protões (protões de açúcar em C3¹, C4¹ C5¹) ; J 2,60e 2,73 dupleto de tripletos, 4 protões (protões de succinato f

Exemplo 2

Conjugação de 5 ' -0-(3-carboxi-l-oxopropil)-2¹desoxi-2 ' , 2 ’ difluorocitidina com007B

Uma amostra de 25 mg do produto do< Exemplo 1 foi dissolvida num pequeno volume de benzeno e metanol, congelada e liofilizada num total de três vezes. O resíduo foi dissolvido em 1 ml de dimetilformamida seca e 4ml de tetra-hidrofurano recentemente destilado. A mistura foi arrefecida até 4°C e adicionou-se N-metil morfolino (151 mel) em tetrahidrofurano. Após 10 minutos, uma amostra de 177 mel de cloroformato de isobutilo em tetrahidrofurano foi adicionada. Após agitação durante 20 minutos a 4°C. adicionaram-se 248 mel N-hidroxisuccinimida. A agitação foi mantida durante 20 minutos a 4°C e durante 3 horas à temperatura ambiente. A solução foi concentrada in vacuo e mantida sob vácuo durante a noite.

O éster activado preparado no parágrafo anterior (31,7 mg) foi dissolvido em 4,18 ml de dimetilformamida seca. 0 anticorpo 007B foi preparado por meio de subclonagem da linha celular que produz o anticorpo ; KS1/4 publicado e seleccionando formas variantes de clones de hibridoma que produzem apenas o anticorpo relaxante monoclonal IgG2a de KS1/4, e não a proteina irrelevante IgGl. Esses clones foram feitos crescer em culturas de células por métodos convencionais para produzir 007B. Quinhentos miligramas de 007B em tampão borato com pH 8,6 foram colocados num frasco de fundo redondo e a solução do éster activado foi adicionado durante um periodo de 10 minutos. A reacção foi agitada no escuro durante 3 horas, ajustada para pH 7,4 com ácido clorídrico IN, e centrifugação durante 10 minutos a 2.000 rpm. O produto flutuante (que sobrenadava) foi di-19vidido ao meio e cada porção foi colocada numa coluna P-6 de Bio-gel (Bio-Rad Laboratories, 32nd and Griffin Avenue, Richmond, Califórnia 94804) com solução salina tamponada com fosfato (PBS) com pH 7,4 como o eluente. Os picos do conjugado foram recolhidos em 3 fracções para cada porção. Fracções semelhantes foram combinadas a partir de 2 trajectórias. As segundas fracções combinadas foram concentradas até 3 ml e diluidas com PBS para dar origem a uma solução com uma concentração de 25,44 mg/ml com um volume total de 13,29 ml. Recuperaram-se 338 mg de proteina e a relação molar entre o nucleosido e a proteina foi de 4:1. O produto foi esterilizado e usado para as experiências in vivo que se seguem.

Exemplo 3

5¹-0-(3-CArboxi-l-oxopropil)-2'-desoxi-2',2¹-difluorocitidina

Uma porção de 600 mg de cloridra. to de 2'-desoxi-22'-difluorocitidina seca, foi adicionada a 6 ml de piridina seca, e adicionaram-se 804 mg de anidrido succinico. A mistura da reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 1,5 horas. A mistura foi então concentrada até se obter um óleo sob vácuo, e o óleo foi armazenado durante a noite no congelador. Foi então deixado repousar à temperatura ambiente durante 4 horas, sendo então cromatografado sobre uma coluna de 500 ml de Q-Sepharose (Pharmacia Inc.). O óleo foi dissolvido em 6 ml de tampão acetato de amónio 0,lM, e foi passado sobre a coluna, fazendo-se a eluição com um tampão gradiente acetato de amónio que variou entre 0,lM el,0M com um pH 8,0 todas as vezes. A cromatografia ana-20-

lítica da mistura numa coluna pequena mono-Q revelou estarem presentes produtos bis-acilados e tris-acilados, assim como produto mono-acilado e uma pequena quantidade de material de partida. As fracções contendo o produto, numa quantidade de cerca de 200 ml, foram colocadas num banho a 37°C durante 68 horas. No fim deste periodo de tempo, o produto tris- .

-acilado tinha sido decomposto e ambos os produtos mono- i e bis-acilados encontravam-se ainda presentes.

A mistura do produto foi então separada por meio de cromatografia preparativa numa coluna mono-Q, fazendo-se a eluição com o mesmo tampão gradiente atrás usado. As fracções contendo o produto mono-acilado foram recolhidas, reunidas e secas por congelação duas vezes para se obter 508 mg do produto intermediário desejado. O produto foi identificado por análise de ressonância magnética nuclear, usando D„0 como o solvente num instrumento de , ; 300 mHz. Os dados caracteristicos do espectro foram 6,15, t dupleto, 1H(C5); 6,25, tripleto, 1H(C1'); 7,7 dupleto, 1H (C6) .

Exemplo 4

5'-0-(3-Carboxi-l-oxopropil)-2'-desoxi-2¹,2¹-difluorocitidina

N-(3-Carboxi-l-oxopropil)-2¹-desoxi-2¹,2¹-difluorocitidina

Duzentos mg de 2'-desoxi-22¹-difluorocitidina, clorohidreto, foram dissolvidos em 2 ml de piridina, sendo então adicionados 134 mg de anidrido

succinico. A mistura foi agitada à te^mperatura ambiente durante 1,25 horas, sendo então concentrada sob vácuo. 0 residuo foi dissolvido em diclorometano/metanol, e a solução foi absorvida sobre 1,5 g de gel de silica, o qual foi então transformado em pasta em diclorometano e carregado sobre uma coluna de gel de silica de 4 g. A coluna foi elui ! da com um solvente em gradiente, começando com diclorometa- j no e finalizando com metanol. As fracções contendo o produto foram combinadas e secas por congelação durante a noite para se obter 255 mg da mistura dos produtos. Esta foi dissolvida em 3 ml de acetato de amónio 0,01M, e foi cromatografada sobre uma coluna de fluxo rápido mono-Q de 22 ml (Pharmacia Inc.) fazendo-se a eluição com o tampão em gradiente acetato de amónio o qual foi previamente descrito. A evaporação das fracções contendo o produto deu origem a uma mistura dos produtos mono-acilados indicados no cabeçalho.

Usando a análise tal como foi

descrito no exemplo 3, foram observados os dados de RMN que
se seguem, <	los dois produtos.
			N-acilado	O-acilado
Tripleto	1H	(Cl' )	í 6,25	S 6,25
Dupleto,	1H	(C5)	ó 7,4	6,15
Dupleto,	1H	(C6)	^8,2	7,7

Exemplo 5

Activação de 5¹-0-(3-carboxi-l-oxopropil)-2¹-desoxi-2¹,2'-difluorocitidina

Uma porção de 23,2 mg do composto intermediário do exemplo 1 foi pesado para um frasco de 50 ml, e foi dissolvido numa pequena quantidade de metanol. Adicionaram-se então alguns ml de benzeno, e a solução foi evaporada sob vácuo. A dissolução e a evaporação foram repetidas uma vez, para assegurar que o composto ficasse seco. Este foi então dissolvido em 1,2 ml de dimetilformamida, a qual tinha sido armazenada na presença de um crivo molecular para a secar. Adicionou-se uma porção de 14,7 mg de N-hidroxisuccinimida, seguindo-se 14,5 mg de diciclohexilcarbodiimida. A mistura foi então agitada durante a noite à temperatura ambiente, para se obter o éster succinimidoxi de 5¹-0-(3-carboxi-l-oxopropil)-2¹-desoxi-2¹,2¹-difluorocitidina.

Exemplo 6

Conjugação com anticorpo 9.2.27

Uma porção de 624 ul da solução de ester activo do exemplo 5 foi adicionada a um recipiente, e a este adicionaram-se 100 mg de anticorpo isolado 9.2.27. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante algumas horas, sendo então armazenada no frigorifico durante dois dias. A mistura foi então cromatografada sobre uma

coluna de exclusão de tamanho G-50 (Pharmacia Inc.), fazendo-se a eluição com PBS. As fracções que contêm o produto foram examinadas por análise por ultravioletas observando o máximo a 280 e o minimo a 251 . A relação entre a droga e o anticorpo foi de 3,7 moles de droga por mole de anticorpo.

Exemplo 7

Conjugação com anticorpo 007B

Uma solução de éster activado i foi preparada tal como foi descrito no exemplo 5, mas numa concentração duas vezes superior, uma porção de 1,4 ml desta solução foi adicionada a 500 mg de anticorpo isolado 007B e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante quatro horas. Foi então centrifugada, e a pilula sólida foi carregada sobre e cromatografada através de uma coluna G-50 tal como foi descrito no exemplo 6 atrás referido. Obtiveram-se dois grupos de fracções contendo o produto, que foram analisados por ultravioletas, tal como foi descrito no exem pio 6. A análise dos dois grupos revelou que 8,9 e 10,2 moles de droga foram conjugados com cada mole de anticorpo, respectivamente.

A inibição do adenocarcinoma P3-UCLA no ratinho nú (rapado) fêmea foi determinada por técnicas padrão. A inoculação dos ratinhos foi realizada no dia 0, os compostos foram doseados intravenosamente nos dias 2, 4 e 8, e a avaliação foi feita nos dias 14 ou 21.

i

A inibição percentual do crescimento do tumor foi determinada utilizando controlos (testemunhas) recebendo apenas o veiculo. Foram usados grupos de 5 ratinhos para cada teste e para cada grupo de controlo (testemunha). A dose para o conjugado é expressa como o mg/kg calculado do nucleosido de origem (original)administrado. Os resultados destes tes- ί tes são resumidos no Quadro II.

QUADRO II

Inibição do Adenocarcinoma P3-UCLA

em ratinhos Nús
Composto do Exemplo	Dose (mg/kg)*	Inibição Percentual
14 dias	21 dias
1	5,0	25%	37%
2	5,0	86%	84%
	2,5	63%	62%
	0,5	31%	27%

* Dose administrada intravenosamente nos dias 2, 4 e 8.

Inoculação de células no dia 0; avaliação nos dias 14 ou 21.

Dose para o exemplo 2 calculada como mg/kg do nucleosido de origem (original).

-25Foram realizados testes adicionais do mesmo tipo, com observação dos animais, 14. 21 e 28 dias após a inoculação. 0 conjugado do exemplo 2 foi um lote reunido posuindo uma taxa média de conjugação de 7, 8.

Composto do Exemplo	Dose (mg/kg)	Inibição Percentual
14 dias	21 dias 2	8 dias
1	10	41	36	28
	2,5	28	18	2
	0,5	25	7	23
2	10	97	99	95
	5	97	98	94
	2,5	96	92	85
	1	48	38	32
	0,5	48	16	4
		Um dos cinco	jratinhos	com a

taxa mais elevada do exemplo 1 morreu, tal como aconteceu com três dos cinco ratinhos com a taxa mais elevada do exemplo 2.

Os resultados dos testes atrás referidos demonstram o valor da conjugação do nucleosido a um anticorpo director. Torna-se óbvio a partir dos dados que a droga conjugada produz uma inibição duas vezes maior do tumor, em comparação com o nucleosido de origem (original) mesmo com doses não tóxicas, inferiores.

Os testes in vitro foram realizados num sistema ELISA para determinar a afinidade da porção do anticorpo da droga conjugada em relação ao antigénio ao qual está ligado o anticorpo não conjugado. Os resulta, dos são apresentados como a fracção do anticorpo presente na amostra qie se liga ao antigánio.

Anticorpo 007B

Taxa de Conjugação

8,9

6,6

2,5

Anticorpo 9.2.27

Taxa de Conjugação

16,5

4,9

Resultado ELISA

0,43

0,42

0,55

Resultado ELISA

0,15

0,26

0,65 f ¹ «

Os novos conjugados do invento ; são uteis no tratamento de cancros e como tal são preparados de preferência para utilização em formulações apropriadas para injecção. Assim o invento inclui uma formulação farmacêutica, por exemplo, uma preparação injectável compreendendo um conjugado do invento juntamente com um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável tal como os que são bem conhecidos nesta técnica. A formulação é feita de !

preferência sob a forma de unidade de dosagem, contendo cada dosagem, por exemplo, de 0,01 a 10 mg do ingrediente activo (em termos de metade da droga nucleosido).

Os novos conjugados são eficazes com amplas variações de taxa de dosagem por semana, por exemplo, para o tratamento de seres humanos adultos que sofram de cancro, as doses situar-se-ão entre 0,01 e 10 mg/kg (uma metade da droga nucleosido),mais usualmente variando entre 0,03 e 9 mg/kg. Contudo deve ter-se em consideração que a quantidade de conjugado realmente administrada será determinada por um médico dependendo de circunstâncias relevantes, incluindo a situação a ser tratada e a via de administração escolhida.

Claims

REIVINDICAÇÕES lâ. - Processo para preparar um conjugado com a fórmula (Q)_n~Im em que Im é uma imunoglobulina ou um fragmento de imunoglobulina, n é cerca de 1-10, e Q é um difluoronucleosídeo acilado com a fórmula

R1OH2CI

Ϊ

Hl-F (I) em que a porção -R-NH- é é hidrogénio, C^-C^alquilo, -COR^, ou -COXCO-; R£ é hidrogénio ou -COXCO-; R₄ é hidrogénio, C^-C^lquilo, amino, bromo, fluoro, cloro ou iodo; R^ é hidrogénio ou ^C1~^C4 ^x ® ^uma ligação» ^Cl~^C10 alquileno de cadeia linear, ^C2^-C10^al^^U‘*‘^leno ramificado ' ^C2 ^C10 alquenileno, C₃-C_1Qalquinileno, C₃-C_1Qalquinileno, C₃-CgCicloalquileno, fenileno, ou C^-C^Qalquileno substituido com hidroxi, e A é N ou C-R^; contanto que um e apenas um de entre R₁ θ r_{2 se}ja -COXCO-; caracterizado por compreender a reacção de um composto com a fórmula

Λ R-NHR s

O

-----1>—F

RaOHsC^ / \ r ¹ηΓ~ (VII) em que R_o é hidrogénio, C, -C.alquilo, -COR-. ou -COXCOZ;

Rg é hidrogénio ou -COXCOZ; contanto que um e apenas um de entre Rg e Rg seja -COXCOZ; Z é um grupo de activação; com a imunoglobulina ou fragmento de imunoglobulina.
2½. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um conjugado em que Im é uma imunoglobulina possuindo propriedades de reconhecimento de antigénios.
3â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um conjugado em que a imunoglobulina é um anticorpo monoclonal.
4â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um conjugado em que R2 é hidrogénio.

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I

I

-305§. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um conjugado em que Q é 5¹-0-(1,4-dioxobutil)-2¹-desoxi-2¹,2'-difluorocitidinilo.^Λ