PT667787E

PT667787E - Vacinas de conjugado de polissacarido-proteina de estreptococos do grupo b do tipo ii e tipo v

Info

Publication number: PT667787E
Application number: PT93922357T
Authority: PT
Inventors: Dennis L Kasper; Harold J Jennings
Original assignee: Brigham & Womens Hospital; Ca Nat Research Council
Priority date: 1992-09-24
Filing date: 1993-09-24
Publication date: 2001-10-31
Also published as: GR3036928T3; IL107103A0; NO319569B1; DE69330464D1; EP0667787A1; ATE203167T1; AU690525B2; IL107103A; EP0667787B1; CA2145397A1; US5795580A; NO951109D0; JP4308174B2; NO951109L; AU5137893A; DK0667787T3; NZ248766A; FI951412A; JP2009132727A; FI951412A0

Description

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DESCRIÇÃO "VACINAS DE CONJUGADO DE POLISSACÁRIDO-PROTEÍNA DE ESTREPTOCOCOS DO GRUPO B DO TIPO II E TIPO V"

ÂMBITO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a moléculas de conjugado antigénicas que compreendem o polissacárido capsular do estreptococos do grupo B do tipo II ou V, que está ligado covalentemente a proteína. A presente invenção refere-se também a vacinas e métodos para a imunização de mamíferos, incluindo humanos, contra a infecção por estreptococos do grupo B do tipo II (GBS II) e/ou tipo V (GBS V) . Também se reivindicam vacinas multivalentes que compreendem as moléculas de conjugado da presente invenção e antigénios de outros patogéneos bacterianos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As infecções devidas a estreptococos do grupo B (GBS) são a causa mais comum de sepsia e meningite nos recém-nascidos, nos países desenvolvidos (3, 31). Descrições recentes de alguns centros nos Estados Unidos reflectem uma mortalidade mais baixa (9 a 13%) do que nos anos 70, talvez como resultado de diagnóstico precoce e cuidado intensivo (1, 10) . Apesar de tudo, ainda ocorrem infecções fatais e, de igual relevância, até 50% dos sobreviventes de meningite por GBS têm danos 1 T t (“ ^ ^ neurológicos crónicos, que vão desde a surdez e incapacidade de aprendizagem ligeira a incapacidades motora, sensorial e cognitiva, profundas (3). A prevenção, em vez de um diagnóstico ou terapia melhorados, terá provavelmente um impacto mais significativo numa redução cada vez maior da morbidez e mortalidade, associadas a GBS.

Uma vez que os anticorpos específicos de polissacáridos capsulares de GBS parecem proteger, tanto animais experimentais (23, 24), como crianças humanas (4, 5) da infecção por GBS, alguns dos polissacáridos foram purificados e testados em adultos saudáveis, como vacinas experimentais (6). Se existisse uma vacina contra GBS eficaz e segura, esta poderia ser administrada a mulheres, antes e durante a gravidez, para desencadear anticorpos, que seriam transferidos para o feto, no útero, e proporcionariam protecção contra a infecção neonatal. De entre os três polissacáridos de GBS (tipos Ia, II e III) testados em voluntários, o de tipo II tinha a taxa mais elevada de imunogenicidade, desencadeando uma resposta de anticorpos específicos do tipo II em 88% de receptores anteriormente não imunes (6). Embora se tenha reconhecido que uma variedade de serotipos de GBS contribuem de forma significativa para a percentagem de pacientes com infecção por GBS, o tipo V não tem sido considerado responsável por uma percentagem significativa de infecção por GBS. Em recém-nascidos, o nível de anticorpos específicos necessários para proteger contra a infecção por GBS tipo II não está definido de forma precisa, mas foi estimado em 2 ou 3 μρ/πιΐ (6) . Num receptor de uma vacina, que alcança uma resposta de anticorpos apenas ligeiramente acima do mínimo necessário para protecção, a quantidade de anticorpos maternos transferidos através da placenta poderá não ser adequada para proteger uma criança prematura, devido à transferência 2

t incompleta para o feto de material de imunoglobulina G (IgG), ou uma criança com um infecção de inicio tardio, uma vez que a semi-vida dos anticorpos IgG maternos no recém-nascido é de cerca de 25 dias (13) . Muitas das crianças nestes dois grupos de pacientes poderiam ser protegidas, se a magnitude da resposta de anticorpos específicos contra a vacinação fosse maior. A transferência de IgG materno para o feto, aumenta ao longo do terceiro trimestre, pelo que um nível maior de anticorpos maternos iria proporcionar uma protecção mais cedo, i.e. numa criança mais prematura (16). De modo semelhante, níveis maternos mais elevados iriam resultar numa persistência maior de anticorpos maternos na criança, proporcionando desse modo uma protecção também contra a doença de início tardio. A imunogenicidade de alguns antigénios de polissacáridos bacterianos tem sido aumentada, pela ligação de proteínas transportadoras adequadas a polissacáridos, ou a oligossacáridos derivados (2, 14, 17-19, 22, 27, 29, 30, 34) . As propriedades desejáveis de vacinas de conjugados polissacárido-proteína, incluem uma imunogenicidade aumentada do polissacárido, uma resposta aumentada de anticorpos específicos de hapteno a doses de reforço, e uma predominância de anticorpos de classe IgG. Recentemente, os requerentes desenvolveram, com sucesso, uma vacina de GBS III-toxóide de tétano (TT), utilizando as porções de ácido siálico da cadeia lateral como locais de acoplamento de proteínas direccionado (33). A vacina III-TT desencadeou anticorpos específicos de GBS tipo III, opsonicamente activos, enquanto que o polissacárido tipo III não conjugado era não imunogénico, em coelhos (33). 3 f u

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção reivindica moléculas de conjugado antigénicas, que compreendem o polissacárido capsular derivado de estreptococos do grupo B, tipo II e um componente proteico, ou estreptococos do grupo B, tipo V e um componente proteico, em que duas ou mais cadeias laterais que terminam em resíduos de ácido siálico do componente polissacarídeo do tipo II ou tipo V estão, cada uma, ligadas através de uma ligação amina secundária à proteína.

Também se reivindica um método para preparar as moléculas conjugadas de um polissacárido capsular de estreptococos do grupo B do tipo II ou tipo V e uma proteína compreendendo: (a) submeter o polissacárido capsular de estreptococos do grupo B do tipo II ou tipo V, a oxidação peroxidativa, suficiente para introduzir um grupo aldeído em dois ou mais resíduos de ácido siálico terminais, ligados ao esqueleto do polissacárido; (b) acoplar o polissacárido capsular de estreptococos do grupo B do tipo II ou tipo V, oxidado, a uma proteína, através de aminação redutora, para produzir uma ligação de amina secundária entre o polissacárido capsular e a proteína.

Também se reivindicam moléculas conjugadas, preparadas de acordo com o método descrito acima. A presente invenção reivindica ainda vacinas compreendidas por cada uma das moléculas conjugadas descritas acima. Além disso, a presente invenção reivindica vacinas multivalentes, que compreendem as moléculas conjugadas da invenção e pelo 4

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U -¾. menos uma outra molécula imunogénica capaz de desencadear a produção de anticorpos contra uma substância patogénica diferente do estreptococos do grupo B do tipo II ou tipo V. Em particular, para além de compreender as moléculas conjugadas de GBS tipo II e/ou GBS tipo V, a vacina multivalente de acordo com a invenção compreende ainda outras moléculas imunogénicas capazes de desencadear a produção de anticorpos contra patogéneos seleccionados de entre o grupo constituído por estreptococos do grupo B tipos Ia, Ib, III, IV e Haemophilus influenzae tipo b e E. coli tipo Kl. De preferência, as outras moléculas imunogénicas são capazes de desencadear a produção de anticorpos contra patogéneos seleccionados de entre o grupo constituído por estreptococos do grupo B tipos Ia, Ib, III e Haemophilus influenzae tipo b e E. coli tipo Kl, ou seleccionados do grupo constituído por estreptococos do grupo B do tipo Ia, Ib, III.

Noutra forma de concretização da presente invenção, reivindica-se a utilização da molécula de conjugado da invenção para a produção da vacina para imunização de recém-nascidos, em que a vacina é administrada numa quantidade imunogénica a um humano do sexo feminino, de forma a produzir anticorpos capazes de passar para um feto, concebido antes ou depois da administração da vacina, numa quantidade suficiente para produzir protecção contra a infecção no recém-nascido, na altura do nascimento. A vacina pode ser administrada a uma fêmea entre as idades de 10 e 50 anos. Além disso, a vacina pode ser administrada durante a gravidez.

Também se reivindica a utilização da molécula de conjugado da presente invenção para a produção de uma vacina para a imunização de humanos, por administração da vacina numa 5 t f-' u quantidade imunogénica a um humano. Além disso, também se reivindica a utilização da molécula de conjugado da invenção, para a produção de uma vacina para imunização de adultos, por administração da vacina numa quantidade imunogénica a uma pessoa, em risco de ser infectada por estreptococos do grupo B do tipo II ou tipo V.

Noutra forma de concretização da presente invenção, administra-se uma vacina compreendendo as moléculas de conjugados da invenção, numa quantidade imunogénica, a receptores voluntários da vacina, que podem doar soro ou plasma que pode ser administrado passivamente aos grupos acima referidos. A presente invenção proporciona também um método para imunizar pessoas, incluindo recém-nascidos, crianças e adultos em risco de serem infectados por estreptococos do grupo B tipo II ou tipo V. As pessoas em risco poderão ser pessoas cujo sistema imunitário está suprimido, por uma variedade de razões, incluindo, mas não se limitando a cancro e diabetes. A vacina pode ser administrada num transportador farmaceuticamente aceitável.

Outra forma de concretização da presente invenção é a utilização da molécula de conjugado de acordo com a invenção para a produção de uma vacina para imunizar manadas de gado produtor de leite contra a mastite bovina, administrando a vacina numa quantidade imunogénica a vacas produtoras de leite. FIGURA 1. Estrutura da unidade de repetição do heptassacárido do polissacárido capsular de GBS do tipo II. FIGURA 2. ELISA competitivo do polissacárido de GBS do tipo II. Utilizaram-se polissacáridos de GBS tipo la(0), tipo 6 Γ

t II (·) e tipo III (A), como inibidores de anticorpos de vacina II-TT que se ligam a placas revestidas com polissacárido do tipo II. Os resultados são expressos como percentagens de inibição em relação aos poços controlo que não possuíam inibidor. FIGURA 3. ELISA competitivo de polissacárido de GBS do tipo II. Utilizaram-se polissacáridos tipo II nativo (·) e dessializado, ou nuclear (□), como inibidores de anticorpos desencadeados pela vacina II-TT. Os pontos de dados são médias (com desvios padrão) de determinações em triplicado. Os resultados são expressos como percentagem de inibição, em relação aos poços controlo que não tinham inibidor. FIGURA 4. Estrutura da unidade de repetição do polissacárido capsular de GBS tipo V. FIGURA 5. ELISA competitivo de polissacáridos de GBS tipo V. Utilizaram-se polissacáridos de GBS tipo Ia (-A-) , tipo Ib (-A-), tipo II (- -), tipo III (-0-), tipo V (--) e tipo VI (-□-), como inibidores de anticorpos desencadeados pela vacina V-TT. Os pontos de dados são médias de determinações em duplicado. Os resultados são expressos como percentagem de inibição, em relação aos poços controlo que não possuíam inibidor. FIGURA 6. Morte opsonofagocítica in vitro por linfócitos de sangue periférico humano, de GBS tipo V estirpe CJB 111, opsonizados por antisoro de coelho, produzidos contra a vacina conjugada de GBS tipo V-TT. C’ é complemento. 7 \ * \ *

Lc,

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE CONCRETIZAÇÃO PREFERIDAS A invenção refere-se a moléculas de conjugado antigénicas compreendendo um componente polissacárido capsular e um componente proteico.

Estirpes bacterianas. 0 GBS tipo II estirpe 18RS21 e tipo Ia estirpe 090 foram originalmente obtidos de Rebecca Lancefield da Universidade Rockefeller, recentemente falecida, e foram mantidos como culturas congeladas a -80°C. A estirpe 18RS21 foi utilizada em testes in vitro e in vivo e foi a fonte de polissacárido capsular do tipo II, utilizado na vacina conjugada. Dois isolados clínicos de GBS tipo II (estirpes S16 e S20) e tipo III estirpe M781, foram obtidos da colecção de culturas do Laboratório Channing.

Embora anteriormente não se tenha reconhecido que contribui significativamente para o número de infecções por GBS em humanos, dados recentes indicam que o serotipo tipo V contribui para cerca de 15% das infecções por GBS. Para preparar uma vacina conjugada de GBS-tipo V, obtiveram-se GBS tipo V estirpe 1169-NT1 do Dr. J. Jelinkova do Instituto de Higiene e epidemiologia, Praga, República Checa e estes foram mantidos como culturas congeladas a -80°C. A estirpe 1169-NT1 foi utilizada em estudos in vitro e in vivo e foi a fonte de polissacárido capsular tipo V, utilizada na vacina conjugada. O GBS tipo V, estirpe CJB 111 foi originalmente obtido da Dr. Carol Baker da Universidade de Baylor.

Conjugação do polissacárido GBS tipo II ou polissacárido tipo V a TT. O polissacárido capsular tipo II foi purificado a partir de células da estirpe 18RS21 por métodos descritos 8 anteriormente, para a purificação de polissacáridos do tipo III (33) . A conjugação de polissacáridos tipo II a TT monomérico foi realizada utilizando técnicas anteriormente descritas em pormenor, para a conjugação de TT a polissacáridos de GBS tipo III (33). Em resumo, o polissacárido tipo II nativo foi fraccionado, de acordo com o tamanho, numa coluna de Sepharose CL-6B (1,6 por 85 cm; Pharmacia Fine Chemicals). Reuniu-se o material que elui no centro do pico principal, dializou-se contra água e liofilizou-se, para se obter um material com um peso molecular relativo de 200.000. A análise deste material por espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 1H a 500 MHz, confirmou a estrutura do polissacárido tipo II nativo (20) , e a ausência do antigénio do grupo B (26) . Os polissacáridos adequados para utilização em moléculas conjugadas da presente invenção podem variar em peso molecular, numa vasta gama. Uma gama de peso molecular preferida para o componente polissacárido é entre 5.000 e 1.000.000 daltons. Uma gama mais preferida para o componente polissacárido é entre 50.000 e 500.000 daltons. Uma gama mais preferida é entre 100.000 e 300.000. Na gama de 100.000 a 300.000 daltons, os polissacáridos com peso molecular de 200.000 daltons são preferidos. O polissacárido do tipo II, fraccionado de acordo com o tamanho, foi submetido a uma oxidação suave com meta-periodato de sódio (18) . Este processo resultou na conversão de uma porção de resíduos de ácido siálico no polissacárido, no análogo de ácido siálico de oito carbonos, o ácido 5-acetamido-3,5-didesoxi-D-galactosiloctulossónico (33). A percentagem de resíduos de ácido siálico oxidados foi estimada por espectroscopia de massa-cromatografia gasosa dos resíduos de ácido siálico e os seus derivados oxidados, como descrito 9 \

U, ^ anteriormente (33) . De preferência, entre 5 e 50% dos resíduos de ácido siálico de cada polissacárido de GBS tipo II são modificados e estão disponíveis para se ligarem à proteína. De preferência, entre 5 e 25% dos resíduos de ácido siálico do polissacárido de GBS tipo II são modificados e disponíveis para ligação à proteína. Uma modificação de entre 5 e 10% dos polissacáridos de GBS tipo II é muito preferida.

Uma oxidação do polissacárido de GBS tipo V para se obter entre 5 e 80% de modificação dos resíduos de ácido siálico terminais, para formar aldeídos reactivos, é preferida. Uma modificação entre 10 a 50% dos resíduos de ácido siálico terminais é mais preferida. Uma modificação entre 5 a 50%, 5 a 25% e 5 a 10% dos resíduos de ácido siálico terminais é bastante preferida. O componente proteico das moléculas de conjugado da invenção pode ser qualquer proteína fisiologicamente tolerada. De entre as proteínas preferidas referem-se o toxóide de tétano, toxóide de difteria e materiais de reticulação como CRM197 . 0 polissacárido do tipo II oxidado foi ligado a toxóide de tétano monomérico ("TT") (Instituto Armand Frappier, Montreal, Canadá) por aminação redutora, como descrito anteriormente (33) . O TT foi purificado na sua forma monomérica por cromatografia de filtração em gel, também como anteriormente descrito (33). Em resumo, dissolveram-se 10 mg de polissacárido tipo II, tratado com periodato e 10 mg de TT purificado em 0,6 ml de bicarbonato de sódio 0,1 M (pH 8,1). Adicionou-se cianoborohidreto de sódio (20 mg) à mistura e incubou-se a 37°C, durante 5 dias. A evolução da conjugação foi monitorizada 10

por cromatografia líquida de proteínas rápida (FPLC), de pequenas alíquotas da mistura reaccional, analisadas numa coluna de filtração em gel Superose 6 ® (Pharmacia). A reacção foi terminada quando a altura do pico eluído no volume vazio da coluna (representando o conjugado de peso molecular elevado) permaneceu constante. 0 conjugado foi purificado por cromatografia numa coluna de Biogel A®, 0,5 M (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.), tal como descrito anteriormente (33) . 0 conteúdo proteico da vacina foi estimado pelo método de Lowry et al. (25) , utilizando albumina de soro bovino como padrão. 0 conteúdo em carbohidratos foi determinado pelo método de Dubois et al. (11), utilizando polissacárido do tipo II, purificado, como padrão. A preparação da molécula de conjugado foi realizada de um modo tal, que, de preferência, 5 a 50%, 5 a 25% e 5 a 10% dos resíduos de ácido siálico de cada polissacárido são covalentemente ligados à proteína. Numa forma de concretização preferida, o polissacárido é GBS tipo II e 5% dos resíduos de ácido siálico de cada polissacárido estão covalentemente ligados à proteína.

Purificou-se um polissacárido capsular tipo V, a partir de células GBS tipo V estirpe 1169-NT1, pelos métodos descritos anteriormente para a purificação do polissacárido tipo III (33) . A conjugação do polissacárido tipo V com TT monomérico foi realizada utilizando técnicas anteriormente descritas em pormenor, para a conjugação de TT ao polissacárido GBS tipo III (33) . O polissacárido tipo V nativo tinha um peso molecular relativo de 200.000 daltons. A análise deste material por 11 espectroscopia de ressonância magnética nuclear-H a 500 MHz confirmou a estrutura do tipo V nativo (2) e a ausência de antigénio do grupo B (26) .

Para introduzir grupos aldeído reactivos nos resíduos de ácido siálico terminais do polissacárido tipo V para ligar à proteína, o polissacárido tipo V foi submetido a uma oxidação suave com meta-periodato de sódio (18). Este processo resultou na conversão de uma porção dos resíduos de ácido siálico no polissacárido análogo ao ácido siálico de oito carbonos, o ácido 5-acetamido-3,5-didesoxi-D-galactosiloctulossónico (33). A percentagem de resíduos de ácido siálico oxidados foi estimada por cromatografia gasosa - espectroscopia de massa dos resíduos de ácido siálico e seus derivados oxidados. O polissacárido tipo V oxidado foi ligado a TT monomérico (Instituto Armand Frapier, Montreal, Canadá) por aminação redutora, como descrito anteriormente (33). O TT foi purificado no seu monómero por cromatografia de filtração em gel, também descrita anteriormente (33). Em resumo, dissolveram-se 8,6 mg do polissacárido tipo V tratado com periodato e 8,7 mg de TT purificado em 0,5 ml de bicarbonato de sódio 0,1 M (pH 8,2) . Adicionou-se cianoborohidreto de sódio (31,5 mg) à mistura e incubou-se a 37°C, durante 10 dias. A evolução da conjugação foi monitorizada por cromatografia líquida de proteínas rápida (FPLC), de pequenas aliquotas da mistura reaccional, analisadas numa coluna de filtração em gel Superose 6 ® (Pharmacia). A reacção foi terminada quando a altura do pico eluído no volume vazio da coluna (representando o conjugado de peso molecular elevado) permaneceu constante. 0 conjugado foi purificado por cromatografia numa coluna de 2,6 x 91 cm de Sephacryl S-300 HR (Pharmacia), utilizando fosfato 0,01M, NaCl 0,15 M, pH 7 mais 12

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t timesoral a 0,01%, como tampão de corrida. O conteúdo proteico da vacina foi estimado pelo método de Lowry et al. (25), utilizando albumina de soro bovino como padrão. O conteúdo em carbohidratos foi determinado pelo método de Dubois et al. (11), utilizando galactose como padrão. A preparação da molécula de conjugado foi realizada de modo a que, de preferência, 5 a 50%, 5 a 25% e 5 a 10% dos resíduos de ácido siálico de cada polissacárido são covalentemente ligados à proteína. Numa forma de concretização preferida, o polissacárido é GBS tipo II e 25% dos resíduos de ácido siálico de cada polissacárido estão covalentemente ligados à proteína.

Vacinação de coelhos com a vacina II-TT e vacina V-TT.

Vacinaram-se grupos de três coelhos fêmea New Zealand White (Millbrook Farms, Amherst, Mass.), tendo cada coelho um peso aproximado de 3 kg, subcutaneamente em quatro locais nas costas, com 50 μg, ou de polissacárido do tipo II nativo, não acoplado, ou de vacina II-TT, cada um emulsionado com adjuvante de Freund completo, num volume total de 2 ml. Estes animais receberam injecções de reforço (50 μg) de vacina, preparadas com adjuvante de Freund incompleto, aos dias 20 e 41. O soro foi obtido de cada animal aos dias 0, 20, 34, 41, 55 e 70; filtrado de forma estéril e armazenado a -80°C.

Vacinou-se um coelho fêmea New Zealand White (Millbrook Farms, Amhrest, Mass.) com um peso aproximado de 3 kg, subcutaneamente em quatro locais nas costas, com 50 μg de vacina conjugada GBS tipo V-TT, misturada com alum, num volume total de 2 ml. Este animal recebeu injecções de reforço (50 μg) de vacina, preparadas com alum, aos dias 22 e 42. O soro foi 13

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t obtido de cada animal aos dias 0, 35, 56 e 91; filtrado de forma estéril e armazenado a -80°C. ELISAs. Os anticorpos de coelho específicos de GBS tipo II foram quantificados por ensaio imunoadsorvente ligado a enzimas (ELISA), com IgG de cabra anti-coelho, conjugado com fosfatase alcalina (Tago Inc., Burlingham, Calif.) a uma diluição de 1/3.000. As placas de microtítulo (Imulon 2; Dynatech Laboratories, Inc., Chantillty, Va.) foram revestidas com 100 ng de polissacárido tipo II purificado, ligado a poli-L-lisina, por poço, como descrito anteriormente (15, 33) . Os títulos de anticorpo foram registados como a diluição recíproca que resultou numa A4os > 0,3, quando os poços contendo o soro referência (antisoro de coelho produzido contra células BGS 18RS21 totais) a uma diluição de 1/800, atingiram uma A405 de 0,5. A quantidade de anticorpo específico para a porção de proteína da vacina conjugada, foi estimada por ELISA, utilizando placas revestidas com TT monomérico (100 ng por poço). Os títulos de IgG específicos de TT foram registados como a diluição recíproca que resultou numa A40s > 0,3, 35 min após a adição de substrato, p-nitrofenil fosfato (comprimidos de substrato de fosfatase 104 da Sigma; Sigma Chemical Co.).

Os anticorpos de coelho específicos para GBS tipo V também foram quantificados por ELISA com IgG de cabra anti-coelho, conjugado com fosfatase alcalina (Tago Inc. Burlingham, Calif.) a uma diluição 1/3.000. As placas de microtítulo (Immulon 2; Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA) foram revestidas com 100 ng de polissacárido tipo V purificado, ligado a poli-L-lisina, por poço, como anteriormente descrito (15). Os títulos de anticorpo foram registados como a diluição recíproca que resultou numa A4qs > 0,3, quando os poços que contêm o soro 14 Γ U, referência (antisoro de coelho produzido contra o tipo V estirpe 1169-NT1 total) a uma diluição de 1/3000 atingiu uma A405 de 0,3.

Separação de IgG e IgM do soro de coelho imune. Utilizou-se cromatografia em coluna de afinidade de proteína A-agarose (Pierce Chemical Co., Rockford, 111.) para separar as imunoglobulinas (IgG e IgM) de 0,5 ml de soro de coelho imune, reunido, obtido ao dia 70, produzido contra a vacina II-TT, como descrito noutro local (28) . A separação das classes de anticorpo foi confirmada por placas ELISA revestidas com polissacárido tipo II, com IgG de cabra anti-coelho (especifico da cadeia γ e cadeia leve; Tago) utilizado a uma diluição de 1/500 e IgM de cabra anti-coelho (específico da cadeia μ; Sera-Lab, Westbury, N.Y.) utilizado a uma diluição de 1/200. ELISA competitivo. A especificidade do soro de coelho produzido contra a vacina II-TT foi determinada por ELISA competitivo, com polissacáridos homólogos (tipo II) e heterólogos (tipos Ia e III) como inibidores. A especificidade de epitopo do soro de coelho reunido, induzido pela vacina (obtido ao dia 70) foi analisada com polissacárido do tipo II, nativo e dessializado e β-Ο-metilgalactopiranose, como inibidores da ligação de anticorpo. O polissacárido tipo II nativo foi des-sializado por tratamento com ácido acético a 6% a 80°C, durante 2 h. Os inibidores de polissacáridos foram diluídos em série 4-vezes e misturados com um volume igual (75 μΐ) de soro de coelho reunido (diluído 10.000-vezes), obtido ao dia 70 após vacinação com a vacina II-TT. Esta mistura (100 μΐ) foi então adicionada a poços ELISA revestidos com polissacárido tipo II. Utilizou-se IgG anti-coelho conjugado com fosfatase alcalina, como anticorpo secundário, a uma diluição de 1/3.000. 15 Γ L-Ci t

Os resultados são expressos como se segue: % inibição = [A405 sem inibidor - A4os com inibidor)/A405 sem inibidor] x 100. A especificidade para o serotipo do antisoro de coelho GBS V-TT foi avaliada utilizando polissacáridos de GBS específicos do tipo, Ia, Ib, II, III, V e VI. Os poços de ELISA foram revestidos a 100 ng/poço com polissacárido GBS tipo V, ligado a poli-L-lisina. O antisoro de coelho contra a vacina V-TT, diluído 1/6000 foi incubado com cada um dos inibidores de polissacárido. O antisoro incubado foi adicionado a poços ELISA e a placa foi processada com IgG de cabra anti-coelho, conjugado com fosfatase alcalina (diluído 1/3000) e substrato, como descrito em pormenor anteriormente (28).

Morte de GBS in vitro mediada por anticorpos. A capacidade dos anticorpos de coelho induzidos pela vacina opsonizarem as células GBS, para a morte subsequente por leucócitos de sangue periférico humano foi determinada por um teste de opsonofagocitose in vitro (7,8). O teste reaccional para a determinação da actividade opsonofagocitica de anticorpos GBS tipo V reactivos foi realizado incubando 1,5 x 107 glóbulos brancos (WBC) em 300 μΐ de tampão; 3 x 106 CFU de GBS tipo V estirpe CJB 111 em 50 μΐ; complemento humano (absorvido com células GBS tipo V) (50 μΐ) ; anticorpo anti-V-TT inactivado pelo calor (50 μΐ) ; meio de Eagle modificado (50 μΐ) . A mistura foi incubada com mistura durante 60 min a 37°C. A diferença nas unidades formadoras de colónias (CFU) de GBS foi determinada após a incubação a 37°C durante 1 hora, pelo método convencional de contagem de placas. 16

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Protecção passiva de ratinhos por anticorpos de coelho induzidos pela vacina. Injectaram-se grupos de 10 ratinhos fêmea cruzados, Swiss-Webster (Taconic Farms, Germantown, N.Y.), tendo cada rato um peso de 18 a 20 g, intraperitonealmente com 0,2 ml de soro reunido (dia 70) de coelhos vacinados ou com polissacárido tipo II, ou com vacina II-TT. O titulo, tal como medido por ELISA, do soro reunido obtido no dia 70, a partir de coelhos imunizados com polissacárido tipo II era de 100 e o da vacina II-TT era de 12.800. Grupos controlo de cinco ratinhos receberam soro de coelho pré-imunizado reunido, ou antisoro reunido produzido contra TT não acoplado (27). Vinte e quatro horas mais tarde, os ratinhos foram desafiados com tipo II estirpe 18RS21 (1,5 x 105 CFU por ratinho) num volume total de 1,0 ml de caldo Todd-Hewitt. A dose de desafio para cada estirpe foi previamente determinada como letal para >90% de ratinhos de pesos e idades semelhantes. Os ratinhos sobreviventes foram contados diariamente, durante três dias consecutivos.

Análise estatística. Utilizou-se o teste exacto de Fisher para comparar as capacidades de diferentes soros de ratinho protegerem, de forma passiva, os ratinhos, contra a infecção por GBS, fatal.

RESULTADOS

Preparação e composição da vacina II-TT e V-TT. As vacinas GBS II-TT e GBS V-TT foram preparadas por métodos anteriormente descritos em pormenor, para a construção da vacina conjugada de GBS tipo III (33) . A oxidação com periodato, controlada, do polissacárido GBS tipo II resultou na modificação de 7% dos 17

resíduos de ácido siálico do polissacárido, tal como determinado por análise de cromatografia gasosa-espectrometria de massa. 0 TT monomérico foi ligado covalentemente para modificar os locais de resíduos de ácido siálico no polissacárido tipo II, por aminação redutora. A vacina II-TT purificada continha 32% (p/p) de proteína e 68% (p/p) de carbohidratos). 0 rendimento final de vacina II-TT era de 7,8 mg, ou 39%.

As oxidações por periodato, controladas, do polissacárido GBS tipo V resultaram numa modificação de cerca de 8%, 25% e 50% dos resíduos de ácido siálico no polissacárido. O TT monomérico foi ligado covalentemente aos resíduos de ácido siálico modificados no polissacárido tipo V, por aminação redutora. Os polissacáridos oxidados de forma que cerca de 8% dos seus resíduos de ácido siálico foram modificados, resultaram em conjugados com uma razão molar entre polissacárido e proteína baixa. Os polissacáridos em que 25 ou 50% dos resíduos de ácido siálico terminais foram modificados, resultaram em moléculas conjugadas com uma razão molar entre polissacárido e proteína mais preferida. Um polissacárido GBS tipo V, em que 25% dos resíduos de ácido siálico foram modificados, foi utilizado para produzir vacinas conjugadas com a caracterização bioquímica apresentada na tabela I. 18

TABELA 1. Composição da vacina GBS tipo V-TT

Tamanho do polissacárido (M1) Resíduos de ácido siálico oxidados (%) 200.000 25

Quantidade de vacina como toxóide de tétano {% peso seco) 38

Quantidade de vacina como carbohidrato (% peso seco) Mol carbohidrato/mol proteína3 62 0, 56 aO M’ do monómero do toxóide de tétano era de 150.000.

Imunogeni cidade da vacina II-TT e da vacina V-TT em coelhos. As imunogenicidades da vacina II-TT e do polissacárido tipo II, nativo foram comparadas em coelhos. Observou-se um aumento no anticorpo específico de tipo II após a primeira dose de vacina II-TT (tabela 2) . Uma dose de reforço da vacina aumenta ainda mais a resposta de anticorpos. Os níveis de anticorpo permaneceram inalterados, ou aumentaram ligeiramente após uma segunda dose reforço, ao dia 41, e foram mantidos ao longo do resto do estudo (tabela 2) . Em contraste com a vacina II-TT, o polissacárido GBS tipo II nativo, não acoplado, não conseguiu desencadear uma resposta de anticorpos específica (tabela 2) . Os animais vacinados com a vacina II-TT também desenvolveram anticorpos contra TT, alcançando aproximadamente uma aumento de 3-logio além dos níveis de pré-imunização. 19 f u

TABELA 2. Titulos de anticorpo específico para polissacárido GBS tipo II de coelhos vacinados com polissacárido tipo II

nativo ou com vacina II-TT Título de anticorpo em ELISA como dia:a

Vacina e coelho 0 20b 34 41b 55 70 100 100 200 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 400 3, 200 3,200 6, 400 12,800 1, 600 3,200 6,400 6,400 25,600 6, 400 12,800 25,600 12,800 12,800

Polissacárido tipo II nativo 1 100 2 100 3 200 II-TT 1 100 2 100 3 100 a um valor de 100 indica um título de anticorpo < 100. Os valores são as médias de determinações em duplicado. Os coelhos foram vacinados subcutaneamente com 50 μg de vacina emulsionada com adjuvante de Freund completo, no dia 0. b Administraram-se doses de reforço com adjuvante de Freund incompleto. A imunogenicidade da vacina V-TT (polissacárido oxidado a 25%) foi também determinada em coelhos. Os níveis de anticorpo (IgG) aumentaram após a primeira e segunda doses de vacina tipo V-TT e mantiveram-se no decorrer do estudo (Tabela 3). 20

TABELA. 3. Titulo de IgG especifico do polissacárido GBS tipo V

Titulo de IgG determinado por um ELISA no diaa:

Vacina 0 35 56 91

V25%ox-TT

Coelho Ia 100 800 1.600 1.600 a Este animal recebeu três doses de 50 de vacina misturados com alum a intervalos de 3 semanas, começando no dia 0.

Propriedades antigénicas de soro de coelho induzido com vacina. A conjugação de polissacárido a um transportador proteico não deverá alterar epítopos antigénicos importantes, encontrados no polissacárido na sua forma nativa. Os requerentes testaram a especificidade dos anticorpos induzidos pela vacina II-TT por ELISA competitivo, utilizando polissacáridos GBS homólogos e heterólogos, como inibidores. O polissacárido tipo II nativo a uma concentração de 450 ng/ml inibiu 50% da ligação de anticorpos de coelho produzidos contra a vacina II-TT (fig. 2) . Os polissacáridos GBS tipo Ia e tipo III não inibiram a ligação do soro produzido contra a vacina II-TT, mesmo a concentrações tão elevadas quanto 500 μg/ml (Fig. 2) . Este resultado confirma a especificidade do serotipo de anticorpos induzidos pela vacina II-TT para o antigénio alvo e indicam a preservação de epitopos antigénicos da porção polissacárido da vacina conjugada.

Para determinar se o epítopo influenciado pelo ácido siálico se mantinha durante a preparação da vacina II-TT, utilizaram-se polissacáridos tipo II, nativos e dessializados num ELISA competitivo, como inibidores de ligação de anticorpos Γ de coelho produzidos contra a vacina II-TT. A dessialização do polissacárido foi realizada por tratamento com ácido acético a 6% a 80°C, durante 2 horas. A remoção quantitativa de resíduos de ácido siálico foi con firmada pelo teste do ácido tiobarbitúrico (32), utilizando ácido N-acetilneuramínico (Sigma) como padrão. 0 Kav do polissacárido tipo II nativo, antes do tratamento ácido era de 0,49, enquanto que o Kav do polissacárido tratado com ácido era de 0,52, numa coluna de FPLC Superose 6 ® (LKB-Pharmacia, Suécia), indicando uma ligeira redução no tamanho molecular do polissacárido, devido à perda dos resíduos de ácido siálico da cadeia lateral, que perfazem 20% dos polissacárido nativo, em peso. Mesmo 200 μg de polissacárido GBS tipo II dessializado por ml inibiram em 33% a ligação de anticorpos de vacina II-TT contra o polissacárido tipo II nativo (Fig. 3) . O reconhecimento relativamente fraco dos polissacáridos tipo II dessializados ou nucleares pelo antisoro de vacina II-TT foi confirmado por geles de imunoelectroforese, que mostraram uma banda de precipitina formada com o polissacárido nativo, mas não com ao polissacárido tipo II nuclear (não apresentado). A ligação do antisoro de vacina II-TT a polissacárido tipo II nativo não pode ser inactivada com β-Ο-metilgalactopiranose, utilizada numa gama de concentrações de 0,01 a 10 mg/ml (não apresentado). A especificidade dos anticorpos induzidos por vacina GBS tipo V-TT foi testada por ELISA competitivo, utilizando polissacáridos GBS homólogos e heterólogos como inibidores. Os polissacáridos tipo V nativos inibiram eficazmente a ligação de anticorpos de coelho produzidos contra a vacina tipo V-TT (Figura 5). Os GBS tipo Ia, tipo Ib, tipo II, tipo III e tipo VI não inibiram a ligação do soro produzido contra a vacina 22 tipo V-TT (Figura 5) . Estes resultados demonstram a especificidade dos anticorpos induzidos pela vacina tipo V-TT, para o antigénio alvo.

Actividade in vitro de anticorpos induzidos pela vacina GBS. A capacidade do soro imune opsonizar o GBS para morte por leucócitos de sangue periférico humano in vitro, correlacionou-se com a eficácia protectora contra GBS, em experiências de protecção animal (27, 33) . Os anticorpos produzidos nos três coelhos vacinados com a vacina II-TT aumentaram a morte de GBS tipo II estirpe 18RS21 em > l,81ogio (tabela 4). 0 soro de coelho pré-imunizado ou soro de ratos vacinados com polissacárido GBS tipo II, nativo, ou TT não acoplado, não conseguiram aumentar a morte de GBS in vitro (Tabela 4) . Os anticorpos de coelho induzidos pela vacina promoveram a morte por leucócitos de sangue humano de dois isolados clínicos de GBS tipo II (estirpes S16 e S20) em > 1,8 logio, em comparação com o soro de coelho pré-imunizado (tabela 5). 0 soro de coelho contra a vacina tipo II-TT foi determinado como sendo específico do serotipo, uma vez que não promoveu a morte in vitro de estirpes de GBS heterólogas (tipos Ia e III) (tabela Γ

TABELA. 4. Morte opsonofagocitica in vitro de GBS tipo II estirpe 18RS21 por antisoro de coelho produzido contra polissacárido tipo II nativo, vacina II-Tt ou TT

Fonte de soro (dia da recolha) 0 CFU min aa 60 min GBS mortos (logio) polissacárido tipo II (70)b 4.3 X 106 6.6 X 106 -0.19 vacina II-TT (0) 6.0 X 106 6.4 X 106 -0.03 vacina II-TT (70) coelho 1 4.0 X 106 5.7 X 10a 1.85 coelho 2 4.3 X 106 2.7 X 10a 2.20 coelho 3 3.9 X 106 4.3 X 10a 1.96 TT (70) 4.2 X 106 6.9 X 106 -0.21 Nenhum 3.9 X 106 7.1 X 106 -0.26 A mistura reaccional continha o soro (numa concentração teste final de 1%) a ser testado, soro de humano absorvido-GBS tipo II como fonte de complemento, leucócitos de sangue periférico humano e GBS tipo II 18RS21. Os valores são médias de determinações em duplicado.

Soro de coelho recolhido após a primeira dose de polissacárido tipo II nativo, em adjuvante de Freund completo. 24 I 1 (Η Li ^ TABELA 5. Morte opsonofagocítica in vitro de estirpes de GBS por pré-imunização e soro de coelho imune, produzido contra a

vacina II-TT GBS mortos (logio)a tipo e estirpe de GBS Pré-imunização vacina II-TT imune (dia 0) (dia 70) II 18RS21 -0.36 1.98 S16 0.96 2.78 S20 -0.01 1.84 Ia 090 ND -0.51 III M781 ND -0.54 a CFU (logio) a 60 min - CFU (logio ) a 0 min. A mistura reaccional continha 0 soro a ser testado, soro humano absorvido-GBS tipo II como fonte de complemento, leucócitos de sangue periférico humano e GBS tipo II 18RS21. Os valores são médias de determinações em duplicado. Nd, não realizado.

Os IgG e IgM purificados por afinidade de proteína A foram obtidos de um conjunto de soro produzido contra a vacina tipo II-TT (28). A especificidade de cada fracção de IgG foi confirmada por ELISA com anticorpo secundário específico da classe. A A405S das fracções IgM e IgG (diluída 1/100) era de 0,384 e 0,009, respectivamente, com conjugado específico de cadeia-μ e 0,086 e 2,367, respectivamente, com IgG de cabra anti-coelho (específico de cadeia γ e leve) . 0 IgM e IgG isolados foram testados quanto à sua capacidade de aumentar a 25

morte opsónica de GBS tipo II por leucócitos de sangue humano. Os soros não fraccionados produzidos contra a vacina tipo II-TT diluídos 1:100 e uma diluição 1:100 equivalente da fracção IgG do mesmo soro promoveram a morte de GBS tipo II em 1,65 + 0,22 e 0, 95 + 0, 09 logio, respectivamente. Pelo contrário, os GBS tipo II não foram mortos, mas cresceram na presença de soro pré-imunização (-0,39 + 0,13 logio) e fracção enriquecida em IgM, de soro produzido contra a vacina tipo II-TT (-0,28 + 0,09 logio), no teste opsonofagocítico. A capacidade do antisoro de coelho induzido pela vacina GBS tipo V-TT promover a morte de uma estirpe de GBS tipo V (CJB 111) por leucócitos de sangue humano foi também determinada pelo teste osponofagocitico in vitro (8) . Como se pode ver na Figura 6, o antisoro GBS tipo V-TT a uma concentração de 10%, optimizou eficazmente o GBS tipo V estirpe CJB 111, em relação aos controlos. As condições de reacção controlo eram: complemento (10%) sem antisoro; antisoro (10%) sem complemento; antisoro (1%) e complemento.

Teste de protecção de ratinho. Para testar as capacidades protectoras in vivo de anticorpos induzidos pela vacina, os ratinhos foram imunizados passivamente com um conjunto de soro de vacina II-TT (dia 70), 24 h antes do desafio com GBS tipo II 18RS21. Anteriormente, a dose de desafio tinha sido determinada como letal para 90 a 100% dos ratinhos testados. Obteve-se uma protecção completa (100%) em grupos de ratinhos que receberam soro produzido contra a vacina GBS II-TT, enquanto que apenas um de cinco ratinhos que receberam soro pré-vacinação sobreviveram (tabela 6) . Não houve sobreviventes entre os ratinhos que receberam soro de coelhos vacinados ou 26 Γ

com polissacárido tipo II não acoplado ou com TT não acoplado (tabela 6) . TABELA 6. Protecção passiva de ratinhos cruzados Swiss-Webster contra GBS tipo II estirpe 18RS21, com soro de coelhos vacinados com polissacárido tipo II nativo, vacina II-TT ou TTa

Soro de coelhob (dia de recolha) No no de sobreviventes/ . total de ratinhosc % Sobrevivência vacina II-TT (70) 10/10 100a vacina II-TT (0) 1/5 20 polissacárido tipo II 0/10 0 TT (70) 0/5 0

os ratinhos receberam uma dose 90% letal (1,5 x 105 CFU por ratinho) de GBS reuniram-se amostras de soro de três coelhos c a sobrevivência foi determinada 72 h após o desafio d P = 0, 0037 comparado com os valores de pré-imunização (dia 0) A estratégia de acoplamento utilizada com o polissacárido GBS tipo III, primeiro desenvolvida para polissacárido de meningococos (18), pode ser aplicável a todos os antigénios de polissacáridos capsulares GBS, uma vez que todos contêm ácido siálico. No entanto, ao contrário de outros polissacáridos GBS que têm ácido siálico como sacarideo terminal de cadeias laterais di- ou trissacarideas, o polissacárido GBS tipo II tem uma unidade de repetição, que comporta ácido siálico como o único açúcar numa das duas cadeias laterais de monossacárido (9, 20) . Ao construir a vacina conjugada de GBS tipo II, os 27 Γ

t requerentes oxidaram 7% dos resíduos de ácido siálico no polissacárido tipo II e utilizaram estes como locais para o acoplamento do polissacárido a TT. A vacina II-TT purificada eluiu no volume vazio de uma coluna de Superose 6 ® (compatível com um peso molecular > 106) e era composta por 68% (p/p) de carbohidrato e 32% (p/p) de proteína. A vacina tipo II-TT emulsionada com adjuvante era imunogénica em coelhos, em contraste com o polissacárido tipo II, nativo, não acoplado, que não desencadeou anticorpos específicos de polissacárido tipo II. Dois de três coelhos imunizados responderam fortemente 3 semanas após uma única dose de vacina II-TT. Obteve-se anticorpo específico do tipo óptimo, em todos os três coelhos, 3 semanas após uma dose reforço de vacina II-TT. Não se observaram mais aumentos no título de anticorpo especifico de tipo II após a terceira dose de vacina II-TT. Os resultados de experiências in vitro e in vivo indicaram que os anticorpos produzidos contra a vacina II-TT eram funcionalmente activos contra GBS tipo II. 0 soro de cada um dos três coelhos vacinados com vacina II-TT promoveu a morte in vitro de GBS tipo II por leucócitos periféricos humanos e proporcionou ratinhos cruzados com uma protecção completa (100%), contra uma dose letal de GBS tipo II. O antisoro de vacina II-TT era opsonicamente activo contra estirpes homólogas de GBS (18RS21, S16 e S20) , mas não serotipos de GBS heterólogos (tipos la e III), testados.

Enquanto que o polissacárido tipo II nativo inibiu a ligação de antisoro de vacina II-TT a poços ELISA revestidos com polissacárido tipo II , obteve-se < 40% de inibição com o polissacárido tipo II dessializado, mesmo quando este foi utilizado a uma concentração de 200 μg/ml. Este resultado 28 Γ L-Cj sugere que um determinante antigénico importante do polissacárido tipo II é dependente da presença de resíduos de ácido siálico. Este resultado corrobora os obtidos com antisoro de coelho produzido contra organismos do tipo II, totais (21). No entanto, as experiências de inibição de ELISA utilizando β-O-metilgalactopiranose como inibidor indicaram que o antisoro de coelho produzido contra a vacina II-TT não continha anticorpos específicos de galactose. Não se obteve nenhuma inibição da ligação de antisoro de vacina II-TT ao polissacárido tipo II nativo, mesmo com β-0-metilgalactopiranose a uma concentração de 10 mg/ml. Assim, a galactose da cadeia lateral não parece ser um epítopo imunodominante do polissacárido tipo II, quando o polissacárido é acoplado a TT. Estes resultados são contrários a estudos imunoquímicos realizados com soro de coelho produzido contra organismo totais de GBS tipo II (12, 21), em que a cadeia lateral de galactose parece ser um de dois locais imunodominantes, juntamente com um epítopo dependente de ácido siálico, do polissacárido tipo II. As células totais de GBS tipo II utilizadas em estudos anteriores (12, 21) e não cultivadas em condições de pH controlado, podem possuir polissacáridos que, nalguma extensão, não possuem ácido siálico. Nestas circunstâncias, a galactose de cadeia lateral pode ser um epítopo antigénico principal. A fonte de polissacárido tipo II utilizada para sintetizar a vacina II-TT foi uma cultura de GBS do tipo II, mantida a um pH de 7,0; uma análise final confirmou que o ácido siálico constituía ~20% (p/p) do polissacárido. Não se pode excluir a possibilidade de que o acoplamento do polissacárido tipo II a TT alterou a conformação do polissacárido, tornando assim o epítopo de galactose indisponível para o reconhecimento pelo sistema imunitário do hospedeiro. Embora o antisoro de coelho induzido 29 '1 p L·, ^^ pela vacina ΙΙ-ΤΤ não possuísse anticorpos específicos para a galactose, este era totalmente funcional in vitro e in vivo, contra organismos GBS tipo II. Nem a modificação química de alguns dos resíduos de ácido siálico, nem a subsequente ligação de TT a estes locais alterou epítopos antigénicos críticos, necessários para desencadear anticorpos específicos de tipo II, funcionais. 0 facto de o IgG purificado de coelho produzido contra a vacina II-TT, promover a morte in vitro de GBS tipo II por leucócitos humanos, sugere que não só a imunogenicidade do polissacárido tipo II aumentou pela sua conjugação a TT, mas também que foram produzidos anticorpos IgG funcionais. 0 polissacárido capsular tipo V tem uma estrutura de unidade de repetição que consiste de um esqueleto trissacarídeo contendo duas cadeias laterais distintas, em resíduos de açúcar adjacentes (referência 35, Figura 4) . Numa das preparações de vacina conjugada de GBS tipo V-TT, 25% dos resíduos de ácido siálico na cadeia lateral mais longa (i.e. 3 resíduos de açúcar) no polissacárido tipo V estavam oxidados. Os resíduos de ácido siálico oxidados foram utilizados como locais para acoplar o polissacárido tipo V ao TT. A vacina tipo V-TT purificada era composta por 38% (p/p) de TT e 62% (p/p) de carbohidrato. Verificou-se que a vacina V-TT misturada com alúmen era imunogénica em coelhos. Observou-se uma resposta forte após a primeira dose e doses de reforço da vacina tipo v-TT. A segunda dose de reforço também resultou num novo aumento do título de IgG de polissacárido tipo V. A seroespecificidade dos testes induzidos por tipo V-TT foi demonstrada por ELISAs competitivos. 0 antisoro de coelho produzido contra a vacina V-TT é funcionalmente activo, tal como evidenciado pela capacidade de matar GBS tipo V in vitro, na presença de glóbulos brancos e complemento humanos. 30 Γ

Tal como a vacina III-TT, a vacina II-TT demonstrou uma imunogenicidade melhorada em coelhos, em comparação com o polissacárido activo e desencadeou IgG opsonicamente activo em coelhos, apesar da diferença na estrutura de polissacáridos, posição do ácido siálico no polissacárido ao qual o TT estava ligado e composição da vacina. Também se verificou que a vacina tipo V-TT era imunogénica em coelhos e era capaz de induzir anticorpos funcionais in vivo. Os requerentes antevêem que os conjugados de polissacárido GBS-proteina deste tipo irão ser componentes de uma vacina de GBS multivalente, capaz de proporcionar protecção contra os serotipos de GBS mais comummente associados com a doença, em humanos.

Além disso, prevê-se que as vacinas possam ser produzidas a partir de moléculas conjugadas de acordo com a invenção, adicionando moléculas conjugadas a um transportador farmaceuticamente aceitável. De preferência, o nível de entrecruzamento nas moléculas antigénicas da invenção é controlado a uma extensão suficiente para proporcionar vacinas que possam ser esterilizadas por filtragem, através de um filtro de 0,2 micron. Estas vacinas são de preferência solúveis. A imunização pode ser realizada injectando o mamífero receptor com a vacina uma vez, seguido de injecções de reforço subsequentes, como necessário. Uma dose suficiente de vacina a ser administrada pode basear-se na quantidade de polissacárido presente: pode-se administrar uma gama de 3-80 μg de componente polissacarídeo da vacina conjugada. 31

V

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Schneerson, R. 0. Barrera, A. Sutton, e J.B. Robbins. 1980. Preparation, characterization e immunogenicity of Haemophilus ínfluenzae type b polysaccharide-protein conjugates. J. Exp. Med. 152:361-376.

Svenson, S.B. e A.A. Lindberg. 1979. Coupling of acid-labile Salmonella specific oligosaccharides to macromolecular carriers. J. Immunol. Methods 25:323-335.

Walsh, J.A., e S. Hutchins. 1989. Group B streptococcal disease: its importance in the developing world e prospect for prevention with vaccines. Pediatr. Infect. Dis. J, 8:271-276.

Warren, L. 1959. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. J. Biol. Chem. 234:1971-1975.

Wessels, M.R., L.C. Paoletti, D.L. Kasper, J.L. DiFabio, F. Michon, K. Holme, e H.J. Jennings. 1990. Immunogenicity in animais of a polysaccharide-protein conjugate vaccine 36 against type III group B Streptococcus, J. Clin. Invest. 86:1428-1433.

Zigterman, J.W.J., J.E.G. van Dam, H. Snippe, F.T.M. Rottsveel, M. Jansze, J.M.N. Willers, J.P. Kamerling, e J.F.G. Vliegenthart. 1985. Immunogenic properties of octasaccharide-protein conjugates derived from Klebsiella serotype II capsular polysaccharide. Infect. Immun. 47:421-428.

Wessels, M.R., J.L.D;Fabio, V.J. Benedi, D.L. Kasper, F. Michon, J-R. Brisson, J.Jelinkova e H.J. Jennings 1991. Structural Determination e Immunochemical Characterization of the Type V Group B Streptococcus Capsular Polysaccharide. Journal of Biological Chemistry 266:6714-6719.

Apesar de se terem descrito várias formas de concretização da presente invenção, deve entender-se que as construções básicas podem ser alteradas, para proporcionar outras formas de concretização que utilizem os métodos da invenção. Assim, deve considerar-se que o âmbito da invenção é definido pelas reivindicações, e não pelas formas de concretização específicas que foram apresentadas anteriormente, a titulo de exemplo.

Lisboa, 31 de Julho de 2001.

O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de conjugado antigénica compreendendo o polissacárido capsular seleccionado do grupo derivado a partir de um estreptococos do grupo B de bactérias do tipo II ou tipo V, e um componente proteico, em que duas ou mais cadeias laterais que terminam em resíduos de ácido siálico do componente polissacarídeo estão cada uma ligadas através de uma ligação amina secundária a proteína e em que o peso molecular do polissacárido é de pelo menos 5000 daltons.
2. Molécula de conjugado de acordo com a reivindicação 1 em que entre 5 e 50% dos resíduos de ácido siálico terminais de cada polissacárido, estão disponíveis para ser ligados à proteína.
3. Molécula de conjugado de acordo com a reivindicação 2 em que entre 5 e 25% dos resíduos de ácido siálico terminais de cada polissacárido, estão disponíveis para ser ligados à proteína.
4. Molécula de conjugado de acordo com a reivindicação 3 em que entre 5 e 10% dos resíduos de ácido siálico terminais de cada polissacárido, estão disponíveis para ser ligados à proteína.
5. Molécula de conjugado de acordo com a reivindicação 4, em que o polissacárido é GBS tipo II e em que 7% dos resíduos de ácido siálico terminais de cada polissacárido estão disponíveis para ser ligados à proteína. 1 ^ U, ^^
6. Molécula de conjugado de acordo com a reivindicação 1, em que a molécula de conjugado antigénica é capaz de ser filtrada por um filtro de 0,2 micron.
7. Molécula de conjugado de acordo com a reivindicação 1, em que o componente polissacarideo tem um peso molecular entre 5.000 e 1.000.000 daltons.
8. Molécula de conjugado de acordo com a reivindicação 1, em que o componente polissacarideo tem um peso molecular entre 50.000 e 500.000 daltons.
9. Molécula de conjugado de acordo com a reivindicação 1, em que o polissacárido é GBS tipo V e em que 25% dos resíduos de ácido siálico terminais de cada polissacárido estão ligados à proteína.
10. Molécula de conjugado de acordo com a reivindicação 8, em que o componente polissacarideo tem um peso molecular entre 100.000 e 300.000 daltons.
11. Molécula de conjugado de acordo com a reivindicação 10, em que o componente polissacarideo tem um peso molecular de 200.000 daltons.
12. Molécula de conjugado de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína é seleccionada do grupo constituído por toxóide do tétano, toxóide de difteria e CKM ("Cross Reactive Material") 197.
13. Método para preparar uma molécula de conjugado de um polissacárido capsular de estreptococos do grupo B de 2 r u bactérias do tipo II ou tipo V e uma proteína, compreendendo (a) submeter o polissacárido capsular de estreptotococos de grupo B, tipo II ou tipo V a oxidação com periodato, suficiente para introduzir um grupo aldeído em dois ou mais resíduos de ácido siálico terminais ligados ao esqueleto de polissacárido; (b) acoplar o polissacárido capsular de estreptococos do grupo B, tipo II ou tipo V oxidado, a uma proteína, através de aminação redutora para produzir uma ligação amina secundária entre o polissacárido capsular e a proteína.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que entre 5 e 50% dos resíduos de ácido siálico de cada polissacárido são oxidados, para formar grupos aldeído capazes de se acoplar a proteína.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que entre 5 e 25% dos resíduos de ácido siálico de cada polissacárido, são oxidados para formar grupos aldeído capazes de se acoplar a proteína.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que entre 5 e 10% dos resíduos de ácido siálico de cada polissacárido são oxidados para formar grupos aldeído capazes de se acoplar a proteína. 3 V

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17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o polissacárido é GBS tipo II e em que 7% dos resíduos de ácido siálico de cada polissacárido são oxidados para formar grupos aldeído capazes de se acoplar a proteína.
18. Método de acordo com a reivindicação 13, em que entre 5 e 50% dos resíduos de ácido siálico de cada polissacárido estão ligados covalentemente a proteína.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que entre 5 e 25% dos resíduos de ácido siálico de cada polissacárido estão ligados covalentemente a proteína.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que entre 5 e 10% dos resíduos de ácido siálico de cada polissacárido estão covalentemente ligados à proteína.
21. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o polissacárido é GBS tipo II e em que 5% dos resíduos de ácidos siálico de cada polissacárido estão ligados covalentemente a proteína.
22. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o polissacárido é GBS tipo V e em que cerca de 25% dos resíduos de ácido siálico terminais de cada polissacárido estão ligados a proteína.
23. Molécula de conjugado preparada de acordo com o método da reivindicação 13.
24. Vacina que compreende a molécula de conjugado de acordo com a reivindicação 1. 4 Γ

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25. Vacina multivalente que compreende a molécula de conjugado de acordo com a reivindicação 1 e pelo menos uma outra molécula imunogénica, capaz de desencadear a produção de anticorpos contra uma substância patogénica diferente do estreptococos do Grupo B, tipo II.
26. Vacina multivalente de acordo com a reivindicação 25, em que as outras moléculas imunogénicas são capazes de desencadear a produção de anticorpos contra patogéneos seleccionados do Grupo constituído por estreptococos do grupo B, tipos Ia, Ib, III, IV e V, Haemophilus influenzae tipo b e E. coli tipo Kl.
27. Vacina multivalente de acordo com a reivindicação 26, em que as outras moléculas imunogénicas são capazes de desencadear a produção de anticorpos contra patogéneos seleccionados do grupo constituído por estreptococos do Grupo B, tipos Ia, Ib, III, Haemophilus influenzae tipo b e E. coli tipo Kl.
28. Vacina multivalente de acordo com a reivindicação 27, em que as outras moléculas imunogénicas são capazes de desencadear a produção de anticorpos contra patogéneos seleccionados do grupo constituído por estreptococos do Grupo B, tipos Ia, Ib, III e E. coli tipo Kl.
29. Vacina multivalente de acordo com a reivindicação 28, em que as outras moléculas imunogénicas são capazes de desencadear a produção de anticorpos contra patogéneos seleccionados do grupo constituído por estreptococos do grupo B, tipos Ia, Ib, III. 5 Γ U
30. Utilização de uma molécula de conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, para a produção de uma vacina para a imunização de recém-nascidos, por administração da vacina numa quantidade imunogénica a um humano fêmea, de modo a produzir anticorpos capazes de passar para um feto humano, concebido antes ou depois da administração da vacina, numa quantidade suficiente para produzir protecção contra infecção num recém-nascido, no nascimento.
31. Utilização de uma molécula de conjugado de acordo com a reivindicação 30, em que a vacina é administrada antes da gravidez.
32. Utilização da molécula de conjugado de acordo com a reivindicação 30, em que a vacina é administrada a uma fêmea entre as idades de 10 e 50 anos.
33. Utilização da molécula de conjugado de acordo com a reivindicação 30, em que a vacina é administrada durante a gravidez.
34. Utilização da molécula de conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, para a produção de uma vacina para imunização de adultos, por administração da vacina numa quantidade imunogénica a humanos.
35. Utilização da molécula de conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, para a produção de uma vacina para imunização de humanos por administração da vacina numa quantidade imunogénica a uma pessoa em risco de ser infectada por estreptococos tipo II ou tipo V. 6
36. Utilização da molécula de conjugado de acordo com a reivindicação 35 em que a vacina é administrada a uma pessoa cujo sistema imune está suprimido.
37. Utilização da molécula de conjugado de acordo com a reivindicação 36, em que a imunossupressão é devida a doenças seleccionadas do grupo constituído por cancro ou diabetes.
38. Utilização da molécula de conjugado de acordo com a reivindicação 37, em que a vacina é administrada num transportador farmaceuticamente aceitável.
39. Utilização da molécula de conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, para a produção de uma vacina para a imunização de manadas de gado produtor de leite contra a mastite bovina, por administração da vacina numa quantidade imunogénica a vacas produtoras de leite. Lisboa, 31 de Julho de 2001 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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