PT2185198E - Inibidores lox e l0xl2 e utilizações dos mesmos - Google Patents

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PT2185198E
PT2185198E PT8830207T PT08830207T PT2185198E PT 2185198 E PT2185198 E PT 2185198E PT 8830207 T PT8830207 T PT 8830207T PT 08830207 T PT08830207 T PT 08830207T PT 2185198 E PT2185198 E PT 2185198E
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antibodies
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Victoria Smith
Scott Ogg
Peter Van Vlasselaer
Vivian E Barry
Derek Marshall
Alison Kay Holzer
Hector Rodriguez
Miho Oyasu
Scott Alan Mccauley
Carlos Aurelio Garcia
Donna Hiroko Tokuoka Biermann
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Gilead Biologics Inc
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Description

DESCRIÇÃO
INIBIDORES LOX E L0XL2 E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 cancro é um problema de saúde pública sério nos Estados Unidos e noutros países desenvolvidos. Atualmente, uma em quarto mortes nos Estados Unidos é devida a cancro. A terapêutica cancerígena envolve tratar pacientes com fármacos quimioterapêuticos para matar as células tumorais. Contudo, subconjuntos de células tumorais são frequentemente resistentes à terapêutica com fármacos e sobrevivem para repovoarem nos locais de origem e em locais metastáticos distantes, conduzindo à reincidência e morbidez da doença detetável. Pensa-se que muitas células tumorais de carcinoma que têm as propriedades de capacidade mestastática e invasiva aumentadas, e resistência aos fármacos alterada, sofreram uma transformação morfológica que abrange ou semelhante a EMT (transição epitelial-mesenquimatosa). Células submetidas a EMT perdem as propriedades adesivas normais das células epiteliais e passam por um espetro de alterações, incluindo perda de expressão de E-caderina e expressão de marcadores mesenquimatosos, motilidade aumentada, capacidade de invasão aumentada e resistência à morte celular aumentada.
As terapêuticas líder para cancro são atualmente a cirurgia, radiação e quimioterapêutica. As abordagens quimioterapêuticas, tais como antibióticos anti-tumorais, agentes alquilantes, compostos de nitrosoureia, vinca alcaloides, hormonas esteróides e anti-metabolitos formam a maioria das terapêuticas disponíveis aos oncologistas. Apesar dos avanços no campo do tratamento de cancro, o cancro continua a ser um grande problema de saúde.
Angiogénese, a formação de novos vasos sanguíneos fora dos capilares pré-existentes, é uma sequência de acontecimentos que é de uma importância crucial na ampla gama de processos fisiológicos e patológicos. 0 crescimento normal de tecido, tal como no desenvolvimento embrionário, na cicatrização e no ciclo menstrual, é caracterizado pela dependência na formação de novos vasos para o fornecimento de oxigénio e nutrients, bem como remoção de produtos de desperdício. Um grande número de doenças diferentes e não relacionadas também está associado com a formação de nova vasculatura. Entre certas patologias encontram-se condições patológicas nas quais a angiogénese é baixa e deveria ser potenciada para melhorar as condições da doença. Mais frequentemente, contudo, a angiogénese excessiva é uma característica importante de várias patologias, incluindo patologias caracterizadas ou associadas com uma proliferação anormal ou descontrolada de células. Patologias que envolvem angiogénese excessiva incluem, por exemplo, cancro (tanto tumores sólidos como hematológicos), doenças cardiovasculares (tais como aterosclerose e restenose), inflamação crónica (artrite reumatóide, doença de Crohn), diabetes (retinopatia diabética), psoríase, endometriose, glaucoma neovascular e adiposidade (3). Estas condições patológicas podem beneficiar de inibição quimioterapêutica da angiogénese.
Falando em geral, o processo angiogénico requer a proliferação e migração de um endotélio normalmente quiescente, a proteólise controlada da matriz pericelular e a síntese de novos componentes da matriz extracelular desenvolvendo capilares. 0 estabelecimento de novos contactos intra e intercelulares e a diferenciação morfológica de células endoteliais em redes tubulares tipos capilares providenciam suporte para a sua maturação, ramificação, remodelação e regressão seletiva subsequentes para formar uma rede microvascular altamente organizada, funcional. As interações autócrinas, parácrinas e anfícrinas do endotélio vascular com os seus componentes circundantes do estroma, bem como com as citocinas pró-angiogénicas e angiostáticas e fatores de crescimento orquestrando a angiogénese fisiológica, são normalmente reguladas firmemente tanto espacialmente como temporalmente. A angiogénese é crucial para o crescimento de tecidos neoplásicos. Durante mais de 100 anos, os tumores foram observados como sendo tecidos mais vasculares do que normais. Vários estudos experimentais sugeriram que ambos crescimento tumoral primário e metástase requerem neovascularização. Em contraste com o processo bem orquestrado descrito anteriormente para o crescimento de tecidos normal, a angiogénese patológica necessária para o crescimento tumoral ativo é, em geral, prolongada e persistente, sendo a aquisição inicial do fenótipo angiogénico um mecanismo comum para o desenvolvimento de uma variedade de tipos de tumores sólidos e hematopoiéticos. Tumores que são incapazes de recrutar e suster uma rede vascular permanecem tipicamente dormentes como lesões assintomáticas in situ. A metástase também é dependente da angiogénese: para uma célula tumoral metastizar com êxito, em geral tem de ganhar acesso à vasculatura no tumor primário, sobreviver à circulação, deter a microvasculatura do orgão alvo, sair desta vasculatura, crescer no orgão alvo e induzir a angiogénese no local alvo. Assim, a angiogénese parece ser necessária no inicio, bem como a conclusão da cascata metastática. A criticalidade da angiogénese para o crescimento e metástase de neoplasmas providencia assim um ótimo alvo potencial para esforços quimioterapêuticos. Agentes anti-angiogénicos apropriados podem atuar diretamente ou indiretamente para influenciar a angiogénese associada a tumor atrasando o seu despoletar (isto é, bloqueando um "interrutor angiogénico") ou bloqueando a neovascularização prolongada e focal que é caracteristica de muitos tipos de tumor. Terapêuticas anti-angiogénese dirigidas contra o endotélio associado a tumor e os múltiplos processos moleculares e celulares e alvos implicados na angiogénese patológica prolongada estão a ser avaliados ativamente em relação à sua segurança e eficácia em múltiplos ensaios clínicos. Contudo, tem havido sucesso limitado, até à data, com a descoberta e/ou identificação de agentes anti-angiogénicos seguros e/ou eficazes.
Fibrose é a acumulação anormal de tecido fibroso que pode ocorrer como uma parte do processo de cicatrização no tecido danificado. Tal dano tecidular pode resultar de lesão física, inflamação, infeção, exposição a toxinas e a outras causas. A fibrose do fígado (hepática), por exemplo, ocorre como uma parte da resposta de cicatrização à lesão hepática crónica. A fibrose ocorre como uma complicação de hemocromatose, doença de Wilson, alcoolismo, esquistosomíase, hepatite virai, obstrução do duto biliar, exposição a toxinas e distúrbios metabólicos. Pensa-se que esta formação de tecido cicatrizante representa uma tentativa pelo corpo de encapsular o tecido lesado. A fibrose hepática é caracterizada pela acumulação de matriz extracelular que pode ser distinguida qualitativamente da do fígado normal. Se não for tratada, a fibrose hepática progressa para cirrose (definida pela presença de nódulos encapsulados), falha hepática e morte.
Conforme sumarizado por Li e Friedman (Gastroenterol. Hepatol. 14:618-633, 1999), estratégias terapêuticas propostas e reais para a fibrose hepática incluem a remoção da causa subjacente (por exemplo, toxina ou agente infecioso), supressão da inflamação (utilizando, por exemplo, corticosteróides, antagonistas do recetor IL-1 ou outros agentes), regulação para baixo da ativação de células estreladas utilizando, por exemplo, gama interferão ou antioxidantes), promoção da degradação da matriz ou promoção da apoptose das células estreladas. Apesar do progresso recente, muitas destas estratégias ainda estão na fase experimental e as terapêuticas existentes têm como objetivo suprimir a inflamação em vez de se dirigirem aos processos bioquímicos subjacentes. Assim, continua a haver uma necessidade na arte de materiais e métodos para tratar fibrose, incluindo fibrose pulmonar e hepática.
Os tecidos fibróticos acumulam-se no coração e vasos sanguíneos como um resultado de hipertensão, cardiopatia hipertensiva, aterosclerose e infarto agudo do miocárdio. A pressão sanguínea elevada, ou hipertensão, pode ser causada por uma variedade de fatores e conduz, com frequência, ao desenvolvimento de cardiopatia hipertensiva (HHD) com progressão para paragem cardíaca e infarto agudo do miocárdio. Da mesma forma, aterosclerose e outras doenças cardíacas isquémicas também resultam, com frequência, em paragem cardíaca. Estas doenças cardiovasculares todas exibem uma acumulação de matriz extracelular ou deposição fibrótica que resulta no enrijecimento da vasculatura e enrijecimento do próprio tecido cardíaco. Esta deposição de material fibrótico é uma resposta ao dano induzido pelo estado hipertenso e/ou esclerótico, mas os efeitos desta resposta também resultam nos efeitos negativos do enrijecimento vascular e cardíaco, bem como no aumento do ventrículo. Adicionalmente, pensa-se que a fibrose cardíaca aumentada observada na doença cardiovascular interrompe ou altera os sinais transmitidos aos cardiomiócitos através de andaime de tecido cardíaco, conduzindo ainda à interrupção da função cardíaca eficiente e promovendo paragem cardíaca e infarto agudo do miocárdio. 0 documento WO 00/44910 descreve polipeptideos proteínas e anticorpos Lor-2. Peinado et al, EMBO Journal, volume 24, N.° 19, 2005, páginas 3446-3458; e Peinado et al, Cancer Research 2008, volume 68, N.° 12, 15 páginas 4541-4550, relaciona-se com LOXL2 e a sua utilização como um marcador prognóstico de carcinomas de células escamosas. 0 documento US 2007/021365 refere-se a métodos de identificar inibidores LOX e a utilização de tais inibidores para prevenir ou tratar tumores.
SUMMARY DA INVENÇÃO
Transição Epitelial-para-Mesenquimatosa (EMT) refere-se ao processo pelo qual uma célula com uma expressão/fenótipo génico caracteristico de células epiteliais (isto é, que expressa proteínas, fatores e moléculas especificas) muda ou altera os genes ou os seus níveis de expressão que resulta numa alteração no fenótipo da célula conforme exibido pela alteração ou mudança nos genes expressos. São necessárias composições que previnem EMT e que são eficazes no bloqueio da atividade de LOXL2. Tais inibidores são úteis no tratamento de doenças e distúrbios associados com níveis aberrantes de LOXL2. A presente invenção providencia um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a uma proteína lisil oxidase-tipo 2 (LOXL2), em que dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno se liga especificamente à sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 6 e inibe a atividade enzimática da proteína LOXL2, em que a inibição é não competitiva. Estas e outras modalidades da invenção são apresentadas na descrição e nas reivindicações em anexo. A referência aqui a anticorpos LOXL2 significa anticorpos da invenção, conforme definidos anteriormente.
Anticorpos que se ligam a enzimas podem ser inibidores competitivos, inibidores acompetitivos ou inibidores não competitivos. Em relação à inibição competitiva, um inibidor normalmente tem semelhança estrutural com o substrato. A inibição será evidente a baixas concentrações do substrato, mas pode ser ultrapassada a concentrações do substrato elevadas. Em relação à inibição acompetitiva, um inibidor liga-se a um local que se torna disponível depois do substrato se ligar no local ativo. A inibição será mais evidente a concentrações do substrato elevadas. Em relação à inibição não competitiva, um inibidor liga-se a um local longe do local de ligação do substrato e a inibição relativa será, em geral, a mesma para todas as concentrações do substrato. Numa modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descritos aqui, liga-se especificamente tanto a L0XL.2 de comprimento inteiro como processado. Num aspeto, tanto a L0XL2 de comprimento inteiro como processado são formas ativas da enzima.
Num aspeto, o anticorpo L0XL2 da invenção que se liga ao aminoácido da SEQ. ID N.° 6 compreende uma cadeia pesada variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID N.° 1 e uma cadeia leve variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID N.° 2.
Numa modalidade, um anticorpo L0XL2 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma cadeia pesada variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID N.° 1. Noutra modalidade, um anticorpo L0XL2 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma cadeia leve variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID N.° 2. Ainda noutra modalidade, um anticorpo L0XL2 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compete com, ou liga-se especificamente a, qualquer um dos anticorpos anti-L0XL2 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos aqui para ligação ao L0XL2. Anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ligar-se especificamente a L0XL2 com uma afinidade de ligação de pelo menos 2, 5, 10, 50, 100, 500 ou 1000 vezes superior a pelo menos um de LOX, LOXL1, LOXL3 ou LOXL4. São providenciados aqui anticorpos anti-LOXL2 humanizados. Numa modalidade, o anticorpo LOXL2 humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma cadeia pesada variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID N.° 25, 26, 27 ou 28 e uma cadeia leve variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID N.° 30, 31 ou 32.
Um anticorpo LOXL2 humanizado isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode compreender uma cadeia pesada variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID N.° 25, 26, 27 ou 28 e uma cadeia leve variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID N.° 30, 31 ou 32.
Um anticorpo LOXL2 humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode compreender uma cadeia pesada variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID N.° 25, 26, 27 ou 28.
Um anticorpo LOXL2 humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode compreender uma cadeia leve variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID N.° 30, 31 ou 32. Podem ser feitas combinações de cadeias pesadas variáveis e cadeias leves variáveis para avaliar a afinidade de ligação. É providenciado aqui um anticorpo LOXL2 humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compete com, ou que se liga especificamente a, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito aqui para ligação a L0XL2. É providenciado aqui um anticorpo L0XL2 humanizado, ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, que se liga a L0XL2, compreendendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que dita região variável da cadeia pesada compreende: (i) uma cadeia pesada FR1 com a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 33 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 33, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de glutamina (Q) por valina (V) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 24; (b) uma substituição de leucina (L) por valina (V) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 30; (c) uma substituição de valina (V) por lisina (K) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 31; (d) uma substituição de arginina (R) por lisina (K) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 32; e (e) uma substituição de treonina (T) por alanina (A) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 35; e uma deleção dos resíduos de aminoácidos 1-19; (ii) uma cadeia pesada FR2 com a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 34 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 34, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de lisina (K) por arginina (R) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 3; (b) uma substituição de arginina (R) por alanina (A) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 5, and (iii) uma cadeia pesada FR3 com a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 35 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 35, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de lisina (K) por arginina (R) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 1; (b) uma substituição de alanina (A) por valina (V) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 2; (c) uma substituição de leucina (L) por isoleucina (I) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 4; (d) uma substituição de serina (S) por treonina (T) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 10; (e) uma substituição de glutamina (Q) por ácido glutâmico (E) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 16; (f) uma substituição de treonina (T) por arginina (R) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 21; (g) uma substituição de ácido aspártico (D) por ácido glutâmico (E) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 23; (h) uma substituição de serina (S) por treonina (T) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 25; e (i) uma substituição de fenilalanina (F) por tirosina (Y) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 29; e (iv) uma cadeia pesada FR4 com a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 36 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 36, mas por uma substituição de lisina (K) por valina (V) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 7, e em que dita região variável da cadeia leve compreende: (i) uma cadeia leve FR1 com a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 49 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 49, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de alanina (A) por treonina (T) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 27; (b) uma substituição de alanina (A) por prolina (P) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 28; (c) uma substituição de prolina (P) por leucina (L) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 29; (d) uma substituição de valina (V) por leucina (L) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 31; (e) uma substituição de ácido glutâmico (E) por glutamina (Q) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 37; (d) uma substituição de serina (S) por prolina (P) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 38; (f) uma substituição de valina (V) por alanina (A) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 39; e uma deleção dos resíduos de aminoácidos 1-20; (ii) uma cadeia leve FR2 com a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 50 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N. 0 50, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de fenilalanina (F) por tirosina (Y) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 2; e (b) uma substituição de arginina (R) por lisina (K) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 5; (iii) uma cadeia leve FR3 com a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 51 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 51, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de alanina (A) por ácido aspártico (D) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 14; e (b) uma substituição de arginina (R) por lisina (K) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 18; e (iv) uma cadeia leve FR4 com a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 52 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 52, mas por uma substituição de leucina (L) por valina (V) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 7;
Numa modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, compreende uma região variável da cadeia pesada FR1 com uma sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ. ID N.° 33, 37 ou 44; uma região variável da cadeia pesada FR2 com uma sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ. ID N.° 34, 38 ou
45; uma região variável da cadeia pesada FR3 com uma sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ. ID N.° 35, 39, 46, 47 ou 48; uma região variável da cadeia pesada FR4 com uma sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ. ID N.° 36 ou 40; uma região variável da cadeia leve FR1 com uma sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ. ID N.° 49 ou 53; uma região variável da cadeia leve FR2 com uma sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ. ID N.° 50, 54 ou 60; uma região variável da cadeia leve FR3 com uma sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ. ID N.° 51, 55 ou
61; e uma região variável da cadeia leve FR4 com uma sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ. ID N.0 52 ou 5 6 .
Um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo pode ser rotulado com um rótulo detetável, um rótulo terapêutico ou ambos.
Numa modalidade, um fragmento de ligação ao antigeno é, por exemplo, uma cadeia pesada variável, uma cadeia leve variável, um Fv, um scFv, um Fab, um F(ab')2, um anticorpo fabricado por engenharia genética, um anticorpo monoclonal ou em anticorpo humanizado. É providenciado aqui um kit para tratar uma condição patológica associada com LOXL2, que compreende uma composição de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo de qualquer uma das modalidades precedentes e um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Uma condição patológica associada com L0XL2 pode ser, por exemplo, um tumor, uma metástase, angiogénese ou fibrose. Um kit pode ainda compreender um rótulo detetável, um rótulo terapêutico ou ambos. Kits podem ainda compreender instruções escritas que descrevem como conjugar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo com o rótulo detetável, um rótulo terapêutico ou ambos. Além disso, as instruções escritas podem descrever como administrar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo. Numa modalidade, as composições no kit são livres de pirogénios e podem, nalgumas ocasiões, ser liofilizadas. É providenciado aqui um método de diagnosticar uma condição patológica associada com L0XL2 que compreende avaliar um nível de L0XL2 numa amostra de um sujeito contactando dita amostra com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo descrito aqui, em que uma alteração no nível de L0XL2 na amostra em comparação com uma amostra referência indica a presença ou aumento de um tumor ou metástase. Uma condição patológica associada com L0XL2 pode ser, por exemplo, um tumor, uma metástase, angiogénese ou uma condição patológica fibrótica. Numa modalidade, um aumento nos níveis de L0XL2 na amostra em comparação com uma amostra referência indica a presença de um tumor ou metástase ou um aumento no crescimento do tumor ou metastático. Uma amostra referência é uma amostra colhida do sujeito num ponto temporal anterior ou uma amostra de outro indivíduo. Os níveis de níveis L0XL2 na amostra são detetados contactando a amostra com qualquer um dos anticorpos or fragmentos de ligação ao antigeno dos mesmos descritos aqui. Para fins de deteção, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo é rotulado de forma detetável conforme necessário, dependendo do método utilizado para avaliar a ligação. É providenciado aqui um método de inibir L0XL2 contactando uma amostra ou um tecido celular com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, descrito aqui. Numa modalidade, a ligação de dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo a L0XL2 inibe a atividade enzimática de L0XL2.
Inibir LOX ou L0XL2 pode reduzir o crescimento tumoral num sujeito seja parcialmente ou completamente. Inibir L0XL2 pode reduzir a angiogénese num sujeito, de tal modo que ocorre um beneficio terapêutico. Inibir L0XL2 pode reduzir a fibrose num sujeito, de tal modo que ocorre um beneficio terapêutico. E providenciado aqui um método de reduzir o crescimento de um tumor num sujeito, compreendendo administrar um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, descrito aqui. Um tumor pode ser um tumor primário ou um tumor metastático. Num aspeto, um tumor é, por exemplo, cancro do pulmão (incluindo adenocarcinoma pulmonar, carcinoma das células escamosas, carcinoma das células grandes, carcinoma bronquioloalveolar, carcinoma das células não pequenas, carcinoma das células pequenas, mesotelioma); cancro da mama (incluindo carcinoma dutal, carcinoma lobular, cancro da mama inflamatório, cancro da mama claro, carcinoma mucinoso); cancro colo-retal (cancro do cólon, cancro retal); cancro anal; cancro pancreático (incluindo adenocarcinoma pancreático, carcinoma de células dos ilhéus, tumores neuroendócrinos); cancro da próstata; carcinoma ovárico (carcinoma epitelial ovárico ou tumor da superfície epitelial-estroma incluindo tumor seroso, tumor endometrióide e cistadenocarcinoma mucinoso, tumor dos cordões sexuais-estroma); carcinoma hepático e do duto biliar (incluindo carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma, hemangioma); carcinoma esofágico (incluindo adenocarcinoma esofágico e carcinoma das células escamosas); linfoma de não Hodgkin; carcinoma da bexiga; carcinoma do útero (incluindo adenocarcinoma do endométrio, carcinoma seroso papilar uterino, carcinoma das células claras uterino, sarcomas uterinos e leiomiossarcomas, tumores mulerianos mistos); glioma, glioblastoma, medulablastoma e outros tumores cerebrais; cancros renais (incluindo carcinoma das células renais, cancro da mama claro, tumor de Wilm); cancro da cabeça e do pescoço (incluindo carcinomas das células escamosas); cancro do estômago (adenocarcinoma estomacal, tumor estromal gastrointestinal); mieloma múltiplo; cancro testicular; tumor das células germinativas; tumor neuroendócrino; cancro cervical; carcinóides do trato gastrointestinal, mama e outros orgãos; carcinoma de células em anel de sinete; tumores mesenquimatosos incluindo sarcomas, fibrossarcomas, hemangioma, angiomatose, hemangiopericitoma, hiperplasia estromal pseudoangiomatosa, miofibroblastoma, fibromatose, tumor miofibroblástico inflamatório, lipoma, angiolipoma, tumor das células granulares, neurofibroma, schwanoma, angiossarcoma, lipossarcoma, rabdomiossarcoma, osteossarcoma, leiomioma ou um leiomirssarcoma. Numa modalidade, um tumor é, por exemplo, um tumor do cólon, um tumor ovárico, um tumor pulmonar, um tumor esofágico, um tumor mamário, um tumor da próstata, um carcinoma. 0 tamanho do tumor no sujeito pode ser reduzido em pelo menos 10%, 25%, 50%, 70%, 90%, 95% ou mais após tratamento quando comparado com o tumor no sujeito antes do tratamento. Num aspeto, a sobrevivência de um sujeito com um tumor é aumentada em pelo menos 10 dias, 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 2 anos, 5 anos, 10 anos ou mais comparada com a de um sujeito ao qual não é administrado o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo. A carga de tumores metastáticos de um sujeito pode ser estabilizada após a administração de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, descrito aqui. Por exemplo, a carga de tumores metastáticos pode ser estabilizada durante pelo menos 10 dias, 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 2 anos, 5 anos, 10 anos ou mais. É providenciado aqui um método de inibir a angiogénese num sujeito por um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, descrito aqui. É providenciado aqui um método de inibir uma doença fibrótica num sujeito administrando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, descrito aqui. Doenças fibróticas incluem, mas não se limitam a, fibrose hepática, fibrose pulmonar, fibrose renal, fibrose cardíaca e escleroderma. Numa modalidade, a fibrose renal inclui, mas não se limita a, nefropatia diabética, refluxo vesicoureteral, fibrose renal tubulointersticial; glomerulonefrite ou nefrite glomerular, incluindo glomerulosclerose segmentar focal e glomerulonefrite membranosa e nefrite glomerular mesangiocapilar. Numa modalidade, a fibrose hepática resulta em cirrose, e em condições patológicas associadas, tais como hepatite virai crónica, doença hepática gorda não alcoólica (NAFLD), esteato-hepatite alcoólica (ASH), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), cirrose biliar primária (PBC), cirrose biliar e hepatite autoimune. É providenciado aqui um método de diminuir a formação de matriz extracelular contactando uma amostra ou tecido celular com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, descrito aqui. Administração ou contacto pode ocorrer, num exemplo, por administração parentérica. É providenciado aqui um método de monitorizar a resposta de um sujeito à administração de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, descrito aqui detetando os níveis e/ou atividade de LOXI2.
Numa modalidade, dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, é rotulado com um rótulo terapêutico . É contemplada aqui a terapêutica de combinação na qual os métodos compreendem ainda co-administrar um segundo agente terapêutico. Numa modalidade, o segundo agente terapêutico é um anticorpo ou um agente quimioterapêutico. E providenciada aqui uma utilização de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, descrito aqui na preparação de uma formulação para inibir L0XL2, reduzir o crescimento tumoral, inibir a angiogénese, inibir uma doença fibrótica ou diminuir a formação de matriz extracelular num sujeito. Numa modalidade, dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo é rotulado com um rótulo terapêutico e, opcionalmente, um rótulo diagnóstico. É providenciada aqui uma utilização de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, descrito aqui na preparação de uma formulação para diagnosticar um tumor ou metástase que compreende avaliar os níveis de L0XL2 numa amostra de um paciente, em que uma alteração nos níveis de L0XL2 na amostra em comparação com uma amostra referência indica a presença de um tumor ou metástase ou um aumento no crescimento do tumor ou metastático. Numa modalidade, dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo é rotulado com um rótulo diagnóstico.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Características da invenção são apresentadas com particularidade nas reivindicações em anexo. Um melhor entendimento das caracteristicas e vantagens da presente invenção será obtido por referência à seguinte descrição detalhada que apresenta modalidades ilustrativas, nas quais os princípios da invenção são utilizados e os desenhos acompanhantes. A Figura 1 ilustra a Enzimologia da Lisil Oxidase. Enzimas LOX/L atuam através de um mecanismo ping-pong que pode ser descrito pela cinética de Michaelis-Menten. A Figura 2 ilustra modos comuns de inibição enzimática. A Figura 3 ilustra βΑΡΝ é um inibidor competitivo de L0XL2. A Figura 4 ilustra modos de inibição enzimática: L0XL2. A Figura 5 ilustra localização de L0XL2 extracelular e função de L0XL2 extracelular.
A Figura 6A providencia as sequências de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada e a Figura 6B providencia as sequências de aminoácidos de uma região variável da cadeia leve de um anticorpo que se liga à região SRCR3-4 de L0XL2. Para cada região variável, são mostrados péptidos sinais em itálico, CDRs são sublinhadas e o inicio da estrutura constante é mostrada a negrito. A Figura 7A providencia as sequências de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada e as Figuras 7B e 7C providenciam sequências de aminoácidos de duas regiões variáveis da cadeia leve de anticorpos que se ligam a LOX. Para cada região variável, são mostrados péptidos sinais em itálico e CDRs são sublinhadas. A Figura 8 providencia uma atualização do rastreio B de proteínas utilizando anticorpos anti-L0XL2. A atividade enzimática de L0XL2 foi avaliada. A Figura 9 ilustra a atividade enzimática do anticorpo antÍ-L0XL2 AB0023. A Figura 10 demonstra que o anticorpo anti-LOXL2 AB0023 é um inibidor não competitivo. A Figura 11 ilustra a afinidade de ligação e a taxa de dissociação do anticorpo anti-LOXL2 AB0023. A Figura 12 ilustra o mapeamento do domínio do anticorpo anti-LOXL2 AB0023; ο AB0023 liga-se ao domínio SRCR 3-4 de LOXL2. A Figura 13 mostra que o anticorpo anti-LOXL2 AB0023 demonstra inibição de migração/invasão consistente no colagénio I e colagénio IV, de sobrenadantes através de 10 ml de material de preparação e 100 ml de preparação ampliado e material ascites. A inibição parcial também foi observada em ensaios de adesão celular. Em amostras teste, as células no ensaio migram em direção ao soro e a fluorescência é medida para determinar a contagem e migração das células. A barra mais à esquerda é uma amostra controlo na qual o anticorpo está presente e a camada de baixo contém soro (controlo positivo para invasão celular). A segundo barra da esquerda é um controlo negativo no qual o anticorpo está presente e a camada de baixo não contém soro. A Figura 14 providencia sequências de aminoácidos das cadeias pesada variável (VH) e leve variável (VL) de anticorpo monoclonal murino AB0023 (anti-hLOXL2). Regiões determinantes de complementaridade (CDRs) são mostradas a sublinhado negrito. A Figura 14 também providencia quatro variantes humanizadas do anticorpo monoclonal murino. Resíduos nas regiões estrutura (FR) das cadeias leve e pesada variáveis humanizadas que diferem do anticorpo monoclonal murino são mostradas por traços interrompidos (---) ou por sublinhado em itálico. A Figura 15 demonstra que M64 se liga a LOX numa forma dependente da dose. O Lote 3 tem uma KD de 6,6 nM, o Lote 4 tem uma KD de 5,0 nM e o Lote 5 tem uma KD de 5,7 nM. A Figura 16 ilustra a afinidade de ligação do anticorpo anti-LOX M64. A Figura 17 demonstra que os anticorpos anti-LOXL2 inibiram o crescimento celular de quatro linhas celulares derivadas de cancro.
As Figuras 18 demonstra um efeito sinérgico de um anticorpo anti-LOX em combinação com cisplatina. Os valores IC50 de M64 também foram determinados em quatro linhas celulares.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao campo da medicina, incluindo diagnóstico e tratamento de cancro. Um aspeto da invenção refere-se a L0XL2 como indicadores da progressão da doença e um alvo para agentes terapêuticos. A presente invenção providencia metodologia inovadora e composição relacionada e kits para diagnosticar ou monitorizar várias doenças associadas com a proliferação celular anormal, angiogénese e fibrose, utilizando agentes gue reconhecem especificamente formas ativas ou maduras de proteínas tipo lisil oxidase (L0XL2). São providenciados métodos para diagnosticar ou monitorizar metástase cancerígena num sujeito, compreendendo: avaliar os níveis de L0XL2 ativo ou atividade no sangue ou num tumor, pelos guais uma alteração nos níveis de L0XL2 ativo ou atividade no sangue ou no tumor em comparação com uma amostra referência, indica a presença de crescimento tumoral metastático.
Conforme descrito com mais detalhe a seguir, os níveis de L0XL2 ativo podem ser avaliados por vários métodos incluindo, mas não limitados a, imunohistoquímica utilizando anticorpos que se ligam especificamente à forma ativa ou madura de L0XL2. A atividade enzimática do L0XL2 ativo pode ser medida utilizando vários métodos incluindo, mas não limitados a, ensaios fluorométricos e cromogénicos.
Também são providenciados aqui anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que reconhecem especificamente formas ativas de L0XL2, métodos para gerar anticorpos contra formas ativas de L0XL2 e método de utilizer os anticorpos para tratar a proliferação celular anormal, angiogénese e fibrose. I. Definições gerais A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado como vulgarmente entendidos por alguém com habilitação comum na arte à qual esta invenção pertence. Se uma definição apresentada nesta secção é contrária a, ou de outra forma inconsistente com uma definição apresentada nas patentes, pedidos, pedidos publicados e noutras publicações, a definição apresentada nesta secção prevalece. Os cabeçalhos são providenciados aqui por conveniência apenas.
Conforme utilizado aqui, "um" ou "uma" significa "pelo menos um" ou "um ou mais." A frase "substituição de aminoácidos conservadora" refere-se ao agrupamento de aminoácidos com base em certas propriedades comuns. Uma forma funcional de definir propriedades comuns entre aminoácidos individuais é analisar as frequências normalizadas de alterações de aminoácidos entre proteínas correspondentes de organismos homólogos (Schulz, G. E. e R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). De acordo com tais analyses, grupos de aminoácidos podem ser definidos onde aminoácidos dentro de um grupo se trocam preferencialmente uns com os outros e, portanto, são parecidos um com o outro mais no seu impacto na estrutura global da proteína (Schulz, G. E. e R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). Exemplos de grupos de aminoácidos definidos desta forma incluem: (i) um grupo carregado, consistindo em Glu e Asp, Lys, Arg e His, (ii) um grupo carregado positivamente, consistindo em Lys, Arg e His, (iii) um grupo carregado negativamente, consistindo em Glu e Asp, (iv) um grupo aromático, consistindo em Phe, Tyr e Trp, (v) um anel de nitrogénio, consistindo em His e Trp, (vi) um grande grupo não polar alifático, consistindo em Vai, Leu e Ile, (vii) um grupo ligeiramente polar, consistindo em Met e
Cys, (viii) um grupo pequeno de resíduos, consistindo em Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gin e Pro, (ix) um grupo alifático consistindo em Vai, Leu, lie, Met e Cys, e (x) um grupo hidroxilo pequeno consistindo em Ser e Thr.
Além dos grupos apresentados anteriormente, cada resíduo de aminoácidos pode formar o seu grupo e o grupo formado por um aminoácido individual pode ser referido por uma abreviatura com simplesmente uma e/ou três letras para aquele aminoácido vulgarmente utilizada na arte, conforme descrito anteriormente.
Um "resíduo conservado" é um aminoácido que é relativamente invariante ao longo de uma gama de proteínas semelhantes. Com frequência, os resíduos conservados variarão apenas ao serem substituídos com um aminoácido semelhante, conforme descrito anteriormente para "substituição de aminoácidos conservadora".
Pretende-se que a letra "x" ou "xaa", conforme utilizada nas sequências de aminoácidos aqui, indique que qualquer um dos vinte aminoácidos padrão pode ser colocado nesta posição, a menos que especificamente indicado o contrário. Para os fins do desnho péptido-mimético, um "x" ou um "xaa" numa sequência de aminoácidos pode ser substituído por uma mímica do aminoácido presente na sequência alvo ou o aminoácido pode ser substituído por um espaçador de essencialmente qualquer forma que não interfira com a atividade do péptido-mimético. "Homologia" ou "identidade" ou "semelhança" refere-se à semelhança de sequências enre dois péptidos ou entre duas moléculas de ácido nucleico. Homologia e identidade podem cada ser determinadas comparando uma posição em cada sequência que pode ser alinhada para fins de comparação. Quando uma posição equivalente nas sequências comparadas é ocupada pela mesma base ou aminoácido, então as moléculas são idênticas nessa posição; quando o local equivalente ocupado pelo mesmo ou por um resíduo de aminoácido semelhante (por exemplo, semelhante na natureza estérica e/ou eletrónica), então as moléculas podem ser referidas homólogas (semelhantes) nessa posição. Expressão como uma percentagem de homologia/semelhança ou identidade refere-se a uma função do número de aminoácidos idênticos ou semelhantes nas posições partilhadas pelas sequências comparadas. Uma sequência que é "não relacionada" ou "não homóloga" partilha menos de 40% de identidade, apesar de preferencialmente menos de 25% de identidade com uma sequência da presente invenção. Ao comparar duas sequências, a ausência de resíduos (aminoácidos ou ácidos nucleicos) ou presença de resíduos extra também diminui a identidade e homologia/semelhança. O termo "homologia" descreve uma comparação abseada matematicamente de semelhanças de sequência que é utilizada para identificar genes ou proteínas com funções ou motivos semelhantes. As sequências de ácidos nucleicos (nucleotídeo, oligonucleotídeo) e aminoácidos (proteína) da presente invenção podem ser utilizadas como uma "sequência de consulta" para realizer uma pesquisa contra bases de dados públicas para, por exemplo, identificar outros membros da família, sequências relacionadas ou homólogas. Tais pesquisas podem ser realizadas utilizando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Pesquisas do nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, classificação=l00, comprimento da palavra=12 para obter sequências nucleotídicas homólogas às moléculas de ácido nucleico da invenção. Pesquisas dos aminoácidos BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, classificação=50, comprimento da palavra=3 para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas proteína da invenção. Para obter alinhamentos com intervalos para fins comparativos, pode ser utilizado BLAST com intervalos, conforme descrito em Altschul et al. , (1997) Nucleic Acid Res. 25(17):3389-3402. Ao utilizar os programas BLAST e BLAST com intervalos, podem ser utilizados os parâmetros por defeito dos respetivos programas (por exemplo, XBLAST e BLAST) (ver, www.ncbi.nlm.nih.gov).
Conforme utilizado aqui, "identidade" significa a percentagem de nucleotideos ou resíduos de aminoácidos idênticos nas posições correspondentes em duas ou mais sequências quando as sequências estão alinhadas para maximizar a correspondência da sequência, isto é, tendo em consideração intervalos e inserções. A identidade pode ser prontamente calculada por métodos conhecidos, incluindo, mas não limitados, aos descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., editor, Oxford University Press, Nova Iorque, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., editor, Academic Press, Nova Iorque, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., e Griffin, H. G., editores, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., editores, M Stockton Press, Nova Iorque, 1991; e Carillo, H., e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Métodos para determinar a identidade são desenhados para originar a maior correspondência entre as sequências testadas. Além disso, métodos para determinar a identidade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Métodos de programas de computador para determinar a identidade entre duas sequências incluem, mas não se limitam a, o pacote do programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acid Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, S. F. et al. , J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990) e Altschul et al. Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). O programa BLAST X está publicamente disponível a partir do NCBI e de outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al. , J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) . O algoritmo Smith Waterman bem conhecido também pode ser utilizado para determinar identidade. O termo "substancialmente idêntica" significa identidade entre uma primeira sequência de aminoácidos que contém um número suficiente ou mínimo de resíduos de aminoácidos que são i) idênticos a ou ii) substituições conservadoras de resíduos de aminoácidos alinhados numa segunda sequência de aminoácidos, de modo que a primeira e segunda sequências de aminoácidos podem ter um domínio estrutural comum e/ou atividade funcional comum. Por exemplo, sequências de aminoácidos substancialmente idênticas a LOX contêm um domínio estrutural comum com pelo menos cerca de 60% ou 65% de identidade, provavelmente 75% de identidade, mais provavelmente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com LOX. Por exemplo, sequências de aminoácidos que contêm um domínio estrutural comum com pelo menos cerca de 60% ou 65% de identidade, provavelmente 75% de identidade, mais provavelmente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com LOXL2 são designadas suficientemente ou substancialmente idênticas. No contexto de sequências nucleotídicas, o termo "substancialmente idêntica" é utilizado aqui para referir-se a uma primeira sequência de ácidos nucleicos que contém um número suficiente ou mínimo de nucleotideos que são idênticos aos nucleotídeos alinhados numa segunda sequência de ácidos nucleicos, de modo que a primeira e a segunda sequências nucleotídicas codificam um polipeptídeo com atividade funcional comum ou codificam um domínio polipeptídico estrutural comum ou uma atividade polipeptídica funcional comum. Por exemplo, sequências nucleotídicas com pelo menos cerca de 60% ou 65% de identidade, provavelmente 75% de identidade, mais provavelmente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com sequências de ácidos nucleicos providenciadas aqui são designadas substancialmente idênticas. II. Proteínas Lisil Oxidase (LOX) e tipo Lisil Oxidase (LOXL)
Tipicamente, os tumores sólidos contêm áreas de baixa tensão de oxigénio (hipoxia). Células hipóxicas colocam um grande problema no tratamento de cancro, porque estas células são altamente agressivas, metastáticas e resistentes à terapêutica. Os mecanismos subjacentes que contribuem para estas caracteristicas são mal compreendidos. A metástase coloca um problema particular no cancro da mama, porque não existe tratamento eficaz para a maioria dos pacientes com cancro da mama metastático detetável (Steeg, PS. Br. Can. Res. 2(6): 396-9 (2000)). A matriz extracelular (ECM) pode ter uma influência curcial nas células tumorais (Chang e Werb. Trends Cell. Biol. 11: S37-43 (2001); e Radisky et al. Semin. Cancer Bio. 11: 87-95 (2001)). Ratinhos expostos a hipoxia exibem aumentos específicos de tecido na atividade da lisil oxidase (LOX), uma amina oxidase que desempenha um papel essencial na formação e manutenção do ECM (Brody et al. Am. Rev. Respir. Dis. 120: 1289-95 (2001)). Um estudo recente de microarray confirmou o LOX como um gene induzido por hipoxia numa variedade de linhas celulares (Denko, NC. Oncogene 22: 5907-14 (2003)). Contudo, não foi identificado um papel biológico de LOX em condições hipóxicas. LOX inicia a reticulação covalente de colagénios e elastina no ECM, aumentando a deposição da matriz insolúvel e força tênsil (Kagan e Li. J. Cell. Biochem. 88: 660-72 (2003)). A expressão de LOX é essencial para a cicatrização e função do tecido conjuntivo normal e os ratinhos knock-out morrem pouco depois do parto devido à instabilidade cardiovascular (Homstra et al. J. Biol. Chem. 278: 14387-93 (2003)).
Atividade de LOX diminuída está associada com doenças, tais como síndrome de Ehler-Danlos (Pinnell, SR. J. Invest. Dermatol. 79(Supp 1): 90S-92S (1982); Royce et al. Biochem. J. 192: 579-86 (1980); e Khakoo et al. Clin. Genet. 51: 109-14 (1997)). Atividade de LOX aumentada contribui para doenças fibróticas e de remodelação do tecido, tais como cirrose hepática (Kagan, HM. Pathol. Res. Pract. 190: 910-0 (1994); Chanki et al. Br. J. Dermatol. 133: 710-5 (1995); e Ooshima e Midorikawa. Jpn. Circ. J. 41: 1337-40 (1977)).
Expressão elevada de LOX correlaciona-se com preparação aumentada no cancro das células renais (Stassar et al. Br. J. Cancer, 85: 1372-82 (2001)) e é observada expressão aumentada de LOX em linhas celulares de cancro da mama altamente metastáticas e/ou invasivas (Kirschmann et al. Breast Cancer Res. Treat. 55: 127-36 (1999); e Kirschmann et al. Cancer Res. 62: 4478-83 (2002)). Em contraste, LOX atua como um supressor de tumor em reversores não tumorgénicos de fibroblastos ras-transformados (Smith-Mungo e Kagan. Matrix Biol. 16: 387-98 (1998)) . A perda de LOX está associada com tumorgénese em vários tipos de cancro, tais como cancro gástrico, do cólon e da próstata (Ren et al. Cancer Res. 58: 1285-90 (1998); Cxiszar et al. Int. J. Cancer 97: 636-42 (2002); e Kaneda et al. Cancer Res. 64: 6410-5 (2004)). Pareceria, assim, que o papel supressor de tumor de LOX depende do tipo de célula e estado de transformação. Demonstrou-se recentemente que o domínio pró-péptido (e não a enzima ativa) é responsável pelas atividades de supressão de tumor. No cancro da mama, a expressão aumentada de LOX está associada com a reação stromal inicial (Decitre et al. Lab. Invest. 78: 143-51 (1998)) e o tratamento com LOX anti-senso neste tipo de célula cancerígena previne a invasão in vitro (Kirschmann et al. Cancer Res. 62: 4478-83 (2002)). A sequência de aminoácidos de LOXL2 partilha uma vasta homologia de sequência com a ligação ao cobre conservada e domínios catalíticos de ambos LOX e LOXL. Estes domínios conservados são codificados por cinco exões consecutivos dentro dos genes LOX, LOXL e L0XL2 que também mantêm conservação da estrutura exão-intrão. A conservação do nucleotídeo e sequência de aminoácidos deduzida dentro da extremidade carboxilo-terminal de L0XL2, LOX e LOXL incluem o domínio da ligação ao cobre (WEWHSCHQHYH) em LOX e LOXL e WIWHDCHRHYH em L0XL2 com as quatro histidinas que fornecem os ligandos de nitrogénio para o complexo de coordenação de cobre específico para proteínas lisil oxidase (Krebs e Krawetz, Biochim. Biophys. Acta 1202: 7-12 (1993)). O local ativo em LOX (DIDCQWWIDITDVXPGNY) e em LOXL2 (DIDC-QWVDITDVPPPGDY) contém, em cada, um resíduo Tyr (Y) na extremidade COOH-terminal, que participa juntamente com um resíduo Lys na formação do co-fator quinona que está presente nestas proteínas. Dez cisteínas características de LOX e LOXL são, da mesma forma, conservadas em LOXL2 (Kagan et al., (1994) em Molecular Biology and Pathology of Elastic Tissue (Mecham, R. P. e Roberts, L., editores), Ciba Foundation Symposium Series, Wiley, Chichester, Reino Unido). Um fator de crescimento e domínio recetor de citocina presentes nas proteínas LOX e LOXL também foi identificado dentro da sequência de aminoácidos derivada de LOXL2. Quatro repetições do domínio rico em cisteína recetor captador também estão presentes de LOXL2 (Saito et al. , J. Biol. Chem 272: 8157-8160 (1997), Resnick et al. , Trends Biochem Sei. 19: 5-8 (1994)).
Três locais de terminação de transcrição principais foram notados dentro dos domínios 3'-UTR de ADNc de LOXL2. O primeiro local de terminação tem 690 bp 3' do codão de terminação, o segundo local tem 740 bp e o local de terminação de transcrição final tem 900 bp 3' do codão de terminação. Estes ARNm todos têm 3'-UTRs que diferem ligeiramente em tamanho. A maioria das fronteiras exão-intrão do gene LOXL2 mostra a sequência consenso (C/T)AG- exão-GT(A/G). Os tamanhos dos 11 exões do gene L0XL2 oscilam entre 112 e 940 bp. Apesar do gene LOXL2 ter 11 exões, cinco exões consecutivos (exões 6-10), que codificam a ligação ao cobre e domínios catalíticos, exibem 84% de semelhança de sequência e os tamanhos dos exões são muito semelhantes aos exões correspondentes dos genes LOX e LOXL. Todos os outros exões no gene LOXL2 são divergentes em ambos sequência e tamanho. LOXL2 foi identificado em todos os tecidos com a exceção de leucócitos sanguíneos. O ARNm de LOXL2 foi detetado no coração, fígado e pâncreas; a expressão é significativamente superior na placenta, próstata, útero e pâncreas (razões entre 2 e 3) comparada com a expressão inferior no cérebro, pulmão, músculo esquelético, timo e rim (razões abaixo de 0,5). (Jourdan-Le Saux, et al. J. Biol. Chem., 274(18): 12939-12944 (1999)). A expressão de LOX e as diferentes proteínas LOXL varia em doenças diferentes. Isto pode ser devido a um número de razões, tais como a diferença na distribuição do tecido, processamento, domínios, regulação da atividade, bem como outras diferenças entre as proteínas. Por exemplo, LOX e LOXL estão implicadas em doenças fibróticas, tais como ambas LOX e LOXL são altamente expressas em miofibroblastos à volta de áreas fibróticas (Kagen, Pathol. Res. Pract. 190:910-919 (1994); Murawaki et al., Hepatology 14:1167-1173 (1991); Siegel et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:2945-2949 (1978); Jourdan Le-Saux et al. , Biochem.
Biophys. Res. Comm. 199:587-592 (1994); Kim et al. , J. Cell
Biochem. 72:181-188 (1999)) . LOX e os vários LOXL também estão implicados num número de cancros. Por exemplo, demonstrou-se que LOXL e LOXL4 são silenciados epigeneticamente e podem inibir a via sinalizadora da quinase regulada pelo sinal ras/extracelular no cancro da bexiga humano (Wu et al. , Cancer Res. 67:4123-4129 (2007)).
Outros mostraram a regulação para cima seletiva e amplificação do gene LOXL4 no carcinoma das células escamosas da cabeça e do pescoço (Gorough et al., J. Pathol. 212:74-82 (2007)). LOX e LOXL2 também foram implicados num número de tumores, tais como cancros do cólon e esofágico (Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70:1-32 (2001)) . No cancro da mama, os membros da família LOX e LOXL foram ligados ao cancro (Kirschmann et al., Cancer Res . 62:448-4483 (2002)) .
Lisil oxidase catalisa a desaminação oxidativa de resíduos de peptidil lisina e hidroxilisina nos colagénios, e resíduos de peptidil lisina na elastina. Os peptidil aldeídos resultantes condensam espontâneamente e passam por reações de oxidação para formar as reticulações covalentes derivadas de lisina necessárias para a integridade estrutural normal da matriz extracelular. Na reação da lisil oxidase com os seus substratos, peróxido de hidrogénio (H202) e amónia são libertados em quantidades estoiquiométricas com o produto peptidil aldeído. Ver, por exemplo, Kagan et al., J. Cell. Biochem. 88:660-72 (2003) .
Lisil oxidase é segregada para o ambiente extracelular onde é depois processada por clivagem proteolítica para uma enzima funcional com 30 kDa e um pró-péptido com 18 kDa. A lisil oxidase com 30 kDa está enzimaticamente ativa, ao passo que a pró-enzima com 50 kDa não. Pró-colagénio C-proteinases processam pró-lisil oxidase para a sua forma ativa e são produtos dos genes Bmpl, Till e T112. A localização da enzima é principalmente extracelular, apesar de lisil oxidase processada também estar localizada intracelularmente e nuclearmente. A codificação de sequência para o pró-péptido é moderadamente (60-70%) conservada entre as proteínas LOX e LOXL, ao passo que a codificação de sequência para a região C-terminal com 30 kDa da pró-enzima na qual o local ativo está localizado é altamente conservada (aproximadamente 95%) . Ver Kagan et al. , J. Cell Biochem. 59:329-38 (1995) . LOX é induzida por um número de fatores de crescimento e esteróides, tais como TGF-β, TNF-α e interferão (Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70:1-32 (2001)) .
Sabes-se que existem cinco lisil oxidases diferentes tanto em humanos como em ratinhos, LOX e quatro LOX relacionadas ou proteínas tipo LOX (LOXL, LOXL2, LOXL3, LOXL4) . LOX e as proteínas tipo LOX são referidas coletivamente como "LOX/LOXL" para os fins da presente revelação. As cinco formas de lisil oxidases residem em cinco cromossomas diferentes. Estes membros da família mostram alguma sobreposição na estrutura e função, mas parecem ter funções distintas também. Por exemplo, apesar da atividade principal de LOX ser a oxidação de resíduos de lisina específicos no colagénio e elastina fora da célula, também pode atuar intracelularmente, onde pode regular a expressão génica. Além disso, LOX induz a quimiotaxia de monócitos, fibroblastos e células do músculo liso. Além disso, uma deleção de LOX em ratinhos knockout parece ser letal no parto (Hornstra et al. , J. Biol. Chem. 278:14387-14393 (2003)), ao passo que a deficiência em LOXL não causa fenótipo de desenvolvimento severo (Bronson et al., Neurosci. Lett. 390:118-122 (2005)). A atividade principal de LOX é a oxidação de resíduos de lisina específicos no colagénio e elastina fora da célula, contudo, também pode atuar intracelularmente, onde pode regular a expressão génica (Li et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:12817-12822 (1997), Giampuzzi et al., J. Biol. Chem. 275:36341-36349 (2000)) Além disso, LOX induz a quimiotaxia de monócitos, fibroblastos e células do músculo liso (Lazarus et al., Matrix Biol. 14:727-731 (1995) Nelson et al. , Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 188:346-352 (1988)). O próprio LOX é induzido por um número de fatores de crescimento e esteróides, tais como TGF-β, TNF-α e interferão (Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70:1-32 (2001)). Estudos recentes atribuíram outros papéis ao LOX em diversas funções biológicas, tais como regulação do desenvolvimento, supressão do tumor, motilidade celular e senescênca celular. 0 papel diverso de LOX, e da sua família amino oxidase recentemente descoberta, tipo LOX (LOXL), pode desempenhar papéis importantes com as suas localizações intracelular e extracelular.
Conforme utilizado aqui, o termo "lisil oxidase" refere-se a uma enzima que catalisa a seguinte reação: peptidil-L-lisil-péptido + 02 + H20 -> peptidil-alisil- péptido + NH3 + H202. Outros sinónimos para lisil oxidase (EC 1.4.3.13) incluem proteína-lisina 6-oxidase e proteína-L-lisina:oxigénio 6-oxidoredutase (desaminante). Ver, por exemplo, Harris et al. , Biochim. Biophys. Acta 341:332-44 (1974); Rayton et al. , J. Biol. Chem. 254:621-26 (1979);
Stassen, Biophys. Acta 438:49-60 (1976). Uma quinoproteína que contém cobre com um aduto lisil da tirosilquinona no seu centro ativo, LOX catalisa a oxidação de peptidil lisina para resultar na formação de peptidil alfa-aminoadípico-delta-semialdeído. Uma vez formado, este semialdeído pode condensar espontâneamente com aldeídos vizinhos ou com outros grupos lisil para formar reticulações intra e intercadeias. Ver, por exemplo, Rucker et al., Am. J. Clin. Nutr. 67:996S-1002S (1998). O termo "LOX" refere-se a uma enzima com uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica a um polipeptídeo expresso ou traduzido de uma das seguintes sequências: EMBL/N. 0s de acesso do Genbank: M94054 (SEQ. ID N.° 10); AAA5 952 5.1 (SEQ. ID N.° 11) - ARNm; S45875 (SEQ. ID N.°
12); AAB2 354 9.1 (SEQ. ID N.° 13) - ARNm; S78694 (SEQ. ID N.° 14); AAB21243.1 (SEQ. ID N.° 15) - ARNm; AF039291 (SEQ. ID N.° 16); AAD0 2130.1 (SEQ. ID N.° 17) - ARNm; BC074820 (SEQ. ID N.° 18); AAH74820.1 (SEQ. ID N.° 19) - ARNm; BC074872 (SEQ. ID N.° 20); M84150 (SEQ. ID N.° 22); AAA59541.1 (SEQ. ID N.° 23) - ADN genómico. Uma modalidade
de LOX é prépróproteína lisil oxidase humana (hLOX) com uma sequência de aminoácidos (SEQ. ID N.° 7), uma hLOX segregada após clivagem do péptido sinal, tal como a SEQ. ID N.° 8 ou uma hLOX Madura após processamento proteolítico, tal como a SEQ. ID N.° 9. O LOX tem dominios de proteína altamente conservados, conservados em várias espécies incluindo humanos, ratinho, ratazana, galinha, peixes e Drosophila. A família de LOX humano tem uma região C-terminal altamente conservada contendo os 205 aminoácidos do domínio catalítico de LOX. A região conservada contém a ligação ao cobre (Cu), domínio tipo recetor de citocina conservado (CRL) e o local do co-fator lisil-tirosilquinona (LTQ). Doze resíduos de cisteína são também, da mesma forma, conservados, em que dois deles reside dentro da região pré-pró-péptido e dez estão na forma processada cataliticamente ativa de LOX (Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70:1-32 (2001)). A região conservada também inclui um domínio de ligação à fibronectina. A região pré-pró-péptido de LOX contém o péptido sinal e é dividida, prevê-se que o local de clivagem esteja entre Cys21-Ala22, para gerar um péptido sequência sinal e uma forma pró-péptido aminoácido com 48kDa de LOX, que ainda está inativa. O pró-péptido é N-glicosilado durante a passagem através do aparelho de Golgi que é segregado para o ambiente extracelular onde a pró-enzima, ou pró-péptido, é dividido entre Glyl68-Aspl69 por uma metaloendoprotease, um pró-colagénio C-proteinase, que são produtos dos genes Bmpl, Tllll e T112. BMP I (proteína morfogenética do osso I) é um pró-colagénio C-proteinase que processa o pró-péptido para produzir uma enzima funcional com 30 kDa e um pró-péptido com 18 kDa. A codificação de sequência para o pró-péptido é moderadamente (60-70%) conservada, ao passo que a codificação de sequência para a região C-terminal com 30 kDa da pró-enzima na qual o local ativo está localizado é altamente conservada (aproximadamente 95%). (Kagan e Li, J. Cell. Biochem. 88:660-672 (2003); Kagan et al., J. Cell Biochem. 59:329-38 (1995)). As unidades N-glicosil também são subsequentemente removidas. LOX ocorre nas formas não processadas e/ou processadas (maduras). A forma madura de LOX está tipicamente ativa apesar de, nalgumas modalidades, LOX não processada também estar ativa.
Exemplos particulares de uma enzima ou proteína LOXL são descritos em Moinar et al., Biochim Biophys Acta. 1647:220-24 (2003); Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70:1-32 (2001); e no documento WO 01/83702 publicado a 8 de novembro de 2001. (de notar que nestas 3 publicações, "LOXL1" foi referido como "LOXL", ao passo que na presente invenção "LOXL" é utilizado para se referir a proteínas tipo lisil oxidase em geral, não só LOXL1.) Estas enzimas incluem LOXL1, codificado por ARNm depositado no GenBank/EMBL BC015090; AAH15090.1; LOXL2, codificado por ARNm depositado no GenBank/EMBL U89942; LOXL3, codificado por ARNm depositado no GenBank/EMBL AF282619; AAK51671.1; e LOXL4, codificado por ARNm depositado no GenBank/EMBL AF 33 8 4 41; AAK71934.1. Péptidos sinal potenciais semelhantes aos descritos anteriormente para LOX foram previstos no terminal amino de LOXL, LOXL2, LOXL3 e LOXL4. Os locais de clivagem do sinal previstos estão entre Gly25-Gln26 para LOXL, entre Ala25-Gln26, para LOXL2 e entre Gly25-Ser26 para LOXL3. O consenso para a clivagem de BUMP-1 em pró-colagénios e pró-LOX está entre Ala/Gly-Asp e é seguido, com frequência, por um resíduo acídico ou carregado. Um local de clivagem potencial para gerar LOXL ativo é Gly303-Asp304, contudo, é depois seguido por um Pró atípico. LOXL3 também tem um local de clivagem potencial em Gly447-Asp448, que é seguido por um Asp, o processamento neste local pode produzir um péptido ativo de tamanho semelhante para ativar LOX. Um local de clivagem potencial de BMP-1 também foi identificado dentro de LOXL4, nos resíduos Ala569-Asp570 (Kim et al. , J. Biol. Chem. 278:52071-52074 (2003)). LOXL2 também pode ser clivado proteoliticamente de forma análoga aos outros membros da família LOXL e segregado (Akiri et al., Cancer Res. 63:1657-1666 (2003)).
As enzimas LOX e LOXL atuam através de um mecanismo ping-pong que pode ser descrito pela cinética de Michaelis-Menten (ver Figura 1).
Um exemplo de proteína LOX ou LOXL incluem a enzima com uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica a um polipeptídeo expresso ou traduzido de uma das seguintes sequências: EMBL/acessos a Genbank N.°s: M94054; AAA59525.1-ARNm; S45875; AAB2 354 9.1-ARNm; S78694; AAB21243.1-ARNm; AF039291; AAD02130.1-ARNm; BC074820; AAH74820.1-ARNm; BC074872; AAH74872.1-ARNm; M84150; AAA59541.1-ADN genómico.
Os termos "LOX" e "LOXL" também abrangem fragmentos ou derivados funcionais que retêm substancialmente a atividade enzimática que catalisa a desaminação dos resíduos lisil. Tipicamente, um fragmento ou derivado funcional retém pelo menos 50% of 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% da sua atividade de oxidação de lisil. Também se pretende que uma proteína LOX ou uma LOXL2 possam incluir substituições de aminoácidos conservadoras que não alteram substancialmente a sua atividade. Substituições de aminoácidos conservadoras adequadas são conhecidas daqueles habilitados nesta arte e podem ser realizadas, em geral, sem alterar a atividade biológica da molécula resultante. Aqueles habilitados nesta arte reconhecerão que, em geral, substituições de aminoácidos simples em regiões não essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica. Ver, por exemplo, Watson, et al., Molecular Biology of the Gene, 4a Edição, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., página 224. Substituições de aminoácidos conservadoras e não conservadoras foram descritas anteriormente.
Uma característica não conhecida como sendo comum entre as proteínas LOX e LOXL é os domínios ricos em cisteína recetor de captura (SRCR) . LOX e LOXL carecem de domínios SRCR, ao passo que LOXL2, LOXL3 e LOXL4 cada têm quatro domínios SRCR no terminal N. Os domínios SRCR são encontrados em proteínas segregadas, transmembranares ou da matriz extracelular. Os domínios SRCR também são conhecidos por mediarem a ligação ao ligando num número de proteínas segregadas e recetoras (Hoheneste et al., Nat. Struct. Biol. 6:228-232 (1999); Sasaki et al., EMBO J. 17:1606-1613 (1998)) . Outro domínio único de LOXL é a presença de um domínio rico em prolina (Moinar et al. , Biochimica Biophsyica Acta 1647:220-224 (2003)). A distribuição do tecido também pode diferir entre LOX e os vários LOXL. LOX é altamente expressa no coração, placenta, testículos, pulmão, rim e útero, mas marginalmente no cérebro e no fígado. LOXL1 é expressa na placenta, rim, músculo, coração, pulmão e pâncreas, e tal como com a LOX, tem muito menor expressão no cérebro e no fígado (Kim et al., J. Biol. Chem. 270:7176-7182 (1995)). LOXL2 é altamente expressa no útero, placenta e noutros orgãos, mas à semelhança de LOX e LOXL, com menor expressão no cérebro e no fígado (Jourdan Le-Saux et al. , J. Biol. Chem. 274:12939:12944 (1999)). LOXL3 é altamente expressa nos testículos, baço e próstata, moderadamente na placenta, e não no fígado, ao passo que LOXL4 é altamente expressa no fígado (Huang et al. , Matrix Biol. 20:153-157 (2001); Maki e Kivirikko, Biochem. J. 355:381-387 (2001); Jourdan Le-Saux et al. , Genomics 74:211-218 (2001); Asuncion et al. , Matrix Biol. 20:487-491 (2001)). A expressão, ou implicação de LOX e as diferentes proteínas LOXL, em doenças também pode variar. Isto pode sr devido a um número de razões, tais como a diferença na distribuição do tecido, processamento, domínios, regulação da atividade, bem como a outras diferenças entre as proteínas. Por exemplo, LOX e LOXL estão implicadas em doenças fibróticas, já que ambas LOX e LOXL são altamente expressas nos miofibroblastos à volta de áreas fibróticas (Kagen, Pathol. Res. Pract. 190:910-919 (1994); Murawaki et al. , Hepatology 14:1167-1173 (1991); Siegel et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:2945-2949 (1978); Jourdan Le-Saux et al. , Biochem. Biophys. Res. Comm. 199:587-592 (1994);
Kim et al., J. Cell Biochem. 72:181-188 (1999)). LOX e as várias LOXL também estão implicadas num número de cancros. Por exemplo, demonstrou-se que LOXL e LOXL4 são silenciadas epigeneticamente e podem inibir a via de sinalização da quinase regulada pelo sinal ras/extracelular no cancro da bexiga humano (Wu et al., Cancer Res. 67:4123-4129 (2007)).
Outros mostraram a regulação para cima seletiva e amplificação do gene LOXL4 no carcinoma das células escamosas da cabeça e do pescoço (Gorough et al., J. Pathol. 212:74-82 (2007)). LOX e LOXL2 também foram implicados num número de tumores, tais como cancros do cólon e esofágico (Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70:1-32 (2001)) . No cancro da mama, LOX e os membros da família LOXL foram ligados ao cancro (Kirschmann et al. , Cancer Res . 62:448-4483 (2002)) . III. Transição epitelial-mesenquimatosa A transição epitelial-para-mesenquimatosa (EMT) refere-se ao processo pelo qual uma célula com uma expressão génica/característica de fenótipo de célula epithelial (isto é, que expressa proteínas, fatores e moléculas específicas) muda ou altera os genes ou os seus níveis de expressão que resulta numa alteração no fenótipo da célula conforme exibido pela alteração ou mudança nos genes expressos.
As células epiteliais e mesenquimatosas representam linhagens distintas, cada com um perfil de expressão génica único que partilha atributos específicos de cada tipo de célula. A conversão de uma célula epithelial numa célula mesenquimatosa requer alterações na morfologia, arquitetura celular, adesão e/ou capacidade de migração. Células tumorais avançadas exibem, com frequência, uma regulação para baixo conspícua de marcadores epiteliais e uma perda de junções intercelulares, resultando numa perda de polaridade epitelial e adesão intercelular reduzida. A perda de características epiteliais é, com frequência, acompanhada de motilidade celular e expressão de genes do mesênquima aumentada. EMT pode incluir perda de inibição de contacto, control do crescimento alterado e/ou capacidade de invasão potenciada (Christiansen e Rajasekaran, Cancer Res., 66(17): 8319-8326 (2006); e Thiery et al. , Curr. Opin. Cell. Biol., 15: 740-6 (2003)). Características moleculares e morfológicas indicadoras de EMT correlacionam-se com fraca diferenciação histológica, destruição da integridade do tecido e metástase. EMT providencia mecanismos para as células epiteliais ultrapassarem as limitações físicas impostas sobre elas pelas junções intercelulares e adotarem um fenótipo móbil (Burdsal et al. Development, 118:829-44 (1993); e Nieto et al., Mech, Dev., 105:27-35 (2001)).
Marcadores moleculares vulgarmente utilizados para EMT incluem expressão aumentada de N-caderina e vimentina, localização nuclear de β-catenina e produção aumentada de fatores de transcrição, tais como Snaill (caracol), Snail2 (lesma), Twist, EF1/ZEB1, SIP1/ZEB2 e/ou E47 que inibem a produção de E-caderina. Marcadores fenotípicos para um EMT incluem, mas não se limitam a, uma capacidade aumentada para migração e invasão tridimensional, bem como resistência à apoptose. Estes marcadores foram ainda correlacionados com a indução de EMT e uma associação com fenótipos cancerígenos. A ocorrência de EMT durante a progressão do tumor permite às células tumorais adquirirem a capacidade de se infiltrarem no tecido circundante e, em última análise, metastizarem em locais distantes. Alterações na expressão génica dentro das células tumorais pode indicar uma progressão do padrão de expressão génica de epitelial ou tipo epithelial para um padrão de expressão génica mesenquimatoso ou tipo mesenquimatoso. A titulo de exemplo, a identificação da perda de E-caderina está correlacionada com carcinoma metastático, bem como com resistência a terapêuticas cancerígenas, tais como inibidores EGFR e inibidores IGF-R1. A análise de muitos tipos diferentes de cancro revela que as células tumorais circulantes, ou aquelas encontradas como micrometástases, evidenciam a conversão do mesênquima com base em alterações na expressão num conjunto de marcadores. Estes marcadores incluem, mas não se limitam a, EGFR, E-caderina, ErbB3, RAB25, integrina beta 6, caderina-2, proteína de ligação ao fator de crescimento de fibroblasto 1, distal-less homeo box 1, ZEBl (fator de transcrição 8), SIP1 e vimentina. A título de exemplo, um perfil de expressão génica tipo epitelial inclui expressão ou expressão aumentada de genes, tais como E-caderina, ErbB3 ou EGFR. Um perfil de expressão génica tipo epitelial pode incluir a expressão de um ou mais destes genes, pelo menos dois, ou pelo menos três destes genes.
Como com os cancros resistentes a terapêutica previamente descritos, os níveis de expressão de E-caderina, ErbB3, RAB25, integrina beta 6, caderina-2, proteína de ligação ao fator de crescimento de fibroblasto 1, distal-less homeo box 1, ZEBl (fator de transcrição 8), SIP1, TGF-β, F0XC2, GSK-3B, Smad-3, Pez, Snaill, Snail2 e ILK, e vimentina representam genes que são comuns a características de EMT, bem como com aquelas células tumorais/cancros baseados no epitélio que desenvolvem resistência às suas respetivas terapêuticas. A presente invenção também se relaciona, em geral, com um método para tratar um paciente com cancro e particularmente um cancro que experimentou EMT. Os inventores descobriram que cancros que experimentaram EMT ou que passaram de um padrão de expressão génica tipo epitelial para um padrão de expressão génica tipo mesenquimatoso são recetivos a inibidores LOX/LOXL.
Para avaliação da expressão de célula epitelial tumoral ou de biomarcador mesenquimatoso, podem ser utilizadas amostras de pacientes que contêm células tumorais, ou proteínas ou ácidos nucleicos produzidas por estas células tumorais, nos métodos descritos, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente U.S. N.° 20070065858. Em suma, o nível de expressão do biomarcador pode ser avaliado avaliando a quantidade (por exemplo, quantidade absoluta ou concentração) do marcador numa amostra da célula tumoral, por exemplo, uma biópsia do tumor obtida de um paciente ou outra amostra de paciente que contém material derivado do tumor (por exemplo, sangue, soro, urina ou outros fluídos corporais ou excreções, conforme descritos aqui anteriormente) . A amostra celular pode, obviamente, ser sujeita a uma variedade de técnicas preparativas e de armazenamento pós-colheita bem conhecidas (por exemplo, extração de ácido nucleico e/ou proteína, fixação, armazenamento, congelamento, ultrafiltração, concentração, evaporação, centrifugação, etc.) antes de avaliar a quantidade do marcador na amostra. Da mesma forma, as biópsias do tumor também podem ser sujeitas a técnicas preparativas e de armazenamento pós-colheita, por exemplo, fixação. É possível detetar a expressão de proteínas biomarcadoras com pelo menos uma porção que é exibida na superfície das células tumorais que a expressam. Trata-se de uma questão simples para o artesão habilitado a de determinar se uma proteína marcadora, ou uma porção da mesma, está exposta na superfície celular. Por exemplo, métodos imunológicos podem se rutilizados para detetar tais proteínas em células inteiras, ou podem ser utilizados métodos computadorizados de análise de sequências bem conhecidos para prever a presença de pelo menos um domínio extracelular (isto é, incluindo ambas proteínas segregadas e proteínas com pelo menos um domínio de superfície celular). A expressão de uma proteína marcadora com pelo menos uma porção que é exibida na superfície de uma célula que a expressa pode ser detetada sem necessariamente lisar a célula tumoral (por exemplo, utilizando um anticorpo rotulado que se liga especif icamente com um domínio de superfície celular da proteína). A expressão de biomarcadores pode ser avaliada por qualquer um de uma ampla variedade de métodos bem conhecidos para detetar a expressão de um ácido nucleico ou proteína transcrito. Exemplos não limitantes de tais métodos incluem, por exemplo, métodos imunológicos para deteção de proteínas segregadas, de superfície celular, citoplasmáticas ou nucleares, métodos de purificação de proteínas, ensaios de atividade ou função proteica, métodos de hibridização de ácidos nucleicos, métodos de transcrição reversa de ácidos nucleicos e métodos de amplificação de ácidos nucleicos. A expressão de um biomarcador pode ser avaliada utilizando um anticorpo (por exemplo, um anticorpo radio-rotulado, rotulado com cromóforo, rotulado com fluoróforo ou rotulado com enzima), um derivado de anticorpo (por exemplo, um anticorpo conjugado com um substrato ou com a proteína ou ligando de um par proteína-ligando (por exemplo, biotina-estreptavidina) ou um fragmento de anticorpo (por exemplo, um anticorpo de cadeia simples, um domínio hipervariável de anticorpo isolado, etc.) que se liga especificamente com uma proteína biomarcadora ou fragmento da mesma, incluindo uma proteína biomarcadora que foi submetida a todas ou a uma porção de modificações pós-translacionais às quais é normalmente sujeita na célula tumoral (por exemplo, glicosilação, fosforilação, metilação etc.). A expressão de um biomarcador também pode ser avaliada preparing ARNm/ADNc (isto é, um polinucleotídeo transcrito) a partir de células numa amostra de paciente e hibridizando o ARNm/ADNc com um polinucleotídeo referência que é um complemento de um ácido nucleico biomarcador, ou de um fragmento do mesmo. 0 ADNc pode, opcionalmente, ser amplificado utilizando qualquer um de uma variedade de métodos de reação em cadeia da polimerase antes da hibridização com o polinucleotídeo referência. A expressão de um ou mais biomarcadores pode, da mesma forma, ser detetada utilizando PCR quantitativa para avaliar o nível de expressão do(s) biomarcador(es). Em alternativa, pode ser utilizado qualquer um de muitos métodos conhecidos de detetar mutações ou variantes (por exemplo, polimorfismos de nucleotídeos únicos, deleções, etc.) de um biomarcador para detetar a ocorrência num paciente.
Uma mistura de polinucleotideos transcritos obtida da amostra pode ser contactada com um substrato tendo fixo ao mesmo um polinucleotídeo complementar à ou homólogo com pelo menos uma porção (por exemplo, pelo menos 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 500 ou mais resíduos de nucleotídeos) de um ácido nucleico biomarcador. Se os polinucleotideos complementares a, ou homólogos com, são detetáveis diferencialmente no substrato (por exemplo, detetáveis utilizando diferentes cromóforos ou fluoróforos ou fixos em posições selecionadas diferentes), então os níveis de expressão de uma pluralidade de biomarcadores podem ser avaliados simultâneamente utilizando um único substrato (por exemplo, um microarray "chip gene" dos polinucleotideos fixos em posições selecionadas). Quando um método de avaliar a expressão do biomarcador é utilizado que envolve hibridização de um ácido nucleico com outro, a hibridização pode ser realizada em condições de hibridização estritas.
Quando uma pluralidade de biomarcadores da invenção são utilizados nos métodos da invenção, o nível de expressão de cada biomarcador numa amostra de paciente pode ser comparado com o nível de expressão normal de cada um da pluralidade de biomarcadores em amostras não cancerígenas do mesmo tipo, seja numa mistura de reação única (isto é, utilizando reagentes, tais como diferentes sondas fluorescentes, para cada biomarcador) ou em misturas de reação individuais correspondentes a um ou mais dos biomarcadores. 0 nível de expressão de um biomarcador em tecido humano normal (isto é, não cancerígeno) pode ser avaliado numa variedade de maneiras. Este nível de expressão normal pode ser avaliado avaliando o nível de expressão do biomarcador numa porção de células que parecem ser não cancerígenas e depois comparando o nível de expressão normal com o nível de expressão numa porção das células tumorais. À medida que se torna disponível mais informação como um resultado do desempenho rotineiro dos métodos descritos aqui, podem ser utilizados valores de médias populacionais para expressão normal dos biomarcadores. Em alternativa, o nível de expressão normal de um biomarcador pode ser determinado avaliando a expressão do biomarcador numa amostra do paciente obtida de um paciente que não padece de cancro, de uma amostra do paciente obtida de um paciente antes do despoletar suspeito do cancro no paciente, de amostras de paciente arquivadas e afins.
Um método exemplar para detetar a presença ou ausência de uma proteína ou ácido nucleico biomarcador numa amostra biológica envolve obter uma amostra biológica (por exemplo, um fluido corporal associado a tumor) de um sujeito teste e contactar a amostra biológica com um compost ou um agente capaz de detetar o polipeptídeo ou ácido nucleico (por exemplo, ARNm, ADN genómico ou ADNc). Os métodos de deteção podem, assim, ser utilizados para detetar ARNm, proteína, ADNc ou ADN genómico, por exemplo, numa amostra biológica in vitro bem como in vivo. Técnicas in vitro para deteção de ARNm incluem, por exemplo, hibridações Northern e hibridações in situ. Técnicas in vitro para deteção de uma proteína biomarcadora incluem, mas não se limitam a, ensaios imunossorbentes ligados a enzima (ELISAs), Western blots, imunoprecipitação e imunofluorescência. Técnicas in vitro para deteção de ADN genómico incluem, por exemplo, hibridações Southern. Técnicas in vivo para deteção de ARNm incluem, por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR), hibridações Northern e hibridações in situ. Além disso, técnicas in vivo para deteção de uma proteína biomarcadora incluem introduzir num sujeito um anticorpo rotulado dirigido contra a proteína ou fragmento da mesma. Por exemplo, o anticorpo pode ser rotulado com um marcador radioativo cuja presença e localização num sujeito pode ser detetada por técnicas de tomografia convencionais.
Um princípio geral de tais ensaios diagnósticos e prognósticos envolve preparar uma amostra ou mistura de reação que pode conter um biomarcador, e uma sonda, em condições apropriadas e durante um tempo suficiente para permitir que o biomarcador e a sonda interajam e se liguem, formando, assim, um complexo que pode ser removido e/ou detetado na mistura de reação. Estes ensaios podem ser conduzidos numa variedade de maneiras.
Por exemplo, um método de conduzir tal ensaio envolve ancorar o biomarcador ou sonda num suporte de fase sólida, também referido como um substrato, e detetar complexos biomarcador/sonda alvo ancorados na fase sólida no final da reação. Numa modalidade de tal método, uma amostra de um sujeito, que é para ser ensaiada para a presença e/ou concentração do biomarcador, pode ser ancorada num veículo ou suporte de fase sólida. Noutra modalidade, a situação contrária é possível, na qual a sonda pode ser ancorada a uma fase sólida e uma amostra de um sujeito pode ser permitida reagir como um componente não ancorado do ensaio.
Existem vários métodos estabelecidos para ancorar componentes do ensaio a uma fase sólida. Estes incluem, sem limitação, moléculas de biomarcador ou sonda que são imobilizadas através da conjugação de biotina e estreptavidina. Tais componentes biotinilados do ensaio podem ser preparados a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-sucinimida) utilizando técnicas conhecidas na arte (por exemplo, kit de biotinilação, Pierce Chemicals, Rockford, 111.) e imobilizados nos poços de placas com 96 poços revestidos com estreptavidina (Pierce Chemical). Em certas modalidades, as superficies com componentes do ensaio imobilizados podem ser preparadas atempadamente e armazenadas. Outros veículos ou suportes de fase sólida adequados para tais ensaios incluem qualquer material capaz de ligar a classe de moléculas à qual o biomarcador ou sonda pertence. Suportes ou veículos bem conhecidos incluem, mas não se limitam a, vidro, polistireno, náilon, polipropileno, náilon, polietileno, dextrano, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, gabros e magnetite. Para conduzir ensaios com as abordagens previamente mencionadas, o componente não imobilizado é adicionado à fase sólida na qual o segundo componente é ancorado. Depois da reação estar completa, os componentes não complexados podem ser removidos (por exemplo, por lavagem) em condições tais que quaisquer complexos formados permanecerão imobilizados na fase sólida. A deteção de complexos biomarcador/sonda ancorados à fase sólida pode ser conseguida através de um número de métodos resumidos aqui. Numa modalidade, a sonda, quando é o componente do ensaio não ancorado, pode ser rotulada para o fim de deteção e leitura do ensaio, seja diretamente ou indiretamente, com rótulos detetáveis discutidos aqui e que são bem conhecidos de alguém habilitado na arte.
Também é possível detetar diretamente a formação de complexos biomarcador/sonda sem manipulação ou rotulagem adicional de qualquer componente (biomarcador ou sonda), por exemplo utilizando a técnica de transferência de energia de fluorescência (isto é, FET, ver, por exemplo, Lakowicz et al., Patente U.S. N.° 5 631 169; Stavrianopoulos, et al. , Patente U.S. N.° 4 868 103) . Um rótulo com fluoróforo na primeira molécula, dadora, é selecionado de tal maneira que, no momento da excitação com luz incidente de comprimento de onda adequado, a sua energia fluorescente emitida será absorvida por um rótulo fluorescente numa segunda molécula aceitadora, que, por sua vez, é capaz de fluorescer devido à energia absorvida. Alternadamente, a molécula proteína dadora pode simplesmente utilizer a energia fluorescente natural dos resíduos de triptofano. São escolhidos rótulos que emitem diferentes comprimentos de onda de luz, para que o rótulo da molécula aceitadora possa ser diferenciado do da dadora. Uma vez que a eficiência da transferência de energia entre os rótulos está relacionada com a distância que separa as moléculas, as relações espaciais entre as moléculas podem ser avaliadas. Numa situação na qual ocorre ligação entre as moléculas, a emissão fluorescente do rótulo da molécula aceitadora no ensaio deveria ser máxima. Um evento de ligação FET pode ser medido de forma conveniente através de meios de deteção fluorométrica convencionais bem conhecidos na arte (por exemplo, utilizando um fluorímetro).
Noutra modalidade, a determinação da capacidade de uma sonda de reconhecer um biomarcador pode ser conseguida sem rotular qualquer um componente do ensaio (sonda ou biomarcador) utilizando uma tecnologia, tal como Análise de Interação Biomolecular em tempo real (BIA) (ver, por exemplo, Sjolander, S. e Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 e Szabo et al. , 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705) . Conforme utilizado aqui, "BIA" ou "ressonância de plasma de superfície" é uma tecnologia para estudar interações biospecíficas em tempo real, sem rotular qualquer um dos interatuantes (por exemplo, BIAcore). Alterações na massa à superfície da ligação (indicador de um evento de ligação) resultam em alterações do índice refrativo da luz próximo da superfície (o fenómeno ótico de ressonância de plasma de superfície (SPR)), resultando num sinal detetável que pode ser utilizado como uma indicação de reações em tempo real entre moléculas biológicas.
Em alternativa, noutra modalidade, podem ser conduzidos ensaios análogos diagnósticos e prognósticos com biomarcador e sonda como solutos numa fase líquida. Em tal ensaio, o biomarcador e sonda complexados são separados dos componentes não complexados por qualquer uma de um número de técnicas convencionais, incluindo, mas não limitadas a: centrifugação diferencial, cromatografia, eletroforese e imunoprecipitação. Na centrifugação diferencial, os complexos biomarcador/sonda podem ser separados dos componentes não complexados do ensaio através de uma série de etapas de centrifugação, devido aos diferentes equilíbrios de sedimentação dos complexos com base nos seus diferentes tamanhos e densidades (ver, por exemplo, Rivas, G., e Minton, A. P., 1993, Trends Biochem Sci. 18(8):284-7). Técnicas cromatográficas convencionais também podem ser utilizadas para separar moléculas complexadas de moléculas não complexadas. Por exemplo, a cromatografia por filtração de gel separa moléculas com base no tamanho e através da utilização de uma resina de filtração de gel apropriada num formato de coluna; por exemplo, o complexo relativamente maior pode ser separado dos componentes não complexados relativamente mais pequenos. Da mesma forma, as propriedades de carga relativamente diferentes do complexo biomarcador/sonda quando comparadas com os componentes não complexados podem ser exploradas para diferenciar os componentes complexados dos não complexados, por exemplo através da utilização de resinas de cromatografia de troca de iões. Tais resinas e técnicas cromatográficas são bem conhecidas daqueles habilitados na arte (ver, por exemplo, Heegaard, N. H., 1998, J. Mol. Recognit. Winter 11(1-6) :141-8; Hage, D. S., e Tweed, S. A. J. Chromatogr B Biomed Sei Appl Oct. 10, 1997; 699(1-2) :499-525) . A eletroforese por gel também pode ser empregue para separar componentes do ensaio complexados de componentes não ligados (ver, por exemplo, Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1987-1999) . Nesta técnica, complexos de proteínas ou ácidos nucleicos são separados com base no tamanho ou carga, por exemplo. Para manter a interação da ligação durante o processo eletroforético, são tipicamente utilizados materiais de matriz de gel e condições não desnaturantes na ausência de agente redutor. As condições apropriadas para o ensaio particular e componentes do mesmo serão bem conhecidas de alguém habilitado na arte.
Noutra modalidade, o nível do biomarcador ARNm pode ser determinado tanto in situ e pelos formatos in vitro numa amostra biológica utilizando métodos conhecidos na arte. O termo "amostra biológica" pretende-se que inclua tecidos, células, fluidos biológicos e isolados dos mesmos, isolados de um sujeito, bem como tecidos, células e fluidos presentes dentro de um sujeito. Muitos métodos de deteção de expressão utilizam ARN isolado. Para métodos in vitro, qualquer técnica de isolamento de ARN que não selecione contra o isolamento de ARNm pode ser utilizada paraa purificação de ARN das células tumorais (ver, por exemplo, Ausubel et al. , ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque 1987-1999). Adicionalmente, grandes números de amostras de tecido podem prontamente ser processados utilizando técnicas bem conhecidas daqueles habilitados na arte, tais como, por exemplo, o processo de isolamento de ARN de etapa única de
Chomczynski (1989, Patente U.S. N.° 4 843 155) . O ARNm isolado pode ser utilziado em ensaios de hibridização ou amplificação que incluem, mas não se limitam a, análises Southern ou Northern, análises de reação em cadeia da polimerase e enaios com sondas. Um método diagnóstico para a deteção de níveis de ARNm envolve contactar o ARNm isolado com uma molécula de ácido nucleico (sonda) que pode hibridizar com o ARNm codificado pelo gene a ser detetado. A sonda de ácido nucleico pode ser, por exemplo, um ADNc de cadeia inteira, ou uma porção do mesmo, tal como um oligonucleotídeo de pelo menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 ou 500 nucleotídeos de comprimento e suficiente para hibridizar especificamente em condições estritas a um ARNm ou ADN genómico que codifica um biomarcador da presente invenção. Outras sondas adequadas para utilização nos ensaios diagnósticos da invenção são descritas aqui. A hibridização deum ARNm com a sonda indica que o biomarcador em questão está a ser expresso.
Num formato, o ARNm é imobilizado numa superfície sólida e contactado com uma sonda, por exemplo, correndo o ARNm isolado num gel de agarose e transferindo o ARNm do gel para uma membrana, tal como nitrocelulose. Num formato alternativo, a(s) sonda(s) são imobilizadas numa superfície sólida e o ARNm é contactado com a(s) sonda(s), por exemplo, num array chip gene Affymetrix. Um artesão ahbilitado pode rapidamente adaptar métodos de deteção de ARNm conhecidos para utilização na deteção do nível de ARNm codificado pelos biomarcadores da presente invenção.
Um método alternativo para determinar o nível de biomarcador ARNm numa amostra envolve o processo de amplificação de ácidos nucleicos, por exemplo, por RT-PCR (a modalidade experimental apresentada em Mullis, 1987, Patente U.S. N.° 4 683 202), reação em cadeia de ligase (Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:189-193), replicação de sequência auto-sustentada (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificação transcricional (Kwoh et al. , 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-Beta Replicase (Lizardi et al. , 1988, Bio/Technology 6:1197), replicação por circulo rolante (Lizardi et al. , Patente U.S. N.° 5 854 033) ou qualquer outro método de amplificação de ácidos nucleicos, seguido da deteção das moléculas amplificadas utilizando técnicas bem conhecidas daqueles habilitados na arte. Estes esquemas de deteção são especialmente úteis para a deteção de moléculas de ácido nucleico se tais moléculas estão presentes em vários números baixos. Conforme utilizado aqui, os iniciadores de amplificação são definidos como sendo um par de moléculas de ácido nucleico que podem emparelhar com regiões 5' ou 3' de um gene (mais ou menos cadeias, respetivamente, ou vice-versa) e contêm uma região curta entre elas. Em geral, os iniciadores de amplificação têm cerca de 10 a 30 nucleotideos de comprimento e flanqueiam uma região com cerca de 50 a 200 nucleotideos de comprimento. Em condições apropriadas e com os reagentes apropriados, tais iniciadores permitem a amplificação de uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência nucleotidica flanqueada pelos iniciadores.
Para os métodos in situ, o ARNm não precisa de ser isolado das células tumorais antes da deteção. Em tais métodos, uma amostra de célula ou tecido é preparada e/ou processada utilizando métodos histológicos conhecidos. A amostra é depois imobilizada num suporte, tipicamente uma lâmina de vidro, e depois contactada com uma sonda que pode hibridizar com o ARNm que codifica o biomarcador.
Como uma alternativa a fazer determinações com base no nível de expressão absoluto do biomarcador, as determinações podem ser baseadas no nível de expressão normalizado do biomarcador. Os níveis de expressão são normalizados corrigindo o nível de expressão absoluto de um biomarcador comparando a sua expressão com a expressão de um gene que não é um biomarcador, por exemplo, um gene de housekeeping que é expresso constitutivamente. Genes adequados para normalização incluem genes de housekeeping, tais como o gene da actina ou genes específicos das células epiteliais. Esta normalização permite a comparação do nível de expressão numa amostra, por exemplo, numa amostra de paciente, com outra amostra, por exemplo, uma amostra de não tumor ou entre amostras de diferentes fontes.
Em alternativa, o nível de expressão pode ser providenciado cmo um nível de expressão relativo. Para determinar um nível de expressão relativo de um biomarcador (por exemplo, um biomarcador mesenquimatoso), o nível de expressão do biomarcador é determinado para 10 ou mais, 20 ou mais, 30 ou mais, 40 ou mais ou 50 ou mais amostras dos isolados de célula normal versus cancerígena antes da determinção do nível de expressão para a amostra em questão. O nível de expressão médio de cada um dos genes ensaiado no número maior de amostras é determinado e é utilizado como um nível de expressão padrão de valor para o biomarcador. O nível de expressão do biomarcador determinado para a amostra teste (nível de expressão absoluto) é depois dividido pelo valor de expressão médio obtido para aquele biomarcador. Isto providencia um nível de expressão relativo.
Noutra modalidade da presente invenção, uma proteína biomarcadora é detetada. Um tipo de agente para detetar uma proteína biomarcadora da invenção é um anticorpo capaz de ligar-se a tal proteína ou a um fragmento da mesma, tal como, por exemplo, um anticorpo detetavelmente rotulado. Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais. Pode sr utilizado um anticorpo intacto, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, polipeptídeo de cadeia de ligação única). O termo "rotulado," em relação à sonda ou anticorpo, pretende-se que abranja a rotulagem direta da sonda ou anticorpo por acoplamento (isto é, ligação física) uma substância detetável à sonda ou anticorpo, bem como rotulagem indireta da sonda ou anticorpo por reatividade com outro reagente que é rotulado diretamente. Exemplos de rotulagem indireta incluem deteção de um anticorpo primário utilizando um anticorpo secundário rotulado de forma fluorescente e rotulagem final de uma sonda de ADN com biotina, de tal modo que pode ser detetada com estreptavidina rotulada de forma fluorescente.
Podem ser isoladas proteínas de células tumorais utilizando técnicas que são bem conhecidas daqueles habilitados na arte. Os métodos de isolamento de proteínas empregues podem, por exemplo, ser tais como aqueles descritos em Harlow e Lane (Harlow e Lane, 1988, Anticorpos: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).
Pode ser empregue uma variedade de formatos para determinar se uma amostra contém uma proteína que se liga a um dado anticorpo. Exemplos de tais formatos incluem, mas não se limitam a, imunoensaio enzimático (EIA), radioimmunoassay (RIA), análise Western blot e ensaio imunossorbente ligado a enzima (ELISA). Um artesão habilitado pode rapidamente adaptar métodos de deteção de proteína/anticorpo conhecidos para utilização na determinação de se as células tumorais expressam um biomarcador da presente invenção.
Num formato, podem ser utilizados anticorpos, ou fragmentos ou derivados de anticorpo, em métodos tais como Western blots ou técnicas de imunofluorescência para detetar as proteínas expressas. Em tais utilizações, tanto os anticorpos como as proteínas podem ser imobilizados num suporte sólido. Suportes de fase sólida ou veículos adeqaudos incluem qualquer suporte capaz de ligar-se a um antígeno ou a um anticorpo. Suportes ou veículos bem conhecidos incluem vidro, polistireno, polipropileno, polietileno, dextrano, náilon, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, gabros e magnetite. Alguém habilitado na arte conhecerá muitos outros veículos adequados para ligar o anticorpo ou antígeno e será capaz de adaptar tal suporte para utilização com a presente invenção. Por exemplo, proteínas isoladas de células tumorais podem ser corridas em eletroforese em gel de poliacrilamida e imobilizadas num suporte de fase sólida, tal como nitrocelulose. 0 suporte pode depois ser lavado com tampões adequados seguido de tratamento com o anticorpo detetavelmente rotulado. 0 suporte de fase sólida pode depois ser lavado com o tampão uma segunda vez para remover anticorpo não ligado. A quantidade de rótulo ligado no suporte sólido pode depois ser detetada por meios convencionais.
Para ensaios ELISA, os pares de ligação específicos podem ser do tipo imune ou não imune. Os pares de ligação específicos imunes são exemplificados por sistemas antígeno-anticorpo ou sistemas hapteno/anti-hapteno. Podem ser mencionados fluoresceina/anti-fluoresceina, dinitrofenil/anti-dinitrofenil, biotina/anti-biotina, péptido/anti-péptido e afins. 0 membro anticorpo do par de ligação específico pode ser produzido pelos métodos habituais familiares daqueles habilitados na arte. Tais métodos envolvem imunizar um animal com o membro antígeno do par de ligação específico. Se o membro antígeno do par de ligação específico não for imunogénico, por exemplo, um hapteno, pode ser acoplado de forma covalente a uma proteína veículo para se tornar imunogénico. Os pares de ligação não imunes incluem sistemas em que os dois componentes partilham uma afinidade natural um pelo outro, mas não são anticorpos. Pares não imunes exemplares são biotina-estreptavidina, fator-vitamina B 12 intrínseco, proteína de ligação do ácido fólico-folato e afins.
Uma variedade de métodos estão disponíveis para rotular de forma covalente anticorpos com membros de pares de ligação específicos. Os métodos são selecionados com base na natureza do membro do par de ligação específico, do tipo de ligação desejado e da tolerância do anticorpo a várias químicas de conjugação. A biotina pode ser acoplada de forma covalente a anticorpos utilizando derivados ativos comercialmente disponíveis. Alguns destes são biotina-N-hidroxi-sucinimida que se liga a grupos amina em proteínas; biotina hidrazida que se liga a frações de carbohidrato, aldeídos e grupos carboxilo através de ma união carbodiimida; e biotina maleimida e iodoacetil biotin que se liga a grupos sulfidrilo. A fluoresceína pode ser acoplada a grupos amina de proteína utilizando isotiocianato de fluoresceína. Os grupos de dinitrofenilo podem ser acoplados a grupos amina de proteína utilizando sulfato de 2,4-dinitrobenzeno ou 2,4-dinitrofluorobenzeno. Podem ser empregues outros métodos de conjugação convencionais para unir anticorpos monoclonais a um membro de um par de ligação especifico incluindo dialdeido, união por carbodiimida, reticulação homofuncional e reticulação heterobifuncional. A união por carbodiimida é um método eficaz de unir grupos carboxilo numa substância a grupos amina de outra. A união por carbodiimida é facilitada utilizando o reagente comercialmente disponível l-etil-3-(dimetil-aminopropil)-carbodiimida (EDAC).
Reticulantes homobifuncionais, incluindo os imidoésteres bifuncionais e N-hidroxisucinimida ésteres bifuncionais, estão comercialmente disponíveis e são empregues para unir grupos amina numa substância a grupos amina de outra. Reticulantes heterobifuncionais são reagentes que possuem diferentes grupos funcionais. Os reticulantes heterobifuncionais comercialmente disponíveis mais comuns têm um N-hidroxisucinimida éster reativo a amina como um grupo funcional e um grupo sulfidrilo reativo como o segundo grupo funcional. Os grupos sulfidrilo reativos mais comuns são as maleimidas, piridil dissulfidos e halogénios ativos. Um dos grupos funcionais pode ser um arilnitreno fotoativo, que quando irradiado reage com uma variedade de grupos. 0 anticorpo detetavelmente rotulado ou membro detetavelmente rotulado do par de ligação especifico é preparado unindo a um repórter, que pode ser um material isótopo radioativo, enzima, fluorogénico, quimioluminescente ou eletroquimico. Dois isótopos radioativos vulgarmente utilizados são 1251 e 3H. Procedimentos convencionais de rotulagem isotópica radioativa incluem os métodos de cloramina T, lactoperoxidase e de Bolton-Hunter para 1251 e metilação redutora para 3H. 0 termo "detetavelmente rotulado" refere-se a uma molécula rotulada de tal maneira que pode ser rapidamente detetada pela atividade enzimática intrínseca do rótulo ou pela ligação ao rótulo de outro componente, que pode ele próprio ser rapidamente detetado.
Enzimas adequadas para utilização nesta invenção incluem, mas não se limitam a, peroxidase de raiz-forte, fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicose oxidase, luciferases, incluindo pirilampo e renila, β-lactamase, ureiase, proteína fluorescente verde (GFP) e lisozima. A rotulagem com enzimas é facilitada utilizando dialdeído, união por carbodiimida, reticulantes homobifuncionais e v reticulantes heterobifuncionais, conforme descrito anteriormente, para unir um anticorpo com um membro de um par de ligação específico. 0 método de rotulagem escolhido depende dos grupos funcionais disponíveis na enzima e do material a ser rotulado e da tolerância de ambas condições de conjugação. 0 método de rotulagem utilizado na presente invenção pode ser um de, mas não limitado a, quaisquer dos métodos convencionais empregues incluindo aqueles descritos por
Engvall e Pearlmann, Immunochemistry 8, 871 (1971), Avrameas e Temynck, Immunochemistry 8, 1175 (1975), Ishikawa et al. , J. Immunoassay 4(3):209-327 (1983) e Jablonski, Anal. Biochem. 148:199 (1985). A rotulagem pode ser conseguida por métodos indiretos, tais como utilizando espaçadores ou outros membros de pares de ligação específicos. Um exemplo disto é a deteção de um anticorpo biotinilado com estreptavidina não rotulada e enzima biotinilada, com estreptavidina e enzima biotinilada a ser adicionada sequencial ou simultâneamente. Assim, de acordo com a presente invenção, o anticorpo utilizado para detetar pode ser detetavelmente rotulado diretamente com um repórter ou indiretamente com um primeiro membro de um par de ligação específico. Quando o anticorpo é unido a um primeiro membro de um par de ligação específico, então a deteção é efetuada reagindo o anticorpo-primeiro membro de um complexo de ligação especifico com o segundo membro do par de ligação que é rotulado ou não rotulado, conforme mencionado anteriormente.
Além disso, o anticorpo detetor não rotulado pode ser detetado reagindo o anticorpo não rotulado com um anticorpo rotulado específico para o anticorpo não rotulado. Nesta ocasião, "detetavelmente rotulado", conforme utilizado anteriormente, é interpretado como contendo um epítopo pelo qual um anticorpo específico para o anticorpo não rotulado se pode ligar. Tal anti-anticorpo pode ser rotulado diretamente ou indiretamente utilizando qualquer uma das abordagens discutidas anteriormente. Por exemplo, o anti-anticorpo pode ser unido a biotina que é detetada reagindo com o sistema estreptavidina-peroxidase de raiz-forte discutido anteriormente. Assim, numa modalidade, é utilizada biotina. O anticorpo biotinilado é, por sua vez, reagido com o complexo estreptavidina-peroxidase de raiz-forte. Ortofenilenodiamina, 4-cloro-naftol, tetrametilbenzidina (TMB), ABTS, BTS ou ASA podem ser utilizados para deteção cromogénica.
Num formato de imunoensaio para praticar esta invenção, um ensaio do tipo forward sandwich é utilizado no qual o reagente de captura foi imobilizado, utilizando técnicas convencionais, na superfície de um suporte. Suportes adequados utilizados nos ensaios incluem suportes de polímeros sintéticos, tais como polipropileno, polistireno, polistireno substituído, por exemplo, polistireno aminado ou carboxilado, poliacrilamidas, poliamidas, cloreto de polivinilo, contas de vidro, agarose ou nitrocelulose. IV. Anticorpos Anti-LOXL2 São providenciados aqui anticorpos que podem ser utilizados para diagnosticar angiogénese e doenças associadas, fibrose e doenças associadas, tumores ou metástase. São providenciados aqui anticorpos que inibem a angiogénese e doenças associadas, inibem fibrose e doenças associadas e tratam tumores ou metástase. São providenciados aqui anticorpos que podem ser utilizados para monitorizar a eficácia de regimes e protocolos de tratamento e afins, conforme descrito ao longo do presente pedido e conhecidos na arte. Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno úteis em tais métodos são aqueles, por exemplo, que se ligam especificamente a L0XL2. A revelação também descreve linhas celulares que produzem anticorpos ou fragmentos funcionais dos mesmos, métodos para produzir as linhas celulares e métodos para produzir os anticorpos ou os fragmentos funcionais dos mesmos. 0 termo "anticorpo" ou "molécula de anticorpo" nas várias formas gramáticas é utilizado aqui como um nome coletivo que se refere a uma população de moléculas de imunoglobulina e/ou porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um local de combinação ao anticorpo ou parátopo. Assim, a referência a um "anticorpo" também inclui referência a qualquer um dos fragmentos de ligação ao antigeno dos anticorpos .
Conforme utilizado aqui, "imunorreativo" refere-se a anticorpos ou fragmentos dos mesmos que são específicos de uma sequência de resíduos de aminoácidos ("local de ligação" ou "epítopo"), no entanto se são reativos de forma cruzada com outros péptidos/proteínas, são não tóxicos nos níveis para os quais eles são formmulados para administração a utilização humana. "Epítopo" refere-se àquela porção de um antigeno capaz de formar uma interação de ligação com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo. Tal interação de ligação pode ser manifestada como um contacto intermolecular com um ou mais resíduos de aminoácidos de uma CDR. A ligação ao antigeno poe envolver uma CDR3 ou um par CDR3. Um epítopo pode ser uma sequência peptidica linear (isto é, "continua") ou pode ser composto de sequências de aminoácidos não contíguas (isto é, "conformacional" ou "descontínua") . 0 termo "preferencialmente liga-se" significa que o agente de ligação liga-se ao local de ligação com maior afinidade do que se liga a sequências de aminoácidos não relacionadas.
Conforme utilizado aqui, o termo "afinidade" refere-se à constante de equilíbrio para a ligação reversível de dois agentes e é expressa como uma constante de dissociação (Kd) . A afinidade pode ser pelo menos 1 vez superior, pelo menos 2 vezes superior, pelo menos 3 vezes superior, pelo menos 4 vezes superior, pelo menos 5 vezes superior, pelo menos 6 vezes superior, pelo menos 7 vezes superior, pelo menos 8 vezes superior, pelo menos 9 vezes superior, pelo menos 10 vezes superior, pelo menos 20 vezes superior, pelo menos 30 vezes superior, pelo menos 40 vezes superior, pelo menos 50 vezes superior, pelo menos 60 vezes superior, pelo menos 70 vezes superior, pelo menos 80 vezes superior, pelo menos 90 vezes superior, pelo menos 100 vezes superior ou pelo menos 1000 vezes superior, ou mais, do que a afinidade de um anticorpo por sequências de aminoácidos não relacionadas. A afinidade de um anticorpo por uma proteína alvo pode ser, por exemplo, de cerca de 100 nanomolar (nM) a cerca de 0,1 nM, de cerca de 100 nM a cerca de 1 picomolar (pM) ou de cerca de 100 nM a cerca de 1 femtomolar (fM) ou mais. Conforme utilizado aqui, o termo "avidez" refere-se à resistência de um complexo de dois ou mais agentes à dissociação após diluição. Os termos "imunorreativo" e "preferencialmente liga-se" são utilizados alternadamente aqui em relação a anticorpos e/ou fragmentos de ligação ao antígeno. O termo "anticorpo" também inclui moléculas que foram fabricadas por engenharia genética através da utilização de técnicas biológicas moleculares para incluir apenas porções da molécula nativa desde que aquelas moléculas têm a capacidade de se ligar a um antígeno particular ou sequências de aminoácidos com a especificidade necessária. Tais moléculas anticorpo alternativas incluem porções classicamente conecidas das moléculas de anticorpo, anticorpos de cadeia simples e moléculas de ligação de cadeia única.
Um "local de combinação ao anticorpo" é aquela porção estrutural de uma molécula de anticorpo que compreende regiões variáveis e hipervariáveis da cadeia leve e pesada que se ligam especificamente ao antígeno.
Conforme utilizado aqui, o termo "CDR" ou "região determinante de complementaridade" pretende-se que signifique os locais de combinação ao antígeno não contíguos encontrados dentro da região variável de ambos polipeptideos da cadeia leve e pesada. Estas regiões particulares foram descritas por Rabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Rabat et al., Departamento de Saúde e Serviços Humanos U.S., "Sequences of proteins of immunological interest" (1991); por Chothia et al., J. Mol.
Biol. 196:901-917 (1987); e MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), onde as definições incluem sobreposições ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparados uns com os outros. No entanto, a aplicação de qualquer uma das definições para se referir a uma CDR de um anticorpo ou anticorpos enxertados ou variantes dos mesmos pretende-se que esteja dentro do âmbito do termo, conforme definido e utilizado aqui. Os resíduos de aminoácidos que abrangem as CDRs, conforme definido por cada uma das referências supracitadas, são apresentados no Quadro 1 a seguir como uma comparação.
Conforme utilizado aqui, o termo "estrutura" quando utilizado em referência a uma região variável de anticorpo pretende-se que signifique todos os resíduos de aminoácidos fora das regiões CDR dentro da região variável de um anticorpo. Uma estrutura da região variável é, em geral, uma sequência de aminoácidos descontínua entre cerca de 100-120 aminoácidos de comprimento, mas que se pretende que se referencie apenas àqueles aminoácidos fora das CDRs. Conforme utilizado aqui, o termo "região estrutura" pretende-se que signifique cada domínio da estrutura que é separado pelas CDRs. "Um inibidor da atividade de L0XL2" pode ser um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo que direta ou indiretamente inibe a atividade da lisil oxidase, incluindo, mas não limitada a, expressão génica, modificação pós-translaciona, processamento enzimático ou clivagem, ligação a um modulador de L0XL2, atividade enzimática de L0XL2 ou qualquer outra atividade descrita aqui .
Conforme utilizado aqui, o termo "anticorpo" refere-se a um agente de ligação isolado ou recombinante que compreende as sequências da região variável necessárias para se ligar especificamente a um epítopo antigénico. Portanto, um anticorpo é qualquer forma de anticorpo ou fragmento do mesmo que exibe a atividade biológica desejada, por exemplo, ligação ao antigeno alvo especifico. Assim, é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento inteiro), anticorpos policlonais, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, diacorpos, anticorpos multispecificos (por exemplo, anticorpos bispecificos) e fragmentos de anticorpo incluindo, mas não limitados a, polipeptideos de ligação de cadeia simples, VH, VL, Fv, scFv, Fab e Fab2, etc., desde que exibam a atividade biológica desejada. 0 termo "anticorpo humano" portanto refere-se a anticorpos que contêm sequências de origem humana, exceto por possíveis regiões CDR não humanas, e não implica que a estrutura completa de uma molécula de Ig esteja presente, apenas que o anticorpo tenha a imunogenecidade mínima num humano. 0 termo "ligação" refere-se a uma associação direta entre duas moléculas, devido a, por exemplo, interações covalentes, eletrostáticas, hidrofóbicas e iónicas e/ou de ligação a hidrogénio, incluindo interações tais como pontes de sal e pontes de água. 0 termo "ligação específica" é aplicável a uma situação na qual um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não mostra qualquer ligação significativa a outras moléculas que não o seu epítopo. Numa modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo liga-se especificamente a um LOX humano ou a um L0XL2 humano com uma constante de dissociação Kd igual a ou inferior a cerca de 100 nM, inferior a cerca de 10 nM, inferior a cerca de 1 nM, inferior a cerca de 0,5 nM, inferior a cerca de 0,1 nM, inferior a cerca de 0,01 nM ou inferior a cerca de 0,005 nM medido a uma temperatura de cerca de 4°C, 25°C, 37°C ou 42 °C.
Podem ser utilizados métodos convencionais para preparar anticorpos. Por exemplo, utilizando um péptido ou proteína lisil oxidase de compirmento inteiro, anti-soros policlonais ou anticorpos monoclonais podem ser feitos utilizando métodos padrão. Um mamífero, (por exemplo, um ratinho, hamster ou coelho) podem ser imunizados com uma forma imunogénica do péptido que despoleta uma resposta de anticorpo no mamífero. Técnicas para conferir imunogenicidade potenciada num péptido incluem conjugação com veículos ou outras técnicas bem conhecidas na arte. Por exemplo, a proteína ou péptido pode ser administrado na presença de adjuvante. O progresso de imunização pode ser monitorizado pela deteção dos títulos de anticorpo no plasma ou soro. Procedimentos de ELISA ou outros imunoensaios convencionais podem ser utilizados com o imunogene como antígeno para avaliar os níveis dos anticorpos. Após imunização, os anti-soros podem ser obtidos e, se desejado, anticorpos policlonais isolados dos soros.
Os anticorpos podem ser gerados em cultivos celulares, em fagos ou em vários animais, incluindo, mas não limitados a, vacas, coelhos, cabras, ratinhos, ratazanas, hamsters, cobaias, ovelhas, cães, gatos, macacos, chimpanzés, primatas. Portanto, um anticorpo útil nos métodos presentes é tipicamente um anticorpo de mamífero. Técnicas de fago podem ser utilizadas para isolar um anticorpo inicial ou para gerar variantes com características de especificidade ou avidez alteradas. Tais técnicas são de rotina e bem conhecidas na arte. Numa modalidade, o anticorpo é produzido por meios recombinantes conhecidos na arte. Por exemplo, um anticorpo recombinante pode ser produzido transfetando uma célula hospedeira com um vetor que compreende uma sequência de ADN que codifica o anticorpo. Um ou mais vetores podem ser utilizados para transfetar a sequência de ADN que expressa pelo menos um região VL e uma VH na célula hospedeira. Descrições exemplares de meios recombinanets de geração e produção do anticorpo incluem Delves, Antibody Production: Essential Techniques (Wiley, 1997); Shephard, et al., Monoclonal antibodies (Oxford University Press, 2000); e Goding, Monoclonal antibodies: Principles and Practice (Academic Press, 1993).
Os anticorpos também podem ser feitos de acordo com o protocolo descrito em Kenney, et al. ("Production of monoclonal antibodies using a secretion capture report web." Biotechnology 13:787-790, 1995). Em suma, ratinhos são injetados por via subcutânea (s.c.) com antígeno numa formulação adjuvante. Para antigenos peptidicos, são conjugados péptidos com albumina do soro bovina e formulados em Adjuvante de Freund (FA) antes da imunização. Para antigenos proteicos, a proteína é formulada em adjuvante de alhidrogel-Muramil Dipéptido (ALD/MDP). Células do baço e nódulos linfáticos dos ratinhos são isoladas e fundidas com células apropriadas e cultivadas. Uma biblioteca de hibridomas de células selecionadas HAT é isolada e é clonada. As células são ordenadas e os soros e sobrenadantes são revistos para a presença de anticorpos. "Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo intacto e podem incluir a ligação ao antígeno ou região variável de um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, fragmentos scFv, diacorpos, anticorpos lineares (Zapata et al. , Protein Eng. 8(10) : 1057-1062 (1995)), moléculas de anticorpo de cadeia simples, polipeptideos de ligação de cadeia simples e anticorpos multispecificos formados a partir de fragmentos de anticorpo. A digestão com papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação ao antigeno idênticos, designados fragmentos "Fab", cada com um local de ligação ao antigeno único e um fragmento "Fc" residual, uma designação que reflete a capacidade de cristalizar rapidamente. O tratamento com pepsina produz um fragmento F (ab')2 que tem dois locais de combinação ao antigeno e é ainda capaz de reticular o antigeno.
Um "polipeptideo de ligação de cadeia simples" refere-se a um polipeptideo com uma região variável da cadeia pesada, uma região variável da cadeia leve e, opcionalmente, uma região Fc da imunoglobulina. Tal molécula é um fragmento variável de cadeia simples opcionalmente com uma função efetora através da presença da região Fc da imunoglobulina. Métodos de preparar polipeptideos de ligação de cadeia simples são conhecidos na arte (por exemplo, Pedido de patente US. N.° 2005/0238646). "Fv" refere-se a um fragmento de anticorpo que contém um local de ligação e de reconhecimento do antigeno completo. Esta região consiste num dimero de um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada em estreita associação não covalente. É nesta configuração que as três CDRS de cada domínio variável interagem para definer um local de ligação ao antigeno na superfície do dimero VH-VL. Coletivamente, as seis CDRs conferem ao anticorpo especificidade de ligação ao antigeno. Contudo, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três CDRs específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar ao antigeno, apesar de numa afinidade menor do que o local completo de ligação.
Um fragmento "Fab" contém um "Fv" e também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab diferem dos fragmentos Fab' pela adição de uns poucos resíduos no terminal carboxi do domínio CHI da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteinas da região dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para Fab' no qual o(s) resíduo (s) de cisteína dos domínios constantes carregam um grupo tiol livre. Os fragmentos F (ab')2 de anticorpo foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteinas dobradiça entre eles. Outras uniões químicas de fragmentos de anticorpo também são conhecidas.
As "cadeias leves" dos anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, chamadas kapa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes.
Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ainda ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada (Fc) que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são designados α, δ, □, □ e μ, respetivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
As "cadeias leves" dos anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, chamados kapa ou ("k") e lambda ou ("λ"), com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes.
Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "sFv" compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que estes domínios estão presentes num cadeia única de polipeptídeo. Um polipeptídeo Fv pode ainda incluir, se necessário, um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL, que permite o sFv de formar uma estrutura desejada para ligação ao antigeno. Para uma revisão de sFv, ver Pluckthun em The Pharmacology of monoclonal antibodies, volume 113, Rosenburg e Moore editores, Springer-Verlag, Nova Iorque, páginas 269-315 (1994). 0 termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo com dois locais de ligação ao antigeno, cujos fragmentos contêm um domínio variável da cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável da cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL). Utilizando um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação ao antigeno. Os diacorpos são descritos com mais detalhe, por exemplo, no documento EP 404 097; documento WO 93/11161; e Hollinger et al. , Proc. Nat1. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).
Um anticorpo também pode ser um anticorpo bispecífico. Anticorpos bispecíficos são anticorpos monoclonais, quiméricos, humanos ou humanizados que têm especificidades de ligação por pelo menos dois antigenos diferentes. No presente caso, uma das especificidades de ligação é, por exemplo, por LOX ou LOXL2, a outra é por qualquer outro antigeno, tal como, por exemplo, um proteína da superfície celular ou recetor ou subunidade de recetor. Em modalidades adicionais, um anticorpo bispecífico é específico por LOX e LOXL2. Métodos para fazer anticorpos bispecíficos são conhecidos na arte. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos bispecíficos é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias pesadas têm diferentes especificidades (Milstein e Cuello, Nature, 305:537 539 (1983)). Por causa do sortido aleatório de cadeias leve e pesada de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura bispecífica correta. A purificação da molécula correta é normalmente conseguida por etapas de cromatografia por afinidade. Procedimentos semelhantes são revelados no documento WO 93/08829, publicado a 13 de maio de 1993 e em Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
Os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação anticorpo-antígeno) podem ser fundidos com sequências do domínio constante de imunoglobulina utilizando métodos convencionais conhecidos na arte. A fusão é, em geral, com um domínio constanteda cadeia pesada da imunoglobulina contendo pelo menos parte das regiões dobradiça, CH2 e CH3. Numa modalidade, a primeira região constante da cadeia pesada (CHI) que contém o local necessário para a ligação da cadeia leve está presente em pelo menos uma das fusões. Os ADN que codificam as fusões das cadeias pesadas da imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve da imunoglobulina, podem ser inseridos em vetores de expressão separados e podem ser co-transfetados num organismo hospedeiro adequado. Para obter mais detalhes sobre a geração de anticorpos bispecíficos ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986) .
De acordo com outra abordagem descrita no documento WO 96/27011, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser fabricada para maximizer a percentagem de heterodímeros que são recuperados a partir da cultura de células recombinante. A interface pode compreender pelo menos uma parte da região CH3 de um domínio constante do anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais pequenas de aminoácidos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano) . "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante ao da cadeia(s) laterais grandes são criadas na interface da segundo molécula de anticorpo substituindo as cadeias laterais grande dos aminoácidos por umas mais pequenas (por exemplo, alanina ou treonina). Isto providencia um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados, tais como homodímeros.
Anticorpos bispecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento inteiro ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos bispecíficos F(ab')2). Técnicas para gerar anticorpos bispecíficos a partir de fragmentos de anticorpo foram descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos bispecíficos podem ser preparados utilizando ligação química. Brennan et al., Science 229:81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são divididos proteoliticamente para gerar fragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença de agente de complexo ditiol arsenito de sódio para estabilizar ditióis vicinais e prevenir a formação de dissulfido intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são depois convertido em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB é depois reconvertido para Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado de Fab'-TNB para formar o anticorpo bispecífico. Os anticorpos bispecíficos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.
Os fragmentos Fab' podem ser recuperados diretamente de E. coli e unidos quimicamente para formar anticorpos bispecificos. Shalaby et al. , J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula F(ab')2 de anticorpo bispecifico completamente humanizada. Cada fragmento Fab' foi segregado separademente de E. coli e sujeito a acoplamento químico dirigido in vitro para formar o anticorpo bispecífico. 0 anticorpo bispecífico assim formado foi capaz de ligar-se a células que sobre-expressam o recetor ErbB2 e células T humanas normais, bem como despoletar a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor mamário humano. Várias técnicas para fabricar e isolar fragmentos de anticorpo bispecificos diretamente a partir de cultivos celulares recombinantes também foram descritas. Por exemplo, anticorpos bispecificos foram produzidos utilizando ziperes de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5) :1547-1553 (1992) . Os péptidos zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão de genes. Os homodimeros do anticorpo foram reduzidos na região dobradiça para formar monómeros e depois re-oxidados para formar os heterodímeros do anticorpo. Este método também pode ser utilizado para a produção dos homodimeros do anticorpo. A tecnologia "diacorpo" descrito por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448 (1993) providenciou um mecanismo alternativo para fazer fragmentos de anticorpo bispecificos. Os fragmentos compreendem um domínio variável da cadeia pesada (VH) ligados a um domínio variável da cadeia leve (VL) por um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Em conformidade, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, formando assim dois locais de ligação ao antígeno. Outra estratégia para fazer fragmentos de anticorpo bispecíficos pela utilização de dimeros Fv (sFv) de cadeia simples também foi reportada. Ver, Gruber et al. , J. Immunol. 152:5368 (1994) .
Anticorpos com mais de duas valências são contemplados. Por exemplo, anticorpos trispecificos podem ser preparados. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991) .
Anticorpos bispecíficos exemplares podem ligar a dois epítopos diferentes num dado polipeptídeo LOXL2 aqui. Em alternativa, um polipeptídeo braço anti-LOXL2 pode ser combined com um braço que se liga a uma molécula que despoleta num leucócito tal como uma molécula recetora de células T (por exemplo, CD2, CD3, CD28 ou B7), ou recetores Fc para IgG (FcyR), tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD 16) de modo a focar mecanismos de defesa celular para a célula que expressa um polipeptídeo alvo particular. Anticorpos bispecíficos também podem ser utilizados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam um polipeptídeo alvo particular. Estes anticorpos possuam um braço de ligação ao alvo e um braço que se liga a um agente citotóxico ou um quelante radionuclídeo, tais como EOTUBE, DPTA, DOTA ou TETA. Outro anticorpo bispecífico de interesse liga o polipeptídeo alvo e liga ainda fator tecidular (TF). O anticorpo anti-LOXL2 também pode ser um anticorpo heteroconjugado. Os anticorpos heteroconjugados são compostos de dois anticorpos unidos de forma covalente. Tais anticorpos têm, por exemplo, sido propostos para dirigirem células do sistema imune para células indesejadas (Patente U.S. N.° 4 676 980) e para tratamento de infeção por HIV (documentos WO 91/00360 e WO 92/200373). Anticorpos podem ser preparados in vitro utilizando métodos conhecidos na química de síntese proteica, incluindo aqueles envolvendo agentes de reticulação. Por exemplo, podem ser construídas imunotoxinas utilizando uma reação de troca de dissulfido ou formando uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este fim incluem, mas não se limitam a, iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e aqueles revelados, por exemplo, na Patente U.S. N.° 4 676 980 .
Pode ser desejável modificar um anticorpo anti-LOXL2 em relação à função efetora, de modo a potenciar, por exemplo, a eficácia do anticorpo no tratamento ou prevenção de metástase cancerígena. Por exemplo, podem ser introduzidos resíduo(s) de cisteína na região Fc, permitindo, assim, formação de ligação dissulfido intercadeia nesta região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter capacidade de internalização melhorada e/ou morte celular mediada pelo complement melhorada e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Ver Caron et al. , J. Exp Me d., 176: 1191-1195 (1992) e Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992) . Anticorpos homodiméricos com atividade anti-tumoral potenciada também podem ser preparados utilizando reticulantes heterobifuncionais conforme descrito em Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993) . Em alternativa, um anticorpo poe ser fabricado por engenharia genética que tem regiões Fc duais e pode, assim, ter capacidade de lise de complemento e ADCC potenciadas. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989).
Um "anticorpo isolado" é um que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Componentes do contaminante do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com utilizações diagnósticas ou terapêuticas para o anticorpo, e pode incluir, por exemplo, enzimas, hormonas e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Numa modalidade, um anticorpo será purificado (1) para maior de 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% por peso de anticorpo, conforme determinado pelo método de Lowry, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de N-terminal ou sequência de aminoácidos interna através da utilização de um sequenciador de copo rotativo e/ou (3) até homogeneidade por SDS-PAGE em condições redutoras ou não redutoras utilizando azul de Coomassie ou coloração de prata. 0 termo "anticorpo isolado" inclui dentro do seu âmbito um anticorpo in situ dentro de células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Em geral, o isolamento de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo incluirá pelo menos uma etapa de purificação.
Um anticorpo pode ser um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano. Formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) incluem, por exemplo, imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos das mesmas (tais como Fv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, polipeptideo de ligação de cadeia simples, VH, VL ou outras subsequências de ligação ao antigeno dos anticorpos) que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Anticorpos quiméricos incluem aqueles nos quais as regiões variáveis das cadeias leve e pesada são combinadas com regiões constantes humanas (Fc) . Anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo recetor) nas quais resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do recetor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) tais como ratinho, ratazana ou coelho com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Nalgumas ocasiões, resíduos da estrutura Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Anticorpos humanizados também podem compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo recetor nem na CDR importada ou sequências estrutura. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas das regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas das regiões FR são aquelas de uma sequência consenso da imunoglobulina humana.
Um anticorpo humanizado também pode conter pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc) , tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329(1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)). Métodos para humanizar anticorpos não humanos são bem conhecidos na arte. Em geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele a partir de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são, com frequência, referidos como resíduos "importado" ou "dadores", que são tipicamente retirados de um domínio variável "importado" ou "dador". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al. , Nature, 321:522 525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323 327 (1988)); Verhoeyen et al. Science, 239:1534 1536 (1988)), substituindo CDRs de roedor ou sequências CDR para as sequências correspondentes de um anticorpo humano. Em conformidade, tais anticorpos "humanizados" incluem anticorpos quiméricos (Patente U.S. N.° 4 816 567), em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente a partir de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos CDR e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores.
Anticorpos humanos também podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na arte, incluindo bibliotecas de exibição de fago (Hoogenboom e Winter, J.
Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991) ) . As técnicas de Cole et al. e Boemer et al. também estão disponíveis para a preparação de anticorpos humanos monoclonais (Cole et al., Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) e Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)). Da mesma forma, podem ser feitos anticorpos humanos introduzindo loci de imunoglobulina humana em animais transgénicos, por exemplo, ratinhos nos quais genes de imunoglobulina endógenos foram parcialmente ou completamente inativados. No momento do desafio, é observada produção de anticorpo humano, que se parece muito com a observada em humanos em todos os aspetos, incluindo rearranjo de genes, montagem e repertório de anticorpo. Esta abordagem é descrita, por exemplo, nas Patentes U.S. N.°s 5 545 807; 5 545 806; 5 569 825; 5 625 126; 5 633 425; 5 661 016 e nas publicações cientificas seguintes: Marks et al., Bio/Technology 10,779-783 (1992); Lonberg et al. , Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812 13 (1994); Fishwald et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995) .
Anticorpos monoclonais murinos foram desenvolvidos que ligam LOX ou LOXL2 e bloqueiam a atividade enzimática dos mesmos. Anticorpos humanizados e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos aqui são criados por humanização das sequências VL e VH dos anticorpos monoclonais murinos anti-LOX e anti-LOXL2.
Imunoglobulinas humanizadas, incluindo anticorpos humanizados, foram construídas por meios de engenharia genética. A maioria das imunoglobulinas humanizadas que foram descritas previamente compreenderam uma estrutura que é idêntica à estrutura de uma cadeia de imunoglobulina humana particular (isto é, um aceitador ou recetor) e três CDRs de uma cadeia de imunoglobulina não humana (dador).
Conforme descrito aqui, a humanização também pode incluir critérios pelos quais um número limitado de aminoácidos na estrutura de uma cadeia de imunoglobulina humanizada são identificados e escolhidos como sendo os mesmos que os aminoácidos nessas posições no dador em vez do que no aceitador, de modo a aumentar a afinidade de um anticorpo que compreende a cadeia de imunoglobulina humanizada. A presente invenção é baseada em parte no modelo que duas causas contribuintes da perda de afinidade em meios anteriores de produzir anticorpos humanizados (utilizando como exemplos anticorpos de ratinhos como a fonte de CDRs) são: (1) quando as CDRs de ratinho são combinadas com uma estrutura humana, os aminoácidos nas estruturas próximos das CDRs tornam-se humanas em vez de ratinho. Sem pretender estar ligado pela teoria, estes aminoácidos alterado podem distorcer ligeiramente as CDRs (por exemplo, eles podem criar diferentes forças eletrostáticas ou hidrofóbicas do que no anticorpo de ratinho dador e as CDRs distorcidas podem não fazer contactos tão eficazes com o antigeno quanto as CDRs fizeram no anticorpo dador); (2) além disso, os aminoácidos no anticorpo de ratinho original que estão próximos, mas não parte de, as CDRs (isto é, ainda parte da estrutura), podem fazer contactos com o antigeno que contribuem para a afinidade. Estes aminoácidos são perdidos quando o anticorpo é humanizado porque, em geral, todos os aminoácidos estrutura são feitos humanos. Para contornar estes problemas, e para produzir anticorpos humanizados que têm uma afinidade muito forte por um antigeno desejado, anticorpos humanizados e fragmentos de ligação ao antigeno dos mesmos podem ser construídos utilizando um ou mais dos seguintes princípios.
Um princípio é que como aceitador, uma estrutura é utilizada de uma imunoglobulina humana particular que é invulgarmente homóloga com a imunoglobulina dadora a ser humanizada ou utilizar uma estrutura consenso de muitos anticorpos humanos é utilizada como um aceitador. Por exemplo, comparação da sequência de uma região variável da cadeia pesada (ou leve) de ratinho contra regiões variáveis de cadeia pesada (ou leve) humana numa base de dados (por exemplo, no Recurso de Identificação de Proteínas da Fundação de Investigação Biomédica Nacional ou a base de dados de sequências de proteínas do Centro Nacional para Informação de Biotecnologia - NCBI) mostra que a extensão de homologia com regiões humanas diferentes podem variar grandemente, por exemplo de cerca de 40% a cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80% ou superior. Ao escolher como aceitador imunoglobulina uma das regiões variáveis de cadeia pesada humana que é mais homóloga com a região variável da cadeia pesada da imunoglobulina dadora, menos aminoácidos serão alterados ao passarem da imunoglobulina dadora para a imunoglobulina humanizada. Ao escolher como o aceitador imunoglobulina uma das regiões variáveis de cadeia leve humana que é mais homóloga com a região variável da cadeia leve da imunoglobulina dadora, menos aminoácidos serão alterados ao passarem da imunoglobulina dadora para a imunoglobulina humanizada. Em geral, utilizando tais técnicas, existe uma possibilidade reduzida de alterar um aminoácidos próximo de uma ou mais das CDRs que distorce a sua conformação. Além disso, a forma global precise de um anticorpo humanizado que compreende a cadeia de imunoglobulina humanizado pode parecer mais estreitamente a forma do anticorpo dador, reduzindo, assim, também a possibilidade de distorcer as CDRS.
Alguém também pode utilizer as cadeias leve e pesada do mesmo anticorpo humano como sequências aceitadoras, para melhorar a probabilidade que as cadeias leve e pesada humanizadas tornarão favoráveis os contactos umas com as outras. Em alternativa, alguém também pode utilizer cadeias leve e pesada de diferentes sequências de linhas germinativas de anticorpo humano como sequências aceitadoras; quando tais combinações são utilizadas, alguém pode prontamente determinar se a VH e VL ligam um epitopo de interesse utilizando ensaios convencionais (por exemplo, uma ELISA). Num exemplo, o anticorpo humano será escolhido no qual as sequências das regiões variáveis da cadeia pesada e leve, em conjunto, são globalmente mais homologas com as sequências das regiões variáveis da cadeia pesada e leve dadoras. Por vezes será dado peso superior à sequência da cadeia pesada. Independentemente de como a imunoglobulina aceitadora é escolhida, pode ser conseguida afinidade superior, nalguns casos, selecionando um pequeno número de aminoácidos na estrutura da cadeia de imunoglobulina humanizada para serem os mesmo que os aminoácidos nessas posições no dador em vez de no aceitador. Métodos de maturação de afinidade são conhecidos na arte.
Anticorpos humanizados, em geral, têm pelo menos três vantagens potenciais sobre os anticorpos quiméricos ou de ratinho para utilização na terapêutica humana. Porque a porção efetora de um anticorpo é humana, pensa-se que interage melhor com as outras partes do sistema immune humano (por exemplo, destruir as células alvo mais eficientemente por citotoxicidade dependente do complemento (CDC) ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)). Adicionalmente, o sistema immune humano não deveria reconhecer a estrutura ou região constante do anticorpo humanizado como estranho e, portanto, a resposta do anticorpo contra tal anticorpo injetado deveria ser menor do que contra um anticorpo de ratinho totalmente estranho ou um anticorpo quimérico parcialmente estranho. Finalmente, anticorpos de ratinho são conhecidos por terem uma meia-vida na circulação humana que é muito mais curta do que a meia-vida dos anticorpos humanos. Anticorpos humanizados podem, presumidamente, ter uma meia-vida mais semelhante aos anticorpos humanos que ocorrem naturalmente, permitindo a administração de doses mais pequenas e menos frequentes. A humanização dos anticorpos e fragmentos de ligação ao antigeno dos mesmos, pode ser conseguida através de uma variedade de métodos conhecidos na arte e descritos aqui. Da mesma forma, a produção de anticorpos humanizados também pode ser conseguida através de métodos conhecidos na arte e descritos aqui. Métodos para modificações de regiões estrutura são conhecidos na arte e são contemplados aqui. A seleção de uma ou mais posições de aminoácidos estrutura relevantes a serem alteradas depende de uma variedade de critérios. Um critério para selecionar a alteração de aminoácidos estrutura relevantes podem ser as diferenças relativas nos resíduos estrutura dos aminoácidos entre as moléculas dadora e aceitadora. A seleção de posições de estrutura relevantes a alterar utilizando esta abordagem tem a vantagem de evitar qualquer viés subjetivo na determinação dos resíduos ou qualquer viés na contribuição da afinidade de ligação da CDR pelo resíduo.
Outro critério que pode ser utilizado para determinar as posições de aminoácidos relevantes a alterar podem ser, por exemplo, seleção de resíduos estrutura que são conhecidos por serem importantes ou por contribuírem para a conformação de CDR. Por exemplo, resíduos de estrutura canónica são importantes para conformação e/ou estrutura de CDR. A direção de um resíduo de estrutura canónica como uma posição relevante a alterar pode ser utilizada para identificar um resíduo de aminoácido mais compatível no contexto com a sua sequência CDR dadora associada. A frequência de um resíduo de aminoácido numa posição estrutura particular é outro critério que pode ser utilizado para selecionar posições de aminoácidos estrutura relevantes a alterar. Por exemplo, a comparação da estrutura selecionada com outras sequências estrutura dentro da sua subfamília pode revelar resíduos que ocorrem em frequências inferiores numa particular posição ou posições. As posições que albergam resíduos menos abundantes são, da mesma forma, aplicáveis para seleção como uma posição a alterar na estrutura da região variável aceitadora.
As posições dos aminoácidos relevantes a alterar também podem ser selecionadas, por exemplo, com base na proximidade a uma CDR. Em determinados contextos, os resíduos FR podem participar na conformação e/ou ligação ao antígeno da CDR. Além disso, este critério pode, da mesma forma, ser utilizado para dar prioridade posições relevantes selecionadas por outros critérios descritos aqui. Portanto, diferenciar entre resíduos próximos e distais de uma ou mais CDRs representa uma maneira de reduzir o número de posições relevantes a alterar.
Outros critérios para selecionar posições de aminoácidos estrutura relevantes a alterar incluem, por exemplo, resíduos que são conhecidos por ou previstos residir num espaço tridimensional próximo da interface antígeno-CDR ou previstos modular a atividade de CDR. Da mesma forma, podem ser selecionados resíduos estrutura que são conhecidos por, ou previstos, formar contactos entre a interface da região variável da cadeia pesada (VH) e leve (VL). Tais posições de estrutura podem afetar a conformação e/ou afinidade de uma CDR modulando o bolso de ligação a CDR, interação de antígeno (epítopo) ou a interação VH e VL. Portanto, a seleção destas posições de aminoácidos para construir uma população diversa para classificar a atividade de ligação pode ser utilizada para identificar alterações de estrutura que substituem resíduos com efeitos prejudiciais na conformação da CDR ou compensam efeitos prejudiciais dos resíduos que ocorrem noutro local na estrutura.
Outros resíduos estrutura que podem ser selecionados para alteração incluem posições de aminoácidos que são inacessíveis ao solvente. Tais resíduos estão, em geral, enterrados na região variável e são, portanto, capazes de influenciar a conformação da CDR ou das interações VH e VL interactions. A acessibilidade ao solvente pode ser prevista, por exemplo, a partir da hidrofobicidade relativa do ambiente criado pelas cadeias laterais dos aminoácidos do polipeptideo e/ou pelos dados estruturais tridimensionais conhecidos.
Após seleção de posições de aminoácidos relevantes nas CDRs dadoras, bem como quaisquer posições de aminoácidos relevantes nas regiões estrutura desejadas a serem variadas, podem ser incorporadas alterações de aminoácidos em algumas ou em todas as posições selecionadas em ácidos nucleicos codificantes para a estrutura da região variável aceitadora e CDRs dadoras. A estrutura ou sequências de CDR alteradas podem ser individualmente feitas e testadas ou podem ser sequencialmente ou simultâneamente combinadas e testadas. A variabilidade a qualquer ou todas as posições alteradas pode oscilar de um poucos a uma pluridade de resíduos de aminoácidos diferentes, incluindo todos os vinte aminoácidos que ocorrem naturalmente ou equivalentes funcionais e análogos dos mesmos. Nalguns casos, aminoácidos que não ocorrem naturalmente também podem ser considerados e são conhecidos na arte. A seleção do número e localização das posições dos aminoácidos a variar é flexível e pode depender da utilização pretendida e eficiência desejada para identificação da região variável alterada com uma atividade desejável, tal como substancialmente a mesma afinidade de ligação ou superior comparada com a região variável dadora. A este respeito, quanto maior o número de alterações que são incorporadas numa população de regiões variáveis alteradas, mais eficiente é identificar pelo menos uma espécie que exibe uma atividade desejável, por exemplo, uma afinidade de ligação substancialmente a mesma ou superior à da dadora. Em alternativa, onde o utilizador tem dados empíricos ou reais relativos ao efeito que certos resíduos de aminoácidos ou posições contribuem desproporcionalmente para a afinidade de ligação, então pode ser desejável produzir uma população limitada de regiões variáveis alteradas que foca nas alterações dentro ou em redor desses resíduos ou posições identificados.
Por exemplo, se regiões variáveis enxertadas de CDR são desejadas, uma população grande, diversa de regiões variáveis alteradas pode incluir todas as posições de região estrutura não idênticas entre a estrutura dadora e aceitadora e todas as alterações de posição dos aminoácidos CDR únicos. Em alternativa, uma população de diversidade intermerdiária pode incluir subconjuntos, por exemplo, de apenas as posições estrutura não idênticas próximas a serem incorporadas juntas com todas as alterações de posição dos aminoácidos CDR únicos para, por exemplo, aumentar a afinidade dos anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação ao antígeno. A diversidade das populações anteriores pode ainda ser aumentada incluindo, por exemplo, adicionalmente todas as alterações de posição dos aminoácidos CDR emparelhados. Em contraste, as populações que se focam em resíduos ou posições pré-determinados que incorporam resíduos variantes a tão poucos quanto uma estrutura e/ou uma posição de aminoácidos CDR podem, da mesma forma, serem construídas para classificar e identificar uma região variável de anticorpo alterada. Tal como com as populações anteriores, a diversidade de tais populações focadas pode ser ainda aumentada expandindo adicionalmente as posições selecionadas para alteração para incluir outras posições relevantes numa das ou em ambas as regiões estrutura e CDR. Existem numerosas outras combinações que oscilam de poucas alterações a muitas alterações numa das ou em ambas das regiões estrutura e CDRs que podem ser, adicionalmente, empregues, todas as quais resultarão numa população de regiões variáveis alteradas que podem ser classificadas para a identificação de pelo menos uma região variável alterada de CDR enxertada com atividade desejada, por exemplo, atividade de ligação a L0X/L0XL2. Aqueles habilitados na arte saberão, ou podem determinar, que posições de resíduo selecionadas na estrutura ou CDRs dadoras, ou subconjuntos das mesmas, podem ser variadas para produzir uma população para classificação e identificação de um anticorpo da invenção alterado, dados os ensinamentos e orientação providenciados aqui. Os codões que codificam os aminoácidos são conhecidos na arte.
Anticorpos humanizados e fragmentos de ligação ao antígeno podem ser feitos utilizando técnicas convencionais conhecidas na arte. Além disso, anticorpos preparados de forma recombinante podem ser produzidos, com frequência, em grandes quantidades, particularmente quando utilizando vetores de expressão de nível elevado.
Os anticorpos podem ser sequenciados utilizando técnicas convencionais conhecidas na arte e as sequências de aminoácidos das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) determinadas. Num aspeto, as sequências de aminoácidos de uma ou mais das CDRs é inserida numa sequência sintética de, por exemplo, uma estrutura de anticorpo humano (ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) para criar um anticorpo humano que poderia limitar reações secundárias adversas de tratar um paciente humano com um anticorpo não humano. As sequências de aminoácidos de uma ou mais das CDRs também podem ser inseridas numa sequência sintética de, por exemplo, numa proteína de ligaçao, tal como uma Avimer para criar uma construção para administração a uma paciente humano. Tais técnicas podem ser modificadas dependendo da espécie de animal a ser tratado. Por exemplo, para utilizações veterinárias, um anticorpo, um fragmento de ligação ao antigeno ou proteína de ligação podem ser sintetizados para administração de um primata, uma vaca, um cavalo, etc.
Num outro aspeto, utilizando técnicas reconhecidas na arte, tais como aquelas providenciadas e incorporadas aqui, nucleotídeos que codificam sequências de aminoácidos de uma ou mais das CDRs podem ser inseridos, por exemplo, por técnicas recombinantes em locais de endonuclease de restrição de um polinucleotídeo existente que codifica um anticorpo, um fragmento de ligação ao antigeno ou proteína de ligação.
Para produção de alto nível, o sistema de expressão de mamífero mais amplamente utilizado é um que utiliza o procedimento de amplificação génica oferecido pelas células de ovário de hamster Chinês deficientes em dihidrofolato redutase ("dhfr - ") . 0 sistema é bem conhecido do artesão habilitado. 0 sistema é baseado no gene dihidrofolato redutase "dhfr", que codifica a enzima DHFR, que catalisa a conversão de dihidrofolato em tetrahidrofolato. Para atingir produção elevada, as células dhfr-CHO são transfetadas com um vetor de expressão que contém um gene dhfr funcional, juntamente com um gene que codifica uma proteína desejada. Neste caso, a proteína desejada é cadeia pesada e/ou cadeia leve do anticorpo recombinante.
Aumentando a quantidade do inibidor competitivo DHFR metotrexato (MTX), as células recombinantes desenvolvem resistência amplificando o gene dhfr. Em casos convencionais, a unidade de amplificação empregue é muito maior do que o tamanho do gene dhfr e, como resultado, a cadeia pesada do anticorpo é co-amplifiçada.
Quando é desejada produção em grande escala da proteína, tal como a cadeia do anticorpo, ambos o nível de expressão e a estabilidade das células a serem empregues são tidos em consideração. No cultivo a longo prazo, populações de células CHO recombinantes perdem a homogeneidade em relação à sua produtividade de anticorpo especifica durante a amplificação, mesmo apesar de derivarem de um único clone parental. 0 presente pedido providencia um polinucleotideo (ácido nucleico) isolado que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, conforme descrito aqui, vetores contendo tais polinucleotídeos e células hospedeiras e sistemas de expressão para transcrever e traduzir tais polinucleotídeos em polipeptídeos. 0 presente pedido também providencia construções na forma de plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou expressão que compreendem pelo menos um polinucleotídeo, conforme anteriormente. 0 presente pedido também providencia uma célula hospedeira recombinante que compreende uma ou mais construções, conforme anteriormente. Um ácido nucleico que codifica qualquer anticorpo ou fragmentos de ligação ao antigeno do mesmo descritos aqui conforme providenciado, ele próprio forma um aspeto do presente pedido, tal como o forma um método de produção do anticorpo ou fragmentos de ligação ao antigeno do mesmo descritos aqui cujo método compreende expressão da codificação do ácido nucleico a partir dele. A expressão pode ser conseguida de forma conveniente cultivando em condições apropriadas células hospedeiras recombinantes que contêm o ácido nucleico. Após produção pela expressão, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno pode ser isolado e/ou purificado utilizando qualquer técnica adequada, depois utilizado conforme apropriado.
Anticorpos, fragmentos de ligação ao antigeno e moléculas de ácido nucleico codificantes e vetores específicos descritos aqui podem ser providenciados isolados e/ou purificados, por exemplo, a partir do seu ambiente natural, na forma substancialmente pura ou homogénea ou, no caso do ácido nucleico, livre ou substancialmente livre de origem de ácido nucleico ou genes além da sequência que codifica um polipeptideo com a função necessária. Ácido nucleico pode compreender ADN ou ARN e pode ser totalmente ou parcialmente sintético.
Sistemas para clonagem e expressão de um polipeptideo numa variedade de células hospedeiras diferentes são bem conhecidos. Células hospedeiras adequadas incluem células de bactérias, mamíferos, sistemas de leveduras e baculovírus. Linhas celulares de mamíferos disponíveis na arte para expressão de um polipeptideo heterólogo incluem células de ovário de hamster Chinês, células HeLa, células de rim de hamster bebé, células de melanoma de ratinho NSO e muitas outras. Um hospedeiro bacteriano comum é E. coli. A expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpo em células procariontes, tais como E. coli, está bem estabelecida na arte. Para uma revisão, ver, por exemplo, Pliickthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991) . A expressão em células eucariontes em cultura também está disponível àqueles habilitados na arte como uma opção para produção dos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno descritos aqui, ver para revisões recentes, por exemplo Raff, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560.
Vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos, contendo sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências terminadoras, sequências de poliadenilação, sequências potenciadoras, genes marcadores e outras sequências conforme apropriado. Os vetores podem ser plasmídeos, virais, por exemplo 'fago ou faguemídeo, conforme apropriado. Para mais detalhes ver, por exemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a edição, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para manipulação de ácido nucleico, por exemplo na preparação de construções de ácido nucleico, mutagénese, sequenciação, introdução de ADN em células e expressão génica e análise de proteínas, são descritos com detalhe em Short Protocols in Molecular Biology, Segunda Edição, Ausubel et al. editores, John Wiley & Sons, 1992.
Assim, um aspeto adicional providencia uma célula hospedeira contendo ácido nucleico conforme revelado aqui. Ainda um outro aspeto adicional providencia um método que compreende introduzir tal ácido nucleico numa célula hospedeira. A introdução pode empregar qualquer técnica disponível. Para células eucariontes, técnicas adequadas podem incluir, por exemplo, transfeção com fosfato de cálcio, DEAE Dextrano, eletroporação, biolística, transfeção mediada por lipossoma e transdução utilizando retrovirus ou outros vírus, por exemplo, vaccinia ou, para células de insetos, baculovirus. Para células bacterianas, técnicas adequadas podem incluir, por exemplo, transformação com cloreto de cálcio, eletroporação e transfeção utilizando bacteriofago. A introdução pode ser seguida causando ou permitindo a expressão a partir do ácido nucleico, por exemplo, cultivando células hospedeiras em condições para expressão do gene.
Numa modalidade, o ácido nucleico é integrado no genoma (por exemplo, cromossoma) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida por inclusão de sequências que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com as técnicas padrão. 0 presente pedido também providencia um método que compreende utilizar uma construção, conforme indicado anteriormente, num sistema de expressão para expressar os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, conforme anteriormente. 0 presente pedido também se relaciona com ácidos nucleicos isolados, tais como moléculas de ADN recombinantes ou genes clonados, ou variantes degeneradas dos mesmos, mutantes, análogos ou fragmentos dos mesmos, que codificam um anticorpo ou sequência de ligação ao antigeno que se liga a LOX ou L0XL2 descritos aqui.
Num aspeto, o presente pedido providencia um ácido nucleico que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo que se liga a LOX ou L0XL2, conforme descrito aqui.
Numa modalidade adicional, a sequência de ADN inteira da molécula de ADN recombinante ou gene clonado de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno descritos aqui pode ser operacionalmente ligada a uma sequência de controlo da expressão que pode ser introduzida num hospedeiro apropriado. 0 pedido estende-se, em conformidade, a hospedeiros unicelulares transformados com o gene clonado ou molécula de ADN recombinante que compreende uma sequência de ADN que codifica VH e/ou VL, ou porções das mesmas, do anticorpo.
Outra caracteristica é a expressão das sequências de ADN reveladas aqui. Como é bem conhecido na arte, as sequências de ADN podem ser expressas ligando-as operacionalmente a uma sequência de controlo da expressão num vetor de expressão apropriado e empregando aquele vetor de expressão para transformar um hospedeiro unicelular apropriado.
Tal ligação operacional de uma sequência de ADN a uma sequência de controlo da expressão, obviamente, inclui, se não for já parte da sequência de ADN, a provisão de um codão de iniciação, ATG, no quadro de leitura correto a montante da sequência de ADN.
Podem ser providenciados polinucleotideos e vetores numa forma isolada e/ou a purificada (por exemplo, livre ou substancialmente livre de polinucleotideos de origem que não o polinucleotídeo que codifica um polipeptideo com a função necessária). Conforme utilizado aqui, "substancialmente puro" e "substancialmente livre," referem-se a uma solução ou suspensão que contém menos de, por exemplo, 20% ou menos de material extrínseco, 10% ou menos de material extrínseco, 5% ou menos de material extrínseco, 4% ou menos de material extrínseco, 3% ou menos de material extrínseco, 2% ou menos de material extrínseco ou 1% ou menos de material extrínseco.
Uma ampla variedade de combinações de hospedeiro/vetor de expressão pode ser empregue na expressão de sequências de ADN desta invenção. Vetores de expressão úteis, por exemplo, podem consistir de segmentos de sequências de ADN cromossómicas, não cromossómicas e sintéticas- Vetores adequados incluem derivados de SV40 e plasmídeos bacterianos conhecidos, por exemplo, plasmídeos de E. coli col El, Perl, Pbr322, Pmb9 e seus derivados, plasmídeos tais como RP4; ADNs de fago, por exemplo, os numerosos derivados de fago λ, por exemplo, NM989 e outros ADN de fago, por exemplo, M13 e ADN de fago de cadeia simples filamentosa; plasmídeos de levedura, tais como o plasmídeo 2u ou derivados do mesmo; vetores úteis em células eucariontes, tais como vetores úteis em células de insetos ou mamíferos; vetores derivados de combinações de plasmídeos e ADNs de fago, tais como plasmídeos que foram modificados para empregar ADN de fago ou outras sequências de controlo da expressão; e afins.
Também é providenciada aqui uma célula hospedeira recombinante que compreende uma ou mais construções de polinucleotídeo. Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, conforme providenciado aqui, forma um aspeto do presente pedido, tal como o forma um método de produção do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antigeno cujo método compreende expressão a partir do polinucleotídeo. A expressão pode ser atingida, por exemplo, cultivando em condições apropriadas células hospedeiras recombinantes que contêm o polinucleotideo. Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno pode depois ser isolado e/ou purificado utilizando qualquer técnica adequada e utilizado conforme apropriado.
Qualquer uma de uma ampla variedade de sequências de controlo de expressão - sequências que controlam a expressão de uma sequência de ADN ligada operacionalmente a ela - pode ser utilizada nestes vetores para expressar as sequências de ADN. Tais sequências de controlo de expressão úteis incluem, por exemplo, os promotores iniciais ou tardios de SV40, CMV, vaccinia, polioma ou adenovirus, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC, o sistema TRC, o sistema LTR, as regiões operadora principal e promotora do fago λ, as regiões controlo da proteína de revestimento fd, o promotor para 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores da fosfatase ácida (por exemplo, Pho5), os promotores dos fatores de cruzamento de leveduras e outras sequências conhecidas por controlarem a expressão de genes de células procariontes ou eucariontes ou o seus vírus e várias combinações dos mesmos.
Sistemas para clonagem e expressão de um polipeptídeo numa variedade de células hospedeiras diferentes são bem conhecidos. Células hospedeiras adequadas incluem células de bactérias, mamíferos, sistemas de leveduras e baculovírus. Linhas celulares de mamíferos disponíveis na arte para expressão de um polipeptídeo heterólogo incluem células de ovário de hamster Chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hamster bebé, células de melanoma de ratinho NSO e muitas outras. Um hospedeiro bacteriano comum pode ser, por exemplo, E. coli.
A expressão de anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigeno em células procariontes, tais como E. coli, está bem estabelecida na arte. Para uma revisão, ver, por exemplo, Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991) . A expressão em células eucariontes em cultivo também está disponível àqueles habilitados na arte (Raff, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560) .
Uma ampla variedade de células hospedeiras unicelulares também são úteis na expressão de sequências de ADN. Estes hospedeiros incluem hospedeiros eucariontes e procariontes bem conhecidos, tais como estirpes de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, fungos, tais como leveduras e células animais, tais como células CHO, YB/20, NSO, SP2/0, Rl.l, B-W e L-M, células do rim do macaco verde Africano (por exemplo, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 e BMT10), células de inseto (por exemplo, Sf9) e células humanas e células de plantas em cultura de tecido.
Será entendido que nem todos os vetores, sequências de controlo de expressão e hospedeiros funcionarão igualmente bem para expresser as sequências de ADN. Nem todos os hospedeiros funcionarão igualmente bem com o mesmo sistema de expressão. Contudo, alguém habilitado na arte será capaz de selecionar os vetores, sequências de controlo de expressão e hospedeiros apropriados sem experimentação indevida para conseguir a expressão desejada sem partir do âmbito deste pedido. Por exemplo, ao selecionar um vetor, o hospedeiro tem de ser considerado, porque o vetor tem de funcionar nele. O número de cópias do vetor, a capacidade de controlar aquele número de cópias e a expressão de quaisquer outras proteínas codificadas pelo vetor, tais como marcadores antibióticos, também serão considerados. Alguém de habilitação comum na arte pode selecionar os vetores, sequências de controlo de expressão e hospedeiros apropriados para cnseguir a expressão desejada sem partir do âmbito deste pedido. Por exemplo, ao selecionar um vetor, o hospedeiro é considerado, porque o vetor funciona nele. O número de cópias do vetor, a capacidade de controlar aquele número de cópias e a expressão de quaisquer outras proteínas codificadas pelo vetor, tais como marcadores antibióticos, também podem ser considerados. 0 presente pedido também providencia construções na forma de plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou expressão, conforme descritas noutro local aqui, que compreendem pelo menos um polinucleotídeo, conforme anteriormente. Vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos, contendo sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências terminadoras, sequências de poliadenilação, sequências potenciadoras, marcadores selecionáveis e outras sequências conforme apropriado. Os vetores podem ser plasmídeos, virais, por exemplo, fago, faguemídeo, etc., conforme apropriado. Para mais detalhes ver, por exemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a edição, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para manipulação de ácido nucleico, por exemplo na preparação de construções de ácido nucleico, mutagénese, sequenciação, introdução de ADN em células e expressão génica e análise de proteínas, são descritos com detalhe em Short Protocols in Molecular Biology, Segunda Edição, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992.
Ao selecionar uma sequência de controlo de expressão, uma variedade de fatores serão normalmente considerados. Estes incluem, por exemplo, a força relativa do sistema, a sua controlabilidade e sua compatibilidade com a sequência de ADN particular ou gene a ser expresso, particularmente no que respeita a potenciais estruturas secundárias. Hospedeiros unicelulares adequados serão selecionados por consideração de, por exemplo, sua compatibilidade com o vetor escolhido, as suas características de secreção, a sua capacidade de dobrar proteínas corretamente e os seus requisitos de fermentação, bem como a toxicidade ao hospedeiro do produto codificado pelas sequências de ADN a serem expressas e a facilidade de purificação dos produtos de expressão.
Um aspeto adicional providencia uma célula hospedeira que contém um ou mais polinucleotideos conforme revelado aqui. Um outro aspeto adicional providencia um método de introduzir tal um ou mais polinucleotídeos numa célula hospedeira, qualquer técnica disponível. Para células eucariontes, técnicas adequadas podem incluir, por exemplo, transfeção com fosfato de cálcio, DEAE Dextrano, eletroporação, transfeção mediada por lipossoma e transdução utilizando retrovirus ou outros vírus (por exemplo vaccinia) ou, para células de insetos, baculovírus. Para células bacterianas, técnicas adequadas podem incluir, por exemplo, transformação com cloreto de cálcio, eletroporação e transfeção utilizando bacteriofagos. A introdução pode ser seguida causando ou permitindo a expressão de um ou mais polinucleotídeos, por exemplo, cultivando células hospedeiras em condições para expressão de um ou mais polipeptideos de um ou mais polinucleotídeos. Sistemas indutíveis podem ser utilizados e a expressão induzida pela adição de um ativador.
Numa modalidade, os polinucleotídeos podem ser integrados no genoma (por exemplo, cromossoma) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida pela inclusão de sequências que promovem recombinação com o genoma, de acordo com técnicas padrão. Noutra modalidade, o ácido nucleico é mantido num vetor epissomal na célula hospedeira. São providenciados métodos aqui que incluem utilizar uma construção, conforme indicado anteriormente, num sistema de expressão para expressar um polipeptideo específico.
Considerando estes e outros fatores, alguém habilitado na arte será capaz de construer uma variedade de combinações de vetor/sequência de controlo de expressão/hospedeiro que expressarão as sequências de ADN em fermentação ou em culturas animais em grande escala.
Um polinucleotideo que codifica um anticorpo, fragmento de ligação ao antigeno ou uma proteína de ligação podem ser preparados de forma recombinante/sinteticamente além de, ou em vez de, clonados. 0 polinucleotideo pode ser desenhado com os codões apropriados para o anticorpo, fragmento de ligação ao antigeno ou uma proteína de ligação. Em geral, alguém selecionará codões preferidos por um hospedeiro pretendido se a sequência for utilizada para expressão. 0 polinucleotideo completo pode ser montado a partir de oligonucleotídeos sobrepostos preparados por métodos padrão e montados numa sequência codificante completa. Ver, por exemplo, Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair et al. , Science, 223:1299 (1984); Jay et al. , J. Biol. Chem., 259:6311 (1984).
Um método geral para incorporação específica do local em aminoácidos não naturais em proteínas é descrito em Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz, Science, 244:182-188 (abril de 1989) . Este método pode ser utilizado para criar análogos com aminoácidos não naturais.
Conforme mencionado anteriormente, uma sequência de ADN que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo pode ser preparada sinteticamente em vez de ser clonada. A sequência de ADN pode ser desenhada com os codões apropriados para a sequência de aminoácidos do anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno. Em geral, alguém selecionará codões preferidos para o hospedeiro pretendido se a sequência for utilizada para expressão. A sequência completa é montada a partir de oligonucleotídeos sobrepostos por métodos convencionais e montada numa sequência codificante completa. Ver, por exemplo, Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair et al. , Science, 223:1299 (1984); Jay et al., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984). 0 termo "adjuvante" refere-se a um composto ou mistura que potência a resposta imune, particularmente a um antigeno. Um adjuvante pode servir como um depósito de tecido que liberta lentamente o antigeno e também como um ativador do sistema linfóide que potência de forma não especifica a resposta imune (Hood et al., Immunology, Segunda Edição, 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, página 384) . Com frequência, um desafio primário com apenas um antigeno, na ausência de um adjuvante, falhará em despoletar uma resposta imune humoral ou celular. Adjuvantes previamente conhecidos e utilizados incluem, mas não se limitam a, adjuvante completo de Freund (CFA), adjuvante incompleto de Freund (IFA), saponina, géis minerais, tais como hidróxido de alumínio, substâncias ativas de superfície, tais como lisolecitina, polióis plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões oleosas ou de hidrocarbono, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol e adjuvante humano potencialmente útil, tal como BCG (Bacille Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Adjuvantes de sais minerais incluem, mas não se limitam a: hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, fosfato de cálcio, hidróxido de zinco e hidróxido de cálcio. Preferencialmente, uma composição adjuvante ainda compreende um lípido de emulsão gorda que compreende cerca de 10% (por peso) óleo vegetal e cerca de 1-2% (por peso) fosfolípidos. Preferencialmente, uma composição adjuvante compreende ainda opcionalmente uma forma de emulsão com partículas oleosas dispersas numa fase aquosa continua com uma emulsão a formar poliól numa quantidade de cerca de 0,2% (por peso) a cerca de 49% (por peso), opcionalmente um óleo metabolizável numa quantidade formadora de emulsão de até 15% (por peso) e opcionalmente um tensoativo baseado em éter glicol numa quantidade estabilizadora de emulsão até cerca de 5% (por peso).
Anticorpos também podem ser amadurecidos para afinidade utilizando métodos de seleção e/ou mutagénese conhecidos, conforme descrito anteriormente. Os anticorpos amadurecidos por afinidade podem ter uma afinidade que é duas vezes, cinco vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes ou mais superior ao anticorpo de partida (em geral, murino, coelho, galinha, humanizado ou humano) a partir do qual o anticorpo amadurecido é preparado. Afinidades aparentes podem ser determinadas por métodos, tais como um ensaio imunossorbente ligado a enzima (ELISA) ou qualquer outra técnica familiar a alguém habilitado na arte. As avidezes podem ser determinadas por métodos, tais como uma análise Scatchard ou qualquer outra técnica familiar a alguém habilitado na arte. Outra técnica para medir a afinidade aparente de ligação familiar a alguém habilitado na arte é uma técnica de ressonância de plasma de superfície (analisado num sistema BIACORE 2000) (Liljeblad, et al., Glyco. J. 2000, 17:323-329) . Medições padrão e ensaios de ligação tradicional são descritos por Heeley, R. P., Endocr. Res. 2002, 28:217-229.
Ainda noutra modalidade, um anticorpo liga-se especificamente e seletivamente a LOXL2 com uma afinidade de ligação superior (por exemplo, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes ou pelo menos cerca de 1000 vezes superior) do que a afinidade de ligação a pelo menos um de: LOX humana, a LOX humana ativa ou madura, a forma segregada de LOX ou outras proteínas tipo lisil oxidase (LOL) ou relacionadas com lisil oxidase (por exemplo, LOXL1, LOXL3 e LOXL4) em produtos não processados, maduros, ativos e/ou segregados. Numa modalidade, o anticorpo liga-se especificamente e seletivamente a LOXL2 em formas não processadas e/ou processadas (maduras). A forma madura de LOXL2 está tipicamente ativa apesar de, nalgumas modalidades, LOXL2 não processada também estar ativa.
Um anticorpo pode-se ligar a ambas LOX humana ou L0XL2 humana, com uma afinidade de ligação superior (por exemplo, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes ou pelo menos cerca de 1000 vezes superior) do que a afinidade de ligação a pelo menos uma de: outras proteínas tipo lisil oxidase ou relacionadas com lisil oxidase (por exemplo, LOXL1, LOXL3 e LOXL4).
Anticorpos que se ligam a enzimas podem ser inibidores competitivos, inibidores acompetitivos ou inibidores não competitivos. Em relação à inibição competitiva, um inibidor normalmente carrega semelhança estrutural com o substrato. A inibição será evidente a baixas concentrações do substrato, mas pode ser ultrapassada a concentrações do substrato elevadas. Em relação à inibição acompetitiva, um inibidor liga-se no local que se torna disponível após o sustrato ser ligado no local ativo. A inibição será mais evidente a concentrações do substrato elevadas. Em relação à inibição não competitiva, um inibidor liga-se num local longe do local de ligação do substrato. A inibição relativa será, em geral, a mesma para todas as concentrações do substrato. O mecanismo de ação anticorpos que atuam como inibidores competitivos, inibidores acompetitivos e inibidores não competitivos é ilustrado na Figura 4. Anticorpos descritos aqui podem ser inibidores competitivos, inibidores acompetitivos ou inibidores não competitivos. Num aspeto, anticorpos descritos aqui podem ser inibidores não competitivos.
Anticorpos descritos aqui são inibidores não competitivos; ou seja, os anticorpos bloqueiam a atividade enzimática de LOXL2 independentemente de se as enzimas estão ou não ligadas ao substrato (colagénio). A ligação de um anticorpo a L0XL2 pode (1) reduzir ou inibir a captação ou internalização de L0XL2 (por exemplo, através da integrina beta 1 ou outros recetores celulares ou proteínas) e/ou (2) reduzir ou inibir a atividade enzimática de L0XL2. Pensa-se que tal anticorpo poderia reduzir EMT e é, assim, útil para as aplicações reveladas aqui. Um anticorpo descrito aqui pode ligar-se ao local de clivagem proteolítica de L0XL2, bloqueando, assim, eficazmente (inibindo) o processamento da L0XL2 para reduzir o nível de LOX ou L0XL2 ativo. Tal inibição pode ocorrer através de ligação direta a L0XL2 ou através de interferência indireta incluindo impedimento estérico, alteração enzimática de L0XL2, inibição da transcrição ou tradução, destabilização de transcritos de ARNm, exportação debilitada, processamento ou localização de L0XL2 e afins. A ligação de L0XL2 com outras proteínas, tais como recetores celulares (por exemplo, recetor de captação integrina beta 1), BTK (tirosina quinase agamaglobulinémia de Burton) ou outras integrinas também é realizada utilizando o ensaio previamente mencionado, em que em vez de proteínas ECM, são utilizados recetores celulares (por exemplo recetor de captação integrina beta 1) , BTK (tirosina quinase agamaglobulinémia de Burton) ou outras integrinas.
Aqueles anticorpos anti-L0XL2 que inibem a ligação de L0XL2 a proteínas ECM, recetores celulares e integrinas, são selecionados como candidatos para desenvolvimento posterior. Numa modalidade, os anticorpos anti-L0XL2 que inibem a ligação de L0XL2 a proteínas ECM, recetores celulares e integrinas são inibidores não competitivos.
Numa modalidade, um anticorpo descrito aqui liga-se especificamente ao domínio catalítico de LOX. Este domínio, na região C-terminal, contém os elementos necessários para atividade catalítica (o local de ligação ao cobre, resíduos tirosil e lisil que contribuem para o co-fator carbonilo e 10 resíduos de cisteína. Ver, Thomassin et al. "The Pro-regions of lysyl oxidase and lysyl oxidase-like 1 are required for deposition onto elastic fibers," J Biol. Chem. 2005 Dec 30; 280(52) :42848-55 para mais detalhes.
Os anticorpos podem ligar ambas LOXL2 de comprimento inteiro e/ou processada. São providenciados aqui anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a LOXL2, conforme definido nas reivindicações. Anticorpos anti-LOXL2 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a e/ou inibem LOXL2 têm utilização nos métodos de purificação, diagnóstico e terapêuticos descritos aqui. São ainda providenciados aqui anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno que compete com, ou se ligam especificamente a, qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos precedentes para ligação a LOXL2.
Qualquer um de tais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno pode ligar-se especificamente a LOXL2 com uma afinidade de ligação de pelo menos 2,5, 10, 50, 100, 500 ou 1000 vezes superior a pelo menos uma de LOX, LOXL1, LOXL3 ou LOXL4.
Numa modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descritos aqui liga-se especificamente à região SRCR3-4 de L0XL2 e liga, assim, ambas L0XL2 de comprimento inteiro e processada. Num aspeto, ambas L0XL2 de comprimento inteiro e processada são formas ativas da enzima. Um anticorpo pode, por exemplo, ligar-se especificamente a um epítopo com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID N.° 6. Tais anticorpos podem servir como um inibidor parcial acompetitivo da atividade enzimática in vitro, inibindo aproximadamente metade da atividade enzimática contra um substrato 1,5-diaminopentano com um IC50 aparente de 20 - 30 nM. Tais anticorpos podem servir como inibidores não competitivos.
Quando anticorpos humanizantes, pode ser conseguida incorporação simultânea de todos os ácidos nucleicos codificantes FR e/ou CDR e de todos as alterações de posição de aminoácidos selecionadas por uma variedade de métodos conhecidos daqueles habilitados na arte, incluindo por exemplo, síntese recombinante e química. Por exemplo, a incorporação simultânea pode ser conseguida, por exemplo, sintetizando quimicamente a sequência nucleotídica para a região variável aceitadora, fundida juntamente com os ácidos nucleicos codificantes CDR dadores e incorporando nas posições selecionadas para albergarem resíduos de aminoácidos variáveis uma pluralidade de codões de aminoácidos correspondentes. São providenciados aqui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a L0XL2. Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a L0XL2 podem inibir (parcialmente ou completamente) ou gerir/tratar (parcialmente ou completamente) sintomas associados com e/ou causados pela expressão aberrante de L0XL2. 0 pedido também providencia linhas celulares que podem ser utilizadas para produzir os anticorpos, métodos para produzir as linhas celulares, métodos para expressar os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno e de purificar os mesmos.
Uma pessoa reconhecerá que os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente a L0XL2 gerados utilizando os métodos descritos aqui podem ser testados utilizando os ensaios providenciados aqui ou conhecidos na arte para a capacidade de se ligar a L0XL2 (por exemplo, ELISA) bem como para a afinidade (por exemplo, Biacore ou Ressonância de plasma de superfície).
Versões humanizadas de anticorpos anti-L0XL2 têm uma ou mais das seguintes características: retenção da função inibidora dos anticorpos monoclonais murinos, afinidade de ligação equivalente ou aumentada com uma taxa de dissociação lenta (por exemplo, Kd 0,1-1 nM) , ligação a LOXL2 de comprimento inteiro e/ou processada, inibição não competitiva parcial da atividade enzimática, Ic50 equivalente ou superior (por exemplo, cerca de 30 nM) , atividade inibidora em ensaios de migração/invasão baseados em células, inibição de uma alteração tipo EMT induzida pela LOXL2 segregada em meios condicionados de células tumorais, ligação a LOXL2 associada a matriz gerada pelas células tumorais humanas vivas, reatividade cruzada da ligação de LOXL2 humana com LOXL2 murina, eficácia terapêutica (por exemplo, parcial ou redução no tamanho e/ou sintomas do tumor), toxicidade reduzida e imunogenicidade reduzida. São providenciados aqui anticorpos humanizados que se ligam a hLOXL2 e anticorpos humanizados que se ligam a hLOXL2 e LOXL2 (LOXL2 murina). Num aspeto, os anticorpos humanizados são inibidores não competitivos.
Numa modalidade, um anticorpo anti-LOXL2 humanizado tem cadeia VH com uma sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 25, SEQ. ID N.° 26, SEQ. ID N.° 27 ou SEQ. ID N.° 28. Alguém compreenderia que podem ser feitas modificações de aminoácidos conservadoras utilizando os métodos descritos aqui numa ou mais regiões CDR ou estrutura para maturação da afinidade do anticorpo. Anticorpos modificados por tais métodos podem ser testados em relação à função utilizando qualquer um dos ensaios descritos aqui ou conhecidos na arte.
Noutra modalidade, um anticorpo anti-LOXL2 humanizado tem cadeia VL com uma sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 30, SEQ. ID N.° 31 ou SEQ. ID N.° 32. Alguém compreenderia que podem ser feitas modificações de aminoácidos conservadoras utilizando os métodos descritos aqui numa ou mais regiões CDR ou estrutura para maturação da afinidade do anticorpo. Anticorpos modificados por tais métodos podem ser testados em relação à função utilizando qualquer um dos ensaios descritos aqui ou conhecidos na arte. É providenciado aqui um anticorpo humanizado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a L0XL2, compreendendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que dita região variável da cadeia pesada compreende: (i) uma cadeia pesada FR1 com a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 33 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 33, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de glutamina (Q) por valina (V) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 24; (b) uma substituição de leucina (L) por valina (V) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 30; (c) uma substituição de valina (V) por lisina (K) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 31; (d) uma substituição de arginina (R) por lisina (K) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 32; e (e) uma substituição de treonina (T) por alanina (A) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 35; e uma deleção dos resíduos de aminoácidos 1-19; (ii) uma cadeia pesada FR2 com a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 34 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 34, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de lisina (K) por arginina (R) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 3; (b) uma substituição de arginina (R) por alanina (A) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 5, e (iii) uma cadeia pesada FR3 com a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 35 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 35, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de lisina (K) por arginina (R) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 1; (b) uma substituição de alanina (A) por valina (V) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 2; (c) uma substituição de leucina (L) por isoleucina (I) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 4; (d) uma substituição de serina (S) por treonina (T) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 10; (e) uma substituição de glutamina (Q) por ácido glutâmico (E) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 16; (f) uma substituição de treonina (T) por arginina (R) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 21; (g) uma substituição de ácido aspártico (D) por ácido glutâmico (E) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 23; (h) uma substituição de serina (S) por treonina (T) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 25; e (i) uma substituição de fenilalanina (F) por tirosina (Y) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 29; e (iv) uma cadeia pesada FR4 com a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 36 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 36, mas por uma substituição de lisina (K) por valina (V) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 7, e em que dita região variável da cadeia leve compreende: (i) uma cadeia leve FR1 com a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 49 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 49, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de alanina (A) por treonina (T) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 27; (b) uma substituição de alanina (A) por prolina (P) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 28; (c) uma substituição de prolina (P) por leucina (L) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 29; (d) uma substituição de valina (V) por leucina (L) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 31; (e) uma substituição de ácido glutâmico (E) por glutamina (Q) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 37; (d) uma substituição de serina (S) por prolina (P) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 38; (f) uma substituição de valina (V) por alanina (A) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 39; e uma deleção dos resíduos de aminoácidos 1-20; (ii) uma cadeia leve FR2 com a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 50 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N. 0 50, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de fenilalanina (F) por tirosina (Y) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 2; e (b) uma substituição de arginina (R) por lisina (K) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 5; (iii) uma cadeia leve FR3 com a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 51 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 51, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de alanina (A) por ácido aspártico (D) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 14; e (b) uma substituição de arginina (R) por lisina (K) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 18; e (iv) uma cadeia leve FR4 com a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 52 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 52, mas por uma substituição de leucina (L) por valina (V) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 7;
Numa modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, compreende uma região variável da cadeia pesada FR1 com uma sequência de aminoácidos, conforme apresentada na SEQ. ID N.° 33, 37 ou 44; uma região variável da cadeia pesada FR2 com uma sequência de aminoácidos, conforme apresentada na SEQ. ID N.° 34, 38 ou 45; uma região variável da cadeia pesada FR3 com uma sequência de aminoácidos, conforme apresentada na SEQ. ID N.° 35, 39, 46, 47 ou 48; uma região variável da cadeia pesada FR4 com uma sequência de aminoácidos, conforme apresentada na SEQ. ID N.° 36 ou 40; uma região variável da cadeia leve FR1 com uma sequência de aminoácidos, conforme apresentada na SEQ. ID N.° 49 ou 53; uma região variável da cadeia leve FR2 com uma sequência de aminoácidos, conforme apresentada na SEQ. ID N.° 50, 54 ou 60; uma região variável da cadeia leve FR3 com uma sequência de aminoácidos, conforme apresentada na SEQ. ID N.° 51, 55 ou 61; e uma região variável da cadeia leve FR4 com uma sequência de aminoácidos, conforme apresentada na SEQ. ID N.0 52 ou 5 6 .
Abrangidas no âmbito do presente pedido estão as cadeias variáveis pesadas e cadeias variáveis leves que são pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%,85%, 90%, 95% ou até 100% idênticas às cadeias variáveis pesadas e cadeias variáveis leves descritas aqui.
Substituições conservadoras são modificações menores destas sequências nucleotidicas e/ou pretende-se que aminoácidos sejam incluídos como cadeias pesada e leve que codificam ácidos nucleicos e os seus fragmentos funcionais.
Tais modificações menores incluem, por exemplo, aquelas que não alteram a sequência de aminoácidos codificada devido à degeneração do código genético, bem como aquelas que resultam em apenas uma substituição conservadora da sequência de aminoácidos codificada ou aquelas que não alteram substancialmente a capacidade de ligação do anticorpo. Substituições conservadoras de aminoácidos codificados incluem, por exemplo, aminoácidos que pertencem aos grupos seguintes: (1) aminoácidos não polares (Gly, Ala, Vai, Leu e Ile) ; (2) aminoácidos polares neutrais (Cys, Met, Ser, Thr, Asn e Gin) ; (3) aminoácidos polares acidicos (Asp e Glu); (4) aminoácidos polares básicos (Lys, Arg e His); e (5) aminoácidos aromáticos (Phe, Trp, Tyr e His). Outras modificações menores estão incluídas nos ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos das cadeias pesada e leve da invenção desde que os ácidos nucleicos ou polipeptídeos codificados retenham alguma, ou toda, da sua função, conforme descrito aqui, e que têm utilização nos métodos descritos aqui. Substituições não conservadoras são aquelas que não são identificads como substituições conservadoras. Utilizando os métodos descritos aqui, uma pessoa pode verificar se seria possível substituir um aminoácido não conservador por um resíduo de aminoácidos estrutura residue e testar a função do anticorpo modificado utilizando os ensaios descritos aqui noutro local.
Cadeias variáveis pesadas e cadeias variáveis leve modificadas podem ser classificadas em relação à ligação e atividade utilizando métodos conhecidos na arte e descritos aqui.
Uma porção substancial de um domínio variável incluirá três regiões CDR, juntamente com as suas regiões estrutura intervenientes. A porção também pode incluir pelo menos cerca de 50% de qualquer uma ou ambas a primeira e quarta regiões estrutura, sendo 50% correspondente a 50% do C-terminal da primeira região estrutura e 50% do N-terminal da quarta região estrutura. Resíduos adicionais na extremidade N-terminal ou C-terminal da parte substancial do domínio variável podem ser aqueles não normalmente associados com regiões do domínio variável que ocorrem naturalmente. Por exemplo, a construção de anticorpos anti-L0XL2 humanizados e fragmentos de ligação ao antígeno descritos aqui feitos por técnicas de ADN recombinante podem resultar na introdução de resíduos N- ou C-terminal codificados por ligantes introduzidos para facilitar a clonagem ou outras etapas de manipulação. Outras etapas de manipulação incluem a introdução de ligantes para juntar domínios variáveis a sequências proteicas adicionais incluindo cadeias pesadas da imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo, na produção de diacorpos) ou rótulos proteicos, conforme discutido com mais detalhes a seguir.
Anticorpos abrangidos pelo presente pedido, incluindo, por exemplo, aqueles com cadeias variáveis pesadas ou leves que têm pelo menos 50% de identidade com aqueles descritos aqui podem ser avaliados em relação à atividade anti-LOX ou anti-LOXL2. É providenciado aqui um método para identificar um anticorpo que inibe o crescimento celular do tumor metastático, compreendendo contactar L0XL2 ou uma célula que expressa L0XL2 com um anticorpo candidato; e determinar a expressão ou atividade da L0XL2, pela qual o anticorpo candidato que reduz a expressão ou atividade da L0XL2 comparado com a expressão ou atividade da detetada na ausência do anticorpo é identificado como o composto que inibe o crescimento celular do tumor metastático. Em modalidades particulares, o anticorpo é contactado com L0XL2 ou uma célula que expressa L0XL2 em condições hipóxicas. Num aspeto, os anticorpos descritos aqui podem ser inibidores não competitivos.
Também é providenciado aqui um método para identificar um anticorpo que aumenta a eficácia de agentes quimioterapêuticos, compreendendo contactar L0XL2 ou uma célula que expressa L0XL2 com um anticorpo candidato; pela qual o anticorpo candidato que reduz a expressão ou atividade da L0XL2 comparado com a expressão ou atividade da detetada na ausência do anticorpo é identificado como o anticorpo que aumenta a eficácia dos agentes quimioterapêuticos na inibição ou redução do crescimento tumoral metastático.
Qualquer fonte adequada de L0XL2 pode ser empregue como um alvo de anticorpo no presente método. A enzima pode ser derivada, isolada ou produzida de forma recombinante a partir de qualquer fonte conhecida na arte, incluindo levedura, microbiana e de mamífero, que permitirá a geração de um produto adequado que pode gerar um reagente detetável ou será biologicamente ativo num ensaio adequado. A atividade enzimática de L0XL2 pode ser avaliada por qualquer método adequado descrito aqui ou conhecido na arte. Métodos exemplares de avaliar a atividade de L0XL2 incluem os de Trackman et al. , Anal. Biochem. 113:336-342 (1981); Kagan, et al., Methods Enzymol. 82A:637-49 (1982); Palamakumbura et al. , Anal. Biochem. 300:245-51 (2002); Albini et al. , Cancer Res. 47: 3239-45 (1987); Kamath et al, Cancer Res. 61:5933-40 (2001); Patente U.S. N.° 4 997 854; e Pedido de Patente U.S. N.° 2004/0248871. Por exemplo, a atividade enzimática pode ser avaliada detetando e/ou quantificando "biprodutos da lisil oxidase," tais como produção de H2O2; resíduos de piridinio colagénio, produção de amónia; produção de produto aldeído; oxidação de lisil, deoxipiridinolina (Dpd)-discutida anteriormente. Também é possível detetar e quantificar a capacidade de invasão celular in vitro·, adesão e crescimento celular in vitro·, e crescimento metastático in vivo. Modelos in vivo incluem, mas não se limitam a, modelos singénicos adequados, modelos de xeno-enxerto de tumor humano, modelos ortotópicos, modelos metastáticos, modelos transgénicos e modelos de gene knockout (ver, por exemplo, Teicher, Tumors Models in Cancer Research (Humana Press 2001)).
As condições hipóxicas podem ser induzidas ou ocorrer naturalmente. As áreas hipóxicas ocorrem, com frequência, no interior do tumor sólido. A hipoxia também pode ser induzida in vivo, particularmente em modelos animais experimentais, utilizando diminuição ou cessação do fluxo sanguíneo arterial para o tumor ou a administração de compostos vasoconstritores. Ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 5 646 185. Compostos vasoconstritores exemplares incluem agonistas adrenérgicos diretos e indiretos, tais como norepinefrina, epinefrina, fenilefrina e cocaína. A presença de uma região hipóxica num tumor sólido presente num sujeito pode ser observada por um número de métodos atualmente conhecidos na arte, incluindo ressonância magnética nuclear (NMR) e histografia de elétrodo de oxigénio p02. Tais métodos podem ser utilizados no contexto da presente invenção (conforme descrito a seguir) para identificar regiões alvo de tratamento hipóxico e para guiar a adminitração de composições de tratamento a tais regiões. Condições hipóxicas, in vitro, podem ser induzidas utilizando qualquer método adequado. Por exemplo, as células podem ser mantidas em condições anóxicas (<0,1% O2) a 37°C numa câmara anaeróbica ou em condições hipóxicas (1 a 2% O2) a 37°C numa câmara incubadora modular preenchida com 5% CO2 e 1 a 2% O2 balançado com N2. Ver, por exemplo, Erler et al., Mol. Cell. Biol. 24:2875-89 (2004).
As enzimas LOXL2 ou células que expressam LOXL2 podem ser contactadas com um composto (por exemplo, um inibidor de LOX/LOXL, tal como um anticorpo) de qualquer maneira adequada durante qualquer quantidade de tempo adequada. Para regiões do tumor que estão acessíveis para entrega hipodérmica do agente, pode ser desejável injetar o composto diretamente na região hipóxica. As células podem ser contactadas com o composto mais do que uma vez durante a incubação ou tratamento. Tipicamente, a dose necessária para um anticorpo está no intervalo de cerca de 1 micro-g/ml a 1000 micro-g/ml, mais tipicamente no intervalo de cerca de 100 pg/ml a cerca de 800 pg/ml. A dose exata pode ser prontamente determinada a partir de culturas in vitro das células e exposição da célula a várias dosagens do composto. Tipicamente, a quantidade de tempo em que a célula é contactada com o composto é cerca de 5 minutos, cerca de 15 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 4 horas, cerca de 12 horas, cerca de 36 horas, cerca de 48 horas a cerca de 3 dias ou mais, mesmo indefinidamente, mais tipicamente durante cerca de 24 horas. Para ensaios de invasão in vitro, pode ser utilizada qualquer matriz adequada. Numa modalidade, a matriz é matriz Matrigel™ de membrana basal reconstituída (BD Sciences). Métodos de classificação também podem incluir uma etapa de medição dos níveis de FAK. Conforme descrito a seguir, FAK (quinase de adesão focal [pl25FAK]) é ativada como parte do processo de motilidade celular. Quando LOX é inibida, a fosforilação de FAK não é aumentada em condições hipóxicas. Num ensaio de classificação de composto, uma etapa secundária pode incluir a deteção dos níveis de fosfo-FAK ambos com e sem a adição do anticorpo teste. Um anticorpo inibidor teste também reduzirá os níveis de fosfo-FAK.
Um anticorpo é um inibidor da expressão ou atividade biológica de LOXL2 quando o anticorpo reduz a expressão ou atividade de LOXL2 relativa à observada na ausência do anticorpo. Numa modalidade, um anticorpo é um inibidor de LOXL2 quando reduz a incidência de metástases em relação à observada na ausência do anticorpo e, em testes adicionais, inibe o crescimento tumoral metastático. Num aspeto, os anticorpos descritos aqui são inibidores não competitivos. A inibição do tumor pode ser quantificada utilizando qualquer método de medição conveniente. A incidência de metástases pode ser avaliada examinando a disseminação relativa (por exemplo, número de sistemas de orgãos envolvidos) e carga de tumor relativa nestes locais. 0 crescimento metastático pode ser verificado por analise microscópica ou macroscópica, conforme apropriado. As metastases de tumor podem ser reduzidas em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais. Nalgumas modalidades, o anticorpo pode ser avaliado em relação a outros anticorpos ou compostos que não têm impacto sobre a expressão ou atividade biológica de LOX ou LOXL2. Os anticorpos teste podem ser administrados no momento da inoculação do tumor, depois do estabelecimento do crescimento tumoral primário, ou após o estabelecimento de metástases locais e/ou distantes. A administração única ou múltipla do anticorpo teste pode ser feita utilizando qualquer modo de administração conveniente incluindo, mas não limitado a, intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, subcutânea e intradérmica.
Qualquer célula adequada que expressa LOXL2 pode ser empregue com os presentes métodos. Conforme utilizado aqui, o termo "célula" inclui uma célula biológica (por exemplo, CHO, HeLa, etc.). A célula pode ser humana ou não humana. A célula pode ser isolada de fresco (isto é, primária) ou derivada a partir de uma linha celular estabelecida a curto prazo ou a longo prazo. Linhas celulares biológicas exemplares incluem células cancerígenas mamárias humanas MDA-MB 231, células cancerígenas mamárias humanas MDA-MB 435, glioma U-87 MG, células SCL1 do carcinoma das células escamosas, CEM, carcinoma epitelial HeLa e células de ovário de hamster Chinês (CHO). Tais linhas celulares são descritas, por exemplo, no Catálogo de Linhas celulares da Coleção Americana de Culturas Tipo (ATCC, Rockville, MD).
Uma célula pode expressar a L0XL2 ou o seu promotor endogenamente ou exogenamente (por exemplo, como um resultado da transferência estável de genes) . A expressão endógena por uma célula, conforme providenciada aqui, pode resultar da expressão constitutiva ou induzida de genes endógenos. A expressão endógena por uma célula, conforme providenciada aqui, pode resultar da introdução das sequências de ácidos nucleicos que codificam ou L0XL2 ou um fragment biologicamente ativo do mesmo, ou sequência de ácido nucleico do promotor de LOXL2 promoter. A transformação pode ser conseguida utilizando vetores virais, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, eletroporação, biolística, reagentes lipídicos catiónicos ou qualquer outra técnica conveniente conhecida na arte. A maneira de transformer de forma útil na presente invenção é convencional e é exemplificada em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, et ai., editores 2000) . A expressão exógena da lisil oxidase ou do seu promotor pode ser passageira, estável ou alguma combinação das mesmas. A expressão exógena da enzima pode ser conseguida utilizando promotores constitutivos, por exemplo, SV40, CMV e afins, e promotores indutíveis conhecidos na arte. Promotores adequados são aqueles que funcionarão na célula de interesse.
Os métodos descritos aqui não são limitantes e quaisquer outros métodos conhecidos na arte também podem ser utilizados para testar a atividade de anticorpos anti-LOXL2. Ensaios adicionais são descritos a seguir nos Exemplos.
Pode ser necessário nalgumas ocasiões introduzir uma região ligante de polipeptídeo não estruturada entre um rótulo da presente invenção e porções dos anticorpos. O ligante pode facilitar flexibilidade potenciada e/ou reduzir impedimento estérico entre quaisquer dois fragmentos. 0 ligante também pode facilitar a ocorrência da dobragem apropriada de cada fragmento. 0 ligante pode ser de origem natural, tal como uma sequência determinada para existir em espiral aleatória entre dois domínios de uma proteína. Uma sequência ligante exemplar é o ligante encontrado entre os domínios C-terminal e N-terminal da subunidade a da ARN polimerase. Outros exemplos de ligantes que ocorrem naturalmente incluem os ligantes encontrados nas proteínas 1CI e LexA.
Dentro do ligante, a sequência de aminoácidos pode ser variada com base nas características do ligante preferidas, conforme determinado empiricamente ou conforme revelado por modelação. Considerações na escolha de um ligante incluem a flexibilidade do ligante, carga do ligante e presença de alguns aminoácidoss do ligante nas subunidades que ocorrem naturalmente. 0 ligante também pode ser desenhado de tal modo que os resíduos do ligante contactam o ADN, influenciando, assim, a afinidade de ligação ou especificidade, ou para interagir com outras proteínas. Nalguns casos, particularmente quando é necessário abranger uma distância mais longa entre subunidades ou quando os domínios têm de ser mantidos numa configuração particular, o ligante pode opcionalmente conter um domínio dobrado adicional.
Nalgumas modalidades, é preferível que o desenho de um ligante envolva um arranjo de domínios que requer que o ligante abranja uma distância relativamente curta, preferencialmente menos de cerca de 10 Angstroms (A). Contudo, em certas modalidades, os ligantes abrangem uma distância de até cerca de 50 A.
Os anticorpos são providenciados aqui de modo que são conjugados ou ligados a frações terapêuticas e/ou de tomografia/detetáveis. Métodos para conjugar ou ligar anticorpos são bem conhecidos na arte. As associações entre anticorpos e rótulos incluem quaisquer meios conhecidos na arte incluindo, mas não limitados a, interações covalentes e não covalentes.
Numa modalidade não limitante, os anticorpos podem estar associados com uma toxina, um radionuclideo, um composto relacionado com ferro, um corante, um reagente de tomografia, um rótulo fluorescente ou um agente quimioterapêutico que seria tóxico quando entregue a uma célula cancerígena.
Em alternativa, os anticorpos podem ser associados com rótulo detetável, tal como um radionuclideo, composto relacionado com ferro, um corante, um reagente de tomografia, ou um agente fluorescente para imunodeteção de antígenos alvo.
Exemplos não limitantes de radio-rótulos incluem, por exemplo, 32P, 33P, 43K, 52Fe, 57Co, 64Cu, 67Ga, 67Cu, 68Ga, 71Ge, 75Br, 76Br, 77Br, 77As, 77Br, 81Rb/81MKr, 97MSr, 90Y, 97Ru, 99Tc, 100Pd, 101Rh, 103Pb, 105Rh, 109Pd, 411Ag, 411In, 113ln, 119Sb, 121Sn, 1231 1251, 127Cs, 128Ba, 129Cs, 1311 131Cs, 143Pr, 153Sm, 161Tb, 166Ho, 169Eu, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 1910s 193Pt, 194 Ir, 197Hg, 199Au, 203Pb 211At, 212Pb, 1212BÍ e 213Bi.
Exemplos não limitantes de toxinas incluem, por exemplo, cadeia A da difteria, fragmentos de ligação não ativa da toxina da difteria, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor da Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor da Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, tricotecenos, fosfolipase C de Clostridium perfringens (PLC), ribonuclease pancreática bovina (BPR), proteína antiviral (PAP), abrina, fator de veneno de cobra (CVF), gelonina (GEL), saporina (SAP) viscumina.
Exemplos não limitantes de compostos relacionados com ferro incluem, por exemplo, partículas de óxido de ferro magnéticas, partículas férricas ou ferrosas, Fe203 e Fe304 . Compostos relacionados com ferro e métodos de rotular polipeptídeos, proteínas e péptidos podem ser encontrados, por exemplo, nas Patentes U.S. N.°s 4 101 435 e 4 452 773 e Pedidos publicados U.S. 20020064502 e 20020136693.
Em certas modalidades, os anticorpos sujeitos podem ser unidos de forma covalente ou não covalente a uma citotoxina ou outro composto de inibição da proliferação celular, de modo a localizer a entrega daquele agente a uma célula tumoral. Por exemplo, o agente pode ser selecionado do grupo que consiste em agentes, inibidores de enzima, inibidores da proliferação, agentes líticos, inibidores da síntese de ADN ou ARN, modificadores da permeabilidade da membrana, metabolitos de ADN, derivados de dicloroetilssulfido, inibidores da produção de proteínas, inibidores de ribossomas, indutores da apoptose e neurotoxinas.
Em certas modalidades, os anticorpos sujeitos podem sr unidos a um agente útil na tomografia de tumores. Tais agentes incluem: metais; quelantes de metal; lantanidos; quelantes de lantanidos; radiometais; quelantes de radiometais; núcleos emissores de positrões; microbolhas (para ultra-som); lipossomas; moléculas microencapsuladas en lipossomas ou nanosferas; nanocompostos de óxido de ferro monocristalino; agentes de constraste de tomografia de ressonância magnética; agentes de absorção, refletores e/ou de dispersão da luz; partículas coloidais; fluoróforos, tais como fluoróforos quase-infravermelhos. Em muitas modalidades, tal fração/funcionalidade secundária será relativamente grande, por exemplo, pelo menos 25 amu de tamanho e em muitas ocasiões podem ser pelo menos 50, 100 ou 250 amu de tamanho.
Em certas modalidades, a funcionalidade secundária é uma fração quelada para quelar um metal, por exemplo, um quelante para um radiometal ou ião paramagnético. Em modalidades adicionais, é um quelante para um radionuclídeo útil para radioterapêutica ou procedimentos de tomografia.
Radionuclídeos úteis na presente invenção incluem emissores de gama, emissores de positrão, emissores de eletrões de Auger, emissores de raios X e emissores de fluorescência, com emissores de beta ou alfa preferidos para utilização terapêutica. Exemplos de radionuclídeos úteis como toxinas na terapêutica de radiação incluem: 32P, 33P, 43K 52Fe, 57Co, 64Cu, 67Ga, 67Cu, 68Ga, 71Ge, 75Br, 76Br, 77Br, 77As, 77Br, 81Rb/81MKr, 87MSr, 90Y, 97Ru, 99Tc, 100Pd, 101Rh, 103Pb, 105Rh, 109Pd, 411Ag, 411In, 113In, 119Sb, 121Sn, 1231, 1251, 127Cs, 12 8Ba, 129Cs, 1311, 131Cs, 143Pr, 153Sm, 161Tb, 166Ho, 169EU, 177Lu 186Re, 188Re, 189Re, 1910s, 193Pt, 194Ir, 197Hg, 199Au, 203Pb, 211At, 212Pb, 212Bi e 213Bi.
Radionuclídeos terapêuticos preferidos incluem 188Re, 186Re, 203Pb, 212Pb, 212Bi, 109Pd, 64Cu, 67Cu, 90Y, 125I, 131I, 77Br, 211At, 97Ru, 105Rh, 198Au e 199Ag, 166Ho ou 177Lu. Condições sob as quais um quelante coordenará um metal são descritas, por exemplo, por Gasnow et ai. Patentes U.S. N.°s 4 831 175, 4 454 106 e 4 472 509. Na presente invenção, "radionuclídeo" e "radio-rótulo" são intercambiáveis. 99Tc é um radioisótopo particularmente atrativo para aplicações diagnósticas, já que está prontamente disponível a todos os departamentos de medicina nuclear, é barato, proporciona doses de radiação mínimas ao paciente e tem propriedades de tomografia nuclear ideais. Tem uma meia-vida de seis horas o que significa que é desejável alvejar rapidamente um anticorpo rotulado com tecnécio. Em conformidade, em certas modalidades preferidas, os anticorpos modificados incluem um agente quelante para tecnécio.
Ainda noutras modalidades, a funcionalidade secundária pode ser um agente radiossensibilizador, por exemplo, uma fração que aumenta a sensibilidade das células à radiação. Exemplos de agentes radiossensibilizadores incluem nitroimidazóis, metronidazol e misonidazol (ver: DeVita, V. T. em Harrison's Principles of Internal Medicine, página 68, McGraw-Hill Book Co., Nova Iorque, 1983). Os anticorpos modificados que compreendem um agente radiossensibilizador como a fração ativa são administrados para localizar na célula alvo. No momento da exposição do indivíduo à radiação, o agente radiossensibilizador é "excitado" e causa a morte da célula.
Existe uma ampla gama de frações que podem servir como quelantes e que podem ser derivadas nos anticorpos da presente invenção. Por exemplo, o quelante pode ser um derivado de ácido 1,4,7,10- tetraazaciclododecanotetraacético (DOTA), ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA) e ácido 1-p-Isotiocianato-benzil-metil-dietilenotriaminapentaacético (ITC-MX). Estes quelantes têm tipicamente grupos na cadeia lateral pelos quais o quelante pode ser utilizado para anexação a antagonistas sujeitos. Tais grupos incluem, por exemplo, benzilisotiocianato, pelo qual o DOTA, DTPA ou EDTA pode ser unido a, por exemplo, um grupo amina.
Numa modalidade, a fração quelada é uma fração quelada "NxSy". Conforme definido aqui, os "quelados NxSy" incluem quelantes bifuncionais que são capazes de ligar de forma coordenada um metal ou radiometal e, preferencialmente, têm núcleos N2S2 ou N3S. Quelados NxSy exemplares são descritos, por exemplo, em Fritzberg et al. (1998) PNAS 85: 4024-29; e Weber et al. (1990) Chem. 1: 431-37; e nas referências citadas neles.
Jacobsen et al. (pedido PCT WO 98/12156) providenciam métodos e composições, isto é, bibliotecas sintéticas de frações de ligação, para identificar compostos que se ligam a átomo metal. A abordagem descrita nessa publicação pode ser utilizada para identificar frações de ligação que podem subsequentemente ser adicionadas aos anticorpos para derivar os anticorpos modificados.
Um problema encontrado com frequência com a utilização de proteínas conjugadas em aplicações radiodiagnósticas é uma acumulação potencialmente perigosa dos fragmentos da fração radio-rotulada no rim. Quando o conjugado é formado utilizando um ligante lábil ácido ou básico, pode ocorrer com vantagem a clivagem do quelado radioativo da proteína. Se o quelado tiver um peso molecular relativamente baixo, como se espera que a maioria dos anticorpos modificados sujeitos, fragmentos de ligação ao antígeno e péptidos sejam, não é retido no rim e é excretado na urina, reduzindo, assim, a exposição do rim à radioatividade. Contudo, em certas ocasiões, pode ser vantajoso utilizer ligandos sujeitos lábeis ácidos ou básicos pelas mesmas razões que foram utilizados nas proteínas rotuladas.
Em conformidade, certos dos anticorpos rotulados/modifiçados sujeitos podem ser sintetizados, por métodos convencionais na arte, para providenciarem grupos funcionais reativos que podem formar ligações lábeis ácidas com, por exemplo, um grupo carbonilo do ligando. Exemplos de ligações lábeis ácidas adequadas incluem funções hidrazona e tiosemicarbazona. Estas são formadas reagindo o carbihidrato oxidado com quelados com hidrazida, tiosemicarbazida e funções, respetivamente.
Em alternativa, pode ser utilizada clivagem básica que foi utilizada para a eliminação potenciada do radio-rótulo dos rins. Ver, por exemplo, Weber et al. 1990 Bioconjg. Chem. 1:431. A união de um quelado bifuncional a um anticorpo através de uma ligação hidrazida pode incorporar frações éster sensíveis a base num braço espaçador do ligante. Tal unidade de ligante contendo éster é exemplificada pelo etileno glicolbis (sucinimidil sucinato), (EGS, disponível de Pierce Chemical Co. , Rockford, 111.), que tem dois derivados éster N-hidroxisuccinimida (NHS) terminal de duas unidades de ácido 1,4-dibutírico, cada uma das quais estão liqadas a uma única fração de etilenoqlicol por dois ésteres de alquilo. Um éster NHS pode ser substituído com um BFC contendo amina adequado (por exemplo, 2-aminobenzil DTPA), enquanto que o outro éster NHS é reaqido com uma quantidade limitante de hidrazina. A hidrazida resultante é utilizada para unir aos antagonistas, formando uma ligação ligando-BFC que contém duas funções de éster de alquilo. Tal conjugado é estável a pH fisiológico, mas rapidamente dividido a pH básico.
Os anticorpos rotulados por quelação de radioisótopos são sujeitos a cisão induzida por radiação do quelante e à perda de radioisótopo por dissociação do complexo de coordenação. Nalgumas ocasiões, o metal dissociado do complexo pode ser re-complexado, providenciando eliminação mais rápida de isótopos localizados de forma não específica e, portanto, toxicidade inferior para os tecidos não alvo. Por exemplo, os compostos quelantes, tais como EDTA ou DTPA, podem ser infundidos em pacientes para providenciar um grupo de quelantes para ligar o radiometal libertado e facilitar a excreção de radioisótopos livres na urina.
Ainda noutras modalidades, os anticorpos são unidos a um adendo de Boron, tal como um carborano. Por exemplo, podem ser preparados carboranos com funções carboxilo ou cadeias laterais pendentes, como é bem conhecido na arte. A anexação de tais carboranos a péptidos amina pode ser conseguida por ativação dos grupos carboxilo dos carboranos e condensação com o grupo amina para produzir o conjugado. Tais anticorpos modificados podem ser utilizados para terapêutica de captura de neutrões. A presente invenção também contempla a modificação de antagonistas sujeitos com corantes, por exemplo, úteis na terapêutica e utilizados em conjunto com radiação não ionizante apropriada. A utilização de luz e porfirinas nos métodos da presente invenção também está contemplada e a sua utilização na terapêutica de cancro foi revista por van den Bergh, Chemistry in Britain, 22: 430-437 (1986).
Uma modalidade da presente invenção inclui antagonistas rotulados com um rótulo fluorescente. Rótulos fluorescentes comuns incluem, por exemplo, FITC, PE, Texas Red, citocromo c, etc. Técnicas para rotular polipeptideos e fragmentos dos mesmos, tais como aquelas providenciadas aqui, são bem conhecidas na arte. O termo "agente anticancerígeno" também inclui os agentes quimioterapêuticos descritos a seguir. O termo agente anticancerígeno também inclui tratamento com uma substância que reduz a hipoxia numa célula, quando tal agente é combinado com inibição de LOX. Tal substância pode incluir, por exemplo, p53. Ver, por exemplo, Matoba et al., "p53 Regulates Mitochondrial Respiration," Science 16 de junho de 2006 312: 1650-1653; publicado online em 24 de maio de 2006, e referências citadas nele. Uma substância que conduz células cancerígenas para a via respiratória e para longe da via glicolítica seria utilizada com vantagem com um inibidor de LOX na medida em que LOX não seria regulada para cima neste caso.
Quimioterapêuticos úteis como frações ativas que quando conjugados com antagonistas dos mesmos da presente invenção são entregues especificamente a células são tipicamente, entidades químicas pequenas produzidas por síntese química. Quimioterapêuticos incluem fármacos citotóxicos e citostáticos. Quimioterapêuticos podem incluir aqueles que têm outros efeitos nas células, tais como reversão do estado transformado para um estado diferenciado, ou aquelas que inibem a replicação celular. Exemplos de agentes citotóxicos conhecidos úteis na presente invenção são listados, por exemplo, em Goodman et al., "The Pharmacological Basis of Therapeutics," Sexta Edição, A. B . Gilman et al., eds./Macmillan Publishing Co. Nova Iorque, 1980. Estes incluem taxanos, tais como paclitaxel e docetaxel; nitrogénio tais como mecloretamina, melfalano, mostarda de uracilo e clorambucilo; derivados de etilenimina, tais como tiotepa; sulfonates de alquilo, tais como busulfano; nitrosoureias, tais como lomustina, semustina e estreptozocina; triazenos, tais como dacarbazina; análogos do ácido fólico, tais como metotrexato; análogos da pirimidina, tais como fluorouracilo, citarabina e azaribina; análogos da purina, tais como mercaptopurina e tioguanina; vinca alcaloides, tais como vinblastina e vincristina; antibióticos, tais como dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina e mitomicina; enzimas, tais como complexos de coordenação de platina, tais como cisplatina; ureia substituída, tais como hidroxiureia; derivados de metil hidrazina, tais como procarbazina; supressores adrenocorticais, tais como mitotano; hormonas e antagonistas, tais como adrenocortisteróides (prednisona), a (caproato de hidroxiprogesterona, acetato e acetate de megestrol), estrogénios (dietilstilbestrol e etinil estradiol) e androgénios (propionato de testosterona e fluoximesterona). Fármacos que interferem com a síntese proteica também podem ser utilizados; tais fármacos são conhecidos daqueles habilitados na arte e incluem puromicina, cicloheximida e ribonuclease. A maioria dos agentes quimioterapêuticos atualmente em utilização no tratamento de cancro possuem grupos funcionais que são passíveis de reticulação química diretamente com um grupo amina ou carboxilo de um agente da presente invenção. Por exemplo, grupos amino livres estão disponíveis em metotrexato, doxorrubicina, daunorrubicina, citosinarabinosida, bleomicina, fludarabina e cladribina enquanto que grupos do ácido carboxílico livres estão disponíveis em metotrexato, melfalano e clorambucilo.
Estes grupos funcionais, que são ácidos carboxílicos e amino livres, são alvos para uma variedade de agentes de reticulação química homobifuncionais e heterobifuncionais que podem reticular estes fármacos diretamente para um grupo amino livre de um antagonista.
Agentes quimioterapêuticos contemplados pela presente invenção também incluem outros fármacos quimioterapêuticos que estão comercialmente disponíveis. Apenas para ilustrar, o quimioterapêutico pode ser um inibidor da função da cromatina, um inibidor, um fármaco inibidor, um agente que danifica o ADN, um antimetabolito (tal como antagonistas de folato, análogos da pirimidina, análogos da purina e análogos modificados de açúcar), um inibidor da síntese de ADN, um agente interativo de ADN (tal como um agente intercalante), um inibidor da reparação do ADN.
Os agentes quimioterapêuticos podem ser categorizados pelo seu mecanismo de ação, por exemplo, nos seguintes grupos: anti-metabolitos/agentes anti-cancerígenos, tais como análogos da pirimidina floxuridina, capecitabina e citarabina) e análogos da purina, antagonistas de folato e inibidores antiproliferativos/ agentes antimitóticos relacionados incluindo produtos naturais, tais como vinca alcaloides (vinblastina, vincristina e microtúbulo, tais como taxano (paclitaxel, docetaxel), vinblastina, nocodazol, epotilonas e navelbina, epidipodofilotoxinas (etoposido, teniposido), agentes que danificam o ADN (actinomicina, amsacrina, busulfano, carboplatina, clorambucilo, cisplatina, ciclofosfamida, citoxano, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, ifosfamida, melfalano, mercloretamina, mitomicina, mitoxantrona, nitrosoureia, procarbazina, taxol, taxotero, teniposido, trietilenotiofosforamida e etoposido; antibióticos, tais como dactinomicina (actinomicina D) , daunorrubicina, doxorrubicina (adriamicina) , idarrubicina, antraciclinas, mitoxantrona, bleomicinas, plicamicina (mitramicina) e mitomicina; enzimas (L-asparaginase que metaboliza sistematicamente L-asparagina e priva as células que não têm a capacidade de sintetizar a sua própria asparagina); agentes anti-plaquetas; agentes alquilantes antiproliferativos/antimitóticos, tais como mostardas de nitrogénio ciclofosfamida e análogos, melfalano, clorambucilo) e (hexametilmelamina e tiotepa), alquilo nitrosoureias (BCNU) e análogos, estreptozocina), trazenos-dacarbazinina (DTIC); antimetabolitos antiproliferativos/antimitóticos, tais como análogos do ácido fólico (metotrexato); complexos de coordenação de platina (cisplatina, oxiloplatinima, carboplatina) , procarbazina, hidroxiureia, mitotano, aminoglutetimida; hormonas, análogos de hormonas (estrogénio, tamoxifeno, goserelina, bicalutamida, nilutamida) e inibidores da aromatase (letrozol, anastrozol); anticoagulantes (heparina, sais de heparina sintéticos e outros inibidores de trombina); agentes fibrinoliticos (tais como ativador do plasminogénio de tecido, estreptoquinase e uroquinase), aspirina, dipiridamol, ticlopidina, clopidogrel; agentes antimigratórios; agentes antisecretores (breveldina); imunossupressores tacrolimus sirolimus azatioprina, micofenolato; compostos (TNP-470, genisteina) e inibidores do fator de crescimento (inibidores do fator de crescimento endotelial vascular, inibidores do fator de crescimento de fibroblasto); bloqueador do recetor de angiotensina, dadores de óxido nítrico; oligonucleotídeos anti-senso; anticorpos (trastuzumab, rituximab); inibidores do ciclo celular e indutores de diferenciação (tretinoina); inibidores, inibidores da topoisomerase (doxorrubicina (adriamicina), daunorrubicina, dactinomicina, eniposido, epirrubicina, etoposido, idarrubicina, irinotecano e mitoxantrona, topotecano, irinotecano), corticosteróides (cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilpednisolona, prednisona e prenisolona); inibidores da quinase de transdução do sinal do fator de crescimento; indutores de disfunção, toxinas tais como tozia da cólera, ricina, exotoxina de Pseudomonas, toxina adenilato ciclase da Bordetella pertussis ou toxina da difteria e ativadores da caspase; e cromatina. Dosagens preferidas dos agentes quimioterapêuticos são consistentes com as dosagens atualmente prescritas.
Adicionalmente, outros rótulos, tais como biotina seguida de estreptavidina-fosfatase alcalina (AP) , peroxidase de raiz-forte estão contempladas pela presente invenção.
Conforme utilizado aqui, os termos "tratamento do dano a ácido nucleico" e "agente que danifica ácido nucleico" referem-se a qualquer regime de tratamento que danifica diretamente ou indiretamente ácido nucleico (por exemplo, ADN, ADNc, ADN genómico, ARNm, ARNt ou ARNr). Exemplos de tais agentes incluem agentes alquilantes, nitrosoureias, anti-metabolitos, alcaloides vegetais, extratos vegetais e radioisótopos. Exemplos de agentes também incluem fármacos que danificam ácidos nucleicos, por exemplo, 5-fluorouracil (5-FU), capecitabina, S-l (Tegafur, 5-cloro-2,4-dihidroxipiridina e ácido oxónico), 5-etiniluracilo, arabinosil citosina (ara-C), 5-azacitidina (5-AC), 2',2'-difluoro-2’-deoxicitidina (dFdC), antimetabolitos da purina (mercaptopurina, azatiopurina, tioguanina), cloridrato de gemcitabina (Gemzar), pentostatina, alopurinol, 2-fluoro-arabinosil-adenina (2F-ara-A), hidroxiureia, mostarda de enxofre (biscloroetihilsulfido) , mecloretamina, melfalano, clorambucilo, ciclofosfamida, ifosfamida, tiotepa, AZQ, mitomicina C, dianhidrogalactitol, dibromoducitol, sulfonato de alquilo (busulfano), nitrosoureias (BCNU, CCNU, 4-metil CCNU ou ACNU), procarbazina, decarbazina, rebecamicina, antraciclinas, tais como doxorrubicina (adri-amicina; ADR), daunorrubicina (Cerubicina) , idarrubicina (Idamicina) e epirrubicina (Ellence), análogos de antraciclina, tais como mitoxantrona, actinomicina D, inibidores da topoisomerase não intercalantes, tais como epipodofilotoxinas (etoposido=VP16, teniposido=VM-26), podopfilotoxina, bleomicina (Bleo), pepleomicina, compostos que formam adutos com ácido nucleico incluindo derivados da platina (por exemplo, cisplatina (CDDP), transanálogo da cisplatina, carboplatina, iproplatina, tetraplatina e oxaliplatina), camptotecina, topotecano, irinotecano (CPT-11) e SN-38. Exemplos específicos de tratamentos que danificam ácidos nucleicos incluem radiação (por exemplo, microondas focados, radiação ultravioleta (UV), infravermelho (IR) ou alfa, beta ou gama) e choque ambiental (por exemplo, hipertermia) .
Conforme utilizado aqui, os termos "tratamento anti-proliferativo" e "agente anti-proliferativo" significa qualquer regime de tratamento que diretamente ou indiretamente inibe a proliferação de uma célula, vírus, bactéria ou outro organismo unicelular ou multicelular independentemente de se o tratamento ou agente danifica ou não o ácido nucleico. Exemplos particulares de agentes anti-proliferativos são fármacos anti-tumorais e anti-virais que inibem a proliferação celular ou proliferação ou replicação do vírus. Exemplos incluem, entre outros, ciclofosfamida, azatioprina, ciclosporina A, prednisolona, melfalano, clorambucilo, mecloretamina, busulfano, metotrexato, 6-mercaptopurina, tioguanina, citosina arabinosida, taxol, vinblastina, vincristina, doxorrubicina, actinomicina D, mitramicina, carmustina, lomustina, semustina, estreptozotocina, hidroxiureia, cisplatina, mitotano, procarbazina, dacarbazina e dibromomanitol. Agentes anti-proliferativos que causam erros de replicação de ácidos nucleicos ou inibem a replicação do ácido nucleico são aqueles como análogos de nucleosídeo e nucleotídeo (por exemplo, AZT ou 5-AZC).
Noutra modalidade, o anticorpo anti-LOX pode ser conjugado com um "recetor" (tal como estreptavidina) para utilização na pré-direção de tumor em que o conjugado anticorpo-recetor é administrado ao paciente, seguido da remoção de conjugado não ligado da circulação utilizando um agente de eliminação e depois administração de um "ligando" (por exemplo, avidina) que é conjugado com um agente citotóxico (por exemplo, um radionuclídeo).
Metodologia para rotular polipeptídeos e fragmentos dos mesmos incluindo, mas não limitados a, é aquela providenciada aqui bem conhecida na arte. Quando os anticorpos da presente invenção são rotulados com um radio-rótulo ou toxina, os anticorpos podem ser preparados como composições farmacêuticas que são úteis para tratamento terapêutico de pacientes onde as composições farmacêuticas são administradas ao paciente numa quantidade eficaz. Quando os anticorpos da presente invenção são rotulados com um rótulo que pode ser visualizado, os anticorpos podem ser preparados como composições farmacêuticas que são úteis para diagnóstico de pacientes onde as composições farmacêuticas são administradas ao paciente numa quantidade eficaz para tomografia in vivo ou onde as composições farmacêuticas são testadas num ensaio in vitro. V. Composições
Cada um dos anticorpos da presente invenção pode ser utilizado como uma composição quando combinado com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Tais composições farmacêuticas são úteis para administração a um sujeito in vivo ou ex vivo e para diagnosticar e/ou tratar um sujeito com os anticorpos revelados, por exemplo.
Veículos farmaceuticamente aceitáveis são fisiologicamente aceitáveis ao paciente administrado e retêm as propriedades terapêuticas dos anticorpos ou péptidos com os quais é administrado. Veículos farmaceuticamente aceitáveis e suas formulações são e, em geral, descritos em, por exemplo, Pharmaceutical Sciences de Remington (18a Edição, editor A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990) . Um veículo farmacêutico exemplar é solução salina fisiológica. A frase "veículo farmaceuticamente aceitável", conforme utilizada aqui, significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal como um preenchidor líquido ou sólido, diluente, excipiente, solvente ou material encapsulante, envolvido no transporte ou carregamento de anticorpos sujeitos ou péptidos do local de administração de um orgão, ou porção do corpo, para outro orgão, ou porção do corpo. Cada veículo tem de ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não prejudicial para o paciente. Nem o veículo farmaceuticamente aceitável deveria alterar a atividade específica dos antagonistas. Veículos e excipientes exemplares foram providenciado noutro local aqui.
Num aspeto, a presente invenção providencia composições farmaceuticamente aceitáveis ou fisiologicamente aceitáveis incluindo solventes (aquosos ou não aquosos), soluções, emulsões, meios de dispersão, revestimentos, agentes de retardamento ou promoção da absorção e isotónicos, compatíveis com administração farmacêutica. Composições farmacêuticas ou formulações farmacêuticas referem-se, portanto, a uma composição adequada para utilização farmacêutica num sujeito. As composições e formulações farmacêuticas incluem uma quantidade de um composto da invenção, por exemplo, uma quantidade eficaz de um antagonista da invenção e um veiculo farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável.
Composições farmacêuticas podem ser formuladas para serem compatíveis com uma via de administração particular, sistémica ou local. Assim, composições farmacêuticas incluem veículos, diluentes ou excipientes adequados para administração por várias vias.
Numa invenção adicional, as composições da presente invenção compreendem ainda um aditivo farmaceuticamente aceitável de modo a melhorar a estabilidade do antagonista na composição e/ou para controlar a taxa de libertação da composição. Aditivos farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção não alteram a atividade especifica do antagonista sujeito. Um aditivo farmaceuticamente aceitável preferível é um açúcar, tal como manitol, sorbitol, glicose, xilitol, trehalose, sorbose, sacarose, galactose, dextrano, dextrose, frutose, lactose e misturas dos mesmos. Aditivos farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser combinados com veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como dextrose. Em alternativa, aditivo farmaceuticamente aceitável preferível é um tensoativo, tal como polissorbato 20 ou polissorbato 80 para aumentar a estabilidade do péptido e diminuir a gelificação da solução farmacêutica. O tensoativo pode ser adicionado à composição numa quantidade de 0,01 % a 5% da solução. A adição de tais aditivos farmaceuticamente aceitáveis aumenta a estabilidade e meia-vida da composição no armazenamento. Métodos de formulação e entrega serão, em geral, adaptados de acordo com o local e a doença a ser tratada. Formulações exemplares incluem, mas não se limitam, aquelas adequadas para administração parentérica, por exemplo, administração intravenosa, intra-arterial, intramuscular ou subcutânea, incluindo formulações encapsuladas em micelas, lipossomas ou cápsulas libertadoras de fármaco (agentes ativos incorporados num revestimento biocompatível desenhado para libertação lenta); formulações ingeriveis; formulações para utilização tópica, tais como cremes, unguentos e géis; e outras formulações, tais como inaladores, aerossóis e vaporizadores. A dosagem dos compostos da invenção variarão de acordo com a extensão e severidade da necessidade para tratamento, da atividade da composição administrada, do estado geral de saúde do sujeito e de outras considerações bem conhecidas do artesão habilitado.
Formulações ou administração entérica (oral) podem sr contidas num comprimido (revestido ou não revestido), cápsula (dura ou mole), microsfera, emulsão, pó, grânulo, cristal, suspensão, xarope ou elixir. Veículos sólidos não tóxicos convencionais que incluem, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose, carbonato de magnésio, podem ser utilizados para preparar formulações sólidas. Compostos ativos suplementares (por exemplo, agentes conservantes, antibacterianos, antivirais e antifúngicos) também podem ser incorporados nas formulações. Uma formulação liquida também pode ser utilizada para administração entérica. 0 veículo pode ser selecionado de vários óleos incluindo petróleo, animal, vegetal ou sintético, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo. Excipientes farmacêuticos adequados incluem, por exemplo, amido, celulose, talco, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de magnésio, estearato de sódio, monostearato de glicerol, cloreto de sódio, leite magro seco, glicerol, propilenoglicol, água, etanol.
Composições farmacêuticas para entrega entérica, parentérica ou transmucosal incluem, por exemplo, água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, solução de Hank, solução de Ringer, dextrose/solução salina e soluções de glicose. As formulações podem conter substâncias auxiliares para aproximar condições fisiológicas, tais como agentes tamponantes, agentes de ajuste de tonicidade, agentes humidificantes, detergentes e afins. Aditivos também podem incluir ingredientes ativos adicionais, tais como agentes bactericidas ou estabilizadores. Por exemplo, a solução pode conter acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, monolaurato de sorbitano ou oleato de trietanolamina. Formulações e métodos parentéricos adicionais são descritos em Bai (1997) J. Neuroimmunol. 80:65 75; Warren (1997) J. Neurol. Sei. 152:31 38; e Tonegawa (1997) J. Exp. Med. 186:507 515. A preparação parentérica pode ser encerrada em âmpolas, seringas descartáveis ou frascos de vidro ou plástico de doses múltiplas.
Composições farmacêuticas para administração intradérmica ou subcutânea podem incluir um diluente estéril, tal como água, solução salina, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como álcool benzilico ou metil parabenos; antioxidants, tais como ácido ascórbico, glutationa ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como ácido etilenodiaminatetraacético; tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste de tonicidade, como cloreto de sódio ou dextrose.
Composições farmacêuticas para injeção incluem soluções ou dispersões aquosas (onde solúvel em água) e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou dispersão. Para administração intravenosa, veículos adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e afins) e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pela utilização de tensoativos. Agentes antibacterianos e antifúngicos incluem, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico e timerosal. Agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis, tais como manitol, sorbitol e cloreto de sódio podem ser incluídos na composição. As soluções resultants podem ser embaladas para utilização como tal ou liofilizadas; a preparação liofilizada pode ser combinada posteriormente com uma solução estéril antes da administração.
Veículos farmaceuticamente aceitáveis podem conter um composto que estabiliza, aumenta ou retarda a absorção ou eliminação. Tais compostos incluem, por exemplo, carbohidratos, tais como glicose, sacarose ou dextranos; proteínas de baixo peso molecular; composições que reduzem a eliminação ou hidrólise de péptidos; ou excipientes ou outros estabilizadores e/ou tampões. Agentes que retardam a absorção incluem, por exemplo, monostearato de alumínio e gelatina. Também podem ser utilizados detergentes para estabilizar ou para aumentar ou diminuir a absorção da composição farmacêutica, incluindo veículos lipossómicos. Para proteger da digestão o composto pode ser complexado com uma composição para o tornar resistente à hidrólise enzimática e acídica ou o composto pode ser complexado num veículo apropriadamente resistente, tal como um lipossoma. Meios de proteger compostos da digestão são conhecidos na arte (ver, por exemplo, Fix (1996) Pharm Res. 13:1760 1764; Samanen (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:119 135; e Patente U.S. N.° 5 391 377 que descrevem composições lipídicas para entrega oral de agentes terapêuticos).
Para administração transmucosal ou transdérmica, são utilizados na formulação penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada. Tais penetrantes são, em geral, conhecidos na arte, e incluem, por exemplo, para administração transmucosal, detergentes, sais biliares e derivados de ácido fusídico. A administração transmucosal pode ser através de vaporizadores nasais ou supositórios (ver, por exemplo, Sayani (1996) "Systemic delivery of peptides and proteins across absorptive mucosae" Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 13:85 184) . Para administração transdérmica, o composto ativo pode ser formulado em unguentos, salvas, géis ou cremes como, em geral, conhecidos na arte. Sistemas de entrega transdérmica também podem ser conseguidos utilizando emplastros.
Para entrega de inalação, a formulação farmacêutica pode ser administrada na forma de um aerossol ou borrifo. Para administração de aerossol, a formulação pode ser fornecida numa forma finamente dividida juntamente com um tensoativo e propulsor. Noutra modalidade, o dispositivo para entregar a formulação ao tecido respiratório é no qual a formulação vaporiza. Outros sistemas de entrega conhecidos na arte incluem aerossóis de pó seco, sistemas de entrega líquidos, inaladores, nebulizadores de ar a jato e sistemas propulsores (ver, por exemplo, Patton (1998) Biotechniques 16:141 143; Dura Pharmaceuticals, San Diego, Calif.; Aradigm, Hayward, Calif.; Aerogen, Santa Clara, Calif.; e Inhale Therapeutic Systems, San Carlos, Calif.).
Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser utilizados, tais como etileno vinilo acetato, polianidretos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Métodos de preparação de tais formulações são conhecidos daqueles habilitados na arte. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente de Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Suspensões lipossómicas (incluindo lipossomas dirigidos a células ou tecidos utilizando anticorpos ou proteínas de revestimento virai) também podem ser utilizadas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estas podem ser preparadas de acordo com os métodos conhecidos na arte, por exemplo, conforme descrito nas Patentes U.S. N.°s 4 235 871; 4 501 728; 4 522 811; 4 837 028; 6 110 490; 6 096 716; 5 283 185; 5 279 833; Akimaru (1995) Cytokines Mol. Ther. 1:197 210; Alving (1995) Immunol. Rev. 145: 5 31; e Szoka (1980) Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467). Microsferas ou cápsulas biodegradáveis ou outras configurações biodegradáveis de polímero capazes de entrega prolongada de pequenas moléculas, incluindo péptidos, são conhecidas na arte (ver, por exemplo, Putney (1998) Nat. Biotechnol. 16:153 157) . Compostos da invenção podem ser incorporados em micelas (ver, por exemplo, Suntres (1994) J. Pharm. Pharmacol. 46 :23 28; Woodle (1992) Pharm. Res. 9:260 265) . Antagonistas podem ser anexados à superfície da monocamada ou bicamada lipídica. Por exemplo, os antagonistas podem ser anexados a lipossomas contendo hidrazida-PEG-(distearoil-fosfatidi-1) etanolamina (ver, por exemplo, Zalipsky (1995) Bioconjug. Chem. 6: 705 708) . Em alternativa, pode ser utilizada qualquer forma de membrana lipídica, tal como uma membrana lipídica planar ou a membrana celular de uma célula intacta, por exemplo, uma célula vermelha sanguínea. As formulações que contêm lipossomas e lípidos podem ser entregues por qualquer meio, incluindo, por exemplo, administração intravenosa, transdérmica (ver, por exemplo, Vutla (1996) J. Pharm. Sei. 85:5 8), transmucosal ou oral.
As composições da presente invenção podem ser combinadas com outras frações terapêuticas ou frações de tomografia/diagnósticas, conforme providenciadas aqui. As frações terapêuticas e/ou frações de tomografia podem ser providenciadas como composições separadas ou como uma fração conjugada. Podem ser incluídos ligantes para frações conjugadas conforme necessário e foram descritas noutro local aqui.
Os anticorpos revelados aqui também podem ser formulados como imunolipossomas. Lipossomas contendo o anticorpo são preparados pelos métodos conhecidos na arte, tais como descritos em Epstein et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA, 77: 4030 (1980); e Patentes U.S. N.°s 4 485 045 e 4 544 545. Lipossomas com tempo de circulação potenciado são revelados na Patente U.S. N.° 5 013 556.
Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase reversa com uma composição lipídica que compreende fosfatidileolina, cholesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE) . Lipossomas são expulsos através de filtros de tamanho de poro definido para produzir lipossomas com o diâmetro desejado. Fragmentos Fab' do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados com os lipossomas, conforme descrito em Martin et al. , J. Biol. Chem., 257: 286 288 (1982) através de uma reação de intercâmbio dissulfido. Um agente quimioterapêutico (tal como Doxorrubicina) está opcionalmente contido no lipossoma. Ver Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989).
Também podem ser utilizados lipofeções ou lipossomas para entregar o anticorpo anti-LOX ou um fragmento de anticorpo nas células. Onde são utilizados fragmentos de anticorpo, pode ser utilizado o fragmento inibitório mais pequeno que se liga especificamente ao domínio de ligação da proteína alvo. Por exemplo, com base nas sequências da região variável de um anticorpo, podem ser desenhadas moléculas peptídicas que retêm a capacidade de ligar a sequência proteica alvo. Tais péptidos podem ser sintetizados quimicamnete e/ou produzidos por tecnologia de ADN recombinante. Ver, por exemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 7889 7893 (1993) . A formulação aqui também pode conter mais de um composto ativo conforme necessário para a indicação particular a ser tratada, incluindo, por exemplo, aqueles com atividades complementares que não afetam de forma adversa um ao outro. Em alternativa, ou adicionalmente, a composição pode compreender um agente que potência a sua função, tal como, por exemplo, um agente citotóxico, citocina, agente quimioterapêutico ou agente inibidor do crescimento. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o fim pretendido. Os ingredientes ativos também podem ser presos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respetivamente, em sistemas de entrega de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microsferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são reveladas em Pharmaceutical Sciences de Remington, supra.
Formulações para administração in vivo são estéreis. A esterilização pode ser conseguida rapidamente através de filtração por membranas de filtração estéreis.
Podem ser preparadas preparações de libertação prolongada. Exemplos adequados de preparações de libertação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libertação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) ou poli(vinilálcool)), polilactidos (Patente U.S. N.° 3 773 919), copolímeros de L-ácido glutâmico e γ-etil-L-glutamato, etileno vinil acetato não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradável, tais como os LUPRON DEPOT® (microsferas injetáveis compostas de copolimero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolido) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Ao passo que polímeros tais como etileno vinil acetato e ácido láctico-ácido glicólico permitem a libertação de moléculas durante mais de 100 dias, certos hidrogéis libertam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando os anticorpos encapsulados permanecem no corpo durante muito tempo, eles podem desnaturar ou agregar como um resultado da exposição à humidade a 37°C, resultando numa perda da atividade biológica e possíveis alterações na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planificadas para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação é descoberto ser formação de ligação S-S intermolecular através de intercâmbio tio-dissulfido, a estabilização pode ser conseguida modificando resíduos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluções acídicas, controlando o conteúdo em humidade, utilizando aditivos apropriados e desenvolvendo composições de matriz de polímero específicas. Várias outras composições farmacêuticas e técnicas para a sua preparação e utilização serão conhecidas daqueles habilitados na arte à luz da presente revelação. Para uma listagem detalhada de composições farmacológicas adequadas e técnicas administrativas associadas é possível referenciar os ensinamento detalhados aqui, que podem ser ainda suplementados por textos, tais como Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20a Edição (Lippincott, Williams & Wilkins 2003) .
Composições farmacêuticas contempladas pela presente invenção foram descritas anteriormente. Numa modalidade da presente invenção, as composições farmacêuticas são formuladas para serem livres de pirogénios de modo que são aceitáveis para administração a pacientes humanos. Testar composições farmacêuticas para pirogénios e preparar composições farmacêuticas livres de pirogénios são bem compreendidos de alguém com habilitação comum na arte.
Uma modalidade da presente invenção contempla a utilização de qualquer uma das composições farmacêuticas da presente invenção para fazer um medicamento para tratar um distúrbio da presente invenção. Medicamentos podem ser formulados com base nas caracteristicas físicas do paciente/sujeito em necessidade do tratamento e podem ser formulados em formulações únicas ou múltiplas com base no estádio do tecido cancerígeno. Medicamentos da presente invenção podem ser embalados num pacote farmacêutico adequado com rótulos apropriados para a distribuição a hospitais e clínicas em que o rótulo é para a indicação de tratar um distúrbio conforme descrito aqui num sujeito. Medicamentos podem ser embalados como unidades únicas ou múltiplas. Instruções para a dosagem e administração das composições farmacêuticas da presente invenção podem ser incluídas com os pacotes farmacêuticos e kits descritos a seguir. VI. Purificação da afinidade
Os anticorpos anti-L0XL2 descritos aqui são úteis para purificação da afinidade de L0XL2 a partir de cultura de células recombinantes, fontes naturais ou amostras de biópsia de tecido (tecido e/ou soro). Neste processo, anticorpos contra L0XL2 são imobilizados num suporte adequado, tal como resina Sephadex ou papel de filtro, utilizando métodos bem conhecidos na arte. 0 anticorpo imobilizado é depois contactado com uma amostra que contém a L0XL2 a ser purificada e, depois disso, o suporte é lavado com um solvente adequado que removerá substancialmente todo o material na amostra exceto a L0XL2, que é ligada ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado que libertará a L0XL2 do anticorpo. VII. Pacotes e Kits
Uma modalidade do presente pedido inclui um pacote ou kit farmacêutico útil para os métodos providenciados aqui. Uma modalidade de tais pacotes ou kits farmacêuticos inclui preparações (composições) dos antagonistas, conforme providenciados aqui.
Um aspeto da presente invenção relaciona-se com kits para realizarem a administração de um inibidor de L0XL2. Outro aspeto da presente invenção relaciona-se com kits para realizarem a administração combinada do inibidor de L0XL2 com um ou mais outros agentes terapêuticos. Numa modalidade, o kit compreende um inibidor de L0XL2 formulado num veiculo ou excipiente farmacêutico e pelo menos um agente terapêutico que não é dito inibidor de L0XL2, formulado conforme apropriado, numa ou mais preparações farmacêuticas separadas.
Pacotes e kits farmacêuticos podem adicionalmente incluir um excipiente, um veiculo, um agente tamponante, um conservante ou um agente estabilizante numa formulação farmacêutica. Cada componente do kit pode ser encerrado num recipiente individual e todos os vários recipientes podem estar dentro de um único pacote. Os kits da invenção podem ser desenhados para armazenamento à temperatura ambiente ou no frio.
Adicionalmente, as preparações pode conter estabilizadores para aumentar o prazo de validade dos kits e incluir, por exemplo, albumina do soro bovina (BSA) ou outros estabilizadores convencionais conhecidos. Onde as composições são liofilizadas, o kit pode ainda conter preparações de soluções para reconstituir as preparações. Soluções aceitáveis são bem conhecidas na arte e incluem, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato farmaceuticamente aceitável (PBS).
Adicionalmente, os pacotes ou kits farmacêuticos providenciados aqui podem ainda incluir qualquer uma das outras frações providenciadas aquim tais como, por exemplo, um agente quimioterapêutico conforme descrito noutro local com mais detalhe.
Os pacotes e kits farmacêuticos da presente invenção podem ainda incluir os componentes para um ensaio providenciado aqui, tal como, por exemplo, um ensaio ELISA. Em alternativa, preparações dos kits são utilizadas em imunoensaios, tais como imunohistoquímica para testar as secções de biópsia de tecido do paciente. Os pacotes e kits farmacêuticos da presente invenção podem ainda incluir os componentes para colheita de uma amostra.
Os pacotes e kits farmacêuticos da presente invenção podem ainda incluir um rótulo especificando, por exemplo, uma descrição do produto, modo de administração e indicação do tratamento. Pacotes farmacêuticos providenciados aqui podem incluir qualquer uma das composições conforme descritas aqui. 0 pacote farmacêutico pode ainda incluir um rótulo para prevenir, reduzir o risco de ou tratar qualquer uma das indicações de doença descritas aqui. 0 termo "material de embalamento" refere-se a uma estrutura física que alberga os componentes do kit. 0 material de embalamento pode manter os componentes esterilmente e pode ser feito de material vulgarmente utilizado para tais fins (por exemplo, papel, fibra corrugada, vidro, plástico, lâmina, âmpolas, etc.). 0 rótulo ou inserção de embalamento pode incluir instruções escritas apropriadas. Kits da invenção podem, portanto, incluir adicionalmente rótulos ou instruções para utilizar os componentes do kit em qualquer método da invenção. Um kit pode incluir um composto da invenção num pacote, ou dispensar juntamente com instruções para administrar o composto num método da invenção.
Instruções podem incluir instruções para praticar qualquer um dos métodos da invenção descritos aqui incluindo métodos de tratamento, deteção, monitorização ou diagnósticos. Instruções podem adicionalmente incluir indicações de um ponto final clínico satisfatório ou quaisquer sintomas adversos que podem ocorrer ou informação adicional requerida pelas agências reguladoras, tais como a Administração de Fármacos e Alimentos para utilização num sujeito humano.
As instruções podem ser numa "maneira impressa," por exemplo, em papel ou cartão dentro ou afixado ao kit ou num rótulo afixado ao kit ou material de embalamento ou anexado a um frasco de vidro ou tubo que contém um componente do kit. Instruções podem adicionalmente ser incluídas num meio lido por computador, tal como um disco (disquete ou disco duro) , CD ótico tal como CD- or DVD-ROM/RAM, fita magnética, meios de armazenamento elétrico tais como RAM e ROM, 1C tip e híbridos destes tais como meios de armazenamento magnéticos/óticos.
As composições do kit da presente invenção podem ser formuladas em unidades únicas ou múltiplas para um único teste ou para testes múltiplos.
Em modalidades preferidas, as preparações do kit estão livres de pirogénios. Métodos para testar a presença de, e/ou níveis específicos de, pirogénios são rotineiros na arte e estão comercialmente disponíveis kits para tal fim. É providenciado aqui um kit para tratar uma condição patológica associada com L0XL2, contendo uma composição de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descritos aqui e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A condição patológica associada com L0XL2 pode ser, por exemplo, um tumor, uma metástase, angiogénese ou fibrose. Numa modalidade, anticorpos em tais kits podem compreender um rótulo detetável, um rótulo terapêutico ou ambos. Noutra modalidade, anticorpos em tais kits podem ser liofilizados.
Outro aspeto da presente invenção refere-se a kits para realizarem a administração combinada do inibidor de L0XL2 com outros compostos terapêuticos. Numa modalidade, o kit compreende um inibidor de LOXL2 formulado num veiculo farmacêutico, e pelo menos um agente citotóxico, formulado conforme apropriado, numa ou mais preparações farmacêuticas separadas. VIII. Métodos diagnósticos A presente invenção também providencia métodos para diagnosticar, monitorizar, encenar ou detetar as doenças descritas anteriormente utilizando agentes que reconhecem diferentes formas de L0XL2. Por exemplo, conforme descrito anteriormente, anticorpos contra formas diferentes de L0XL2, a forma de pré-pró-proteína, segregada, madura ou ativa podem ser utilizados para estes fins. Métodos de diagnosticar, monitorizar, encenar ou detetar as doenças descritas anteriormente utilizando agentes que reconhecem diferentes formas de L0XL2 pretende-se que abranjam todas as doenças e indicações descritas aqui.
Conforme descrito anteriormente, a L0XL2 ativa é dividida e pode ser detetada em virtude da sua alteração no peso molecular (imunoblot) ou por utilização de anticorpos que detetam a forma não dividida vs. dividida da L0XL2 juntamente com a localização celular utilizando vários métodos de deteção, tais como imunohistoquímica (IHC).
Pensa-se que a matriz extracelular e meio condicionado deveriam conter L0XL2 ativa proteoliticamente processada, ao passo que L0XI2 inativa, não dividida deveria ser localizada intracelularmente. Alguma L0XI2 ativa, dividida pode também ser detetada dentro da célula como uma consequência da captação do espaço extracelular.
Amostras de indivíduos podem ser colhidas e analisadas determinando os níveis de LOX ativa ou inativa. Esta análise pode ser realizada antes da iniciação do tratamento utilizando terapêutica específica de lisil oxidase para identificar tumores com expressão ou atividade de L0XL2 ativa elevadas. Tal análise diagnóstica pode ser realizada utilizando qualquer amostra, incluindo, mas não limitada a, células, proteínas ou extratos de membranas celulares, fluidos biológicos tais como cuspe, sangue, soro, plasma ou urina, ou amostras biológicas, tais como amostras de tecido, fixas em formalina ou secções de tecido congeladas.
Qualquer método adequado para deteção e análise de L0XL2 inativa e/ou ativa pode ser empregue. Conforme utilizado aqui, o termo "amostra" refere-se a uma amostra de um humano, animal ou a uma amostra de investigação, por exemplo, uma célula, tecido, orgão, fluido, gás, aerossol, pasta fluida, colóide ou material coagulado. As amostras também incluem, mas não se limitam a, proteína ou extratos de membranas celulares, fluidos biológicos, tais como cuspe, sangue, soro, plasma ou urina ou amostras biológicas, tais como secções fixas em formalina ou de tecido congeladas empregando os anticorpos descritos aqui. 0 termo "amostra" também se pode referir a uma célula, tecido, orgão ou fluido que é colhido de fresco de um humano ou animal, ou a uma célula, tecido, orgão ou fluido que é processado ou armazenado. A amostra pode ser testada in vivo, por exemplo, sem remoção do humano ou animal ou pode ser testada in vitro. A amostra pode ser testada após processamento, por exemplo, por métodos histológicos.
Podem ser utilizadas várias técnicas de ensaio diagnóstico conhecidas na arte, tais como ensaios de ligação competitiva, ensaios sandwich diretos ou indiretos e ensaios de imunoprecipitação conduzidos em fases heterogéneas ou homogéneas (Zola, Monoclonal antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) páginas 147-158) . Os anticorpos utilizados nos ensaios diagnósticos podem ser rotulados com uma fração detetável. A fração detetável produz direta ou indiretamente um sinal detetável. Por exemplo, a fração detetável pode ser qualquer uma das descritas aqui tais como, por exemplo, um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 355 ou 125I, um composto fluorescente ou quimioluminescentes, tal como isotiocianato de fluoresceina (FITC), vermelho de Texas, cianina, fotociano, rodamina ou luciferina, ou uma enzima, tal como fosfatase alcalina, β-galactosidase ou peroxidase de raíz-forte. Qualquer método conhecido na arte para conjugar o anticorpo com a fração detetável pode ser empregue, incluindo aqueles métodos descritos por Hunter et al. , Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); e Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982) . É providenciado aqui um método de diagnosticar uma condição patológica associada com LOX ou LOXL2 que compreende avaliar um nível de LOXL2 numa amostra de um sujeito, em que uma Iteração no nível de L0XL2 na amostra em comparação com uma amostra referência indica a presença ou aumento de um tumor ou metástase. Num aspeto, a condição patológica associada com LOXL2 é um tumor, uma metástase, angiogénese ou fibrose. Um aumento nos níveis de LOXL2 na amostra em comparação com uma amostra referência pode indicar a presença de um tumor ou metástase ou um aumento no crescimento do tumor ou metastático. A amostra referência pode ser uma amostra colhida do sujeito a um ponto temporal inicial ou uma amostra de outro indivíduo. O nível dos níveis de LOXL2 na amostra pode ser detetada contactando a amostra com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito aqui. Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é detetavelmente rotulado.
Numa modalidade, é providenciado um método para diagnosticar metástase cancerígena num sujeito, compreendendo: avaliar os níveis de LOXL2 ativa ou atividade no sangue, pelos quais uma alteração nos níveis de L0XL2 ativa ou atividade (por exemplo, na expressão génica, atividade enzimática, etc.) no sangue em comparação com uma amostra referência, indica a presença de crescimento tumoral metastático. Algumas ocasiões, os níveis de LOXL2 ativa ou atividades no sangue podem ser inferiores aos quando medidos inicialmente, o que pode indicar que o sujeito corre um risco maior de metástase cancerígena; que o cancro metastasizou; ou que a metástase cancerígena aumentou. A amostra referência pode ser derivada do mesmo sujeito, colhida do mesmo tumor num ponto temporal diferente ou de outro local do corpo ou de outro indivíduo.
Noutra modalidade, é providenciado um método para diagnosticar metástase cancerígena num sujeito com um tumor, compreendendo: avaliar os níveis de L0XL2 ativo ou atividade no tumor, pelos quais uma alteração nos níveis de L0XL2 ativo ou atividade no tumor em comparação com uma amostra referência indica a presença de crescimento tumoral metastático. Nalgumas ocasiões, os níveis de L0XL2 ativo ou atividades no tumor podem ser superiores aos quando medidos inicialmente, o que pode indicar que o sujeito corre um risco maior de metástase cancerígena; que o cancro metastasizou; ou que a metástase cancerígena aumentou. A amostra referência pode ser derivada do mesmo sujeito, colhida do mesmo tumor num ponto temporal diferente ou de outro local do corpo ou de outro indivíduo.
Também é providenciado aqui um método para encenar o crescimento tumoral ou metástase num sujeito, compreendendo avaliar os níveis de L0XL2 (por exemplo, hL0XL2) num tumor do sujeito, pelos quais uma alteração no nível de L0XL2 (por exemplo, na expressão génica ou atividade enzimática) no tumor em comparação com uma amostra referência, indica a presença de crescimento tumoral metastático. Nalgumas ocasiões, os níveis de L0XL2 ou atividades no tumor podem ser superiores aos quando medidos inicialmente para o mesmo sujeito ou superiores aos numa amostra referência colhida de um tecido normal, o que pode indicar que o paciente corre um risco maior de metástase do tumor; que o tumor metastasizou; que a metástase do tumor aumentou. A encenação de cancros de tumores sólidos é bem conhecida. 0 sistema TNM é um dos sistemas de encenação mais vulgarmente utilizados. Este sistema foi aceite pela União Internacional Contra Cancro (UICC) e pelo Comité
Conjunto Americano sobre Cancro (AJCC). A maioria das instalações médicas utilizam o sistema TNM como o seu método principal de reportagem de cancro. PDQ®, a base de dados de cancro exaustiva do NCI, também utiliza o sistema TNM. 0 sistema TNM, referido aqui como "encenação," é baseado na extensão do tumor, na extensão da propagação para os nódulos linfáticos e na presença de metástase.
Também é providenciado aqui um método para monitorizar uma resposta de um sujeito a uma terapêutica, incluindo um modulador de L0XL2, tal como o tratamento de cancro, tumores e doenças fibróticas. 0 método compreende: detetar uma alteração no nível de proteína reativa C no sujeito após administração de um modulador de L0XL2 ao sujeito, em que a alteração indica que o modulador de LOX ou LOXL2 tem um efeito terapêutico no sujeito. Uma proteína reativa C é um marcador farmacodinâmico importante para a inflamação sistémica. Pensa-se que um nível reduzido de proteína reativa C (por exemplo, na amostra de sangue do sujeito) conforme comparado com o anterior à administração do inibidor de L0XL2 é indicativo da resposta do sujeito à terapêutica utilizando um inibidor de L0XL2. A medição dos níveis de L0XL2 ativa pode tomar a forma de um ensaio imunológico, que deteta a presença de uma proteína L0XL2 ativa com um anticorpo para a proteína, preferencialmente um anticorpo que se liga especificamente à L0XL2 ativa. Fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos anti-L0XL2 também podem ser utilizados.
Também podem ser utilizados imunoensaios juntamente com fluorescência induzida por laser (ver, por exemplo, Schmalzing e Nashabeh, Electrophoresis 18:2184-93 (1997); e Bao, J. Chromatogr. B. Biomed. Sei. 699:463-80 (1997). Imunoensaios lipossómicos, tais como imunoensaios lipossómicos de jeção por fluxo e imunossensores lipossómicos também podem ser utilizados para determinar os níveis de LOX ou LOXL ativa, de acordo com um método da invenção (Rongen et al., J. Immunol. Methods 204:105-133 (1997) . Os imunoensaios, tais como ensaios imunossorbentes ligados a enzima (ELISAs), podem ser particularmente úteis num método da invenção. Um radioimunoensaio também pode ser útil para determinar se uma amostra é positiva para LOXL2 ativa ou para determinar o nível de LOXL2 ativa. Um radioimunoensaio gue utiliza, por exemplo, um anticorpo secundário rotulado com iodina-125 pode ser utilizado.
Além disso, é possível medir a atividade de LOXL2 ativa, ignorando, assim, a guantidade de enzima inativa. A atividade enzimática da LOXL2 ativa pode ser medida num número de maneiras, utilizando uma elastina solúvel ou colagénio solúvel com lisina rotulada como um substrato. Detalhes de um ensaio de atividade são dados em Royce et al., "Copper metabolism in mottled mouse mutants. The effect of copper therapy on lysyl oxidase activity in brindled (Mobr) mice," Biochem J. 15 de fevereiro del982; 202(2): 369-371. Um ensaio exemplar é um ensaio cromogénico, tal como aguele descrito por Palamakumbura, et al. "A fluorometric assay for detection of lysyl oxidase enzyme activity in biological samples," Anal Biochem. 15 de janeiro de 2002; 300(2):245-51.
Além de medir o nível de LOXL2 no sangue (ou urina), é possível medir produtos secundários da atividade de LOXL2. Por exemplo, deoxipiridinolina (Dpd) é formada pela ação enzimática da lisil oxidase em resíduos de lisina. Dpd é libertada para a circulação como um resultado da degradação osteoclástica do osso. Não pode ser reutilizada, é eliminada pelo rim e é excretada inalterada na urina. Assim, pode ser utilizado um teste baseado no ensaio Gama BCT Dpd dos Sistemas Imunodiagnósticos (IDS), utilizando um tubo revestido RIA utilizando um anticorpo monoclonal anti-Dpd para medir a atividade enzimática.
Os anticorpos anti-LOXL2 descritos agui também podem ser utilizados no diagnóstico de doenças ou condições patológicas associadas com metabolismo aberrante de colagénio, tal como várias condições patológicas fibróticas, por exemplo, fibrose pulmonar, bem como na retinopatia vítrea proliferativa, cicatrização cirúrgica, esclerose sistémica, escleroderma, contração de feridas, cicatrizes hipertróficas, fibromatose (especialmente doença de Dupuytren) e quelóides. IX. Métodos terapêuticos
As formulações farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas para tratar uma ampla variedade de doenças e distúrbios, tais como, por exemplo, cancro, metástase, fibrose e angiogénese aberrante. É providenciado aqui um método de inibir a L0XL2 contactando uma amostra ou um tecido celular com qualquer um dos anticorpos anti-L0XL2 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos aqui. A ligação de dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a L0XL2 inibe a atividade enzimática de L0XL2.
Em qualquer um de tais métodos, o contacto pode ocorrer in vitro, in vivo ou ex vivo. A inibição de L0XL2 pode ter um ou mais efeitos num sujeito tais como, por exemplo, redução no crescimento tumoral, redução na angiogénese, redução numa doença fibrótica e/ou diminuição da formação de matriz extracelular. Doenças fibróticas incluem, mas não se limitam a, fibrose hepática, fibrose pulmonar, fibrose renal, fibrose cardíaca e escleroderma. São providenciados aqui anticorpos L0XL2 para utilização em métodos para tratar doenças e distúrbios associados com a expressão aberrante de ou L0XL2. Doenças e distúrbios incluem, mas não se limitam a, tumores (por exemplo, primário ou metastático), condições patológicas relacionadas com angiogénese e condições patológicas fibróticas.
Conforme utilizado aqui, "prevenção" refere-se à profilaxia, prevenção do despoletar de sintomas, prevenção da progressão de uma doença ou distúrbio associado com fibrose ou correlacionado com a atividade de L0XL2. Conforme utilizado aqui, "tratar" ou "tratamento" significa estase ou um adiar do desenvolvimento dos sintomas associados com uma doença ou distúrbio descritos aqui. Os termos incluem ainda melhorar sintomas descontrolados ou indesejados existentes, prevenindo sintomas adicionais e melhorando ou prevenindo as causas metabólicas subjacentes dos sintomas. Assim, os termos indicam que um resultado benéfico foi conferido num sujeito mamífero com uma doença ou sintomas ou com o potencial de desenvolver tal doenças ou sintoma. É conseguida uma resposta quando o paciente experimenta alívio parcial ou total ou redução dos sinais ou sintomas de doença e inclui especificamente, sem limitação, prolongamento da sobrevivência. Os tempos de sobrevivência livres de progressão esperados podem ser medidos em meses a anos, dependendo dos fatores prognósticos incluindo o número de reincidências, estádio da doença e outros fatores. 0 prolongamento da sobrevivência inclui, sem limitação, tempos de pelo menos 1 mês (mo), cerca de pelo menos 2 meses (meses), cerca de pelo menos 3 meses, cerca de pelo menos 4 meses, cerca de pelo menos 6 meses, cerca de pelo menos 1 ano, cerca de pelo menos 2 anos, cerca de pelo menos 3 anos ou mais. A sobrevivência global também pode ser medida em meses a anos. Os sintomas do paciente podem permanecer estáticos ou podem diminuir.
As composições farmacêuticas da presente invenção são administradas em quantidades terapeuticamente eficazes que são eficazes para produzir algum efeito terapêutico desejado a uma razão benefício/risco razoável aplicável a qualquer tratamento médico. Para a administração das presentes composições farmacêuticas a pacientes humanos, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas pela metodologia conhecida de alguém com habilitação comum na arte para serem substancialmente livres de pirogénios, de tal modo que não induzem uma resposta inflamatória.
Conforme utilizado aqui, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico que quando administrado sozinho ou em combinação com outro agente terapêutico a uma célula, tecido ou sujeito é eficaz na prevenção ou melhoria da condição de doença ou na progressão da doença. Uma dose terapeuticamente eficaz refere-se ainda àquela quantidade do composto suficiente para resultar na melhoria dos sintomas, por exemplo, tratamento, cura, prevenção ou melhoria da condição médica relevante ou em aumento na taxa de tratamento, cura, prevenção ou melhoria de tais condições patológicas. Quando aplicada a um ingrediente ativo individual administrado sozinho, uma dose terapeuticamente eficaz refere-se àquele ingrediente apenas. Quando aplicada a uma combinação, uma dose terapeuticamente eficaz refere-se a quantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, seja administrada em combinação, em série ou simultâneamente. Por exemplo, quando é empregue a administração in vivo de um anticorpo anti-L0XL2, as quantidades de dosagem normais podem variar de cerca de 10 ng/kg a 100 mg/kg do peso corporal do mamífero ou mais por dia, preferencialmente cerca de 1 yg/kg/dia a 50 mg/kg/dia, opcionalmente cerca de 100 yg/kg/dia a 20 mg/kg/dia, 500 yg/kg/dia a 10 mg/kg/dia ou 1 mg/kg/dia a 10 mg/kg/dia, dependendo da via de administração.
Uma resposta eficaz da presente invenção é conseguida quando o paciente experimenta alívio parcial ou total ou redução dos sinais ou sintomas da doença e inclui especificamente, sem limitação, prolongamento da sobrevivência. Os tempos de sobrevivência livres de progressão esperados podem ser medidos em meses a anos, dependendo dos fatores prognósticos incluindo o número de reincidências, estádio da doença e outros fatores. 0 prolongamento da sobrevivência inclui, sem limitação, tempos de pelo menos 1 mês (mo) , cerca de pelo menos 2 meses, cerca de pelo menos 3 meses, cerca de pelo menos 4 meses, cerca de pelo menos 6 meses, cerca de pelo menos 1 ano, cerca de pelo menos 2 anos, cerca de pelo menos 3 anos ou mais. A sobrevivência global também pode ser medida em meses a anos. Os sintomas do paciente podem permanecer estáticos e a carga do tumor pode não aumentar.
Um médico ou veterinário com habilitação comum na arte pode rapidamente determinar e prescrever a quantidade eficaz (ED50) da composição farmacêutica necessária. Por exemplo, o médico ou veterinário pode começar por doses dos compostos da invenção empregues na composição farmacêutica a níveis inferiores às necessárias para conseguir atingir o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até o efeito desejado ser atingido.
Conforme utilizado aqui, o termo "sujeito" significa sujeitos mamíferos. Sujeitos exemplares incluem, mas não se limitam a, humanos, macacos, cães, gatos, ratinhos, ratazanas, vacas, cavalos, cabras e ovelhas. Nalgumas modalidades, o sujeito tem cancro e pode ser tratado com o agente da presente invenção conforme descrito a seguir.
Independentemente da via de administração selecionada, os compostos da presente invenção, que são utilizados numa forma adequadamente hidratada e/ou as composições farmacêuticas da presente invenção são formuladas em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis, tais como descritas a seguir ou por outros métodos convencionais conhecidos daqueles habilitados na arte.
Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas desta invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para atingir a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração particular, sem ser tóxico para o paciente. 0 nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do composto particular da presente invenção empregue, a via de administração, de tempo de administração, da taxa de excreção do composto particular a ser empregue, da duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com a composição particular empregue, com a idade, sexo, peso, condição física, estado de saúde geral e historial médico do paciente a ser tratado e fatores afins bem conhecidos das artes médicas.
Num aspeto providenciado aqui, a administração dos anticorpos resulta numa melhoria da condição do sujeito. Noutro aspeto, a administração dos anticorpos previne a condição do sujeito de piorar e/ou prolonga a sobrevivência do paciente. 0 paciente pode ser um mamífero, tal como um humano ou um não humano. Tal paciente pode ser sintomático ou assintomático.
As composições podem ser administradas localmente, regionalmente ou sistemicamente por qualquer via adequada providenciada aqui.
Num aspeto, os sintomas do paciente são melhorados. A melhoria pode ser manifestada como, por exemplo, redução da dor, tamanho do tumor reduzido, eliminação de tumores, prevenção de aumentos no tamanho do tumor ou progressão ou de doença, prevenção da formação de metástase ou inibição de crescimento metastático, inibição de fibrose, inibição de angiogénese ou uma combinação dos mesmos.
Se necessário, para tratamentos cancerígenos, os métodos podem anda incluir remoção cirúrgica do cancro e/ou administração de um agente ou tratamento anti-cancerígeno. A administração de tal agente ou tratamento anti-cancerígeno pode ser coincidente com a administração das composições reveladas aqui. Agentes anti-cancerigenos foram providenciados noutro local aqui.
Num aspeto, a administração de qualquer um dos anticorpos providenciados aqui reduz ou elimina a necessidade do paciente se submeter a cirurgia ou tratamento com um ou mais agentes ou tratamentos anti-cancerígenos.
Indicações que podem ser tratadas utilizando as formulações farmacêuticas da presente invenção incluem aquelas envolvendo proliferação celular indesejável ou descontrolada. Tais indicações incluem tumores benignos, vários tipos de cancros, tais como tumores primários e metástase de tumor, restenose (por exemplo, coronária, carótida e lesões cerebrais), distúrbios hematológicos, estimulação anormal de células endoteliais (aterosclerose), estragos ao tecido corporal devido a cirurgia, cicatrização anormal, angiogénese anormal, doenças que produzem fibrose de tecido, degeneração macular, glaucoma; degeneração macular relacionada com a idade (AMD húmida e AMD seca), aterosclerose, artrite reumatóide, esclerose múltipla, fibrose hepática, fibrose renal, fibrose pulmonar, escleroderma, aterosclerose e doença de Alzheimer, distúrbios motores repetitivos, distúrbios de tecidos que não são altamente vascularizados e respostas proliferativas associadas com transplantes de orgãos. A fibrose hepática inclui, mas não se limita a, cirrose e condições patológicas associadas tais como hepatite virai crónica, doença hepática gorda não alcoólica (NAFLD), esteato-hepatite alcoólica (ASH), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), cirrose biliar primária (PBC), cirrose biliar e hepatite autoimune. A fibrose pulmonar inclui, mas não se limita a, fibrose pulmonar idiopática (IPF) ou alveolite fibrosante criptogénica, pneumonia intersticial fibrosante crónica, doença pulmonar intersticial (ILD), doença difusa do parênquima pulmonar (DPLD), enfisema e doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD) e asma crónica. A fibrose cardíaca inclui, mas não se limita a, insuficiência cardíaca congestiva, cardiomiopatia e pós-infarto agudo do miocárdio defeitos na função cardíaca. A fibrose renal inclui, mas não se limita a, nefropatia diabética, refluxo vesicoureteral, fibrose renal tubulointersticial; glomerulonefrite ou nefrite glomerular, incluindo glomerulosclerose segmentar focal e glomerulonefrite membranosa e nefrite glomerular mesangiocapilar.
Em geral, as células num tumor benigno retêm as suas características diferenciadas e não se dividem de uma maneira completamente descontrolada. Um tumor benigno está normalmente localizado e é não metastático. Tipos específicos de tumores benignos que podem ser tratados utilizando a presente invenção incluem hemangiomas, adenoma hepatocelular, hemangioma cavernoso, hiperplasia nodular focal, neuromas acústicos, neurofibroma, adenoma do duto biliar, cistanoma do duto biliar, fibroma, lipomas, leiomiomas, mesoteliomas, teratomas, mixomas, hiperplasia regenerativa nodular, tracomas, granulomas piogénicos, verrugas, fibróides uterinos, adenomas da tiróide, adenomas adrenocorticais e adenomas pituitários.
Num tumor maligno, as células tornam-se indiferenciadas, não respondem aos sinais de controlo de crescimento do corpo e multiplicam-se de uma maneira descontrolada. 0 tumor maligno é invasivo e capaz de espalhar para locais distantes (entrar em metástase). Os tumores malignos são, em geral, divididos em duas categorias: primários e secundários. Os tumores primários surgem diretamente do tecido no qual são encontrados. Um tumor secundário, ou metástase, é um tumor que é originado noutro lado no corpo, mas espalhou-se agora para um orgão distante. As vias comuns para metástase são o crescimento direto para estruturas adjacentes, espalhado para os sistemas vascular ou linfático e seguimento ao longo dos planos do tecido e espaços corporais (fluido peritoneal, fluido cerebrospinal, etc.)
Tipos específicos de cancros ou tumores malignos, sejam primários ou secundários, que podem ser tratados utilizando esta invenção incluem, mas não se limitam a, cancro do pulmão (incluindo adenocarcinoma pulmonar, carcinoma das células escamosas, carcinoma das células grandes, carcinoma bronquioloalveolar, carcinoma das células não pequenas, carcinoma das células pequenas, mesotelioma); cancro da mama (incluindo carcinoma dutal, carcinoma lobular, cancro da mama inflamatório, cancro da mama claro, carcinoma mucinoso); cancro colo-retal (cancro do cólon, cancro retal); cancro anal; cancro pancreático (incluindo adenocarcinoma pancreático, carcinoma de células dos ilhéus, tumores neuroendócrinos); cancro da próstata; carcinoma ovárico (carcinoma epitelial ovárico ou tumor da superfície epitelial-estroma incluindo tumor seroso, tumor endometrióide e cistadenocarcinoma mucinoso, tumor dos cordões sexuais-estroma); carcinoma hepático e do duto biliar (incluindo carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma, hemangioma); carcinoma esofágico (incluindo adenocarcinoma esofágico e carcinoma das células escamosas); linfoma de não Hodgkin; carcinoma da bexiga; carcinoma do útero (incluindo adenocarcinoma do endométrio, carcinoma seroso papilar uterino, carcinoma das células claras uterino, sarcomas uterinos e leiomiossarcomas, tumores mulerianos mistos); glioma, glioblastoma, medulablastoma e outros tumores cerebrais; cancros renais (incluindo carcinoma das células renais, cancro da mama claro, tumor de Wilm); cancro da cabeça e do pescoço (incluindo carcinomas das células escamosas); cancro do estômago (adenocarcinoma estomacal, tumor estromal gastrointestinal); mieloma múltiplo; cancro testicular; tumor das células germinativas; tumor neuroendócrino; cancro cervical; carcinóides do trato gastrointestinal, mama e outros orgãos; carcinoma de células em anel de sinete; tumores mesenquimatosos incluindo sarcomas, fibrossarcomas, hemangioma, angiomatose, haeman- giopericytoma, hiperplasia estromal pseudoangiomatosa, miofibroblastoma, fibromatose, tumor miofibroblástico inflamatório, lipoma, angiolipoma, tumor das células granulares, neurofibroma, schwanoma, angiossarcoma, lipossarcoma, rabdomiossarcom , osteossarcoma, leiomioma ou leiomissarcoma. 0 termo "metástase" significa a capacidade das células tumorais de invadirem os tecidos do hospedeiro e metastizarem para locais de orgãos distantes, com frequência, específicos. Como é sabido, esta é a característica saliente dos crescimentos tumorais letais. A formação de metástase ocorre através de uma série complexa de interações únicas entre células tumorais e tecidos e células do hospedeiro normais. No contexto da presente invenção, a atividade da lisil oxidase é crítica no crescimento metastático de tumores, isto é, no crescimento de metástases, particularmente em condições hipóxicas. Como os tumores hipóxicos também são os mais agressivos e resistentes à quimioterapêutica tradicional, agentes que modulam a expressão e/ou função da lisil oxidase providenciam uma terapêutica nova contra tumores metastáticos, particularmente tumores quimio-resistentes. "Metástase" é distinguida de invasão. Conforme descrito em "Understanding Cancer Series: Cancer," na página de internet: cancer . gov/cancertopics/understandingcancer/cancer; invasion refere-se à migração direta e penetração pelas células cancerígenas em tecidos vizinhos.
Distúrbios hematológicos incluem crescimento anormal de células sanguíneas que conduz a alterações displásticas nas células sanguíneas e a malignidades hematológicas, tais como várias leucemias. Exemplos de distúrbios hematológicos incluem, mas não se limitam a, leucemia mielóide aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielogenosa crónica, as síndromes mielodisplásticas e anemia das células falciformes.
Leucemia mielóide aguda (AML) é o tipo mais comum de leucemia aguda que ocorre em adultos. Vários distúrbios genéticos herdados e estados de imunodeficiência estão associados com um risco aumentado de AML. Estes incluem distúrbios com defeitos na estabilidade do ADN, conduzindo a quebra cromossómica aleatória, tais como síndrome de Bloom, anemia de Fanconi, síndrome de parentesco de Li-Fraumeni, ataxia-telangiectasia e agamaglobulinémia ligado ao X. A leucemia promielocítica aguda (APML) representa um subgrupo distinto de AML. Este subtipo caracteriza-se por blastos promielocíticos que contêm a translocação cromossómica 15;17. Esta translocação conduz à geração do transcrito de fusão compreendido do recetor ácido retinóico e de uma sequência PML. A leucemia linfoblástica aguda (ALL) é uma doença heterogénea com características clínicas distintas exibidas por vários subtipos. Anomalias citogenéticas recorrentes foram demonstradas em ALL. A anomalia citogenética mais comum é a translocação 9;22. 0 cromossoma Philadelphia resultante representa um fraco prognóstico do paciente. A leucemia mielogenosa crónica (CML) é um distúrbio mieloproliferativo clonal de uma célula estaminal pluripotente. CML caracteriza-se por uma anomalia cromossómica específica que envolve a translocação dos cromossomas 9 e 22, criando o cromossoma Philadelphia. Radiação ionizante está associada com o desenvolvimento de CML .
As síndromes mielodisplásticas (MDS) são distúrbios de células estaminais hematopoiéticas clonais heterogéneas agrupadas juntas, por causa da presença de alterações displásticas numa ou mais das linhagens hematopoiéticas incluindo alterações displásticas nas séries mielóide, eritróide e megacariocitica. Estas alterações resultam em citopenias numa ou mais das três linhagens. Pacientes que padecem de MDS tipicamente desenvolvem complicações relacionadas com anemia, neutropenia (infeções) ou trombocitopenia (sangramento). Em geral, de cerca de 10% a cerca de 70% dos pacientes com MDS desenvolvem leucemia aguda.
Verificou-se que a administração de inibidores de LOX2 reduz o tamanho dos tumores existentes, previne metastases e reduz o tamanho de (ou elimina mesmo) metástases existentes (ver, por exemplo, Moinar et ai. (2003) Biochim Biophys. Acta. 1647:220-224). É providenciado aqui um método de reduzir o crescimento tumoral num sujeito, administrando qualquer um dos anticorpos anti-LOX ou anti-LOXL2 ou fragmentos de ligação ao antigeno dos mesmos descritos aqui. Numa modalidade, um tumor é um tumor primário. Noutra modalidade, um tumor é um tumor metastático. A carga de tumor metastático de um sujeito pode ser estabilizada administrando anticorpos, conforme descrito aqui. O tumor no sujeito pode ser reduzido em pelo menos 10%, 25%, 50%, 70%, 90%, 95%, ou mais conforme comparado com o tumor no sujeito antes do tratamento.
Quando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo se liga especificamente a LOXL2, exemplos de tumores incluem, mas não se limitam a, um tumor do cólon, um tumor esofágico, um tumor mamário, um tumor da próstata, um carcinoma escamoso ou um carcinoma fusocelular.
Quando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo se liga especificamente a LOX, exemplos de tumores incluem, mas não se limitam a, um tumor mamário, um tumor pulmonar, um tumor renal, um tumor uterino, um tumor hepático ou um tumor da cabeça e do pescoço. E providenciado aqui um método para prevenir ou reduzir crescimento tumoral, crescimento tumoral metastático, num sujeito in vivo, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um inibidor da atividade de LOX ou L0XL2; opcionalmente, um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, prevenindo ou reduzindo, assim, crescimento tumoral, por exemplo, em pelo menos 25%, 50%, 75%, 90% ou 95%, no sujeito tratado. Uma descrição detalhada de composições adequadas para utilização nos presente métodos de tratamento é dada a seguir. Tais métodos são úteis, por exemplo, quando o tumor é hipóxico. Tumores hipóxicos podem ser rapidamente identificados utilizando métodos de rotina na arte. Ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 5 674 693.
Além disso, é providenciado aqui um método de tratar metástase num sujeito com cancro in vivo, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um inibidor de LOXL2, inibindo, assim, a metástase, por exemplo, em pelo menos 25%, 50%, 75%, 90% ou 95% no sujeito tratado. Numa modalidade, inibidores inibem especificamente LOXL2 humana. Anticorpos a serem utilizados nestes métodos foram descritos anteriormente. Pode ser desejável que o anticorpo minimize reações cruzadas com outros membros das famílias de LOXL2 e, assim, reduzam os efeitos secundários adversos potenciais devido a complicações e toxicidade de tecido normais.
Também é providenciado aqui um método de aumentar ou potenciar as probabilidades de sobrevivência de um sujeito com tumor metastático, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-L0XL2, aumentando ou potenciando, assim, as probabilidades de sobrevivência do sujeito tratado por certo período de tempo, por exemplo, em pelo menos 10 dias, 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 1,5 anos, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 8 anos, 10 anos ou mais. O aumento na sobrevivência de um sujeito pode ser definido, por exemplo, como o aumento na sobrevivência de um modelo animal pré-clínico de metástases cancerígenas (por exemplo, um ratinho com cancro metastático), por um certo período de tempo, por exemplo, em pelo menos 10 dias, 1 mês, 3 meses, 6 meses, ou 1 ano, ou pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 8 vezes ou 10 vezes, mais do que um modelo animal controlo (que tem o mesmo tipo de cancro metastático) sem o tratamento com o método inventivo. Em alternativa, o aumento na sobrevivência de um mamífero também pode ser definido, por exemplo, como o aumento na sobrevivência de um paciente com metástases cancerígenas por um certo período de tempo, por exemplo, em pelo menos 10 dias, 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 1,5 anos, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 8 anos, 10 anos ou mais do que um paciente com o mesmo tipo de cancro metastático, mas sem o tratamento com o método inventivo. O paciente controlo pode estar num placebo ou tratado com cuidados padrão de suporte, tais como terapêutica química, biológica e/ou radiação que não incluem o método inventivo como uma parte da terapêutica.
Também é providenciado aqui um método de estabilizar a carga do tumor metastático de um sujeito, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-LOX ou de um anticorpo anti-LOXL2, estabilizando, assim, a carga de tumor metastático de um sujeito durante um certo período de tempo, por exemplo, durante pelo menos 10 dias, 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 1,5 anos, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 8 anos, 10 anos ou mais. A estabilização da carga de tumor metastático de um sujeito pode ser definida como estabilização da carga de tumor metastático de um modelo animal pré-clínico com carga de tumor metastático (por exemplo, um ratinho com tumor metastático) durante um certo período de tempo, por exemplo, durante pelo menos 10 dias, 1 mês, 3 meses, 6 meses ou 1 ano mais do que um modelo animal controlo (que tem o mesmo tipo de tumor metastático) sem o tratamento com o método inventivo.
Os presentes métodos de tratamento também incluem um método para aumentar a eficácia dos agentes quimioterapêuticos, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-LOXL2; e opcionalmente, um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, aumentando, assim, a eficácia dos agentes quimioterapêuticos (que são descritos com mais detalhe acima). Também são contemplados métodos que envolvem a entrega de formulações inibidoras de LOX em combinação com terapêutica de radiação. Terapêutica de radiação pode ser utilizada para tratar quase todos os tipos de tumores sólidos, incluindo cancros do cérebro, mama, colo do útero, laringe, pulmão, pâncreas, próstata, pele, espinha, estômago, útero ou sarcomas de tecido mole. A radiação também pode ser utilizada para tratar leucemia e linfoma (cancros das células formadoras de sangue e sistema linfático, respetivamente) . A dose de radiação para cada local depende de um número de fatores, incluindo o tipo de cancro e se existem tecidos e orgãos próximos que podem ser danificados por radiação. A radiação será tipicamente entregue como raios X, onde a dosagem é dependente do tecido a ser tratado. Radiofarmacêuticos, também conhecidos como radionucleotideos, também podem ser utilizados para tratar cancro, incluindo cancro da tiróide, cancro que reincide na parede do peito e a dor causada pela disseminação do cancro para o osso (metastases ósseas). Radionuclídeos foram descritos com mais detalhe a seguir. 0 sujeito a ser tratado ou diagnosticado pelos presentes métodos inclui um sujeito com ou correndo o risco de ter crescimento tumoral metastático. Tais tumores podem estar um Num aspeto, um tumor é, por exemplo, cancro do pulmão (incluindo adenocarcinoma pulmonar, carcinoma das células escamosas, carcinoma das células grandes, carcinoma bronquioloalveolar, carcinoma das células não pequenas, carcinoma das células pequenas, mesotelioma) ; cancro da mama (incluindo carcinoma dutal, carcinoma lobular, cancro da mama inflamatório, cancro da mama claro, carcinoma mucinoso,); cancro colo-retal (cancro do cólon, cancro retal); cancro anal; cancro pancreático (incluindo adenocarcinoma pancreático, carcinoma de células dos ilhéus, tumores neuroendócrinos); cancro da próstata; carcinoma ovárico (carcinoma epitelial ovárico ou tumor da superfície epitelial-estroma incluindo tumor seroso, tumor endometrióide e cistadenocarcinoma mucinoso, tumor dos cordões sexuais-estroma); carcinoma hepático e do duto biliar (incluindo carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma, hemangioma) ; carcinoma esofágico (incluindo adenocarcinoma esofágico e carcinoma das células escamosas); linfoma de não Hodgkin; carcinoma da bexiga; carcinoma do útero (incluindo adenocarcinoma do endométrio, carcinoma seroso papilar uterino, carcinoma das células claras uterino, sarcomas uterinos e leiomiossarcomas, tumores mulerianos mistos); glioma, glioblastoma, medulablastoma e outros tumores cerebrais; cancros renais (incluindo carcinoma das células renais, cancro da mama claro, tumor de Wilm); cancro da cabeça e do pescoço (incluindo carcinomas das células escamosas); cancro do estômago (adenocarcinoma estomacal, tumor estromal gastrointestinal); mieloma múltiplo; cancro testicular; tumor das células germinativas; tumor neuroendócrino; cancro cervical; carcinóides do trato gastrointestinal, mama e outros orgãos; carcinoma de células em anel de sinete; tumores mesenquimatosos incluindo sarcomas, fibrossarcomas, hemangioma, angiomatose, hemangiopericitoma, hiperplasia estromal pseudoangiomatosa, miofibroblastoma, fibromatose, tumor miofibroblástico inflamatório, lipoma, angiolipoma, tumor das células granulares, neurofibroma, schwanoma, angiossarcoma, lipossarcoma, rabdomiossarcoma, osteossarcoma, leiomioma ou um leiomirssarcoma. Numa modalidade não limitante, o tumor é um tumor mamário, um tumor do pâncreas, um tumor pulmonar, um tumor cervical, um tumor do cólon ou um tumor da cabeça e do pescoço. A presente invenção também providencia anticorpos L0XL2 para utilização num método para prevenir ou reduzir o risco de metástase de tumor num sujeito, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-L0XL2; e opcionalmente, um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, prevenindo ou reduzindo, assim, o risco de metástase de tumor. 0 inibidor pode ser um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo. 0 sujeito em necessidade de tal profilático pode ser um indivíduo que está geneticamente predisposto a cancro a corre um elevado risco de desenvolver cancro devido a várias razões, tais como historial familiar de cancro e ambiente carcinogénico.
Exemplos dos genes humanos que estão envolvidos no despoletar do desenvolvimento de cancro incluem, mas não se limitam a, VHL (o gene Von Hippon Landau envolvido no carcinoma das células renais); P16/INK4A (envolvido em linfoma); E-caderina (envolvido na metástase de cancro da mama, tiróide, gástrico); hMLHl (envolvido na reparação de ADN no cancro do cólon, gástrico e endometrial); BRCA1 (do na reparação de ADN no cancro da mama e ovárico) ; LKB1 (envolvido no cancro do cólon e da mama); P15/INK4B (envolvido em leucemia tal como AML e ALL); ER (recetor de estrogénio, envolvido no cancro do cólon, mama e leucemia); 06-MGMT (envolvido na reparação de ADN no cancro do cérebro, cólon, do pulmão e linfoma); GST-pi (envolvido no cancro da mama, próstata e renal); TIMP-3 (metalloprotease de tecido, envolvido na metástase de cancro do cólon, renal e cerebral); DAPK1 (DAP quinase, envolvido na apoptose das células de linfoma das células B); P73 (envolvido na apoptose de células de linfoma); AR (recetor de androgénio, involved in cancro da próstata); RAR-beta (retinoic acid receptor-beta, envolvido no cancro da próstata); recetor da endotelina-B (envolvido no cancro da próstata); Rb (envolvido na regulação do ciclo celular do retinoblastoma); p53 (um importante gene supressor de tumor); P14ARF (envolvido na regulação do ciclo celular); RASSFl (envolvido na transdução do sinal); APC (envolvido na transdução do sinal); Caspase-8 (envolvido na apoptose); TERT (envolvido na senescência); TERC (envolvido na senescência); TMS-1 (envolvido na apoptose); SOCS-1 (envolvido na resposta do fator de crescimento de hepatocarcinoma); PITX2 (hepatocarcinoma cancro da mama); MINT1; MINT2; GPR37; SDC4; MY0D1; MDR1; THBS1; PTC1; e pMDRl, conforme descrito em Santini et al. (2001) Ann. of Intern. Med. 134:573-586. Sequências nucleotídicas destes genes podem ser recuperadas do sítio de internet do Centro Nacional para Informação de Biotecnologia (NCBI).
Deveria ser notado que, apesar da leucemia ser um cancro do sangue, pode afetar outros orgãos, ou, efetivamente, metastasizar. Em leucemias agudas, as células anormais podem colher no sistema nervoso central, nos testículos, na pele e em qualquer outro orgão no corpo. Porque a leucemia já envolve toda a medula óssea no corpo e, em muitos casos, espalhou para outros orgãos tais como fígado, baço e nódulos linfáticos, a encenação da leucemia depende de outra informação que reflete a perspetiva do paciente em relação à sobrevivência. As leucemias incluem, por exemplo, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia mielogenosa aguda (AML), leucemia mielogenosa crónica (CML) e leucemia das células peludas (HCL). Diferentes sistemas de encenação são utilizados para diferentes tipos de leucemia crónica. Alguns tipos não têm qualquer sistema de encenação. Métodos de encenação são descritos com mais detalhe a seguir. 0 tratamento da proliferação celular anormal devido a estragos ao tecido corporal durante a cirurgia pode ser possível para uma variedade de procedimentos cirúrgicos, incluindo cirurgia às articulações, cirurgia do intestino e cicatrização quelóide. Doenças que produzem tecido fibrótico incluem enfisema. Distúrbios motores repetitivos que podem ser tratados utilizando a presente invenção incluem síndrome do túnel carpal. Um exemplo de distúrbios proliferativos celulares que podem ser tratados utilizando a invenção é um tumor ósseo. São providenciados aqui anticorpos L0XL2 para utilização num método para prevenir ou reduzir o risco de proliferação celular anormal devido aos estragos ao tecido corporal durante a cirurgia ou uma doença que produz tecido fibrótico num sujeito, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-LOX ou de um anticorpo anti-L0XL2; e opcionalmente, um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, prevenindo ou reduzindo, assim, a proliferação celular anormal devido aos estragos ao tecido corporal durante a cirurgia. 0 inibidor pode ser um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo. 0 sujeito em necessidade de tal profilático pode ser um indivíduo que está geneticamente predisposto para cancro ou com elevado risco de desenvolver cancro devido a várias razões tais como historial familiar de cancro e ambiente carcinogénico. Numa modalidade, a doença pode ser, por exemplo, cirurgia às articulações, cirurgia do intestine, cicatrização quelóide, uma doença que produz tecido fibrótico, distúrbios motores repetitivos de um tumor ósseo.
As respostas proliferativas associadas com transplante de orgãos que podem ser tratadas utilizando esta invenção incluem aquelas respostas proliferativas contribuindo para rejeições de orgão potenciais ou complicações associadas. Especificamente, estas respostas proliferativas podem ocorrer durante o transplante do coração, pulmão, fígado, rim e outros orgãos corporais ou sistemas de orgãos. São providenciados aqui anticorpos L0XL2 para utilização num método de tratar uma resposta proliferativa anormal associada com transplante de orgãos, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-L0XL2; e opcionalmente, um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, prevenindo ou reduzindo, assim, a proliferação celular anormal devido a transplante de orgãos. 0 transplante pode incluir, por exemplo, transplante do coração, pulmão, fígado, rim e outros orgãos corporais ou sistemas de orgãos. A indicação para a composição inventiva também inclui fibrose. A fibrose resulta da acumulação anormal de tecido fibroso que pode ocorrer como uma parte do porcesso de cicatrização em tecido danificado. Tal dano tecidular pode resultar de lesão física, inflamação, infeção, exposição a toxinas e outras causas. Exemplos de fibrose incluem fibrose hepática, fibrose pulmonar, fibrose renal, fibrose cardíaca e escleroderma. Os compostos e agentes da invenção descrita também são contemplados para o tratamento, prevenção e/ou melhoria de condições fibróticas.
Tecidos fibróticos acumulam-se no coração e vasos sanguíneos como um resultado de hipertensão, cardiopatia hipertensiva, aterosclerose e infarto agudo do miocárdio. Pressão sanguínea elevada, ou hipertensão, pode ser causada por uma variedade de fatores e, com frequência, conduz ao desenvolvimento de cardiopatia hipertensiva (HHD) com progressão para paragem cardíaca e infarto agudo do miocárdio. Da mesma forma, aterosclerose e outras doenças cardíacas isquémicas também resultam, com frequência, em paragem cardíaca. Estas doenças cardiovasculares todas exibem uma acumulação da matriz extracelular ou deposição fibrótica que resulta no enrijecimento da vasculatura e enrijecimento do próprio tecido cardíaco. Esta deposição de material fibrótico é uma resposta ao dano induzido pelo estado hipertensivo e/ou esclerótico, mas os efeitos desta resposta também resultam nos efeitos negativos do enrijecimento vascular e cardíaco, bem como aumento do ventrículo. Adicionalmente, pensa-se que a fibrose cardíaca aumentada observada na doença cardiovascular interrompe ou altera os sinais transmitidos para os cardiomiócitos através da dobragem do tecido do coração, conduzindo ainda à interrupção da função cardíaca eficiente e promoção da paragem cardíaca e infarto agudo do miocárdio. Dado o papel identificado da deposição aumentada da matriz extracelular nas fibroses cardíacas, os compostos da presente invenção são úteis na prevenção, tratamento e/ou melhoria das fibroses cardíacas por uma inibição de L0XL2. A presente invenção também providencia composições, métodos, sistemas, dispositivos médicos ou kits para o tratamento ou prevenção de fibrose cardíaca associada com doenças cardiovasculares, tais como cardiopatia hipertensiva (HHD), infarto agudo do miocárdio (MI), aterosclerose, restenose (por exemplo coronária, carótida e lesões cerebrais) e doença cardíaca associada com eventos isquémicos cardíacos. A resposta de cura pós-MI pode induzir a expressão de L0XL2, mas se este processo continua por verificar, a reticulação excessiva conduz à remodelação da matriz extracelular ou fibrose que resulta em disfunção cardíaca. As enzimas que desmantelam matrizes e colagénio ou elastina reticulada parecem funcionar mais lentamente ou menos eficientemente e são ultrapassadas pelos eventos de reticulação. Como a L0XL2 também desempenha um papel na transição epitelial-mesenquimatosa (EMT), isto contribui ainda para a remodelação de cardiomiócitos e hipertrofia de cardiomiócitos, além da remodelação da matriz.
Fibrose reparadora inicial induzida pelo MI pode ser útil (por exemplo, previne aneurisma e dano relacionado) e pode ser permitida proceder sem impedimentos. Contudo, apesar de não desejar estar ligados a uma teoria ou mecanismo de ação em particular, os inventores acreditam que o tratamento anti-L0XL2 iniciado após esta fase de fibrose reparadora poderia atenuar a fibrose reativa (não adaptada) que conduz a disfunção cardíaca. Por exemplo, o tratamento anti-L0XL2 pode ser iniciado 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 16, 20, 22, 24, 36 ou 48 horas após MI, inclusivé todos os números inteiros entre estes. Adicionalmente, o tratamento anti-LOXL2 pode ser iniciado 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias após MI. Da mesma forma, aumentos na pressão sanguínea (hipertensão) resultam na deposição aumentada de colagénio e degradação de proteína reduzida no tecido cardíaco. (Berk et al., J. Clin. Invest., 117(3): 568-575 (2007)). O tratamento anti-LOXL2 iniciado após diagnóstico e/ou estabelecimento de cardiopatia hipertensiva ou hipertensão pode prevenir, reduzir ou melhorar a fibrose associada com hipertensão. Tal tratamento anti-LOXL2 é iniciado 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias após serem diagnosticados ou detetados aumentos da hipertensão ou pressão sanguínea sistémica.
Como outro exemplo, podem ser utilizados biomarcadores para determinar quando um nível apropriado de reticulação pode estar a ocorrer: por exemplo, demonstrou-se que níveis de LOX estão correlacionado com proteína C reativa (CRP), um biomarcador vulgarmente utilizado, e o tratamento poderia começar quando os níveis de CRP são elevados acima dos níveis apropriados normais. Mais diretamente, métodos e kits teste existem para medir a libertação de telopeptídeos de colagénio reticulados na urina ou sangue. Os níveis elevados destes fragmentos de colagénio poderiam indicar uma transição de fibrose reparadora para fibrose reativa (não adaptada). Além disso, podem ser feitas medições da função e rendimento cardíaco, incluindo aquelas associadas com contração eficiente do ventrículo.
Um inibidor de L0XL2 pode ser entregue a um sujeito antes de, simultâneamente, ou após uma condição patológica ou doença cardíaca, tal como hipertensão, cardiopatia hipertensiva (HHD), infarto agudo do miocárdio (MI), aterosclerose e restenose, para prevenir o desopletar de, para reduzir o risco de ou para regredir a fibrose patológica associada com tal condição patológica ou doença cardíaca. Por exemplo, um inibidor de L0X/L0XL2 pode ser administrado pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 5 horas ou 10 horas ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, ou 14 dias após o despoletar de tal condição patológica ou doença cardíaca.
Adicionalmente, está prevista uma duração limitada do tratamento. O tratamento deveria ser prolongado apenas o tempo suficiente para prevenir ou atenuar a fibrose reativa para prevenir ou reduzir disfunção cardíaca. Por exemplo, fragmentos de anticorpo FAB de vida curta são utilizados quando durações curtas do tratamento são desejadas. Em alternativa, podem ser utilizados anticorpos de comprimento inteiro que têm uma meia-vida mais longa no soro, com dosagem limitada ao longo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 semanas, inclusivé todos os dias entre eles. Testes padrão da função cardíaca podem ser utilizados para monitorizar o progresso e ajustar a dosagem conforme necessário, juntamente com a avaliação de biomarcadores relevantes discutidos anteriormente. A duração limitada do tratamento adiciona à segurança desta abordagem.
Fibrose do fígado está implicada na patologia de numerosas doenças hepáticas. Conforme notado previamente, a fibrose ocorre como uma complicação de hemocromatose, doença de Wilson, alcoolismo, esquistosomíase, hepatite virai, obstrução do duto biliar, exposição a toxinas e distúrbios metabólicos. Se não for verificada, a fibrose hepática progride para cirrose (definida pela presença de nódulos encapsulados), falha hepática e morte. Os estragos crónicos ao figado de tais fontes como parasitas e infeção virai (por exemplo HBV, HCV, HIV, esquistosomíase) ou o stress a longo prazo pelo consume de álcool resulta inevitavelmente na remodelação do fígado, presumivelmente para encapsular a área danificada e proteger o tecido hepático restante do dano. (Li e Friedman, Gastroenterol. Hepatol. 14:618-633, 1999). A fibrose hepática resulta em alterações da matriz extracelular, incluindo aumentos de 3-10 vezes no conteúdo de colagénio total e substituição da membrana basal de baixa densidade com matriz de alta densidade, que debilitam a função metabólica e síntese de hepatócitos, células de Ito e células endoteliais. (Girogescu, M., Non-invasive Biochemical Markers of fibrotic liver, J. Gastrointestin. Liver Dis., 15(2) : 149-159 (2006)). Os compostos da invenção instante são, assim, úteis para a prevenção, tratamento e/ou melhoria de doenças hepáticas fibróticas e tal utilização é contemplada aqui por inibição de LOXL2.
Tal como a fibrose hepática, fibrose renal pode resultar de várias doenças e estragos aos rins. Exemplos de tais doenças e estragos incluem doença renal crónica, síndrome metabólica, diabetes e nefrite glomerular resultante. Tornou-se reconhecido que a síndrome metabólica é um grupo de anomalias incluindo distintivos diabéticos tais como resistência à insulina bem como obesidade central ou visceral e hipertensão. Em quase todos os casos, a desregulação da glicose resulta na estimulação da libertação de citocina e regulação para cima da deposição de matriz extracelular. Fatores adicionais que contribuem para doença renal crónica, diabetes, síndrome metabólica e nefrite glomerular incluem hiperlipidemia, hipertensão e proteinúria, todos os quais resultam em dano adicional aos rins e estimulam ainda mais a deposição de matriz extracelular. Assim, independentemente da causa primária, estragos aos rins resultam em fibrose renal e na perda concomitante da função renal. (Schena, F. e Gesualdo, L., Pathogenic Mechanisms of Diabetic Nephropathy, J. Am. Soc. Nephrol., 16: S30-33 (2005); Whaley-Connell, A., e Sower, J.R., Chronic Kidney Disease and the Cardiometabolic Syndrome, J. Clin. Hypert., 8(8): 546-48 (2006)). Os compostos da invenção instante são, assim, úteis para a prevenção, tratamento e/ou melhoria de doenças renais fibróticas (doença renal crónica, nefropatia diabética, nefrite glomerular, síndrome metabólica) e tal utilização é contemplada aqui. A fibrose pulmonar inclui muitos síndromes e doenças. Doenças exemplares incluem fibrose pulmonar idiopática (IPF), pneumonia intersticial idiopática e síndrome do desconforto respiratório do adulto (ARDS). A patogénese da maioria das fibroses pulmonares, incluindo as doenças supracitadas não são bem entendidas, contudo todas são caracterizadas por um influxo de células inflamatórias e um aumento subsequente na síntese e deposição de matriz extracelular rica em colagénio. (Chua et ai., Am J. Respir. Cell. Mol. Biol., 33:9-13 (2005); Tzortzaki et al., J. Histochem. & Cytochem., 54(6): 693-700 (2006); Armstrong et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 160: 1910-1915 (1999)). Dado o papel identificado de deposição de colagénio e matriz extracelular aumentada nas fibroses pulmonares, os compostos da presente invenção são úteis para a prevenção, tratamento e/ou melhoria das fibroses pulmonares por uma inibição de LOXL2.
Escleroderma é um distúrbio autoimune, no qual existe uma sobreprodução de colagénio anormal. Este colagénio em excesso acumula-se por todo o corpo, causando endurecimento (esclerose), cicatrização (fibrose) e outro dano. 0 dano pode afetar o aparecimento de pele ou pode envolver apenas os orgãos internos. Os sintomas e severidade do escleroderma variam de pessoa para pessoa. Dado o papel identificado de colagénio aumentado no escleroderma, os compostos da presente invenção são úteis para a prevenção, tratamento e/ou melhoria de escleroderma por uma inibição de L0XL2. A angiogénese anormal que pode ser tratada ou prevenida utilizando esta invenção inclui aquela angiogénese anormal que acompanha a artrite reumatóide, edema e lesão cerebral relacionado com reperfusão isquémica, isquémia cortical, hiperplasia e hipervascularidade, (sindrome do ovário policistico), endometriose, psoriase, retinopatia diabética e outras doenças angiogénicas oculares, tais como retinopatia da prematuridade (fibroplasia retrolental) , degeneração muscular, rejeição do enxerto da cornea, glaucoma neuroscular e sindrome de Oster Webber.
Doenças associadas com a angiogénese anormal requerem ou induzem crescimento vascular. Por exemplo, a angiogénese córnea envolve três fases: um período latente pré-vascular, neovascularização ativa e maturação e regressão vascular. A identidade e mecanismo de vários fatores angiogénicos, incluindo elementos da resposta inflamatória, tais como leucócitos, plaquetas, citocinas e eicosanoids ou constituintes do plasma não identificados ainda estão para ser revelados.
Os anticorpos anti-L0XL2 descritos aqui podem ser utilizados para tratar doenças associadas com angiogénese anormal ou indesejada. 0 método compreende administrar a um paciente que padece de angiogénese anormal ou indesejada um inibidor de LOXL em combinação com agente anti-neoplástico ou agente anti-angiogénico que não é dito inibidor de LOXL. A dosagem particular destes agentes necessária para inibir (parcialmente ou completamente) a angiogénese e/ou doenças angiogénicas pode depender da severidade da condição patológica, da via de administração e fatores relacionados que podem ser decididos pelo médico em funções. Em geral, doses diárias aceites e eficazes são a quantidade suficiente para inibir eficazmente a angiogénese e/ou doenças angiogénicas.
De acordo com esta modalidade, as formulações farmacêuticas da presente invenção podem ser utilizadas para tratar uma variedade de doenças associadas com angiogénese indesejada, tais como neovascularização retinal/coroidal e neovascularização da córnea. Exemplos de neovascularização retinal/coroidal incluem, mas não se limitam a, doenças de Bests, miopia, poços óticos, doenças de Stargarts, doença de Pagets, oclusão venosa, oclusão arterial, anemia das células falciformes, sarcóide, sífilis, doenças obstrutivas da carótida de Pseudoxanthoma elasticum, uveíte/vitrite crónica, infeções micobacterianas, doença de Lyme, lúpus eritematoso sistémico, retinopatia de prematuridade, doença de Eales, retinopatia diabética, degeneração macular, doenças de Bechets, infeções que causam uma retinite ou croidite, suposta histoplasmose ocular, pars planite, destacamento da retina crónico, síndromes de hiperviscosidade, toxoplasmose, trauma e complicações pós-laser, doenças associadas com rubese (neovascularização do ângulo) e doenças causadas pela proliferação anormal do tecido fibrovascular ou fibroso incluindo todas as formas de vítreo-retinopatia proliferativa. Exemplos de neuvascularização da córnea incluem, mas não se limitam a, ceratoconjuntivite epidémica, deficiência em Vitamina A, desgaste da lente de contacto, ceratite atópica, ceratite límbica superior, ceratite pterígeo sicca, síndrome de Sjogrens, acne rosácea, filectenulose, retinopatia diabética, retinopatia de prematuridade, rejeição do enxerto da córnea, úlcera de Mooren, degeneração marginal de Terrien, ceratólise marginal, poliartrite, sarcoidose de Wegener, esclerite, ceratotomia radial perifigóide, glaucoma neovascular e fibroplasia retrolental, sífilis, infeções por Mycobacteria, degeneração lipídica, queimaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras fúngicas, infeções por Herpes simplex, infeções por Herpes zóster, infeções por protozoários e sarcoma de Kaposi.
Ainda noutra modalidade, as formulações farmacêuticas da presente invenção podem ser utilizadas para tratar doenças inflamatórias crónicas associadas com angiogénese anormal. 0 método compreende administrar a um paciente que padece de uma doença inflamatória crónica associada com angiogénese anormal um inibidor de L0XL2 em combinação com agente anti-neoplástico ou agente anti-angiogénico que não é dito inibidor de L0XL2. A inflamação crónica depende da formação continua de brotes capilares para manter um influxo de células inflamatórias. 0 influxo e presença das células inflamatórias produz granulomas e mantém, assim, o estado de inflamação crónica. A inibição da angiogénese utilizando os compostos descritos aqui pode prevenir a formação dos granulossomas, aliviando, assim, a doença. Exemplos de doença inflamatória crónica incluem, mas não se limitam a, doenças inflamatórias do intestino, tais como a doença de Crohn e colite ulcerativa, psoríase, sarcoidose e artrite reumatóide.
Doenças inflamatórias do intestino, tais como doença de Crohn e colite ulcerativa caracaterizam-se por inflamação crónica e angiogénese em vários locais no trato gastrointestinal. Por exemplo, a doença de Crohn ocorre como uma doença inflamatória transmural crónica que afeta de forma mais comum o íleo distai e cólon, mas também pode ocorrer em qualquer parte do trato gastrointestinal da boca ao ânus e área perianal. Os pacientes com doença de Crohn têm, em geral, diarreia crónica associada com dor abdominal, febre, anorexia, perda de peso e inchaço abdominal. A colite ulcerativa também é uma doença crónica, inespecífica, inflamatória e ulcerativa que surge na mucosa colónica e se caracateriza pela presença de diarreia ensanguentada. Estas doenças inflamatórias do intestino são, em geral, causadas por inflamação granulomatosa crónica ao longo do trato gastrointestinal, envolvendo novos brotes capilares rodeados de um cilindro de células inflamatórias. A inibição da angiogénese pelas formulações farmacêuticas da presente invenção deveria inibir a formação de brotes e prevenir a formação de granulomas. As doenças inflamatórias do intestino também exibem manifestações intestinais extra, tais como lesões da pele. Tais lesões caracterizam-se pela inflamação e angiogénese e podem ocorrer em muitos locais além do trato gastrointestinal. A inibição da angiogénese pelas formulações farmacêuticas da presente invenção deveria reduzir o influxo de células inflamatórias e prevenir a formação de lesões. Portanto, são providenciados aqui anticorpos L0XL2 para utilização num método de tratar uma doença intestinal inflamatória, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-L0XL2; e opcionalmente, um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Sarcoidose, outra doença inflamatória crónica, caracteriza-se como um distúrbio granulomatoso multi-sistema. Os granulomas desta doença podem formar-se em qualquer lado do corpo e os sintomas dependem, assim, do local dos granulomas e se a doença está ativa. Os granulomas são criados pelos brotes capilares angiogénicos que providenciam um fornecimento constante de células inflamatórias. Ao utilizar as formulações farmacêuticas da presente invenção para inibir a angiogénese, tal formação de granulomas pode ser inibida. A psoriase, também uma doença inflamatória recorrente e crónica, caracteriza-se por pápulas e placas de vários tamanhos. 0 tratamento utilizando as formulações farmacêuticas da presente invenção deveriam prevenir a formação de novos vasos sanguíneos necessários para manter as lesões características e providenciar ao paciente alívio dos sintomas. Portanto, é providenciado aqui um método de prevenir a formação de novos vasos sanguíneos necessários para manter as lesões características e providenciar ao paciente alívio dos sintomas, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-L0XL2; e opcionalmente, um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A artrite reumatóide (RA) também é uma doença inflamatória crónica caracterizada pela inflamação inespecífica das articulações periféricas. Pensa-se que os vasos sanguíneos no revestimento sinuvial das articulações passam por angiogénese. Além de formar novas redes vasculares, as células endoteliais libertam fatores e espécies de oxigénio reativos que conduzem a crescimento de pano e destruição da cartilagem. Os fatores envolvidos na angiogénese podem contribuir ativamente para, e ajudar a manter, o estado cronicamente inflamado de artrite reumatóide. 0 tratamento utilizando as formulações farmacêuticas da presente invenção apenas ou em conjunção com outros agentes anti-RA pode prevenir a formação de novos vasos sanguíneos necessário para manter a inflamação crónica e providenciar ao paciente com RA alívio dos sintomas. Outros agentes anti-RA são convencionais e conhecidos na arte. Portanto, são providenciados aqui anticorpos L0XL2 para utilização num método de prevenir ou tratar RA, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-LOX ou um anticorpo anti-L0XL2; e opcionalmente, um ou mais outros agentes anti-RA.
Além da utilização dos anticorpos anti-LOXL2 sozinhos no tratamento das indicações descritas anteriormente, também é contemplada terapêutica de combinação aqui. Os métodos providenciados aqui podem ainda incluir administrar um agente ou tratamento anti-cancerigeno ao paciente. É providenciado aqui um método de tratar qualquer uma das indicações descritas anteriormente administrando um anticorpo anti-LOX e um anticorpo anti-L0XL2.
Num aspeto, esta invenção contém métodos para inibir a invasão e metástase de células tumorais, contactando as células com pelo menos um agente citotóxico e pelo menos um anticorpo anti-L0X2. Em geral, o método inclui uma etapa de contactar células de tumor metastático com uma quantidade de pelo menos um agente citotóxico e pelo menos um anticorpo anti-L0X2, que, em combinação, é eficaz para reduzir ou inibir a invasão ou potencial metastático da célula. Em alternativa, de acordo com a presente invenção, um anticorpo anti-L0XL2 pode ser combinado com um agente quimioterapêutico para sensibilizar as células tumorais (por exemplo, transição do estado EMT para o estado MET) para serem mortas pelo agente quimioterapêutico, assim não só prevenindo ou inibindo a invasão tumoral e metástase, mas também inibindo o crescimento tumoral primário.
Qualquer agente anti-cancerigeno adequado pode também ser empregue nos presentes métodos.
Conforme utilizado aqui o termo "agente quimioterapêutico" ou "quimioterapêutico" (ou "quimioterapêutica," no caso de tratamento com um agente quimioterapêutico) pretende-se que abranje qualquer composto químico não proteináceo (isto é, não peptídico) útil no tratamento de cancro. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN™); sulfonates de alquilo, tais como busulfano, improsulfano e piposulfano; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo os seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogénio, tais como clorambucilo, clomafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo; nitrosoureias tais como carmustina, clorozotocina, foremustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tais como os antibióticos enedina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama II e caliqueamicina phill, ver, por exemplo, Agnew, Chem. Inti. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994); dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonates, tais como clodronato; uma esperamicina; bem como cromóforo neocarzinostatina e cromóforos antibióticos cromoproteina enedina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (Adramicina™) (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e deoxidoxorrubicina) , epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tais como metotrexato e 5-fluorouracilo (5-FU); análogos do ácido fólico tais como demopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos da purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgénios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tais como ácido frolinico; aceglatona; aldofosfamida glicosida; ácido aminolevulinico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; uma epotilona; etoglúcido; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidamina; maitansinóides tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenameto; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilinico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK™; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente T-2 toxina, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiopeta; taxóides, por exemplo, paclitaxel (TAXOL™, Bristol Meyers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) e docetaxel (TAXOTERE™., Rhone-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucilo; gemcitabina (Gemzar™); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos da platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitroxantrona; vancristina; vinorelbina (Navelbine™) ; novantrona; teniposido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeoloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; diflurometilornitina (DMFO) ; retinóides tais como ácido retinóico; capecitabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores. Também estão incluídos na definição de "agente quimioterapêutico" agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação hormonal nos tumores tais como anti-estrogénios e moduladores do recetor de estrogénio seletivos (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo Nolvadex™), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (Fareston™); inibidores da enzima aromatase, que regula a produção de estrogénio nas glândulas adrenais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazóis, aminoglutetimida, acetato de megestrol (Megace™), exemestano, formestano, fadrozol, vorozol (Rivisor™), letrozol (Femara™) e anastrozol (Arimidax™) ; e anti-androgénios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuproliada e goserelina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores.
Num exemplo não limitante, esta invenção inclui métodos para inibir sinergicamente a invasão e metástase das células tumorais, contactando as células com pelo menos cisplatina e pelo menos um anticorpo anti-LOX (ver Figura 18). Alguém que pratique os métodos descritos aqui deveria entender que um anticorpo anti-LOX2 poderia ser utilizado em tais métodos.
Numa modalidade, o agente anti-neoplástico em combinação com o modulador LOX/LOXL é um inibidor da tirosina quinase. Por exemplo, ZD1839 (Iressa™ de AstraZeneca K.K.) mostra um efeito competitivo para ATP no local de ligação de ATP de EGFR (recetor do fator de crescimento epidérmico) tirosina quinase e inibe a atividade da tirosina quinase inibindo a autofosforilação da tirosina quinase. Como um resultado, o efeito anti-cancerígeno é expresso bloqueando uma transdução do sinal que equipa EGFR (ligandos tais como fator de crescimento epidérmico (EGF) estão ligados ao domínio extracelular de EGFR, seguido da ativação de EGFR tirosina quinase no domínio intracelular, causando não só autofosforilação de EGFR, mas também a fosforilação de várias proteínas alvo intracelulares, transduzindo depois um sinal de proliferação da superfície celular para o núcleo, transduzindo depois os sinais de proliferação da superfície da célula cancerígena para o núcleo e resultando na proliferação, infiltração, metástase, angiogénese das células cancerígenas) em associação com proliferação, infiltração, diferenciação e metástase. IMC-C225 ou cetuximab (Erbitux™) que é um anticorpo monoclonal dirigido a EGFR) reconhece a parte recetora de EGFR numa superfície da membrana celular e inibe a autofosforilação de EGFR inibindo, assim, a atividade de tirosina quinase. Herceptina é um anticorpo monoclonal contra Her2/Neu que é homóloga a EGFR e mesilato de imatinib (GLEEVEC™, anteriormente STI-571) podem inibir ambas atividades de tirosina quinase de BCR-Abl e c-kit (documento não patente N.° 2) . Sorafenib (Nexavar™) é um pequeno inibidor molecular da Raf quinase, PDGF (fator de crescimento derivado de plaqueta), recetor de VEGF 2 & 3 quinases e c-Kit.
Conforme utilizado aqui, anticorpos monoclonais contra tumores antigenos são anticorpos despoletados contra antigenos expressos por tumores e células leucémicas, preferencialmente antigenos específicos de tumor. 0 anticorpo monoclonal também inclui anticorpo humanizado e completamente humano.
Outros exemplos de anticorpos terapêuticos para terapêutica cancerígena incluem Trastuzumab (HERCEPTIN™; A sobre-expressão da proteína HER2 está associada com doença mais agressiva e prognóstico mais fraco na clínica); Rituximab (RITUXAN™) que é criado contra CD20 em células de linfoma e depleta seletivamente células CD20+ pré-B e B maduras normais e malignas; Alemtuzumab (CAMPATH™), um anticorpo monoclonal que se dirige especificamente ao antigeno CD52 que é encontrado nos linfócitos B e T e utilizado para o tratamento de leucemia linfocítica crónica (CLL) e linfoma; e Gemtuzumab zogamicina (MYLOTARG™), um conjugado de anticorpo que combina um anticorpo específico contra CD33 com um fármaco quimioterapêutico (zogamicina) e é indicado para o tratamento de leucemia mielocítica aguda adulta reincidente.
Noutra modalidade, o agente anti-angiogénico é combinado com um inibidor de L0XL2 para tratar cancro e outras doenças associadas com angiogénese anormal ou indesejável. Exemplos de agentes anti-angiogénicos incluem, mas não se limitam a, ácido retinóide e derivados do mesmo, 2-metoxiestradiol, ANGIOSTATIN™, ENDOSTATIN™, suramin, esqualamina, inibidor de tecido da metaloproteinase-I, inibidor de tecido da metaloproteinase-2, inibidor do ativador de plasminogénio-1, inibidor do ativador de plasminogénio-2, inibidor derivado de cartilagem, paclitaxel, fator de plaqueta 4, sulfato de protamina (clupeína), derivados de quitina sulfatados (preparados a partir de conchas de caranguejo rainha), complexo de peptidoglicano polissacarídeo sulfatado (sp-pg), estaurosporina, moduladores de metabolismo da matriz, incluindo, por exemplo, análogos da prolina ((ácido I-azetidina-2-carboxílico (LACA), cishidroxiprolina, d,1-3,4-dehidroprolina, tiaprolina, a-dipiridilo, fumarato de β-aminopropionitrilo, 4-propil-5- (4-piridinil)-2(3h)-oxazolona; metotrexato, mitoxantrona, heparina, interferões, 2 macroglobulina-soro, chimp-3, quimiostatina, tetradecassulfato de β-ciclodextrina, eponemicina; fumagilina, tiomalato de sódio ouro, d-penicilamina (CDPT), beta.-1-anticolageniase-soro, alfa.2-antiplasmina, bisantreno, lobenzarito dissódico, ácido n-2-carboxifenil-4-cloroantronílico dissódico ou "CCA", talidomida; esteróide angiostático, carboxinaminolmidazol; inibidores de metalloproteinase, tais como BB94. Outros agentes anti-angiogénese incluem anticorpos, preferencialmente anticorpos monoclonais contra estes fatores de crescimento angiogénicos: bFGF, aFGF, FGF-5, isoformas VEGF, VEGF-C, HGF/SF e Ang-l/Ang-2. Ferrara N. e Alitalo, K. "Clinicai application of angiogenic growth factors and their inhibitors" (1999) Nature Medicine 5:1359-1364.
Agentes anti-fibróticos exemplares incluem, mas não se limitam a, compostos tais como β-aminoproprionitrilo (BAPN), bem como aos compostos revelados na Patente U.S. N.° 4 965 288 para Palfreyman, et ai., emitida a 23 de outubro de 1990, intitulada "Inhibitors of lysyl oxidase, relating to inhibitors of lysyl oxidase and their use in the treatment of diseases and conditions associated with the abnormal deposition of collagen; Patente U.S. N.° 4 997 854 para Kagan, et al. , emitida a 5 de março de 1991, intitulada " Anti-fibrotic agents and methods for inhibiting the activity of lysyl oxidase in situ using adjacently positioned diamine analogue substrate," em relação a compostos que inibem LOX para o tratamento de vários estados fibróticos patológicos. Inibidores exemplares adicionais são descritos na Patente U.S. N.° 4 943 593 para Palfreyman, et al. , emitida a 24 de julho de 1990, intitulada " Inhibitors of lysyl oxidase," em relação a compostos tais como 2-isobutil-3-fluór-, cloro-, ou bromo-alilamina; bem como, por exemplo, Patente U.S. N.° 5 021 456; Patente U.S. N.° 5 5059 714; Patente U.S. N.° 5 120 764; Patente U.S. N.° 5 182 297; Patente U.S. N.° 5 252 608 (em relação a 2-(1-naftiloximetil)-3-fluoroalilamina) . Agentes anti-fibróticos exemplares também incluem as aminas primárias que reagem com o grupo carbonilo do local ativo das lisil oxidases, e mais particularmente aqueles que produzem, após ligação com o carbonilo, um produto estabilizado pela ressonância, tais como as seguintes aminas primárias: etilenodiamina, hidrazina, fenilhidrazina e seus derivados, semicarbazida e derivados de ureia, aminonitrilos, tais como beta-aminopropionitrilo (BAPN) ou 2-nitroetilamina, haloaminas insaturadas ou saturadas, tais como 2-bromoetilamina, 2-cloroetilamina, 2-trifluoroetilamina, 3-bromopropilamina, p-halobenzilaminas, selenohomocisteína lactona. Noutra modalidade, os agentes anti-fibróticos são agentes quelantes do cobre, penetrando ou não nas células. Compostos exemplares adicionais incluem inibidores indiretos tais como compostos que bloqueiam os derivados de aldeído que originam da desaminação oxidativa de resíduos lisil e hidroxilisil pelas lisil oxidases, tais como as tiolaminas, em particular D-penicilamina ou os seus análogos tais como ácido 2-amino-5-mercapto-5-metilhexanóico, ácido D-2-amino-3-metil-3-((2-acetamidoetil)ditio) butanóico, ácido p-2-amino-3-metil-3-((2-aminoetil)ditio) butanóico, sulfinato de sódio-4-((p-1-dimetil-2-amino-2-carboxietil)ditio)butano, sulfanato de 2-acetamidoetil-2-acetamidoetanetiol, trihidrato de sódio-4-mercaptobutanesulfinato.
Os presentes métodos podem ser realizados em células em cultivo, por exemplo, in vitro ou ex vivo, ou podem ser realizados em células presentes num sujeito, por exemplo, como parte de um protocolo terapêutico in vivo. O regime terapêutico pode ser realizado num sujeito humano ou noutros animais. O anticorpo anti-LOX2 providenciado aqui pode ser administrado em qualquer ordem relativa ao agente quimioterapêutico. Por vezes, o anticorpo anti-LOX2 e o agente são administrados simultâneamente ou sequencialmente. Eles podem ser administrados em diferentes locais e em diferentes regimes de dosagem. A eficácia terapêutica potenciada da terapêutica de combinação da presente invenção representa uma alternativa promissora aos regimes altamente tóxicos convencionais de agentes anti-cancerígenos. Agentes quimioterapêuticos a serem empregues em tais métodos foram descritos com mais detalhe anteriormente. EXEMPLOS EXEMPLO 1 Métodos de gerar Anticorpos Monoclonais Murinos Anti-LOX e Anti—LOXL2
Ratinhos (BALB/c (00467)) foram injetados por via subcutânea (s.c.), 5 vezes em intervalos de 2-3 semanas com 0,05 mg antigeno (Ag) numa formulação de adjuvante. Para péptidos Ags, os péptidos foram conjugados a albumina do soro bovina e formulados em Adjuvante de Freunds (FA) antes da imunização. Para proteínas Ags, a proteína foi formulada em adjuvante dipeptídico de Alhidrogel-Muramilo (ALD/MDP).
Ratinhos foram injetados com Ag formulados em PBS, cada dia durante 3 dias através de uma combinação de vias s.c., intraperitoneal (i.p.) e intravenosa (i.v.), 0,05 a 0,1 mg/via. Células do baço e nódulos linfáticos dos ratinhos foram isolados e fundidos com células de mieloma P3X63-Ag8.653 utilizando 50% polietilenoglicol. Células foram cultivadas e uma biblioteca de hibridomas de células selecionadas HAT foi isolada essencialmente conforme descrito em Kenney, et al. ("Production of monoclonal antibodies using a secretion capture report web." Biotechnology 13:787-790, 1995). A biblioteca de hibridomas foi clonada utilizando urn classificador de células ativadas fluorescentes com unidade de deposição de células automática. Células viáveis únicas foram classificadas em placas com 96 poços com base nos critérios de análise de dispersor para a frente, dispersor para o lado e fluorescência de iodeto de propídio, conforme descritos por Kenney et ai.
Os soros e sobrenadantes foram classificados por ensaio imunossorbente ligado a enzima (ELISA) utilizando poços de placa de microtítulo revestidos com Ag, que foram depois incubados com plasma de ratinho ou sobrenadante de hibridoma, seguido de conjugado anticorpo-HRP IgG (específico de Fc) de ratinho de cabra seguido pela solução de substrato TMB e reagente de terminação.
Os poços da placa foram lavados para remover anticorpo ou antígeno não ligado entre todas as incubações e os resultados foram determinados.
As sequências de aminoácidos VH e VL de um anticorpo monoclonal murino anti-L0XL2 identificado utilizando os métodos descritos são providenciadas na Figura 6A e Figura 6B, respetivamente. Para cada região variável, os péptidos sinal são mostrados em itálico, as CDRs são sublinhadas e o inicio da estrutura constante é mostrada a negrito.
Uma sequência de aminoácidos VH de um anticorpo monoclonal murino anti-LOX identificado utilizando os métodos descritos é providenciada na Figura 7A. Duas sequências de aminoácidos VL de anticorpos monoclonais murinos anti-LOX identificados utilizando os métodos descritos são providenciadas nas Figuras 7B e 7C. Para cada região variável, os péptidos sinal são mostrados em itálico, as CDRs são sublinhadas. EXEMPLO 2
Anticorpos anti-L0XL2 foram classificados utilizando uma atualização do rastreio B de proteínas para avaliar a atividade enzimática de L0XL2.
Anticorpos candidatos foram inicialmente escolhidos com base em testes de ponto ELISA. Foi realizada ELISA em múltiplos antígenos por Soluções de Anticorpo e anticorpos que mostram forte sinal de ELISA no antígeno de interesse foram selecionados para caracterização adicional em ensaios enzimáticos. L0XL2 produz peróxido de hidrogénio quando o substrato 1,5-diaminopentano é desaminado e a enzima regenerada.
Os anticorpos foram avaliados pela sua capacidade para inibir a atividade enzimática utilizando um ensaio bioquímico que une a produção de peróxido (libertado pela L0XL2) a HRP e medindo a conversão de vermelho amplex em produto fluorescente. 0 sobrenadante hibridoma de anticorpo (10 pL) foi adicionado a 40 pL de mistura de enzima (62,5 mM borato de sódio pH 8,0, 5 unidades/ml HRP, 125 nM LOXL2, 10 ppm anti-espuma) e incubado à temperatura ambiente durante 1 hora numa placa com 96 poços com área completamente negra. A reação enzimática foi iniciada com a adição de 50 pL de solução de substrato (50 mM borato de sódio, 100 mM reagente vermelho amplex, 20 mM 1,5-diaminopentano (DAP), 10 ppm anti-espuma) e lido num leitor de placa Molecular Devices M5 a 37°C. O leitor de placa foi configurado para ler fluorescência (ex=544 nm, em=590 nm) em modo cinético durante 1 hora. Os dados foram registados como o declive da resposta de fluorescência com o tempo. Estes declives foram comparados com um controlo no qua los meios hibridoma foram adicionados à mistura da enzima. Os declives menores dos do controlo foram considerados inibidores.
Os anticorpos Ml (asc) , M4, Mil, Ml, M13, M22, M16, M19, M20, M20 (asc) e anticorpos teste M25 foram testados contra BAPN (um inibidor competitivo de LOXL2) como um controlo positivo eLOXL2 como um controlo negativo (ver Figura 8).
Um anticorpo anti-LOXL2 foi designado AB0023. Anticorpos anti-LOXL2 repetiram a atividade inibidora observada em 10 ml de materiais de preparação no ensaio enzimático. A inibição também foi repetida em ensaios baseados na célula (ver a seguir). A análise de sequência confirmou que as sequências de aminoácidos de M01, M16, M19 e M20 são idênticas. EXEMPLO 3
Anticorpo anti-LOXL2 AB0023 e atividade enzimática A atividade enzimática dos anticorpos anti-L0XL2 pode ser avaliada e os IC50s determinados.
Ml, Ml (asc) , M20 e M20 (asc) foram avaliados na presença de 25 nM L0XL2 e 15 mM 1,5 DAP sobre concentrações crescentes de anticorpo.
Determinações de IC50
Respostas de dose em anticorpos selecionados foram realizadas contra L0XL2 utilizando o ensaio enzimático unido descrito anteriormente. Uma série de diluições do anticorpo foi criada em PBST (0,01% tween-20) e 10 pL disto foi adicionado a 40 pL da mistura da enzima (62,5 mM borato de sódio pH 8,0, 5 unidades/ml HRP, 125 nM LOXL2, 10 ppm anti-espuma) e incubado à temperatura ambiente durante 1 hora numa placa com 96 poços com área completamente negra. A reação enzimática foi iniciada com a adição de 50 pL de solução de substrato (50 mM borato de sódio, 100 mM reagente vermelho amplex, 20 mM 1,5-diaminopentano, 10 ppm anti-espuma) e lida num leitor de placa M5 utilizando as condições descritas anteriormente. Os declives da resposta de fluorescência como uma função do tempo foram desenhadas em gráficos contra a concentração do anticorpo e os dados foram ajustados a um ajuste de quatro parâmetros utilizando GraFit. O ponto central deste gráfico é o IC50 aparente e é a concentração à qual cinquenta por cento da resposta total é inibida.
Verificou-se que o Ab0023 é um inibidor parcial da atividade enzimática de LOXL2 com um IC50 aparente de aproximadamente 30 nM (ver Figura 9).
Com base na utilização de um inibidor parcial na clínica para tratamento terapêutico (isto é, Nevirapina - conforme fármaco HIV-1 aprovado descrito por Spence et al. (1995) Science 267), um inibidor parcial de L0XL2 também pode ser utilizado em aplicações terapêuticas. EXEMPLO 4
Anticorpo anti-LOXL2 AB0023 é um inibidor não competitivo A atividade do anticorpo anti-L0XL2 AB0023 foi avaliada sobre concentrações crescentes de 1,5 DAP e sobre concentrações crescentes de anticorpo (1 μΜ, 0,005 μΜ, 0,050 μΜ e 0,300 μΜ).
Modo de inibição O modo de inibição de anticorpos contra LOXL2 foi conduzido utilizando o modelo descrito a seguir. Nestas experiências, a dependência da taxa do estado estcionário da concentração de 1,5-diaminopentano foi monitorizada em concentrações crescentes do anticorpo. O objetivo foi avaliar se a Km para o substrato, kcat ou ambos se alteram na presença de anticorpo. Os dados recolhidos foram analisados globalmente com Grafit utilizando o modelo mostrado na figura a seguir. E representa enzima, S representa substrato, A representa anticorpo e P representa produto. O parâmetro α descreve o efeito do composto na afinidade do substrato. Um valor α igual a um descreve uma situação na qual o composto liga igualmente bem a enzima livre e o complexo enzima-substrato (tipo inibição não competitiva). Os valores inferiores a um descrevem uma interação na qual o composto liga o complexo enzima-substrato (tipo inibição acompetitiva). Valores superiores a um correspondem à ligação do composto a enzima livre melhor do que ao complexo enzima-substrato (tipo inibição competitiva). O valor β descreve o efeito do modulador na taxa da enzima. Os inibidores têm valores inferiores a um (para um inibidor completo β =0) e os ativadores têm valores superiores a um. KA é a constante de dissociação do composto, Ks é a constante de Michaelis para o substrato e k é a taxa catalítica da enzima. As taxas do estado estacionário foram determinadas a partir do declive da resposta de fluorescência como uma função do tempo, conforme descrito anteriormente (determinação de IC50). Os dados foram representados num gráfico como a dependência da taxa do estado estcionário da concentração do substrato (1,5-diaminopentano) a várias concentrações fixeas do anticorpo e analisados com GraFit.
Anticorpo anti-L0XL2 AB0023 foi determinado como sendo um inibidor não competitivo com base nos seguintes resultados: a = 1, K± = 0,067 e β = 0,5 (ver Figura 10). EXEMPLO 5
Medição cinética da ligação do anticorpo ΆΒ0023 a LOXL2 por ressonância de plasma de superficie A afinidade de ligação e taxa de dissociação de AB0023 foram avaliadas através de ressonância de plasma de superficie (SPR).
As afinidades de ligação foram medidas utilizando um instrumento Bio-Rad ProteOn com termostato a 25°C. As afinidades de ligação foram determinadas utilizando dois métodos, utilizando acoplamento de amina; um no qual o anticorpo foi imobilizado e o antigeno (LOXL2) foi adicionado e outro no qual o antigeno (LOXL2) foi imobilizado e o anticorpo foi adicionado. O anticorpo ou antigeno foi imobilizado num chip GLC utilizando uma razão de 1:1 de NHS para EDC providenciada com o kit d eimobilização ProteOn. O chip foi primeiro ativado com uma mistura NHS/EDC e depois o antigeno ou anticorpo a 1 pg/ml em tampão de acetato pH 4,5 foi fluido sobre a superfície ativada a unir. Isto tipicamente produz um acoplamento de cerca de 500 RU's. A superfície ativada do chip foi depois tapada com a adição de 1M etanolamina. Os chips unidos foram armazenados a 4 °C e regenerados com 50 mM hidróxido de sódio.
As constantes de dissociação foram determinadas sondando o chip acoplado com uma série de diluições do anticorpo ou antigeno em PBST (0,05% Tween-20) . Os adados foram adquiridos em todos os seis canais disponíveis no ProteOn utilizando um canal não acoplado como referência. Os dados recolhidos foram analisados utilizando o programa de gestão ProteOn da Bio-Rad.
Verificou-se que ο AB0023 se liga estreitamente a LOXL2 e se liberta lentamente. Kd foi estimada ser 0,1 -1,0 nM. Além disso, verificou-se que ο AB0023 tem as seguintes características: kon = 1, 68 x 106 M_1s_1, koff = 1,17 x 10_4s_1, KD = 0,69 nM e ti/2 = 98,7 minutos. Ver
Figura 11. EXEMPLO 6 O mapeamento do domínio foi conduzido e verificou-se que ο AB0023 se liga ao domínio SRCR3-4.
Materiais e Métodos
Todas as placas foram obtidas de Corning. O anticorpo secundário e o substrato Pico foram obtidos de Pierce. A peroxidase de raiz-forte (HRP) foi obtida da Sigma. Todos os reagentes ProteOn foram obtidos de Bio-Rad. LOXL2 foi obtida de R&D Systems. Os anticorpos utilizados neste estudo forma produzidos numa Solução de Anticorpo ou através de ascites da Aragen Biosciences. Todos os outros reagentes foram fa qualidade mais elevada possível.
Ligação através de ELISA A ligação do anticorpo a LOXL2 foi determinada utilizando uma ELISA baseada em Luminiscência. Placas
Corning brancas foram revestidas com 0,1 pg/ml de LOXL2 ou antigeno de interesse em 50 mM tampão borato (pH 8,0) durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas utilizando lavador de placa BioTek e bloqueadas com 5% leite magro em PBST (0,05% tween-20) durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBST (0,05% tween-20) e depois utilizadas imediatamente ou armazenadas a 4°C num dissecador para utilização futura. O corpo do anticorpo a ser testado foi diluído em série em PBST (0,01% tween-20) e 100 pL de cada diluição foram adicionados por poço. As placas foram incubadas com artigo teste durante 1 hora à temperatura ambiente e depois lavadas com PBST (0,05% Tween-20). O anticorpo de deteção (conjugado HRP anti-ratinho) foi diluído 16,000 vezes em 5% leite magro em PBST (0,05% Tween-20) e 100 pL foram aplicados por poço. As placas foram incubadas durante 1 hora com o anticorpo de deteção e depois lavadas com PBST (0,05% PBST). O sinal foi detetado utilizando o substrato quimioluminiscente pico de SuperSignal ELISA da Pierce, de acordo com as instruções do fabricante. A luminiscência foi medida utilizando um leitor de placa Molecular Devices M5 com um tempo de integração de 500 ms que captura todos os comprimentos de onda. Os dados foram corrigidos com o fundo e a dependência do sinal de luminiscência da concentração do anticorpo foi ajustada utilizando a Equação isotérmica de Langmuir utilizando o programa GraFit. Nas ocasiões em que a concentração do antigeno foi semelhante à constante de dissociação, foi utilizada a equação quadrática de ligação apertada. Os valores de dissociação reportados foram obtidos dos ajustes a estas equações; onde PL representa o sinal do complexo ligado, Bmax é aquela ligação máxima, KD é a constante de dissociação e L é a concentração do ligando.
Equação isotérmica de Langmuir:
Equação de ligação apertada:
0 AB 0 02 3 foi testado contra MCD-LOXL2, LOXL2 (R&D), SRCR1-2 e SRCR 1-4. Verificou-se que ο AB0023 se liga ao domínio SRCR3-4 (ver Figura 12). EXEMPLO 7
Inibição da migração/invasão no Colagénio I e Colagénio IV e inibição do crescimento celular
Ensaios baseados na célula foram conduzidos para avaliar a ligação do AB0023 para ligar substrato (isto é, colagénio).
Em suma, ο AB0023 foi ampliado a partir de várias amostras antes do teste.
Kits de invasão de células de colagénio I e colagénio IV com 96 poços Cultrex (Trevigen, Gaithersburg, MD) foram utilizados para classificações de sobrenadantes anti-soros / anticorpo. Células 231 MDA MB foram privadas de soro 24 horas antes do ensaio ser montado. No dia de realização do ensaio, as placas revestidas com colagénio I e colagénio IV foram feitas pelo menos 4 horas antes do ensaio de invasão estar montado (não mais de 8 horas antes) . Plascas com colagénio I e colagénio IV foram revestidas, de acordo com as instruções do fabricante. As células foram colocadas em placas a 20,000 células por poço em 95 pis de meios livres de soro na câmara superior da placa. Cento e cinquenta (150) pis de meios contendo 10% FBS e lx L-glutamina foram aliquotados nas câmaras inferiores da placa. Utilizando uma pipeta multicanal, 5 pis de cada anti-soros foi colocada nas câmaras superiores da placa. A mistura de anti-soros e célula foi cuidadosamente misturada para cima e para baixo uma vez com a pipeta. As placas foram incubadas a 37 °C com 5% C02 durante 48 horas.
Após 48 horas, as placas estavam prontas para serem lidas. A solução de dissociação celular contendo calceina AM foi feita, de acordo com as instruções do fabricante. As placas também foram lavadas e desmontadas, de acordo com as instruções do fabricante. 125 pis de solução de dissociação celular contendo calceina AM foi adicionado aos poços das câmaras inferiores e as placas foram colocadas a 37 °C durante 30 minutos. Após 30 minutos os lados das placas foram tocados levemente para soltarem as células e as placas foram colocadas numa incubadora por mais 30 minutos a 37 °C. As placas foram depois desmontadas e a placa inferior foi colocada num leitor de placa (SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, Ca) com as definições: Fluorescência, emissão 485-520, leitura do topo, placa opaca negra, sensibilidade a 30. A inibição de migração/invasão consistente foi observada no colagénio I (Figura 13) e colagénio IV, dos supematentes através de 10 ml material de preparação e ampliado para 100 ml preparações e ascites.
Ensaios de adesão celular Células MDA-MB231 foram colocadas em placas com 15 cm2 e crescidas em 4,5g/L glicose contendo DMEM (10% FBS e 2 mM L-Glutamina) para que fossem confluentes no dia do ensaio. Os meios foram aspirados e as células foram lavadas 2 vezes com 10 ml 1 mM EDTA PBS por placa. As células fram removidas das placas incubando com outros 10 ml 1 mM EDTA PBS durante 5 minutos a 37 °C num armário de biossegurança e pipetando, subsequentemente, as células para for a da placa numa solução EDTA PBS. A concentração das células foi determinada e foram giradas células suficientes para o ensaio (50k/poço mais extra para pipetagem) em tubos cónicos de 15 ml. A bola de células foi dispersa em DMEM livre de soro pré-aquecido para 500K células/ml e foi adiiconado CuCl2 a uma concentração final de 1 μΜ. Cem (100) μΐ/poço de suspensão celular foi pipetada para uma placa de cultivo de tecidos com 96 poços com fundo estilo U contendo 10 μΐ de diluição de mAb apropriada. A mistura da suspensão celular/mAb foi deixada incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente na escuridão. Cem (100) μΐ/poço da mistura de células ressuspensas/mAb foi depois transferido para placas com 96 poços revestidas com colagénio IV (BD Biocoat, BD Biosciences) . As placas foram incubadas a 37 °C num armário de biossegurança durante 1 hora. Os poços foram depois aspirados e lavados gentilmente duas vezes com 200 μΐ DPBS (Mediatech) para remover as células que não aderiram. Cem (100) μΐ de concentração final de 10 μΜ Calceína-AM (BD Biosciences) em DPBS foi depois adicionado a cada poço para corar as células que permaneceram. As placas foram incubadas a 37 °C num armário de biossegurança durante 1 hora. As placas foram lidas num leitor de placa Molecular Devices M5 a 494/517 (excitação/emissão). A percentagem (%) de adesão foi calculada normalizando para controlos PBS ou anticorpo não relacionados.
Utilizando este ensaio, foi observada a inibição parcial da adesão no momento da exposição das células ao anticorpo AB0023.
Crescimento celular
Anticorpos anti-LOXL2 inibiram o crescimento celular de quatro linhas celulares: 231 é uma linha de células cancerígenas da mama, BT549 é uma linha de células cancerígenas da mama, HT1080 é um fibrossarcoma e BxPC3 é uma linha de células cancerígenas da próstata (Figura 17). Assim, o anticorpo é eficaz na inibição do crescimento de cancros com diferentes origens. EXEMPLO 8
Inibição de ΆΒ0023 de alteração tipo EMT
Alterações epiteliais a mesenquimatosas foram avaliadas utilizando imunohistoquímica.
Para detetar se uma célula está num estado EMT ou de transição mesenquimatoso-para-epitelial (MET), as células foram coradas com anticorpos específicos de marcadores proteicos celulares para estados epiteliais ou mesenquimatosos, tais como E-caderina, vimentina, fibronectina e faloidina para detetar F-actina.
Protocolo de coloração de rodamina faloidina
As células foram semeadas 24 horas antes do dia da coloração; as células eram aproximadamente 80% confluentes 24 horas depois numa lâmina com 8 câmaras. No dia seguinte, os meios foram aspirados e as câmaras foram enxaguadas com IX PBS. As células foram depois fixas com 4%
Paraformaldeido (PFA) durante 20 minutos à temperatura ambiente e depois enxaguadas uma vez com IX Solução salina tamponada com fosfato (PBS). Para permeabilização, as células foram tratadas com 0,5 % Saponina (JT Baker,
Phillipsburg, NJ) em PBS durante 5 minutos à temperatura ambiente. As câmaras foram enxaguadas cuidadosamente uma vez com IX PBS e uma diluição de 1:100 de rodamina faloidina (Invitrogen, Carlsbad, Ca) em PBS foi adicionada às células e incubada durante 15 minutos à temperatura ambiente. As câmaras foram enxaguadas duas vezes com IX PBS e as lâminas foram montadas com Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
Protocolo de coloração de E-Caderina
As células foram semeadas 24 horas antes do dia da coloração; as células eram aproximadamente 80% confluentes no dia seguinte numa lâmina com 8 câmaras. No dia seguinte, os meios foram aspirados e as câmaras foram enxaguadas com IX PBS. As células foram depois fixas com metanol gelado e depois incubadas durante 2 minutos a -20 °C. As células foram enxaguadas uma vez com IX PBX e 1 pg/ml de E-caderina Ab (Calbiochem, Gibbstown, NJ) foi adicionado às câmaras da lâmina. As lâminas foram depois incubadas a 37 °C durante 1 hora. Depois de enxaguar cuidadosamente as câmaras uma vez com IX PBS, o Ab secundário (conjugado IgG cy3 anti-ratinho, Jackson Immuno Research, West Grove, Pa) foi adicionado e incubado à temperatura ambiente durante 30-45 minutos. As câmaras foram enxaguadas duas vezes com IX PBS e montadas com Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
Meios condicionados de células HS-578t (elevada L0XL2) aplicados a células MCF-7 (baixa L0XL2/negativas). Células foram coradas com rodamina-faloidina (F-actina, vermelho) e Dapi (núcleos, azul).
Verificou-se que AB0023 inibe alterações tipo EMT induzidas pelos meios condicionados de células tumorais que expressam L0XL2 (dados não mostrados). EXEMPLO 9
Anticorpo anti-L0XL2 AB0023 liga-se a L0XL2 associada a matriz.
Estudos de internalização e captação de Ab em células Hs578t.
Células Hs578t foram cultivadas em DMEM contendo 10% FBS e lx glutamina. As células foram semeadas numa lâmina de vidro com 8 câmaras (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) e permitidas aderir durante a noite. Para baixa confluência, as células foram semeadas a 30-40,000 células por lâmina. A baixa confluência foi utilizada para deteção de Lox no citosol 24 horas mais tarde. Para elevada confluência, as células foram semeadas a 100,000 células por lâmina. A elevada confluência foi utilizada para deteção de Lox associada com a matriz e colagénio aproximadamente 48-72 horas mais tarde.
No dia seguinte, 1 pg/ml (concentração final no meio de crescimento regular) de Ab monoclonal M20 anti-Lox M64 ou anti-Loxl2 (mAb) foi adicionado às câmaras. Para captação continua, os mAbs foram incubados com células em diferentes pontos temporais: por exemplo, 3 horas, 8 horas ou 24 horas (durante a noite) . Depois de quantidade apropriada de captação continua, os meios foram removidos e as câmaras foram enxaguadas com IX PBS. As células foram fixas em 4% PFA (paraformaldeido) à temperatura ambiente durante 20 minutos. Após fixação, as células foram lavadas com IX PBS à temperatura ambiente durante 5 minutos e depois extintas em 50 mM cloreto de amónio à temperatura ambiente durante 10 minutos. As células foram lavadas de novo com IX PBS à temperatura ambiente durante 5 minutos.
As células foram permeabilizadas adicionando tampão de saponina (0,5% Saponina/1% BSA en PBS) à temperatura ambiente durante 20 minutos. O Ab de deteção secundário (IgG anti-ratinho de burro Alexa Fluor 488, Invitrogen, Carlsbad, CA) foi adicionado à temperatura ambiente em tampão de saponina e as células foram incubadas durante 30-45 minutos. As células foram depois lavadas 3X em tampão de saponina. As lâminas foram montadas com vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
Para deteção da deteção de colagénio, as células foram incubadas com anticorpo anti-colagénio (1:50, Calbiochem anti-colagénio tipo I coelho policlonal, Gibbstown, NJ) , uma hora antes de fixar as células com 4% PFA. O Ab secundário para colagénio utilizado é Cy3 de burro anti-coelho (ImmunoJackson Labs, West Grove, PA). A análise por imunoblot e imunofluorescência (dados não mostrados) indicou que a LOXL2 era predominantemente intracelular e baixa densidade, mas era segregada a elevada densidade celular (células confluentes). LOXL2 foi detetada nos meios de células confluentes e também na matriz extracelular. A imunofluorescência em células vivas indicou que AB0023 ligou LOXL2 associado com a matriz de colagénio. EXEMPLO 10
Anticorpo Anti-LOX M64 liga LOX A atividade do anticorpo anti-LOX M64 foi avaliada sobre concentrações crescentes de 1,5 DAP e sobre concentrações crescentes de anticorpo (ver Figura 15). Materiais e Métodos
Todas as placas foram obtidas de Corning. O anticorpo secundário e substrato Pico foram de Pierce. Reagente vermelho Amplex foi de Invitrogen. A peroxidase de raíz-forte (HRP), 1,5-diaminopentano, anti-espuma foram de Sigma Todos os reagentes ProteOn foram de Bio-Rad. LOX foi produzido internamente em Arresto Biosciences. Os anticorpos utilizados neste estudo foram produzidos em solução de Anticorpo ou através de ascites (ase) da Aragen Biosciences. Todos os outros reagentes foram da qualidade mais alta possível.
Ligação por ELISA A ligação do anticorpo a LOX foi determinada utilizando uma ELISA baseada em luminiscência. Placas Corning brancas foram revestidas com 0,1 ug/ml de LOX ou antígeno de interesse em 50 mM tampão borato (pH 8,0) durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas utilizando um lavador de placas BioTek plate e bloqueadas com 5% leite magro em PBST (0,05% tween-20) durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBST (0,05% tween-20) e depois utilizadas imediatamente ou armazenadas a 4°C num dissecador para utilização futura. O anticorpo a ser testado foi diluído em série em PBST (0,01% tween-20) e 100 uL de cada diluição foram adicionados por poço. As placas foram incubadas com material teste durante 1 hora à temperatura ambiente e depois lavadas com PBST (0,05% tween-20). O anticorpo de deteção (conjugado HRP anti-ratinho) foi diluído 16000 vezes em 5% leite magro em PBST (0,05% tween-20) e 100 uL foram aplicados por poço. As placas foram incubadas durante 1 hora com o anticorpo de deteção e depois lavadas com PBST (0,05% PBST) . O sinal foi detetado utilizando o substrato quimioluminiscente pico SuperSignal ELISA da Pierce, de acordo com as instruções do fabricante. A luminiscência foi medida utilizando um leitor de placa Molecular Devices M5 com um tempo de integração de 500 ms que captura todos os comprimentos de onda. Os dados foram corrigidos pelo fundo e a dependência do sinal de luminiscência da concentração do anticorpo foi ajustada utilizando a Equação isotérmica de Langmuir utilizando o programa GraFit. Nas ocasiões em que a concentração do antigeno foi semelhante à constante de dissociação, foi utilizada a equação quadrática de ligação apertada. Os valores de dissociação reportados foram obtidos dos ajustes a estas equações; onde PL representa o sinal do complexo ligado, Bmax é aquela ligação máxima, KD é a constante de dissociação e L é a concentração do ligando.
Equação isotérmica de Langmuir
Equação isotérmica de Langmuir:
Equação de ligação apertada:
0 anticorpo anti-LOX M64 foi testado em três lotes e verificou-se que tinha uma KD de 6,6 nM, 5,0 nM e 5,7 nM para o Lote 3, Lote 4 e Lote 5, respetivamente (Figura 15). EXEMPLO 11
Medição cinética do anticorpo M64 que se liga a LOX por Ressonância de plasma de superfície A afinidade de ligação de M64 foi avaliada por pessonância de plasma de superfície (SPR).
As afinidades de ligação foram medidas utilizando um instrumento ProteOn Bio-Rad com termostato a 25 °C. As afinidades de ligação foram determinadas utilizando dois métodos, utilizando acoplamento de amina; um no qual o anticorpo foi imobilizado e o antigeno (LOX) foi adicionado e outro no qual o antigeno (LOX) foi imobilizado e foi adicionado anticorpo. Anticorpo ou antigeno foi imobilizado num chip GLC utilizando uma razão 1:1 de NHS para EDC providenciada com o kit de imobilização ProteOn. O chip foi primeiro ativado com NHS/EDC uma mistura e depois antigeno ou anticorpo a 1 pg/ml em tampão acetato pH 4,5 foi fluído sobre superfície ativada para unir. Isto produziu tipicamente um acoplamento de cerca de 500 RU's. A superfície do chip ativada foi depois tapada com a adição de 1M etanolamina. Os chips unidos foram armazenados a 4°C e regenerados com 50 mM hidróxido de sódio.
As constantes de dissociação foram determinadas sondando o chip unido com uma série de diluição de anticorpo ou antígeno em PBST (0,05% tween-20). Os dados foram adquiridos em todos os seis canais disponíveis no ProteOn utilizando um canal não unido como uma referência. Os dados recolhidos foram analisados utilizando o software de gestão ProteOn da Bio-Rad.
Verificou-se que ο M64 tinha uma KD de 7 nM (Figura 16) . EXEMPLO 12 A seguir está uma listagem de sequências descritas ao longo da especificação.
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • WO 0044910 A [0011] • US 2007021365 A [0011] • WO 0183702 A [0071] • US 20070065858 A [0085] • US 5631169 A, Lakowicz [0097] • US 4868103 A, Stavrianopoulos [0097] • US 4843155 A, Chomczynski [0100] • US 4683202 A, Mullis [0103] • US 5854033 A, Lizardi [0103] • US 20050238646 A [0136] • EP 404097 A [0143] • WO 9311161 A [0143] • WO 9308829 A [0145] • WO 9627011 A [0147] • US 4676980 A [0153] • WO 9100360 A [0153] • WO 92200373 A [0153] • US 4816567 A [0158] • US 5545807 A [0159] • US 5545806 A [0159] • US 5569825 A [0159] • US 5625126 A [0159] • US 5633425 A [0159] • US 5661016 A [0159] • US 4997854 A [0249] [0430] • US 20040248871 A [0249] • US 5646185 A [0250] • US 4101435 A [0266] • US 4452773 A [0266] • US 20020064502 A [0266] • US 20020136693 A [0266] • US 4831175 A [0270] • US 4454106 A [0270] • US 4472509 A [0270] • WO 9812156 A, Jacobsen [0275] • US 5391377 A [0305] • US 4235871 A [0308] • US 4501728 A [0308] • US 4522811 A [0308] • US 4837028 A [0308] • US 6110490 A [0308] • US 6096716 A [0308] • US 5283185 A [0308] • US 5279833 A [0308] • US 4485045 A [0310] • US 4544545 A [0310] • US 5013556 A [0310] • US 3773919 A [0314] • US 5674693 A [0389] • US 4965288 A, Palfreyman [0430] • US 4943593 A, Palfreyman [0430] • US 5021456 A [0430] • US 55059714 B [0430] • US 5120764 A [0430] • US 5182297 A [0430] • US 5252608 A [0430]
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Lisboa, 25 de Março de 2015

Claims (19)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo que se liga a uma proteína lisil oxidase-tipo 2 (L0XL2), em que dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno se liga especificamente à sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 6 e inibe a atividade enzimática da proteína L0XL2, em que a inibição é não competitiva.
  2. 2. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da reivindicação 1, em que o anticorpo ou fragmento compreende uma cadeia pesada variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID N.° 1.
  3. 3. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o anticorpo ou fragmento compreende uma cadeia leve variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID N. 0 2.
  4. 4. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno é humanizado ou humano.
  5. 5. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da reivindicação 4, em que o anticorpo ou fragmento é humanizado e compreende CDRs de cadeia pesada variável com sequências de aminoácidos CDR1-3 de GYAFTYYLIE (SEQ. ID N.° 41), VINPGSGGTNYNEKFKG (SEQ. ID N.° 42) e NWMNFDY, respetivamente, e CDRs de cadeia leve variável com CDR1-3 sequências de aminoácidos de RSSKSLLHSNGNTYLY (SEQ. ID N.° 57), RMSNLAS (SEQ. ID N.° 58) e MQH-LEYPYT (SEQ. ID N.° 59), respetivamente.
  6. 6. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da reivindicação 4 ou 5, em que o anticorpo ou fragmento é humanizado e tem uma cadeia pesada variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID N.° 25, 26, 27 ou 28.
  7. 7. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da reivindicação 6, em que a cadeia pesada variável compreende a SEQ. ID N.° 27.
  8. 8. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 4-7, em que o anticorpo ou fragmento é humanizado e tem uma cadeia leve variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID N.° 30, 31 ou 32.
  9. 9. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da reivindicação 8, em que a cadeia leve variável compreende a SEQ. ID N.° 31.
  10. 10. Um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, que compete com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo compreendendo uma cadeia pesada variável com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID N.° 1 e uma cadeia leve variável com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID N.° 2 para ligação ao LOXL2.
  11. 11. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-10, em que o anticorpo ou fragmento é rotulado com um rótulo terapêutico ou com um rótulo diagnóstico.
  12. 12. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-11, em que o anticorpo ou fragmento é rotulado com um rótulo detetável.
  13. 13. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-12, em que o anticorpo ou fragmento é um Fv, um scFv, um Fab, um F(ab')2, um anticorpo fabricado por engenharia genética ou um anticorpo monoclonal.
  14. 14. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-13, para utilização num método para reduzir o crescimento tumoral, reduzir a metástase, inibir a angiogénese, tratar fibrose ou diminuir a formação de matriz extracelular.
  15. 15. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo para utilização num método de acordo com a reivindicação 14, em que dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo é utilizado em combinação com um segundo agente terapêutico.
  16. 16. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo para utilização num método de acordo com a reivindicação 15, em que o segundo agente terapêutico é um anticorpo ou um agente quimioterapêutico.
  17. 17. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo para utilização num método de acordo com a reivindicação 14, em que dita fibrose é uma fibrose hepática, uma fibrose pulmonar, uma fibrose renal, uma fibrose cardíaca ou escleroderma.
  18. 18. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para utilização num método de acordo com a reivindicação 17, em que dita fibrose pulmonar é fibrose pulmonar idiopática (IPF), alveolite fibrosante criptogénica, pneumonia intersticial fibrosante crónica, doença pulmonar intersticial (ILD), doença difusa do parênquima pulmonar (DPLD), enfisema, doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD) ou asma crónica.
  19. 19. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para utilização num método de acordo com a reivindicação 17, em que dita fibrose hepática é cirrose, hepatite virai crónica, doença hepática gorda não alcoólica (NAFLD), esteato-hepatite alcoólica (ASH), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), cirrose biliar primária (PBC), cirrose biliar ou hepatite autoimune. Lisboa, 25 de Março de 2015
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