PT2270508E - Método de ensaio de membrana e kit - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Método de ensaio de membrana e kit"

CAMPO TÉCNICO 0 presente invento refere-se a um método de ensaio para detectar ou quantificar uma certa substância numa amostra utilizando um dispositivo de ensaio equipado com uma membrana, especificamente a um método de ensaio simples de membrana que pode ser utilizado clinicamente e a um kit utilizado para este método.

ESPECIALIDADE ANTERIOR

Recentemente, têm sido desenvolvidos reagentes ou kits de ensaio simples onde vários itens de medição incluindo a infecção com patogénios tais como virus e bactérias, a presença de gravidez e o nível de açúcar no sangue podem ser detectados ou quantificados num curto período de tempo desde alguns minutos até várias dezenas de minutos utilizando reacções antigénio-anticorpo, reacções enzimáticas e outras. Proteínas que compõem patogénios, gonadotrofina coriónica humana (hCG), açúcar no sangue e outros são os sujeitos da detecção ou quantificação. A maioria dos reagentes de ensaio simples têm as características de não requererem qualquer equipamento especial, as suas operações são também fáceis e são de preço baixo. Por exemplo, um reagente de ensaio simples para diagnóstico da gravidez é comercializado em farmácias como de venda livre (OTC, "over-the-counter"). Os reagentes de ensaio simples medindo a infecção por patogénios são também amplamente utilizados em hospitais gerais e clínicas, para além de em grandes hospitais e centros de diagnóstico clínico, ao contrário de outros reagentes de ensaio. Estes locais são frequentemente as instituições médicas que os pacientes visitam primeiro. Se a presença de infecções em amostras colhidas a partir de pacientes pudesse ser aí clarificada então o tratamento terapêutico poderia ser aplicado em etapas iniciais dos sintomas. A importância destes reagentes ou kits de ensaio simples na área médica está por isso a aumentar cada vez ma is. 2 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ

Presentemente, métodos de ensaio de membrana, especificamente métodos de ensaio utilizando uma membrana tal como uma película ou filtro de nitrocelulose e outros, são geralmente conhecidos como métodos de teste simples, sendo grosseiramente classificados em métodos de ensaio de membrana do tipo fluxo atravessante e do tipo fluxo lateral. 0 primeiro é um método onde uma solução contendo uma substância ou um analito a ser examinada é feita passar verticalmente através de uma membrana revestida com uma substância para detectar o referido analito e o segundo é um método revelado numa direcção lateral. Em ambos os métodos, existe um ponto em comum que é a detecção ou quantificação de um analito numa amostra ser realizada por formação de um complexo de uma substância imobilizada sobre a membrana que especif icamente se liga ao analito, o analito e uma substância marcada que especificamente se liga ao analito sobre uma película, e depois detecção ou quantificação da referida substância marcada.

Porém, quando uma amostra colhida na prática a partir de um paciente é analisada por um tal método de ensaio simples de membrana utilizando membranas ou filtros, pode ocorrer o assim chamado "falso positivo" ou "positividade falsa", que é uma análise considerada positiva apesar da ausência de um analito na amostra. A ocorrência de uma reacção positiva falsa durante a medição da infecção com patogénios conduz a informação errada sobre o paciente. Por este motivo, não apenas a especificação da causa pode ser retardada, mas também pode ser empreendido um tratamento inapropriado conduzindo a sérias consequências tais como agravamento da condição de uma doença para mais severa. Por conseguinte, a supressão de uma reacção positiva falsa é uma questão extremamente importante em face do principal propósito da utilização de um método de ensaio simples.

Até agora, para um assim chamado imunoensaio, foram noticiados um método com diluição da amostra com um tampão contendo um tensioactivo (por exemplo, JP-A-9-501494), um método com absorção por um filtro absorvente contendo um tensioactivo (por exemplo, JP-A-2000-502452) e outros, mas estes não têm sido suficientes (o termo "JP-A" como aqui 3 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ utilizado significa "um pedido de patente Japonesa publicado não examinado"). S.P. Tucker et al. descrevem um imunoensaio óptico da gripe (ThermoBioStar's FLU OIA) como uma ferramenta de diagnóstico para gestão melhorada da influenza em Phil. Trans. R. Soc. Lond. B, vol. 356, 2001, páginas 1915-1924. A US 5 202 267 revela um procedimento de imunoensaio para detecção de analitos na urina onde é conduzida uma reacção imunológica numa fase aquosa contendo a urina e forma-se um imunocompósito filtrável contendo uma partícula de sol de ouro inerentemente colorida se o ensaio for positivo. O imunocompósito contendo a partícula colorida de sol de ouro é recolhido para observação visual directa sobre um elemento de filtro. Leituras positivas falsas são minimizadas por (1) remoção de contaminantes da urina para prevenir a oclusão do elemento de filtro e a ligação não específica de reagentes não reagidos ao mesmo por contacto da urina com um elemento de contacto poroso possuindo um material detergente disperso sobre as suas superfícies externas e intersticiais; (2) prevenção da ligação não específica de substâncias imunorreactivas não reagidas ao elemento de filtro bloqueando este último com polivinilpirrolidona; e/ou (3) inclusão de um material de pigmento verde na fase reaccional aquosa para melhorar a distinção óptica, após lavagem do filtro de recolha, entre resultados negativos e positivos sobre o filtro.

Um método de medição específico é revelado na JP2000088851. Neste método um membro de retenção de um filtro de pré-tratamento está unido a um recipiente e uma solução de amostra contendo um antigénio, i.e., uma substância a ser medida, é alimentada ao filtro de pré- tratamento. Faz-se passar a solução de amostra filtrada pelo filtro de pré-tratamento através de uma matriz de reacção que retém um anticorpo. O antigénio é capturado pela matriz de reacção e a solução de amostra que se fez passar através da matriz é absorvida por um material absorvente. O anticorpo marcado é fornecido através do filtro de pré- tratamento e é ligado ao antigénio capturado pela matriz de reacção. Depois, o membro de retenção do filtro de pré- 4 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ tratamento é removido e um líquido de lavagem apropriado é fornecido a partir de uma abertura para lavar a matriz de reacção. A WO 87/01393 refere-se a um teste de aglutinação específico de extracção de estreptococos na forma seca com ácido micronitroso.

Um agente de pré-tratamento específico para um fluido de um sujeito num teste de gravidez imunológico é revelado na US 4 270 923. 0 agente de pré-tratamento consiste essencialmente de uma fibra de resina de permuta de catiões do tipo ácido carboxílico ou uma fibra de vidro siliciada, que se afirma que remove os componentes interferentes e os elementos de turbidez presentes no fluido do sujeito.

REVELAÇÃO DO INVENTO

Um objectivo do presente invento é proporcionar um método de ensaio simples para testar uma amostra utilizando um método de ensaio de membrana, onde o método pode inibir a ocorrência de positividade falsa e pode detectar ou quantificar um analito com elevada exactidão, e um kit utilizado num tal método.

Na detecção e quantificação de um analito utilizando um método de ensaio de membrana, constatou-se que a ocorrência de positividade falsa pode ser grandemente inibida por filtração de uma possível amostra contendo o analito através de um filtro.

Isto equivale a dizer que, um objectivo do presente invento pode ser conseguido por um método de ensaio de membrana para detectar ou quantificar um analito numa amostra utilizando um dispositivo de ensaio equipado com uma membrana à qual está ligada uma substância de captura para capturar o analito, compreendendo os passos de: filtrar a amostra utilizando um filtro que está ligado à ponta de um tubo de filtro, deixar cair gota a gota o filtrado sobre a membrana, e detectar ou quantificar a presença do analito na amostra, onde a amostra foi colhida a partir da faringe ou cavidade 5 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ nasal de um paciente ou é um aspirado da cavidade nasal, e onde o tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas do filtro é de 0,2 a 8,0 pm.

Adicionalmente, um objectivo do presente invento pode ser conseguido por um kit de ensaio de membrana para detectar ou quantificar a presença de um analito numa amostra, onde a amostra deve ser colhida a partir da faringe ou cavidade nasal de um paciente ou é um aspirado da cavidade nasal, onde o kit compreende: (1) um filtro para filtrar a amostra, onde o filtro está ligado à ponta de um tubo de filtro; e (2) um dispositivo de ensaio equipado com uma membrana à qual está ligada uma substância de captura para capturar o analito; onde o tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas do filtro é de 0,2 a 8,0 pm.

Outra concretização refere-se ao método ou kit acima mencionados, caracterizados por o material do filtro ser seleccionado entre o grupo consistindo de tecido não tecido, papel, fibra de vidro, fibra de sílica, nitrocelulose, éster de celulose, uma mistura de nitrocelulose e éster de celulose, poliétersulfona, polissulfona, politetrafluoroetileno, poli(fluoreto de vinilideno), policarbonato, polipropileno, poliamida, nylon 6,6, poliéster, algodão, fibra de aço inoxidável e uma sua combinação.

Uma concretização preferida é o método ou kit acima mencionado, onde o tamanho de poro do filtro ou o tamanho de retenção de partículas do referido filtro é de 0,2 a 4,0 pm, mais preferivelmente de 0,2 a 2,0 pm, e muito preferivelmente de 0,2 a 0,6 pm tendo em vista o efeito do presente invento.

Além disso, outra concretização preferida de acordo com o presente invento é o método ou kit acima mencionado, onde o referido filtro é um filtro de fibra de vidro, um filtro de nitrocelulose, ou uma combinação de filtro de fibra de vidro e filtro de nitrocelulose. 6 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ

Além disso, outra concretização preferida de acordo com o presente invento é o método ou kit acima mencionado, onde o material da referida membrana é seleccionado entre o grupo consistindo de tecido não tecido, papel, nitrocelulose, fibra de vidro, fibra de sílica, éster de celulose, poliétersulfona, polissulfona, politetrafluoroetileno, poli(fluoreto de vinilideno), policarbonato, polipropileno, poliamida, nylon 6,6 e uma mistura de éster de celulose e nitrocelulose, e o tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas da referida membrana é não inferior ao tamanho de poro ou ao tamanho de retenção de partículas do referido filtro e é de 0,3 to 15 pm.

Outra concretização mais preferida de acordo com o presente invento é o método ou kit acima mencionado, onde o material da membrana acima mencionado é nitrocelulose e o seu tamanho de poro é de 0,4 a 12 pm.

Além disso, outra concretização preferida de acordo com o presente invento é o método ou kit acima mencionado, onde o referido analito na amostra é um vírus influenza.

Adicionalmente, uma concretização particularmente preferida de acordo com o presente invento é o método ou kit acima mencionado compreendendo um método de ensaio simples de membrana ou kit do tipo de fluxo atravessante ou do tipo de fluxo lateral.

No caso de um método de ensaio de membrana ou kit de ensaio do tipo de fluxo atravessante, o tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas do filtro é preferivelmente de 0,2 a 4,0 pm, mais preferivelmente de 0,2 a 2,0 pm, e muito preferivelmente de 0,2 a 0,6 pm. No caso de um método de ensaio de membrana ou kit de ensaio do tipo de fluxo lateral, o tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas do filtro é preferivelmente de 0,2 a 4,0 pm, mais preferivelmente de 0,2 a 2,0 pm, e muito preferivelmente de 0,2 a 0,6 pm.

De acordo com o método do presente invento, num método de ensaio simples de membrana utilizando um dispositivo de ensaio equipado com uma membrana à qual está ligada uma 7 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ substância de captura para capturar um analito, a ocorrência de positividade falsa poderá ser grandemente diminuída. A justificação para o efeito será considerada como se segue mas não limitada ao mesmo. Num método de ensaio simples de membrana utilizando um dispositivo de ensaio equipado com uma membrana à qual está ligada uma substância de captura para capturar um analito, uma amostra é colhida esfregando o local onde se prevê que exista o analito, i.e. a faringe ou cavidade nasal de um paciente, e suspende-se a amostra num tampão, ou uma porção de secreção ou excreção contendo o analito, i.e. descarga nasal, é colhida e diluída com um tampão para preparar uma amostra para o ensaio de membrana. Neste caso, para além dos materiais a medir, células arrancadas do local de amostragem, ou componentes da secreção ou excreção podem estar a contaminar a referida amostra. Porque um tal contaminante contém vários componentes biológicos incluindo uma substância viscosa tal como proteoglicano e glicolípido, se a referida amostra for adicionada sobre uma membrana directamente, alguns componentes podem aderir sobre ou no interior da membrana. Quando se adiciona um componente com um tamanho equivalente ao tal tamanho de poro ou tamanho de retenção de partículas, considera-se que o componente pode bloquear os poros na membrana e depois inibir o movimento dos ingredientes na solução. Considera-se que podem ocorrer reacções não específicas devido a um tal fenómeno e então pode ocorrer a assim chamada positividade falsa, onde se pensa ter um resultado positivo apesar da ausência do analito na amostra. Esta positividade falsa poderá ser inibida eficazmente de acordo com o método do presente invento, e então poderá ser estabelecido um método de ensaio simples altamente fiável.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é uma projecção horizontal de um dispositivo de ensaio de membrana do tipo de fluxo atravessante que é uma concretização de acordo com o presente invento. A Figura 2 é uma vista em corte através de um plano de corte definido pela linha I-I' da Figura 1. A Figura 3 mostra uma concretização de um tubo de filtro para amostra utilizado no presente invento. 8 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ A Figura 4 mostra uma vista em perspectiva da peça da ponta do tubo de filtro para amostra da Figura 3. A Figura 5 é uma projecção horizontal de um dispositivo de ensaio de membrana do tipo de fluxo lateral que é uma concretização de acordo com o presente invento. A Figura 6 é uma vista em corte através de um plano de corte definido pela linha 11-11' da Figura 5.

Em cada Figura, cada sinal refere-se ao seguinte: A: orifício, B: orifício, a: adaptador, b: membrana, c: almofada de absorção de líquido, d: peça da ponta do tubo de filtro, e: peça do corpo do tubo de filtro, f: filtro, g: almofada de recepção de amostra, h: almofada de recepção de substrato, i: almofada de absorção, j: membrana de nitrocelulose, k: linha revestida com anticorpo monoclonal NP antivírus influenza do tipo B, 1: linha revestida com anticorpo monoclonal NP antivírus influenza do tipo A, m: folha de suporte.

MELHOR MODO PARA REALIZAR O INVENTO O presente invento é descrito em detalhe abaixo. Método de ensaio simples de membrana O método de acordo com o presente invento é um método de ensaio simples de membrana para detectar ou quantificar um analito numa amostra utilizando um dispositivo de ensaio equipado com uma membrana à qual está ligada uma substância de captura para capturar o analito, caracterizado por a amostra ser filtrada utilizando um filtro que está ligado à ponta de um tubo de filtro, seguindo-se deixar cair gota a gota o filtrado sobre a referida membrana e depois a presença do analito na referida amostra é detectada ou quantificada. Neste método a amostra foi colhida a partir da faringe ou cavidade nasal de um paciente ou é aspirado da cavidade nasal, e o tamanho de poro ou tamanho de retenção de partículas do filtro é de 0,2 a 8,0 pm. 9 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ

Como aqui utilizado, "um método de ensaio simples de membrana" refere-se a um método onde a presença de um analito numa amostra é testada simplesmente num curto período de tempo utilizando um dispositivo de ensaio compreendendo uma membrana na qual uma substância de captura que especificamente se liga ao analito está na fase sólida. Tipicamente, é um método onde se faz reagir um analito com a referida substância de captura e um reagente de detecção marcado para formar um complexo em sanduíche sobre a membrana, e depois detecta-se a presença deste complexo por detecção do referido marcador. Os exemplos de reacção do analito com a referida substância de captura ou reagente de detecção marcado incluem reacção de antigénio-anticorpo, outra reacção entre aceitador e receptor, reacção de ligação específica entre biotina e avidina, reacção entre ADNs possuindo sequências complementares uns com os outros e outras. Além disso, o método de ensaio simples de acordo com o presente invento pode ser utilizado para qualquer tipo de analito ou pode utilizar qualquer tipo de membrana ou de substância marcada sem limitação desde que sejam utilizados num tal método. 0 método de ensaio de membrana de acordo com o presente invento é preferivelmente seleccionado entre dois tipos de métodos de ensaio de membrana, um dos quais é um método de ensaio de membrana do tipo de fluxo atravessante e o outro é um método de ensaio de membrana do tipo de fluxo lateral, porque estes métodos são simples e rápidos. O método de ensaio de membrana do tipo de fluxo atravessante é um método onde se faz passar uma solução contendo um analito verticalmente através de uma membrana possuindo uma substância de captura imobilizada sobre a mesma, que se liga especificamente ao analito ou uma substância para detectar o analito. Neste método, a detecção ou quantificação do analito é conduzida por formação de um complexo da substância de captura que se liga especificamente ao analito, o analito e a substância marcada que se liga especificamente ao analito sobre a membrana, seguindo-se detecção ou quantificação do marcador. 0 método de ensaio de membrana do tipo de fluxo lateral é diferente do método de ensaio de membrana do tipo de fluxo atravessante pelo facto de utilizar uma membrana similar para revelar a solução 10 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ contendo ο analito na direcção lateral em contraste com a membrana, mas o seu princípio de detecção é similar ao do método de ensaio de membrana do tipo de fluxo atravessante.

Um exemplo de procedimentos concretos para o método de acordo com o presente invento é mostrado abaixo para ilustrar o presente invento. (1) Uma amostra colhida a partir da faringe ou cavidade nasal de um paciente infectado com vírus, bactéria ou outro é suspensa numa suspensão de amostra como descrito abaixo. (2) A suspensão é colocada num tubo de filtro para amostra equipado com um filtro na ponta do tubo de filtro e é filtrada através do filtro. (3) Deixa-se cair o filtrado gota a gota sobre a membrana, à qual está ligada uma substância de captura que se liga especificamente ao analito num dispositivo de ensaio equipado com a membrana para capturar o analito, e depois deixa-se o analito ser capturado sobre a membrana. (4) Deixa-se cair gota a gota um reagente de detecção marcado que se liga especificamente ao analito sobre a referida membrana para formar sobre esta um complexo da substância de captura / analito / reagente de detecção marcado. (5) A presença do analito na amostra é determinada por detecção da presença do complexo através do reagente de detecção marcado no referido complexo.

Filtro

No método de acordo com o presente invento, uma amostra colhida a partir de um paciente é dissolvida ou suspensa numa solução para dissolução ou suspensão de uma amostra seguindo-se filtração da suspensão ou solução utilizando um filtro. 0 tamanho de poro (diâmetro) do filtro ou o tamanho de retenção de partículas do filtro é de 0,2 a 8,0 pm, preferivelmente de 0,2 a 4,0 pm, mais preferivelmente de 0,2 a 2,0 pm, e muito preferivelmente de 0,2 a 0,6 pm. Além disso, no método de ensaio de membrana do tipo de fluxo atravessante e no kit de ensaio de membrana do tipo de fluxo atravessante, o tamanho de poro (diâmetro) ou o tamanho de retenção de partículas do filtro é em particular preferivelmente de 0,2 a 4,0 pm, mais preferivelmente de 0,2 11

ΕΡ 2 270 508/PT a 2,0 μιη, e muito preferivelmente de 0,2 a 0,6 pm. Adicionalmente, no método de ensaio de membrana do tipo de fluxo lateral e no kit de ensaio de membrana do tipo de fluxo lateral, o tamanho de poro (diâmetro) ou o tamanho de retenção de partículas do filtro é de 0,2 a 8,0 pm, preferivelmente de 0,2 a 4,0 pm, mais preferivelmente de 0,2 a 2,0 pm, e muito preferivelmente de 0,2 a 0,6 pm. O tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas do filtro é importante para efeito do presente invento. Se o tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas do filtro for demasiado grande, em alguns casos, pode ocorrer uma ligação não especifica sobre a membrana para resultar numa positividade falsa. Inversamente, se for demasiado pequeno, o próprio filtro pode ficar entupido devido a quaisquer substâncias viscosas ou aglomerados presentes na amostra resultando em filtração impraticável, ou a área de filtro tem de ser relativamente alargada. Isto não é adequado considerando o propósito do filtro de ser utilizado para um método de teste simples.

Pode-se utilizar não apenas um tipo de filtro, mas também uma combinação de filtros cujos materiais e/ou o tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas são diferentes uns dos outros. No caso de se utilizar um filtro de combinação (isto é, vários filtros numa forma combinada) , o tamanho de poro mais pequeno ou o tamanho de retenção de partículas mais pequeno entre os vários filtros é considerado o tamanho de poro ou tamanho de retenção de partículas do filtro de combinação. Então, se pelo menos um filtro num filtro de combinação tiver o tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas dentro de 0,2 a 8,0 pm, preferivelmente de 0,2 a 4,0 pm, mais preferivelmente de 0,2 a 2,0 pm, e muito preferivelmente de 0,2 a 0,6 pm, não existe qualquer problema mesmo se o tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas dos outros filtros no filtro de combinação estiverem para além do referido intervalo.

Adicionalmente, uma combinação de dois ou mais dos mesmos filtros proporciona uma vantagem de ser possível obter um certo efeito mesmo se se utilizarem filtros cujo 12 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ tamanho de poro ou tamanho de retenção de partículas varia grandemente. Adicionalmente, quando se utilizam quaisquer filtros de resistência inadequada, podem-se acumular dois ou mais filtros para aumentar a resistência do filtro resultante. A acumulação de múltiplos filtros, porém, tem também uma desvantagem de o filtro resultante poder ser facilmente entupido, a pressão para filtrar aumenta e então perde-se a simplicidade, dependendo do tipo de filtro. O material do filtro inclui, mas não está limitado a, tecido não tecido, papel, fibra de vidro, fibra de sílica, nitrocelulose, éster de celulose, uma mistura de nitrocelulose e éster de celulose, poliétersulfona, polissulfona, politetrafluoroetileno, poli(fluoreto de vinilideno), policarbonato, polipropileno, poliamida, nylon 6,6, poliéster, algodão, fibra de aço inoxidável e outros. Preferem-se fibra de vidro e nitrocelulose.

Os filtros estão geralmente divididos em filtros de profundidade e filtros de tela dependendo do mecanismo de recolha. O filtro de profundidade é o que recolhe a matéria sólida no seu interior, enquanto o filtro de tela é o que recolhe a matéria sólida sobre a superfície do filtro. Preferivelmente podem-se utilizar filtros com ambos os mecanismos.

Tubo de filtro O filtro anterior é fixado à ponta de um tubo de filtro para amostra a utilizar no método de ensaio simples de membrana ou kit de acordo com o presente invento. Isto equivale a dizer, um método onde uma amostra suspensa numa suspensão é colocada no interior do tubo de filtro, filtrada através do filtro fixado à ponta do tubo de filtro, e depois o filtrado é deixado cair gota a gota sobre a membrana no dispositivo de ensaio de membrana, é simples e preferível. Os diagramas esquemáticos de uma concretização deste tubo de filtro são apresentados na Figura 3 e na Figura 4. O tubo de filtro é uma forma consistido de uma peça da ponta e de uma peça do corpo, por exemplo, como descrito na Figura 3. Um filtro está montado no interior da peça da ponta, como se mostra na Figura 4. Uma suspensão de amostra é colocada na 13 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ peça do corpo e a peça da ponta equipada com o filtro é fixada à peça do corpo. A amostra é filtrada através do filtro, e depois deixa-se cair o filtrado gota a gota sobre o dispositivo de ensaio de membrana. A peça do corpo é preferivelmente constituída de um material flexível tal como polietileno e poli(tereftalato de etileno) (PET) uma vez que a amostra pode ser facilmente filtrada por aplicação de pressão com a mão ou de modo análogo no tubo fixado ao filtro.

Dispositivo de ensaio

Um dispositivo de ensaio equipado com uma membrana (também referido como um dispositivo de ensaio de membrana), como aqui utilizado, é um dispositivo compreendendo uma membrana possuindo uma substância de captura imobilizada sobre a mesma ou em fase sólida, que se liga especificamente a um analito. Um tal dispositivo de ensaio é preferivelmente um dispositivo que utiliza um método de ensaio de membrana do tipo de fluxo atravessante ou um método de ensaio de membrana do tipo de fluxo lateral. O exemplo do dispositivo de ensaio que utiliza um método de ensaio de membrana do tipo de fluxo atravessante é, por exemplo, um dispositivo como se mostra na Figuras 1 e 2. A Figura 1 é uma projecção horizontal do dispositivo do tipo de fluxo atravessante, e a Figura 2 é uma vista em corte através de um plano de corte definido pela linha I-I' da Figura 1. "a" é um adaptador que possui uma abertura para deixar cair gota a gota uma amostra preparada e que está provido com orifícios (orifício "A" e orifício "B") para fazer passar a amostra para o fundo, "b" é uma membrana à qual está ligada uma substância de captura que se liga especificamente a um analito. "c" é uma almofada de absorção de líquido. 0 exemplo do dispositivo de ensaio utilizando um método de ensaio de membrana do tipo de fluxo lateral é, por exemplo, um dispositivo como se mostra nas Figuras 5 e 6. A Figura 5 é uma projecção horizontal do dispositivo do tipo de fluxo lateral, e a Figura 6 é uma vista em corte 14 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ através de um plano de corte definido pela linha 11-11' da Figura 5. "g" é uma almofada que está instalada para receber uma amostra preparada e que permite conter um reagente de detecção marcado num estado seco. "h" é uma almofada que está instalada para receber um substrato para a enzima e "i" é uma almofada para absorver uma solução que se deixa cair gota a gota. "j" é uma membrana à qual está ligada uma substância de captura que se liga especificamente a um analito. "k" e "1" mostram a posição onde estão ligadas substâncias de captura que se ligam especificamente ao analito sobre o "j" na forma de uma linha, "m" é uma folha de suporte de plástico para fixar os membros do dispositivo de modo a aumentar a resistência do dispositivo.

Membrana 0 material da membrana no dispositivo de ensaio de membrana inclui um material seleccionado entre o grupo consistindo de tecido não tecido, papel, nitrocelulose, fibra de vidro, fibra de sílica, éster de celulose, poliétersulfona, polissulfona, politetrafluoroetileno, poli(fluoreto de vinilideno), policarbonato, polipropileno, poliamida, nylon 6,6 bem como uma mistura de nitrocelulose e éster de celulose. Uma substância microporosa produzida a partir de nitrocelulose é particularmente preferida. Adicionalmente, a referida mistura de éster de celulose e nitrocelulose pode ser utilizada preferivelmente. 0 tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas da referida membrana é não inferior ao tamanho de poro ou ao tamanho de retenção de partículas do filtro acima mencionado e é preferivelmente de 0,3 a 15 pm, em particular preferivelmente de 0,4 a 12 pm. Além disso, a espessura da membrana não está particularmente limitada, mas está geralmente dentro do intervalo da ordem de 100 a 200 pm.

Analito

Um analito como aqui utilizado inclui, mas não está limitado a, um antigénio de vírus tal como vírus influenza, adenovírus, vírus RS, HAV, HBc, HCV, HIV, EBV, vírus tipo Norwalk, etc., um antigénio de bactérias tais como Chlamydia trachomatis, estreptococos hemolítico, Bordetella pertussis, 15 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ

Helicobacter pylori, Leptospira, Treponema pallidum, Toxoplasma gondii, Borrelia, Bacillus anthracis, MRSA, etc., antigénio lípido de Micoplasma, um péptido de hormona tal como gonadotrofina coriónica humana (hCG) , etc., um esteróide tal como uma hormona esteróide, etc., aminas biologicamente activas tais como epinefrina, morfina, etc., vitaminas tais como vitaminas B, etc., prostaglandinas, antibióticos tais como tetraciclina, etc., uma toxina produzida por bactérias e outras, vários marcadores tumorais, agroquimicos, anticorpo anti-Escherichia coli, anticorpo anti-Salmonella, anticorpo anti-Staphylococcus, anticorpo anti-Campylobacter, anticorpo anti-Clostridium perfringens, anticorpo anti-Vibrio parahemolytica, anticorpo anti-verotoxina, anticorpo anti- transferrina de humano, anticorpo anti-albumina de humano, anticorpo anti-imunoglobulina de humano, anticorpo anti-microglobulina, anticorpo anti-CRP, anticorpo anti-troponina, anticorpo anti-HCG, anticorpo anti-Chlamydia trachomatis, anticorpo anti-estreptolisina 0, anticorpo anti-Helicobacter pylori, anticorpo anti-3-glucano, anticorpo anti-HBe, anticorpo anti-HBs, anticorpo anti-adenovirus, anticorpo anti-HIV, anticorpo anti-rotavirus, anticorpo antivírus influenza, anticorpo anti-parvovírus, anticorpo antivírus RS, anticorpo anti-RF, um nucleótido complementar com um componente de ácido nucleico derivado do microrganismo patogénico e outros. A amostra a ser analisada pelo método do presente invento é como definida acima e inclui, mas não está limitado a, um fluido colhido a partir de um esfregaço de faringe ou cavidade nasal, suspenso num tampão apropriado, aspirado da cavidade nasal, e uma sua solução diluída por um tampão apropriado. Adicionalmente, o referido tampão pode conter de 0,01 a 20% em peso de tensioactivo. 0 tensioactivo que pode ser aqui utilizado inclui, mas não está limitado a, TritonX-100: mono-p-iso-octilfeniléter de polietilenoglicol (Nacalai Tesuque Inc.) , Tween 20: polioxietileno-monolaurato de sorbitano (Nacalai Tesuque Inc.), Tween 80: polioxietileno-monooleato de sorbitano (Nacalai Tesuque Inc.), NP-40: Nonidet P-40 (Nacalai Tesuque Inc.), Zwittergent: Zwittergent 3-14 (Calbiochem Co. Ltd.), SDS: dodecilsulfato de sódio (Nacalai Tesuque Inc.), CHAPS: 3- 16 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ

[(3-colamidopropil)dimetilamónio]propanossulfonato (DOJINDO

Inc.) e outros, ou uma mistura de dois ou mais destes.

Substância de captura

Uma substância de captura para capturar um analito é uma substância que se liga ao analito através de uma reacção especifica, tal como uma reacção antigénio-anticorpo, para formar um complexo. É por isso natural que a substância de captura a utilizar varie dependendo do tipo de analito. No entanto, em geral, quando o analito é uma bactéria, virus, hormona, outro marcador clinico e outros, como substância de captura podem-se utilizar anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais e outros que reagem especificamente com o analito. Exemplos de substâncias de captura incluem ainda antigénios virais, partículas semelhantes a vírus, uma proteína expressa por um gene recombinante de E. coli, uma proteína expressa por um gene recombinante de levedura e outros. 0 método para permitir que uma tal substância de captura se ligue à superfície da membrana acima mencionada pode ser uma adsorção física ou através de uma ligação química. Uma membrana à qual está ligada uma substância de captura é preparada, por exemplo, por adsorção de uma solução da substância de captura diluída num tampão ou outro sobre a membrana seguindo-se secagem da membrana.

Kit de ensaio simples de membrana O kit de ensaio simples de membrana de acordo com o presente invento é um kit que é utilizado no método de ensaio simples de membrana acima mencionado de acordo com o presente invento. O kit de ensaio simples de membrana de acordo com o presente invento compreende pelo menos (1) e (2) : (1) um filtro onde o filtro está fixado à ponta de um tubo de filtro; e (2) um dispositivo de ensaio equipado com uma membrana à qual está ligada uma substância de captura para capturar um analito. 0 tamanho de poro ou tamanho de retenção de partículas do filtro é de 0,2 a 8,0 pm. 17 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ

Mais preferivelmente, ο filtro acima mencionado está fixado ao tubo de filtro para amostra acima mencionado. 0 kit pode compreender adicionalmente, se necessário, uma suspensão de amostra, uma composição de lavagem, e/ou um reagente de detecção marcado. Adicionalmente, quando o marcador do reagente de detecção marcado é um marcador enzimático, o kit pode compreender um substrato para a enzima, uma solução de terminação da reacção e outros como depois descrito.

Adicionalmente, conforme necessário, o kit pode compreender ainda uma solução de controlo negativo que consiste apenas de um tampão para examinar a actividade do kit e um controlo positivo que consiste de um tampão contendo um analito tal como uma substância antigénica. Além disso, o kit pode compreender um instrumento para colheita de amostra tal como um esfregaço de algodão esterilizado.

Suspensão de amostra

Uma amostra é colhida a partir da faringe, ou da cavidade nasal de um paciente, por exemplo, utilizando um instrumento para colheita de amostra tal como um esfregaço de algodão esterilizado, ou pode-se utilizar como amostra um aspirado da cavidade nasal. A amostra assim obtida é geralmente suspensa numa suspensão de amostra para realizar o ensaio. Como suspensão de amostra, podem-se utilizar tampões e outros que são geralmente utilizados na detecção ou quantificação de amostras por uma técnica imunológica tal como um método de imunodifusão, imunoensaio enzimático e método de aglutinação.

Mais especificamente, exemplos da suspensão de amostra incluem, mas não estão limitados a, solução salina fisiológica, solução salina tamponada com fosfato (PBS), PBS com gelatina adicionada, PBS com albumina de soro de bovino (BSA) adicionada, tampão de Good, caldo de perfusão de vitelo (VIB), caldo de perfusão de coração, meio essencial mínimo de Eagle (EMEM), EMEM com BSA adicionada e outros. Adicionalmente, pode-se utilizar uma combinação de dois ou mais dos tampões anteriores. 18 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ

Além disso, para além da composição anterior, podem-se adicionar aminoácidos básicos, sais inorgânicos e/ou tensioactivos. É preferivel a utilização de uma suspensão de amostra contendo pelo menos dois de aminoácidos básicos, sais inorgânicos e tensioactivos, por causa da ligação à própria membrana e pode-se diminuir a ligação não especifica à substância de captura sobre a membrana dos outros componentes na amostra que não o analito.

Reagente de detecção

Um reagente de detecção, como aqui utilizado, é algo que se pode ligar especificamente a um analito para formar um complexo com o analito. Adicionalmente, um reagente de detecção marcado refere-se a um reagente de detecção que foi marcado de modo detectável por algum meio após formação de um complexo com o analito. Por exemplo, quando o analito é uma substância antigénica tal como um virus, pode-se incluir um anticorpo contra o virus, que foi marcado com uma enzima ou de outro modo. Se o reagente de detecção foi marcado desta maneira com uma enzima, a detecção do complexo pode ser realizada por adição de um substrato de uma tal enzima que produz uma substância que pode ser detectada por um método colorimétrico ou por um método de fluorescência através de uma reacção catalisada por uma tal enzima. Antes de ser marcado, o reagente de detecção inclui as mesmas substâncias tais como as acima descritas para a substância de captura. Adicionalmente, o marcador inclui uma enzima, um marcador fluorescente, um marcador magnético, um isótopo radioactivo, ouro coloidal, látex colorido e outros.

Quando se utiliza enzimático utilizado alcalina, peroxidase, outros. um marcador enzimático, o marcador inclui, por exemplo, fosfatase glucose-6-fosfato-desidrogenase e

Substrato

Quando se utiliza um marcador enzimático como o marcador de um reagente de detecção marcado, geralmente adiciona-se um substrato desta enzima que produz uma substância que pode ser detectada por um método colorimétrico ou por um método 19 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ de fluorescência através de uma reacção catalisada por uma tal enzima. Os exemplos operativos incluem ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfórico (BCIP) / azul de nitrotetrazólio (NBT), tetrametilbenzidina (TMB) e glucose-6-fosfato NAD+.

Solução de terminação da reacção O kit de acordo com o presente invento pode ainda compreender, se necessário, uma solução de terminação da reacção de modo a terminar uma reacção tal como uma reacção entre uma enzima e um substrato. Uma tal solução de terminação da reacção inclui, por exemplo, ácido cítrico, ácido sulfúrico e outros.

Exemplos

Exemplo 1

Detecção de vírus influenza por um método de ensaio imunocromatográfico do tipo de fluxo atravessante. 1. Preparação de anticorpo monoclonal (1) Preparação de anticorpo monoclonal NP antivirus influenza do tipo Ά (ratinho)

Fez-se a ablação de um baço a partir de um ratinho BALB/c que tinha sido imunizado com antigénio purificado de vírus influenza do tipo A e mantido durante um certo período, e fundiu-se este com células de mieloma de ratinho (P3 x 63) pelo método de Kohler et al. (Kohler et al., Nature, Vol, 256, páginas 495-497 (1975)).

As células fundidas obtidas (hibridoma) foram mantidas numa incubadora a 37°C e efectuou-se a purificação (monoclonagem) das células enquanto se confirmava a actividade de anticorpo do sobrenadante por ELISA utilizando uma placa de fase sólida de antigénio NP de vírus influenza do tipo A. com

Duas das células obtidas foram cada uma administradas intraperitonealmente a um ratinho BALB/c tratado 20 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ pristano, após cerca de 2 semanas, colheram-se ascites de cada um contendo um anticorpo. Purificou-se a IgG a partir de cada uma das ascites obtidas por fraccionamento com sulfato de amónio para dar dois tipos de anticorpos monoclonais NP antivirus influenza do tipo A. (2) Preparação de anticorpo monoclonal NP antivirus influenza do tipo B (ratinho)

Fez-se a ablação de um baço a partir de um ratinho BALB/c que tinha sido imunizado com antigénio purificado de vírus influenza do tipo B e mantido durante um certo período, e fundiu-se este com células de mieloma de ratinho (P3 x 63) pelo método de Kohler et ai. (Kohler et ai., Nature, Vol, 256, páginas 495-497 (1975)).

As células fundidas obtidas (hibridoma) foram mantidas numa incubadora a 37°C e efectuou-se a purificação (monoclonagem) das células enquanto se confirmava a actividade de anticorpo do sobrenadante por ELISA utilizando uma placa de fase sólida de antigénio NP de vírus influenza do tipo B.

Duas das células obtidas foram cada uma administradas intraperitonealmente a um ratinho BALB/c tratado com pristano, após cerca de 2 semanas, colheram-se ascites de cada um contendo um anticorpo. Purificou-se a IgG a partir de cada uma das ascites obtidas por fraccionamento com sulfato de amónio para dar dois tipos de anticorpos monoclonais NP antivirus influenza do tipo B. 2. Preparação de solução de anticorpo anti-influenza marcado (1) Preparação de solução de anticorpo anti-influenza do tipo A marcado 2 0 mg de um tipo do anticorpo monoclonal NP antivirus influenza do tipo A purificado foram dialisados com tampão acetato 0,1 M (pH 3,8) seguindo-se adição de 10 mg de pepsina e realizou-se o tratamento digestivo de Fab' durante uma hora a 37°C. A solução tratada foi fraccionada através de uma coluna Ultrogel AcA 44 para dar uma fracção 21 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ purificada de F(ab')2 anti-influenza do tipo A. A fracção assim obtida foi concentrada até cerca de 10 mg/mL, e depois misturou-se com mercaptoetilamina 0,1 M numa proporção em volume de 10:1 e realizou-se um tratamento de redução durante 90 minutos a 37°C. A solução tratada foi fraccionada através de uma coluna Ultrogel AcA 44 para dar uma fracção purificada de Fab' anti-influenza do tipo A seguindo-se concentração das fracções até cerca de 1 mL.

Dialisaram-se 1,5 ml de fosfatase alcalina (10 mg/ml) com tampão borato 50 mM (ácido bórico 50 mM (pH 7,6), cloreto de magnésio 1 mM, cloreto de zinco 0,1 mM) , e depois adicionaram-se 0,7 mg de N-(6-maleimidacaproiloxi)succinimida (EMCS; DOJINDO Inc.) e depois deixou-se a mistura em repouso durante uma hora a 30°C. Fraccionou-se a solução tratada através de uma coluna Sephadex G-25 e recuperou-se o primeiro pico para dar maleimida-fosfatase alcalina seguindo-se concentração das fracções até cerca de 1 mL.

Misturou-se o Fab' anti-influenza do tipo A concentrado com maleimida-fosfatase alcalina na proporção de proteína de 1:2,3, agitou-se suavemente a mistura resultante durante 20 horas a 4°C e fez-se reagir para dar Fab' anti-inf luenza do tipo A marcado com fosfatase alcalina. Fraccionou-se a solução reaccional através de uma coluna AcA 44 e removeram-se os materiais não reagidos para dar Fab' marcado com fosfatase alcalina purificado.

Diluiu-se o Fab' marcado com fosfatase alcalina purificado com uma solução para diluição do anticorpo marcado compreendendo 4,5% (p/v) de albumina de soro de bovino, 5,25% (p/v) de polietilenoglicol 6000, tampão Tris-ácido clorídrico 10 mM (pH 7,4), cloreto de sódio 150 mM, 1,5% (p/v) de Triton X-100, cloreto de magnésio 1,5 mM e cloreto de zinco 0,15 mM a 1,0 pg/mL seguindo-se filtração da solução através de um filtro com 0,22 pm de tamanho de poro para dar uma solução de anticorpo anti-inf luenza do tipo A marcado. (2) Preparação de solução de anticorpo anti-influenza do tipo B marcado 22 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ 20 mg de uma espécie do anticorpo monoclonal NP antivirus influenza do tipo B purificado foram dialisados com tampão acetato 0,1 M (pH 3,8) seguindo-se adição de 10 mg de pepsina e realizou-se o tratamento digestivo de Fab' durante uma hora a 37°C. A solução tratada foi fraccionada através de uma coluna Ultrogel AcA 44 para dar uma fracção purificada de F(ab')2 anti-influenza do tipo B. A fracção assim obtida foi concentrada até cerca de 10 mg/mL, e depois misturou-se com mercaptoetilamina 0,1 M numa proporção em volume de 10:1 e realizou-se um tratamento de redução durante 90 minutos a 37°C. A solução tratada foi fraccionada através de uma coluna Ultrogel AcA 44 para dar uma fracção purificada de Fab' anti-influenza do tipo B seguindo-se concentração da fracção até cerca de 1 mL.

Misturou-se o Fab' anti-influenza do tipo B concentrado com maleimida-fosfatase alcalina preparado no parágrafo "2.(1)" acima na proporção de proteína de 1:2,3, agitou-se suavemente a mistura resultante durante 20 horas a 4°C e fez-se reagir para dar Fab' anti-influenza do tipo B marcado com fosfatase alcalina. Fraccionou-se a solução reaccional através de uma coluna AcA 44 e removeram-se os materiais não reagidos para dar Fab' marcado com fosfatase alcalina purificado.

Diluiu-se o Fab' marcado com fosfatase alcalina purificado com uma solução para diluição do anticorpo marcado compreendendo 4,5% (p/v) de albumina de soro de bovino, 5,25% (p/v) de polietilenoglicol 6000, tampão Tris- ácido clorídrico 10 mM (pH 7,4), cloreto de sódio 150 mM, 1,5% (p/v) de Triton X-100, cloreto de magnésio 1,5 mM e cloreto de zinco 0,15 mM a 1,0 pg/mL seguindo-se filtração da solução através de um filtro com 0,22 pm de tamanho de poro para dar uma solução de anticorpo anti-inf luenza do tipo B marcado. 3. Preparação de um dispositivo de ensaio de membrana do tipo de fluxo atravessante para detecção de vírus influenza

Utilizou-se o dispositivo de ensaio de membrana do tipo de fluxo atravessante para detecção de vírus influenza cuja 23 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ constituição é a mesma como se mostra na Figuras 1 e 2. Como membrana utilizou-se uma membrana de nitrocelulose possuindo 3 pm de tamanho de poro (Immunopore fabricada pela empresa Whatman, tamanho de 2 x 3 cm, espessura de 125 pm). A imobilização de um anticorpo à membrana foi realizada manchando as duas variedades de soluções de anticorpo sobre a membrana de nitrocelulose. 12 pL de solução contendo 0,2 mg/mL de anticorpo monoclonal NP antivirus influenza do tipo A purificado que não tinha sido utilizada na "preparação de anticorpo anti-influenza do tipo A marcado" foram filtrados através de um filtro com 0,22 pm de tamanho de poro para manchar sobre o orifício A do dispositivo. 12 pL de solução contendo 1 mg/mL de anticorpo monoclonal NP antivirus influenza do tipo B purificado que não tinha sido utilizada na "preparação de anticorpo anti-influenza do tipo B marcado" foram filtrados através de um filtro com 0,22 pm de tamanho de poro para manchar sobre o orifício B do dispositivo. Utilizou-se tampão citrato 10 mM (pH 4,0) para diluir os anticorpos. Depois, secaram-se os anticorpos manchados numa câmara de secagem a 45°C durante 40 minutos para preparar um dispositivo de ensaio de membrana para detecção de vírus influenza. 4. Detecção de virus influenza (1) Detecção pelo método de ensaio de membrana do tipo de fluxo atravessante

Colheram-se fluidos limpando com um esfregaço de algodão esterilizado cada cavidade nasal de 115 pacientes clinicamente suspeitos de uma infecção com vírus influenza, e depois suspenderam-se em 1,5 mL de solução possuindo uma composição de tampão fosfato 50 mM (pH 7,0), cloreto de sódio 1,5 M, 1% (p/v) de Triton X-100 e 0,5% (p/v) de albumina de soro de bovino para preparar uma amostra para teste. Suspendeu-se bem a amostra e depois dividiu-se em três alíquotas de 40 pL em três tubos de filtro para amostra. Depois, na ponta de cada tubo montaram-se os bicos seguintes, respectivamente; bico 1 compreendendo um filtro de uma membrana de nitrocelulose com 0,45 pm de tamanho de poro ensanduichada entre duas fibras de vidro com 0,67 pm de tamanho de poro (tamanho de retenção de partículas); bico 2 24 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ compreendendo um filtro que é uma pilha de três fibras de vidro com 0,67 pm de tamanho de poro (tamanho de retenção de partículas); e bico 3 não compreendendo qualquer filtro (comparativo).

Filtrou-se cada uma das amostras através de cada bico. Depois adicionaram-se 150 pL do filtrado a cada um dos orifícios A e B do dispositivo de ensaio de membrana do tipo de fluxo atravessante preparado no parágrafo "3." anterior e deixaram-se em repouso até a amostra estar absorvida completamente num membro de absorção de líquido de membrana de nitrocelulose colocado no fundo. A seguir, adicionou-se gota a gota uma alíquota de 180 pL de solução de anticorpo anti-influenza do tipo A marcado no orifício A, adicionou-se uma alíquota de 180 pL de solução de anticorpo anti-influenza do tipo B marcado no orifício B e depois deixaram-se em repouso até cada uma das referidas soluções de anticorpo estar absorvida completamente no membro de absorção de líquido. Depois, removeu-se o adaptador, adicionaram-se gota a gota 150 pL de uma solução de lavagem possuindo uma composição de tampão fosfato 20 mM (pH 7,0), cloreto de sódio 0,5 M, 5% (p/v) de cloridrato de arginina e 1% (p/v) de Triton X-100 a cada um dos orifícios A e B, e depois deixaram-se em repouso até cada uma das referidas soluções de lavagem estar absorvida completamente no membro de absorção de líquido. Subsequentemente, adicionaram-se gota a gota 250 pL de solução de substrato BCIP/NBT (fabricado pela empresa Sigma) a cada um dos orifícios A e B para iniciar uma reacção de coloração. Após 10 minutos, adicionaram-se gota a gota 150 pL de tampão citrato 100 mM (pH 3,0) a cada um dos orifícios A e B para terminar a reacção. Imediatamente após terminação da reacção, observaram-se os orifícios A e B a partir de uma direcção elevada vertical. Se a cor era reconhecida apenas no orifício A, então considerava-se positivo o vírus influenza do tipo A, se a coloração era reconhecida apenas no orifício B, então considerava-se positivo o vírus influenza do tipo B, se a coloração era reconhecida em ambos os orifícios A e B, então consideravam-se positivos ambos os vírus do tipo A e do tipo B, e se a coloração não era reconhecida em nenhum dos orifícios, então consideravam-se negativos ambos os vírus do tipo A e do tipo B. 25 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ

(2) Detecção pelo método de RT-PCR

Utilizaram-se os restos das amostras para teste preparadas no parágrafo "4.(1)" anterior para determinar a presença de genes de vírus influenza na amostra pelo método de RT-PCR. O método de RT-PCR foi realizado pelo método de Shimizu ("Kansensho-gaku Zasshi" (The Journal of the

Japanese Association for Infectious Diseases), Vol. 71, N.°6, páginas 522-526).

(3) Comparação entre o método de ensaio de membrana do tipo de fluxo atravessante e o método de RT-PCR

Nas Tabelas 1 a 3 apresentam-se comparações de resultados entre o método de ensaio simples de membrana de acordo com o presente invento e o método de RT-PCR acima mencionado. O método de RT-PCR mostrou ser um método de medição cuja sensibilidade e especificidade são extremamente elevadas, pelo que se o resultado fosse diferente do obtido pelo método de RT-PCR, então este era considerado como um falso positivo ou um falso negativo.

Tabela 1

Comparação no caso de se utilizar o bico 1 Método de RT-PCR positivo tipo A positivo tipo B positivo tipo A & B negativo total Método de ensaio de membrana positivo tipo A 32 0 0 0 32 positivo tipo B 0 18 0 0 18 positivo tipo A & B 0 0 0 0 0 negativo 0 0 0 65 65 total 32 18 0 65 115 * O valor numérico na Tabela refere-se ao número de amostras. 26 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ

Tabela 2

Comparação no caso de se utilizar o bico 2 Método de RT-PCR positivo tipo A positivo tipo B positivo tipo A & B negativo total Método de ensaio de membrana positivo tipo A 30 0 0 0 30 positivo tipo B 0 15 0 [3] 18 positivo tipo A & B [2] [3] 0 0 5 negativo 0 0 0 62 62 total 32 18 0 65 115 * 0 valor numérico na Tabela refere-se ao número de amostras. Adicionalmente, o valor numérico entre parêntesis refere-se a um falso positivo.

Tabela 3

Comparação no caso de se utilizar o bico 3 Método de RT-PCR positivo tipo A positivo tipo B positivo tipo A & B negativo total Método de ensaio de membrana positivo tipo A 5 0 0 0 5 positivo tipo B 0 2 0 [18] 20 positivo tipo A & B [27] [16] 0 [35] 78 negativo 0 0 0 12 12 total 32 18 0 65 115 * 0 valor numérico na Tabela refere-se ao número de amostras. Adicionalmente, o valor numérico entre parêntesis refere-se a um falso positivo.

No caso de se utilizar o bico 1, os resultados pelo método de ensaio de membrana foram completamente idênticos aos resultados pelo método de RT-PCR e não existiu qualquer resultado falso positivo. No caso de se utilizar o bico 2, a incidência de positividade falsa foi de 7% (8 amostras em 115 amostras (número total de amostras falsos positivos entre parêntesis na Tabela 2)) mas os restantes resultados estavam de acordo com os resultados pelo método de RT-PCR. Por outro lado, no caso de se utilizar o bico 3, a incidência positividade falsa foi de 83% (96 amostras em 115 amostras (número total de amostras falsos positivos entre parêntesis na Tabela 3)). 27 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ

Exemplo 2

Detecção de vírus influenza pelo método de ensaio imunocromatográfico do tipo de fluxo lateral 1. Preparação de anticorpo monoclonal (1) Preparação de anticorpo monoclonal NP antivírus influenza A (ratinho)

Este anticorpo foi preparado do mesmo modo que no método descrito no Exemplo 1, parágrafo 1.(1). (2) Preparação de anticorpo monoclonal NP antivírus influenza do tipo B (ratinho)

Este anticorpo foi preparado do mesmo modo que no método descrito Exemplo 1, parágrafo 1.(2). 2. Preparação de anticorpo anti-influenza marcado (1) Preparação de anticorpo anti-influenza do tipo A marcado 20 mg de uma espécie dos anticorpos monoclonais NP antivírus influenza do tipo A purificados foram dialisados com tampão acetato 0,1 M (pH 3,8) seguindo-se adição de 10 mg de pepsina e realizou-se o tratamento digestivo de Fab' durante uma hora a 37°C. A solução tratada foi fraccionada através de uma coluna Ultrogel AcA 44 para dar uma fracção purificada de F(ab')2 anti-influenza do tipo A. A fracção assim obtida foi concentrada até cerca de 10 mg/mL, e depois misturou-se com mercaptoetilamina 0,1 M numa proporção em volume de 10:1 e realizou-se um tratamento de redução durante 90 minutos a 37°C. A solução tratada foi fraccionada através de uma coluna Ultrogel AcA 44 para dar uma fracção purificada de Fab' anti-influenza do tipo A seguindo-se concentração da fracção até cerca de 1 mL.

Dialisaram-se 1,5 ml de fosfatase alcalina (10 mg/ml) com tampão borato 50 mM (ácido bórico 50 mM (pH 7,6), cloreto de magnésio 1 mM, cloreto de zinco 0,1 mM), e depois adicionaram-se 0,7 mg de N-(6-maleimidacaproiloxi)- 28 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ succinimida (EMCS; DOJINDO Inc.) e deixou-se a mistura em repouso durante uma hora a 30°C. Fraccionou-se a solução tratada através de uma coluna Sephadex G-25 e recuperou-se o primeiro pico para dar maleimida-fosfatase alcalina seguindo-se concentração da fracção até cerca de 1 mL.

Misturou-se o Fab' anti-influenza do tipo A concentrado com maleimida-fosfatase alcalina na proporção de proteina de 1:2,3, agitou-se suavemente a mistura resultante durante 20 horas a 4°C e fez-se reagir para dar Fab' anti-inf luenza do tipo A marcado com fosfatase alcalina. Fraccionou-se a solução reaccional através de uma coluna AcA 44 e removeram-se os materiais não reagidos para dar Fab' marcado com fosfatase alcalina purificado. (2) Preparação de anticorpo anti-influenza do tipo B marcado 20 mg de uma espécie dos anticorpos antivirus influenza do tipo B purificados foram dialisados com tampão acetato 0,1 M (pH 3,8) seguindo-se adição de 10 mg de pepsina e realizou-se o tratamento digestivo de Fab' durante uma hora a 37°C. A solução tratada foi fraccionada através de uma coluna Ultrogel AcA 44 para dar uma fracção purificada de F(ab')2 anti-influenza do tipo B. A fracção assim obtida foi concentrada até cerca de 10 mg/mL, e depois misturou-se com mercaptoetilamina 0,1 M numa proporção em volume de 10:1 e realizou-se um tratamento de redução durante 90 minutos a 37°C. A solução tratada foi fraccionada através de uma coluna Ultrogel AcA 44 para dar uma fracção purificada de Fab' anti-influenza do tipo B seguindo-se concentração da fracção até cerca de 1 mL.

Misturou-se o Fab' anti-influenza do tipo B concentrado com maleimida-fosfatase alcalina preparada em 2 — (1) na proporção de proteina de 1:2,3, agitou-se suavemente a mistura resultante durante 20 horas a 4°C e fez-se reagir para dar Fab' anti-influenza do tipo B marcado com fosfatase alcalina. Fraccionou-se a solução reaccional através de uma coluna AcA 44 e removeram-se os materiais não reagidos para dar Fab' marcado com fosfatase alcalina purificado. 29 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ 3. Preparaçao de um dispositivo de ensaio de membrana do tipo de fluxo lateral para detecção de vírus influenza

Utilizou-se o dispositivo de ensaio de membrana do tipo de fluxo lateral para detecção de virus influenza cuja constituição é a mesma como se mostra na Figuras 5 e 6. A membrana "j" consiste de uma membrana de nitrocelulose possuindo 5 pm de tamanho de poro (PuraBind fabricada pela empresa Whatman, tamanho de 5 x 50 mm, espessura de 200 pm). Revestiram-se 2,0 pL de solução contendo 1 mg/ml de anticorpo monoclonal NP antivírus influenza do tipo B purificado que não tinha sido utilizada na "preparação de anticorpo anti-influenza do tipo B marcado" num padrão em linha (largura de 1,0 mm) na posição "k" 15 mm afastada de uma extremidade da membrana "j" (aqui depois esta extremidade é referida como "extremidade a jusante"), e revestiram-se 2,0 pL de solução contendo 0,2 mg/ml de anticorpo monoclonal NP antivírus influenza do tipo A purificado que não tinha sido utilizada na "preparação de anticorpo anti-influenza do tipo A marcado" num padrão em linha (largura de 1,0 mm) na posição "1" 18 mm afastada da referida extremidade a jusante. Nestes passos de revestimento, utilizou-se tampão citrato 10 mM (pH 4,0) para diluir os anticorpos em fase sólida e filtrou-se a solução através de um filtro com 0,22 pm de tamanho de poro imediatamente antes da imobilização. Após a solução estar revestida sobre a membrana, secou-se numa câmara de secagem a 45°C durante 40 minutos.

Depois, fixaram-se os membros e colocou-se uma folha de suporte de plástico "m" (fabricada pela empresa BioDot) sobre o lado oposto à superfície da membrana revestida com anticorpo de modo a aumentar a resistência. A seguir, deixaram-se cair gota a gota 12 pL de cada um dos anticorpos anti-influenza do tipo A marcado e anti-inf luenza do tipo B marcado preparados no parágrafo "2." acima (cada concentração era 2 pg/mL) sobre uma almofada de celulose / fibra de vidro (WF 1.5 fabricada pela empresa

Whatman, 7 mm x 10 mm, espessura de 1,4 mm) e secou-se durante 40 minutos numa câmara de secagem a 45°C. Esta almofada foi fixada numa posição 23 mm afastada da 30 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ extremidade a jusante para constituir uma almofada de recepção de amostra "g". Uma almofada de celulose / fibra de vidro (WF 1.5 fabricada pela empresa Whatman, 7 mm x 15 mm, espessura de 1,4 mm) foi fixada numa posição onde 2 mm da extremidade a montante da membrana foram sobrepostos para constituir uma almofada de recepção de substrato "h".

Depois, uma almofada de celulose / fibra de vidro (WF 1.5 fabricada pela empresa Whatman, 10 mm x 20 mm, espessura de 1,5 mm) foi fixada numa posição onde 5 mm da extremidade a jusante da membrana foram sobrepostos para constituir a almofada de absorção "i". 4. Detecção de vírus influenza (1) Detecção pelo método de ensaio de membrana do tipo de fluxo lateral

Colheram-se fluidos limpando com um esfregaço de algodão esterilizado cada cavidade nasal de 92 pacientes clinicamente suspeitos de uma infecção com vírus influenza, e depois suspenderam-se em 0,8 mL de solução possuindo uma composição de tampão Tris-HCl 20 mM (pH 8.0), cloreto de sódio 0,6 M, 1% (p/v) de Triton X-100, 2,0% (p/v) de L-cloridrato de arginina e 1,0% (p/v) de albumina de soro de bovino para preparar uma amostra para teste. Suspendeu-se bem a amostra e depois dividiu-se em três alíquotas de 200 pL em cada um de três tubos de filtro para amostra. Depois, na ponta de cada tubo montaram-se os bicos seguintes, respectivamente; bico 1 compreendendo um filtro de uma membrana de nitrocelulose com 0,45 pm de tamanho de poro ensanduichada entre duas fibras de vidro com 0,6 7 pm de tamanho de poro (tamanho de retenção de partículas) ; bico 4 compreendendo um filtro que é uma pilha de três fibras de vidro com 1,0 pm de tamanho de poro (tamanho de retenção de partículas); e bico 3 não compreendendo qualquer filtro (comparativo).

Filtrou-se cada uma das amostras através de cada bico seguindo-se a adição de uma aliquota de 60 pL à almofada de recepção de amostra do dispositivo de ensaio de membrana do tipo de fluxo lateral preparado no parágrafo "3." acima e deixou-se em repouso durante 3 minutos. Depois, adicionaram- 31 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ se gota a gota 60 pL de solução de substrato BCIP/NBT (fabricada pela empresa Sigma) para iniciar a reacção de coloração. Após 10 minutos, observaram-se as posições "e" e "f" nas Figuras 5 e 6 a partir de uma direcção elevada vertical. Se a cor era reconhecida apenas na posição "e", então considerava-se positivo o vírus influenza do tipo B, se a cor era reconhecida apenas na posição "f", então considerava-se positivo o vírus influenza do tipo A, se a cor era reconhecida em ambas as posições "e" e "f", então consideravam-se positivos ambos os vírus do tipo A e do tipo B, e se a coloração não era reconhecida em nenhum dos orifícios, então consideravam-se negativos ambos os vírus do tipo A e do tipo B.

(2) Detecção pelo método de RT-PCR

Utilizaram-se os restos das amostras para teste preparadas no parágrafo "4.(1)" para determinar a presença de genes de vírus influenza na amostra pelo método de RT-PCR. O método de RT-PCR foi realizado pelo método de Shimizu (The Journal of the Japanese Association for Infectious Diseases, Vol. 71, No. 6, páginas 522-526).

(3) Comparação entre o método de ensaio de membrana do tipo de fluxo lateral e o método de RT-PCR

Nas Tabelas 4 a 6 apresentam-se comparações de resultados entre o método de ensaio simples de membrana de acordo com o presente invento e o método de RT-PCR acima mencionado. O método de RT-PCR mostrou ser um método de medição cuja sensibilidade e especificidade são extremamente elevadas, pelo que se o resultado fosse diferente do obtido pelo método de RT-PCR, então este era considerado como um falso positivo ou um falso negativo. 32 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ

Tabela 4

Comparaçao no caso de se utilizar o bico 1 Método de RT-PCR positivo tipo A positivo tipo B positivo tipo A & B negativo total Método de ensaio de membrana B positivo tipo A 26 0 0 0 26 positivo tipo B 0 11 0 0 11 positivo tipo A & B 0 0 0 0 0 negativo 0 0 0 55 55 total 26 11 0 55 92 * O valor numérico na Tabela refere—se ao número de amostras.

Tabela 5

Comparação no caso de se utilizar o bico 4 Método de RT-PCR positivo tipo A positivo tipo B positivo tipo A & B negativo total Método de ensaio de membrana B positivo tipo A 25 0 0 0 30 positivo tipo 0 9 0 [2] 11 positivo tipo A & B [1] [2] 0 0 3 negativo 0 0 0 53 53 total 26 11 0 55 92 * 0 valor numérico na Tabela refere-se ao número de amostras. Adicionalmente, o valor numérico entre parêntesis refere-se a um falso positivo.

Tabela 6

Comparação no caso de se utilizar o bico 3 Método de RT-PCR positivo tipo A positivo tipo B positivo tipo A & B negativo total Método de ensaio de membrana B positivo tipo A 18 0 0 0 18 positivo tipo 0 7 0 [10] 17 positivo tipo A & B [8] [4] 0 [7] 19 negativo 0 0 0 38 38 total 26 11 0 55 92 * 0 valor numérico na Tabela refere-se ao número de amostras. Adicionalmente, o valor numérico entre parêntesis refere-se a um falso positivo. 33 ΕΡ 2 270 508/ΡΤ

No caso de se utilizar o bico 1, os resultados pelo método de ensaio de membrana foram completamente idênticos aos resultados pelo método de RT-PCR e não existiu qualquer resultado falso positivo. No caso de se utilizar o bico 4, a incidência de positividade falsa foi de 5% (5 amostras em 92 amostras (número total de amostras falsos positivos entre parêntesis na Tabela 5) ) e os restantes resultados estavam de acordo com os resultados pelo método de RT-PCR. Por outro lado, no caso de se utilizar o bico 3, a incidência de positividade falsa foi de 32% (29 amostras em 92 amostras (número total de amostras falsos positivos entre parêntesis na Tabela 6)). 0 efeito do presente invento

De acordo com o presente invento, foi estabelecido um método de ensaio simples de membrana altamente fiável que pode prevenir a ocorrência de positividade falsa.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL O método de ensaio simples de membrana ou kit de ensaio simples de membrana de acordo com o presente invento pode ser utilizado para um teste simples no qual um analito tal como um patoqénio e um anticorpo numa amostra colhida num cenário médico ou por um indivíduo podem ser detectados ou quantificados in situ rapidamente e com exactidão.

Lisboa, 2013-04-26

Claims (27)

1. ΕΡ 2 270 508/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Método de ensaio de membrana para detectar ou quantificar um analito numa amostra utilizando um dispositivo de ensaio equipado com uma membrana à qual está ligada uma substância de captura para capturar o analito, compreendendo os passos de: filtrar a amostra utilizando um filtro que está ligado à ponta de um tubo de filtro, deixar cair gota a gota o filtrado sobre a membrana, e detectar ou quantificar a presença do analito na amostra, onde a amostra foi colhida a partir da faringe ou cavidade nasal de um paciente ou é um aspirado da cavidade nasal, e onde o tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas do filtro é de 0,2 a 8,0 pm.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas da membrana é não inferior ao tamanho de poro ou ao tamanho de retenção de partículas do filtro.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, onde o tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas da membrana é de 0,3 a 15 pm.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o tubo de filtro consiste de uma peça do corpo e de uma peça da ponta, onde a peça do corpo do tubo de filtro é constituída de material flexível, onde o método compreende os passos de: (i) colocar uma suspensão de amostra na peça do corpo do tubo de filtro; (ii) ligar a peça da ponta equipada com o filtro à peça do corpo; (iii) filtrar a amostra através do filtro por aplicação manual de pressão ao tubo de filtro; (iv) depois deixar cair gota a gota o filtrado sobre a membrana ; e (V) detectar ou quantificar a presença do analito na amostra, onde o tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas da membrana é não inferior ao tamanho de poro ou ao tamanho de retenção de partículas do filtro e é de 0,3 a 15 pm. ΕΡ 2 270 508/ΡΤ 2/5
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, onde o material flexível é seleccionado entre polietileno e poli(tereftalato de etileno).
6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, onde o material da membrana é seleccionado entre o qrupo consistindo de tecido não tecido, papel, nitrocelulose, fibra de vidro, fibra de sílica, éster de celulose, poliétersulfona, polissulfona, politetrafluoroetileno, poli(fluoreto de vinilideno), policarbonato, polipropileno, poliamida, nylon 6,6 e uma mistura de éster de celulose e nitrocelulose.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, onde o material da membrana é nitrocelulose e o seu tamanho de poro é de 0,4 a 12 μιη.
8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, onde o analito é de um vírus influenza.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, onde o filtro é uma combinação de dois ou mais filtros.
10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, onde o material do filtro é seleccionado entre o grupo consistindo de tecido não tecido, papel, fibra de vidro, fibra de sílica, nitrocelulose, éster de celulose, uma mistura de nitrocelulose e éster de celulose, poliétersulfona, polissulfona, politetrafluoroetileno, poli(fluoreto de vinilideno), policarbonato, polipropileno, poliamida, nylon 6,6, poliéster, algodão, fibra de aço inoxidável e uma sua combinação.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 10, onde o filtro é um filtro de fibra de vidro, um filtro de nitrocelulose, ou uma combinação de filtro de fibra de vidro e filtro de nitrocelulose.
12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, que é um método de ensaio de membrana do tipo de fluxo atravessante ou do tipo de fluxo lateral. ΕΡ 2 270 508/ΡΤ 3/5
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12, onde o dispositivo de ensaio é um dispositivo de ensaio de membrana do tipo de fluxo atravessante e o tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas do filtro é de 0,2 a 4,0 pm.
14. 14. Kit de ensaio de membrana para detectar ou quantificar a presença de um analito numa amostra, onde a amostra deve ser colhida a partir da faringe ou cavidade nasal de um paciente ou é um aspirado da cavidade nasal, onde o kit compreende: (1) um filtro para filtrar a amostra, onde o filtro está fixado à ponta de um tubo de filtro; e (2) um dispositivo de ensaio equipado com uma membrana à qual está ligada uma substância de captura para capturar o analito; onde o tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas do filtro é de 0,2 a 8,0 pm.
15. 15. Kit de acordo com reivindicação 14, onde o tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas da membrana é não inferior ao tamanho de poro ou ao tamanho de retenção de partículas do filtro.
16. 16. Kit de acordo com reivindicação 14 ou 15, onde o tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas da membrana é de 0,3 a 15 pm.
17. 17. Kit de acordo com reivindicação 14, onde o tubo de filtro consiste de uma peça do corpo e de uma peça da ponta, onde a peça do corpo é constituída de material flexível e onde o tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas da membrana é não inferior ao tamanho de poro ou ao tamanho de retenção de partículas do filtro e é de 0,3 a 15 pm.
18. 18. Kit de acordo com reivindicação 17, onde o material flexível é seleccionado entre polietileno e poli(tereftalato de etileno). ΕΡ 2 270 508/ΡΤ 4/5
19. 19. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, compreendendo adicionalmente: (3) uma suspensão de amostra; (4) uma composição de lavagem; (5) um reagente de detecção marcado; (6) um instrumento para colheita de amostra; e/ou (7) uma solução de controlo.
20. 20. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 19, onde o material da membrana é seleccionado entre o grupo consistindo de tecido não tecido, papel, nitrocelulose, fibra de vidro, fibra de sílica, éster de celulose, poliétersulfona, polissulfona, politetrafluoro- etileno, poli(fluoreto de vinilideno), policarbonato, polipropileno, poliamida, nylon 6,6 e uma mistura de éster de celulose e nitrocelulose.
21. 21. Kit de acordo com reivindicação 20, onde o material da membrana é nitrocelulose e o seu tamanho de poro é de 0,4 a 12 pm.
22. 22. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 21, onde o analito é um vírus influenza.
23. 23. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 22, onde o filtro é uma combinação de dois ou mais dos filtros.
24. 24. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 23, onde o material do filtro é seleccionado entre o grupo consistindo de tecido não tecido, papel, fibra de vidro, fibra de silica, nitrocelulose, éster de celulose, uma mistura de nitrocelulose e éster de celulose, poliétersulfona, polissulfona, politetrafluoroetileno, poli(fluoreto de vinilideno), policarbonato, polipropileno, poliamida, nylon 6,6, poliéster, algodão, fibra de aço inoxidável e uma sua combinação.
25. 25. Kit de acordo com reivindicação 24, onde o filtro é um filtro de fibra de vidro, um filtro de nitrocelulose, ou uma combinação de filtro de fibra de vidro e de filtro de nitrocelulose. ΕΡ 2 270 508/PT 5/5
26. 26. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 25, que é um kit ensaio de membrana do tipo de fluxo atravessante ou do tipo de fluxo lateral.
27. 27. Kit de acordo com reivindicação 26, onde o dispositivo de ensaio é um dispositivo de ensaio de membrana do tipo de fluxo atravessante e o tamanho de poro ou o tamanho de retenção de partículas do filtro é de 0,2 a 4,0 pm. Lisboa, 2013-04-26