PT2282779E

PT2282779E - Novas abordagens terapêuticas para o tratamento da doença de alzheimer e doenças relacionadas através de uma modulação de resposta ao stresse celular

Info

Publication number: PT2282779E
Application number: PT97381867T
Authority: PT
Inventors: Ilya Chumakov; Daniel Cohen; Oxana Guerassimenko; Serguei Nabirochkin
Original assignee: Pharnext
Priority date: 2008-04-29
Filing date: 2009-04-29
Publication date: 2013-05-28
Also published as: IL208983A0; EA019571B1; DK2282779T3; AU2009242127B2; CA2722314C; KR101611824B1; CA2722314A1; CN102065897A; AU2009242127A1; MX2010011880A; ZA201008039B; WO2009133142A1; PL2282779T3; JP5615805B2; JP2014205696A; US20120071483A1; ES2410930T3; NZ589309A; KR20110011628A; US8552041B2

Description

ΡΕ2282779 1 DESCRIÇÃO "NOVAS ABORDAGENS TERAPÊUTICAS PARA O TRATAMENTO DA DOENÇA DE ALZHEIMER E DOENÇAS RELACIONADAS ATRAVÉS DE UMA MODULAÇÃO DE RESPOSTA AO STRESSE CELULAR" A presente invenção refere-se a composições para o tratamento da doença de Alzheimer (AD) e doenças relacionadas . AD é a demência cortical prototípica caracteri-zada pelo déficit de memória juntamente com a disfasia (desordem de linguagem na qual há um prejuízo de fala e de compreensão de fala); dispraxia (inaptidão para coordenar e executar certos movimentos e gestos propositados na ausência de prejuízos motores ou sensoriais) e agnosia (habilidade para reconhecer objetos, pessoas, sons, formas ou cheiros) atribuível a envolvimento das áreas de associação corticais. Sintomas especiais, tais como paraparesia espasmódica (fraqueza que afeta os extremidades inferiores) também podem ser envolvidos (1-4). A incidência da doença de Alzheimer aumenta dramaticamente com a idade. AD é, no momento, a causa mais comum de demência. Ela é caracterizada clinicamente por um declínio global da função cognitiva que progride lentamente e deixa pacientes em estágio final vinculados à cama, 2 ΡΕ2282779 incontinentes e dependentes de cuidados assistenciais. A morte ocorre, em média, 9 anos depois do diagnóstico (5). A taxa de incidência de AD aumenta dramaticamente com a idade. Projeções acerca da população das Nações Unidas estimam que o número de pessoas mais velhas que 80 anos irão chegar a 370 milhões até o ano 2050. Atualmente, é estimado que 50% das pessoas mais velhas que 85 anos de idade são afligidas com AD. Portanto, mais de 100 milhões de pessoas no mundo inteiro sofrerão de demência em 50 anos. O vasto número de pessoas que necessita cuidado constante e outros serviços afetará severamente recursos médicos, monetários e humanos (6). O prejuizo de memória é a caracteristica precoce da doença e envolve memória episódica (memória para eventos do dia-a-dia). Memória semântica (memória para significado verbal e visual) é envolvida depois na doença. Em contraste, a memória de trabalho (memória de curto prazo que envolve estruturas e processos utilizados para armazenar temporariamente e manipular informação) e memória processual (memória inconsciente que é memória de longo prazo de habilidades e procedimento) , são preservadas até mais tarde. Conforme progride a doença, emergem as caracterís-ticas adicionais de prejuizo de linguagem, déficits de percepção visual e espacial, agnosias e apraxias. O quadro clássico da doença de Alzheimer é suficientemente característico para permitir identificação 3 ΡΕ2282779 em aproximadamente 80% dos casos (7). Não obstante, heterogeneidade clínica ocorre e não apenas esta é importante para administração clínica, mas proporciona implicação adicional de tratamentos de medicamento específicos para formas de funcionalidades diferentes. (8). A característica patológica de AD inclui placas amilóides que contém beta-amilóide (Abeta) , emaranhados neurofibrilares (NFT) que contém disfunções e perdas de Tau e neuronais e sinápticas (9-11). Durante a última década, duas hipóteses principais sobre a causa de AD foram propostas: a "hipótese da cascata amilóide" que afirma que o processo neurodegenerativo é uma série de eventos ativados pelo processamento anormal da Proteína Precursora do Amilóide (APP) (12), e a "hipótese de degeneração do citoesqueleto neuronal" (13), que propõe que mudanças do citoesqueleto são os eventos de ativação. A teoria mais amplamente aceita que explica a progressão de AD permanece a hipótese da cascata amilóide (14-16) e pesquisadores de AD focaram principalmente na determinação dos mecanismos subjacentes à toxicidade associada com proteínas Abeta. Por outro lado, a proteína de Tau tem recebido muito menos atenção da indústria farmacêutica que o amilóide, por causa tanto de preocupações fundamentais quanto práticas. Além disso, mudança de densidade de sinapse é a lesão patológica que se relaciona melhor com o prejuízo cognitivo do que os outros dois. Estudos revelaram que a patologia amilóide parece progredir de uma maneira específica neurotrans-missora em que os terminais colinérgicos aparecem mais 4 ΡΕ2282779 vulneráveis, seguidos pelos terminais glutamatérgicos e, finalmente, pelos terminais GABAérgicos (11).

Sumário da invenção A finalidade da presente invenção é proporcionar novas abordagens terapêuticas para o tratamento de AD e doenças relacionadas.

Os inventores identificaram um caminho molecular que é envolvido na génese da AD e oferece objetivos novos para desenvolvimento de novos tratamentos para melhorar AD e doenças relacionadas, particularmente para o desenvolvimento de terapias de combinação que utilizam moléculas novas ou existentes previamente utilizadas em outras indicações. Mais particularmente, os inventores identificaram vários fármacos que, sozinhos ou em combinação (s) , podem afetar efetivamente tal caminho e representar uma terapia nova e efetiva para o tratamento da AD e doenças relacionadas . A invenção proporciona, portanto, composições novas e métodos para o tratamento da doença AD e doenças relacionadas. 0 objeto desta invenção diz respeito a uma composição tal como definida nas reivindicações.

Mais particularmente, a invenção refere-se às composições adequadas para o tratamento da doença de Alzheimer ou uma desordem relacionada em um indivíduo em 5 ΡΕ2282779 necessidade destas, em que ditas composições compreendem um fármaco que inibe resposta de stresse celular, sulfisoxazole.

Esta invenção revela também composições adequadas para o tratamento da doença de Alzheimer ou uma doença relacionada em um indivíduo em necessidade dessas, em que ditas composições compreendem uma combinação de pelo menos dois fármacos que inibem resposta de stresse celular para administração combinada, separada ou sequencial. A invenção revela também o fármaco ou fármacos que inibem resposta de stresse celular e que se ligam à ou modulam a atividade de uma proteina codificada por um gene selecionado de ACCN1, ADRA1A, ADRB2, AFADIN, AKT, ALDH2, AL0X12, AMPK, APBA1, APBA2BP, APG1, APG12, AP0ER2, ATG5, ATG7, ATM, ATP1A1, ATP2A3, ATP2B1, ATP6V1C1, ATR, BACE1, BAD, BAX, BCAR1, BCL2, BECLN1, BK channels (KCNMA1, KCNMB1), BRCA1, CACNA1C, CALCINEURIN, CD36, CD44, CDH1, CDH2, CDK5, CDKN1A, CHK1, CHRM1, CHRM2, CHRM3, CHRM4, CHRM5, CK1, CTNNA2, CTNNB1, CULLIN1, CYCLINE, DCC, DGKB, DGKH, DNAJB9, D0CK3, DRD2, EDNRA, ELAVL2, ERK1, ERK2, EZRN, FAS, FKBP12, FKBP12.6, F0X03A, FZ2, GADD45, GNPTAB, GPC5, GRK2, GRK5, GRP170, GRIN2B, GRIN3A, GSK3B, HAS1, HAS 2, HAS3, HIPK2, HSPAS, HSP90B1, HSPA5, HTRIA, IDE, IMPDH1, IMPDH2 , INS, INSR, IRF1, ITB1, ITGA1, ITGB1, ITPR1, JNK1, LAMA1, MAD1L1 , MAO, MCC1, MDM1, MME, MOESIN, MTOR, NADPH OXIDASE, NEDD9, NETRIN1, NFKB1, NHERF , NOS1, NOS2A, N0S3, PAELR, ΡΑΚΙ, PARK2, PCAF, PDE11A, PDE3A, PDE4D, PDE5, PDE6D, PI3K, PIK3C3, PKCA, PLCB1, PLD2, PLN , PML, P0P2, 6 ΡΕ2282779

PRDX5, PRDX6, PRKG1, PTPRG, PTPRM, PVRL1, RAC1, RACK1 RADIXIN , RHOA, R0R2, RTN1, RYR3, SAPK3, SCN1A, SCN1B SCNNID, SCNN1G, SH3BP5 , SILL, SLC8A1, SLC8A2, SLC8A3, SLN SNCA, SNCAIP, S0RBS2, S0RCS2, SRC, SYN1, THBS2, TP53, TP63 TRPC3, TRPC4, TRPC5, UNC5C, VPS15, WNT1A, WNT5A, WWOX XANTHINE OXIDASE, e YES 1. A invenção também revela exemplos de tais fármacos que incluem compostos selecionados de albuterol, alendronato, amlodipina, arabitol, cilostazol, dasatinib, fosfenitoina, leflunomida, manitol, metaraminol, metimazole, milrinona, nitroprussiato, omeprazol, fenfor-mina, fenilbutirato de sódio, prilocaina, rapamicina, ri-fabutina, sulfisoxazol, tadalafil, terbinafina, tioguanina, trealose,vidarabina e zonisamida ou uma combinação destes. A invenção também revela composições que compreendem adicionalmente pelo menos um fármaco que modula angiogénese, para utilização combinada, separada ou sequencial.

Esta invenção também revela composições que compreendem adicionalmente pelo menos um fármaco que modula função de sinapse para utilização combinada, separada ou sequencial.

As composições desta invenção compreendem normalmente adicionalmente um veiculo ou excipiente farmaceu-ticamente aceitável. 7 ΡΕ2282779

Esta invenção também revela um método de produção de um fármaco para o tratamento da doença de Alzheimer ou uma doença relacionada, o método que compreende uma etapa de teste de um fármaco candidata para atividade em resposta de stresse celular e selecionar fármacos candidatos que inibem a resposta de stresse celular. A invenção também revela um método de produção de uma composição para o tratamento da doença de Alzheimer ou uma doença relacionada, o método compreende preparar uma combinação de um fármaco que inibe a resposta de stresse celular e um fármaco que modula função de sinapse ou angiogénese e formular dita combinação de fármacos para administração simultânea, separada ou sequencial dessa a um indivíduo em necessidade desta. A invenção se refere adicionalmente a um método para tratamento da doença de Alzheimer ou uma desordem relacionada, o método que compreende administrar simultaneamente, separadamente ou sequencialmente um fármaco ou uma combinação de fármacos que inibem a resposta de stresse celular a um individuo em necessidade dessas. A invenção revela adicionalmente um método para tratamento da doença de Alzheimer ou uma doença relacionada, o método que compreende administrar simultaneamente, separadamente ou sequencialmente um fármaco que inibe a resposta de stresse celular e um fármaco que modula função de sinapse e/ou um fármaco que modula a angiogénese a um individuo em necessidade dessas. ΡΕ2282779 A invenção revela adicionalmente o uso de um fármaco que inibe a resposta de stresse celular para a fabricação de um medicamento para o tratamento da doença de Alzheimer ou uma desordem relacionada. A invenção revela adicionalmente 0 uso de uma combinação de pelo menos dois fármacos que i nibem a resposta de stresse celular para a fabricação de um medicamento para o tratamento da doença de Alzheimer ou uma desordem relacionada, em que ditas pelo menos dois fármacos são administradas juntas, separadamente ou sequencialmente.

Como discutido no presente pedido, as terapias acima e terapias de combinação proporcionam abordagens efetivas e novas para tratar AD em indivíduos humanos.

Breve descrição das figuras

Figura 1: Efeito de fármacos selecionados na viabilidade de PC12 diferenciado por NGF após a intoxicação intoxicada de beta-amilóide p<0,00001: significativamente diferente do veículo. **: p<0,01; ***: p<0,0001 : signif icantemente diferente de Abeta25-35 . O teste de t de Student bilateral. Abeta 25-35 ΙΟμΜ produz uma significante intoxicação, acima de 25%, comparada aos neurónios tratados pelo veículo (Figl-A e B, em vermelho) . Esta intoxicação é prevenida eficientemente por ou. Esta intoxicação é significante- 9 ΡΕ2282779 mente prevenida por Prilocaína (Fig IA) ou Amlodipina (FiglB).

Figura 2: Efeito dos fármacos selecionados na libertação de LDH em cultura de neurónio cortical primário de rato intoxicado por beta-amilóide. : p< 0,000001: significativamente diferente do veiculo. *:p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001 ****: p<0,00001: significantemente diferente de Αβ25-35 . Teste t de Stu-dent Bilateral. Αβ25-35 20μΜ produz uma intoxicação si-gnificante, acima de 25%, comparada aos neurónios tratados por veiculo (Fig2-A e B, em vermelho). Esta intoxicação é prevenida eficientemente por BDNF a 10 ng/ ml, que é considerado como um controlo positivo para neuroproteção. Esta intoxicação é também prevenida significantemente seja pelo fármaco Zonisamida (Fig2A) ou Sulfisoxazol (Fig2B) ou Leflunomida (Fig2C).

Descrição detalhada da invenção A presente invenção proporciona novas abordagens terapêuticas para tratamento de AD ou doenças relacionadas. A invenção revela o uso novo de fármacos ou combinações de fármacos que permitem uma correção efetiva de tais doenças e pode ser usada para o tratamento do paciente. O termo "doença relacionada à AD" designa a doença de Alzheimer (AD), demência senil do tipo AD (SDAT), doença de Parkinson, demência de corpos de Lewis, demência 10 ΡΕ2282779 vascular, prejuízo cognitivo leve (MCI), prejuízo de memória associado à idade (AAMI) e problema associado ao envelhecimento, Parkinsonismo pós-encefálico, ALS e síndrome de Down.

Como utilizado neste documento, "tratamento" de uma desordem inclui a terapia, prevenção, profilaxia, retardamento ou redução de sintomas provocados pela desordem. O termo tratamento inclui, em particular, o controlo de progressão de doença e sintomas associados. O termo "inibir", quando se refere à resposta de stresse celular ("CSR") inclui qualquer redução na CSR quando comparada à atividade existente no indivíduo. Tal redução pode incluir uma diminuição parcial, por exemplo, de 5-20%, que é suficiente para melhorar a condição do paciente, bem como reduções substanciais, por exemplo, de 20-50% ou mais inibição completa, por exemplo, acima de 50%. A inibição pode ser avaliada ou verificada usando testes biológicos conhecidos, tais como descritos na secção experimental.

Também, a designação de compostos específicos dentro do contexto desta invenção significa incluir não apenas as moléculas especificamente nomeadas, mas também qualquer sal farmaceuticamente aceitável, hidrato, éster, éter, isómeros, racemato, conjugados ou pró-fármacos desses . 11 ΡΕ2282779 0 termo "combinação" designa um tratamento em que pelo menos dois ou mais fármacos são co-administrados a um indivíduo para causar um efeito biológico. Em uma terapia combinada de acordo com esta invenção, as pelo menos dois fármacos podem ser administrados juntamente ou separadamente, ao mesmo tempo ou sequencialmente. Também, as pelo menos dois fármacos podem ser administrados através de rotas e protocolos diferentes. Como um resultado, embora elas possam ser formuladas juntas, os fármacos de uma combinação também podem ser formulados separadamente.

Como discutido acima, a invenção refere-se às composições para o tratamento da doença de Alzheimer ou uma doença relacionada, usando um fármaco ou uma combinação de fármacos que inibem a resposta de stresse celular em um indivíduo em necessidade dessas.

Através de uma integração compreensível de resultados que cobrem dados experimentais de estudos de biologia celular, ensaios de desenho de perfil de expressão e estudos de associação genética, que descrevem aspectos diferentes da doença de Alzheimer e ligações que existem na sinalização celular e caminhos funcionais, os inventores descobriram que a resposta de stresse celular representa um mecanismo importante que é alterado em indivíduos que têm AD. Genes localizados na dita rede funcional e implicados na doença de Alzheimer foram selecionados através dos seguintes critérios: 12 ΡΕ2282779 (1) - interação direta com os genes causativamente responsáveis pelos casos familiares da doença de Alzheimer (APP, ApoE, presenilins, proteina tau), (2) - parceiros funcionais dos genes selecionados pelo critério (1) , (3) - parceiros funcionais mais próximos dos genes selecionados pelo critério (2).

Através desse processo, os inventores puderam estabelecer que a rede responsável pela resposta de estresse da célula é uma rede funcional principal afetada na doença de Alzheimer.

Os inventores estabeleceram mais especificamente que resposta de stresse celular é uma caracteristica relevante de funcionalidade da doença de Alzheimer. Como discutido abaixo, os inventores identificaram três familias de proteínas, dentro da resposta de stresse celular, que são funcionalmente relevantes para a génese e controlo da doença de Alzheimer e representam alvos valiosos para terapias (combinação). Estes grupos de proteínas são, mais especificamente, proteínas que participam na homeostase do cálcio, envelamento de proteina e na execução de apoptose. A presente invenção também revela composições e métodos que usam um fármaco ou uma combinação de fármacos que modulam a atividade de uma proteina envolvida na homeostase do cálcio. 13 ΡΕ2282779 Cálcio, um dos mais importantes mensageiros intracelulares, media uma pleiotropia de processos celulares tanto em células endoteliais quanto neuronais, que incluem plasticidade sináptica, angiogénese e apoptose. Mutações, envelamento anormal ou hiperfosforilação de presenilin., APP e proteínas tau afetam homeostase do cálcio. Reci-procamente, o rompimento de cálcio intracelular que sinaliza lesões características exacerbadas da doença de Alzheimer que leva a acumulação acelerada de agregações de β-amilóide e hiperfosforilação de proteína tau, indicam a existência de retorno regulatório entre homeostase do cálcio e patologia celular específica de AD. 0 nível de cálcio intracelular é precisamente regulado pela ação cooperativa de uma série de canais permeáveis ao cálcio, bombas de cálcio e trocadores de cálcio em membrana plasmática e retículo endoplasmático. por exemplo, cálcio é armazenado dinamicamente no retículo endoplasmático (ER) , que é capaz de acumular altos níveis de Ca2+ devido a atividade de bombas de SERCA de Ca2+ que alcançam concentrações minimolares (17). A libertação de Ca2+ do retículo endoplasmático é controlada por dois tipos de canais de libertação de Ca2+, chamados de Receptores de Ria-nodina (RYR) e de Receptores de IP3 (ITPR) . Eles poderiam ser diretamente ativados por múltiplos mensageiros de sinalização que incluem flutuação citoplasmática local de concentrações de Ca2+ ou IP3 e são funcionalmente modulados por várias proteínas regulatórias como PKA, PRKG1, mTOR, calcineurina, FKBP, fosfolambano etc. (18). As bombas de 14 ΡΕ2282779 SERCA são reguladas pela concentração de Ca2+ dentro do ER, quando o conteúdo diminuído de cálcio do ER aumenta atividade SERCA. No nível da membrana plasmática, homeos-tase do cálcio é regulado principalmente pelos canais de cálcio operado em armazenamento e dependentes de voltagem responsáveis pela entrada de Ca2+, bombas de extrusão de cálcio ATPase, trocadores de Na+/Ca2+ e canais de Na+ dependentes de voltagem.

Identificou-se uma rede de genes implicados no caminho de homeostase do cálcio, cuja função poderia ser modificada pelas proteínas de proselinins mutantes ou por β-amilóide tóxica. Dentre eles, receptores IP3R (ITPRl) e RYR3, ATP2A3 (SERCA3 Ca2+ ATPase) que regula homeostase do cálcio no nível de ER, ATPase ATP2B1 de membrana plasmática, íons de cálcio de extrusão de células eucarió-ticas contra gradientes de concentração e canais de Na+ dependentes de voltagem representam interesse particular. Foi mostrado que ΑΡΡ, Αβ42 e PS1 mutado são capazes de modular atividade de receptores de rianodina e bombas de SERCA. Αβ42 e FAD variante de PS1 aumenta expressão de RYR3 e atividade (19-21) que leva à vulnerabilidade neuronal aumentada para insulto por excitotoxicidade do glutamato (22). Além disso, a inibição de recaptação de cálcio através de bomba de SERCA se relaciona com a baixa de libertação de Abeta, enquanto a promoção de atividade de SERCA aumenta a produção de Abeta (23) . Adicionalmente, no nível da membrana plasmática, presenilin e BACE-1 são envolvidos no processamento de subunidades de β de canais 15 ΡΕ2282779 de sódio dependentes de voltagem, que modulam e poderiam -sob condições patológicas - reverter a atividade dos trocadores de Na+/Ca2+ que provocam acumulação excessiva de cálcio intracelular (24). A presente invenção também revela composições e métodos que usam um fármaco ou combinação de fármacos que modula a atividade de uma proteína envolvida na agregação ou envelamento de proteína. A agregação de proteínas é um fenómeno citopato-lógico central na AD. Duas características celulares principais da doença de Alzheimer são manifestadas no desenvolvimento do emaranhado neurofibrilar (NFTs) e deposição de placas amilóides, compostas de proteína tau hiperfosfori-lada agregada e fragmentos de Αβ da proteína APP, respetivamente. Outra proteína propensa à agregação - a-sinucleina, reconhecida como característica muito específica da doença de Parkinson, pode ser, no entando, detetada em placas amilóides na maioria dos casos de formas familiares e esporádicas da doença de Alzheimer (25-26).

Identificou-se caminho de vários genes implicados na modulação de envelamento, modificação pós-translacional e processamento de agregações de proteínas associadas a todo constituinte principal da doença de Alzheimer. Esta descoberta ressalta a importância do efeito patológico combinado de tau misfolded, proteínas sinucleina e Abeta para desenvolvimento da doença de Alzheimer. Por exemplo, 16 ΡΕ2282779 identificou-se enzima que degrada insulina, IDE, que é também envolvida na proteólise de Abeta, (27) e proteínas APBA1 e APBA2BP que interagem com APP e regulam sua estabilidade e funções (28-29). Bem como, a exploração de dados revelou α-sinucleina (SNCA), seu parceiro de interação Sinfilina (SINCAIP) e PARK2, uma ubiquitina-proteína ligase implicada na libertação e proteção de neurónios contra toxicidade de α-sinucleina, como fatores de risco para o desenvolvimento da doença de Alzheimer (30) .

Desequilíbrio na atividade de quinases, tais como Θ3Κ3β, CDK5 e MARK (31-32) e fosfatases que regulam nível de fosforilação da proteína tau poderiam contribuir para e intensificar a agregação de tau, Levando-se em conta que presenilin é também regulado funcionalmente pela fosforilação dependente de Θ3Κ-3β, a quinase Θ3Κ-3β poderá realizar um papel particularmente importante na patogénese da doença de Alzheimer. Esta conclusão é reforçada pela nossa descoberta de que alguns módulos de sinalização que regulam a atividade de quinase Θ3Κ-3β ou sua interação direta com a proteína tau - WWOX (33), receptor de hialuronano CD44, Fz2/ROR2 receptores de Wnt e receptor de insulina/complexo de fosfatase PTPRG (34) - poderia ser associado com génese da doença de Alzheimer. A presente invenção também revela composições e métodos que usam um fármaco ou combinação de fármacos que inibe a apoptose. 17 ΡΕ2282779

Apoptose, reconhecida como o mecanismo celular principal responsável pela perda celular na doença de Alzheimer, pode ser efetivamente ativada pelos insultos celulares tipicamente associados com o desenvolvimento da doença de Alzheimer - interrupção de homeostase do cálcio e produção aumentada de espécies de oxigénio reativo (ROS) estimulada pelas agregações tóxicas do péptido β-amilóide (Abeta).

Como identificado por nossa análise, apoptose no caso da doença de Alzheimer, mais provavelmente, é executada através de caminhos dependentes de p53 canónico. p53 é uma proteina de ligação ao DNA e trabalha como um fator de transcrição que controla a expressão de genes alvos que inibem o crescimento e invasão de celular tumorais. Portanto, p53 é reconhecida como uma proteina supressora de tumor e realiza um papel essencial na regulação de progressão de ciclo de célula, especificamente na transição de GO a G1 e ponto de verificação de dano de G2/M DNA e indução de apoptose. A última parece ser mediada seja por estimulação de expressão de proteinas pró-apoptóticas, tais como Bax, ou pela repressão de proteinas anti-apoptóticas tais como Bcl-2. A proteina p53 pode ser regulada através de modificações pós-translacional e através de interações com fatores regulatórios negativos e positivos. Identificou-se várias de tais proteinas regulatórias - WWOX, MDM1, HIPK2 e 18 ΡΕ2282779 PML - que confirmam a proposta sobre o papel principal da proteina p53 na execução de morte de célula na doença de Alzheimer. Uma oxidoredução que contém dominio WW de interação com p53 (WOXW) é um mediador essencial da citotoxidade de TNFa e media apoptose siqergisticamente com p53 (35). Soro nuclear de interação com homeodomínio/ treonina proteina quinase-2 (HIPK2) fosforila p53 no Ser 46 e coopera com p53 na ativação da transcrição dependente de p53 e caminhos apoptóticos (36). Finalmente, a proteina PML antagoniza o efeito da proteina MDM2, que promove a degradação de p53 pelo proteassoma, e ativa p53 pelo seu recrutamento aos complexos de multiprotinas chamados corpos nucleares PML (37).

Entre os sistemas receptores que poderiam ser implicados especificamente e diretamente na indução da apoptose no contexto da doença de Alzheimer, receptores de netrin UNC5C (Unc-5 Homólogo C) e DCC (Deletado do Carcinoma Clororetal), envolvidos na orientação de axônios e angiogénese, representam interesse particular. Estes receptores são designados supressores de tumor condicionais putativos desde que eles se comportem como receptores dependentes de netrin que induzem apoptose na ausência de seus ligantes (38) . A ligação de netrin-1 a estes receptores inibe apoptose dependente de p53 de supressor de tumor, e p53 é diretamente envolvida na regulação trans-cricional de netrin-1 e seus receptores (39). Além disso, o receptor DCC é processado por presenilin para gerar dominio de receptor intracelular que processa atividade transcri- 19 ΡΕ2282779 cional (40) . Consequentemente, nossa exploração de dados sugere que apoptose dependente de p53 e mediada por receptores de netrin poderiam ser um dos caminhos pró-apoptóticos específicos implicado na perda de célula patológica no contexto da doença de Alzheimer, além dos programas pró-apoptóticos muito inespecíficos estimulados pela homeostase do cálcio interrompida e produção excessiva de ROS. A presente invenção também revela composições e métodos que usam uma combinação de fármacos que inibe a atividade de pelo menos duas proteínas distintas envolvidas na homeostase do cálcio, no envelamento de proteína e na execução de apoptose.

Na presente invenção, os inventores propõem composições novas que podem ser usadas para inibir resposta de stresse celular induzida na doença de Alzheimer e outras doenças neurodegenerativas. A invenção também revela composições e métodos que usam um fármaco ou fármacos que inibem a resposta de stresse celular através da ligação à ou modulação da atividade de uma proteína codificada por um gene selecionado de ACCN1, ADRA1A, ADRB2, AFADIN, AKT, ALDH2, ALOX12, AMPK, APBA1, APBA2BP, APG1, APG12, APOER2, ATG5, ATG7, ATM, ATP1A1, ATP2A3, ATP2B1, ATP6V1C1, ATR, BACE1, BAD, BAX, BCAR1, BCL2, BECLIN1, BK channels (KCNMA1, KCNMB1), BRCA1, CACNA1C, CALCINEURIN, CD36, CD44, CDH1, 20 ΡΕ2282779 CDH2, CDK5, CDKNIA, CHK1, CHRM1, CHRM2, CHRM3, CHRM4, CHRM5, CK1, CTNNA2, CTNNB1, CULLIN1, CYCLINE, DCC, DGKB, DGKH, DNAJB9, DOCK3, DRD2, EDNRA, ELAVL2, ERK1, ERK2, EZRN, FAS, FKBP12, FKBP12.6, F0X03A, FZ2, GADD45, GNPTAB, GPC5, GRK2, GRK5, GRP170, GRIN2B, GRIN3A, GSK3B, HAS1, HAS2, HAS3, HIPK2, HSPAS, HSP90B1, HSPA5, HTR1A, IDE, IMPDH1, IMPDH2, INS, INSR, IRF1, ITB1, ITGA1, ITGB1, ITPR1, JNK1, LAMAl, MAD1L1, MAO, MCCl, MDMl, MME, MOESIN, MTOR, NADPH OXIDASE, NEDD9, NETRIN1, NFKB1, NHERF, NOS1, NOS2A, NOS3, PAELR, ΡΑΚΙ, PARK2, PCAF, PDE11A, PDE3A, PDE4D, PDE5, PDE6D, PI3K, PIK3C3, PKCA, PLCB1, PLD2, PLN, PML, POP2, PRDX5, PRDX6, PRKG1, PTPRG, PTPRM, PVRL1, RAC1, RACK1, RADIXIN, RHOA, ROR2, RTN1, RYR3, SAPK3, SCN1A, SCN1B, SCNNID, SCNN1G, SH3BP5, SIL1, SLC8A1, SLC8A2, SLC8A3, SLN, SNCA, SNCAIP, SORBS2, SORCS2, SRC, SYN1, THBS2, TP53, TP63, TRPC3, TRPC4, TRPC5, UNC5C, VPS15, WNT1A, WNT5A, WWOX, XANTHINE OXIDASE, e YES1.

As sequências de todos os genes listados acima e proteínas estão disponíveis das bibliotecas de gene e podem ser isolados por técnicas conhecidas na técnica. Além disso, a atividade destes genes e proteínas pode ser avaliada por técnicas conhecidas por si na técnica, como discutido na secção experimental. A invenção divulga adicionalmente fármacos que podem ser usados para modular estes genes e proteínas alvos. A invenção revela a identificação e atividade de fármacos particulares que, sejam sozinhos, mas preferen- 21 ΡΕ2282779 cialmente em combinação (s) , modulam o caminho acima e podem ser usados para tratar ditas doenças. Em particular, identificou-se moléculas pequenas que já existem na literatura, mas sendo usadas para tratar doenças distintas em indivíduos humanos. A este respeito, a inveção revela composições queo compreendem pelo menos um modulador de AMPK (preferencialmente, selecionado de fenformina e vidarabina) , um inibidor de ATP1A1 (preferencialmente, omeprazol) , um ini-bidor de CACNA1C (preferencialmente, amlodopina) , um antagonista de receptor endotelina ENDRA (preferencialmente, sulfisoxazol), um modulador de receptores GRIN3A e GRIN3B de glutamatérgico e Gabaérgico (preferencialmente, acampo-sato), um inibidor de atividade de GSK3B (preferencialmente selecionado de albuterol e mataraminol), um modulador de sintases de hialuronano HAS1-3 (preferencialmente, leflu-nomida), um inibidor de IMPDH1 e IMPDH2 (preferencialmente, tioguanina), um inibidor de MTOR (preferencialmente, rapi-micina), um inbidor de PDHE11A, PDE4A e fosfodiesterases de PDE5A (preferencialmente, tadalafil), um inibidor de PDE4D (preferencialmente, milrinona) , um modulador de PRDX5 e PRDX6 (preferencialmente, metilmazol) , um ativador de PRKG1 (preferencialmente selecionado de nitroprussiato, tadalafil e cilostazol), um modulador de RHOA (preferencialmente selecionado de alendronato e terbinafina), um modulador de RYR3 (preferencialmente, prilocaína), um inibidor de SCN1A e um ativador de canais BK (preferencialmente zonisamida), um inibidor de SCN1A/B (preferencialmente selecionado de 22 ΡΕ2282779 zonisamida e fosfenitoína), um inibidor de YES1 e SRC (preferencialmente, dasatinib), um ativador de autofagia (preferencialmente, trealose) e/ou acompanhantes quimicos (preferencialmente selecionados de fenilbutirato de sódio, rifabutina, arabitol e manitol).

Como discutido acima, a invenção propõe particularmente desenvolver terapias de combinação para endereçar os mecanismos de AD e doenças relacionadas. A este respeito, a invenção revelauma composição que compreende pelo menos uma das seguintes combinações de fármacos para administração combinada, separada ou sequencial: - um modulador de AMPK (preferencialmente, fenformina) e um inibidor de SCN1A de canal de sódio e um ativador de canais de BK (preferencialmente, zonisamida), - um modulador de receptores GABAérgicos e glutamér-gicos (preferencialmente, acamprosato) e modulador de RHOA (preferencialmente, terbinafina), - um inibidor de canal de sódio SCN1A e um ativador dos canais BK (preferencialmente, zonisamida) e um modulador de receptor de rianodina RYR3 (preferencialmente, prolocaina), - um modulador de AMPK (preferencialmente, fenformina) e um modulador de receptor de rianodina RYR3 (preferencialmente, prilocaina), - um modulador de AMPK (preferencialmente, fenformina) e um modulador de RHOA (preferencialmente, terbinafina) , 23 ΡΕ2282779 - um inibidor de canal de sódio SCN1A e um ativador de canais BK (preferencialmente, zonisamida) e um modulador de RHOA (preferencialmente, terbinafina), - um modulador de receptor de rianodina RYR3 (preferencialmente, prilocaina) e um modulador de RHOA (preferencialmente, terbinafina), - um modulador de AMPK (preferencialmente, fenformina) e uma chaperona química (preferencialmente, rifabu-tina), - um inibidor de canal de sódio SCN1A e um ativador dos canais BK (preferencialmente, zonisamida) e uma chaperona química (preferencialmente, rifabutina), - um modulador de receptor de rianodina RYR3 (preferencialmente, prilocaina) e uma chaperona química (preferencialmente, rifabutina), um modulador de RHOA (preferencialmente, terbinafina) e uma chaperona química (preferencialmente, rifabutina), ou - um modulador de AMPK (preferencialmente, fenformina) e um inibidor de fosfodiesterases PDE11A e PDE4A, PDE5A (preferencialmente, tadalafil). A invenção também divulga composições que compreendem um composto selecionado de acamprosato, albuterol, alendronato, amlopidina, arabitol, cilostazol, dasanitib, fosfenitoína, leflunomida, manitol, metaraminol, metimazole, milrinona, nitroprussiato, omeprazol, fenformina, fenilbutirato de sódio, prilocaina, rapamicina, rifabutina, sulfisoxazol, tadalafil, terbinafina, 24 ΡΕ2282779 tioguanina, trealose, vidarabina e zonisamida ou uma combinação destes. A invenção também divulga composições que compreendem pelo menos um composto escolhido do grupo que consiste de acamprosato, cilostazol, metilmazol, fenformina, prilocaina, tadalafil, terbinafina, zonisamida e rifabutina ou sais ou pró-fármacos ou derivados ou formulações de libertação prolongada destes para administração simultânea, separada ou sequencial. A invenção também divulga composições que compreendem uma combinação de pelo menos dois compostos escolhidos do grupo que consiste de acamprosato, cilostazol, metilmazol, fenformina, prilocaina, tadalafil, terbinafina, zonisamida e rifabutina, ou sais ou pró-fármacos ou derivados ou formulações de libertação prolongadas destes para administração simultânea, separada ou sequencial. A invenção também divulga composições que compreendem uma combinação de pelo menos dois compostos escolhidos do grupo que consiste acamprosato, cilostazol, metilmazol, fenformina, prilocaina, tadalafil, terbinafina, zonisamida e rifabutina, ou sais ou pró-fármacos ou derivados ou formulações de libertação prolongadas destes, em que ditas composições inibem resposta de stresse celular induzida em doenças neurodegenerativas selecionadas do grupo que consiste de doença de Alzheimer (AD), doença de Par-kinson (PD), esclerose lateral Amiotrófica (ALS) e esclerose múltipla (MS) . 25 ΡΕ2282779 A invenção também divulga composições que compreendem uma combinação de pelo menos dois compostos escolhidos do grupo que consiste de acamprosato, cilostazol, metilmazol, fenformina, prilocaina, tadalafil, terbinafina, zonisamida e rifabutina, ou sais ou pró-fármacos ou derivados ou formulações de libertação prolongadas destes, para o tratamento da doença de Alzheimer (AD). A invenção divulga, por exemplo, composições para o tratamento da doença de Alzheimer ou uma doença relacionada em um indivíduo em necessidade destas, que compreendem pelo menos uma das seguintes combinações de fármacos para administração combinada, separada ou sequencial: fenformina e zonisamida, acomprosato e terbinbafina, zonisamida e prilocaina, fenformina e prilocaina, fenformina e terbinbafina, zonisamida e terbinbafina, prilocaina e terbinbafina, fenformina e rifabutina, zonisamida e rifabutina, prilocaina e rifabutina, terbinbafina e rifabutina, ou fenformina e tadalafil.

Outra composição revelada na invenção compreende 26 ΡΕ2282779 pelo menos amlodipina e prilocaína, ou sais ou pró-fármacos ou derivados ou formulações de libertação prolongadas destes para administração simultânea, separada ou sequencial.

Outra composição revelada na invenção compreende pelo menos amlodipina e/ou prilocaína, ou sais ou pró-fármacos ou derivados ou formulações de libertação prolongadas destes para o tratamento da doença de Alzheimer ou uma desordem relacionada.

Outra composição revelada na invenção compreende adicionalmente pelo menos um fármaco que inibe a resposta de stresse celular para uso combinado, separado ou sequencial .

Por exemplo, o dito fármaco adicional que inibe a resposta de stresse celular é selecionado de um modulador de AMPK (preferencialmente, vidarabina), um inibidor de ATP1A1 (preferencialmente, omeprazol) , um inibidor de atividade de GSK3B (preferencialmente selecionado de albu-terol e metaraminol), um inibidor de IMPDH1 e IMPDH2 (preferencialmente, tioguanina), um inibidor de MTOR (preferencialmente, rapamicina), um inibidor de PDE4D (preferencialmente, milrinona), um ativador de PRKG1 (preferencialmente, cilostazol), um modulador de RHOA (preferencialmente alen-dronato), um inibidor de SCN1A/B (preferencialmente, fos-fenitoína), um inibidor de YES1 e SRC (preferencialmente, dasatinib), um ativador de autofagia (preferencialmente, trealose) e/ou acompanhantes químicos (preferencialmente selecionado de fenilbutirato de sódio, arabitol e manitol). 27 ΡΕ2282779 A invenção também revela que o fármaco adicional que inibe resposta de stresse celular pode ser selecionado do fármaco ou fármacos que se liqam à ou modulam a atividade de uma proteina codificada por um qene selecionado de ACCN1, ADRA1A, ADRB2, AFADIN, AKT, ALDH2, AL0X12, AMPK, APBA1, APBA2BP, APG1, APG12, AP0ER2, ATG5, ATG7, ATM, ATPlAl, ATP2A3, ATP2B1, ATP6V1C1, ATR, BACEl, BAD, BAX, BCAR1, BCL2, BECLIN1, canais BK (KCNMA1, KCNMB1), BRCA1, CACNA1C, CALCINEURIN, CD36, CD44, CDH1, CDH2, CDK5, CDKNIA, CHK1, CHRM1, CHRM2, CHRM3, CHRM4, CHRM5, CK1, CTNNA2, CTNNB1, CULLIN1, CYCLINE, DCC, DGKB, DGKH, DNAJB9, D0CK3, DRD2, EDNRA, ELAVL2, ERK1, ERK2, EZRIN, FAS, FKBP12, FKBP12.6, F0X03A, FZ2, GADD45, GNPTAB , GPC5, GRK2 , GRK5, GRP170, GRIN2B, GRIN3A , GSK3B, HAS1, HAS2, HAS3, HIPK2, HSPAS, HSP90B1, HSPA5, HTR1A, IDE, IMPDH1, IMPDH2, NS, INSR, IRF1, ITB1, ITGA1, , ITGB1, ITPR1, JNK1, LAMA1, MAD1L1, MAO, MCC 1, MDM1, MME, MOESIN, MTOR, NADPH OXIDASE, NEDD9, NETRIN1, NFKB1, NHERF, N0S1, N0S2A, N0S3, PAELRj r ΡΑΚΙ, PARK2, PCAF, PDE11A, PDE3A , PDE4D, PDE5, PDE6D, PI3K, PIK3C3, PKCA, PLCB1, PLD2, PLN, PML, POP2, PRDX5, PRDX6, PRKG1, PTPRG, PTPRM, PVRL1, RAC1, RACK1, RADIXIN, RHOA, ROR2, RTN1, RYR3, SAPK3, SCN1A, SCN1B, SCNNID, SCNN1G, SH3BP5, SIL1, SLC8A1, SLC8A2, SLC8A3, SLN, SNCA, SNCAIP, S0RBS2, S0RCS2, SRC, SYN1, THBS2, TP53, TP63, TRPC3, TRPC4, TRPC5, UNC5C, VPS15, WNT1A, WNT5A, WWOX, XANTHINE OXIDASE e YES1.

Os compostos nomeados acima estão listados na 28 ΡΕ2282779 tabela seguinte, juntamente com seus números de CAS. A invenção também revela o uso dos compostos acima bem como qualquer sal farmaceuticamente aceitável, hidrato, éster, éter, isómeros, racemato, conjugados ou pró-fármacos desses. Pró-fármacos podem ser preparados (por exemplo, acoplando o fármaco a um veiculo adequado) para oferecer um controlo melhor diante dos parâmetros farmacocinéticos do tratamento.

Tabela 1 NOME DO FÁRMACO NUMBER DE CAS Acamprosato 77337-76-9 Albuterol 18559-94-9 Alendronato 66376-36-1 Amlodipina 88150-42-9 Arabitol 488-82-4, 7643-75-6, 6018-27-5 Cilostazol 73963-72-1 Dasatinib 302962-49-8 Fosfenitoina 93390-81-9 Leflunomida 75706-12-6 Manitol 69-65-8 Metaraminol 54-49-9 Metimazole 60-56-0 Milrinona 78415-72-2 Nitroprussiato 15078-28-1 Omeprazol 73590-58-6 Fenformina 114-86-3 Fenilbutirato de Sódio 1716-12-7 29 ΡΕ2282779 (continuação) NOME DO FÁRMACO NUMBER DE CAS Prilocaina 721-50-6 Rapamicina 53123-88-9 Rifabutina 72559-06-9 Sulfisoxazol 127-69-5 Tadalafil 171596-29-5 Terbinafina 91161-71-6 Tioguanina 154-42-7 Trealose 99-20-7 Vidarabina 24356-66-9 Zonisamida 68291-97-4

Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis, sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis, sais de metal farmaceuticamente aceitáveis, amónio e sais de amónio alquilados. Sais de adição de ácidos incluem sais de ácidos inorgânicos bem como ácidos orgânicos. Exemplos representativos de ácidos inorgânicos adequados incluem ácidos hidroclórico, hidrobrómico, hidroiódico, fosfórico, sulfúrico, nitrico e outros. Exemplos representativos de ácidos orgânicos adequados incluem fórmico, acético, tri-cloroacético, trifluoroacético, propiónico, benzóico, cinâ-mico, citrico, fumárico, glicólico, láctico, maléico, máli-co, malónico, mandélico, oxálico, pícrico, pirúvico, sali-cílico, succinico, metanossulfónico, etanossulfónico, tar-tárico, ascórbico, pamóico, bismetileno salicilico, etano- 30 ΡΕ2282779 dissulfónico, glucónico, citracónico, aspártico, esteárico, palmítico, EDTA, glicólico, p-aminobenzóico, glutâmico, benzenossulfónico, ácidos p-toluenossulfónicos, sulfatos, nitratos, fosfatos, percloratos, boratos, acetatos, ben-zoatos, hidroxinaftoatos, glicerofosfatos, cetoglutaratos e outros. Exemplos adicionais de sais de adição de ácido orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis são listados em, por exemplo, J. Pharm. Sei. 1977, 66, 2, que está incorporado neste documento por referência. Exemplos de sais de metal incluem litio, sódio, potássio, sais de magnésio e outros. Exemplos de amónio e sais de amónio alquilado incluem sais de amónio, metilamónio, dimetil-amónio, trimetilamónio, etilamónio, hidroxietilamónio, di-etilamónio, butilamónio, tetrametilamónio e outros. Exemplos de bases orgânicas incluem lisina, arginina, guani-dina, dietanolamina, colina e outras.

Terapia de acordo com a invenção pode ser executada sozinha ou como combinação de fármacos, e/ou juntamente com qualquer outra terapia, que almeja o mesmo caminho ou que tem modos distintos de ações. Isto e pode ser proporcionado em casa, no consultório do médico, uma clinica, o departamento de alta do paciente de um hospital ou um hospital, de forma que o médico possa observar os efeitos da terapia de perto e fazer qualquer ajuste que seja preciso. A invenção também revela composições que compreendem adicionalmente pelo menos um fármaco que modula 31 ΡΕ2282779 angiogénese, de preferência que aumenta angiogénese, para uso combinado, separado ou sequencial, selecionado do grupo que consiste de ambrisentan, ácido aminocapróico, arga-troban, balsalazida, baclofermina, cabergolina, clopido-grel, desirudina, di-hidroergotamina, eplerenona, fenol-dopam, fludrocortisona, gemfibrozil, hesperitina, lefluno-mida, L-histidina, liotironina, marimastato, meloxicam, me-pacrina, metazolamida, montelucaste, netilmicina, nitrogli-cerina, pirimetamina, sulfisoxazol, sunitinib, tietilpera-zina, triofiban, topotecan e varfarina (ver tabela 2 abaixo) .

Tabela 2 NOME DO FÁRMACO NUMERO DO CAS Ambrisentan 177036-94-1 Ácido Aminocaproico 60-32-2 Argatroban 74863-84-6 Balsalazida 80573-04-2 Becaplermina 165101-51-9 Cabergolina 81409-90-7 Clopidoprel 113665-84-2 Desirudina 120993-53-5 Di-hidroerqotamina 6190-39-2 Eplerenona 107724-20-9 Fenoldopam 67227-57-0 Fludrocortisona 127-31-1 Gemfibrozil 25812-30-0 32 ΡΕ2282779 (continuação) NOME DO FÁRMACO NUMERO DO CAS Hesperetina 520-33-2 Leflunomida 75706-12-6 L-histidina 71-00-1 Liotironina 6893-02-3 Marimastate 154039-60-8 Meloxicum 71125-38-7 Mepacrina 83-89-6 Metazolamida 554-57-4 Montelucaste 158966-92-8 Netilmicina 56391-56-1 Nitroglycerin 55-63-0 Pirimetamina 58-14-0 Sulfisoxazole 127-69-5 Sunitinib 557795-19-4 Tiethilperazina 1420-55-9 Tirofiban 144494-65-5 Topotecan 119413-54-6 varfarina 81-81-2 A invenção também revela composições que compreendem adicionalmente pelo menos um fármaco que modula a função de sinapse, de preferência que melhora a função de sinapse, para uso combinado, separado ou sequencial, selecionados do anfetanil, amiloria, amlodipina, aztreonam, baclofeno, buclizina, bumetanida, bruprenorfina, Lidocaina, clorzoxasona, cinacalcet, difilina, eletriptan, ergotamina, flunitrazepam, imatinib, cetrotifeno, pegaptanib, pentazo- 33 ΡΕ2282779 tiagabi-tabela 3 cina, fenobarbital, pregabalina, propiltiouracil, na, topiramato, triamtereno e vigabratina (ver abaixo).

Tabela 3 NOME DO FÁRMACO NUMERO DO CAS Alfentanil 71195-58-9 Amilorida 2016-88-8 Amlodipina 88150-42-9 Aztreonam 78110-38-0 Buclizina 82-95-1 Bumetanida 28395-03-1 Buprenorfina 52485-79-7 Lidocaina 137-58-6 Clorzoxazona 95-25-0 Cinacalcet 226256-56-0 Dasatinibe 302962-49-8 Difillina 479-18-5 Eletriptano 143322-58-1 Ergotamina 113-15-5 Fosfenitoina 93390-81-9 Fenobarbi tal 50-06-6 Pregabalina 148553-50-8 Propiltiouracil 51-52-5 Tiagabina 115103-54-3 Triamtereno 396-01-0 Vigabatrina 60643-86-9 34 ΡΕ2282779 A invenção também revela uma composição que compreende um fármaco que inibe resposta de stresse celular, um fármaco que aumenta anqioqénese e um fármaco que melhora a função de sinapse, para administração simultânea, separada ou sequencial. A invenção também revela uma composição que usa um fármaco que exibe pelo menos duas das atividades listadas acima. De facto, fármacos que inibem a resposta de stresse celular e que também aumentam a angioqénese ou melhoram a função de sinapse, são também revelados nesta invenção.

As composições da invenção compreendem tipicamente um ou vários veículos ou excipientes farmaceutica-mente aceitáveis. A duração da terapia depende do estágio da doença sendo tratada, a combinação usada, a idade e condição do paciente e como o paciente responde ao tratamento. A dosagem, frequência e modo de administração de cada componente da combinação podem ser controlados independentemente. Por exemplo, um fármaco pode ser administrado via oral enquanto um segundo fármaco pode ser administrado via intramuscular. Terapia de combinação pode ser dada em ciclos on-and-off que incluem períodos de descanso de forma que o corpo do paciente tenha uma chance para recuperar de qualquer como ainda efeitos colaterais imprevistos. Os fármacos também podem ser formulados juntamente de tal modo que uma administração entrega todas os fármacos. 35 ΡΕ2282779 A administração de cada fármaco da combinação pode ser por qualquer meio adequado que resulte em uma concentração do fármaco que, combinada com o outro componente, possa corrigir o funcionamento dos caminhos implicados na AD.

Embora seja possivel para os ingredientes ativos da combinação ser administrados como o quimico puro, é preferencial apresentá-los como uma composição farmacêutica, também referida como, neste contexto, formulação farmacêutica. Possíveis composições incluem aquelas adequadas para administração oral, retal, tópica (que inclui transdérmica, bucal e sublingual) ou parenteral (que inclui subcutânea, intramuscular, intravenosa e intradérmica).

Mais comummente estas formulações farmacêuticas são prescritas ao paciente em "pacotes para pacientes" que contêm uma quantidade de unidades de dosagem ou outro meio para administração de doses unitárias calibradas para uso durante um periodo de tratamento distinto em um único pacote, normalmente um pacote bolha. Pacotes para pacientes têm uma vantagem em relação às prescrições tradicionais em que um farmacêutico divide a provisão de um paciente de um farmacêutico de uma provisão volumosa, pelo facto de que o paciente sempre tem acesso à inserção de suplemento contida no pacote do paciente, que normalmente faltam em prescrições tradicionais. A inclusão de uma inserção de pacote tem sido mostrada para aprimorar a complacência do 36 ΡΕ2282779 paciente com as instruções do médico. Consequentemente, a invenção inclui adicionalmente uma formulação farmacêutica, como descrita anteriormente neste documento, em combinação com um material do pacote adequado para ditas formulações. Em tal pacote para pacientes o uso planejado de uma formulação para o tratamento de combinação pode ser deduzido pelas instruções, instalações, condições, adaptações e/ou outros meios para ajudar no uso da formulação mais adequadamente para o tratamento. Tais medidas fazem um pacote de paciente especificamente adequado para e adaptado para o uso para tratamento com a combinação da presente invenção. 0 fármaco pode estar contido em qualquer quantidade apropriada em qualquer substância veiculo adequada e pode estar presente em uma quantidade de 1-99% por peso do peso total da composição. A composição pode ser proporcionada em uma forma de dosagem que seja adequada para a via de administração oral, parenteral (por exemplo, via intravenosa, via intramuscular), retal, cutânea, nasal, vaginal, inalante, pele (caminho) ou ocular. Consequentemente, a composição pode estar na forma de, por exemplo, comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, granulados, suspensões, emulsões, soluções, géis que incluem hidrogéis, pastas, pomadas, cremes, emplastros, banhos, dispositivos de entrega osmótica, supositórios, enemas, injetáveis, implantes, sprays, ou aerossóis.

As composições farmacêuticas podem ser formuladas 37 ΡΕ2282779 de acordo com a prática farmacêutica convencional (ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20a ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wil-kins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Mareei Dekker, New York).

Composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser formuladas para libertar o fármaco substancialmente ativo imediatamente após administração ou em qualquer tempo pré-determinado ou periodo de tempo após a administração.

As formulações de libertação controladas incluem (i) formulações que criam uma concentração substancialmente constante do fármaco dentro do corpo durante um periodo prolongado de tempo; (i i) formulações que depois de um periodo de incubação pré-determinado cria uma concentração substancialmente constante do fármaco dentro do corpo durante um periodo prolongado de tempo; (iii) formulações que sustentam ação do fármaco durante um periodo de tempo pré-determinado que mantém um nivel de fármaco relativamente, constante, efetivo no corpo com minimização concomitante de efeitos colaterais indesejáveis associados com flutuações no nível de plasma da substância fármaco ativa; (iv) formulações que localizam ação de fármaco, por exemplo, pela colocação espacial de uma composição de libertação controlada adjacente à ou no tecido ou no órgão doente; e (v) formulações que alvejam ação de fármaco pelo 38 ΡΕ2282779 uso de veículos ou derivados químicos para entregar o fármaco para um tipo particular de célula alvo.

Administração de fármacos na forma de uma formulação de libertação controlada é especialmente preferencial em casos nos quais o fármaco, seja sozinho ou em combi- nação, possui (i) um índice terapêutico estreito (i.e., a diferença entre a concentração de plasma que conduz a efeitos colaterais prejudiciais ou reações tóxicas e a concentração de plasma que conduz a um efeito terapêutico é pequena; em geral, o índice terapêutico, TI, é definido como a razão de dose letal mediana (LD50) para dose efetiva mediana (ED50)); (ii) uma janela de absorção estreita no trato gastrointestinal; ou (iii) uma meia-vida biológica muito curta de forma que a dosagem frequente durante um dia é exigida para sustentar o nivel de plasma a um nível terapêutico.

Quaisquer de várias estratégias podem ser prosseguidas para obter libertação controlada na qual a taxa de libertação excede a taxa de metabolismo do fármaco em questão. A libertação controlada pode ser obtida pela seleção apropriada de vários parâmetros de formulação e ingredientes, que incluem, por exemplo, vários tipos de composições de libertação controlada e camadas. Consequentemente, o fármaco é formulado com excipientes apropriados dentro de uma composição farmacêutica que, após a administração, liberta o fármaco de uma maneira controlada (comprimido de unidade única ou múltipla ou composições de 39 ΡΕ2282779 cápsula, soluções em óleo, suspensões, emulsões, micro-cápsulas, micro-esferas, nanopartículas, caminhos e lipossomas).

Formas de dosagem sólida para uso oral

Formulações para uso oral incluem comprimidos que contêm o ingrediente(s) ativo em uma mistura com exci-pientes farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos. Estes excipientes podem ser, por exemplo, diluentes inertes ou agentes de enchimento (por exemplo, sacarose, celulose microcristalina, amido que inclui amido de batata, carbonato de cálcio, cloreto de sódio, fosfato de cálcio, sulfato de cálcio ou fosfato de sódio); agentes de granulação e desintegração (por exemplo, derivados de celulose que incluem celulose microcristalina, amidos que incluem amido de batata, croscarmelose de sódio, alginatos ou ácido alginico); agentes de ligação (por exemplo, acácia, ácido alginico, alginato de sódio, gelatina, amido, amido pré-gelatinizado, celulose microcristalina, sódio de carboximetilcelulose, metilcelulose, hidroxipropil metil-celulose, etilcelulose, polivinilpirrolidona ou polietile-noglicol); e agentes de lubrificação, glidantes e anti-adesivos (por exemplo, ácido esteárico, sílica ou talco). Outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem ser colorantes, agentes de sabor, plastificantes, humectantes, agentes de solução tampão e outros.

Os comprimidos podem ser não revestidos ou eles 40 ΡΕ2282779 podem ser revestidos através de técnicas conhecidas, para opcionalmente atrasar a desintegração e absorção no trato gastrointestinal e, proporcionando, assim, uma ação prolongada durante um periodo mais longo. O revestimento pode ser adaptado para libertar a substância fármaco ativa em um padrão pré-determinado (por exemplo, para alcançar uma formulação de libertação controlada) ou pode ser adaptada para não libertar a substância fármaco ativa até depois da passagem do estômago (revestimento entérico). O revestimento pode ser um revestimento de açúcar, um revestimento de filme (por exemplo, à base de hidroxipropil metilcelu-lose, metilcelulose, metilcelulose, metil-hidroxietilcelu-lose, hidroxipropilcelulose, carboximetilcelulose, copolí-meros acrilato, polietilenoglicóis e/ou polivinilpirroli-dona) ou um revestimento entérico (por exemplo, à base de copolimero ácido metacrilico, ftalato de acetato de celulose, ftalato de hidroxipropilmetilcelulose, acetato succinato de hidroxipropilmetilcelulose, ftalato de acetato de polivinilo, goma-laca/verniz e/ou etilcelulose). Um material de retardo de tempo tal como, por exemplo, monostearato de glicerilo ou distearato de glicerilo pode ser empregado.

As composições de comprimido sólidas podem incluir um revestimento adaptado para proteger a composição a partir de mudanças químicas não desejadas (por exemplo, degradação química antes da libertação da substância fármaco ativa). O revestimento pode ser aplicado na forma de dosagem sólida de uma maneira similar como aquela descrita na Encyclopedia of Pharmaceutical Technology. 41 ΡΕ2282779 Vários fármacos podem ser misturados juntos no comprimido ou podem ser divididos. Para exemplo, o primeiro fármaco é contido no lado de dentro do comprimido e o segundo fármaco está no lado de fora, de modo que uma porção substancial do segundo fármaco é libertada antes da libertação do primeiro fármaco.

Formulações para uso oral também podem ser apresentadas como comprimidos mastigáveis ou como cápsulas de gelatina duras em que o ingrediente ativo é misturado com um diluente sólido inerte (por exemplo, amido de batata, celulose microcristalina, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulim); ou como cápsulas de gelatina macias em que o ingrediente ativo está misturado com água ou um meio de óleo, por exemplo, parafina liquida ou azeite de oliva. Pós e granulados podem ser preparados usando os ingredientes mencionados acima debaixo de comprimidos e cápsulas de uma maneira convencional.

Composições de libertação controlada para uso oral podem, por exemplo, ser construídas para libertar o fármaco ativo controlando a dissolução e/ou a difusão da substância fármaco ativa.

Libertação controlada de dissolução ou difusão pode ser alcançada pelo revestimento apropriado de uma formulação de fármacos em comprimido, cápsula, pelete, ou granulado; ou pela incorporação do fármaco em uma matriz 42 ΡΕ2282779 apropriada. Um revestimento de libertação controlada pode incluir uma ou mais das substâncias de revestimento mencionadas acima e/ou, por exemplo, goma-laca/verniz, cera de abelha, glicocera, cera de castor, cera de carnaúba, álcool estearilico, monoestearato de glicerilo, diestearato de glicerilo, palmitoestearato de glicerol, etilcelulose, resinas acrílicas, ácido dl-poliláctico, butirato de acetato de celulose, cloreto de polivinilo, acetato de poli-vinilo, vinilpirrolidona, polietileno, polimetacrilato, metilmetacrilato, 2-hidroximetacrilato, hidrogéis de meta-crilato, 1,3 butilenoglicol, metacrilato de etilenoglicol e/ou polietilenoglicóis. Em uma formulação de matriz de libertação controlada, o material de matriz também pode incluir, por exemplo, metilcelulose hidratada, cera de carnaúba e álcool estearilico, carbopol 934, silicone, tri-estearato de glicerilo, metilacrilato-metilmetacrilato, cloreto de polivinilo, polietileno e/ou fluorocarboneto halogenado.

Uma composição de libertação controlada que contém um ou mais dos fármacos das combinações reivindicadas também podem estar na forma de um comprimido ou cápsula flutuante (i.e., um comprimido ou cápsula que, depois da administração oral, flutua sobre o tipo do conteúdo gástrico por um certo período de tempo). Uma formulação de comprimido flutuante do(s) fármaco(s) pode ser preparada pela granulação de uma mistura do(s) fármaco(s) com excipientes e 20-75% p/p de hidrocolóides, tais como hi-droxietilcelulose, hidroxipropilcelulose ou hidroxipropil- 43 ΡΕ2282779 metilcelulose. Os grânulos obtidos podem ser comprimidos, então, em comprimidos. Em contato com o suco gástrico, o comprimido forma uma barreira de gel substancialmente impermeável à água ao redor de sua superfície. Esta barreira de gel participa na manutenção de uma densidade de menos que um, permitindo, portanto, o comprimido permanecer flutuante no suco gástrico. Líquidos para Administração Oral Pós, pós dispersiveis ou grânulos adequados para preparação de uma suspensão aquosa por adição de água são formas de dosagem convenientes para administração oral. Formulação como uma suspensão proporciona o ingrediente ativo em uma mistura com um agente de dispersão ou de umidade, agente de suspensão e um ou mais conservantes. Agentes de suspensão adequados são, por exemplo, carboxime-tilcelulose de sódio, metilcelulose, alginato de sódio e outros.

Composições Parenterais A composição farmacêutica também pode ser administrada de modo parenteral por injeção, infusão ou implantação (intravenosa, intramuscular, subcutânea ou outras) em formas de dosagem, formulações ou por dispositivos de entrega adequados ou implantes que contém veículos farmaceuticamente aceitáveis convencionais, não tóxicos e adjuvantes. A formulação e preparação de tais composições 44 ΡΕ2282779 são bem conhecidas para aqueles versados na técnica da formulação farmacêutica.

Composições para uso parenteral podem ser proporcionadas em forma de dosagens únicas (por exemplo, em ampolas de dose única), ou em frascos que contêm várias doses e nos quais um conservante adequado pode ser adicionado (ver abaixo) . A composição pode ser na forma de uma solução, uma suspensão, uma emulsão, um dispositivo de infusão ou um dispositivo de entrega para implantação ou pode ser apresentada como um pó seco a ser reconstituído com água ou outro veiculo adequado antes do uso. Além do(s) fármaco(s) ativo(s), a composição pode incluir veiculos e/ou excipientes aceitáveis de modo parenteral adequados. 0(s) fármaco(s) ativo(o) pode(m) ser incorporadO(S) em micro-esferas, micro-cápsulas, nanoparticulas, lipossomas ou outros, para libertação controlada. A composição pode incluir agentes de suspensão, solubilização, estabilização, ajuste de PH e/ou agentes de dispersão.

As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem estar na forma adequada para injeção estéril. Para preparar tal composição, o(s) fármaco(s) ativo(s) adequado (s) é(são) dissolvido(s) ou suspens(o)s em um veiculo liquido aceitável de modo parenteral. Entre os veiculos aceitáveis e solventes que podem ser empregados estão água, água ajustada a um pH adequado pela adição de uma quantidade apropriada de ácido hidroclórico, hidróxido de sódio ou uma solução tampão adequada, 1,3-butanodiol, solu- 45 ΡΕ2282779 ção de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônico. A formulação aquosa também pode conter um ou mais conservantes (por exemplo, p-hidroxibenzoato de metilo, etilo ou n-propilo). Nos casos em que um dos fármacos é apenas frugalmente ou ligeiramente solúvel em água, uma dissolução que aumenta ou agente de solubilização pode ser adicionado ou o solvente pode incluir 10-60% p/p de propilenoglicol ou outro.

Composições parenterais de libertação controlada podem estar na forma de suspensões aquosas, micro-esferas, micro-cápsulas, micro-esferas magnéticas, soluções em óleo, suspensões de óleo ou emulsões. Alternativamente, o(s) fár-maco(s) ativo(s) pode(m) ser incorporado(s) em veiculos biocompativeis, lipossomas, nanoparticulas, implantes ou dispositivos de infusão. Materiais para uso na preparação de micro-esferas e/ou micro-cápsulas são, por exemplo, polímeros biodegradáveis/bioerodiveis tais como poligalac-tina, poli- (isobutil cianoacrilato) , poli(2-hidroxietil-L-glutamnina). Veiculos biocompativeis que podem ser usados quando formulando uma formulação parenteral de libertação controlada são hidratos de carbono (por exemplo, dextra-nos) , proteínas (por exemplo, albumina), lipoproteínas ou anticorpos. Materiais para uso em implantes podem ser não biodegradáveis (por exemplo, polidimetil siloxano) ou biodegradáveis (por exemplo, poli(caprolactona), poli(ácido glicólico) ou poli(orto éster)). 46 ΡΕ2282779

Composições retais

Para aplicação retal, formas de dosagem adequadas para uma composição incluem supositórios (tipo de emulsão ou suspensão) e cápsulas de gelatina retais (soluções ou suspensões). Em uma formulação de supositório tipica, o(s) fármaco(s) ativo(s) é(são) combinado(s) com uma base de supositório apropriado farmaceuticamente aceitável tal como manteiga de cacau, ácidos gordos esterifiçados, gelatina glicerinada e várias bases solúveis em água ou dispersiveis como polietilenoglicóis. Vários aditivos, aumentadores ou surfactantes podem ser incorporados.

Composições percutâneas e tópicas

As composições farmacêuticas também podem ser administradas topicamente na pele para absorção percutânea em formas de dosagem ou formulações que contém veiculos excipientes aceitáveis farmaceuticamente convencionalmente não tóxicos e que incluem micro-esferas e lipossomas. As formulações incluem cremes, pomadas, loções, linimentos, géis, hidrogéis, soluções, suspensões, bastões, sprays, pastas, emplastros e outros tipos de sistemas de entrega de fármaco transdérmicos. Os veiculos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem incluir agentes de emulsifi-cação, antioxidantes, agentes de solução tampão, conservantes, humectantes, aumentadores de penetração, agentes de quelantes, agentes de formação de gel, bases de pomada, perfumes e agentes protetores da pele. 47 ΡΕ2282779

Agentes de emulsificação podem ser gomas de ocorrência de modo natural (por exemplo, goma de acácia ou goma de tra-gacanto)

Os conservantes, humectantes, aumentadores de penetração podem ser parabenos, tais como metil ou propil p-hidroxibenzoato, e cloreto de benzalcônio, glicerina, propilenoglicol, ureia, etc.

As composições farmacêuticas descritas acima para administração tópica sobre a pele podem ser usadas também em conexão com a administração tópica sobre ou perto da parte do corpo que será tratada. As composições podem ser adaptadas para aplicação direta ou para aplicação por meio de dispositivos de entrega de fármaco especiais tais como vestuários ou alternativamente emplastros, almofadas, esponjas, faixas ou outras formas de material flexivel adequado.

Doses e duração do tratamento

Será apreciado que os fármacos da combinação podem ser administrodas concomitantemente, seja na mesma ou em formulação farmacêutica diferente ou sequencialmente. Se houver administração sequencial, o atraso na administração do segundo (ou adicional) ingrediente ativo não deveria ser de modo a perder o beneficio do efeito eficaz da combinação dos ingredientes ativos. Uma exigência minima para uma 48 ΡΕ2282779 combinação de acordo com esta descrição é que a combinação deveria ser pretendida para uso combinado com o beneficio do efeito eficaz da combinação dos ingredientes ativos. 0 uso pretendido de uma combinação pode ser deduzido pelas instalações, condições, adaptações e/ou outros meios para ajudar que usam a combinação de acordo com a invenção.

Embora os fármacos ativos da presente invenção possam ser administrados em doses divididas, por exemplo, duas ou três vezes diariamente, uma única dose diária de cada fármaco nas combinações é preferencial, com uma única dose diária de todos os fármacos em uma única composição farmacêutica (forma de dosagem por unidade) sendo mais preferencial. 0 termo "forma de dosagem por unidade" refere-se a unidades fisicamente discretas (tais como cápsulas, comprimidos ou cilindros de seringa carregados) adequados como dosagens unitárias para indivíduos humanos, cada unidade contendo uma quantidade pré-determinada de material ativo ou materiais calculados para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico exigido.

Administração pode ser de uma a várias vezes por dia durante vários dias a vários anos e pode ser até mesmo para a vida do paciente. Crónico ou pelo menos periodicamente repetida a administração à longo prazo será indicada na maioria dos casos. 49 ΡΕ2282779

Adicionalmente, informação farmacogenómica (o efeito do genótipo na farmacocinética, farmacodinâmica ou perfil de eficácia de um terapêutico) sobre um paciente particular pode afetar a dosagem usada.

Exceto quando responder a prejuízos especialmente nos casos de doença de AD quando dosagens mais altas podem ser exigidas, a dosagem preferencial de cada fármaco na combinação irá recair normalmente dentro da faixa das doses não acima do usualmente prescrito para tratamento de manutenção à longo prazo ou provará estar seguro na grande fase 3 de estudos clínicos.

Por exemplo, a dosagem mais preferencial corresponderá a quantidades de 1% até 10% daquelas prescritas para tratamento de manutenção à longo prazo. • fenformina via oral de aproximadamente 0,5 a 5 mg por dia e rifabutina via oral de aproximadamente 6 a 60 mg por dia, • fenformina via oral de aproximadamente 0,5 a 5 mg por dia e arabitol via oral de aproximadamente 50 a 500 mg por dia, • tadalafil via oral de aproximadamente 0,05 a 0,5 mg por dia e omeprazol via oral de aproximadamente 0,4 a 4 mg por dia. • cilostazol via oral de aproximadamente 1 a 10 mg por dia e omeprazol via oral de aproximadamente 0,4 a 4 mg por dia. 50 ΡΕ2282779 • fenformina via oral de aproximadamente 0,5 a 5 mg por dia e dasatinib via oral de aproximadamente 1 a 10 mg por dia • dasatinib via oral de aproximadamente 1 a 10 mg por dia e acamprosato via oral de aproximadamente 7 a 70 mg três vezes diariamente, • desatinib via oral de aproximadamente 1 a 10 mg por dia e terbinafina via oral de aproximadamente 2,5 a 25 mg uma ou duas vezes diariamente,

Será entendido que a quantidade do fármaco administrado de facto será determinada por um médico, à luz das circunstâncias relevantes que incluem a condição ou condições a ser tratadas, a composição exata a ser administrada, a idade, peso e resposta do paciente individual, a severidade dos sintomas do paciente e a rota escolhida de administração. Portanto, as faixas de dosagens anteriores são pretendidas para proporcionar um guia geral e suporte para os ensinamentos neste documento, mas não pretendem limitar o escopo da invenção.

Exemplos

Validação do fármaco utilizando ensaios in vitro

Ensaios in vitro são uma ferramenta poderosa para aprimoramento de fármacos e suas combinações que agem em caminhos implicados na AD. Fármacos da presente invenção e as suas combinações são otimizados pela ação em ensaios in 51 ΡΕ2282779 vitro específicos, adaptados de acordo com a rede de AD identificada nesta invenção. Subsequentemente, estas moléculas ou as suas combinações poderiam ser testadas em modelo in vivo de AD.

Estes testes in vitro começaram com o estudo do nivel de expressão de gene APP seguido pelos ensaios do potencial de neuroproteção dos fármacos sobre células expostas a efeito tóxico da proteína Abeta. Os fármacos em caminhos implicados são testados individualmente, seguidos por ensaios de suas ações combinatórias. No estágio subsequente, as combinações mais eficientes que agem sobre os alvos nos caminhos individuais são combinados e testados em testes de neuroproteção.

Na AD, as formas da proteína agregadas de folha plissada de β insolúvel de proteína fibrilar Abeta (amilóide). A troca de conformação de formas solúveis para fibrilar parece ser um evento espontâneo, que aumentou com as maiores concentrações de Abeta, então qualquer produção de maiores quantidades de Abeta do que o normal (ou produção de formas solúveis de Abeta menore, maiores) tenderá a aumentar formação da placa. Uma vez que a placa Abeta tenha começado a se formar, outras moléculas podem interagir com a placa nascente para produzir eventualmente a placa madura, com suas áreas associadas de morte celular neuronal. Considerando isso, tem-se dado prioridade ao teste de efeitos dos fármacos sobre a viabilidade das células expostas à proteina β amilóide. 52 ΡΕ2282779

Cultura de células PC12: Células PC12 (Feocromocitoma de Rato, ATCC ref: CRL-1721) de ATCC (ATCC CRL-1721) foram rapidamente descongeladas em água a 37°C. 0 sobrenadante foi imediatamente colocado em 9 ml de um "meio de proliferação de PC12" que contém meio de Eagle modificado de Dulbecco DMEM-F12 (Pan Biotech ref: P04-41450) com 15% de soro de cavalo inati-vado pelo calor (Invitrogen ref: 16050-130), 2,5% de soro fetal bovino (FBS; Invitrogen ref: 16000-036), 1% de penicilina lO.OOOU/ml e lOmg/ml de Estreptomicina (PS; Pan Biotech ref: P06-07100) e 1% de L-glutamina 200 mH (Pan Biotech ref: P04-80100).

As células foram centrifugadas (800 voltas/min, 4°C durante 5 min) e adicionadas em 5 ml de "meio de proliferação de PC12", células viáveis foram contadas com uma célula de Malassez utilizando o teste de exclusão do vermelho neutro (Sigma).

Em seguida, as células foram cultivadas em 3.104 células por cm2 em "meio de proliferação de PC12" em frascos plásticos de 75 cm2 (Greiner Ref: 658175) pré-revestidas com poli-L-lisina (10pg/ml, Sigma Ref.: P2636).

O meio foi trocado a cada dois dias. Após três dias de cultura, quando as células atingiram 80% de confluência, elas foram lavadas em HBSS sem cálcio e magnésio (Pan Biotech Ref: P06-33500) e incubadas em tripsina EDTA 53 ΡΕ2282779 (0,05%, Pan Biotech Ref: P10-023100). A reação enzimática foi interrompida com o meio de proliferação de PC12 adicionado de 0,5 mg/ml de DNAse 1 grau 2 (Pan Biotech Ref: T60-37780100). Então, PC12 foram centrifugadas (800 vol-tas/min a 4°C durante 10 min) e as células foram cultivadas na densidade de 2,9 104 por cm2 em garrafa de cultura de 175 cm2 (Greiner Ref: 661195), pré-revestidas com poli-L-lisina.

Ensaio de viabilidade de MTT e intoxicação: Células PC12 (passagem #2) são cultivadas na base de 3300 células por cm2 em 96 poços/placa (Greiner Ref: 655 180) pré-revestidas com poli-L-lisina (Sigma) meio Neuro-basal (Invitrogen, Ref: 21103049) que contém B27 (2%, Invitrogen, Ref: 21103049), penicilina, (50 U/ml)-estrepto-micina (50 pg/ml) e glutamina (1%) e 50 ng/ml de NGF (Sigma Ref.: N1408). NGF permite PC12 diferenciar em células como neurónios.

Após 5 dias de cultura, o meio é trocado com neurobasal adicionado por NGF (50 ng/ml) , B27 sem anti- oxidante, glutamina e antibióticos. Após 24h, as células são incubadas durante 1 hora com fármacos a 5 concentrações, 6 poços por condições. Após uma hora de pré-incubação, as células são intoxicadas por 10μΜ de beta-amilóide (25-35; Sigma), juntamente com os fármacos no meio de cultura celular. 24h depois, as células são lavadas uma vez com PBS (Pan Biotech, Ref: P04-36100) e a sobrevivência 54 ΡΕ2282779 de células PC12 foi avaliada pelo teste de viabilidade MTT (3,[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difeniltetrazoliumbromida).

Cultura de Células neuronais Corticais

Neurónios corticais primários de rato são cultivados como descrito por Singer et al. 1999. Resumi damente, ratas grávidas de 15 dias de gestação são mortas por deslocamento cervical (ratos Wistar; Janvier) e os fetos removidos do útero. Os córtex são removidos e colocados em meio gelado de Leibovitz (L15; Invitrogen) que contém 1% de Penicilina-Estreptomicina (PS; Invitrogen) e 1% de albumina de soro bovino (BSA, Sigma) . Córtex são dissociados por tripsinisação durante 20 min a 37°C (Tripsina EDTA IX; Invitrogen) diluidos em PBS sem cálcio e magnésio. A reação é interrompida pela adição de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Invitrogen) que contém DNAase I grau II (0,1 mg/ml; Roche Diagnostic) e 10% de soro fetal de bezerro (FCS; Invitrogen). As células são, então, dissociadas mecanicamente por 3 passagens através de uma pipeta de 10 ml. As células são, então, centrifugadas a 180 x g durante 10 min a 10°C. O sobrenadante é descartado e as células de pelete são re-suspensas em um meio de cultura definido, que consiste de Neurobasal (Invitrogen) suplementado com B27 (2%; Invitrogen), L-glutamina (0,2 mM;

Invitrogen) , 1% da solução de PS e 10 g/ml de fator neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF, Pan Biotech). Células viáveis são contadas em um citômetro de Neubauer 55 ΡΕ2282779 utilizando o teste de exclusão de azul tripano. As células são cultivadas a uma densidade de 30.000 células/poço em placas de 96 poços (poços são pré-revestidos com poli-L-lisina (10 yg/ml, Sigma)) e são cultivadas a 37°C em ar umidificado (95%)/ Atmosfera C02 (5%).

Após 6 dias de cultura, as células são incubadas com os fármacos (5 concentrações) . Após 1 hora, as células são intoxicadas por 20 μΜ de β-amilóide (25-35; Sigma) em meio definido sem BDNF, mas juntamente com fármacos. Neurónios corticais são intoxicados durante 2 dias. BDNF (10 ng/ml) é utilizado como um controlo (neuroprotetor) positivo.

Ensaio de atividade de desidrogenase lática (LDH).

Depois de 2 dias de cultura, o supernatante é coletado e analisado com Kit de Detecção de Citotoxidade (LDH, Roche Apllied Sciences). Este ensaio colorimétrico para a quantificação de morte de célula é baseado na medição de atividade de desidrogenase lática (LDH) libertada do citosol de células danificadas dentro do supernatante. A densidade óptica (DO) é avaliada pelo espectrofotômetro a 4 92 nm de comprimento de onda por um aparelho multiscan (Thermo, Ref Ascent). Resultados são expressos em porcentagem de viabilidade de célula, comparada ao controlo negativo (veículo). 56 ΡΕ2282779

Resultados

Os resultados apresentados na figura 1 e 2 são extraídos de duas culturas independentes, 6 poços por condição. Todos os valores são expressos como meio ± s.e.m. Uma análise de teste t de Student bilateral é executada sobre dados grosseiros. Os resultados são expressos em porcentagem de comprimento de neurites, comparado ao controlo (veículo).

As células PC12 diferenciadas por NGF são incubadas com fármacos uma hora antes de intoxicação de Αβ25-35 ΙΟμΜ que dura 24 horas.

Um dia depois desta incubação, a viabilidade de PC12 diferenciadas por NGF é quantificada, utilizando ensaio de MTT. Os inventores observaram que 2 fármacos exercem claramente um efeito neuroprotetor contra esta intoxicação de Abeta 25-35 (fig 1) ·

Neurónios corticais primários de ratos são incubados com fármacos uma hora antes da intoxicação por Αβ25-35 20μΜ que dura 2 dias. Dois dias após esta incubação, libertação de LDH no meio de cultura é quantificado, que reflete o nível de morte celular. Os inventores observaram que 3 fármacos exercem claramente um efeito de proteção contra esta intoxicação por Αβ25-35 (Fig 2). 57 ΡΕ2282779

Testes in vivo

Compostos e as suas combinações ativas em testes in vitro foram testadas em modelo in vivo de doença de Alzheimer. Super expressão da doença de Alzheimer transgenes de precursor de beta proteina amilóide humana mutante (APP) ligados têm sido o meio de libertação mais seguro de promover disposição de Abeta em cérebros de ratos transgênicos que serviram como modelos da doença de AD em numerosos estudos. Conforme eles envelhecem, estes ratos de APP mutantes desenvolvem patologia amilóide robusta e outras caracteristicas como AD que incluem densidade sináptica diminuída, gliosis reativa e alguns déficits cognitivos. Muitos modelos de ratos de APP mutante mostram pequena evidência de perda neurónica manifesta e patologia de emaranhado neurofibrilar (NFT). Hemizigoto de ratos para este transgene BRI-Abeta42 são viáveis e férteis com um período de vida normal. BRI-Abeta42 mRNA transgênico é expressado em uma característica padrão do promotor de proteína príon de rato; níveis de expressão de transgene mais altos são detetados nas células de grânulo cerebelar e hipocampo, seguidos pelo córtex, ponte, tálamo e mesencéfalo. Na proteína de fusão transgênica, Abetal-42 é fundida à terminação C da proteína BRI no local de divisão como furina de modo que a divisão resulta em secreção de Abetal-42 eficiente dentro do lúmen ou espaço extracelular. Portanto, estes ratinhos expressam especificamente o isoforme de Abetal-42. Ratos de BRI-Abeta42 hemizigotos acumulam amilóide-beta insolúvel por detergente com idade e 58 ΡΕ2282779 desenvolvem placas desnucleadas no cerebelo nos primeiros 3 meses de idade. 0 desenvolvimento de patologia de pro-sencéfalo ocorre mais tarde, placas de Abeta extracelular não estão presentes consistentemente no hipocampo e córtices entorhinal/piriforme até 12 meses de idade. Depósitos de amilóide beta (placas desnucleadas) podem ser observados nos primeiros 3 meses na camada molecular de cerebelo de ratinhos transgênicos e se tornam mais pronunciados com a idade; placas extracelulares ocasionais são vistas nos córtices entorhinal/piriforme e hipocampo em 6 meses de idade, mas não são encontrados consistentemente até >12 meses de idade. Ratinhos mais velhos mostram patologia difundida com placas nucleadas e difusas no cerebelo, córtex, hipocampo e bolbo olfativo. Placas amilóides extracelulares mostram núcleos de amilóide densos com fibrilos de radiação; muitos feixes de neurites distróficos são observados na periferia destas placas. Gliosis reativo é associado com placas.

Tratamentos por fármacos 0 ratinho mc A12E Tg transgênico (Prnp-ITM2B/APP695M2) (43) foi obtido de Jackson Laboratory (http://j axmice.jax.org/strain/007002.html) . 0 descobridor do ratinho com os niveis de plasma de Abeta42 mais altos, linha BRI-Abeta42A (12e) , foi mantido em um campo de B6C3 misturado. Ratinho transgênico macho adulto tem acesso livre a comida e água. De acordo com um protocolo do Institutional Animal Care and Use Committee aprovado, 59 ΡΕ2282779 ratinhos foram pesados e injetados i.p. ou alimentados à força uma vez diariamente durante 10 a 20 semanas consecutivas com, seja uma solução de controlo (placebo) ou fármacos de PXT, preparadas em doses diferentes.

Análise de sobrevivência

Foram analisadas taxas de sobrevivência usando métodos de Kaplan-Meier. Métodos de Holm-Sidak (post hoc) foram usados para todos os testes de comparação múltiplos aos pares. As mortes estranhas foram censuradas. Todas as comparações foram feitas entre crias da mesma camada para limitar quaisquer efeitos confundiveis de diferenças de origem.

Testes comportamentais

Testes comportamentais foram projetados e conduzidos de acordo com os métodos publicados por vários autores (44-47).

Aprendizagem de espaço e memória no labirinto aquático de Morris (MWM)

Este ensaio é executado em uma piscina circular, 90 cm de diâmetro, feita de plástico branco e preenchida com água colorida láctea. Uma plataforma de fuga, 8 cm de diâmetro, feito de plástico claro foi submergida 0,5 cm abaixo do nível de água. Pistas visuais são proporcionadas 60 ΡΕ2282779 por formas geométricas diferentes impressas em papelão de tamanho A4 e colocadas sobre as quatro paredes circunvizinhas (distância da piscina foi de 50 a 70 cm) . A cada rato foram concedidas 4 tentativas diariamente (5- a 7 minutos de intervalo entre tentativas, um total de 16 tentativas) durante 4 dias. Cada tentativa foi executada a partir de um dos quatro pontos de partida diferentes. O movimento do ratinho é monitorado usando Software de Videotrack (Ponto de Visão). O tempo levado para localizar a plataforma de fuga (latência de fuga; até 60 segundos) foi determinado. Depois de localizar a plataforma ao rato foi permitido permanecer nesta durante 15 segundos. Os ratinhos que falharam em encontrar a plataforma dentro de 60 segundos foram guiados para ela e permitidos ficar nessa durante 15 segundos. Uma latência de 60 segundos é entrada no registro para tal ocorrência. Todas as quatro tentativas por dia foram calculadas a média para análise estatística com exceção da primeira tentativa no dia 1. No dia 9 (5 dias depois do último treinamento) os ratinhos foram sujeitados a uma tentativa de prova de 60 segundos na qual a plataforma é removida e os ratinhos são permitidos a procurar por ela. O tempo que cada animal perdeu em cada quadrante foi registrado (tempo de procura de quadrante). Vários grupos de ratinhos masculinos foram usados em 3, 7, 10 e 12 meses.

Alguns poucos ratinhos mostraram comportamento de frio (por exemplo, permanecendo imóvel na água e se recusando a nadar) que interferiu fortemente com o teste, estes animais foram excluídos da análise de dados. 61 ΡΕ2282779

Todos os testes comportamentais são conduzidos debaixo de um ambiente quieto de luz reduzida.

Teste de memória de trabalho em labirinto aquático de braço de Radial

Esta medida sensível baseada no cognitivo da memória de trabalho foi obtida com a ajuda do aparelho consistido de uma piscina preenchida com água de lOOcm de diâmetro (também usada para o labirinto aquático de Morris e tarefas de Reconhecimento de Plataforma) aparelhada com uma inserção de alumínio para criar seis braços de nado distribuídos radialmente. 0 teste consiste de cinco, tentativas de 1 min por sessão diária, durante 9-12 dias consecutivos. No começo de cada sessão, uma plataforma submergida clara é posicionada na extremidade de um dos seis braços de nado (alternadamente selecionado, trocado diariamente). Para cada uma das primeiras quatro tentativas de aquisição, o animal é colocado em um dos braços que não contém plataforma (sequência randomizada) e permitido procurar a plataforma. Durante a tentativa de 60 s, toda vez que o animal entra em outro braço que não contém plataforma, é gentilmente retornado à sua localização inicial e registrado um erro. Depois da quarta tentativa, o animal é permitido descansar durante 30 min, seguido por uma quinta (retenção) tentativa, que origina no final do braço que não contém plataforma. O número de erros (escolhas de braço incorretas) e latência de fuga (tempo 62 ΡΕ2282779 para chegar à plataforma, máximo 60 s) são registrados para cada tentativa.

Aprendizado de referência espacial e memória em teste de plataforma Circular

Este teste de tarefa baseada no cognitivo é executado com a ajuda do aparelho que consiste de uma plataforma circular de 69 cm de diâmetro que tem 16 buracos de "fuga" espaçados equidistantemente ao redor da circunferência. Um refúgio de fuga é instalado em baixo de um dos buracos, e uma cortina preta, sobre a qual são colocadas várias sugestões visuais, cerca a plataforma. O animal é colocado no centro da plataforma no começo de uma única, tentativa de 5 min. e estímulos aversivos (luzes brilhantes, vento de ventilador) são apresentados. 0 número total de erros (cabeça-empurrões nos buracos de não-fuga) e latência de fuga (tempo para alcançar o buraco de fuga) são registrados.

Habilidade de reconhecimento em teste de reconhecimento de Plataforma

Esta tarefa de procura baseada no cognitivo avalia identificação de objeto e habilidade de reconhecimento. O objeto alvo consiste em uma plataforma circular de 9 cm de diâmetro provida com uma bandeira preta de 10 cmx40 cm que é posicionada 0,8 cm sobre a superfície da água em uma piscina circular de 100 cm de diâmetro. O teste consiste de 63 ΡΕ2282779 quatro tentativas de 60 s por dia em cada um dos quatro dias consecutivos. Em cada dia, o objeto alvo é colocado em um quadrante diferente da piscina para cada tentativa e o animal é libertado no mesmo local ao longo da circunferência da piscina para todas as quatro tentativas. A latência total (máximo 60 s) é registrada para cada tentativa.

Exame de Irwin modificado

Uma tela compreensiva, modificada de Irwin, é usada para determinar se quaisquer dos ratinhos exibiram prejuízos fisiológicos, comportamentais ou sensório-motores relacionados aos seus genótipos. Para explorar habilidades motoras, coordenação e força muscular, os ratinhos são colocados em um arame que foi apertado entre duas colunas de 30 cm de altura e suas habilidades para se equilibrar no arame é avaliada. Além disso, a suas habilidades para agarrar e esperar sobre o arame com todas as quatro patas durante pelo menos 5 segundos e escalar para trás sobre o arame é determinada.

Quantificação do depósito amilóide vascular

Para quantificação de angiopatia amilóide cerebral (CAA), secções incorporadas por 5 ym de parafina em intervalos de 30 ym através das leptomeninges do córtex cerebelar ou parietal são imunocoradas com anticorpo de Ab9 biotinilado (anti-ΑβΙ-Ι6, 1:500) durante a noite à 4°C (n = 64 ΡΕ2282779 5-7 ratinhos por genótipo em cada grupo etário, n = 6 secções por ratinho). Recipientes de sangue colorados positivamente são avaliados usando o sistema de pontuação de Vonsattel modificado (36). A pontuação da severidade de CAA é calculada multiplicando o número de recipientes de CAA com o grau de severidade de CAA.

Histologia: Imuno-histoquímica e Imunofluorescência

Ratinhos Tg e WT de 3 a 12 meses são anestesiados e perfundidos transcardialmente sequencialmente com NaCl 0,9% e paraformaldeido 4% em 0,1 mol/L de salino fosfato tampão (PBS) (pH 7,4) ou formalina 10% e paraformaldeido 4% em 0,1 mol/L de PBS (pH 7,4). Cérebros e espinhas dorsais são removidas e armazenadas em paraformaldeido 4%. Algumas amostras são incorporadas em parafina e cortadas sobre um micrótomo deslizante a uma espessura de 10 ym. CriosecçÕes (14 ym) são cortadas sobre um criostato e montadas em cromo alume revestido deslizante. Peroxidase endógena é extinta tratando a secção com metanol que contém 0,3% de H202, durante 30 minutos. São bloqueadas secções em soro de cavalo 10%.

Anticorpos primários são usados e incubados durante a noite à 4°C na presença de soro de cavalo 1%. Todos os biotinilados secundários ou fluoresceina-, Vermelho Texas- e anticorpos acoplado por AMCA, fluorocromos, kit ABC e 3,3'- diaminobenzidina como cromogeno para atividade de peroxidase são de Vector Laboratories. Incubação com o 65 ΡΕ2282779 anticorpo secundário é mantido à temperatura ambiente durante 1 hora. Todas as etapas de lavagem (3 - 10 minutos) e diluição de anticorpos são executadas usando salina de fosfato-tampão (0,1 mol/L PBS, pH 7,4) ou salina de Tris-tampão (0,01 mol/L Tris, 0,15 mol/L NaCl, pH 7,4). Incubação com o complexo de ABC e detecção com 3,3'-diaminobenzidina é transportada para fora, de acordo com o manual do fabricante. Contagem de coloração de hematoxilina é executada de acordo com procedimentos padrões. Um minimo de três ratinhos por genótipo, idade e sexo é usado para cada determinação (49).

Preparação dos Extratos de Cérebro. Cérebros são rapidamente colhidas sobre gelo entre 90 e 120 min após a última injeção e congelados a -80°C. O hemisfério direito do cérebro de cada rato é pesado após o congelamento. Análise da massa do hemisfério por desvio absoluto médio nos permite excluir as amostras que estão além de 4 desvios absolutos médios a partir do resto do conjunto. Hemisférios cerebrais são homogeneizados e lisados de células que contêm proteínas completas são preparados de acordo com as instruções do fabricante dos kits de ensaio enzimático (R&D Systems, Inc.). Em resumo, os córtex cerebrais são homogeneizados em 800 μΐ de sal contendo lx tampão de extração (kit R&D) e incubados em gelo por 10 min. Os homogeneizados são então centrifugado a 13.000 g por 15 min a 4°C. A concentração de proteínas em cada amostra é estimado de acordo com ensaio biureto 66 ΡΕ2282779 derivado (Pierce) . Níveis de APP, Αβ40, e Αβ42 são medidos por técnicas de imunotransferência Western e de sanduíche ELISA, respetivamente, como descrito (41). Além disso, atividades de α-, β- e γ- secretases podem ser medidas a partir dos mesmos extratos.

Ensaio dos Niveis de APP total em Extratos de Córtex Cerebral de Ratos

Um montante de proteínas iguais de extratos de cérebro é carregado em cada gel, 30 pg por pista, por exemplo. Cada gel continha oito tratamentos: controlo; fármacol dose de 7,5 mg/kg; e fármaco2 dose em várias doses. Para minimizar a variação intra-gel, cada gel continha três conjuntos de todos os grupos de tratamento. Cada transferência é sondada com anticorpo 22C11. Cada transferência também é sondada com o anticorpo β-actina para a normalização para a eficiência da transferência. A intensidade do sinal de banda APP é normalizada com a da β-actina. Dois "controlos" de amostra são carregados em cada gel/transferência para testar a variação da transferência para transferência. Análise de transferências é feita de duas maneiras: por transferência (n = 3), para testar a variação do gel no gel; e transferências combinadas (n = 9 ou 10) conforme descrito (50-51). Análise por transferência com n = 3 mostra a mesma tendência que a análise final com n = 9 ou 10. Os resultados da análise combinada são apresentados. 67 ΡΕ2282779 ELISA Αβ sanduíche

Para ELISA Αβ de cérebro, níveis de Αβ prosen-céfalo e rombencéfalo são determinados de forma independente, e o bolbo olfatório é excluído da análise. Para a análise de plasma Αβ, o sangue é coletado em tubos de revestidos de EDTA após a punção cardíaca. Amostras de sangue são centrifugadas a 3000 rpm por 10 min a 4°C, e o plasma é separado em alíquotas e estocado a -80°C até ser utilizado. Níveis Αβ são determinados por ELISA sanduíche específico de terminal usando Ab9 (anti-ΑβΙ-Ιδ Ab) como a captura de Ab para Αβ40, 13.1.1-HRP (3ηίί-Αβ35-40 Ab) como a detecção de Ab para Αβ40, 2.1.3 (anti-Aip5-42 Ab) como a captura Ab para Αβ42 e Ab9-HRP como detecção Ab para Αβ42 (n = 5-7 ratos por genótipo, em cada grupo etário). Níveis Αβ são normalizados aos resultados anteriores com os mesmos conjuntos de ratos como controlos internos para minimizar a variabilidade ELISA potencial, como descrito (41).

Tranferência Western

Amostras de prosencéfalo Snap-congeladas são homogeneizadas em tampão (Boston bioprodutos, Worcester, MA) de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) com a mistura de 1% de mistura do inibidor de protease (Roche) . O homogeneizado é centrifugado a 100.000 x g por lha 4°C. O teor de proteína no sobrenadante é determinado através do ensaio da proteína BCA (Pierce). Amostras de proteínas (20 68 ΡΕ2282779 μg) são executadas em géis 12% Bis-Tris XT ou géis 4-12% Bis-Tris XT (Bio-Rad, Hercules, CA) e transferidas para membranas de nitrocellose de 0,2 μιη. Transferências são submetidas a microondas por 2 min em PBS de 0,1 M duas vezes e sondados com Ab 82E1 (anti-ΑβΙ-Ιβ, 1 : 1000; IBL, Gunma, Japão) e aminoácidos 20 terminal C anti-APP (1:1000) como descrito (41). Transferências são stripped e novamente sondados com anti β-actina (1:1000, Sigma) como um controlo de carga. A intensidade relativa da banda é medida usando o software ImageJ.

Quantificação da deposição de amilóide no parênquima

Os hemi-cérebros são fixados em imersão de formol 10% e processados para incorporação em parafina. Secções de tecido cerebral (5 pm) foram imunocontrastados com anticorpo Αβ anti-total (Ab) . As secções são contrastadas com hematoxilina. Seis secções por cérebro através do hipocampo, córtex piriforme (bregma, -1,70 a -2,80 mm), ou cerebelo (paraflocculus, crus ansiformes, e lóbulos simples; bregma, -5,40 a -6,36 mm) são usadas para quantificação (n = 5-7 ratos por genótipo em cada faixa etária). A carga da placa Αβ é determinada utilizando software MetaMorph (Molecular Devices, Paio Alto, CA). Para a quantificação de placas tubulares, secções seriais daquelas analisadas para carga Αβ são contrastados com tioflavina S (ThioS), e é contado o número de placas ThioS positivas no hipocampo, córtex entorrinal/ piriforme, ou 69 ΡΕ2282779 cerebelo. Todas as análises acima são realizados de forma cega.

Análise estatística de em Dados in vivo.

Resultados de todos os ensaios são analisados com STATISTICA 8.0 (StatSoft). Níveis Αβ, carga de placas amilóides e severidade de CAA são analisados usando ANOVA com o teste de comparação múltipla Holm-Sidak post hoc ou o teste de t de Student de duas caudas. Se o ajuste de dados não encontra as suposições do teste paramétrico, tanto o teste de Kruskal-Wallis seguido pela comparação múltipla de Dunn post hoc quanto o teste de soma dos postos de Mann-Whitney é executado. Para testar se os níveis Αβ nos ratos bitrangênicos foram consistentes em relação a uma soma aditiva de níveis Αβ nas crias transgênicas individuais da mesma camada, é usada uma regressão linear múltipla ratos sem interceptação. Todas as comparações são feitas entre crias da mesma camada. A modelagem da resposta de fármaco é feita excluindo as amostras de controlo (0 mg/ kg) . ED50 corresponde à dose (mg/kg) exigida para induzir resposta 50% da resposta máxima induzida por fármaco nos ensaios. É calculado utilizando o modelo de equação de Hill para o log de ED50. 70 ΡΕ2282779

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Lisboa, 22 de maio de 2013

Claims

ΡΕ2282779 1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição, que compreende sulfisoxazole ou um seu sal ou uma sua formulação de libertação prolongada, para utilização no tratamento da doença de Alzheimer.
2. Composição para utilização da reivindicação 1, que compreende adicionalmenteu pelo menos um composto selecionado do grupo de acamprosato, amlodipina, cilos-tazol, leflunomida, metimazole, fenformina, prilocaína, tadalafil, terbinafina, zonisamida e rifabutina, seus sais ou suas formulações de libertação prolongada, para administração combinada, separada ou sequencial com sulfisoxazole.
3. Composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que compreende um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
4. Composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida composição é administrada repetidamente ao indivíduo.
5. Composição, que compreende sulfisoxazole ou um seu sal ou uma sua formulação de libertação prolongada, 2 ΡΕ2282779 o efeito doença de para utilização para proteger neurónios contra tóxico do péptido Abeta num indivíduo tendo Alzheimer. Lisboa, 22 de maio de 2013