PT85921B

PT85921B - Processo para a preparacao de um novo antibiotico glicopeptidico

Info

Publication number: PT85921B
Application number: PT85921A
Authority: PT
Inventors: Holdom Kelvin Scott; Roddock John Cornish; Tone Junsuke; Maeda Hiroshi
Original assignee: Pfizer Ltd
Priority date: 1986-10-16
Filing date: 1987-10-14
Publication date: 1990-08-31
Also published as: GR3000885T3; CA1337759C; EP0265143A2; IE872775L; DE3764604D1; DK538787D0; AU7978987A; US4954482A; GB8624806D0; AU584525B2; JPH0432080B2; JPS63104998A; DK538787A; ES2017722B3; EP0265143A3; DK167816B1; PT85921A; IE60376B1; US4992369A; EP0265143B1

Description

PFIZER LIMITED

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM NOVO ANTIBIÓTICO GLICOPEPTIDICO

o qual pode ser preparado por propagação aeróbica submersa em meios nutritivos aquosos de Actinoplanes sp. ATCC 53533.

antibiótico e os seus catiónicos são activos contra diversos microorganismos e são eficazes no controle de coccidiose, entrite, disentria de suínos e teileriose, e também eficazes para promover crescimento e/ou melhorar a eficiência da utilização de alimentos em aves domésticas, suínos e ruminantes.

-3Antecedentes da Invenção

A presente invenção diz respeito a um novo elemento do grupo glicopeptídico de antibióticos, classe de compostos caracterizados biologicamente pela sua acção antibacteriana Gram-positiva exercida pela inibição de biossíntese de parede de célula bacteriana. Esta família de antibióticos inclui agentes conhecidos, por exemplo avoparcina; actaplanina; teicoplanina; complexo A41030 e as aridicinas. 0 assunto foi examinado por Williams e Barna. Estrutura e modo de acção de glicopeptídeos antibióticos do grupo vancomicina. Annual Rev. Microbiol., 38, 339, 1984.

Na busca de novos antibióticos, tenta-se sempre que possível a modificação estrutural de antibióticos conhecidos. Esta via está limitada, no entanto, a modificações que retêm a actividade desejada. Muitos antibióticos, incluindo os glicopeptídeos, têm estruturas tão complexas que pode ser difícil fazer, por meios químicos, mesmo pequenas modificações. A descoberta de novos antibióticos produzidos por processos de fermentação continua a ter, portanto, grande importância mesmo em casos em que o antibiótico., uma vez identificado, é muito similar a um antibiótico conhecido anteriormente.

Os gl icopeptídeos antibióticos mencionados acima são activos contra bactérias

Gram-positivas.

Têm sido utilizados, portanto, com graus de êxito diversos para administração a aves domésticas e outros animais de criação incluindo os ruminantes e porcos, para controlar infecção ou promover crescimento ou produção de leite.

Entre diversos estados que podem ser tratados com estes agentes está a entrite, uma doença que pode causar grandes perdas económicas a produtores de gado. A enterite ataca frangos, porcos, gado vacum e ovinos e é atribuída principalmente a bactérias anaerbicas, particularmente Clostri dium perfringens, e víros. A enteroxemia em ruminantes, um exemplo da qual é a doença do excesso de comida nos ovinos, é um estado causado por infecção devida a C. perfringens.

A melhoria de resultados (maior velocidade de crescimento e/ou maior eficiência de utilização dos alimentos) em ruminantes como gado vacum, e em animais monogástricos como porcos, é outro objectivo economicamente desejável da ciência veterinária. Tem interesse particular a melhoria de resultados obtida pelo aumento da eficiência da utilização dos alimentos. 0 mecanismo para a utilização da maior parte nutritiva de alimentos para ruminantes é conhecido. Microrganismos do rúmem do animal degradam hidratos de carbono para produzir monossacáridos, e, em seguida, transformar estes monossacáridos em compostos piruvatos são metabolizados por processos microbiológicos para formar acetatos, butiratos ou propionatos, denominados colectivamente ácidos gordos voláteis. Embora se utilizem acetatos e butiratos, os propionatos são utilizados com maior eficiência. Além disso, quando se dispõe de propionato em quantidade pequena de mais, os animais podem sofrer de cetose. Um composto benéfico, portanto, estimula os animais a produzir uma proporção maior de propionatos a partir de hidratos de carbono, aumentando por este meio a eficiência da utilização de hidrato de e diminuindo ao mesmo tempo a incidência de cetose.

Descrição Pormenorizada da Invenção

A presente invenção refere-se a um novo glicopeptídeo ácido antibiótico, designado por UK-68,597, produzido pela propagação aeróbica submersa em meios nutritivos aquosos de um microrganismo isolado a partir de uma amostra de solo proveniente de Sam Diego, Califórnia, EUA. 0 antibiótico é activo contra vários microrganismos e é eficaz na promoção de crescimento e no aumento da eficiência da utilização dos alimentos em aves domésticas, suínos e ruminantes.

microrganismo é designado na presente por Actinoplanes sp, ATCC 53533. Foi identificado como uma espécie de Actinoplanes devido às suas hifas estreitas, micélio substrato laranja-amarelado a laranja e composições de aminoácido e açúcar da célula completa.

Uma cultura deste microrganismo, designada na presente por N693-3, foi plantada a partir de um corte em caldo de cultura ATCC N⁹. 172 e cultivada durante qua. tro dias a 28⁹C num sacudidor. Seguidamente foi centrifugada durante 20 minutos, lavada três vezes com água destilada esterilizada e plantada em meios correntemente utilizados para iI dentificação de elementos dos Actinomicetales conforme descrito adiante. A cultura foi incubada à temperatura de 28^QC e os resultados foram lidos em momentos diversos, mas a sua maior parte foi correntemente lida aos 14 dias. As cores descritas em terminologia comum mas determinaram-se cores exactas por meio de comparação com rodelas coloridas do Manual da Harmonia das Cores, quarta edição. Os métodos das análises de aminoácido e açúcar da célula completa são os descritos por Becker, B. et al, Appl. Microbiol. 12,421-423, 1964; e por Lechevalier, Μ. P., J. Lab. Clin. Med., 71,934-944, 1968.

| Os meios de identificação utilizados para a caracterização da cultura e as referências para a sua composição são os seguintes:

1. Caldo de Extrato Triptona-Fermento - (meio ISP n⁹.1, Difco)

2. Agar de Extracto Fermento-Extracto Malte - (meio ISP n^s. 2,

Difco).

3. Agar de Farinha de Aveia - (meio ISP n⁹.3, Difco).

4. Agar de Sais Inorgânicos-Amido - (meio ISP n⁹.4, Difco).

5. Agar de G1icerol-Asparagina - (meio ISP n⁹.5, Difco).

6. Agar Ferro Extrato Peptona-Fermento - (meio ISP n⁹.6, Difco).

7. Agar Czapek-Sacarose - S.A. Waksman, The Actinomycetes, Vol. 2, meio n⁹. 1, p. 328, 1961.

8. Agar Glucose-Asparagina - Ibid, meio n⁹. 2, p. 328.

9. Agar de Bennett - Ibid, meio n⁹. 30, p. 331.

10. Agar de Emerson - Ibid, meio n⁹. 28, p. 331.

11. Agar Nutritivo - Ibid, meio n⁹. 14, p. 330

12. Agar de Extracto Glucose-Fermento - Ibid, meio n⁹. 29, p. 331.

13. Agar de Peptona-Czapek - J.N. Couch, J. Elisha Mitchell Soc., 79,53-70, 1963.

14. Agar de Hickey e Tresner - R.J. Hickey e H.D. Tresner, J. Bacteriol., 64,891-892, 1952.

15. Agar Tirosina de Gordon e Smith - R.E. Gordon e M.M. Smith, J. Bact., 69,147-150, 1955.

16. Agar de Caseína - Ibid.

17. Agar de Malato de Cálcio - S.A. Waksman, Bact. Rev., 21,1-29, 1957.

18. Agar de Gelatina - R.E. Gordon e J.M. Mihm, J. Bact., 73,15-27, 1957.

19. Agar de Amido - Ibid.

20. Agar de Nitrato Orgânico - Ibid.

21. Agar de Cenoura e Batata - M.P.- Lechevalier, J, Lab. and Clin. Med. 71,934,944, 1968, mas utilizar apenas 30 g de batatas, 2,5 g de cenouras e 20 g de ágar.

22. Agar de Agua Corrente a 2%.

23. Caldo de Nitrato de Dextrose - S.A. Waksman, The Actinomycetes, Vol. 2, meio n^s. 1, p. 328, 1961, com 3 g de dextrose a substituir 30 g sacarose e sem ágar.

24. Utilização de celulose

a) H.L. Jensen, Proc.. Linn, Soc. N.S.W., 55,231-248, 1930.

b) M. Levine e H. W. Schoenlein, Compilação de Meios de Cultura, meio n^s. 2511, 1930.

25. Leite Desnatado - Difco.

26. Hidratos de Carbono - G.M. Luedemann e B.C. Brodsky, Antimicrob. Agents Chemother., 1964,47, 1965, meio ISP n^e.9 Difco.

27. Gama de Temperaturas - Manual de Meios ATCC, meio ATCC 172 P edição, p. 10, 1984.

As observações de crescimento e aspecto do organismo foram as seguintes:

Agar de Extracto de Fermento-Extracto de Malte - Crescimento bom, laranja a laranja amarelado (5ia, 51a, 4ga), rugoso, elevado, nenhum micélio aéreo; reverso igual à superfície; nenhum pigmento solúvel.

Agar de Farinha de Aveia - Crescimento moderado a bom, creme mas laranja amarelado pálido em direcção à borda, moderadamente elevado, liso, nenhum micélio aéreo; reverso laranja amarelado pálido (3ca, 3ea); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Saís Inorgânicos-Amido - Crescimento moderado, laranja amarelado (4ea, 4ga), liso, um puoco elevado, nenhum micélio aéreo; reverso igual à superfície; nenhum pigmento solúvel.

Agar de G1icerol-Asparagína - Crescimento bom, laranja a laraji ja escuro (41a, 51a), enrugado, elevado, nenhum micélio aéreo; reverso igual à superfície; nenhum pigmento solúvel.

Agar de Czapek-Sacarose - Crescimento moderado, laranja amarelado pálido (3ca), um pouco elevado, nenhum micélio aéreo; reverso laranja amarelado pálido (3ca, 3ea); nenhum pigmento solúvel .

Agar de Glucose-Asparagína - Crescimento moderado a bom, laraii ja (4ga, 4ia), liso mas pode ser enrugado em direcção à borda, moderadamente elevado, nenhum micélio aéreo; reverso laranja (4ía, 41a); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Bennet - Crescimento bom, laranja amarelado (4ia, 4pa), enrugado, elevado, nenhum micélio aéreo; reverso laranja amar£ lado (41a, 4pa), nenhum pigmento solúvel.

Agar de Emerson - Crescimento bom,laranja avermelhado (6ia, 6,5ga), enrugado, elevado, nenhum micélio aéreo; reverso igual à superfície; pigmento solúvel castanho amarelado (41c).

Agar Nutritivo - Crescimento fraco a moderado, laranja avermelhado (5ea,55ga, 6ga), liso mas enrugado em direcção ao fim de faixa, delgado mas elevado em direcção ao fim de faixa, nenhum micélio aéreo; reverso igual à superfície; nenhum pigmento solúvel .

Agar de Extracto Glucose-Fermento - Crescimento excelente, laranja (41a, 51a), enrugado, muito elevado, nenhum micélio aereo; reverso igual à superfície; pigmento solúvel castanho amarelado (31c).

Agar de Peptona-Czapek - Crescimento escasso, laranja amarelado (4ia), granular, elevado, nenhum micélio aéreo; reverso igual à superfície; nenhum pigmento solúvel.

Agar de Hickey e Tresner - Crescimento bom, amarelado a laranja amarelado (3ea, 3ia, 4ia), enrugado, elevado, nenhum micélio aéreo; reverso igual à superfície; nenhum pigmento solúvel.

Agar Tirosina de Gordon e Smith - Crescimento moderado, averme lhado escuro (61e, 6,51e), liso mas pode ser enrugado no fim de faixa, delgado a um pouco elevado, nenhum micélio aéreo; reverso castanho a castanho avermelhado (51e, 61a); pigmento solúvel castanho escuro (5ng).

Agar de Caseína - Crescimento moderado a bom, laranja vivo (5na, 5pa), enrugado, moderadamente elevado, nenhum micélio aéreo; reverso igual à superfície; pigmento solúvel amarelado (21c).

Agar de Malato de Cálcio - .Crescimento fraco a moderado, laran_ ja amarelado pálido (3ea, 4ea), liso, delgado, nenhum micélio aéreo; reverso igual à superfície; nenhum pigmento solúvel.

Agar de Gelatina - Crescimento moderado a bom, laranja (5ga, 5ia), enrugado, moderadamente elevado, nenhum micélio aéreo; reverso igual à superfície; nenhum pigmento solúvel.

.Agar de Amido - Crescimento bom, laranja (5ia), enrugado, elevado , nenhum micélio aéreo; reverso laranja (5ia, 6ga); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Cenoura e Batata - Crescimento moderado, laranja-amarelado (3ea, 3ga), liso, delgado, nenhum micélio aéreo; rever, so igual à superfície; nenhum pigmento solúvel.

Agar de agua Corrente - Crescimento fraco a moderado, creme (2ca), liso, delgado, nenhum micélio aéreo; reverso incolor a creme (2ca); nenhum pigmento solúvel.

Propriedades Morfológicas - Hifas vegetativas estreitas, rectas ou onduladas, ramificadas, diâmetro 0,4-1,0 um, não se produziram nenhuns esporos ou esporângios depois de decorridas quatro semanas de incubação nos meios utilizados; decorridas sete se manas de incubação a 21²C ou 28²C em ágar de farinha de aveia, ágar de glicerol-asparagina, ágar de Czapek-sacarose, ágar de extractos de glucose-fermento ou ágar de Hickey e Tresner, não se produziram esporos ou esporângios.

Propriedades Bioquímicas - Melanina não produzida em caldo de extracto triptona-fermento; sulfureto de hidrogénio produzido em ágar de extracto de peptona-fermento; gelatina liquefeita; amido hidrolisado; nitrato reduzido para nitrito em caldo de n_i. trato orgânico e caldo de nitrato de dextrose; crescimento bom mas nenhuma desintegração em ambos os caldos de celulose; coagulação em leite; digestão de caseína positiva; digestão de m_a lato de cálcio negativa; digestão de tirosina negativa. Utilização de hidrato de carbono; glucose, arabinose, frutose, inositol, manitol, rafinose, ramnose, sacarose, xilose, celobiose, dulcitol, galactose, glicerol, lactose, manose, melezitose, me libiose, ribose, salicina, amido solúvel, sorbitol e trehalose utilizados, adonitol e sorbose não utilizados.

Relações de Temperatura:

21²C	28²C	37²C	45²C
Crescimento Excelente	Crescimento Excelente	Crescimento Bom a Excelente	Nenhum Crescimento

-11Análise de Parede de Célula - Os hidrolisados de célula completa comtinham ácido 3-hidroxidiaminopimélico, xilose, arabinose, glucose, manose e ribose.

A cultura N693-3 é caracterizada pelo micélio substrato laranja-amarelado a laranja, a falta de esporos ou esporângios, e a ausência de pigmentos solúveis na maior parte dos meios utilizados. As tentativas feitas para induzir a produção de esporo ou esporângio falharam. As reacções negativas incluem produção de melanina, desintegração de celulose, digestão de malato de cálcio ou tirosina, utilização de adonitol e sorbase, e crescimento a 45⁹C. As reacções que se seguem são positivas: liquefacção de gelatina, hidrólise de amido, redução de nitrato, crescimento em celulose, coagulação e clarificação.em leite, digestão de caseína, utilização de todos os açúcares utilizados, salvo adonitol e sorbose; crescimento a 21^SC, 28^SC e 37^SC. A presença de ácido

3-hidroxidiaminopimélico, xilose, arabinose, manose e ribose indica que a cultura pertence ao Tipo II de parede de célula.

Visto que a cultura em estudo não produziu esporângios, e dado que a apreciação do género Actinoplanes depende das dimensões e formas dos esporângios, a sua identificação ao nível de espécie é impossível, e, por conseguinte, a cultura N693-3 é comsiderada uma espeóie do género Actinoplanes e denominada Actinoplanes sp. Foi depositada na Colecção Americana de Culturas Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, E:U.A., de acordo com os termos do Tratado de Budapeste de 3 de Setembro de 1986, com o número de entrada ATCC 53533.

A cultura e isolamento de Antibiótico UK-68.597 podem ser efectuados em condições análogas às geralmente utilizadas para produzir antibióticos por fermentação. A cultura efectua-se preferivelmente em meios nutritivos aquosos em condições aeróbicas submersas, com agitação, a

uma temperatura de 24^Q a 36^SC. Os meios nutritivos utilizáveis para a cultura incluem uma fonte de carbono assimilável, por exemplo açúcares, amidos e glicerol; uma fonte de azoto orgânico, por exemplo caseína, digesto enzimático de caseína, farinha de soja, farinha de semente de algodão, farinha de amendoim, glútem de trigo, farinha de carne e farinha de peixe. Uma fonte de substâncias de crescimento, por exemplo grãos solúveis, farinha de peixe, farinha de semente de algodão, e extracto de fermento assim como sais minerais, por exemplo cloreto de sódio e carbonato de cálcio e vestígios de elementos, por exemplo ferro, magnésio, cobre, zinco, cobalto e manganês, pode também ser utilizada com resultados vantajosos. Se houver formação de espuma excessiva durante a fermentação podem juntar-se agentes antiespuma, por exemplo polipropileno glicóis ou silicones ao meio de fermentação. 0 arejamento do meio em tanques para crescimento submerso é mantido preferivelmente com o débito de cerca de 0,5 a 2 volumes de ar livre es_ terilizado por volume de caldo de fermentação por minuto, for çado para o interior do caldo de cultura por meio de um asper sor. Pode manter-se agitação por meio de agitadores conhecidos em geral pelos técnicos da fermentação. A velocidade da agitação depende do tipo de agitador utilizado. Um balão sacudidor é agitado em geral a 150 a 200 ciclos por minuto, ao passo que uti fermentador é mantido em geral a 300 a 1700 revoluções por minuto. E claro que se devem manter condições assép ticas durante a transferência do organismo e durante todo o seu crescimento.

Pode obter-se inóculo para a preparação dos antibióticos de acordo com a presente invenção, por meio da uti1ização de crescimento a partir de um corte da cultura ou de garrafas

Roux inoculadas com a cultura:Um meio sólido apropriado para crescimento inicial do organismo em cortes e em garrafas Roux é o meio ATCC n^e. 172. A cultura po de ser utilizada para inocular balões sacudidores ou tanques de inóculo, ou os tanques de inóculo podem ser semeados a par;

tir dos balões sacudidores. A cultura em frascos sacudidos a-13tingirá em geral o máximo ao fim de 4 ou 5 dias, ao passo que

inóculo em tanques de inóculo submerso estarão no período mais favoravel ao fim de 3 a 6 dias.

andamento da produção de antibióa fermentação e a bioactividade da cultura de fer bioactividade da cultura de fermentação podem ser tico durante mentação e a observados por meio de experiência biológica da cultura como emprego de uma estirpe sensível de Staphylococcus aureus ou

Baci 1 lus subtilis. A estirpe B_. Subtil is ATCC 6633 é apropriada para este fim. Emprega-se técnica de experiência de placa normal, na qual a zona de inibição que rodeia um disco de pa pel de filtro saturado com a cultura é utilizada como medida de potência antibiótica. Além disso,a cromatografia de camada delgada que emprega gel de sílica é um instrumento útil para a detecção dos antibióticos produzidos em meios de fermentação e para a análise da composição de materiais impuros e purifica dos extraídos das culturas de fermentação. Os cromatogramas são revelados com acetonitrilo, água, hidróxido de amónio (3:1.7), e a placa revelada é revestida com ágar semeado com aureus ou B>. subtilis e incubada a 37²C durante 16 horas pa. ra tornar visíveis os antibióticos.

antibiótico UK-68,597 produzido

Actinoplanes sp, ATCC 53533 pode ser sepapor meio de ajustamento do pH de toda a cultura para pH 0 antibiótico de adsorções por fermentação de rado , e filtração da cultura para retirar micélio.

pode em adsorventes apropriados, por exemplo resinas permutadoras ser adicionalmente purificado por sucessão de iões, suportes inorgânicos hidrófobos modificados quimicamente como os utilizados em cromatografia líquida de fase inversa com grande eficácia, ou polímeros com grande porosidade, eluindo o antibiótico em cada caso com um dissolvente apropri ado.

composto antibiótico de acordo com a presente invenção é ácido, e formará sais catiónicos por reacção com agentes básicos. Todos esses sais estão abrangidos

no âmbito da invenção.

antibiótico UK-68.597 pode ser caracterizado com base nas seguintes propriedades fisioquími cas.

A) Espectro de absorção ultraviole - ta. 0 composto apresenta os seguintes máximos de absorção:

Dissolvente máx (nm)

a)	metanol		238,	280,	370
b)	metanol,	HCl 0,1 M (9:1)	238,	286
c)	metanol,	NaOH 0,1 M (9:1)	264,	300,	358

B) Espectro de absorção infraverme lha. 0 composto apresenta os seguintes máximos de absorção (cm^-1); 3700-3100; 1660; 1595; 1500; 1230; 1140; 1055; 1015; 990; 755.

C) Rotação óptica /<Χ/₀ ²^θ = -25,6⁹(c = 0,1, DMSO)

D) Tempo de retenção (Rt) de 12,4 mj_ nutos, quando analisado por CLPE de fase inversa nas seguintes condições:

Coluna : C-18 Micro-Bondapack, 3,9 mm (i.d.) χ 150 mm (waters)

Eluente

Caudal

Detecção : CH3CN 10%, formato de amónio aquoso

0,1M 90% ajustado para pH 7,4 : 2 ml/min : U.V. a 225 nm

E) Peso molecular deduzido de um espectro de massa de bombardeamento atómico rápido que apresenta o pico M+ em m/e 1651.

Com base em espectroscopia de ressonância magnética nuclear em combinação com espectrometria de massa, foi atribuida ao UK-68.597 a seguinte estrutura:

'1

antibiótico UK-68.597 manifesta a£ ção inibitória contra o crescimento de vários microrganismos Gram-positivos. No Quadro 1, abaixo, estão resumidos os resultados de experiências in vitro. Para esta experiência, cada oj? ganismo é inoculado numa série de tubos de ensaio que contêm meio nutritivo e diversas concentrações de Antibiótico UK-68.597 para determinar a concentração mínima do composto em mcg/ml que inibe o crescimento do organismo durante um período de 24 ho ras (MIC).

QUADRO I

ACTIVIDADE ANTIBACTERIANA

Organismo	Estirpe NS.	MIC, mcg/ml Antibiótico UK-68.597
Staphylococcus aureus	01A106	12,5
	01A539	12,5
	01A540	12,5
Actinomyces pyogenes	14D011	< 0,2
Pasteurella multocida	59A006	>100
Clostridium perfringens	10A009	4 0,2
Bacteroides frágil is	78C024	>100
Fusobacterium necrophorum	84C004	>100
Treponema hyodysenteriae	94A007	>100

Contra as bactérias gram-negativas como Escheri sch ia coli, e Pseudomonas aeruginosa, os valores MIC foram > 100 em cada caso.

valor de alimentos para animais tem sido determinado em geral directamente, alimentado o animal. A especificação de Patente Britânica N^s. 1.197.826 descreve pormenorizadamente uma técnica de rúmen in vitro por meio da qual as alterações produzidas em alimentos provocados por microrganismos são medidas mais facilmente e com grande rigor na avaliação de alimentos para animais. Esta técnica i£ clui a utilização de um aparelho no qual os processos digestivos dos animais são efectuados e estudados in vitro. Os alimentos para animais, inóculo rúmen e diversos promotores de crescimento são introduzidos e retirados de uma unidade de U boratório em condições cuidadosamente controladas, e as alterações produzidas são estudadas crítica e progressivamente d_u rante o consumo do alimento pelos microrganismos. Um aumento do conteúdo de ácido propiónico do fluido do rúmens indica que uma resposta desejável quanto ao resultado ruminante global foi proporcionada pelo promotor de crescimento na composição alimentar. A variação do conteúdo de ácido propiónico é expressa em percentagem do conteúdo de ácido propiónico encontrado no fluido de rúmen de controlo. Estudos de alimentação in vivo de longo prazo são utilizados para mostrar uma correlação fidedigna entre aumento de ácido propiónico no fluido de rúmen e maior resultado no animal.·

Colhe-se fluido de rúmen de uma vaca fistulada que é alimentada com uma ração de engorda comercial mais feno. 0 fluido de rúmen é imediatamente filtrado através de pano para queijo, e adiciona-se 10 ml a um frasco cónico de 50 ml que contém 400 mg de substrato normal (68% amido de milho + 17% celulose + 15% farinha de soja extraída), 10 ml de um tampão pH 6,8 e o composto em experiência. Os frascos são gaseados com azoto livre de oxigénio durante aproximadamente

dois minutos, e incubados num banho de água sacudido a 39^aC, durante cerca de 16 horas. Todas as experiências são feitas em triplicado.

Depois de incubação, misturam-se 5 ml da amostra com 1 ml de ácido metafosfórico a 25%. Passados 10 minutos, adicionam-se 0,25 ml de ácido fõrmico e a mistura é centrifugada a 1500 rpm durante 10 minutos. As amostras são depois analisadas por cromatografia líquido-gás pelo método de D. W. Kellog, 2· Dairy Science, 52, 1690, 1968. Os máximos para ácidos acético, propiónico e butírico são determinados para amostras provenientes de frascos não tratados e tratados.

Quando exprimentado por este processo in vitro, o Antibiótico UK-68.597 ao nível de 10 microgramas por mililitro provocou um aumento de cerca de 25% na produção de ácido propiónico em relação ao produzido na solução de contrlo sem Antibiótico UK-68.597 adicionado. Em comparação, o composto salinomicina à venda no mercado (um po-liéter antibiótico) a 10 mg/ml produziu um aumento de cerca de 46% de ácido propiónico em relação ao controlo.

Estes dados mostram que o Antibiótico UK-68.597 aumentará a utilização de alimentos por ruminantes como gado vacum e ovinos. Os compostos terão também um efeito análogo em animais monogástricos como suínos e aves d_o mésticas.

Em particular, comforme indicado no Quadro 2, o Antibiótico UK-68.597 é conveniente para aumentar o ganho de peso e a utilização de alimento em aves domésticas.

composto foi adicionado ao al.imeji to que é dado a pintos de criação com quatro dias de idade que se encontram em filas numa base de acesso livre. Decorridos dez dias, as aves são pesadas e o ganho de peso vivo é comparado com um grupo de controlo não tratado para dar uma melho* **

-19ria percentual de ganho de peso vivo. A quantidade de alimento consumida é dividida pelo peso vivo dos animais do grupo quando se completa a experiência, para se obter uma taxa de transformação (que dá uma medida da quantidade de alimento necessária para produzir 1 aumento de 1 Kg do peso corporal), e esta é também comparada com o grupo de controlo e o aumento da taxa de transformação de alimento é calculado em percentagem. Os resultados mostram uma melhoria significativa tanto no ganho de peso vivo como na eficiência de transformação do alimento quando se junta Antibiótico UK-68.597 a alimentos num nível de 10 ppm:

QUADRO 2

AUMENTO DO EFEITO DE ACTIVIDADE EM AVES

DOMESTICAS

Ppm

Ganho de peso vivo (melhoria %)

Taxa de transformação de alimento (melhoria %)

4,3

2,7

Antibiótico UK-68.597 pode ser incorporado em composições alimentares na forma do ácido livre ou na forma de sal. Podem empregar-se formas impuras alternativas de Antibiótico UK-68.597 ou cultura de fermentação seca que contém os antibióticos, por meio de incorporação em composições alimentares, para se obterem as concentrações de potência desejadas de antibiótico.

A invenção é descrita de maneira mais completa pelos Exemplos que se seguem.

’<· _20_

EXEMPLO 1

1. Preparação de Inóculo

Preparou-se um meio aquoso esterilizado que tem a seguinte composição.
Ingrediente	Gramas/1itro
Glucose	1
Amido	24
Peptona	5
Extracto de fermento	5
Extracto de carne	3
Carbonato de cálcio	4
frascos cónicos de 2,8	Distribui-se 1 litro de meio por litros e esteriliza-se a 120⁹C e 1,05

kg/cm (15 p.s.i.) durante 30 minutos. Depois de arrefecimento, o meio é inoculado com uma suspensão de célula vegetativa proveniente de um corte de cultura de Actinoplanes sp ATCC 53533.

Os frascos são sacudidos a 28^SC num sacudidor rotativo quer tem uma deslocação de 4 a 7 cm e 150 a 200 ciclos por minuto durante três a cinco dias.

2. Fermentação e isolamento de Antibiótico UK-68.597

Utilizaram-se 50 ml do meio inóculo descrito no Exemplo 1 para inocular cada um de nove recipientes de fermentação de cinco litros que contêm 2,5 litros de

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meio esterilizado com a composição que se segue, à qual foi adicionado 1 ml de agente antiespuma polipropileno glicol:

Ingrediente

Gramas/1itro

Cerelose10,0

Amido de milho10,0

Farinha de soja10,0

Solúveis de destilaria5,0

Cloreto de sódio5,0

Carbonato de cálcio1,0

Cloreto de cobalto0,002

Agua para 1 litro pH 6,9-7,0

Efectuou-se fermentação a 28⁹C com agitação a 1500 revoluções por minuto e arejamento a um volume de ar por volume de cultura por minuto até se observar actividade substancial (com base em experiência de disco antibiótico dontra B.subtilis ATCC 6633), geralmente 4 a 6 dias.A bioactividade da cultura, ede corrente de recuperação subsequentes, foi acompanhada com oeemprego de uma estirpe sensível de Baci1lus subti1 is ATCC 6633 ou Staphylococcus aureus ATCC 6538. 0 componente antibiótico da cultura e correntes de recuperação subsequentes, foi acompanhada com o emprego de uma etirpe sensível de Baci1lus subti1 is ATCC 6633 ou Staphylococcus aureus ATCC 6538. 0 componente antibiótico da cultura e correntes de recuperação foram detectados depoius de separação cromatográfica com utilização de placas de sílica de gel reveladas com acetonitrilo, água, hidróxido de amónio (3:1:0,7). As placas foram tornadas visíveis com luz UV a 254 nm e em seguida reves_ tidas com ágar, semeado com S. aureus ou J3. subti 1 is, ao qual se tinham adicionado 1,0 ml de uma solução a 1% de cloreto de

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2,3,5,-trifeni1-2H-tetrazó1io, e incubadas a 37^SC durante 16 horas para se observar o antibiótico na forma de uma área braii ca contra um fundo cor de rosa.

No final da fase de produção de fermentação, a cultura proveniente de todos os fermentadores foi ajustada para pH 10 e filtrada para separar micélio. 0 antibiótico UK-68.597 foi adsorvido sobre uma coluna de afinidade que compreende um ligando D-alanina-D-alanina imobilizado numa matriz agarose (conforme descrito na EP 0132117), e eluído com uma mistura de acetonitrilo e hidróxido de amónio 0,1N (30:70). Fez-se nova purificação empregando cromatografia líquida de grande resultado com o uso de gel de sílica silanizado como s_u porte e acetonitrilo, formiato de amónio aquoso 0,1M (pH 7,3.) (1:9) como eluente para dar UK-68.597 em forma pura.

EXEMPLO 2

Utilizaram-se 2 litros de um inóculo preparado conforme descrito no Exemplo 1 para inocular 70 litros de meio inóculo que tem a composição descrita no Exemplo 1 contido num fermentador de 100 litros. Este inóculo de segunda fase foi incubado a 28^aC. Com uma velocidade de agitação de 450 revoluções por minuto e um débito de ar de um volume de ar por volume de cultura por minuto. Depois de 48 horas de in-

cubação, o inóculo meio da composição litros:	foi utilizado para inocular 1200 litros de seguinte, contida num fermentador de 2000
	Meio de Fermentação
Ingrediente		Gramas/1itro
Cerelose Amido de milho		10 10

Farinha de soja10

Cloreto de cobalto0,002

Solúveis de destilaria0,5

Cloreto de sódio5

Carbonato de cálcio1 fermentador foi mantido a 28⁹C, com arejamento e agitação a 160 revoluções por minuto. Decorridas 96 horas, o pH da cultura completa foi ajustado para pH 10,0 e a cultura foi filtrada por um filtro prensa previamente revestido com auxiliar de filtro. Os sólidos que continham os microorganismos foram separados, e o filtrado foi ajustado para pH 7,0. Fez-se o filtrado descer por uma coluna de resina Amberlite XAD-2 (Rohm & Haas), a coluna foi lavada com água e o antibiótico UK-68.597 eluído com acetona aquosa a 50%.

eluato foi concentrado para 12 litros. Depois de diluição com 1,75 litros de formiato de amónio aquoso 0,1 M, carregaram-se 3,5 litros deste concentrado numa coluna Prep-Pak C-18 num sistema de cromatografia líquida de alta pressão Waters Prep 500. A coluna foi eluída, por sua vez, com os dissolventes seguintes:

Dissolvente

Volume (litro) formato de amónio aquoso 0,1 M formato de amónio aquoso 0,1 M, formato de amónio aquoso 0,1 M, água acetonitrilo em água (3:7) acetonitrilo (1:19) 4,5 acetonitrilo (1:9) 1,3

0,9

5,5

I i_r «<

As fracções ricas em antibiótico foram concentradas e adsorvidas sobre resina Amberlite XAD-2. Eluição da resina com emprego de acetona aquosa a 50%, concentração das fracções relevantes e liofilização deram UK-68.597 em forma livre de sal.

Claims

R Ε I V INDICAÇÕES:

la. - Processo para a preparação de um antibiótico que tem a fórmula e dos seus sais catiónicos farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado pelo facto de compreender a cultura do microrganismo Actinoplanes sp. ATCC 53533 ou uma sua forma mutante ou recombinante capaz de produzir um antibiótico com a fórmula (I), em meios de cultura que contêm uma fonte assimilável de carbono, azoto e sais inorgânicos em condições de fermentação aeróbica submersa até ser obtida uma quantidade recuperavel do referido antibiótico.
2â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido antibiótico ser separado do meio de fermentação.

< < ί ·

-263^â.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido antibiótico ser recuperado sob a forma de uma preparação micêlica ou por meio de secagem por aspersão do meio de fermentação completo.
4³.- Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de o referido antibiótico ser misturado com um alimento animal nutritivo.
5^â.- Processo para a preparação de uma composição alimentar nutritiva para gado vacum, porcos ou aves damésticas, caracterizado pelo facto de ser incluído no referido alimento um antibiótico obtido de acordo com a reivindicação 1, numa quantidade eficaz para promover crescimento e,'ou melhorar a utilização do alimento pelos referidos gado vacum ou porcos ou para controlar infecções coccídicas em aves domésticas.