PT725648E - Agentes hepatosselectivos farmacologicamente activos. - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "AGENTES HEPATOSSELECTIVOS FARMACOLOGICAMENTE ACTIVOS" A presente invenção refere-se a novos agentes hepatosselectivos farmacologicamente activos. Em particular refere-se a novos análogos de insulina hepatosselectivos, adequados para utilização num tratamento aperfeiçoado dos diabetes mellitus.

Quando são administrados medicamentos ou outros agentes farmacologicamente activos ao corpo humano ou de um animal poderá ser necessário que o agente activo se encontre principalmente no figado ou que actue em primeiro lugar nos tecidos hepáticos. Isto é, o agente activo tem de ser hepatosselectivo. Atingir a hepatosselectividade pode ser difícil, em particular quando o agente activo é administrado por meio de injecção na pele. Um caso em que este atingir da hepatosselectividade seria especialmente desejável é o da administração de insulina. A hormona insulina, segregada pelo pâncreas, tem vários papéis importantes a desempenhar no metabolismo da glicose. No fígado, depois de ligar aos receptores de superfície das células, a insulina promove a conversão da glucose em glicogénio (glicogénese) , promove a síntese de proteínas e inibe a lipólise. A deficiência em insulina tem como resultado uma degradação do glicogénio (glicogenólise), proteína e conversão de produtos da gordura e proteólise em glucose (gluconeogénese) conduzindo a um aumento do nível de glucose no plasma (hiperglicemia). Em indivíduos que produzem quantidades adequadas de insulina, o nível de 2 glicemia mantém-se dentro de certos limites. Um excesso de glucose é armazenado no fígado e músculos como glicogénio. A insulina também actua nos receptores da membrana celular, noutros tecidos para intensificar a entrada da glucose nas células, diminuindo assim a concentração de glucose no plasma. Assim a insulina age de forma a reduzir o nível de glucose no plasma, reduzindo a produção de glucose pelo fígado e aumentando a recaptação e metabolismo da glucose pelo fígado e aumentando a recaptação e metabolismo da glucose pelos tecidos periféricos.

Deficiência de insulina devido a doença das ilhotas de Langerhans e/ou deficiência da acção da insulina tem como resultado diabetes mellitus, um estado em que a concentração de glicemia é elevada.

Em indivíduos que não são diabéticos, a insulina é produzida no pâncreas e transportada directamente para a circulação hepática, donde é transportada para o fígado antes de qualquer outro órgão ou região do corpo. Assim, o fígado experimenta uma exposição muito elevada à insulina produzida. Normalmente, pelo menos 50% da insulina produzida é ligada a receptores no fígado, a partir dos quais actua no fígado. A insulina ligada a receptores no fígado é removida da circulação e degradada pelas células hepáticas. A insulina que não é ligada no fígado e passa então para a circulação periférica tem portanto uma concentração muito inferior. Assim, os tecidos periféricos (p.ex. gordura e músculo) que são também alvos da insulina, têm uma exposição muito menor à insulina segregada. 3

Em indivíduos diabéticos o tratamento é frequentemente realizado por meio de terapia de substituição da insulina. Em geral uma preparação de insulina é injectada por via subcutânea. 0 regime de insulina subcutânea mais comum envolve a injecção duas vezes ao dia de misturas de preparações de insulina de acção rápida e de acção intermédia. A insulina é absorvida da subderme para a circulação periférica e daí para todo o corpo, incluindo o fígado. Com um sistema destes o fígado e os tecidos periféricos tendem a ter uma exposição aproximadamente igual à insulina.

Existem várias desvantagens e efeitos secundários negativos com a utilização deste sistema.

Em primeiro lugar, se for injectada insulina suficiente para permitir a existência de uma concentração suficientemente alta na circulação hepática existirá então uma concentração demasiado alta na circulação periférica. Do mesmo modo, se estiver presente uma concentração adequada na circulação periférica, a concentração de insulina na circulação hepática será inadequada.

Acredita-se existir um perigo associado a elevadas concentrações de insulina na circulação periférica (hiperinsulinemia) de doença cardiovascular.

Em segundo lugar, existe um sério risco de hipoglicemia em indivíduos diabéticos que recebem a terapia de substituição da insulina por injecção subcutânea. Uma concentração de insulina na circulação periférica demasiado alta pode conduzir a um nível de glicemia demasiado baixo e subsequente colapso. 4

Por conseguinte, seria desejável ser capaz de dirigir uma grande concentração de insulina directamente para os receptores de insulina hepáticos, sendo dirigida uma menor concentração de insulina para os receptores de insulina periféricos. Seria também desejável atingir esta hepatosselectividade para outras moléculas activas. Têm sido feitas algumas tentativas para obter a hepatosselectividade desejada da insulina. A injecção intravenosa directamente para a circulação portal hepática poderia permitir à insulina injectada passar directamente para o figado antes de atingir a circulação periférica. Este sistema é inadequado para utilização em geral devido à dificuldade e natureza complicada desta operação, em particular não é adequado para utilização pelos próprios pacientes diabéticos excepto em circunstâncias excepcionais.

Tem sido feita uma tentativa para tornar a insulina hepatosselectiva por meio da sua injecção subcutaneamente encapsulada em vesículas lipídicas. (Spangler, Ronald S., "Selective Insulinisation of Liver in Conscious Diabetic Dogs", Am. J. Physiol. 249 (Endocrinol. Metab. 12) : E152 -EI 59, 1985). A insulina encapsulada em vesículas lipídicas (designadas insulina encapsulada em vesículas - vesicle encapsulated insulin VEI) foi orientada para hepatócitos por meio de uma fracção diglicérido digalactosilo incorporada no exterior das vesículas lipídicas. Com esta abordagem foi possível alterar a distribuição de uma carga de glucose administrada de forma a favorecer a deposição hepática. 5

Os autores da presente invenção descobriram (British Diabetic Association Medicai and Scientific section Conference, Manchester, 13 a 15 de Abril 1989) que os dímeros covalentes da insulina (peso molecular ± 12.000 Daltons em vez de 6.000 para o monómero insulina) têm um maior efeito no débito da glucose hepática do que na recaptaçâo periférica e utilização. Quer dizer, os dimeros de insulina covalentes parecem actuar preferencialmente nos hepatócitos do que nas células dos tecidos periféricos. Constatou-se também que a pro-insulina revela esta hepatosselectividade num menor grau. A pro-insulina utiliza o zimogénio que é cindido para formar a hormona insulina activa. A molécula pro-insulina é maior do que a molécula de insulina activa.

As células dos tecidos periféricos, por exemplo gordura e músculo, são separadas dos vasos sanguíneos pelo endotélio capilar. No entanto, no fígado não existe esta barreira entre os vasos sanguíneos e os hepatócitos. Pensa-se que o transporte através do endotélio capilar dá-se principalmente por difusão, i.e. transporte activo da insulina através do endotélio capilar não ocorre em qualquer grandeza significativa. Por conseguinte, os autores da presente invenção acreditam que a absorção da insulina nos tecidos periféricos é determinada por factores que influenciam o transporte difusivo, em particular por meio de obstrução estérica ou tamanho das moléculas. Acredita-se que há uma razão para a hepatosselectividade relativa dos dímeros de insulina covalentes e pro-insulina em comparação com os monómeros de insulina; ambos têm livre acesso aos hepatócitos mas o dímero de insulina covalente ou pro-insulina é absorvido nos tecidos periféricos a partir da corrente sanguínea mais lentamente do que o 6 monómero de insulina. Assim, as moléculas maiores passam mais tempo na corrente sanguínea antes de serem absorvidas para os tecidos periféricos e têm assim mais probabilidades de atingir o fígado, onde podem ser activos mais facilmente.

As insulinas aciladas são descritas na JP-A01-254699. Os compostos reduzem a glicose. De acordo com a presente invenção é apresentado um análogo de uma insulina caracterizado por o análogo incluir uma insulina ligada covalentemente a um grupo molecular pendente, sendo o grupo molecular pendente uma hormona tiróideia ou um grupo IGF1. 0 grupo molecular pendente tem uma afinidade para uma ou mais proteínas de ligação presentes no plasma sanguíneo.

Em resultado da administração da composição num corpo humano ou de um animal, um complexo activo com um peso molecular de 25,000 Daltons ou maior fica presente no sistema circulatório humano ou de um animal. A presente invenção tem utilidade particularmente quando o análogo é um análogo de insulina que inclui uma insulina ou seu equivalente funcional, ligado covalentemente a um grupo molecular pendente de forma que, em resultado da administração da composição num corpo humano ou de um animal, fica presente um complexo de insulina com um peso molecular de 25.000 Daltons ou mais no sistema circulatório humano ou do animal.

Assim, quando o análogo é introduzido na corrente sanguínea, a(s) proteína(s) de ligação irá(ão) tornar-se ligada(s) não-covalentemente ao grupo molecular adicional, 7 formando um complexo que tem um peso molecular de 25.000 Daltons ou mais.

Um análogo de insulina assim pode ser injectado subcutaneamente e adsorvido na corrente sanguínea através do endotélio capilar sem dificuldade. Quando se encontrar na corrente sanguínea, o análogo da insulina entrará em contacto com a proteína de ligação para a qual o grupo molecular pendente com ligação covalente tem uma afinidade. Assim, pelo menos algumas moléculas do análogo da insulina irão ficar ligadas à proteína de ligação mencionada, formando um complexo de insulina. As proteínas de ligação tendem a ser moléculas volumosas de elevado peso molecular, por conseguinte, não tendem a difundir-se através do endotélio capilar facilmente e mantêm-se na corrente sanguínea. Assim, o tamanho efectivo da molécula e portanto o peso molecular do análogo de insulina ligado aumenta dramaticamente. A absorção a partir dos vasos sanguíneos para os tecidos periféricos, por exemplo gordura e músculo, através do endotélio capilar fica agora muito inibida devido à ligação do análogo da insulina à proteína de ligação de elevado peso molecular. Mas no fígado não existe uma barreira destas, por conseguinte o análogo de insulina, mesmo com a proteína de ligação associada, pode ter acesso aos receptores de insulina dos hepatócitos essencialmente na mesma escala que a insulina convencional. A ligação do grupo molecular pendente e a proteína de ligação não são covalentes. As forças de ligação podem ser, por exemplo electroestáticas (p.ex. atracção de cargas opostas, ligação por ponte de hidrogénio) ou hidrófobas. Assim, a ligação não é permanente. O análogo de insulina pode ser absorvido pelos tecidos hepáticos na sua forma ligada. As moléculas do análogo de insulina que não ficaram ligadas pela e proteína de ligação ou que ficaram ligadas subsequentemente desligadas são capazes de passar através do endotélio capilar para os tecidos periféricos. 0 grupo molecular com ligação covalente está ligado de tal forma que o sítio (ou sítios) activos da insulina ou equivalente se mantém disponível para executar as suas funções definidas. A ligação de um grupo molecular adequado} a insulina ou equivalente pode ser efectuada por meio de métodos químicos convencionais, conhecidos dos especialistas na técnica. 0 análogo pode ser utilizado num método de terapia de substituição da insulina que inclua injecção subcutânea de uma preparação que inclua o análogo de insulina, conforme anteriormente descrito.

As características preferidas da primeira concretização da presente invenção serão agora descritas pormenorizadamente. A insulina ou seu equivalente funcional, quando a insulina é o agente activo utilizado, pode ser qualquer uma das insulinas utilizadas convencionalmente na terapia de substituição da insulina. J. Brange et al ("Monomeric Insulins and their Experimental and Clinicai Implications", Diabetes Care, vol. 13, no. 9, Setembro 1990) e outros têm estudado a possibilidade de desenvolvimento de insulinas com tendências reduzidas para a auto-associação. Estas insulinas são absorvidas da subderme para a corrente sanguínea mais rapidamente do que a forma em que a insulina é normalmente encontrada em formulações farmacêuticas. A insulina assume um estado associado em formulação farmacêutica. Seis monómeros de insulina associam-se para 9 formar hexâmeros. A associação é não-covalente. Com a utilização da tecnologia do ADN Brange et al. e outros prepararam insulinas que se mantêm diméricas ou mesmo monoméricas em concentração (farmacêutica) elevada por meio da introdução de umas ou algumas substituições de aminoácidos na insulina humana. As insulinas com capacidade de associação reduzida, conforme descritas por Brange et al. e outros são preferidas para serem utilizadas como o equivalente de insulina a que o grupo molecular adicional é ligado. Quando o agente farmacologicamente activo é um equivalente da insulina são preferidas estas insulinas, dado que a sua reduzida tendência para se auto-associar significa que são absorvidos mais rapidamente para a corrente sanguínea desde a subderme do que as insulinas convencionais que tendem a ser injectadas em forma hexamérica.

As insulinas deste tipo têm também sido desenvolvidas por Eli Lilly. Estas são descritas em Protein Engineering, Vol 5, 519-525 e 527-533 (1992) (ambas de D. N. Brems et al) . Estudos de insulinas monoméricas modificadas em aminoácidos têm também sido descritos em Diabetes 40 Supl. 1 (1991), 423A (Howey et al) e 464A (Shaw et al) . O grupo molecular pendente com ligação covalente à insulina tem uma afinidade para uma proteína de ligação presente no plasma sanguíneo e não irá em si actuar no corpo para provocar efeitos negativos. O grupo molecular tem um peso molecular semelhante ou inferior ao da insulina. O peso molecular total da insulina ou seu equivalente funcional e grupo molecular adicional é inferior a 25.000, mais preferivelmente inferior a 20.000 ou 15.000 e pode ser inferior a 12.000. Este facto serve para que a ligação do 10 grupo molecular pendente à insulina para formar o análogo não deve bloquear a passagem por difusão do análogo injectado desde a subderme, através do endotélio capilar para a corrente sanguínea. O grupo molecular pendente é inofensivo quando injectado no corpo, tal pode ser atingido, por exemplo, garantindo que a concentração de análogo de insulina na corrente sanguínea seja suficientemente alta para permitir que sejam sentidos os efeitos benéficos da insulina ou outra terapia mas suficientemente baixos para prevenir quaisquer efeitos que se possam ficar a dever ao sentir do grupo molecular pendente ou garantindo que o análogo da insulina não esteja presente nas partes do corpo em que o grupo molecular pendente possa estar activo ou tornando o grupo molecular pendente inactivo por meio de modificação estrutural que mesmo assim conserva a sua capacidade para ligar à sua proteína de ligação. O grupo molecular pendente pode ser factor de crescimento 1 semelhante à insulina (IGF1). Este polipeptídeo tem uma afinidade para as proteínas de ligação IGF1 que circulam naturalmente na corrente sanguínea humana. O grupo molecular pendente pode ser um grupo tiroxilo nativo ou modificado, derivado a partir de da hormona tiróideia humana tiroxina 3,5,3',5'-L-tetraiodotironina (T4) . Existem várias proteínas de ligação presentes no plasma sanguíneo humano que têm uma afinidade para o grupo T4, por exemplo globulina de ligação da tiroxina (TBG), pré-albumina de ligação da tiroxina (TBPA) e albumina. Estas proteínas são conhecidas colectivamente como proteínas de ligação da tiroxina (TBP). 11 0 grupo molecular pendente com uma afinidade para uma proteína de ligação pode ser ligado covalentemente directamente à insulina ou equivalente, como explicado anteriormente, num lugar escolhido de forma que o grupo molecular adicional não iniba a acção da insulina ou equivalente. A estrutura da insulina e as localizações dos seus sítios activos são bem conhecidos, por conseguinte quando a insulina é utilizada os especialistas na técnica serão capazes de estabelecer as posições apropriadas em que ligar o grupo molecular mencionado, de forma a não interferir significativamente com a acção da insulina ou equivalente.

Em alternativa pode ser utilizada uma cadeia molecular pequena (ou "braço espaçador") para ligar a insulina ou equivalente de insulina e o grupo molecular mencionado. 0 braço espaçador está ligado covalentemente à insulina ou equivalente e ao grupo molecular pendente. Este braço espaçador garante que a insulina ou equivalente e proteína de ligação são distanciados uns dos outros, evitando assim uma interferência substancial com a actividade da insulina pela proteína de ligação de elevado peso molecular (normalmente volumosa). 0 braço espaçador é normalmente uma cadeia linear, de preferência com 3 a 10 átomos de carbono de comprimento. Este braço espaçador pode ser, por exemplo, um grupo amino-hexanoílo (AH) , que é uma cadeia de seis carbonos. Podem evidentemente ser usados outros grupos como braço espaçador. Por exemplo, podem ser usados aminoácidos quer singularmente quer ligados como pequenas sequências de peptídeos.

Deve-se assegurar que a proteína de ligação que tem uma afinidade para o grupo molecular pendente esteja presente 12 no plasma sanguíneo em quantidades suficientemente grandes para que a fixação da proteína de ligação pelo análogo da insulina que tem o grupo molecular ligado covalentemente não esgote os níveis de proteína de ligação no sangue com efeitos negativos. Por exemplo, o nível de proteína de ligação não deve ser esgotado de forma que fique disponível uma quantidade de proteína de ligação insuficiente para executar a sua função habitual no corpo, se tiver alguma. 0 análogo da insulina da presente invenção pode ser produzido por meio de vários métodos, por exemplo: reacção química da insulina ou equivalente da insulina ou outro agente activo com uma substância ou substâncias que incluem o grupo molecular pendente; síntese de proteica do conjugado completo, produção por um microorganismo modificado geneticamente. 0 análogo da insulina da presente invenção pode ser utilizado num método de terapia de substituição da insulina. Um análogo da insulina de acordo com a presente invenção ou uma mistura de dois ou mais análogos da insulina diferentes de acordo com a presente invenção formam parte de uma preparação de insulina. Esta preparação de insulina é adequada para uma utilização num método de tratamento do corpo humano ou de um animal, de preferência é adequada para injecção subcutânea e pode incluir um tratamento para o diabetes. Podem ser acrescentados ingredientes adicionais que modificam a taxa de absorção desde o depósito subcutâneo para a circulação. A preparação à base de insulina é preferencialmente preferida para injecção subcutânea, nesse caso é portanto adequado para utilização por pacientes com diabetes em si mesmos. 13 A preparação de insulina pode incluir o análogo hepatosselectivo da presente invenção e uma insulina não hepatosselectiva convencional. Em injecção subcutânea e a passar para a corrente sanguínea, a insulina convencional irá actuar nos tecidos periféricos enquanto que o conjugado de insulina da presente invenção proporciona uma acção hepatosselectiva controlada.

Na presente invenção, pode ser administrado um análogo da insulina com um grupo molecular pendente com ligação covalente a uma proteína de ligação já ligada com ligação não covalente ao grupo molecular pendente. Uma composição que compreende um análogo de insulina destes seria mais adequada para administração intravenosa do que administração subcutânea devido ao peso molecular muito elevado do análogo da insulina na composição (em comparação só com o análogo da insulina, que forma um complexo de insulina de peso molecular maior que 25.000 só depois da administração no sistema circulatório). No entanto, poderá ser desejável, nalguns casos proporcionar um análogo de insulina destes ou um análogo de outro agente activo para utilizar no fabrico de uma composição adequada para administração intravenosa. A presente invenção inclui ainda preparações que compreendem o novo análogo e um excipiente farmaceuticamente aceitável e a utilização dos novos análogos para o fabrico de preparações para utilização num método de tratamento de um ser humano ou animal.

Exemplos

Os autores da presente invenção realizaram um estudo para explorar a possibilidade de os análogos da insulina com 14 acesso restrito aos tecidos periféricos poderem apresentar uma hepatosselectividade relativa in vivo.

Foram concebidos e testados análogos da insulina que incluem uma fracção tiroxilo que liga à proteína de ligação da hormona tiróideia (TBP). ΝαΒΙ-insulina tiroxilo (T4-Ins) e ΝαΒΙ-insulina tiroxilo-amino-hexanoil (T4-AH-Ins) foram sintetizados com métodos de síntese química indicados em seguida.

Preparação de insulinas tiroxilo Abreviaturas:

Msc = metilsulfoniletiloxicarbonilo Boc = terc. butiloxicarbonilo DMF = dimetilformamida DMSO = dimetilsulfóxido Pf = ponto de fusão ONSu = éster N-oxisuccinimida Exemplo 1

Insulina tiroxilo BI (porcino) (T4-Ins)

Derivados de tiroxina protegidos:

Msc-L-tiroxina (I) 776 mg (1 mmol) de L-tiroxina em 2 ml de dimetilsulfóxido foram feitos reagir com 530 mg (2 mmol) de Msc-ONSu na presença de 139 μΐ (1 mmol) de trietilamina à temperatura ambiente durante 18 horas. Após concentração sob vácuo, o resíduo oleoso foi retomado em acetato de etilo, a camada orgânica foi lavada com água, seca sobre Na2S04 e o solvente foi removido sob vácuo. O resíduo sólido foi cristalizado a partir de hexano.

Rendimento: 651 mg (70,2% do teórico), 15

Pf: 200°C Éster Msc-L-tiroxina-oxisuccinimida (II) A uma solução arrefecida (0°C) de 371 mg (0,4 mmol) de Msc-tiroxina e 40 mg (0,4 mmol) de N-hidroxissuccinimida em 1 ml de tetra-hidrofurano adicionou-se sob agitação uma solução previamente arrefecida de 82,5 mg de N,N-diciclo-hexilcarbodiimida em 0,5 ml de tetra-hidrofurano. Depois de agitação durante mais 3 horas o precipitado foi removido por meio de filtração e o filtrado foi concentrado sob vácuo. Cristalização do resíduo sólido a partir de cloreto de metileno/éter de petróleo.

Rendimento: 295 mg (71%, baseado em I)

Pf: 180°C.

Insulina tiroxilo Bl (porcino) (III) A uma solução de 100 mg (aprox 0,016 mmol) foi adicionada insulina A1,B29-Msc2 (preparada de acordo com Schuttler e Brandenburg, Hoppe-Seyler's z. Physiol, Chem. 360, 1721 - 1725 (1979)) e 18μ1 (0,016 mmol) de N-metilmorfolina em 2 ml de DMSO 116,4 ml (0,160 mmol) de II em 0,2 ml de DMSO. Após agitação durante 6 h à temperatura ambiente, o derivado de insulina foi precipitado com éter/metanol (9:1, v/v) isolado por meio de centrifugação, lavado por 3 vezes com éter/metanol e seco sob vácuo. Os grupos Msc foram removidos por meio de tratamento com NaOH/dioxano/metanol a 0°C e III foi purificado por meio de filtração em gel em Sephadex G 50 fino conforme descrito (Geiger et al, Chem. Ber. 108, 2758 - 2763 (1975)). A liofilização deu 78,4 mg de insulina tiroxilo Bl (75% com base em insulina Msc2).

Exemplo 2 16

Insulina amino-hexanol tiroxilo BI (porcino) (IV) (T4-AH-Ins) 1. Ácido BOC-s-amino-hexanóico foi preparado por meio de reacção de 1,32 g (10 mmol) de ácido ε-amino-hexanóico com 2,4 g (11 mmol) de dicarbonato de di-terc.-butilo em dioxano/água a pH 9 e obteve-se com 87% de rendimento (2,2 g) . Pf após recristalização a partir de acetato de etilo: 75°C. 2. 22,8 mg (0,096 mmol) de ácido BOC-amino-hexanóico foram pré-activados com 13 mg de 1-hidroxibenzotriazole e 17,8 mg (0,09 mmol) diciclo-hexilcarbodiimida em 0,7 ml de dimetilformamida durante 1 h a 0°C e mais 1 hora à temperatura ambiente. 3. Então foi adicionada uma solução de 100 mg (aprox. 0,016 mmol) de insulina Al,B29-Msc2 e 18 μΐ (0,016 mmol) de N-metilmorfolina em 1 ml de DMF. Após agitação durante 70 minutos à temperatura ambiente as misturas foram filtradas e o derivado de insulina foi precipitado com éter etilico/metanol (9:1, v/v) isolado por meio de centrifugação, lavado por 3 vezes com éter/metanol e seco sob vácuo. 4. O grupo protector Boc foi cindido por meio de tratamento do produto com 3 ml de ácido trifluoroacético durante 1 hora à temperatura ambiente. A solução foi concentrada sob vácuo, o derivado de insulina foi precipitado com éter, isolado, lavado com éter e seco. Rendimento: 77,8 mg de insulina Bl-amino-hexil-Al, B29-Msc2. 5. 102 mg (0,016 mmol) deste derivado foram dissolvidos em 2 ml de dimetilformamida e 18μ1 (0,16 mmol) de N-metilmorfolina. Após adição de 116 mg (0,16 mmol) de éster de Msc-tiroxina-N-oxisuccinimida em 0,2 ml de dimetilformamida a mistura foi agitada durante 3 horas à temperatura ambiente. A insulina protegida foi isolada por 17 meio de precipitação com metanol/éter e isolada da forma anteriormente descrita. 6. Os grupos Msc foram removidos por meio de tratamento com NaOH/dioxano/metanol a 0°C e IV foi purificado por meio de filtração em gel em Sephadex G 50 fino conforme descrito (Geiger et al, op. cit.). A liofilização deu 39,1 mg de insulina Bl-tiroxilamino-hexanoilo (37% com base em insulina amino-hexil-Msc2). T4-Ins, T4-AH-Ins e insulina (Ins) foram perfundidos em quatro beagles anestesiados com D-3H-3-glucose para medição das taxas de produção de glucose (Ra) e eliminação da glucose (Rd). A euglicemia e actividade especifica da glucose foram mantidos por perfusão variável de D-glucose com D-3H-3-glucose.

Com todos três materiais a glucose Rd aumentou e a glucose Ra diminuiu a partir do nível basal 2,70 ± 0,19 mg.kg-1 min" \ (p<0,05). Em cada uma das experiências a actividade de tipo insulina para Ra e Rd foi calculada como a área entre os valores basais e cada uma destas variáveis e valores subsequentes foram registados graficamente no tempo (AUC). Para Ins, T4-Ins e T4-AH-Ins respectivamente, AUC para valores Ra forma -431+121, -226+154 e -357+50 (SEM+médio, mg/kg) (sem diferenças significativas) e AUC para valores Rd foram 1142+160, 629+125 e 830+178 mg/kg, sendo ambos os conjugados diferentes de Ins p<0,05.

Estes resultados indicam que os análogos da insulina da presente invenção agem mais nos tecidos do fígado do que nos das regiões periféricas do corpo, tal como gordura e músculo.

Lisboa, 5 de Uulho de 2007

Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Análogo de uma insulina caracterizado por o análogo incluir uma insulina ligada covalentemente a um grupo molecular pendente, sendo o grupo molecular pendente mencionado uma hormona tiróideia de um grupo IGFl.
2. 2. Análogo de acordo com a reivindicação 1, que tem uma afinidade para as proteínas de ligação IGF, albumina, pré-albumina de ligação tiroxina ou globulina de ligação tiroxina.
3. 3. Análogo de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que o grupo molecular pendente é um grupo tiroxilo.
4. 4. Análogo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o grupo molecular pendente está ligado à insulina por um espaçador molecular.
5. 5. Análogo de acordo com a reivindicação 4, em que o espaçador molecular inclui uma cadeia linear com 3 a 10 átomos de carbono.
6. 6. Análogo de acordo com a reivindicação 5 em que o espaçador molecular é um grupo amino-hexanoílo.
7. 7. Preparação adequada para utilização num método de tratamento do corpo humano ou de um animal compreendendo pelo menos um análogo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6. que é
8. 8. Preparação de acordo com a reivindicação adequada para injecção subcutânea. Lisboa, 5 de Julho de 2007