PT788513E

PT788513E - Utilizacao de agentes de ligacao a cd23 no tratamento de doencas autoimunes

Info

Publication number: PT788513E
Application number: PT95936525T
Authority: PT
Inventors: Jean-Yves Marcel Paul Bonnefoy
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1994-10-25
Filing date: 1995-10-20
Publication date: 2001-06-29
Also published as: EP0788514A1; CA2203363A1; ATE198895T1; US20040022783A1; AU710369B2; NO971902D0; EP1018517A3; JPH09511757A; WO1996012742A1; CN1171119A; BR9509434A; IL115733A; MX9702797A; HUT77572A; FI971756A0; IL115733A0; CA2203364A1; ES2154741T3; JPH10507460A; HU223006B1

Description

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DESCRIÇÃO

"UTILIZAÇÃO DE AGENTES DE LIGAÇÃO A CD23 NO TRATAMENTO DE DOENÇAS AUTOIMUNES" A presente invenção refere-se à utilização de agentes de ligação particulares que possuem um efeito no tratamento de doenças autoimunes. CD23 (FCsRII) é uma molécula do tipo II da família das C-lectinas que inclui também o receptor autodireccional de linfócitos (MEL-14) e a molécula-1 de adesão endotelial de leucócitos (ELAM-1). É um receptor de baixa afinidade para IgE. Em humanos uma variedade de tipos de células hematopoiéticas expressam CD23 na sua superfície, incluindo células dendriticas foliculares, células B, células T e macrófagos. As moléculas CD23 são também encontradas em formas solúveis em fluidos biológicos. As moléculas CD23 solúveis (sCD23) são formadas por clivagem proteolítica de receptores transmembranares. CD23 possui actividades pleiotrópicas incluindo mediação da adesão celular, regulação da libertação de IgE e histamina, resgate de células B de apoptose e regulação do crescimento das células mielóides. Estas actividades funcionais são mediadas através da ligação a ligandos específicos de CD23 associados a células, ou sCD23, actuando o último de um modo semelhante à citoquina (Conrad, D.H., Ânnu Rev Immunol 8, 623-645 1990); Delespesse, G. et al., Adv Immunol 49, 149-191 (1991); Bonnefoy, J.Y., et al., Curr

Opin Immunol 5, 944-947 (1993)).

Foi observada expressão aumentada de CD23 num número de doenças inflamatórias. CD23 foi identificado em biópsias sinoviais de doentes com sinovite crónica, e pode ser medido sCD23 em concentrações que excedem os valores normais no soro e no fluido 1

sinovial de doentes com artrite reumatóide (Bansal, A.S., Oliver, w., Marsh, M.N., Pumphrey, R.S., e Wilson, P.B., Immunology 79, 285-289 (1993); Hellen, E.A., Rowlands, D.C., Hansel, T.T., Kitas, G.D. e Crocker, J.J. Clin Pathol 44, 293-296 (1991); Chomarat, P., Brioloay, J., Banchereau, J., & Miossec, P., Arthrit.ifí Rheum 86, 234-242 (1993); Bansal, Λ. , ct al., Clin Exp Immunol 89, 452-455 (1992); Rezonzew, R., & Newkirk, M.M., Clin Immunol Immunopathol 71, 156-163 (1994). Adicionalmente, os níveis de sCD23 no soro em doentes com artrite reumatóide estão relacionados com o estado da doença e correlacionam com o factor reumatóide do soro (Bansal, A.S., et ai., Clin Exp Rheumatol 12, 281-285 (1994)). As citoquinas pro-inflamatórias parecem ser particularmente importantes na artrite reumatóide, e foi postulado um papel central para TNF-a e IL-Ιβ na destruição das articulações artríticas (Brennan, F.M., Chantry, D., Jackson, A., Maini, R. & Feldman, M., Lancet 2, 244-247 (1989); Brennan, F.M., Maini, R.M. & Feldman, M., Br J Rheumatol 31, 293-298 (1992)).

Foi também postulado que as interacções CD23-CD21 podem desempenhar um papel no controlo da produção de IgE (Flores-Romo, L. et ai., Science 261 1038-1041 (1993); Aubry et ai., Nature 358, 505-507 (1992)). CDllb e CDllc são moléculas de adesão que participam em muitas interacções célula-célula e célula-matriz. CDllb/CD18 e CDllc/CD18 (uma associação entre CDllb e CD18 e de CDllc e CD18 respectivamente) foram relatados como ligando vários ligandos, incluindo C.D54, fihrinogénio, factor X, LPS, Con Λ, c zimosana (Springer, T.A., Nature 346, 425-434 (1990)). O papel destas moléculas ligantes não é no entanto completamente compreendido. CDllb/CD18 e CDllc/CD18 são também conhecidos como MAC-1 e pl50, 95 respectivamente. São membros da família de integrinas β2 (por 2

vezes conhecidas como Leu-Cam, isto é, moléculas de adesão de células leucocitárias). Esta família inclui também LFA-1 entre os seus membros (também conhecido como CDlla/CD18). A EP 0205405 propõe-se revelar Mabs contra receptores celulares de linfócitos para IgE (FCsr) que reagem em reacção cruzada com o factor de ligação da imunoglobulina humana (IgE-BF), e derivados deste. A WO 93/04173 pretende revelar um polipéptido que é capaz de se ligar a um dos FCEL (receptor de IgE de baixa afinidade FCeRII) ou FCEH (receptor de alta afinidade FCeRI) mas que é substancialmente incapaz de se ligar aos outros FCEL ou FCEH. O tratamento de uma desordem alérgica é supostamente feito com um polipéptido específico FCEL ou FCEH (desde que o polipéptido específico FCEH seja incapaz de reagir de forma cruzada com FCEH e induzir a libertação de histamina). A EP 0269728 pretende revelar Mabs contra o receptor de IgE de linfócito humano. A EP 0259585 pretende revelar Mabs que reconhecem um receptor de superfície para IgE (FCsR) em linfócitos B humanos. A WO 93/02108 pretende revelar anticorpos primatizados para utilização terapêutica.

Os presentes inventores verificaram surpreendentemente que agentes de ligação a CD23 podem ser de utilidade no tratamento ou profilaxia de várias doenças e em particular no tratamento ou profilaxia de artrite. Antes da presente invenção não tinham sido apresentados resultados que poderiam apoiar tal utilidade, apesar da publicação de um grande número de artigos em que foi discutido o CD23. 3

De acordo com a presente invenção, é proporcionada a utilização de um agente de ligação a CD23 que bloqueia a interacção entre CD23 e um ligando e ligação a CD23 in vivo no fabrico de um medicamento para utilização no tratamento ou profilaxia de doenças autoimunes. 0 agente de ligação pode funcionar bloqueando a interacção entre CD23 e um ligando que se liga a ele. Ensaios in vitro, por exemplo ensaios radio-imunes, podem ser utilizados para estudar tal efeito bloqueante. 0 agente de ligação pode estar numa forma isolada ou como parte de uma composição farmacêutica. Desejavelmente está numa forma estéril. De um modo geral um agente de ligação que é especifico para CD23 é útil no tratamento/profilaxia revelado.

Os presentes inventores demonstraram que os agentes de ligação acima funcionam in vivo no tratamento ou profilaxia de doenças autoimunes.

Esta demonstração é de grande importância, dado o facto destas doenças serem difíceis ou impossíveis de se tratarem eficazmente, apesar do longo período de pesquisa acerca da sua natureza e causas. Este é particularmente o caso respeitante a artrite, que frequentemente afecta pessoas de meia-idade e pode causar-lhes o abandono prematuro do posto de trabalho. Um tratamento eficaz da artrite tem sido um objectivo a longo prazo de muitos grupos de investigação.

Agentes de ligação preferidos incluem anticorpos, fragmentos destes ou construções artificiais compreendendo anticorpos ou fragmentos destes ou construções artificiais concebidas para imitar a ligação de anticorpos ou fragmentos destes. Tais 4

agentes de ligação são discutidos por Dougall et al., em Tibtech 12, 372-379 (1994).

Incluem anticorpos completos, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos ScFv, outros fragmentos, péptidos CDR e imitadores. Estes podem ser obtidos/preparados por especialistas na técnica. Por exemplo, pode ser utilizada digestão enzimática para obter fragmentos F(ab')2 e Fab (sujeitando, uma molécula de IgG a clivagem com pepsina ou papaina respectivamente) . As referências a "anticorpos" na seguinte descrição devem ser entendidas como incluindo todas as possibilidades acima mencionadas.

Podem ser utilizados anticorpos recombinantes. Os anticorpos podem ser humanizados; ou quimerizados.

Uma preparação típica de um anticorpo humanizado no qual os CDRs são derivados de diferentes espécies para além da estrutura dos domínios variáveis dos anticorpos é revelada na EP-A-0239400. Os CDRs podem ser derivados de um anticorpo monoclonal de rato ou murganho. A estrutura dos domínios variáveis e dos domínios constantes do anticorpo alterado' podem ser derivados de um anticorpo humano. Tal anticorpo humanizado estimula uma resposta imunitária negligenciável quando administrada a um humano comparada com a resposta imunitária desenvolvida por um humano contra um anticorpo de rato ou murganho.

Alternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo quimérico, por exemplo do tipo descrito em WO 86/01533.

Um anticorpo quimérico de acordo com WO 86/01533 compreende uma região de ligação ao antigénio e uma região não imunoglobulina. A região de ligação ao antigénio é um domínio variável da cadeia leve ou domínio variável da cadeia pesada de anticorpo. 5

Tipicamente, o anticorpo quimérico compreende os domínios variáveis das cadeias leve e pesada. A região não imunoglobulina é fundida na sua extremidade C-terminal com a região de ligação ao antigénio. A região não imunoglobulina é tipicamente uma proteína não imunoglobulina e pode ser uma região de enzima, uma região derivada de uma proteína possuindo uma especificidade de ligação, de uma proteína toxina ou mesmo de alguma proteína expressa por um gene. As duas regiões do anticorpo quimérico podem ser ligadas através de uma sequência ligante clivável. O anticorpo pode ser uma IgG humana tal como IgGl, IgG2, IgG3, IgG4; IgM; IgA; IgE ou IgD transportando regiões variáveis de rato ou murganho (quiméricos) ou CDRs (humanizados). Técnicas de primatização podem também ser utilizadas, tais como as reveladas em W093/02108.

Como deve ser entendido pelos especialistas na técnica, sempre que são aqui descritos agentes de ligação específicos, também podem ser utilizados derivados destes agentes. O termo "derivado" inclui variantes dos agentes descritos,- possuindo uma ou mais substituições, delecções ou inserções de aminoácidos em relação aos referidos agentes, que possuem ainda a actividade de ligação descrita. Preferencialmente estes derivados possuem uma identidade de sequência de aminoácidos substancial com os agentes de ligação especificados. 0 grau de identidade de sequência de aminoácidos pode ser calculado utilizando um programa tal como "bestfit" (Smith and WdLerraan, Advances in Applied Mathematics, 402-409 (1901)) para encontrar o melhor segmento de semelhança entre quaisquer duas sequências. 0 alinhamento é baseado na maximização do valor conseguido utilizando uma matriz de semelhanças de aminoácidos, 6

tal como a descrita por Schwarz e Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhot, M.O., Ed pp 353-358.

Preferencialmente o grau de identidade de sequência é pelo menos 50% e mais preferencialmente é pelo menos 75%. Mais preferidas são identidades de sequência de pelo menos 90% ou pelo menos 95%.

Deve no entanto ser entendido pelo especialista na técnica que elevados graus de identidade de sequência não são necessariamente exigidos uma vez que vários aminoácidos podem frequentemente ser substituídos por outros aminoácidos que possuem propriedades semelhantes sem alterar substancialmente ou afectar adversamente certas propriedades de uma proteína. Estas são por vezes referidos como alterações de aminoácidos "conservadoras". Assim os aminoácidos glicina, valina, leucina ou isoleucina podem ser frequentemente substituídos uns por outros (aminoácidos possuindo cadeias laterais de hidroxilos alifáticas). Outros aminoácidos que podem ser substituídos uns por outros incluem: fenilalanina, tirosina e triptofano (aminoácidos possuindo cadeias laterais aromáticas); lisina, arginina e histidina (aminoácidos possuindo cadeias laterais básicas); aspartato e glutamato (aminoácidos possuindo cadeias laterais acídicas); asparagina e glutamina (aminoácidos possuindo cadeias laterais amida) e cisteína e metionina (aminoácidos possuindo cadeias laterais contendo enxofre). Assim, o termo "derivado" pode também incluir uma variante de uma sequência de aminoácidos compreendendo uma ou mais destas alterações "conservadoras" em relação à sequência referida. A presente invenção inclui também a utilização de fragmentos dos agentes de ligação acima ou de derivados destes que possuem ainda a actividade de ligação descrita. Fragmentos preferidos 7

têm pelo menos dez aminoácidos em comprimento, mas podem ser maiores (isto é, até 5U ou até 100 aminoácidos de comprimento).

Crê-se que os agentes de ligação utilizados na presente invenção sejam úteis no tratamento e profilaxia de várias doenças humanas autoimunes incluindo artrite, lúpns eritematoso, lúpus eritematoso sistémico, tiroidite de Mashimoto, esclerose múltipla, diabetes, uveite, dermatite, psoriase, urticária, síndroma nefrótico, glomerulonefrite, doença inflamatória do intestino, colite ulcerosa, doença de Crohn, síndroma de Sjogren e insulite.

Podem também ser úteis no estudo de interacções entre CD23 e vários ligandos por exemplo entre CD23 e CD21, entre CD23 e CDllb, entre CD23 e CDllc, entre CD23 e uma proteína de 70 a 85 KDa da célula endotelial (que pode ser uma proteína de célula endotelial de 76, 80 ou 85 KDa) ) ou entre CD23 e uma proteína endotelial de 115 KDa (que se crê estar relacionada com a proteína 70 a 85 KDa) . Crê-se que uma ou mais das interacções acima ocorrem in vivo. Anticorpos ou outros agentes de ligação que são capazes de bloquear estas interacções são particularmente preferidos uma vez que se crê que podem ser especialmente adequados para reduzir ou aliviar os efeitos inflamatórios mediados por citoquina. Podem também ser úteis contra as nocividades de células B tais como leucemia linfocítica crónica, e leucemia de células capilares.

Os agentes de ligação acima são particularmente aplicáveis para utilização no tratamento ou profilaxia de artrite reumatóide.

Sem estar ligado à teoria são avançadas as seguintes explicações possíveis:-

No sinóvio inflamado da artrite reumatóide, macrófagos expressam CD23 e as integrinas ¢2 CDllb e CDllc, permitindo que ocorram 8

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possíveis interacções homotípicas neste tecido. Adicionalmente, a difusão de moléculas solúveis CD23 através do sinóvio e sua ligação com os ligandos da integrina é também possível. Deste modo, interacções CD23-CDllb/CDllc envolvendo uma ansa de activação positiva podem existir in vivo. Se presente em doentes com artrite reumatóide, pode explicar alguns dos mecanismos patogénicos da exacerbação da doença e cronicidade, e apoia a hipótese de que uma vez localizada nas articulações, podem os próprios macrófagos manter e exacerbar a inflamação através de uma via envolvendo moléculas CD23, integrinas-p2 CDllb e CDllc, assim como citoquinas pro-inflamatórias TNF-a, IL-Ιβ e IL-6.

Um mecanismo de acção alternativo da terapia anti CD23 pode envolver o bloqueio de uma resposta imunitária IgE.

Em trabalho anterior publicado, foi mostrado que o tratamento in vivo de ratos com anticorpo anti-CD23 resultou numa inibição específica para o antigénio da produção de IgE, provavelmente pelo bloqueio das interacções CD23-CD21 necessárias para a diferenciação completa de células B cometidas para IgE. (Flores-Romo et al., Science 261, 1038-1041 (1993)).

Estruturalmente, a proteína CD21 é composta de um domínio extracelular de 15 (Moore et al., Molecular cloning of the cDNA encoding the Epstein Barr Virus C3d receptor (complement receptor type 2) of human B lymphocyte, Proc. Natl. Acad. Sei USA 84: 9194 (1987)) ou 16 (Weis et al., Structure of the human B lymphocyte receptor for C3d and the Epstein Barr Virus and relatedness to other members of the family of C3/C4 binding proteins, J Exp Med 167: 1047 (1988)) unidades repetitivas de 60 a 75 aminoácidos, denominadas repetições consensuais curtas (SCRs), seguidas por um domínio transmembranar (24 aminoácidos) e uma região intracitoplásmica de 34 aminoácidos. Utilizando mutantes em CD21 possuindo delecções de SCRs extracitoplásmicas 9

(Carel et al., Structural requirements for C3d,g/Epstein Barr Vírus receptor (CR2/CD21) ligand binding, internalization and virai infection J Biol Chem 265:12293 (1990)), os presentes inventores verificaram recentemente que CD23 se liga a SCRs 5-8 e 1-2 em CD21. A ligação de CD23 aos SCRs 5-8 é uma interacção tipo lectina, envolvendo carbohidratos nos Asn 295 e 370. Em contraste, a ligação de CD23 aos SCRs 1-2 é uma interacção proteína-proteína (Aubry et al., CD23 interacts with a new functional extracytoplasmic domain involving N-linked oligosaccharides on CD21, J. Immunol. 152: 5806 (1994)). Os presentes inventores testaram agora o efeito dos outros ligandos de CD21 (EBV, C3d,g e IFN-α) na ligação de CD23 a CD21 e na regulação da produção de Ig na presença de IL-4. Apenas partículas EBV e um péptido derivado de EBV são capazes de inibir a ligação de CD23 a CD21. Além disso, o péptido EBV diminuiu selectivamente a produção de IgE e IgG4 e aumentou a produção de IgM. Estes resultados indicam que a ligação de CD23 ao sítio de ligação de EBV no CD21 regula selectivamente a produção de Ig humana na presença de IL-4.

De novo sem estar ligado à teoria, crê-se que a presente invenção permita serem conseguidos tratamentos eficazes por supressão da síntese de novo de citoquinas pro-inflamatórias.

Isto contrasta com utilizações anteriores de anticorpos simplesmente para neutralizar as moléculas de citoquinas já presentes nos tecidos inflamados.

Deve ser notado que existem publicações especulativas na técnica que listam grande número de anticorpos assim como grande número de possíveis doenças em que os anticorpos são referidos como sendo úteis no tratamento, mas não fornecendo qualquer evidência forte ou resultado para a maioria das combinações possíveis. Uma 10 destas publicações é W093/02108 que é principalmente dirigida para a produção de anticorpos quiméricos particulares. A presente invenção distingue-se claramente de tais publicações por proporcionar a utilização de agentes de ligação a CD23 que são r.larsmentfi indicados como sendo úteis no tratamento ou profilaxia de doenças autoimunes à luz dos resultados e explicações aqui fornecidas.

Os agentes de ligação acima podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com agentes imunossupressores tais como esteróides, ciclosporina, ou anticorpos tais como um anticorpo anti-linfócito ou mais preferencialmente com um indutor de tolerância, agente anti-autoimune ou anti-inflamatório tal como um agente de inibição CD4+célula T, por exemplo um anticorpo anti-CD4 (preferencialmente um anticorpo bloqueante ou de não depleção), um anticorpo anti-CD8, um antagonista TNF por exemplo um anticorpo anti-TNF ou inibidor TNF, por exemplo, receptor de TNF solúvel, ou agentes tais como NSAIDS. O agente de ligação deverá ser normalmente fornecido como parte de uma composição farmaceuticamente aceitável estéril. Esta composição farmacêutica pode estar em qualquer forma adequada, dependendo do método desejado de administração ao doente pode ser fornecido numa forma unitária de dosagem e pode ser fornecida como parte de um "kit". Tal "kit" deverá incluir normalmente (embora não necessariamente) instruções para utilização.

As administrações de agente de ligação são geralmente dadas parentericamente, por exemplo intravenosamente, intramuscularmente ou sub-cutaneamente. Os agentes de ligação são geralmente dados por injecção ou por infusão. Para este fim é formulado um agente de ligação numa composição farmacêutica 11

contendo um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável, yualquer veiculo ou diluente apropriado pode ser utilizado, por exemplo, solução salina isotónica. Podem ser adicionados estabilizadores tais como um quelante metálico para evitar clivagem induzida por cobre. Um quelante adequado será EDTA, DTPA ou citrato de sódio.

Podem ser dados oralmente ou nasalmente por meio de um "spray", especialmente para tratamento de desordens respiratórias.

Podem ser formulados como cremes ou unguentos, especialmente para utilização no tratamento de desordens de pele.

Podem ser formulados como gotas, ou afins, para administração no olho, para utilização no tratamento de desordens tais como conjuntivite vernal.

Para soluções injectáveis, os excipientes que podem ser utilizados incluem, por exemplo, água, alcoóis, polióis, glicerina, e óleos vegetais.

As composições farmacêuticas podem conter agentes conservantes, agentes de solubilização, agentes de estabilização, agentes de humedecimento, emulsificantes, adoçantes, corantes, aromatizantes, sais, tampões, agentes de revestimento ou antioxidantes. Podem também conter outros agentes terapeuticamente activos.

Doses adequadas do agente de ligação variarão, dependendo de factores tai3 como a doença ou desordem a ser tratada, a via de administração e a idade e peso do indivíduo a ser tratado. Sem estar ligado a qualquer dosagem particular, crê-se que por exemplo por administração parentérica, uma dosagem diária de 0,01 a 50 mg/kg de um agente de ligação (usualmente presente 12

como parte de uma composição farmacêutica como acima indicado) pode ser adequada para o tratamento de um adulto típico. Mais adequadamente a dose deve ser de 0,05 a 10 mg/kg, tal como de 0,1 a 2 mg/kg.

Esta dosagem pode ser repetida tão frequentemente quanto apropriado. Tipicamente a administração pode ser 1 a 7 vezes por semana. Se aparecerem efeitos secundários, pode ser reduzida a quantidade ou frequência de dosagem.

Uma unidade de dosagem típica para incorporação numa composição farmacêutica deve ser então pelo menos 1 mg de agente de ligação, adequadamente 1 a 1000 mg.

Um ensaio para determinar se um agente particular se liga ou não a CD23 pode ser útil no tratamento de uma doença autoimune compreendendo: determinar se o agente é ou não capaz de bloquear a interacção entre CD23 e CDllb, ou a interacção entre CD23 e CDllc, ou a interacção entre CD23 e CD21, ou a interacção entre CD23 e uma proteína de 70 a 85 KDa (tal como uma de 76 KDa, 85 KDa ou 80 KDa) ou uma de 115 KDa expressa em células· endoteliais.

Este ensaio pode ser utilizado para a pesquisa de compostos ou moléculas utilizando linhas de células que expressam as moléculas apropriadas. Preferencialmente CDllb é utilizado nestes ensaios como CDllb/CD18 e CDllc é utilizado como CDllc/CD18. CDllb/CD18 e CDllc/CD18 podem ser co-expressas na superfície celular.

Qualquer técnica de ensaio apropriada pode ser utilizada, por exemplo, ensaios proteína-não proteína (por exemplo ensaiando a interacção de proteínas com químicos ou açúcares), ensaios proteína-proteína ou ensaios proteína-célula. 13

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/ A presente invenção será agora descrita na forma de exemplo apenas com referência às figuras acompanhantes; em que: A FIGURA 1 ilustra o efeito do tratamento preventivo contra artrite em murganhos utilizando um anticorpo anti-CD2 3 ; A FIGURA 2 ilustra o feito do tratamento em murganhos com um anticorpo anti-CD23 respeitante a artrite estabelecida, em que foram utilizados vários tratamentos com o anticorpo; A FIGURA 3 ilustra o efeito do tratamento de murganhos com um anticorpo anti-CD23 respeitante a artrite estabelecida em que é utilizado um único tratamento;

As FIGURAS 4a) e b) ilustram o efeito do tratamento de murganhos com um anticorpo monoclonal anti-CD23 respeitante a artrite estabelecida em que são utilizados tratamentos múltiplos;

As FIGURAS 4 c) e d) ilustram o efeito do tratamento de murganhos com fragmentos F(ab')2 e Fab de um anticorpo monoclonal anti-CD23 respeitante a artrite estabelecida em que foram utilizados tratamentos múltiplos; A FIGURA 5a ilustra liposomas-CD23 que se ligam a células mononucleadas do sangue positivas para CD14; A FIGURA 5b ilustra várias proteínas purificadas por afinidade com CD23 em géis 3D3-PAGE; A FIGURA 6 ilustra a percentagem de inibição da ligação liposoma-CD23 a monócitos sanguíneos activados obtidos utilizando certos anticorpos monoclonais; 14

A FIGURA 7 ilustra a ligação de liposomas de CD23 a várias células transfectadas; A FIGURA 8 ilustra o efeito de várias substâncias nas interacção CD23-CDllb e CD23-CDllc; A FIGURA 9 ilustra os efeitos na produção de nitrito e evento oxidativo em monócitos causado pela ligação de CD23 a CDllb e CDllc; e A FIGURA 10 ilustra que a ligação de CD23 recombinante a CDllb e CDllc aumenta especificamente a produção de citoquina por monócitos.

EXEMPLOS (Em alguns dos seguintes exemplos são utilizados os termos "ip", "id" e "n". Estes significam "intraperitoneal", "intradérmico" e "número de animais", respectivamente). EXEMPLO 1- Tratamento Preventivo de Murganhos contra Artrite utilizando Anticorpo Anti-CD23

Murganhos machos DBA/1 (8-12 semanas de idade) foram sedados com 0,1 mL de uma diluição 1:10 de Fentanyl/Fluanisol 'Hypnorm' ip e injectados intradermicamente na base da cauda com 100 mg de colagénio bovino tipo II (CII) emulsificado em adjuvante de Freund completo (Difco) . No dia 13 pós-imunização com CII, murganhos teste foram tratados com uma única injecção de IgG anti-CD23 de coelho purificada por proteina-A Sepharose® (Bio-Processing, Reino Unido) (2 mg/murganho, ip) (n=16, -) . A IgG anti-CD23 purificada contém 3- 5% de anticorpo especifico. 15

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Uma descrição detalhada da sua produção é dada em Flores-Romo L. et al., Science 261 1038-1041 (1993).

Resumidamente, foi produzido um anticorpo policlonal ' de coelho contra uma forma truncada de CD23 humano correspondente aos aminoácidos 150-321 do comprimento total de CD23 [Kikutani et al., Cell 47 657 (1986)]. O polipépLidu truncado foi produzido em E. coli e purificado de um sedimento de E. coli por cromatografia de troca iónica e filtração em gel. Possuía um peso molecular de 25 kD e-após purificação foi injectado num coelho. O anti-soro resultante apresentou teste positivo tanto em ELISA como em imunotransferência de proteína com o CD23 humano recombinante. Uma fracção IgG foi então isolada por cromatografia de afinidade em proteína A-Sepharose®. Os animais controlo receberam IgG de soro normal de coelho purificada por proteína A (2 mg/murganho) (n=17, ·-----·).

Os murganhos foram inspeccionados diariamente quanto ao desenvolvimento de sintomas clínicos de artrite. A severidade da doença foi avaliada em cada pata utilizando uma escala de 0 = sem sintomas a 3 = inchaço pronunciado, eritema e impedimento do movimento como descrito em Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 9784-9788 (1992); o recrutamento de membros foi avaliado por contagem do número de patas afectadas. Foram comparados grupos por análise estatística utilizando o teste t de duas caudas em (a), e o teste de Mann-Whitney não-paramétrico em (b) ; *0,05 > p > 0,01, **0,01 > p >0,005, ***0,005> p. Não foi observada diferença no desencadear da doença (dia médio do desencadear + sem: 20+0,7 no grupo teste e 20 0,5 no grupo controlo) ou incidência da doença (100% de murganhos artríticos em ambos os grupos), demonstrando que o tratamento com anticorpos anti-CD23 não tinha efeito na indução da doença na altura da proliferação de células T e 16 7 indução de anticorpos IgG anti-colagénio. No entanto, todos os valores clínicos eram mais baixos nos murganhos tratados com anticorpo anti-CD23 (Fig. la) . 0 mais notável foi a supressão marcada do recrutamento do membro no grupo tratado com anti-CD23 (Fig. lb) . Estes resultados indicam uma forte influência do tratamento na progressão da doença a longo prazo. EXEMPLO 2 - Tratamento de Artrite Estabelecida (tratamentos múltiplos)

Foi induzida artrite como revelado no Exemplo 1 e os murganhos foram monitorizados diariamente quanto ao desenvolvimento de inflamação visível. 0 tratamento foi administrado no primeiro dia de inflamação clínica (dia 1) e dois dias depois (dia 3) em três grupos de murganhos divididos aleatoriamente. Os murganhos teste receberam IgG anti-CD23 purificada com proteína-A (200 pg/injecção), n=6, ---------; 400 μg/injecção/ n=8 -; murganhos controlo

receberam IgG de coelho normal purificada por proteína-A (200 μg/injecção, n=15, ·-----·) . A severidade da doença (Fig. 2a) foi avaliada como descrito no Exemplo 1. A inflamação foi avaliada pelo incremento do inchaço desde o dia 1 em que a primeira pata se tornou artrítica medido utilizando um compasso de pontas (Proctest 2T. Kroeplin Langenmesstechnik) . Os grupos foram comparados utilizando o teste t de duas caudas, *0,05>p>0,01, **0,01>p>0,0005, ***0,0005>p.

Pode ser observado um melhoramento marcante na severidade da doença, que está relacionado com a dose. A propriedade inflamatória da IgG anti-CD23 é claramente demonstrada pela redução do inchaço da pata no grupo de murganhos recebendo tratamento com anticorpo. 17

EXEMPLO 3 - Tratamento de Artrite Estabelecida (tratamento unico) A concepção da experiência foi semelhante ao Exemplo 2 com a excepção de que os murganhos foram tratados apenas uma vez, no dia 1 de artrite, com 2 mg/murganho de igG anti- CD23 purificada com proteina-A (n—10, -) ou IgC dc coelho normal purificada com proteina-A (n=10,·-----·) . ç>s valores clínicos e o recrutamento do membro foram avaliados como no Exemplo 1. O efeito significativo no recrutamento do membro obtido após uma injecção no dia 1 demonstra que em termos de recrutamento da articulação uma única injecção administrada quando a artrite está já estabelecida é suficiente para proteger contra a progressão adicional da doença (Fig. 3b). EXEMPLO 4- Tratamento de Artrite Estabelecida com Anti-CD23 Monoclonal

Murganhos artríticos DbA/1 foram obtidos como descrito acima para o Exemplo 1. Ao primeiro sinal de doença clínica os murganhos foram separados aleatoriamente em quatro grupos e tratados nos dias 1 e 3 com três doses de anticorpo monoclonal contra CD23 (B3B4, gentilmente cedido pelo Professor D. Conrad, Richmond, Virgínia, EUA e disponíveis de Pharmingen. É discutido em J. Immunol. 138: 1845-1851 (1987)); B3B4 25 μg/injecção,n=4, o......ο, B3B4 50 μg/injecção, n=4; -----·, B3B4 100 μg/injecção, n=5. -) . Ratos controlo receberam PBS (n=6 ·-----·) . Os valores clínicos e incrementos na espessura da pata desde o dia 1 foram avaliados como descrito no Exemplo 2.

Injecções intraperitoneais de 50 pg de anticorpo monoclonal B3B4 foram suficientes para terapia eficaz como apresentado 18

pela diminuição significativa nos valores clínicos e do número de patas afectadas obtido utilizando este regime de tratamento. Em contraste, a severidade da doença em ratos tratados com 25 pg de anticorpo monoclonal não melhoraram o efeito terapêutico positivo obtido com 50 μg de anticorpo monoclonal B3B4 (Flg. 4). o efeito anti-inflamatório relacionado com a dose de administração de B3B4 é ilustrado na Fig. 4b que mostra que o inchaço das patas artríticas não aumentou desde o dia 1 nos grupos que receberam injecções ip de 50 ou 100 μg de anticorpo monoclonal B3B4. De modo semelhante ao que foi observado com as outras medidas clínicas, doses de 25 pg de anti-CD23 monoclonal, administrado após o início da doença, foram sub-terapêuticos e os incrementos no inchaço da pata foram semelhantes aos controlos (Fig. 4b) . Do mesmo modo, foi obtida uma significativa redução na severidade da artrite estabelecida após tratamento com 50 μρ de IgG anti-CD23 policlonal purificada por afinidade (resultados não apresentados). A melhora na severidade clínica a seguir ao tratamento com anticorpo anti-CD23 (tanto monoclonal como policlonal) foi confirmada por exame histológico das patas artríticas. Os ratos tratados apresentaram severidade da doença reduzida com menos destruição aparente de cartilagem e osso e um decréscimo marcado na infiltração celular da camada inferior do sinóvio. Além disso, a proporção de articulações severamente afectadas foi significativamente inferior nos animais tratados com anticorpo anti-CD23 em comparação com os ratos controlo (0% vs 94%), em que a proporção de articulações que manteve estrutura normal foi significativamente aumentada (80% vs 0%). 19

Isto é demonstrado na Tabela 1 abaixo:

Tabela 1: Histopatologia das patas: Os murganhos foram tratados e as articulações processadas como na Fiq. 4. As preparações histológicas foram avaliadas como descrito na metodologia.

Tratamento (n° de murganhos) Normal (%) Suave (%) Moderado (%) Severo (%) Número total de articulações examinadas anti-CD23 (n=6) 80 8 12 0 59 controlos (n=6) 0 0 6 94 69

Esta tabela mostra uma comparação de preparações histológicas respeitantes às articulações tiradas de murganhos tratados com anti-CD23 ou de murganhos controlo. Os murganhos foram tratados como descrito acima em relação à Fig. 4. A histopatologia foi avaliada como se segue: 0 primeiro membro a tornar-se artrítico foi removido post-mortem, fixado em formalina tamponada a 10% (peso/volume) e descalcifiçada em EDTA em formalina tamponada (5,5%). As patas foram então embebidas em parafina, seccionadas e coradas com hematoxilina e eosina. As preparações histológicas (3 secções por pata) foram avaliadas utilizando o seguinte critério: sinovite suave + mínima, perda de cartilagem e erosões do osso limitadas a focos discretos; moderada = sinovite e erosões presentes mas arquitectura da articulação intacta; severa = sinovite extensa e erosões com rotura da arquitectura da articulação. Todas as articulações presentes em cada secção foram avaliadas e foi determinada a percentagem que 20

apresentava valores normais, suaves, moderados ou severos. A inflamação foi avaliada pelo incremento na espessura da pata em relação à espessura da pata no primeiro dia de tratamento, medida utilizando calibradores (Proctest 2T, Kroeplin Langenmesstechnik).

Evidência adicional para apoiar a especificidade deste tratamento foi obtida por tratamento dos murganhos artríticos com fragmentos Fab e F(ab')2 do anticorpo monoclonal B3B4. Embora menos potentes do que a molécula de IgG intacta, os fragmentos Fab e F(ab')2 de B3B4 foram ainda eficazes demonstrando que a porção Fc do anticorpo não é obrigatória para a actividade (Tabela 2). Além disso, anticorpos contra as moléculas CD72 e B220, ambas largamente expressas em linfócitos B, mostraram pouca ou nenhuma actividade terapêutica (Tabela 2). Adicionalmente a comparação com anticorpos contra TNF-a (Williams et al., Proc Natl Acad Sei USA 36: 9784-9788 (1992) e CD5 (Plater-Zyberk et al., Clin Exp Immunol 98:442-447 (1994)) mostraram que nas nossas condições experimentais, o tratamento com o anticorpo anti-CD23 foi o mais eficaz (Tabela 2).

Tabela 2: Comparação na resposta a diferentes regimes de tratamento: os murganhos foram imunizados com colagénio tipo II e tratados terapeuticamente no dia 1 e 3 de artrite clínica por injecção ip de anticorpos monoclonais. A diminuição nos valores clínicos no dia 5 foi calculada como uma percentagem do isotipo controlo utilizado em cada experiência. 21

Mab Clone Tratamento Decréscimo dose ISOtipo nos valores clínicos (%) CD23 B3B4 50 μς x 2 IgG2a de Rato 74 75 μ9 x 2 F(ab)2 de Rato 52 150 pg x 2 Fab de Rato 56 TNF-a 1F3F3D4 50 μς χ 2 IgM de Rato 63 CD5 TIB 104 200 μg χ 2 IgG2a de rato 30 B220 TIB 146 200 μς χ 2 IgM de Rato 5 CD72 TIB 165 200 μς χ 2 IgG2b de Rato 0

Resultados adicionais respeitantes a anticorpos monoclonais e fragmentos destes são fornecidos nas Figuras 4c e 4d. Estes resultados basearam-se no seguinte protocolo:

Murganhos machos DBA/1 de 8-12 semanas de idade injectados id com 100 μg de colagénio bovino tipo II emulsificado em adjuvante completo de Freund.

Ao primeiro sinal de doença clinica (± 3 semanas depois) os murganhos são injectados ip com as seguintes preparações de anticorpos monoclonais, (injecções no dia 1 e dia 3)

IgG2a B3B4 completa Fab de B3B4 F(ab')2 de B3B4 IgG2a controlo M6 50 pg/injecçâo ip n=8 150 μg/injecção ip n=6 75 μg/injecção ip n=7 50 pg/injecçâo ip n=7

Os murganhos são inspeccionados diariamente e a severidade da doença clinica de cada pata é avaliada (max/pata = 3; max/murganho = 12). Os resultados para a avaliação da doença clínica estão apresentados na Figura 4c. 22 'ν ί Ç-Y> 7 0 inchaço da primeira pata artrítica é seguido utilizando calibradores. Os resultados para a avaliação do inchaço da pata estão apresentados na Fig 4d.

Os ratos são sacrificados no dia 10 de artrite, a primeira pata artrítica é seccionada, fixada e descalcifiçada para exame histopatológico.

Interacção entre CD23 e CDllb e entre CD23 e CDllc Sem querer estar restrito à teoria, uma vez que não é totalmente compreendido como é que anticorpos anti-CD23 obtêm os surpreendentes resultados acima revelados, é possível que isto possa ser devido à interacção entre CD23 com CDllb e/ou CDllc. Os Exemplos 5 a 10 e as Figuras acompanhantes (ver mais tarde) ilustram isto.

Nestes Exemplos, CD23 recombinantes completos incorporados em liposomas fluorescentes mostraram ligar-se a células COS transfectadas com ADNc codificando ou CDllb/CD18 ou CDllc/CD18 mas não com transfectantes que expressam CDlla/CD18. A interacção entre os liposomas-CD23 e células COS transfectadas com CDllb/CD18 ou CDllc/CD18 foi especificamente inibida por anti-CDllb ou anti-CDllc, respectivamente, e por anticorpos monoclonais anti-CD23. O significado funcional deste par de ligandos foi demonstrado pelo desencadear de CDllb e CDllc em monócitos com CD23 recombinante ou anticorpos monoclonais anti-CDllb e anti-CDllc para causar um aumento marcante em nitrito (N02“) , produtos oxidativos (H2O2) e citoquinas pró-inflamatórias (IL-Ιβ, IL-6 e TNFa). Estas actividades mediadas por CD23 . foram diminuídas por fragmentos Fab de anticorpos monoclonais contra CDllb, CDllc e CD23. Estes resultados demonstram que as moléculas de adesão à superfície CDllb e CDllc são receptores para CD23 e que este novo par de ligandos regula importantes actividades de monócitos. 23

A seguinte discussão explica brevemente a concepção experimental e a racional antes dos Exemplos b a 1U (que se seguem):- Células mononucleadas de sangue total foram incubadas com CD23 completo recombinante incorporado em liposomas fluorescentes e analisadas por citometria de fluxo · (Pochon, S. et al., J. Exp. Med. 176, 389-398 (1992)). Uma fracção ligou liposomas-CD23 (Exemplo 5, Fig. 5a) que foi então mostrada consistir em células positivas para CD14 (isto é, monócitos) por coloração dupla. Para confirmar que os monócitos eram capazes de ligar liposomas-CD23, células mononucleadas do sangue foram agrupadas por FACS em populações positivas para CD14 e negativas para CD14 (Exemplos 5, Fig.5a). Mostrou-se que liposomas-CD23 se ligavam só à população positiva para CD14 (Exemplo 5, Fig. 5a). Uma vez que se verificou que os monócitos não expressam nem IgE membranar nem CD21 (não apresentado), os ligandos conhecidos para CD23, foi investigado se os monócitos expressam um receptor diferente para CD23. Os monócitos foram lisados e os extractos celulares purificados sobre uma coluna de afinidade acoplada com CD23 solúvel recombinante. Análise em SDS-PAGE e coloração com prata do material eluído revelou bandas de cerca de 80 e 160 kDa de PM (Exemplo 5, Fig 5b). Anticorpos que identificam antigénios desta gama de peso molecular e que foram relatados como sendo expressos em monócitos foram testados por FACS quanto à sua capacidade para inibir a ligação de liposomas-CD23 a monócitos (Exemplo 6, Fig.6). Anticorpos antd —CDllb e anti-CDllc inibiram a ligação de liposomas-CD23 a monócitos, com vários graus de potência (Exemplo 6, Fig 6) . Anti-CD13, anti-CD49d, anti-CD21 (não expressos em monócitos) e anti-CDlla (o terceiro membro da família de integrinas β2 das moléculas de adesão) não 24

•ο , p7 possuíam efeito significativo (Exemplo 6, Fig. 6) . Anticorpos contra MHC Classe I, Classe II, CD14 e CD45, todos altamente expressos em monócitos, foram também testados quanto ao seu efeito na ligação a liposomas-CD23. Nenhum deles tinha no entanto qualquer efeito (não apresentado). 0 anticorpo monoclonal anti-CDIR provocou uma inibição parcial na ligação de CD23. Isto pode ser devido ou a impedimento estéreo ou à indução de uma alteração conformacional nas moléculas CDllb e CDllc após ligação ao Mab anti-CD18. As proteínas derivadas de monócitos eluídas da coluna de afinidade com CD23 imunoreagiram com anti-CDllc (Exemplo 5, Fig. 5b) e anticorpos anti-CDllc/CD18 (não apresentado).

Para confirmar que a cadeia α de CDllb/CD18 e CDllc/CDllb eram os receptores de CD23, ADNcs completos codificando CDllb e CDllc foram transientemente co-transfectados com ADNc de CD18 em células COS. Foi mostrado que os transfectantes expressando CDllb/CD18 e CDllc/CD18 ligavam ambos liposomas-CD23, em contraste com transfectantes expressando CDlla/CD18 (Exemplo 7, Fig." 7). Isto pode ser explicado pelo elevado grau de homologia entre CDllb e CDllc quando comparada com a homologia com CDlla. A especificidade da interacção foi demonstrada pela inibição da ligação de liposomas-CD23 utilizando anticorpos monoclonais anti-CDllb, anti-CDllc e anti-CD23. Os mesmos resultados foram obtidos utilizando células BHK expressando CDllb/CD18 e CDllc/CD18 (não apresentado). Como prova adicional da especificidade da interacção de CD23, monócitos Uo sanyue activados de um doente com a deficiência de Adesão de Leucócitos, sem expressão da intergrina β2 devido a uma mutação no gene que codifica a subunidade β não foram capazes de se ligarem a liposomas-CD23 (não apresentado). Em conjunto, estes resultados 25

demonstram que CD23 interage com CDllb e CDllc em monócitos humanos normais e em trantectantes. CDllb e CDllc são moléculas de adesão que participam em muitas interacções célula-célula e célula-matriz. Os exemplos mostram que CDllb/CD18 e CDllc/CDIR podem exibir uma função adesiva adicional em virtude da sua capacidade para ligar CD23. CD23 parece identificar um epitopo próximo ou idêntico ao factor X como observado pela capacidade do factor X inibir de uma forma dependente da dose a ligação de liposomas-CD23 (Exemplo 8, Fig 8) sem afectar a expressão à superfície de CDllb ou CDllc em monócitos (não apresentado). Nenhum dos outros ligandos testados tinha qualquer efeito. 0 CD23 pode actuar como uma lectina do tipo C na sua interacção com CDllb e CDllc. O EDTA diminui a ligação de CD23 a monócitos (Exemplo 8, Fig. 8) por quelação de Ca2+ que é necessário para a ligação de CD23 e/ou por quelação de catiões divalentes que são necessários para a ligação de ligandos a CDllb e CDllc (Altieri, C.C. J. Immunol. 147, 1891-1898 (1991)). A interacção CD23- CDllb/CDllc parece envolver açúcares, mas não ácido siálico, como observado pela capacidade de tunicamicina, mas não neuraminidase, para diminuir a ligação de CD23 a monócitos. CD23 comporta extracelularmente um tripleto de aminoácidos (Asp, Gly, Arg) (Kikutani, H. et al., Cell 47, 867-885 (1986)), que na orientação reversa é um sítio comum de reconhecimento para receptores de integrina. Assim, o efeito de um anticorpo policlonal dirigido contra este tripéptido foi testado quanto à sua capacidade para inibir a ligação de CD23 a monócitoo. Não foi observada inibição, confirmando a ausência de inibição obtida com fibrinogénio (Exemplo 8, Fig. 8) . A IgE que se liga no domínio da lectina de CD23, inibe parcialmente a ligação de CD23 a monócitos (exemplo 8, Fig. 8). Estes resultados indicam que 26

7 CD23 parece actuar como uma lectina tipo C reconhecendo em separadamente estruturas de açúcar e proteína reminiscente do que foi observado para interacção CD23 com CD21 (Aubry, J-P. et al., J. Immunol. 152, 5806-5813 (1994)).

Para avaliar o significado funcional da interacção de CD23 com CDllb ou CDllc, investigou-ee oc a interacção CD23-CDllb/CDllc poderia desencadear a libertação de mediadores pró-inflamatórios pelos monócitos, tais como óxido nítrico, H2O2 e citoquinas. O desencadear de monócitos normais, com aderência activada utilizando CD23 solúvel recombinante, anticorpos anti-CDllb ou anti-CDllc, aumentou a geração de N02’ indicando a activação da via NO (Moncada, S., Palmer, R.M.J. & Higgs, E.A. Pharmacol. Rev. 43, 109-144 (1991)). O efeito de CD23 na produção de nitrito foi inibida por fragmentos Fab de anticorpos monoclonais anti-CD23 e por nitroarginina, um inibidor específico da via da sintetase de NO (Exemplo 9, Fig. 9a) . O evento oxidativo foi também mostrado regular através de CDllb e CDllc uma vez que o CD23 solúvel recombinante, os anticorpos monoclonais anti-CDllb e anti-CDllc causaram todos a oxidação de hidroetidina a brometo de etídeo em monócitos (Exemplo '9, Fig. 9b) . Isto confirma e estende a verificação de que anticorpos monoclonais anti-CDllb induzem um evento oxidativo em monócitos (Trezzeni, C., Schuepp, B., Maly, F.E. & Jungi, T.W. Brit. J. Haematol. 77, 16-24 (1991)). A ligação de CD23 a CDllb e CDllc foi associada com um fluxo precoce específico de Ca2+ em monócitos sanguíneos (Não apresentado).

Uma vez que macrófagos activados são uma fonte importante de citoquinas pró-inflamatórias, avaliou-se o efeito de CD23 solúvel recombinante e de anticorpos monoclonais anti-CDllb e anti-CDllc na produção de tais citoquinas por monócitos. CD23 solúvel recombinante, anticorpos 27

monoclonais anti-CDllb e anti-CDllc foram estimuladores potentes de IL-Ιβ, IL6 E TNF-α. De novo, a especificidade desta indução foi demonstrada utilizando fragmentos Fab de anticorpos monoclonais anti-CDllb, anti-CDllc e anti-CD23 (Exemplo 10, Fig. 10) . Interessantemente, IL-1 e TNFa foram indutores potentes da ligação de liposomas-CD23 a monócitos (não apresentado), sugerindo uma potencial ansa autócrina de citoquina através da estimulação e regulação por CDllb e CDllc. EXEMPLO 5 a) Liposomas-CD23 ligam-se a células mononucleadas do sangue positivas para CD14 (ver Fig. 5a) . Células mononucleares sanguíneas foram coradas com anticorpo monoclonal anti-CD14 (Becton Dickinson, Erembodegem, Bélgica) seguido por F(ab')2 de anticorpos de ovelha contra IgG e IgM de murganho (Bioart, Meudon, França) conjugados com FITC, ambos diluídos em PBS, BSA a 0,5% e azida de sódio a 0,05% antes de agrupamento por FACS (FACStar Plus, Becton Dickinson) em populações de células positivas para CD14 e Negativas para CD14. As células separadas foram então coradas com liposomas-CD23 ou liposomas-(glicoforina A) controlo diluídos em BSA a 0,5%, azida de sódio a 0,1%, CaCl2 a 2 mM, NaCl a 140 mM. Hepes a 20 mM, pH 7 e incubados durante 2 horas a 4°C (Pochon, S. et al., J. Exp. Med. 176 389-398 (1992)). Depois das lavagens, as células (5 000 eventos/condição) foram analisadas por FACS. b) Peso molecular aparente de proteínas de monócitos sanguíneos purificadas por afinidade com CD23 e imunorreactividade com um anticorpo monoclonal anti-CDllc (Ver Fig. 5b).

Lisados de monócitos sanguíneos foram purificados por afinidade numa coluna de CD23, as proteínas eluídas 28

separadas por SDS-Page e transferidas para nitrocelulose. Marcadores de peso molecular estão apresentados à esquerda. 0 gel foi corado com prata (faixa da esquerda). Os filtros foram incubados ou com um anticorpo do mesmo isotipo (faixa do meio) ou com um anticorpo monoclonal anti-CDllc (BU-15, faixa da direita), depois com anticorpo de cabra anti-murganho conjugado com peroxidase (Kpl; Gaithersburg, Massachusetts). EXEMPLO 6

Anticorpos monoclonais anti-CDllb e antiCDllc diminuem a ligação de liposomas-CD23 a monócitos sanguíneos activados (Ver Fig. 6).

Monócitos foram enriquecidos das células mononucleadas por Ficoll e aderência ao plástico durante a noite em RPMI 1640 (Seromed, Berlim, Alemanha) suplementado com glutamina a 2 mM e FCS inactivado por calor a 10% (Flow Laboratories, Irvine, Escócia). Os monócitos activados foram então incubados com liposomas-CD23 na presença de diferentes anticorpos monoclonais(aCD) ou controlos do mesmo isotipo (CTRL) (Becton Dickinson), todos testados a 10 μg/ml. Anticorpos monoclonais antiCDlla 25.3 e B-B15 foram obtidos de Immunotech (Luminy, França) e Serotec (Oxford, Reino Unido), respectivamente. O anticorpo monoclonal anti-CDllb 44 foi de Serotec, mon.gran 1 foi de Janssen (Beerse, Bélgica), Leu-15 foi de Becton Dickinson (Erembodegem, Bélgica) e (Bear-1) foi de Sera-Lab Ltd (Sussex, GB) . O anticorpo monoclonal anti-CDllc 3.9 foi de Serotec, SL9 foi de Sera-Lab e BU-15 foi de The Binding Site (Birmingham, Reino Unido). Os anticorpos monoclonais anti-CD13 (SJlDl), anti-CD18 (BL5), anti-CD23 (mAb25) e anti-CD49d (HP2.1) foram de Immunotech. O anticorpo monoclonal anti-CD21 BL13 foi de Immunotech, OKB7 de Ortho e BU-33 foi obtido do Dr. MacLennan (Birmingham University, Reino Unido), HB-5 de 29

ATCC, 0KB7 de Ortho Diagnostics System Inc (Raritan, NJ) . Os anticorpos monoclonais anti-CD14, anti-CD3, anti-CD16 e anti-CD20 foram de Becton Dickinson. As células foram analisadas por FACS e foi medida a intensidade média de fluorescência (MFI). São apresentados os resultados de uma experiência representativa. A MFI das células coradas com liposomas controlo foi de 6,5 e com liposomas-CD23 foi de 84,5. A percentagem de inibição utilizando os valores MFI de aritmética linear é calculada de acordo com a seguinte fórmula: [[lipo-CD23]]-[ (lipo-CD23) + Mab]

%inibição = MFI--------------------------------xlOO (lipo-CD23) EXEMPLO 7

Liposomas-CD23 ligam-se a cadeias α de CDllb/CD18 e CDllc/CD18 em transfectantes recombinantes (Ver Fig. 7) . 0 ADNc codificando para CDlla (Corbi, A.L., Miller, L.J., 0'Connor, K. , Larson, R.S. & Springer, T.A. EMBO J. 6, 4023-4028 (1987)) reclonado em pCDNAl (Invitrogen, San

Diego, CA). Os ADNcs para CDllb (Corbi, A.L., Kishimoto, T.K., Miller, L.J. & Springer, T.A. J. Biol. Chem. 263, 12403-12411 (1988)) e CD18 (Kishimoto, T.K., 0'Connor, K. ,

Lee, A. Roberts, T.M. & Springer, T.A. Cell 48, 681-690 (1987)) foram reclonados em pCDM8 (Seed, B., Nature 329 840-842 (1987)). Fracções de 20 pg de ADN foram transfectadas em células COS-7 (ATCC) por electroporação (260V, 960 μΓΏ) utilizando um aparelho Gene Pulser (Bio-Rad, Richmond, CA) e "cuvettes" da 0,4 cm sm Hepes a 20 mmM, pH 7,4,NaCl a 150 mM. Co-transfecções de CDlla, b ou c com CD18 foram efectuadas de modo a obter expressão das integrinas B2 na superfície da célula. Os controlos foram efectuados com transfecções de cadeia simples. Após 48 h de 30

transfecção, as células COS foram coradas com anticorpos monoclonais anti-CDlla, anti-CDllb e anti-CDllc ou anticorpos monoclonais do mesmo isotipo (controlo) seguidos por anticorpo anti-murganho de ovelha marcado com FITC. Cerca de 10 a 15% das células mostraram expressar CDlla, b, c ou CD18 por coloração com os respectivos anticorpos monoclonais. Antes da coloração com liposomas-cD23, células COS transfectadas positivas para CD18 foram então agrupadas por FACS de modo a aumentar a percentagem de células a expressar integrinas β2· Transfectantes CDlla/CD18, CDllb/CDl8 e CDllc/CD18 foram então incubados com liposomas-CD23 (traço 2) ou controlo (liposomas- (Glicoforina-A) (traço 1) . A especificidade da interacção de CD23 com CDllb e CDllc foi demonstrada por inibição da ligação de liposomas-CD23 a transfectantes CDllb/CD18 e CDllc/CD18 utilizando anticorpos monoclonais anti-CDllb (traço 4), anti-CD23 (traço 5) e anti-CDllc (traço 6), respectivamente. Não foi observada ligação de liposomas-CD23 a tranfectantes CDlla/CD18 e não foi verificado efeito do anticorpo monoclonal anti-CDlla (traço 3). EXEMPLO 8

Caracterização estrutural da interacção CD23-CDllb, CDllc (Ver Fig. 8). (a) Envolvimento de açúcares e catiões divalentes.

Monócitos sanguíneos activados purificados foram ou não tratados com tunicamicina (10 μg/ml) durante 48 h ou com neuraminidase (0,1 U/ml; ambas de Boheringer Mannheim, mannheim, Alemanha) durante 45 min. As células foram então incubadas com liposomas-CD23 ou liposomas controlo na ausência e presença de EDTA (5 mM; painel superior esquerdo) , Ca2+ ou Mn2+ (1 a 10 mM; painel superior direito) . (b) Factor X não inibe a ligação de CD23 a monócitos. Monócitos sanguíneos activados purificados foram incubados 31

com liposomas-CD23 na ausência e presença de factor X (0,1 a 10 LJ/ml; Sigma) (painel inferior esquerdo), fibrinogénio (50 μg/ml; Sigma), ICAM-1 recombinante purificado (produzido no nosso laboratório), LPS (1 μg/ml; (Sigma), zimosana opsonizada de soro humano (1 mg/ml; Sigma), IgE (50 μg/ml; The Binding Site, Birmingham) ou anticorpo monoclonal contra o péptido RGD (1/500, ATCC) (painel inferior direito). As células foram analisadas por FACS e a MFI medida. A percentagem de inibição foi calculada como no Exemplo 6. EXEMPLO 9 CD23 recombinante por ligação a CDllb e CDllc aumenta especificamente a, o produto nitrito e b, o evento oxidativo em monócitos.

Os monócitos foram incubados a, durante 4 dias a 37°C ou b, durante a noite na ausência ou presença de CD23 solúvel recombinante (Graber P. et al., J. Immunol. Methods 149 215-226 (1992)) (50 ng/mL), anticorpos monoclonais anti-CDlla (clone 25.3), anti-CDllb (clone 44), anti-CDllc (clone BU-15) (todos a 10 μg/mL).

Para avaliar a quantidade de NO produzida (que é apresentada na Fig. 9a), os sobrenadantes da cultura foram ensaiados quanto aos produtos finais de NO estáveis, N02~ e NO3· de acordo com Graber et al., Annu. Rev. Immunol. 2, 199-218 (1984). A especificidade do aumento da produção de N02~ mediada por Cd23 foi demonstrada pela inibição da produção de N02" por fragmentos Fab de anticorpos monoclonais anti-CD23 (mab25) (testado a 10 μς/πιΐ) e por inibição com nitroarginina (N-Arg a 1 mM) (Sigma). 32

Monócitos activados foram incubados com hidroetidina (Molecular Probes, Eugene, OR) (0,3 μ9/ιη1) durante 30 min a 37 °C (Rothe, G. et al., J. Leukoc. Biol. 47, 440-448 (1990)) e analisados por FACS. O aumento da percentagem na fluorescência vermelha de monócitos estimulados é apresentada em comparação com monócitos não tratados (Ver Fig. 9b) . Monócitos que experimentaram um evento oxidativo apresentaram um aumento dos sinais de fluorescência vermelha comparada com monócitos não tratados reflectindo a oxidação de hidroetidina a brometo de etideo (Lacal P.M. et al., Biochem. J. 268 707-712 (1990)). Os valores de MFI dos monócitos isolados foi de 159 +/- 10. Os valores da média + /- DP de 6 experiências são apresentados. Con A, que se sabe induzir um evento respiratório em monócitos, foi utilizada como controlo positivo. A especificidade da interacção CD23 com CDllb e CDllc foi demonstrada por inibição do aumento da produção de H2O2 mediada por CD23 por fragmentos Fab de anti-CDllb (clone 44), anticorpos monoclonais anti-CDllc, (clone BU-15) e anti-CD23 (mAb25) (testados a 10 pg/ml). EXEMPLO 10

Ligação de CD23 recombinante a CDllb e CDllc aumenta especificamente a produção de citoquinas por monócitos (Ver Fig. 10).

Os monócitos foram incubados durante a noite a 37 °C na ausência ou presença de CD23 solúvel recombinante (Graber P. et al., J. Immunol. Methods 149 215-226 (1992)) (50 ng/mL), anticorpos monoclonais anti-CDlla (clone 23.5), anti-CDllb (clone 44), anti-CDllc (clone BU-15), anti-CD23 (mAb 25 - este anticorpo está disponível em Immunotech. São discutidos no Pedido de Patente Europeia publicado (EP-A-0269728), anticorpos monoclonais, Con A (Sigma), (todos a 10 , LPS (1 ng/mL) (Sigma) ou PMA (5 ng/mL) 33

(Calbiochem, La Jolla, CA) . As citoquinas foram medidas no sobrenadante das culturas por ELISA especifica. 0 limite de especificidade da ELISA é 0,05 ng/mL para IL-Ιβ (Ferrua et al., J. Immunol. Methods 114 41-48 (1988)) 0,01 ng/mL para TNFa (Medgenix, Biotechnie, Rungis, F) e <0,01 ng/mL para IL-6 (Manie et al., Eur. Cytokine Netw. 4 51-56 (1993)). A especificidade da interacção de CD23 com CDllb e CDllc foi demonstrada pela inibição do aumento da produção de citoquina mediado por CD23 por fragmentos Fab dos anticorpos monoclonais anti-CDllb (clone 4), anti-CDllc (clone BU-15), anti-CD23 (mAb25) (testados a 10 μg/ml). Apresentados os valores da média +/- DP de 4 experiências. EXEMPLO 11

Anticorpos Monoclonais contra CD23 solúvel humano recombinante derivado de E. coli (25 kD, aminoácidos 150- 321) foram produzidos em murganhos, por procedimentos convencionais com a excepção de que foram utilizados nódulos linfáticos em vez de células do baço. Estes bloqueavam as actividades de CD23 humano in vitro. EXEMPLO 12

Colite ulcerativa 3 macacos tamarinos foram doseados com Mab anti-CD23 sem efeitos adversos, resultando num melhoramento no valor fecal subjectivo. A dosagem foi 1 mg cada 4 dias por injecção intramuscular. 34 EXEMPLO 13 Não foram observados efeitos tóxicos em qualquer dos testes aqui efectuados.

Lisboa, 22 de Março de 2001

^AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um agente de ligação a CD23 que bloqueia a interacção entre CD23 e um ligando que se liga a CD23 in vivo no fabrico de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de uma doença autoimune.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1 em que o ligando é CD21, CDllb ou CDllc.
3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que CD23 é CD23 associado a células.
4. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1-3 para o tratamento ou profilaxia de artrite, lupus eritematoso, lupus eritematoso sistémico, tiroidite Mashimotos, esclerose múltipla, diabetes, uveíte, dermatite, psoriase, urticária, síndroma nefrótico, glomerulonefrite, doença inflamatória do intestino, colite ulcerativa, doença de Crohn, síndroma de Sjogren, insulite.
5. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1-3 para o tratamento ou profilaxia de artrite reumatóide.
6. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores em que o agente de ligação é um anticorpo.
7. Utilização de acordo com a reivindicação 6 em que o agente compreende um fragmento F(ab')2, Fab, FV ou ScFV de um anticorpo. 1
8. Utilização de acordo com a reivindicação 6 em que o agente compreende uma construção artificial compreendendo um anticorpo ou um fragmento deste ou um imitador ou um derivado de qualquer destes agentes.
9. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 6-8 em que o anticorpo é humanizado.

Lisboa, 22 de Março de 2001 /agbjte oficial da propriedade industrial 2