PT2142905E - Biomarker normalization - Google Patents

Description

ΡΕ2142905 1 DESCRIÇÃO "NORMALIZAÇÃO DE MARCADOR BIOLÓGICO"ΡΕ2142905 1 DESCRIPTION " STANDARDIZATION OF BIOLOGICAL MARKER "

ANTECEDENTES 1. Domínio da Invenção O domínio da invenção refere-se em geral a medições de osmolaridade e, mais particularmente, a sistemas e métodos para calibrar os dispositivos de medição da osmolaridade da película de lágrima. 2. Informação dos antecedentesBACKGROUND 1. Field of the Invention The field of the invention relates generally to osmolarity measurements and, more particularly, to systems and methods for calibrating the osmolarity measuring devices of the tear film. 2. Background information

As lágrimas desempenham um papel essencial na manutenção da integridade da superfície ocular, protegendo contra desafios microbianos e preservando a acuidade visual. Por sua vez, estas funções dependem de maneira crítica da composição e estabilidade da estrutura da película de lágrima que inclui uma fundação subjacente de mucina, um componente médio aquoso e uma camada lipídica superior. A interrupção, deficiência ou ausência da película de lágrima pode prejudicar gravemente o olho. Se não forem controladas com substitutos de lágrima artificial ou terapia de conservação da película de lágrima, estes distúrbios podem conduzir à secura intratável do epitélio 2 ΡΕ2142905 da córnea, ulceração e perfuração da córnea e maior incidência de doenças infecciosas e, finalmente, dificuldades visuais pronunciadas e cegueira. A queratoconjuntivite seca (QCS) ou "olho seco", é uma condição em que um, ou mais, dos atrás referidos componentes da estrutura da pelicula de lágrima está presente em volume insuficiente ou, de outro modo, está em desequilíbrio com os outros componentes. Sabe-se que a tonicidade ou osmolaridade fluida das lágrimas aumenta em pacientes com QCS. A QCS está associada a condições que afectam a saúde geral do corpo, tal como a sindrome de Sjogren, envelhecimento e deficiência androgénica. Portanto, a osmolaridade de uma pelicula de lágrima pode ser um indicador sensivel e especifico para o diagnóstico da QCS e de outras condições. A osmolaridade de uma amostra de fluido (por exemplo, uma lágrima) pode ser determinada por uma técnica ex vivo chamada "depressão de ponto de congelação" na qual solutos ou iões num solvente (isto é, água), provocam um abaixamento do ponto de congelação do fluido a partir do qual ficará sem iões. Na análise de depressão do ponto de congelação, o ponto de congelação da amostra de fluido ionizado é descoberto detectando a temperatura à qual uma quantidade da amostra (tipicamente da ordem de cerca de vários mililitros) começa primeiro a congelar num recipiente (por exemplo, um tubo) . Para medir o ponto de congelação, um volume da amostra de fluido é recolhido num 3 ΡΕ2142905 recipiente, tal como um tubo. Seguidamente, uma sonda de temperatura é imersa na amostra de fluido e o recipiente é colocado em contacto com um banho de congelação ou dispositivo de arrefecimento de Peltier. A amostra é conti-nuamente agitada de maneira a se conseguir um estado liquido super arrefecido abaixo do seu ponto de congelação. Ao ser submetida a indução mecânica, a amostra solidifica, aumentando o seu ponto de congelação devido ao calor termodinâmico da fusão. 0 desvio do ponto de congelação da amostra de 0°C é proporcional ao nivel de soluto na amostra de fluido. Este tipo de dispositivo de medição é por vezes designado como sendo um osmómetro.Tears play an essential role in maintaining the integrity of the ocular surface, protecting against microbial challenges and preserving visual acuity. In turn, these functions depend critically on the composition and stability of the tear film structure which includes an underlying mucin foundation, an aqueous medium component and a higher lipid layer. Disruption, deficiency or absence of tear film can severely damage the eye. If not controlled with artificial tear substitutes or tear film preservation therapy, these disorders may lead to intractable dryness of corneal epithelium 2 ΡΕ2142905, corneal ulceration and perforation, and increased incidence of infectious diseases, and finally pronounced visual difficulties and blindness. Dry keratoconjunctivitis (QCS) or " dry eye " is a condition where one or more of the aforementioned components of the tear film structure is present in insufficient volume or otherwise imbalanced with the other components. It is known that fluid tonicity or osmolality of tears increases in patients with QCS. QCS is associated with conditions that affect the general health of the body, such as Sjogren's syndrome, aging and androgen deficiency. Therefore, the osmolarity of a tear film can be a sensitive and specific indicator for the diagnosis of QCS and other conditions. The osmolarity of a fluid sample (e.g., a tear) can be determined by an ex vivo technique called " freezing point depression " in which solutes or ions in a solvent (i.e., water) causes a lowering of the freezing point of the fluid from which it will be free of ions. In the freezing depression analysis, the freezing point of the ionized fluid sample is detected by detecting the temperature at which a sample amount (typically in the range of about several milliliters) first begins to freeze in a vessel (for example, a pipe) . To measure the freezing point, a volume of the fluid sample is collected in a 3 ΡΕ2142905 vessel, such as a tube. Thereafter, a temperature probe is immersed in the fluid sample and the vessel is brought into contact with a freezing bath or peltier cooling device. The sample is continuously stirred so as to achieve a supercooled liquid state below its freezing point. When subjected to mechanical induction, the sample solidifies, increasing its freezing point due to the thermodynamic heat of the melting. The freezing point deviation of the 0 ° C sample is proportional to the solute level in the fluid sample. This type of metering device is sometimes referred to as an osmometer.

Presentemente, as medições de depressão do ponto de congelação são efectuadas ex vivo retirando-se amostras de lágrima do olho usando uma micropipeta ou tubo capilar e medindo a depressão do ponto de congelação que resulta da maior osmolaridade. Contudo, estas medições ex vivo acarretam frequentemente muitas dificuldades. Por exemplo, para efectuar a análise da depressão do ponto de congelação da amostra de lágrima, deve ser recolhido um volume relativamente grande, tipicamente da ordem dos 20 microlitros (pL) de uma pelicula de lágrima. Como não se consegue obter de um paciente com QCS mais do que cerca de 10 até 100 nanolitros (nL) de amostra de lágrima de uma só vez, a recolha de quantidades suficientes de fluido para técnicas convencionais ex vivo exige que o médico induza lágrimas reflexas ao paciente. As lágrimas reflexas são provocadas por uma irritação aguda ou prolongada da superfície ocular, 4 ΡΕ2142905 semelhante a quando um grande pedaço de pó fica alojado no olho de alguém. As lágrimas reflexas são mais diluídas, isto é, têm menos iões de soluto do que as lágrimas que são normalmente descobertas no olho. Qualquer diluição da película de lágrima invalida a capacidade de diagnóstico de um teste de osmolaridade para o olho seco e, portanto, tornam os actuais métodos ex vivo proibitivos num ambiente clínico.At present, freezing point depression measurements are made ex vivo by tear samples from the eye using a micropipet or capillary tube and measuring the depression of the freezing point resulting from the higher osmolarity. However, these ex vivo measurements often entail many difficulties. For example, to perform freezing depression analysis of the tear sample, a relatively large volume, typically on the order of 20 microliters (æl) of a tear film, should be collected. Because no more than about 10 to 100 nanoliters (nL) of tear sample can be obtained from a patient with QCS at one time, collecting sufficient amounts of fluid for conventional ex-vivo techniques requires the physician to induce reflex tears to the patient. Reflex tears are caused by acute or prolonged irritation of the ocular surface, 4 ΡΕ2142905 similar to when a large piece of dust is lodged in someone's eye. The reflex tears are more diluted, that is, they have fewer solute ions than the tears that are normally discovered in the eye. Any dilution of the tear film invalidates the diagnostic ability of an osmolarity test for the dry eye and therefore makes the ex vivo methods prohibitive in a clinical setting.

Uma técnica similar ex vivo é a osmometria por pressão de vapor, onde um pequeno pedaço circular de papel de filtro é alojado por baixo da pálpebra de um paciente até ser absorvido fluido suficiente. O disco de papel de filtro é colocado numa câmara selada, após o que um sensor de temperatura arrefecido mede a condensação de vapor à sua superfície. Finalmente, o sensor de temperatura é elevado até ao ponto de orvalho da amostra. A redução do ponto de orvalho proporcional à de água é então convertida em osmolaridade. Devido à indução das lágrimas reflexas e à necessidade de um grande volume, os actuais osmómetros de pressão de vapor não são actualmente práticos para a determinação do olho seco. 0 Clifton Nanoliter Osmometer (comercializado pela Clifton Technical Physics de Hartford, N.Y., EUA) tem sido usado extensivamente em ambientes laboratoriais para quantificar as concentrações de soluto de pacientes com QCS, mas é preciso bastante treino para trabalhar com a máquina. Em geral exige calibrações de uma hora e um 5 ΡΕ2142905 técnico experimentado para gerar dados aceitáveis. 0 Clifton Nanoliter Osmometer também é volumoso e relativamente caro. Estas caracteristicas fazem com que se evite usá-lo como osmómetro clinico.A similar ex vivo technique is steam pressure osmometry where a small circular piece of filter paper is housed under a patient's eyelid until sufficient fluid is absorbed. The filter paper disc is placed in a sealed chamber, whereafter a cooled temperature sensor measures the condensation of steam to its surface. Finally, the temperature sensor is raised to the dew point of the sample. The reduction of the dew point proportional to that of water is then converted to osmolarity. Due to the induction of the reflex tears and the need for a large volume, current vapor pressure osmometers are not currently practical for the determination of dry eye. Clifton Nanoliter Osmometer (marketed by Clifton Technical Physics of Hartford, N.Y., USA) has been used extensively in laboratory environments to quantify the solute concentrations of patients with QCS, but it requires considerable training to work with the machine. In general it requires one-hour calibrations and a 5 ΡΕ2142905 experienced technician to generate acceptable data. The Clifton Nanoliter Osmometer is also bulky and relatively expensive. These characteristics make it avoid using it as a clinical osmometer.

Em contraste com as técnicas ex vivo que medem a osmolaridade das amostras de lágrima removidas da superfície ocular, uma técnica in vivo que tentou medir a osmolaridade directamente sobre a superfície ocular usou um par de eléctrodos flexíveis que foram colocados directamente por baixo da pálpebra do paciente. Os eléctrodos foram então ligados a um medidor LCR para determinar a condutividade do fluido que os rodeava. Enquanto já se sabe há muito que a condutividade está directamente relacionada com a concentração iónica, e daí com a osmolaridade das soluções, é muito natural que a colocação do sensor sob a pálpebra durante meio minuto induza lágrimas reflexas. Além disso, estes eléctrodos eram difíceis de fabricar e aumentaram os riscos para a saúde do paciente, em comparação com a simples recolha de lágrimas com um capilar. O pedido US 2006/0107729 mostra outro exemplo de um sistema de medição da osmolaridade das lágrimas.In contrast to ex vivo techniques that measure the osmolarity of tear samples removed from the ocular surface, an in vivo technique that attempted to measure osmolarity directly on the ocular surface used a pair of flexible electrodes that were placed directly beneath the patient's eyelid . The electrodes were then connected to an LCR meter to determine the conductivity of the surrounding fluid. While it has long been known that conductivity is directly related to ionic concentration, and hence with the osmolarity of solutions, it is very natural that placing the sensor under the eyelid for half a minute will induce reflex tears. In addition, these electrodes were difficult to manufacture and increased the risks to the patient's health compared to simply collecting tears with a capillary. US 2006/0107729 shows another example of a tear osmolarity measurement system.

Do que acima foi dito deve tornar-se aparente que as actuais técnicas de medição da osmolaridade não estão disponíveis num ambiente clínico e não podem atingir os volumes necessários para pacientes com olho seco. Assim, há necessidade de uma forma melhor de medição da osmolaridade à escala dos nanolitros que seja clinicamente possível. A 6 ΡΕ2142905 presente invenção satisfaz esta necessidade. As lágrimas desempenham um papel essencial na manutenção da integridade da superfície ocular, protegendo contra ataques microbianos e na preservação da acuidade visual. Estas funções, por sua vez, dependem de maneira crítica da composição e estabilidade da estrutura da película de lágrima, que inclui uma fundação subjacente de mucina, um componente médio aquoso e uma camada lipídica superior. A interrupção, deficiência ou ausência da película de lágrima pode ser gravemente prejudicial ao olho.From what has been said above it should be apparent that current osmolarity measurement techniques are not available in a clinical setting and can not achieve the volumes required for dry eye patients. Thus, there is a need for a better way of measuring the osmolality at the scale of the nanoliters that is clinically possible. The present invention satisfies this need. Tears play an essential role in maintaining the integrity of the ocular surface, protecting against microbial attacks and preserving visual acuity. These functions, in turn, critically depend on the composition and stability of the tear film structure, which includes an underlying mucin foundation, an aqueous medium component and a higher lipid layer. Disruption, deficiency, or absence of the tear film can be seriously damaging to the eye.

SUMÁRIOSUMMARY

De acordo com a invenção, uma amostra de fluido é medida com um sistema de medição da película de lágrima tal como é definido na reivindicação 1.According to the invention, a sample of fluid is measured with a tear film measuring system as defined in claim 1.

Estas e outras características, aspectos e modelos de realização da invenção estão a seguir descritos na secção intitulada "Descrição Pormenorizada".These and other features, aspects and embodiments of the invention are described below in the section entitled " Detailed Description ".

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOSBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

As características, aspectos e modelos de realização das invenções estão descritas em conjunto com os desenhos em anexo, nos quais: A FIGURA 1 ilustra um chip para receber uma amostra do tamanho de uma alíquota para medir a osmolaridade de uma amostra de fluido; 7 ΡΕ2142905 A FIGURA 2 ilustra um modelo de realização alternativo de um chip para receber uma amostra que inclui uma região de circuitos com uma disposição de eléctrodos impressos por técnicas fotolitográficas; A FIGURA 3 ilustra outro modelo de realização alternativo do chip da FIGURA 1, onde uma região de circuitos inclui eléctrodos impressos dispostos numa pluralidade de círculos concêntricos; A FIGURA 4 é uma vista de topo do chip apre sentado na FIGURA 2; A FIGURA 5 é uma vista de topo do chip apre sentado na FIGURA 3; A FIGURA 6 é um diagrama de bloco de um sistema de medição da osmolaridade configurada de acordo com a presente invenção; A FIGURA 7 é uma vista em perspectiva de um sistema de medição da osmolaridade construído de acordo com a presente invenção; A FIGURA 8 é uma vista lateral do chip que recebe a amostra mostrando a abertura na embalagem exterior; A FIGURA 9 é uma curva de calibração relativa ao 8 ΡΕ2142905 teor em sódio da amostra de fluido com condutividade eléctrica; A FIGURA 10 ilustra uma unidade de base articulada do osmómetro que utiliza os chips que recebem a amostra descritos nas FIGURAS 1-5; A FIGURA 11 ilustra uma configuração em cartão sonda do chip que recebe a amostra e da unidade de processamento; A FIGURA 12 é um fluxograma que descreve uma técnica exemplar para a medição da osmolaridade de acordo com a invenção; A FIGURA 13 é um fluxograma que ilustra um método para calibrar um sistema de medição da osmolaridade de acordo com outro exemplo de modelo de realização da invenção; A FIGURA 14 é um fluxograma que ilustra um método para calibrar um sistema de medição da osmolaridade de acordo com outro exemplo de modelo de realização da invenção; A FIGURA 15 é um fluxograma que ilustra um método para calibrar um sistema de medição da osmolaridade de acordo com outro exemplo de modelo de realização da invenção; 9 ΡΕ2142905 A FIGURA 16 é uma imagem que mostra cristais de sal residual numa matriz de microeléctrodos; A FIGURA 17 é um fluxograma que ilustra uma resposta tipica quando uma amostra de fluido é introduzida numa matriz de microeléctrodos; A FIGURA 18 é um fluxograma que ilustra uma resposta quando uma amostra de fluido é introduzida numa matriz de microeléctrodos que contém sal residual; e A FIGURA 19 é um fluxograma que ilustra um método para calibrar um sistema de medição da osmolaridade de acordo com outro exemplo de modelo de realização da invenção . A FIGURA 20 é um fluxograma que ilustra a normalização de um marcador biológico de acordo com a invenção. A FIGURA 21 é uma vista em plano de um substrato de recepção em que a osmolaridade é multiplexada no espaço com a detecção de MARCADOR BIOLÓGICO. A FIGURA 22 é uma vista pormenorizada do substrato de recepção da FIGURA 21 apresentado o arranjo dos eléctrodos na amostra de zona. 10 ΡΕ2142905The features, aspects and embodiments of the inventions are described in conjunction with the accompanying drawings, in which: FIGURE 1 illustrates a chip for receiving an aliquot size sample for measuring the osmolarity of a fluid sample; FIGURE 2 shows an alternative embodiment of a chip for receiving a sample including a region of circuits with an electrode array printed by photolithographic techniques; FIGURE 3 illustrates another alternative embodiment of the chip of FIGURE 1, wherein a region of circuits includes printed electrodes arranged in a plurality of concentric circles; FIGURE 4 is a top view of the chip shown in FIGURE 2; FIGURE 5 is a top view of the chip shown in FIGURE 3; FIGURE 6 is a block diagram of an osmolarity measuring system configured in accordance with the present invention; FIGURE 7 is a perspective view of an osmolarity measuring system constructed in accordance with the present invention; FIGURE 8 is a side view of the chip receiving the sample showing the opening in the outer carton; FIGURE 9 is a calibration curve relative to 8 ΡΕ2142905 sodium content of the fluid sample with electrical conductivity; FIGURE 10 illustrates an osmometer hinged base unit utilizing the sample receiving chips described in FIGURES 1-5; FIGURE 11 illustrates a probe card configuration of the chip receiving the sample and the processing unit; FIGURE 12 is a flowchart describing an exemplary technique for measuring the osmolarity according to the invention; FIGURE 13 is a flowchart illustrating a method for calibrating an osmolarity measurement system in accordance with another exemplary embodiment of the invention; FIGURE 14 is a flow chart illustrating a method for calibrating an osmolarity measurement system in accordance with another exemplary embodiment of the invention; FIGURE 15 is a flowchart illustrating a method for calibrating an osmolarity measurement system in accordance with another exemplary embodiment of the invention; FIGURE 16 is an image showing residual salt crystals in a microelectrode array; FIGURE 17 is a flow chart illustrating a typical response when a sample of fluid is introduced into a microelectrode array; FIGURE 18 is a flowchart illustrating a response when a sample of fluid is introduced into a microelectrode array containing waste salt; and FIGURE 19 is a flow chart illustrating a method for calibrating an osmolarity measurement system according to another exemplary embodiment of the invention. FIGURE 20 is a flowchart illustrating normalization of a biological marker according to the invention. FIGURE 21 is a plan view of a receiving substrate in which the osmolarity is multiplexed in space with the detection of BIOLOGICAL MARKER. FIG. 22 is a detailed view of the receiving substrate of FIG. 21 showing the arrangement of the electrodes in the zone sample. 10 ΡΕ2142905

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA São descritos modelos de realização exemplares para medir a osmolaridade de uma aliquota de uma amostra de fluido (por exemplo, pelicula de lágrima, suor, sangue ou outros fluidos). Os modelos de realização exemplares são configurados para serem relativamente rápidos, não invasi-vos, baratos e fáceis de usar, com riscos mínimos para o paciente. Podem ser fornecidas medições precisas com tão pouco quanto volumes em nanolitros de uma amostra de fluido. Por exemplo, um dispositivo de medição configurado de acordo com a invenção permite medir a osmolaridade com não mais do que 200 pL de amostra de fluido e, tipicamente, volumes muito menores podem ser medidos com sucesso. Num modelo de realização descrito mais à frente, a exactidão da medição da osmolaridade não é comprometida por variações no volume da amostra de fluido recolhido, de maneira que a medição da osmolaridade é substancialmente independente do volume recolhido. A amostra de fluido pode incluir a película de lágrima, suor, sangue ou outros fluidos corporais. Deve notar-se, contudo, que a amostra de fluido pode compreender outros fluidos, tais como leite ou outras bebidas. A FIGURA 1 ilustra um modelo de realização exemplar de um chip de osmolaridade 100 que pode ser usado para medir a osmolaridade de uma amostra de fluido 102, tal como uma amostra de película de lágrima. No modelo de realização da FIGURA 1, o chip 100 inclui um substrato 104 11 ΡΕ2142905 com uma amostra de zona com eléctrodos sensores 108, 109 e ligações de circuito 110 impressas no substrato. Os eléctrodos e as ligações de circuito são preferivelmente impressos usando técnicas fotolitográficas bem conhecidas. Por exemplo, as técnicas correntes permitem que os eléctrodos 108, 10 9 tenham um diâmetro na gama de aproxi-madamente um (1) até oitenta (80) micrones e suficientemente afastados de maneira a não existir um caminho condutor na ausência de amostra de fluido. Contudo, as actuais técnicas disponíveis podem fornecer eléctrodos com um diâmetro inferior a um mícron e estes são suficientes para um chip construído de acordo com a invenção. A quantidade de amostra de fluido necessária para a medição não é superior ao que é necessário para ir de um eléctrodo para o outro, fornecendo por isso uma via condutora operacional. A escala fotolitográfica do chip 100 permite que a medição seja efectuada para amostras de tamanho de alíquota a um nível de micro ou nano escala. Por exemplo, pode ser obtida uma medição da osmolaridade fiável com um volume de amostra inferior a 20 pL de película de lágrima. Um volume de amostra típica é inferior a cem nanolitros (100 nL). Espera-se que seja relativamente fácil recolher 10 nL de uma amostra de película de lágrima mesmo de pacientes com olho seco. O chip 100 é configurado para transferir energia para a amostra de fluido 102 e permitir as propriedades energéticas de detecção da amostra de fluido. A este respeito, uma fonte de corrente é aplicada através dos 12 ΡΕ2142905 eléctrodos 108, 109 através das ligações 110. A osmola-ridade da amostra de fluido pode ser medida sentindo as propriedades da transferência de energia da amostra de fluido 102. As propriedades de transferência de energia podem incluir, por exemplo, condutividade eléctrica, de maneira que a impedância do fluido seja medida, considerando uma quantidade particular de potência eléctrica (por exemplo, corrente) que é transferida para a amostra através das ligações 110 e dos eléctrodos 108, 109.DETAILED DESCRIPTION Exemplary embodiments are provided for measuring the osmolarity of an aliquot of a fluid sample (for example, tear film, sweat, blood or other fluids). Exemplary embodiments are configured to be relatively rapid, non-invasive, inexpensive, and easy to use, with minimal risks to the patient. Accurate measurements with as little volumes in nanoliters of a fluid sample can be provided. For example, a metering device configured in accordance with the invention allows measuring osmolarity with no more than 200 μl of fluid sample, and typically much smaller volumes can be measured successfully. In an embodiment described below, the accuracy of the osmolarity measurement is not compromised by variations in the volume of the collected fluid sample, so that osmolarity measurement is substantially independent of the volume collected. The fluid sample may include tear film, sweat, blood or other body fluids. It should be noted, however, that the fluid sample may comprise other fluids, such as milk or other beverages. FIGURE 1 illustrates an exemplary embodiment of an osmolarity chip 100 that can be used to measure the osmolarity of a fluid sample 102, such as a tear film sample. In the embodiment of FIGURE 1, the chip 100 includes a substrate 104 ΡΕ2142905 with a zone sample with sensor electrodes 108, 109 and circuit connections 110 printed on the substrate. Electrodes and circuit connections are preferably printed using well-known photolithographic techniques. For example, current techniques allow the electrodes 108, 109 to have a diameter in the range of about one (1) to eighty (80) microns and sufficiently far apart so that there is no conductive path in the absence of fluid sample . However, current techniques available may provide electrodes having a diameter of less than one micron and these are sufficient for a chip constructed in accordance with the invention. The amount of fluid sample required for the measurement is not greater than that required to move from one electrode to the other, thereby providing an operational conductive path. The photolithographic scale of the chip 100 allows the measurement to be performed for aliquot size samples at a micro- or nano-scale level. For example, a reliable osmolarity measurement with a sample volume of less than 20 μl of tear film can be obtained. A typical sample volume is less than one hundred nanoliters (100 nL). It is expected to be relatively easy to collect 10 nL of a tear film sample from even dry eye patients. The chip 100 is configured to transfer energy to the fluid sample 102 and to enable the energy sensing properties of the fluid sample. In this regard, a current source is applied through the 12 ΡΕ2142905 electrodes 108, 109 through the connections 110. The osmolativity of the fluid sample can be measured by sensing the energy transfer properties of the fluid sample 102. The properties of transfer of energy may include, for example, electrical conductivity, so that the impedance of the fluid is measured, considering a particular amount of electrical power (e.g., current) which is transferred to the sample through the connections 110 and the electrodes 108, 109.

Se a condutividade da amostra de fluido tiver de ser medida, então, preferivelmente, é aplicado um sinal sinusoidal da ordem dos dez volts a aproximadamente 100 kHz. São medidas as porções reais e imaginárias da complexa impedância da via dos circuitos de um eléctrodo 108 através da amostra de fluido 102 para o outro eléctrodo 109. Às frequências em observação, é possível que a maioria do sinal eléctrico se situe na verdadeira metade do plano complexo, que reduz até à condutividade da amostra de fluido. Este sinal eléctrico (seguidamente referido como sendo condutividade) pode estar directamente relacionado com a concentração iónica da amostra de fluido 102, e a osmolaridade pode ser determinada. Além disso, se a concentração iónica da amostra de fluido 102 se alterar, a condutividade eléctrica e a osmolaridade do fluido irão modificar-se de maneira correspondente. Portanto, a osmolaridade é obtida de maneira fiável. Além disso, como o valor de impedância não depende do volume da amostra de fluido 102, a medição da osmolaridade pode ser efectuada de maneira substancialmente independente do volume da amostra. 13 ΡΕ2142905If the conductivity of the fluid sample is to be measured, then preferably, a sinusoidal signal of the order of ten volts is applied to approximately 100 kHz. The actual and imaginary portions of the complex impedance of the path of the circuits of one electrode 108 through the sample of fluid 102 to the other electrode 109 are measured. At the observed frequencies, it is possible that most of the electrical signal is in the true half of the plane complex, which reduces to the conductivity of the fluid sample. This electrical signal (hereinafter referred to as conductivity) may be directly related to the ionic concentration of the fluid sample 102, and the osmolarity can be determined. In addition, if the ionic concentration of the fluid sample 102 changes, the electrical conductivity and the osmolarity of the fluid will correspondingly change. Therefore, osmolarity is obtained reliably. Further, since the impedance value does not depend on the volume of the fluid sample 102, osmolarity measurement can be performed substantially independently of the sample volume. 13 ΡΕ2142905

Como alternativa ao sinal de entrada atrás descrito, podem ser aplicados sinais mais complexos à amostra de fluido cuja resposta irá contribuir para uma estimativa mais cuidadosa da osmolaridade. Por exemplo, pode ser conseguida calibração por impedâncias de medição numa gama de frequências. Estas impedâncias podem ser medidas quer simultaneamente (por entrada de sinal e decomposição de Fourier) quer sequencialmente. A frequência contra os dados de impedância provará as informações acerca da amostra e o desempenho relativo do circuito de medição da amostra de fluido. A FIGURA 2 ilustra um modelo de realização alternativo de um chip de recepção de amostra 200 que mede a osmolaridade de uma amostra de fluido 202, onde o chip compreende uma camada de substrato 204 com uma amostra de zona 206 compreendendo um circuito impresso que inclui uma matriz de eléctrodos 208. No modelo de realização ilustrado da FIGURA 2, a amostra de zona 20 6 tem uma matriz de eléctrodos 5 por 5 que são impressos com técnicas fotoli-tográficas, tendo cada eléctrodo 208 uma ligação 210 a um dos lados do substrato 204. Para simplificar a ilustração, nem todos os eléctrodos 208 na FIGURA 2 estão apresentados com uma ligação. Os eléctrodos fornecem medições a uma unidade de processamento separada, melhor descrita a seguir. A matriz de eléctrodos da FIGURA 2 fornece um 14 ΡΕ2142905 meio para medir o tamanho da gota de lágrima 202 ao detectar a extensão dos eléctrodos condutores 208 para assim determinar a extensão da goticula. Em particular, os circuitos de processamento podem determinar o número de eléctrodos que estão a conduzir e, portanto, será determinado o número de eléctrodos adjacentes que são cobertos pela goticula 202. A área plana do substrato que é coberto pela amostra de fluido é assim determinada. Com uma tensão superficial nominal conhecida da amostra de fluido, a altura do volume da amostra de fluido sobre a área plana pode ser calculado de maneira fiável e, portanto, pode ser determinado o volume da goticula 202. A FIGURA 3 ilustra outro modelo de realização alternativo de uma amostra de chip de recepção 300 no qual é depositada uma amostra de fluido 302. O chip compreende uma camada de substrato 304, onde uma amostra de zona 306 é fornecida com eléctrodos 308 que são configurados numa pluralidade de circulos concêntricos. Cada eléctrodo 308 pode ser ligado a um lado da camada de substrato 304 por ligações 310. De maneira similar à matriz quadrada da FIGURA 2, a matriz circular dos eléctrodos 308 da FIGURA 3 também fornecem uma estimativa do tamanho do volume 302 da amostra de fluido porque a goticula cobre, tipicamente, uma área circular ou oval da amostra de zona 302. O processamento dos circuitos pode detectar o circulo maior (exterior) de eléctrodos que estão a conduzir e, dai, determinam uma área plana de cobertura pela amostra de fluido. Tal como anteriormente, a área plana determinada 15 ΡΕ2142905 fornece uma estimativa de volume, em conjunção com uma tensão superficial conhecida e altura do volume correspondente da amostra de fluido 302. No modelo de realização ilustrado na FIGURA 3, os eléctrodos 308 podem ser impressos usando técnicas fotolitográficas bem conhecidas que, normalmente, permitem que os eléctrodos tenham um diâmetro na gama de um (1) até oitenta (80) micrones. Isto permite que a goticula de submicrolitro cubra substancialmente os eléctrodos. Os eléctrodos podem ser impressos sobre uma área cujo tamanho foi calculado para receber a amostra de fluido, geralmente cobrindo 1 mm2 até 1 cm2.As an alternative to the input signal described above, more complex signals can be applied to the fluid sample whose response will contribute to a more careful estimation of osmolarity. For example, measurement impedance calibration can be achieved over a frequency range. These impedances can be measured either simultaneously (by signal input and Fourier decomposition) or sequentially. The frequency against the impedance data will prove the information about the sample and the relative performance of the fluid sample measurement circuit. FIGURE 2 illustrates an alternate embodiment of a sample receiving chip 200 that measures the osmolarity of a fluid sample 202, wherein the chip comprises a substrate layer 204 with a zone sample 206 comprising a printed circuit including a electrode array 208. In the illustrated embodiment of FIGURE 2, zone sample 20 has a 5 by 5 electrode array which is printed with photolygraphic techniques, each electrode 208 having a connection 210 to one side of the substrate 204. To simplify the illustration, not all of the electrodes 208 in FIGURE 2 are shown with a connection. The electrodes provide measurements to a separate processing unit, better described below. The electrode array of FIGURE 2 provides a 14 ΡΕ2142905 means for measuring the size of the tear drop 202 upon detecting the extent of the conductive electrodes 208 to thereby determine the extent of the droplet. In particular, the processing circuits can determine the number of electrodes being driven and therefore the number of adjacent electrodes covered by the droplet 202. will be determined. The flat area of the substrate that is covered by the fluid sample is thus determined . With a known nominal surface tension of the fluid sample, the volume height of the fluid sample over the flat area can be reliably calculated, and therefore the volume of the droplet 202. can be determined. FIGURE 3 illustrates another embodiment of a sample of reception chip 300 in which a sample of fluid 302 is deposited. The chip comprises a substrate layer 304, wherein a zone sample 306 is provided with electrodes 308 which are configured in a plurality of concentric circles. Each electrode 308 may be attached to one side of the substrate layer 304 by links 310. In a manner similar to the square array of FIGURE 2, the circular array of electrodes 308 of FIGURE 3 also provide an estimate of the volume size 302 of the fluid sample because the droplet typically covers a circular or oval area of the zone sample 302. The processing of the circuits can detect the larger (outer) circle of electrodes being driven and hence determine a flat area of coverage by the fluid sample . As before, the determined flat area 15 ΡΕ2142905 provides a volume estimate, in conjunction with a known surface tension and corresponding volume height of the fluid sample 302. In the embodiment shown in FIGURE 3, the electrodes 308 may be printed using well-known photolithographic techniques which normally allow the electrodes to have a diameter in the range of one (1) to eighty (80) microns. This allows the submicroliter droplet to substantially cover the electrodes. The electrodes may be printed over an area whose size was calculated to receive the fluid sample, generally covering 1 mm2 to 1 cm2.

Os eléctrodos e ligações apresentadas na FIGURA 1, FIGURA 2 e FIGURA 3 podem ser impressos nas respectivas camadas de substrato como eléctrodos com almofadas de contacto, usando técnicas fotolitográficas. Por exemplo, os eléctrodos podem ser formados com diferente metalização condutora tal como alumínio, platina, titânio, titânio/tun-gsténio e outro material similar. Num modelo de realização, os eléctrodos podem ser formados com uma borda dieléctrica para proteger as densidades de campo nas arestas dos eléctrodos. Isto pode reduzir um campo eléctrico que, de outro modo, seria instável na borda do eléctrodo.The electrodes and connections shown in FIGURE 1, FIGURE 2 and FIGURE 3 may be printed on the respective substrate layers as electrodes with contact pads, using photolithographic techniques. For example, the electrodes may be formed with different conductive metallation such as aluminum, platinum, titanium, titanium / tung-gst and the like. In one embodiment, the electrodes may be formed with a dielectric edge to protect the field densities at the edges of the electrodes. This may reduce an electric field that would otherwise be unstable at the edge of the electrode.

As vistas de topo dos modelos de realização exemplares dos chips 200 e 300 estão ilustrados na FIGURA 4 e FIGURA 5, respectivamente. Os modelos de realização mostram a matriz pormenorizada dos eléctrodos e das ligações e ilustram como cada eléctrodo pode estar ligado 16 ΡΕ2142905 electricamente para medir as propriedades eléctricas de uma goticula de amostra. Tal como atrás mencionámos, a matriz dos eléctrodos e as ligações podem ser impressas sobre o substrato 100, 200, 300 usando técnicas fotolitográficas bem conhecidas. A FIGURA 6 é um diagrama em bloco de um sistema de osmometria 600 configurado de acordo com um modelo de realização da presente invenção, mostrando como é determinada a informação e usada num processo que determina a osmolaridade de uma amostra de fluido. O sistema de osmometria 600 inclui um dispositivo de medição 604 e um dispositivo de processamento 606. O dispositivo de medição recebe, de um dispositivo de recolha 608, um volume de amostra de fluido. O dispositivo de recolha pode compreender, por exemplo, uma micropipeta ou tubo capilar. O dispositivo de recolha 608 recolhe uma amostra de película de lágrima de um paciente, tal como usando pressão negativa de uma micropipeta de volume fixo ou atracção de carga de um tubo capilar para retirar um pequeno volume de lágrima da vizinhança da superfície ocular de um paciente. O dispositivo de medição 604 pode compreender um sistema que transfere energia ao fluido na amostra de zona e detectar a energia conferida. Por exemplo, o dispositivo de medição 604 pode compreender circuitos que forneçam energia eléctrica numa forma de onda específica (tal como a que provém de um gerador de funções) até à via eléctrica compreendendo dois eléctrodos ligados em ponte pela amostra 17 ΡΕ2142905 de fluido. 0 dispositivo de processamento 606 detecta a energia conferida à amostra de fluido e determina a osmolaridade. 0 dispositivo de processamento pode compreender, por exemplo, um sistema incluindo um multimetro RLC que produz dados relativos à reactância do fluido que forma a via condutora entre dois eléctrodos, e incluindo um processador que determina a osmolaridade através de um esquema de consulta de tabela. Se se desejar, o dispositivo de processamento pode ser alojado numa unidade de base para recepção de um dos chips atrás descritos.The top views of the exemplary embodiments of the chips 200 and 300 are shown in FIGURE 4 and FIGURE 5, respectively. The embodiments show the detailed array of the electrodes and the connections and illustrate how each electrode may be electrically connected 16 ΡΕ2142905 to measure the electrical properties of a sample droplet. As mentioned above, the electrode array and the bonds may be printed on the substrate 100, 200, 300 using well-known photolithographic techniques. FIGURE 6 is a block diagram of an osmometry system 600 configured in accordance with an embodiment of the present invention showing how the information is determined and used in a method that determines the osmolarity of a fluid sample. The osmometry system 600 includes a metering device 604 and a processing device 606. The metering device receives, from a collection device 608, a volume of fluid sample. The collection device may comprise, for example, a micropipette or capillary tube. The collection device 608 collects a sample of tear film from a patient, such as by using negative pressure from a fixed-volume micropipette or charging attraction of a capillary tube to withdraw a small volume of tear from the vicinity of a patient's ocular surface . The metering device 604 may comprise a system that transfers energy to the fluid in the zone sample and detect the energy conferred. For example, the metering device 604 may comprise circuits which deliver electrical energy in a specific waveform (such as that from a function generator) to the electrical path comprising two bridged electrodes by the fluid sample 17 ΡΕ2142905. The processing device 606 detects the energy imparted to the fluid sample and determines the osmolarity. The processing device may comprise, for example, a system including an RLC multimeter that produces data relating to the reactance of the fluid forming the conductive path between two electrodes, and including a processor that determines osmolarity through a table query scheme. If desired, the processing device may be housed in a base unit for receiving one of the above described chips.

Tal como atrás foi mencionado, uma amostra suficiente para fornecer uma medição da osmolaridade pode conter menos de 20 microlitros (pL) de fluido. Uma amostra tipica de película de lágrima de acordo com a invenção é recolhida por um colector de fluido, tal como um tubo capilar, que muitas vezes contém menos de um microlitro de película de lágrima. Os profissionais de medicina estão familiarizados com o uso de micropipetas e tubos capilares e serão capazes de recolher facilmente os pequenos volumes de amostra aqui descritos, mesmo no caso de pacientes que sofram de olho seco. A amostra de fluido recolhido é expelida do dispositivo de recolha 608 para o dispositivo de medição 604. O dispositivo de recolha pode ser colocado por cima da amostra de zona do substrato do chip quer manualmente por um profissional de medicina quer sendo guiado mecanicamente sobre a amostra de zona. Num modelo de realização, por 18 ΡΕ2142905 exemplo, o dispositivo de recolha (por exemplo, um tubo capilar) é guiado mecanicamente até ficar em posição com um orificio de plástico moldado por injecção numa unidade de base, ou é montado num conjunto de grampos com parafusos de precisão (por exemplo, um micromanipulador com agulhas para interfaces de microchip). Noutro modelo de realização, o guia é um circuito de controlo de retroacção guiado por computador que segura o tubo capilar e o baixa automaticamente até ficar na posição apropriada.As mentioned above, a sample sufficient to provide an osmolarity measurement may contain less than 20 microliters (pL) of fluid. A typical tear film sample according to the invention is collected by a fluid manifold, such as a capillary tube, which often contains less than one microliter of tear film. Medical professionals are familiar with the use of micropipettes and capillaries and will be able to easily collect the small sample volumes described herein, even in the case of patients suffering from dry eye. The collected fluid sample is expelled from the collection device 608 to the measuring device 604. The collection device may be placed over the sample area of the chip substrate either manually by a medical professional or being mechanically guided over the sample of zone. In one embodiment, for example, the collection device (for example, a capillary tube) is mechanically guided into position with an injection molded plastic bore in a base unit, or is mounted on a set of clamps with precision bolts (for example, a micromanipulator with needles for microchip interfaces). In another embodiment, the guide is a computer-guided feedback control circuit which secures the capillary tube and lowers it automatically until it is in the proper position.

Os eléctrodos e ligações dos chips medem as propriedades energéticas da amostra de fluido, tal como a condutividade, e permitem que as propriedades medidas sejam recebidas pelo dispositivo de processamento 606. As propriedades de energia medidas da amostra de fluido incluem condutividade eléctrica e também podem incluir outros parâmetros, tais como ambas as partes da impedância complexa da amostra, a variância do ruido no sinal de saida e o desvio de medição devido ao aquecimento óhmico da amostra de fluido. As propriedades energéticas medidas são processadas no dispositivo de processamento 606 para forneceram a osmolaridade da amostra. Num modelo de realização, o dispositivo de processamento 606 compreende uma unidade de base que pode aceitar um chip e pode fornecer ligação eléctrica entre o chip e o dispositivo de processamento 606. Noutro modelo de realização, a unidade de base pode incluir uma unidade de apresentação para exibir valores de osmolaridade. Deve notar-se que o dispositivo de processamento 606 e, em particular, a unidade de base podem ser uma unidade portátil. 19 ΡΕ2142905 A FIGURA 7 é uma vista em perspectiva de um sistema de medição da osmolaridade de uma pelicula de lágrima 700 construído de acordo com a presente invenção. No modelo de realização ilustrado da FIGURA 7, o sistema exemplar 700 inclui uma unidade de medição 701 que compreende um chip, tal como um dos chips atrás descritos, e um conector ou base de suporte 710, que fornece a saída de medida apropriada. O sistema 700 determina a osmolaridade medindo a condutividade eléctrica da amostra de fluido: Portanto, o chip de medição 701 compreende um chip de circuito integrado (Cl) de semi-condutor com um substrato tendo uma construção similar à dos chips atrás descritos em relação à FIGURA 1 até à FIGURA 5. Assim, o chip 701 inclui uma camada de substrato com uma amostra de zona que é definida por pelo menos dois eléctrodos impressos sobre a camada de substrato (a escala desses pormenores é demasiado pequena para serem visíveis na FIGURA 7; ver FIGURA 1 até à FIGURA 5) . O substrato e amostra de zona estão fechados dentro de uma embalagem inerte, de maneira conhecida dos especialistas na técnica. Em particular, o chip 701 é fabricado usando-se técnicas de fabrico de semicondutores convencionais numa embalagem de Cl 707 que inclui pernas de ligação eléctrica 708 que permitem que o chip 701 receba sinais eléctricos e que a saída seja comunicada fora do chip. A embalagem 707 fornece um invólucro que faz com que o manuseamento do chip seja mais conveniente e ajude a reduzir a evaporação da amostra de fluido. 20 ΡΕ2142905 A FIGURA 8 mostra que o chip de medição 701 é fabricado com um orifício de abertura exterior 720 dentro do qual é inserida a amostra de fluido 702. Assim, o orifício 720 pode ser formado na embalagem semicondutora 707 para fornecer uma via através do chip exterior ao substrato 804 e à amostra de zona 806. O dispositivo de recolha (tal como uma micropipeta ou tubo capilar) 808 é posicionado dentro do orifício 720 de maneira que a amostra de fluido 702 seja expelida do dispositivo de recolha directamente sobre a amostra de zona 806 do substrato 804. O orifício 720 forma uma abertura ou funil que vai do exterior do chip até à amostra de zona 806 do substrato 804. Desta forma, a amostra de fluido 702 é expelida do dispositivo de recolha 808 e é depositada directamente sobre a amostra de zona 806 do substrato 804. O tamanho da amostra de zona é concebido para receber o volume da amostra de fluido do dispositivo de recolha. Na FIGURA 8, por exemplo, os eléctrodos formam uma amostra de zona 806 que está geralmente na gama de aproximadamente 1 mr2 até 1 cm2 de área.The electrodes and connections of the chips measure the energy properties of the fluid sample, such as conductivity, and allow the measured properties to be received by the processing device 606. The measured energy properties of the fluid sample include electrical conductivity and may also include other parameters such as both parts of the complex sample impedance, the noise variance in the output signal and the measurement deviation due to the ohmic heating of the fluid sample. The measured energy properties are processed in the processing device 606 to provide the osmolarity of the sample. In one embodiment, the processing device 606 comprises a base unit that can accept a chip and can provide electrical connection between the chip and the processing device 606. In another embodiment, the base unit may include a display unit to display osmolarity values. It should be noted that the processing device 606 and, in particular, the base unit may be a portable unit. FIGURE 7 is a perspective view of an osmolarity measurement system of a tear film 700 constructed in accordance with the present invention. In the illustrated embodiment of FIGURE 7, the exemplary system 700 includes a metering unit 701 which comprises a chip, such as one of the chips described above, and a connector or support base 710, which provides the appropriate metering output. The system 700 determines the osmolarity by measuring the electrical conductivity of the fluid sample. Thus, the measurement chip 701 comprises a semiconductor integrated circuit (IC) chip with a substrate having a construction similar to that of the chips described above with respect to FIG. 1 to FIG. 5. Thus, chip 701 includes a substrate layer having a zone sample that is defined by at least two electrodes printed on the substrate layer (the scale of such details is too small to be visible in FIG. 7 see FIGURE 1 through FIGURE 5). The substrate and zone sample are enclosed within an inert package, in a manner known to those skilled in the art. In particular, the chip 701 is manufactured using conventional semiconductor manufacturing techniques in a package of Cl 707 which includes electrical connecting legs 708 which enable the chip 701 to receive electrical signals and the output to be communicated off the chip. The package 707 provides a wrapper that makes chip handling more convenient and helps reduce evaporation of the fluid sample. FIGURE 8 shows that the measurement chip 701 is fabricated with an outer aperture hole 720 into which fluid sample 702 is inserted. Thus, the orifice 720 may be formed in the semiconductor package 707 to provide a path through the external chip to the substrate 804 and the zone sample 806. The collection device (such as a micropipette or capillary tube) 808 is positioned within the bore 720 so that the fluid sample 702 is expelled from the collection device directly onto the sample of the area 806 of the substrate 804. The aperture 720 forms an aperture or funnel extending from the exterior of the chip to the zone sample 806 of the substrate 804. In this way, the fluid sample 702 is expelled from the collection device 808 and deposited directly on the 806 zone sample 804. The size of the zone sample is designed to receive the volume of the fluid sample from the collection device. In FIGURE 8, for example, the electrodes form a zone sample 806 which is generally in the range of about 1 m 2 to 1 cm 2 area.

Voltando à FIGURA 7, o chip 701 pode incluir circuitos de processamento 704 que compreendem, por exemplo, um gerador de funções que gera a forma de onda de um sinal pretendido que é aplicado aos eléctrodos da amostra de zona do chip, e a um dispositivo de medição de voltagem para medir o valor eficaz (RMS) de voltagem que é lido a partir dos eléctrodos do chip. O gerador de funções pode produzir corrente alterna de altas-frequências (AC) 21 ΡΕ2142905 para evitar efeitos de corrente directa indesejável (DC) para o processo de medição. 0 dispositivo de medição de voltagem pode incorporar a funcionalidade de um multimetro RLC. Assim, o chip 701 pode incorporar os circuitos de medição bem como os eléctrodos da amostra de zona. Os circuitos de processamento podem incluir uma unidade de processamento central (CPU) e memória associada que pode armazenar instruções de programação (tais como um micro-programa) e também podem armazenar dados. Desta forma, um único chip pode incluir os eléctrodos e ligações associadas para a amostra de zona e, numa região separada do chip, também pode incluir os circuitos de medição. Esta configuração minimizará as resistências de dispersão das estruturas do circuito.Turning to FIGURE 7, the chip 701 may include processing circuitry 704 which comprises, for example, a function generator that generates the waveform of a desired signal that is applied to the electrodes of the chip zone sample, and to a device of voltage to measure the effective value (RMS) of voltage that is read from the electrodes of the chip. The function generator can produce high frequency (AC) 21 ΡΕ2142905 alternating current to avoid undesirable direct current (DC) effects for the measurement process. The voltage measuring device may incorporate the functionality of an RLC multimeter. Thus, the chip 701 may incorporate the measurement circuits as well as the electrodes of the zone sample. The processing circuitry may include a central processing unit (CPU) and associated memory which may store programming instructions (such as a microprogram) and may also store data. In this way, a single chip may include the electrodes and associated links for the zone sample and, in a region separate from the chip, may also include the measurement circuits. This configuration will minimize the dispersion resistances of the circuit structures.

Como atrás notámos, os circuitos de processamento 7 0 aplicam a forma de onda de um sinal nos eléctrodos da amostra de zona. Os circuitos de processamento também recebem os sinais de propriedade de energia dos eléctrodos e determinam o valor da osmolaridade da amostra de fluido. Por exemplo, a unidade de processamento recebe valores de condutividade eléctrica de um conjunto de pares de eléctrodos. Os especialistas na técnica estarão familiarizados com técnicas e circuitos para determinar a condutividade de uma amostra de fluido que forme uma via condutora entre dois ou mais eléctrodos.As noted above, the processing circuits 70 apply the waveform of a signal to the electrodes of the zone sample. The processing circuitry also receives the energy property signals from the electrodes and determines the osmolarity value of the fluid sample. For example, the processing unit receives electrical conductivity values from a set of electrode pairs. Those skilled in the art will be familiar with techniques and circuits to determine the conductivity of a sample of fluid forming a conductive path between two or more electrodes.

No modelo de realização da FIGURA 7, a unidade de processamento 7 04 produz formas de onda de um sinal a uma 22 ΡΕ2142905 frequência única, tais como 100 kHz e 10 Volts pico a pico. Os circuitos de processamento 704 determinam então o valor de osmolaridade a partir do teor em sódio relacionado com a condutividade eléctrica usando uma curva de calibração, tal como a curva apresentada na FIGURA 9. Neste caso, a curva de calibração é construída como uma função de transferência entre a condutividade eléctrica (voltagem) e o valor de osmolaridade (isto é, o teor em sódio) . Deve notar-se, contudo, que outras curvas de calibração também podem ser construídas para fornecer funções de transferência entre outras propriedades energéticas e o valor de osmolaridade. Por exemplo, a variância, autocorrelação e desvio do sinal podem ser incluídos num cálculo de osmolaridade. Se se pretender, o valor de osmolaridade também pode ser construído sobre gráficos de coeficientes da correlação multi-variável ou interpretação da rede neuronal de maneira que o valor da osmolaridade possa ser optimizado com um conjunto arbitrariamente grande de medidas variáveis.In the embodiment of FIGURE 7, processing unit 074 produces waveforms of a signal at a 22 ΡΕ2142905 single frequency, such as 100 kHz and 10 Volts peak-to-peak. Process circuits 704 then determine the osmolarity value from the sodium content related to electrical conductivity using a calibration curve, such as the curve shown in FIGURE 9. In this case, the calibration curve is constructed as a function of transfer between the electrical conductivity (voltage) and the osmolarity value (ie the sodium content). It should be noted, however, that other calibration curves may also be constructed to provide transfer functions between other energy properties and the osmolarity value. For example, the variance, autocorrelation and signal drift can be included in an osmolarity calculation. If desired, the osmolarity value can also be constructed on multi-variable correlation coefficient or neural network interpretation graphs so that the osmolarity value can be optimized with an arbitrarily large set of variable measures.

Numa forma alternativa do modelo de realização da FIGURA 7, a unidade de processamento 704 produz formas de onda de um sinal de um varrimento de frequência predeterminado, tal como 1 kHz até 100 kHz em incrementos de 1 kHz, e armazena os valores de condutividade e variância recebidos do conjunto de pares de eléctrodos em cada frequência. O sinal de saida contra a curva de frequência pode então ser usado para produzir informação de ordem mais elevada acerca da amostra que pode ser usada com as funções de transferência atrás referidas para produzir uma leitura ideal da osmolaridade. 23 ΡΕ2142905In an alternative form of the embodiment of FIGURE 7, the processing unit 704 produces waveforms of a predetermined frequency scan signal, such as 1 kHz to 100 kHz in 1 kHz increments, and stores the conductivity values and received from the set of electrode pairs at each frequency. The output signal against the frequency curve may then be used to produce higher order information about the sample that can be used with the above-mentioned transfer functions to produce an optimal osmolarity reading. 23 ΡΕ2142905

Tal como está apresentado na FIGURA 7, o conector de suporte da base 710 recebe os pinos 708 do chip 701 nos correspondentes suportes 711. O conector 710, por exemplo, pode fornecer a corrente eléctrica necessária aos circuitos de processamento 704 e eléctrodos do chip. Assim, o chip 701 pode incluir os eléctrodos da amostra de zona, o gerador de sinal e os circuitos de processamento necessários para determinar a osmolaridade, e a produção compreendendo o valor de osmolaridade pode ser comunicada fora do chip por meio dos pinos 708 através do conector 710 e até um monitor de visualização.As shown in FIGURE 7, the base support connector 710 receives the pins 708 from the chip 701 in the corresponding holders 711. The connector 710, for example, can provide the necessary electrical current to the processing circuits 704 and electrodes of the chip. Thus, the chip 701 may include the electrodes of the zone sample, the signal generator and the processing circuitry required to determine the osmolarity, and the production comprising the osmolarity value may be communicated off-chip via the pins 708 through the 710 connector and even a display monitor.

Se se pretender, o suporte do conector de base 710 pode incluir uma camada de Peltier 712 localizada por baixo dos suportes que recebem os pinos 708 do chip 701. Os especialistas na técnica entenderão que uma camada de Peltier compreende uma junção electro-cerâmica de maneira que a corrente devidamente aplicada possa arrefecer ou aquecer a camada de Peltier. Desta forma, o amostra de chip 701 pode ser aquecido ou arrefecido, pelo que a evaporação da amostra de fluido é melhor controlada. Deve ser aparente que a evaporação da amostra de fluido deve ser controlada cuidadosamente, para garantir valores exactos de osmolaridade obtidos a partir da amostra de fluido. A FIGURA 10 mostra um modelo de realização alternativo de um osmómetro no qual o chip não inclui uma unidade de processamento sobre micropastilha tal como foi 24 ΡΕ2142905 atrás descrita mas, de preferência, inclui circuitos limitados compreendendo principalmente os eléctrodos e interconexões da amostra de zona. Ou seja, a unidade de processamento está separada do chip e pode ser fornecida na unidade de base. A FIGURA 10 mostra em pormenor um osmómetro 1000 que inclui uma unidade de base 1004, que aloja o conector de base 710, e uma tampa articulada 1006 que fecha sobre o conector de base 710 e um chip de medição 701 recebida. Assim, depois de a amostra de fluido ter sido vertida sobre o chip, esta é inserida no conector de suporte 710 da unidade de base 1004 e a tampa articulada 1006 é fechada sobre o chip para reduzir a velocidade de evaporação da amostra de fluido.If desired, the base connector holder 710 may include a layer of Peltier 712 located below the holders receiving the pins 708 of the chip 701. Those skilled in the art will appreciate that a Peltier layer comprises a so-called electro-ceramic junction that the duly applied current can cool or heat the Peltier layer. In this way, the chip sample 701 can be heated or cooled, whereby the evaporation of the fluid sample is better controlled. It should be apparent that the evaporation of the fluid sample should be carefully monitored to ensure accurate osmolarity values obtained from the fluid sample. FIGURE 10 shows an alternative embodiment of an osmometer in which the chip does not include a microchip processing unit as described above, but preferably includes limited circuits mainly comprising the electrodes and interconnections of the zone sample. That is, the processing unit is separate from the chip and can be supplied in the base unit. FIGURE 10 shows in detail an osmometer 1000 including a base unit 1004, housing the base connector 710, and a hinged lid 1006 which closes over the base connector 710 and a received measurement chip 701. Thus, after the fluid sample has been poured onto the chip, it is inserted into the support connector 710 of the base unit 1004 and the hinged lid 1006 is closed on the chip to reduce the rate of evaporation of the fluid sample.

Deve notar-se que o problema com a evaporação relativamente rápida da amostra de fluido pode qeralmente ser resolvido numa de duas maneiras. Uma é medir a voltagem da amostra de fluido tão rapidamente quanto possível depois de a gotícula ser colocada na amostra de zona do chip. Outra é permitir que a unidade de medição meça a velocidade de evaporação ao mesmo tempo que as alterações correspondentes em valores de condutividade. A unidade de processamento pode então processar posteriormente a saída para avaliar o valor da osmolaridade. O processamento pode ser efectuado no hardware ou em software armazenado no hardware. Assim, a unidade de processamento pode incorporar diferentes técnicas de processamento tais como usando redes 25 ΡΕ2142905 neuronais para recolher e compreender a característica das amostras de fluido que estão a ser medidas em termos de osmolaridade, assim como variações de temperatura, alterações de volume e outros parâmetros relacionados de maneira que o sistema possa ser treinado de acordo com técnicas de rede neuronal para efectuar medições de osmolaridade mais rápidas e mais exactas. A FIGURA 11 mostra outra construção alternativa, na qual o sistema de osmolaridade utiliza um chip 1102 que recebe a amostra que não inclui embalagem de Cl tal como apresentada na FIGURA 7. De preferência, o chip de medição 1102 da FIGURA 11 está configurado como um chip com uma amostra de zona exposta compreendendo os eléctrodos e ligações associadas, mas os circuitos de processamento estão localizados na unidade de base para medição das propriedades energéticas da amostra de fluido. Nesta construção alternativa, um conector similar ao suporte de conector 710 permite a transmissão das propriedades de energia medida até à unidade de processamento na unidade de base. Os especialistas na técnica entenderão que uma configuração desse tipo é comummente referida como sendo uma estrutura de cartão sonda. A FIGURA 11 mostra uma unidade de base de cartão sonda 1100 que recebe um cartão sonda com amostra de chip 1102 que compreende um substrato 1104 com uma amostra de zona 1106 sobre a qual estão formados eléctrodos 1108 que estão ligados por fios metálicos a arestas conectoras 1110 26 ΡΕ2142905 do cartão sonda. Quando a tampa articulada 1112 da unidade de base é fechada sobre o cartão sonda, dentes de ligação 1114 no lado inferior da tampa entram em contacto com as arestas conectoras 1110. Desta forma, os eléctrodos da amostra de zona 1106 são acoplados ao circuito de processamento e a medição pode ser efectuada. O circuito de processamento do modelo de realização do cartão sonda da FIGURA 11 pode ser configurado em qualquer das configurações atrás descritas. Ou seja, o processamento para aplicar corrente aos eléctrodos e para detectar as propriedades energéticas da amostra de fluido e determinar a osmola-ridade pode ser localizado sobre o chip, sobre o substrato do cartão sonda 1102 ou o circuito de processamento pode estar localizado fora do chip, na unidade de base 1100.It should be noted that the problem with relatively rapid evaporation of the fluid sample can be solved in one of two ways. One is to measure the voltage of the fluid sample as quickly as possible after the droplet is placed in the chip sample area. Another is to allow the metering unit to measure the evaporation rate at the same time as the corresponding changes in conductivity values. The processing unit may then process the output later to evaluate the osmolarity value. Processing can be performed on the hardware or software stored on the hardware. Thus, the processing unit may incorporate different processing techniques such as using neural networks ΡΕ2142905 to collect and understand the characteristics of the fluid samples being measured in terms of osmolarity, as well as temperature variations, volume changes and other related parameters so that the system can be trained according to neural network techniques to make faster and more accurate osmolarity measurements. FIGURE 11 shows another alternative construction in which the osmolar system uses a chip 1102 which receives the sample which does not include Cl pack as shown in FIGURE 7. Preferably, the measurement chip 1102 of FIGURE 11 is configured as a chip with an exposed zone sample comprising the associated electrodes and connections, but the processing circuitry is located in the base unit for measuring the energy properties of the fluid sample. In this alternative construction, a connector similar to the connector holder 710 allows transmission of the measured energy properties to the processing unit in the base unit. Those skilled in the art will appreciate that such a configuration is commonly referred to as a probe board structure. FIGURE 11 shows a probe card base unit 1100 which receives a probe card with chip sample 1102 comprising a substrate 1104 with a zone sample 1106 on which are formed electrodes 1108 which are connected by metal wires to connector edges 1110 26 ΡΕ2142905 of the probe card. When the hinged lid 1112 of the base unit is closed on the probe carton, connecting teeth 1114 on the underside of the lid come into contact with the connecting edges 1110. In this manner, the electrodes of the zone sample 1106 are coupled to the processing circuit and the measurement can be performed. The processing circuit of the probe card embodiment of FIGURE 11 may be configured in any of the configurations described above. That is, the processing for applying current to the electrodes and for detecting the energy properties of the fluid sample and determining the osmolativity can be located on the chip, on the substrate of the probe card 1102 or the processing circuit may be located outside the on the base unit 1100.

Em todos os modelos de realização alternativos atrás descritos, o osmómetro é usado colocando um novo chip de medição na unidade de base enquanto o topo articulado é aberto. Depois de colocado na unidade de base o chip baixa e começa a monitorizar o seu ambiente. O registo de sinais de sarda a partir do chip a uma velocidade de, por exemplo, 1 kHz, irá capturar completamente o comportamento do sistema. Colocar uma amostra sobre qualquer porção da matriz de eléctrodos gera um elevado aumento da razão sinal ruído na condutividade entre pares de eléctrodos aliados cobertos pelo fluido da amostra. A unidade de processamento reconhecerá a alteração de condutividade como estando directamente relacionada com a adição de fluido da amostra e começará a conversão de sinais electrónicos em dados de 27 ΡΕ2142905 osmolaridade logo que este tipo de alteração seja identificado. Esta estratégia ocorre sem a intervenção de profissionais de medicina. Ou seja, o processamento do chip é iniciado ao acoplá-lo à unidade de base e não depende do funcionamento da tampa da unidade de base ou de qualquer outra intervenção do utilizador.In all of the alternative embodiments described above, the osmometer is used by placing a new measurement chip in the base unit while the hinged top is opened. Once placed in the base unit the chip lowers and begins to monitor its environment. Registering mackerel signals from the chip at a rate of, for example, 1 kHz, will completely capture the behavior of the system. Placing a sample over any portion of the electrode array generates a high increase in the signal to noise ratio in the conductivity between pairs of allied electrodes covered by the sample fluid. The processing unit will recognize the change in conductivity as being directly related to the addition of sample fluid and begin the conversion of electronic signals into 27 ΡΕ2142905 osmolarity data as soon as this type of change is identified. This strategy occurs without the intervention of medical professionals. That is, chip processing is started by coupling it to the base unit and does not depend on the operation of the base unit cover or any other user intervention.

Em qualquer das configurações atrás descritas, quer o "chip inteligente" com os circuitos de processamento sobre o chip (FIGURA 7), quer a configuração só de eléctrodos com os circuitos de processamento fora do chip (FIGURA 10), num chip embalado (FIGURA 7 e FIGURA 10) ou num cartão sonda (FIGURA 11), o chip que recebe a amostra pode ser eliminado depois de cada utilização, de maneira que a unidade de base sirva como uma plataforma para interagir com o chip de medição eliminável. Tal como fizemos notar, a unidade de base pode também incluir circuitos de controlo relevante, comunicação e apresentação (não apresentados) , assim como software, ou essas caracteristicas podem ser fornecidas fora do cartão, na unidade de base. A este respeito, os circuitos de processamento podem ser configurados para fornecerem automaticamente potência suficiente aos eléctrodos da amostra de zona para os oxidar irreversivelmente depois de um ciclo de medição, de maneira que os eléctrodos fiquem inoperacionais para qualquer ciclo de medição subsequente. Ao ser inserido um chip usado na unidade de base, o utilizador receberá a indicação de que os eléctrodos estão inoperacionais. Isto ajuda a evitar o inadvertente uso múltiplo de uma amostra de chip que 28 ΡΕ2142905 poderia conduzir a leituras imprecisas da osmolaridade e a condições potencialmente anti-higiénicas.In any of the settings described above, either the " smart chip " with the chip processing circuitry (FIGURE 7), either the configuration of electrodes only with off-chip processing circuits (FIGURE 10), a packaged chip (FIGURE 7 and FIGURE 10) or a probe card (FIGURE 11) , the chip receiving the sample may be disposed of after each use, so that the base unit serves as a platform for interacting with the disposable measuring chip. As noted, the base unit may also include relevant control, communication and presentation (not shown) circuitry, as well as software, or such features may be provided off-board, in the base unit. In this regard, the processing circuits may be configured to automatically deliver sufficient power to the electrodes of the zone sample to irreversibly oxidize them after a metering cycle, so that the electrodes are inoperative for any subsequent measurement cycle. When a used chip is inserted into the base unit, the user will be advised that the electrodes are inoperative. This helps to avoid the inadvertent multiple use of a chip sample that 28 ΡΕ2142905 could lead to inaccurate readings of osmolarity and potentially unhygienic conditions.

Uma aproximação secundária para assegurar que um chip previamente usado não é recolocado na máquina inclui números de série codificados, ou códigos, directamente no chip. A unidade de base armazenará os números dos chips usados na memória e cruzará a sua referência com novos chips colocados no conector de base. Se a unidade de base descobrir que o número de série do chip usado é igual ao de um chip antigo, então o sistema recusar-se-á a medir a osmolaridade até ser inserido um novo chip. É importante assegurar o uso de um novo chip para cada teste porque as proteínas adsorvem e formam-se cristais de sal sobre os eléctrodos depois da evaporação se ter efectuado, o que corrompe a integridade dos eléctrodos de medição. A FIGURA 12 é um fluxograma que descreve uma técnica exemplar de medição da osmolaridade de acordo com a invenção. Uma amostra de fluido corporal, tal como uma pelicula de lágrima, é recolhida na caixa 1300. Tipicamente, a amostra contém menos de um microlitro. Na caixa 1302, a amostra recolhida é depositada sobre uma amostra de zona do substrato do chip. As propriedades energéticas da amostra são então medidas na caixa 1304. As propriedades energéticas medidas são então processadas, na caixa 1306, para determinar a osmolaridade da amostra. Se o chip funcionar de acordo com a medição de condutividade eléctrica, então o processamento da medição na caixa 1306 29 ΡΕ2142905 pode incluir a operação de "oxidação do eléctrodo" atrás descrita que torna os eléctrodos do chip inoperacionais para quaisquer ciclos de medição subsequente.A secondary approach to ensuring that a previously used chip is not reinserted into the machine includes encoded serial numbers, or codes, directly on the chip. The base unit will store the numbers of the chips used in memory and cross your reference with new chips placed in the base connector. If the base unit finds that the chip serial number used is the same as an old chip, then the system will refuse to measure the osmolarity until a new chip is inserted. It is important to ensure the use of a new chip for each test because the proteins adsorb and salt crystals form on the electrodes after the evaporation has taken place, which corrupts the integrity of the measuring electrodes. FIGURE 12 is a flowchart describing an exemplary osmolarity measuring technique according to the invention. A sample of body fluid, such as a tear film, is collected in the carton 1300. Typically, the sample contains less than one microliter. In box 1302, the collected sample is deposited on a sample substrate region of the chip. The energetic properties of the sample are then measured in the carton 1304. The measured energy properties are then processed, in the carton 1306, to determine the osmolarity of the sample. If the chip operates according to the electrical conductivity measurement, then the measurement processing in the box 1306 29 ΡΕ2142905 may include the " oxidation of the electrode " described above which renders the chip electrodes inoperative for any subsequent measurement cycles.

No processo de medição para um sistema de medição da condutividade, uma mudança substancialmente instantânea é observada a partir da voltagem do circuito aberto até um valor que quase representa o estado da amostra na altura da colheita, ao ser colocada uma amostra de película de lágrima sobre uma matriz de eléctrodos do substrato. Subsequentemente, um desvio na condutividade da amostra será reflectido como uma alteração contínua na saída. A saída do chip de medição pode ser uma voltagem de tempo variado que é traduzida num valor de osmolaridade. Assim, num sistema baseado na condutividade, mais informação do que apenas a "condutividade eléctrica" da amostra pode ser obtida pela medição da resposta de frequência numa vasta gama de sinais de entrada, o que melhora o processamento da fase final. Por exemplo, a calibração pode ser efectuada em múltiplas frequências (por exemplo, medir a proporção dos sinais a 10, 20, 30, 40, 50, 100 Hz) para fazer do processo de medição um cálculo relativo. Isto faz com que o desvio da voltagem de chip para chip seja pequeno. O método Standard para as medições de base do eléctrodo em macroescala (isto é, num medidor de pH, ou técnica microcapilar) é depender de tampões conhecidos para determinar uma curva linear de calibração. Como a fotoli-tografia é uma técnica de fabrico relativamente reprodu- 30 ΡΕ2142905 zível, quando acoplada a um varrimento de frequência, a calibração pode ser efectuada sem intervenção do operador.In the measurement process for a conductivity measurement system, a substantially instantaneous change is observed from the open circuit voltage to a value that almost represents the state of the sample at the time of harvest, when a tear film sample is placed over an array of electrodes from the substrate. Subsequently, a deviation in sample conductivity will be reflected as a continuous change in the output. The output of the measurement chip may be a varied time voltage which is translated into an osmolarity value. Thus, in a system based on conductivity, more information than just " electrical conductivity " of the sample can be obtained by measuring the frequency response on a wide range of input signals, which improves the processing of the final phase. For example, calibration may be performed at multiple frequencies (e.g., measuring the ratio of signals at 10, 20, 30, 40, 50, 100 Hz) to make the measurement process a relative calculation. This causes the voltage deviation from chip to chip to be small. The standard method for macroscale electrode base measurements (i.e., a pH meter, or microcapillary technique) is to rely on known buffers to determine a linear calibration curve. As photolygraphy is a relatively reproducible manufacturing technique, when coupled to a frequency scan, calibration can be performed without operator intervention.

Tal como atrás referimos, o processamento das propriedades enerqéticas pode ser efectuado numa configu-ração de rede neuronal, onde os pontos dos dados medidos aparentemente díspares obtidos a partir das propriedades energéticas podem ser usados para fornecer uma leitura da osmolaridade mais exacta do que a partir de uma única medição da propriedade energética. Por exemplo, se apenas for medida a condutividade eléctrica da amostra, então a curva de calibração pode ser usada para, simplesmente, se obter o valor de osmolaridade que corresponde à condutividade. 0 valor de osmolaridade, contudo, não será geralmente tão exacto como a saída da rede neuronal. A rede neuronal pode ser designada para funcionar sobre uma colecção de curvas de calibração que reflicta uma função de transferência substancialmente optimizada entre as propriedades energéticas da amostra de fluido e da osmolaridade. Assim, num modelo de realização, a rede neuronal constrói uma colecção de curvas de calibração para todas as variáveis de interesse, tais como voltagem, velocidade de evaporação e alteração do volume. A rede neuronal também pode construir ou receber como uma entrada uma lista de prioridades que atribua um factor de importância a cada variável para indicar a importância da variável ao resultado final, ou ao valor de osmolaridade. A rede neuronal constrói as curvas de calibração ao qualificar 31 ΡΕ2142905 sobre exemplos de dados reais onde o resultado final é conhecido a priori. Em conformidade, a rede neuronal será qualificada para predizer o resultado final a partir da melhor combinação de variáveis possível. Esta configuração da rede neuronal que processa as variáveis numa combinação eficiente é então carregada na unidade de processamento que reside no chip de medição 701 ou na unidade de base. Uma vez qualificada, a rede neuronal pode ser configurada em software ou hardware. A capacidade de identificar e subtrair defeitos de fabrico nos eléctrodos antes de testar a osmolaridade também pode ser importante. Isto também pode ser conseguido através da calibração de um dispositivo de calibração da osmolaridade que compreende um chip de osmolaridade, tal como o chip 1200 ilustrado na FIGURA 2. Este tipo de calibração também pode ser conseguido, possivelmente de maneira mais eficiente, através do uso de redes neuronais, mas entender-se-á que essas redes não são necessárias para conseguir os processos de calibração descritos a seguir.As discussed above, processing of the energetic properties can be performed in a neural network configuration, where the dots of the apparently disparate measured data obtained from the energy properties can be used to provide a more accurate osmolarity reading than from of a single measurement of energy ownership. For example, if only the electrical conductivity of the sample is measured, then the calibration curve can be used to simply obtain the osmolarity value corresponding to the conductivity. The osmolarity value, however, will not generally be as accurate as the output of the neural network. The neural network may be designed to operate on a collection of calibration curves which reflects a substantially optimized transfer function between the energetic properties of the fluid sample and the osmolarity. Thus, in one embodiment, the neural network constructs a collection of calibration curves for all variables of interest, such as voltage, evaporative velocity, and volume change. The neural network can also construct or receive as an input a priority list that assigns an importance factor to each variable to indicate the importance of the variable to the final result, or to the osmolarity value. The neural network constructs the calibration curves by qualifying 31 ΡΕ2142905 on real data examples where the final result is known a priori. Accordingly, the neural network will be qualified to predict the end result from the best possible combination of variables. This configuration of the neural network which processes the variables in an efficient combination is then loaded into the processing unit residing on the measurement chip 701 or the base unit. Once qualified, the neural network can be configured in software or hardware. The ability to identify and subtract manufacturing defects in the electrodes before testing for osmolarity may also be important. This may also be achieved by calibrating an osmolarity calibration device comprising an osmolarity chip, such as the chip 1200 shown in FIGURE 2. This type of calibration can also be achieved, possibly more efficiently, by using of neuronal networks, but it will be understood that such networks are not necessary to achieve the calibration processes described below.

Classicamente, os eléctrodos de metal não revestido foram considerados dispositivos de fraca medição quando colocados em contacto directo com uma solução electroquímica a observar. Além disso, pode existir uma camada dupla de contraiões que rodeiem o eléctrodo na interface metal/solução que pode impor um campo de magnitude suficiente para alterar significativamente a quantidade iónica a observar. Em soluções a granel, as 32 ΡΕ2142905 correntes de convecção ou agitação podem perturbar estas distribuições e provocar ruido variável no tempo, cuja magnitude seja da ordem do sinal respectivo. Além disso, a capacidade de polarização e histerese dos eléctrodos pode provocar problemas se forem procurados pequenos sinais para os eléctrodos. Finalmente, fontes DC grandes ou AC de baixa frequência, a partir do eléctrodo também podem provocar electrólise irreversível que resulta em bolhas e em oxidação de espécies biológicas importantes. As bolhas introduzem alterações dieléctricas variáveis próximas do eléctrodo e invalidam as inferências em redor da solução a partir de voltagens medidas nessas condições.Classically, uncoated metal electrodes were considered to be poorly measured devices when placed in direct contact with an electrochemical solution to be observed. In addition, there may be a double layer of counterions surrounding the electrode at the metal / solution interface which may impose a field of magnitude sufficient to significantly alter the ionic amount to be observed. In bulk solutions, 32 ΡΕ2142905 convection or stirring currents can disturb these distributions and cause time-varying noise whose magnitude is of the order of the respective signal. In addition, the polarization and hysteresis capabilities of the electrodes can cause problems if small signals are sought for the electrodes. Finally, large DC or low frequency AC sources from the electrode can also lead to irreversible electrolysis resulting in bubbles and oxidation of important biological species. The bubbles introduce variable dielectric changes near the electrode and invalidate inferences around the solution from voltages measured under these conditions.

Uma solução convencional para estes efeitos é a de separar fisicamente os eléctrodos da solução através de uma ponte de sal, pelo que as bolhas e outras não linearidades na vizinhança imediata dos eléctrodos activos são grandemente irrelevantes para a distribuição em estado regular de iões que fluam afastados dos eléctrodos. Como um exemplo, em dispositivos configurados para medir o pH de uma solução, os eléctrodos de metal podem ser separados da solução a granel com uma membrana semipermeável tal como vidro ou cerâmica. Além disso, o eléctrodo de metal dentro da membrana semipermeável compreende geralmente Ag (prata) ou calomelano (mercúrio) imerso numa solução de cloreto de prata ou de cloreto de mercúrio. Isto permite que uma única reacção química domine a acção próxima do eléctrodo. A reacção pode ser mantida próxima de equilíbrio e, quando um gradiente de iões é criado através da membrana semiper- 33 ΡΕ2142905 meável, uma força osmótica é transmitida à superficie do eléctrodo através da reacção redox simétrica que reconduz o sistema em direcção ao equilibrio. Desta forma, os iões estão equilibrados na solução de vidro e na interface de eléctrodo/tampão e não podem ser minimizadas nenhumas não linearidades.A conventional solution to these effects is to physically separate the electrodes from the solution through a salt bridge, whereby the bubbles and other non-linearities in the immediate vicinity of the active electrodes are largely irrelevant to the regular distribution of ions that flow away two electrodes. As an example, in devices configured to measure the pH of a solution, the metal electrodes may be separated from the bulk solution with a semipermeable membrane such as glass or ceramic. In addition, the metal electrode within the semipermeable membrane generally comprises Ag (silver) or calomel (mercury) immersed in a solution of silver chloride or mercuric chloride. This allows a single chemical reaction to dominate the action near the electrode. The reaction can be kept close to equilibrium and, when an ion gradient is created through the meperable semipermeable membrane, an osmotic force is transmitted to the surface of the electrode through the symmetrical redox reaction which brings the system towards equilibrium. In this way, the ions are balanced in the glass solution and at the electrode / buffer interface and no non-linearities can be minimized.

Contudo, em contraste com os sistemas de medição típicos, as medições clínicas da osmolaridade da película de láqrima humana exigem eléctrodos muito menores do que os dos sistemas tradicionais. Isto deve-se ao facto de dezenas de nanolitros representarem o volume máximo viável da recolha de pacientes com, por exemplo, queratoconjuntivite seca. Tal como atrás referimos, os sistemas e métodos aqui descritos podem permitir um dispositivo clínico para medir lágrima que podem satisfazer as estritas exigências para medições exactas e diagnóstico nesta área usando eléctrodos de metal não revestido impressos numa micropastilha, por exemplo, tal como apresentada na FIGURA 1 e FIGURA 2. Como resultado, nenhuma das soluções tradicionais para proteger os eléctrodos é possível para esses dispositivos porque as dimensões físicas são demasiado pequenas. A, por exemplo, 80 pm de diâmetro, os eléctrodos fotolitografados impedem que se fabriquem membranas de maneira eficaz em termos de custo. Por exemplo, uma camada de permeação por gel revestida por rotação é proibitivamente cara, resulta num processo de baixo rendimento e introduz várias variâncias de fabrico. Além disso, perturbações osmóticas devido a gradientes em ponte de sal iriam sobrecarregar o minúsculo 34 ΡΕ2142905 volume da amostra a observar. Portanto, muitos dos métodos típicos para fazer medições com eléctrodos de macroescala não podem ser aplicados aos eléctrodos micro e os problemas adicionais de calibração mantêm-se.However, in contrast to typical metering systems, clinical measurements of osmolarity of human film films require much lower electrodes than traditional systems. This is due to the fact that dozens of nanoliters represent the maximum viable volume of collection of patients with, for example, dry keratoconjunctivitis. As noted above, the systems and methods described herein may enable a clinical tear measuring device that can meet the stringent requirements for accurate and diagnostic measurements in this area using uncoated metal electrodes imprinted on a microchip, for example as shown in FIGURE 1 and FIGURE 2. As a result, none of the traditional solutions to protect the electrodes is possible for these devices because the physical dimensions are too small. A, for example, 80 Âμm in diameter, the photolithograted electrodes prevent cost effective manufacturing of membranes. For example, a spin coated gel permeation layer is prohibitively expensive, results in a low yield process and introduces various manufacturing variances. In addition, osmotic disturbances due to salt bridge gradients would overload the minuscule 34 ΡΕ2142905 volume of the sample to be observed. Therefore, many of the typical methods for making measurements with macroscale electrodes can not be applied to the microelectrodes and the additional calibration problems remain.

Para estabelecer um perfil de calibração linear, onde a entrada é directamente equilibrada com a saída, os eléctrodos de macroescala são tipicamente imersos em múltiplos padrões conhecidos. Por exemplo, os medidores de pH utilizarão um conjunto de três tampões a pH 4, 7 e 10, marcando cada fluido um ponto para a linha montada. Entre cada ponto de calibração, o eléctrodo de macroescala pode ser lavado e seco para garantir que os padrões não se misturam. Partindo-se do princípio de que o tampão do eléctrodo dentro da câmara de vidro tem uma certa concentração, então a calibração pode ser efectuada com tão pouco quanto um ponto modelo. Contudo, com o tempo, o tampão do eléctrodo que era homogéneo torna-se contaminado com as substâncias que mediu, o que exige, então, pelo menos uma calibração de dois pontos para que seja exacto.To establish a linear calibration profile, where the input is directly balanced with the output, macroscale electrodes are typically immersed in multiple known patterns. For example, pH meters will use a set of three buffers at pH 4, 7 and 10, each fluid marking one point for the assembled line. Between each calibration point, the macroscale electrode can be washed and dried to ensure that the standards do not mix. Assuming that the electrode plug within the glass chamber has a certain concentration, then the calibration can be performed with as little as one model point. However, over time, the electrode plug that was homogeneous becomes contaminated with the substances it has measured, which then requires at least a two-point calibration to be accurate.

Quando se trabalha com microeléctrodos, contudo, é por vezes impossível efectuar passos de calibração convencional, como os que atrás foram descritos, sem correr o risco de danificar a matriz e comprometer quaisquer medições consequentes. Por exemplo, depois de um modelo de calibração ter sido colocado no chip, não é prático limpar a matriz com papel porque os riscos na superfície do eléctrodo iram resultar em densidades de corrente 35 ΡΕ2142905 extremamente elevadas na aresta do risco, o que resultará então em bolhas e medições inválidas. Além disso, se for usado um modelo de lágrimas humanas para o modelo de calibração, isto é, com 10 mg/ml de BSA como constituinte, a adsorção de proteína à superfície do eléctrodo iria corromper a pureza de uma medição clínica. Finalmente, se uma pequena quantidade de solução salina for usada para determinar pontos de calibração, o fluido evaporará, deixando um cristal de sal muito notável sobre porções aleatórias da superfície do chip. Este sal residual irá então dissolver-se em qualquer amostra subsequente que for colocada no chip e, ao contrário da independência de volume exibida pela condutividade, ligeiras diferenças na quantidade de fluido depositado como norma resultarão em quantidades diferentes do sal adicionado à amostra de fluido em observação.When working with microelectrodes, however, it is sometimes impossible to perform conventional calibration steps, such as those described above, without running the risk of damaging the matrix and compromising any consequent measurements. For example, after a calibration model has been placed on the chip, it is not practical to clean the die with paper because the scratches on the electrode surface will result in extremely high current densities 35 ΡΕ2142905 at the edge of the hazard, bubbles and invalid measurements. Furthermore, if a human tears model is used for the calibration model, i.e. with 10 mg / ml BSA as a constituent, protein adsorption to the electrode surface would corrupt the purity of a clinical measurement. Finally, if a small amount of saline is used to determine calibration points, the fluid will evaporate, leaving a very remarkable salt crystal over random portions of the chip surface. This residual salt will then dissolve in any subsequent sample that is placed on the chip and, unlike the volume independence exhibited by the conductivity, slight differences in the amount of fluid deposited as a standard will result in different amounts of the salt added to the sample of fluid in Note.

Finalmente, um teste clínico para o olho seco exige uma conversão a partir do movimento relativo de iões em solução para uma osmolaridade absoluta que pode ser comparada entre testes com o passar do tempo. 0 valor final deve ser independente do dispositivo de medição e estável com o passar do tempo para se qualificar para efeitos de diagnóstico. Em conformidade, a capacidade de calibrar uma matriz de microeléctrodos, tais como os que atrás foram descritos, pode ser prejudicada por vários desafios restantes quando se tenta obter as mais estritas tolerâncias possíveis para o dispositivo de medição. 36 ΡΕ2142905Finally, a clinical test for dry eye requires a conversion from the relative movement of ions into solution to an absolute osmolarity that can be compared between tests over time. The final value must be independent of the measuring device and stable over time to qualify for diagnostic purposes. Accordingly, the ability to calibrate a microelectrode array, such as those described above, may be hampered by several remaining challenges when attempting to achieve the strictest possible tolerances for the metering device. 36 ΡΕ2142905

Tal como descrevemos a seguir, contudo, podem ser usadas várias abordagens para calibrar uma matriz de microeléctrodos, tais como os que estão atrás descritos, de acordo com os sistemas e métodos aqui descritos. Estas abordagens podem, cada, começar por determinar uma condu-tividade intrínseca para cada eléctrodo na matriz. A condutividade intrínseca pode então ser armazenada e usada para subtrair o efeito da condutividade intrínseca das medições finais das propriedades eléctricas de um fluido de teste, tal como uma lágrima. Dependendo do modelo de realização, pode ser usada uma norma na determinação de um factor de calibração para os eléctrodos. Além disso, quando se usa um modelo, um passo de lavagem subsequente pode ou não ser incluído.As described below, however, various approaches can be used to calibrate a matrix of microelectrodes, such as those described above, in accordance with the systems and methods described herein. These approaches can each begin by determining an intrinsic conductivity for each electrode in the array. The intrinsic conductivity can then be stored and used to subtract the effect of the intrinsic conductivity from the final measurements of the electrical properties of a test fluid, such as a tear. Depending on the embodiment, a standard can be used in determining a calibration factor for the electrodes. In addition, when using a template, a subsequent wash step may or may not be included.

Também deve indicar-se que várias abordagens podem ser combinadas de maneira modular para produzir resultados de calibração ainda mais exactos. As abordagens podem, assim, ser usadas em planos para produzir níveis sucessivos de complexidade para minimizar a variabilidade entre os testes. A FIGURA 13 é um fluxograma que ilustra um modelo de realização de um método para calibrar um dispositivo de medição de osmolaridade que não usa um modelo de acordo com um modelo de realização dos sistemas e métodos aqui descritos. Na caixa 1402 é medida a condutividade intrínseca dos eléctrodos. A condutividade intrínseca medida para cada eléctrodo pode então ser armazenada numa memória. Na caixa 37 ΡΕ2142905 1404, uma amostra de fluido a observar, tal como uma película de lágrima, é introduzida no dispositivo de medição e as propriedades eléctricas da amostra de fluido são medidas na caixa 1406. Num modelo de realização, os circuitos de processamento também identificam os eléctrodos a partir da matriz de eléctrodos que estão em contacto com o fluido da amostra na caixa 1408. Os eléctrodos que estão em contacto com o fluido da amostra são eléctrodos de condução, e a identidade dos eléctrodos de condução também pode ser armazenada em memória. Na caixa 1410, os circuitos de processamento ajustam as propriedades eléctricas medidas da amostra de fluido para se ajustarem à condutividade intrínseca dos eléctrodos, numa base em pares, que efectuaram a medição da amostra. Este ajuste resulta numa medição da osmolaridade só da amostra e é independente das variâncias de espessura de metalização do eléctrodo, deposição dieléctrica e outras variâncias nos eléctrodos que podem ocorrer durante o fabrico do dispositivo de medição. A condutividade intrínseca pode ser determinada (caixa 1402), num modelo de realização, aplicando uma corrente DC na matriz de eléctrodos e medindo a voltagem de saída resultante para cada eléctrodo. A resistência correspondente pode então ser calculada com base na corrente DC e a voltagem de saída e, por exemplo, armazenada em memória. Num modelo de realização alternativo, um sinal mais complexo, por exemplo, uma onda de senos, pode ser gerada no domínio de tempo e aplicada à matriz de eléctrodos. As 38 ΡΕ2142905 produções correspondentes podem então ser medidas e armazenadas. Uma transformada de Fourier pode então ser aplicada aos dados de saída armazenados. 0 resultado é um mapa de amplitude contra frequência que indica a condu-tância relativa sobre uma gama de frequências para cada eléctrodo. Este mapa pode ser gerado para uma gama de frequências a observar para uma implementação particular, por exemplo, partindo de uma gama baixa de kHz para MHz.It should also be noted that various approaches can be combined in a modular manner to produce even more accurate calibration results. Approaches can thus be used in plans to produce successive levels of complexity to minimize variability between tests. FIGURE 13 is a flowchart illustrating an embodiment of a method for calibrating an osmolarity measuring device which does not use a template in accordance with an embodiment of the systems and methods described herein. In box 1402 the intrinsic conductivity of the electrodes is measured. The measured intrinsic conductivity for each electrode can then be stored in a memory. In box 37 ΡΕ2142905 1404, a sample of fluid to be observed, such as a tear film, is introduced into the metering device and the electrical properties of the fluid sample are measured in the carton 1406. In one embodiment, the processing circuits also identify the electrodes from the array of electrodes that are in contact with the sample fluid in the housing 1408. The electrodes that are in contact with the sample fluid are conduction electrodes, and the identity of the conducting electrodes can also be stored in memory. In box 1410, the processing circuitry adjusts the measured electrical properties of the fluid sample to conform to the intrinsic conductivity of the electrodes on a paired basis which performed sample measurement. This adjustment results in a measurement of the osmolarity only of the sample and is independent of the thickness metallization variances of the electrode, dielectric deposition and other variances in the electrodes that may occur during manufacture of the measuring device. Intrinsic conductivity can be determined (box 1402) in one embodiment by applying a DC current in the electrode array and measuring the resulting output voltage for each electrode. The corresponding resistance can then be calculated based on the DC current and the output voltage and, for example, stored in memory. In an alternative embodiment, a more complex signal, for example a breast wave, may be generated in the time domain and applied to the electrode array. The 38 ΡΕ2142905 corresponding productions can then be measured and stored. A Fourier transform can then be applied to the stored output data. The result is an amplitude versus frequency map which indicates the relative conductivity over a range of frequencies for each electrode. This map can be generated for a range of frequencies to be observed for a particular implementation, for example, starting from a low range from kHz to MHz.

Para entregar um sinal de corrente a cada eléctrodo e medir a saida resultante para efeitos de cali-bração, podem ser fornecidos dois condutores para cada eléctrodo. 0 sinal de corrente pode então ser aplicado e a saida medida, para determinado eléctrodo, através dos dois condutores.To deliver a current signal to each electrode and measure the resultant output for calibration purposes, two conductors can be provided for each electrode. The current signal can then be applied and the output measured, for a determined electrode, through the two conductors.

Num modelo de realização desse tipo, o declive da resultante curva de calibração pode ser assumido para ser constante com o passar do tempo. A curva pode então ser construída num dispositivo de medição da osmolaridade, tal como os atrás descritos. Ajustes para as determinações da osmolaridade podem então ser efectuados através da subtrac-ção da resistência do eléctrodo, o que irá simplesmente desviar a sequenciação de entrada ao longo do eixo x da curva de calibração. Outros efeitos, tais como os efeitos de humidade e temperatura ambiente podem, então, dependendo do modelo de realização, ser contabilizados no processamento de sinal subsequente. 39 ΡΕ2142905 A capacidade de sequenciar a condutividade intrínseca de cada par de eléctrodos antes do teste também confere uma ligação de confiança aos locais da matriz. Desta maneira, o eléctrodo é definido como um processo aleatório de variáveis aleatórias gaussianas com uma média de amostra e variância como definida pelos cálculos de condutividade atrás referidos. Qualquer eléctrodo fora dos 95% da variância esperada pode ser considerado com defeito e os seus sinais podem ser negligenciados em cálculos futuros. Esta capacidade para tratar selectivamente pares de eléctrodos numa matriz potência a capacidade de calibrar a leitura e proteger contra defeitos de fabrico espúrios.In such an embodiment, the slope of the resulting calibration curve can be assumed to be constant over time. The curve may then be constructed in an osmolarity measuring device, such as those described above. Settings for the osmolarity determinations can then be performed by subtracting the resistance from the electrode, which will simply bypass the input sequencing along the x-axis of the calibration curve. Other effects such as the effects of humidity and ambient temperature may then, depending on the embodiment, be counted in the subsequent signal processing. 39 ΡΕ2142905 The ability to sequence the intrinsic conductivity of each pair of electrodes before the test also gives a reliable bond to the sites of the array. In this way, the electrode is defined as a random process of Gaussian random variables with a sample mean and variance as defined by the above conductivity calculations. Any electrode outside 95% of the expected variance can be considered defective and its signals may be neglected in future calculations. This ability to selectively treat pairs of electrodes in a matrix enhances the ability to calibrate reading and protect against spurious manufacturing defects.

Como um exemplo, deve lembrar-se que a matriz de eléctrodos da FIGURA 2 fornece um meio para medir o tamanho de, por exemplo, uma gotícula de lágrima 202 detectando a extensão dos eléctrodos de condução 208 para assim determinar a extensão da gotícula. Em particular, o processamento dos circuitos pode determinar o número de eléctrodos que estão a conduzir e, portanto, o número de eléctrodos adjacentes que estão cobertos pela gotícula 202. As identidades dos eléctrodos a partir da matriz que estão a conduzir e em contacto com o fluido da amostra 202 pode então ser armazenado em memória.As an example, it should be noted that the electrode array of FIGURE 2 provides a means for measuring the size of, for example, a tear droplet 202 by detecting the extent of the conducting electrodes 208 to thereby determine the extent of the droplet. In particular, the processing of the circuits can determine the number of electrodes being driven and hence the number of adjacent electrodes which are covered by the droplet 202. The identities of the electrodes from the array which are conducting and contacting the electrode sample fluid 202 may then be stored in memory.

Assim, depois de completado o teste da amostra, a condutividade intrínseca de todos os pares de eléctrodos condutores pode ser subtraído do sinal de saída da amostra para calcular um valor de osmolaridade indicativo só da 40 ΡΕ2142905 amostra. Num modelo de realização, é importante reconhecer que o fluido da amostra 202 não irá cobrir todos os eléctrodos na matriz. Portanto, só os eléctrodos que estão a conduzir e em contacto com o fluido da amostra 202 são incluídos no cálculo para ajustar a medição da amostra. Tal como referimos, a resultante medição da osmolaridade da amostra de fluido 202 é, portanto, efectuada independente de variâncias na espessura de metalização dos eléctrodos, deposição dieléctrica e outras variâncias que podem ocorrer durante o fabrico de eléctrodos condutores que efectuam a medição.Thus, after completion of the sample test, the intrinsic conductivity of all pairs of conducting electrodes can be subtracted from the sample output signal to calculate an osmolarity value indicative of only the 40 ΡΕ2142905 sample. In one embodiment, it is important to recognize that the sample fluid 202 will not cover all the electrodes in the array. Therefore, only the electrodes which are conducting and contacting the fluid of the sample 202 are included in the calculation to adjust the sample measurement. As mentioned, the resulting measurement of the osmolarity of the fluid sample 202 is therefore performed regardless of variances in electrode metallization thickness, dielectric deposition, and other variances that may occur during the manufacture of conducting electrodes performing the measurement.

Enquanto os sistemas e métodos para a calibração que acabámos de descrever são úteis e fáceis de implementar, exigindo software minimo depois do processamento para conseguir qualquer correcção necessária, é pouco provável que este método detecte deformidades agudas nas geometrias dos eléctrodos tais como picos metálicos ou arestas ásperas porque estes defeitos não irão alterar significativamente a condutividade intrínseca dos eléctrodos. Pode mostrar-se que os eléctrodos de metal não revestido atrás descritos bastam para a medição quando é usada frequência sinusoidal elevada como sinais de entrada para os microeléctrodos. Mesmo a 10 V pico a pico, as ondas de 10 - 100 kHz não dão origem a bolhas na alíquota de amostra de película de lágrima que está a ser medida. Isto pode ser devido ao facto de que, dentro desta gama de frequências, há um equilíbrio entre a capacidade de polarizar água e a mobilidade iónica, resultando mais em oscilações de iões do 41 ΡΕ2142905 que em movimento de massa. Isto soluciona muitos problemas com electrólise e outros problemas com eléctrodos DC. Contudo, quando se aplica um amostra de fluido, as geometrias dos eléctrodos tais como picos de metal ou arestas ásperas podem provocar bolhas e alterar a medição. Portanto, para ter em conta estes efeitos, é útil começar cada teste com um ou dois pontos modelo de calibração antes do uso. A FIGURA 14 é um fluxograma que ilustra um modelo de realização de um método para calibrar um dispositivo de medição da osmolaridade com um fluido modelo. Na caixa 1502, uma curva de calibração é fornecida numa memória, e a curva de calibração é assumida como sendo uma linha recta. É obtido um ponto da linha partindo-se do principio de que quando as propriedades eléctricas medidas do modelo são iguais a zero, a osmolaridade do modelo é igual a zero. As propriedades eléctricas (isto é, a transformada de Fourier da onda de senos, etc.) da extremidade alta da gama de concentração, cerca de 500 mOsms, pode então ser predefinida em memória baseada em propriedades eléctricas conhecidas para um fluido com uma concentração conhecida.While the systems and methods for calibration just described are useful and easy to implement, requiring minimal software after processing to achieve any necessary correction, this method is unlikely to detect acute deformities in electrode geometries such as metal peaks or edges because these defects will not significantly alter the intrinsic conductivity of the electrodes. It may be shown that the above-described uncoated metal electrodes are sufficient for measurement when high sinusoidal frequency is used as input signals for the microelectrodes. Even at 10 V peak to peak, the waves of 10 - 100 kHz do not give rise to bubbles in the tear film sample aliquot being measured. This may be due to the fact that, within this frequency range, there is a balance between the ability to polarize water and the ionic motility, resulting in more oscillations of 41 ΡΕ2142905 ions than in mass movement. This solves many problems with electrolysis and other problems with DC electrodes. However, when a fluid sample is applied, electrode geometries such as metal peaks or rough edges can cause bubbles and change the measurement. Therefore, to take these effects into account, it is helpful to start each test with one or two calibration model prior to use. FIGURE 14 is a flowchart illustrating an embodiment of a method for calibrating an osmolarity measuring device with a model fluid. In box 1502, a calibration curve is provided in a memory, and the calibration curve is assumed to be a straight line. A point on the line is obtained from the principle that when the measured electrical properties of the model are equal to zero, the osmolarity of the model is equal to zero. The electrical properties (i.e., the Fourier transform of the sinewave, etc.) of the high end of the concentration range, about 500 mOsms, may then be predefined in memory based on known electrical properties for a fluid with a known concentration .

Na caixa 1504, um fluido modelo pode ser depositado sobre a matriz de microeléctrodos de um dispositivo de medição e as propriedades eléctricas do modelo podem ser medidas na caixa 1504. Os métodos para medir as propriedades eléctricas do fluido modelo podem incluir os métodos atrás descritos para medir as propriedades eléctricas de 42 ΡΕ2142905 uma amostra de fluido. Um dispositivo de processamento pode então ser configurado para correlacionar as propriedades eléctricas medidas com um valor de osmolaridade e, por exemplo, armazenar a medição de osmolaridade do fluido modelo em memória.In box 1504, a model fluid may be deposited on the microelectrode array of a metering device and the electrical properties of the model may be measured in the carton 1504. Methods for measuring the electrical properties of the model fluid may include the above described methods for measure the electrical properties of a sample of fluid. A processing device may then be configured to correlate the measured electrical properties with an osmolarity value and, for example, store the osmolarity measurement of the model fluid in memory.

Num modelo de realização, o fluido modelo que é adicionado na caixa 1504 compreende uma pequena aliquota, por exemplo, 1 pL, de água desionizada. A medição da osmolaridade para água desionizada pode ser registada como uma ligação inferior sobre a curva de calibração, visto a água desionizada exibir uma quantidade minima de carácter osmótico. Num modelo de realização é usada uma calibração de um ponto, de maneira que toda a gama da escala de medição do dispositivo pode ser extrapolada baseada na diferença entre a osmolaridade esperada da água desionizada e da osmolaridade realmente medida do modelo. Na caixa 1506, o dispositivo de processamento determina um factor de calibração para ajustar o declive da escala de medição para condizer com a curva de calibração. Além disso, quaisquer ajustes ao declive da escala de medição são feitos com o fluido medido por par de eléctrodos, de maneira que o valor final a partir de cada par de eléctrodos seja equivalente a todos os outros. O factor de calibração final pode então ser armazenado em memória.In one embodiment, the model fluid that is added in the carton 1504 comprises a small aliquot, for example, 1 æl of deionized water. The osmolarity measurement for deionized water may be recorded as a lower bond on the calibration curve, since the deionized water exhibits a minimal amount of osmotic character. In one embodiment a one-point calibration is used so that the full range of the metering scale of the device can be extrapolated based on the difference between the expected osmolarity of the deionized water and the actually measured osmolarity of the model. In box 1506, the processing device determines a calibration factor to adjust the slope of the measurement scale to match the calibration curve. Further, any adjustments to the slope of the measurement scale are made with the fluid measured per pair of electrodes, so that the final value from each pair of electrodes is equivalent to all others. The final calibration factor can then be stored in memory.

Depois da calibração ter sido determinada, pode deixar-se o modelo a evaporar a partir da matriz de microeléctrodos na caixa 1508. A evaporação pode ser 43 ΡΕ2142905 necessária para evitar que o modelo se misture com a amostra de fluido e a corrompa. A água desionizada fornece um modelo exemplar quando a água desionizada tem um teor em sal tão baixo que não há cristal de sal depositado no chip depois da evaporação.After the calibration has been determined, the model to be evaporated from the microelectrode array in the 1508 can be left to evaporate. The evaporation can be 43 ΡΕ2142905 necessary to prevent the model from mixing with the sample of the fluid and corroding it. The deionized water provides an exemplary model when the deionized water has a salt content so low that there is no salt crystal deposited on the chip after evaporation.

Num modelo de realização onde não resta cristal de sal depois de o modelo evaporar, a amostra de fluido a ser testado pode então ser depositada na matriz de microeléctrodos do dispositivo de medição na caixa 1510. A matriz de microeléctrodos transfere energia para a amostra de fluido e permite a detecção das propriedades eléctricas da amostra de fluido, que são sequenciadas até uma medição de osmolaridade na caixa 1512 como atrás se descreveu. Na caixa 1514, um dispositivo de processamento pode ser configurado para ajustar a medição da osmolaridade baseado no factor de calibração previamente determinado. O uso do factor de calibração resulta numa medição de osmolaridade que é substancialmente independente de variâncias na geometria da matriz de microeléctrodos. O processo da FIGURA 14 pode também ser combinado com o processo mais simples da FIGURA 13 para melhorar a exactidão. A FIGURA 15 é um fluxograma que ilustra outro modelo de realização de um método para calibrar um dispositivo de medição da osmolaridade usando um fluido modelo que é uma solução salina. Na caixa 1602 pode ser 44 ΡΕ2142905 fornecida uma curva de calibração sobre uma memória, e a curva de calibração pode ser assumida como sendo uma linha recta. Um ponto da linha é obtido partindo-se de principio de que, quando as propriedades eléctricas medidas do modelo são iguais a zero, a osmolaridade do modelo é igual a zero. As propriedades eléctricas da extremidade alta da gama de concentração, cerca de 500 mOsms, pode ser predefinida em memória baseada em propriedades eléctricas conhecidas para um fluido com uma concentração conhecida.In an embodiment where salt crystal is not left after the model evaporates, the sample of fluid to be tested may then be deposited in the microelectrode array of the metering device in the carton 1510. The microelectrode array transfers energy to the fluid sample and enables the detection of the electrical properties of the fluid sample, which are sequenced to an osmolarity measurement in the carton 1512 as described above. In box 1514, a processing device may be configured to adjust the osmolarity measurement based on the predetermined calibration factor. The use of the calibration factor results in an osmolarity measurement which is substantially independent of variances in the geometry of the microelectrode array. The process of FIGURE 14 may also be combined with the simpler process of FIGURE 13 to improve accuracy. FIGURE 15 is a flowchart illustrating another embodiment of a method for calibrating an osmolarity measuring device using a model fluid which is a saline solution. In box 1602, a calibration curve can be given over a memory and the calibration curve can be assumed to be a straight line. A line point is obtained by assuming that when the measured electrical properties of the model are equal to zero, the osmolarity of the model is equal to zero. The high end electrical properties of the concentration range, about 500 mOsms, may be predefined in memory based on known electrical properties for a fluid of known concentration.

Na caixa 1604 um fluido modelo pode ser depositado sobre uma matriz de microeléctrodos de um dispositivo de medição e as propriedades eléctricas do modelo podem ser medidas. Os métodos para medir as propriedades eléctricas do modelo podem, por exemplo, incluir os métodos atrás descritos para medir as propriedades eléctricas de uma amostra de fluido. Um dispositivo de processamento pode então ser configurado para correlacionar as propriedades eléctricas com um valor de osmolaridade, e armazenar a medição de osmolaridade do modelo numa memória.In box 1604 a model fluid can be deposited on a microelectrode array of a metering device and the electrical properties of the model can be measured. Methods for measuring the electrical properties of the model may, for example, include the methods described above for measuring the electrical properties of a fluid sample. A processing device may then be configured to correlate electrical properties with an osmolarity value, and store the osmolarity measurement of the model in a memory.

Na caixa 1606, o dispositivo de processamento pode ser configurado para determinar então um factor de calibração para ajustar o declive da escala de medição para condizer com a curva de calibração. Além disso, quaisquer ajustes ao declive da escala de medição podem ser feitos com o fluido medido numa base por par de eléctrodos, de maneira que o valor final a partir de cada par de eléctrodos seja equivalente a todos os outros. O factor de calibração final pode então ser armazenado em memória. 45 ΡΕ2142905In box 1606, the processing device may be configured to then determine a calibration factor to adjust the slope of the measurement scale to match the calibration curve. Further, any adjustments to the slope of the measurement scale can be made with the fluid measured on a per pair of electrodes basis, so that the final value from each pair of electrodes is equivalent to all others. The final calibration factor can then be stored in memory. 45 ΡΕ2142905

Neste processo, contudo, o modelo pode ser uma simples solução salina (NaCl), ou uma solução salina complexa, por exemplo, com sais de sódio, potássio, cálcio e magnésio em proporções fisiológicas. Contudo, quando a solução de sal se evapora na caixa 1608, um cristal de sal muito notável permanecerá muitas vezes sobre a superfície do chip tal como apresentado na FIGURA 16. Quando isto acontece deve ter-se em conta o cristal de sal que ficou, na subsequente medição da osmolaridade que for feita na caixa 1612.In this process, however, the model may be a simple salt solution (NaCl), or a complex salt solution, for example with sodium, potassium, calcium and magnesium salts in physiological proportions. However, when the salt solution evaporates in the box 1608, a very remarkable salt crystal will often remain on the surface of the chip as shown in FIGURE 16. When this happens, account should be taken of the salt crystal that remained, in subsequent measurement of the osmolarity that is made in the carton 1612.

Por exemplo, a FIGURA 17 demonstra uma resposta típica quando uma amostra de fluido é introduzida numa matriz de microeléctrodos que não inclui sal residual. Em comparação, a FIGURA 18 mostra a resposta quando está presente sal residual na matriz de microeléctrodos na altura em que a amostra de fluido é introduzida. A presença de um cristal de sal altera claramente a resposta, de maneira a declinar de maneira estável durante um período antes de se endireitar e rumar para o modo de evaporação estável. Tal como está apresentada na FIGURA 18, a dinâmica de segunda ordem normal é suprimida. Isto deve-se ao facto de que, ao ser colocada uma amostra, o cristal de sal residual começará a dissolver na amostra de fluido. A concentração de sal residual próxima do eléctrodo continuará a diminuir até a sua contribuição se tornar uniformemente misturada em toda a amostra, depois do que a curva começará a subir outra vez devido à evaporação. 46 ΡΕ2142905For example, FIGURE 17 demonstrates a typical response when a sample of fluid is introduced into a microelectrode array that does not include residual salt. In comparison, FIGURE 18 shows the response when residual salt is present in the microelectrode array at the time the fluid sample is introduced. The presence of a salt crystal clearly alters the response so as to steadily decline for a period before straightening and heading for the steady evaporation mode. As shown in FIGURE 18, normal second order dynamics is suppressed. This is due to the fact that, when a sample is placed, the crystal of the residual salt will begin to dissolve in the fluid sample. The concentration of residual salt near the electrode will continue to decrease until its contribution becomes uniformly mixed throughout the sample, after which the curve will start to rise again due to evaporation. 46 ΡΕ2142905

Durante esta resposta transitória, os iões que se dissolvem entre dois eléctrodos de medição apresentarão uma condutividade muito mais elevada do que na solução originalmente depositada. A FIGURA 16 também mostra como uma goticula de solução salina deslocada pode cobrir a superfície da matriz de maneira diferente, o que significa que o sinal entre pares de eléctrodos será amplamente diferente dependendo da sua proximidade ao cristal de sal.During this transient response, the ions that dissolve between two measuring electrodes will have a much higher conductivity than in the solution originally deposited. FIGURE 16 also shows how a droplet of displaced saline solution may cover the surface of the matrix differently, which means that the signal between pairs of electrodes will be largely different depending on their proximity to the salt crystal.

Portanto, noutro modelo de realização dos sistemas e métodos para calibrar um dispositivo de medição da osmolaridade, um dispositivo de processamento pode ser configurado para eliminar matematicamente os efeitos de quaisquer cristais de sal residual a partir da medição de osmolaridade da amostra na caixa 1614. Os efeitos do cristal de sal residual podem, por exemplo, ser eliminados pela integração das curvas descendentes de cada par de eléctrodos, que calcula a quantidade de sal adicionado à solução. O cálculo da quantidade de sal que é adicionado é conseguido somando apenas a área acima da linha estável que é determinada por uma regressão linear afastada do ponto de tempo da entrega da amostra. Estes efeitos são então subtraídos do volume total da amostra. Tal como anterior-mente se referiu, o volume total da amostra pode ser calculado pelo dispositivo de processamento baseado no número de eléctrodos que estão em contacto com a amostra.Therefore, in another embodiment of the systems and methods for calibrating an osmolarity measuring device, a processing device may be configured to mathematically eliminate the effects of any residual salt crystals from osmolarity measurement of the sample in the carton 1614. The effects of the residual salt crystal can, for example, be eliminated by integrating the downward curves of each pair of electrodes, which calculates the amount of salt added to the solution. Calculation of the amount of salt that is added is achieved by summing only the area above the stable line which is determined by a linear regression away from the time point of sample delivery. These effects are then subtracted from the total sample volume. As previously mentioned, the total volume of the sample can be calculated by the processing device based on the number of electrodes which are in contact with the sample.

Baseada nestes parâmetros, a concentração medida 47 ΡΕ2142905 da amostra é ajustada directamente. A concentração da amostra é baseada no número de iões por unidade de volume. A medição de osmolaridade fornece o número total de iões a partir da amostra mais o cristal de sal residual, e o dispositivo de processamento calcula o volume da amostra. Em conformidade, o ajuste exige a subtracção do número residual de iões de sal do número medido do total de iões na amostra. 0 número de iões de sal residual é determinado através do método de integração atrás referido. Este método permite o uso de uma solução salina modelo em microescala sem a necessidade de dispendioso equipamento de lavagem. Depois de se ter subtraído o efeito do sal residual, o dispositivo de processamento ajusta a resultante medição da osmolaridade baseada no factor de calibração previamente determinado na caixa 1514. 0 uso de um factor de calibração resulta numa medição de osmolaridade que é substancialmente independente das variâncias na geometria da matriz de microeléctrodos. A FIGURA 19 é um fluxograma que ilustra ainda outro modelo de realização de um método para calibrar um dispositivo de medição da osmolaridade com um fluido modelo de acordo com os sistemas e métodos aqui descritos. No modelo de realização da FIGURA 19, pode ser usada uma aguada em conjugação com a aplicação de um fluido modelo. Os passos efectuados nas caixas 1902, 1904 e 1906 foram previamente debatidos e resultam na determinação de um factor de calibração baseado na medição de um ou mais modelos. Numa forma de realização, o modelo contém uma 48 ΡΕ2142905 solução salina simples (NaCl), ou uma solução salina complexa, com sais de sódio, potássio, cálcio e magnésio em proporções fisiológicas.Based on these parameters, the measured concentration 47 ΡΕ2142905 of the sample is adjusted directly. The concentration of the sample is based on the number of ions per unit volume. The osmolarity measurement provides the total number of ions from the sample plus the crystal of residual salt, and the processing device calculates the sample volume. Accordingly, the adjustment requires the subtraction of the residual number of salt ions from the measured number of total ions in the sample. The number of residual salt ions is determined by the above-mentioned integration method. This method allows the use of a microscale saline solution without the need for expensive washing equipment. After the effect of the residual salt has been subtracted, the processing device adjusts the resulting osmolarity measurement based on the calibration factor previously determined in the box 1514. The use of a calibration factor results in an osmolarity measurement that is substantially independent of the variances in the geometry of the microelectrode array. FIGURE 19 is a flowchart illustrating yet another embodiment of a method for calibrating an osmolarity measuring device with a model fluid in accordance with the systems and methods described herein. In the embodiment of FIGURE 19, a watering can be used in conjunction with the application of a model fluid. The steps performed in boxes 1902, 1904 and 1906 were previously discussed and result in the determination of a calibration factor based on the measurement of one or more models. In one embodiment, the model contains a 48 ΡΕ2142905 simple saline solution (NaCl), or a complex salt solution, with sodium, potassium, calcium and magnesium salts in physiological proportions.

Na caixa 1908 é efectuada uma acção para remover o modelo do chip antes de o modelo evaporar e evitar a acumulação de sal residual sobre o chip. Num modelo de realização, o passo de lavagem usa uma câmara microfluidica ligada em série ao substrato que recebe a amostra para permitir uma corrente estável de água desionizada para fluir através da superfície do chip. Uma vez depositada uma alíquota do modelo, quer através de um canal de fluxo microfluidico perpendicular ou por métodos manuais, e logo depois de feita uma medição da calibração, o aparelho de lavagem irá fluir água desionizada através da superfície dos eléctrodos até a condutividade ter alcançado um estado regular comensurável com os esperados níveis de água desionizada. A condutividade estável indica que a superfície do chip foi limpa de qualquer modelo e está pronta para aceitar uma amostra. O fluxo é interrompido e permite-se que a água desionizada se evapore na superfície do chip, idealmente, não deixando restos de qualquer cristal de sal.In box 1908 an action is taken to remove the model from the chip before the model evaporates and prevents the accumulation of residual salt on the chip. In one embodiment, the washing step uses a microfluidic chamber connected in series to the substrate receiving the sample to allow a stable stream of deionized water to flow through the surface of the chip. Once an aliquot of the model is deposited, either through a perpendicular microfluidic flow channel or by manual methods, and soon after a calibration measurement is made, the washing apparatus will flow deionized water through the surface of the electrodes until the conductivity has reached a commensurate state with the expected levels of deionized water. Stable conductivity indicates that the surface of the chip has been cleared from any model and is ready to accept a sample. The flow is interrupted and the deionized water is allowed to evaporate on the surface of the chip, ideally leaving no trace of any salt crystal.

Noutro modelo de realização, um abastecimento de ar regulado a alta pressão pode ser implementado para remover o modelo. O tubo é ligado ao abastecimento de ar e colocado muito próximo do substrato de recepção e num ângulo agudo a partir da superfície. O ângulo é tal que um 49 ΡΕ2142905 rápido sopro de ar do tubo força qualquer fluido à superfície do chip a sair completamente do substrato. 0 fluxo de ar é disparado depois de se completar a medição da calibração. 0 fluxo resultante pode ser pulsado várias vezes até que o sinal em cada par de eléctrodos tenha voltado a abrir os valores do circuito. Noutro modelo de realização, o abastecimento de ar é combinado com a fase de lavagem microfluidica para eliminar a necessidade de evaporar fluidos a partir da superfície do chip.In another embodiment, a high pressure regulated air supply may be implemented to remove the pattern. The tube is connected to the air supply and placed very close to the receiving substrate and at an acute angle from the surface. The angle is such that a rapid puff of air from the tube forces any fluid to the surface of the chip to come out completely from the substrate. The airflow is triggered after the calibration measurement is complete. The resulting flux can be pulsed several times until the signal at each pair of electrodes has reopened the circuit values. In another embodiment, the air supply is combined with the microfluidic lavage phase to eliminate the need to evaporate fluids from the chip surface.

Além disso, calibrações de pontos múltiplos podem ser efectuadas se um aparelho de lavagem completo for ligado à superfície do chip, onde são depositadas, ou fluidas, água desionizada e soluções salinas cada vez mais concentradas sobre a superfície do chip e, então, é usado um sopro de ar para limpar a matriz. Nas caixas 1912 e 1914 a amostra de fluido é depositada sobre a matriz de microeléctrodos e a medição da osmolaridade calibrada é completa nos métodos que atrás referimos.In addition, multi-point calibrations may be performed if a complete lavage apparatus is attached to the surface of the chip, where deionized water and saline solutions are increasingly or more concentrated on the surface of the chip and then used a breath of air to clean the matrix. In boxes 1912 and 1914 the fluid sample is deposited on the microelectrode array and the calibrated osmolarity measurement is complete in the above methods.

Normalização do marcador biológicoStandardization of the biological marker

Na maioria dos pacientes que sofrem da sindrome do olho seco (SOS), alergia ocular, infecções generalizadas ou oculares, blefarite, diabetes ou outras doenças nas quais o ADN ou outros marcadores biológicos estão presentes nas lágrimas, há uma necessidade clinica evidente de se poder analisar quantidades em nanonolitros de lágrimas recolhidas a partir do lago lacrimal inferior. 50 ΡΕ2142905 São necessárias amostras de lágrima em nanolitros para minimizar o tempo de residência de um dispositivo de recolha dentro do lago lacrimal, que reduza a possibilidade de induzir lágrimas reflexas, uma situação na qual lágrimas hipo osmolares (menos concentradas, muito aquosas) inundam a superficie ocular, reduzindo assim as concentrações disponiveis de marcador biológico e introduzindo variabilidade de diagnóstico dentro da rotina clinica. Como a quantidade de lágrimas reflexas é especifica de uma doença e especifica do paciente, a quantidade de diluição varia com o estimulo. Historicamente, os protocolos de recolha de lágrimas sugerem que se recolham volumes de lágrimas relativamente grandes, tipicamente vários microlitros de lágrimas, para se recolher uma amostra com um volume suficiente para se fazerem testes de diagnóstico Standard in vitro. Estes ensaios de marcador biológico por vezes demoram mais de trinta minutos de amostragem continua de lágrimas para se conseguirem esses elevados volumes. Os pacientes mais velhos, e especialmente os que padecem de SOS, muitas vezes apresentam menos de 200 nL de lágrimas disponíveis no lago lacrimal para amostra em determinada altura. Assim, a recolha de lágrimas para testes Standard in vitro é desconfortável e moderadamente invasiva.In most patients suffering from dry eye syndrome (SOS), ocular allergy, generalized or ocular infections, blepharitis, diabetes or other diseases in which DNA or other biological markers are present in tears, there is a clear clinical need to be able to analyze quantities in nanonoliters of tears collected from the lower lacrimal lake. 50 ΡΕ2142905 Tear samples are required in nanoliters to minimize the residence time of a collection device within the tear lake, which reduces the possibility of inducing reflex tears, a situation in which hypo-osmolar (less concentrated, very aqueous) tears flood the surface area, thus reducing the available concentrations of biological marker and introducing diagnostic variability within the clinical routine. As the amount of reflex tears is disease specific and patient specific, the amount of dilution varies with the stimulus. Historically, tear collection protocols have suggested that relatively large tears volumes, typically several microliters of tears, are collected to collect a sample of sufficient volume to perform standard in vitro diagnostic tests. These biological marker assays sometimes take more than thirty minutes of continuous tear sampling to achieve such high volumes. Older patients, and especially those with SOS, often have less than 200 nL of tear available in the tear lake to sample at a given time. Thus, the collection of tears for Standard tests in vitro is uncomfortable and moderately invasive.

As lágrimas hipoosmolares podem resultar de uma variedade de condições. Uma super abundância de lágrimas não lubrificantes pode ocorrer em certos subtipos de olho seco; conhecidos como epífora, estes pacientes podem ter 51 ΡΕ2142905 duetos nasolacrimais oclusos que aumentam o tempo de residência das lágrimas dentro do lago lacrimal.Hypo-osmolar tears can result from a variety of conditions. An overabundance of non-lubricating tears may occur in certain dry eye subtypes; known as epiphora, these patients may have 51 ΡΕ2142905 occlusal nasolacrimal duets that increase the residence time of tears within the lacrimal lake.

Os pacientes com SOS também são conhecidos por terem uma disfunção da pelicula de lágrima que pode resultar numa lágrima hiperosmolar. Quer através de uma deficiência aquosa quer por doença das glândulas de Meibomius, a concentração em equilibrio estável das lágrimas é significativamente aumentada nos pacientes com SOS. Alguns pacientes com SOS são conhecidos por terem concentrações estáveis no lago lacrimal de aproximadamente 30%-50% mais elevadas do que os (sujeitos saudáveis) normais da mesma idade. Frequentemente, têm sido relatadas osmolaridades medidas de 400 mOsm/L no lago lacrimal de pacientes com SOS grave. Também são observadas lágrimas hiperosmolares em utilizadores de lentes de contacto. Independentemente da matéria das lentes de contacto ou do tipo de lente usada, as lentes de contacto perturbam a pelicula de lágrima pré-ocular e desviam a homeostase das lágrimas até um estado hiperosmolar.Patients with SOS are also known to have a tear film dysfunction that can result in a hyperosmolar tear. Whether through aqueous deficiency or Meibomius gland disease, stable steady-state concentration of tears is significantly increased in patients with SOS. Some patients with SOS are known to have stable lacrimal lake concentrations of approximately 30% -50% higher than normal (healthy subjects) of the same age. Frequently, measured osmolality of 400 mOsm / L in the lacrimal lake of patients with severe SOS has been reported. Hyperosmolar tears are also seen in contact lens wearers. Regardless of the matter of the contact lenses or the type of lens used, the contact lenses disrupt the preocular tear film and divert tear homeostasis to a hyperosmolar state.

Os pacientes pós-LASIK e os pacientes com SOS também podem ter vários niveis de inervação e/ou função nervosa, o que afecta a capacidade de produzir lágrimas reflexas. Os diagnósticos ín vitro efectuados neste tipo de pacientes podem, portanto, relatar concentrações bastante diferentes de marcadores biológicos dependendo do estado do paciente e da maneira como as lágrimas são recolhidas. Há uma clara necessidade de métodos de diagnóstico in vitro 52 ΡΕ2142905 que possam eliminar a variabilidade introduzida pela amostragem de lágrimas e a partir de concentrações hipo-osmo-lares e hiperosmolares da pelicula de lágrima.Post-LASIK patients and patients with SOS may also have varying levels of innervation and / or nerve function, which affects the ability to produce reflex tears. The in vitro diagnostics performed on this type of patient may therefore report quite different concentrations of biological markers depending on the condition of the patient and the way tears are collected. There is a clear need for in vitro diagnostic methods 52 ΡΕ2142905 that can eliminate the variability introduced by tear sampling and from hypo-osmotic and hyperosmolar concentrations of the tear film.

Recentemente, uma nova classe de tecnologias microfluidicas reduziram grandemente as necessidades de volume para diagnósticos in vitro, onde podem ser usadas amostras em submicrolitros para testar marcadores biológicos contidos nas lágrimas. Como as lágrimas oferecem uma matriz biológica ideal, grandemente acelular, a partir da qual se efectuam vários diagnósticos in vitro, a recolha de lágrimas pode agora ter interesse para muitos médicos e profissionais de medicina que estejam menos familiarizados com um trabalho próximo da superfície ocular, e que podem, sem saber, provocar lágrimas reflexas indevidas durante a recolha de lágrimas. As lágrimas reflexas indevidas dessa amostragem podem provocar resultados de diagnóstico inexactos. Este problema reforça a necessidade de técnicas de medição das concentrações de marcadores biológicos nas lágrimas que são independentes da recolha de amostras.Recently, a new class of microfluidic technologies greatly reduced volume requirements for in vitro diagnostics, where samples can be used in submicroliters to test biological markers contained in tears. Since tears offer an ideal, highly acellular biological matrix from which various in vitro diagnoses are performed, tear collection may now be of interest to many physicians and medical professionals who are less familiar with work near the ocular surface, and who may unknowingly cause undue reflection tears during the collection of tears. Undue reflection tears from such sampling may cause inaccurate diagnostic results. This problem reinforces the need for techniques for measuring concentrations of biological markers in tears that are independent of sample collection.

De acordo com a presente invenção, a normalização dos marcadores biológicos é efectuada contra uma osmolaridade medida para remover o impacto da recolha de amostras de lágrima, e da homeostase da lágrima especifica de um paciente, da interpretação de concentração em marcador biológico nas lágrimas. A normalização produz um Nivel Ajustado de Marcador Biológico da Lágrima. 53 ΡΕ2142905 A medição tradicional dos marcadores biológicos das lágrimas tais como as imunoglobulinas (IgE, IgA, IgG, IgM) , glicose, niveis de insulina, lactoferrina, lisozima lacrimal, citocinas, hormonas, metabólitos hormonais, fenó-tipos de doença infecciosa, ácidos nucleicos, proteínas, ou fracções lipidicas, são efectuados sem a análise simultânea da osmolaridade lacrimal. Meios tradicionais de medir a osmolaridade lacrimal são incompatíveis com a análise do marcador biológico lacrimal. De acordo com a presente invenção, um substrato de recepção, amostra de zona e mecanismo de transdução energética num canal nanofluídico produzem, pela primeira vez, a possibilidade de medir a osmolaridade lacrimal na mesma amostra de lágrima não diluída como marcador biológico. A combinação de uma interface de recolha de lágrima integrada e um transdutor, produz um efeito de sustentação contra a evaporação que se segue à recolha de amostras. 0 cálculo de um Nível Ajustado de Marcador Biológico de Lágrima é como segue. A osmolaridade normal das lágrimas é geralmente aceite como sendo próxima de 300 mOsm/L (com gamas de 280-316 mOsm/L). O Nível Ajustado de Marcador Biológico de Lágrima pode ser obtido a partir da seguinte equação: Nível Ajustado de Marcador Biológico de Lágrima = (300 mOsm/L*Nível Medido de Marcador Biológico de Lágrima)/ (Nível Medido da Osmolaridade da Lágrima) 54 ΡΕ2142905 O valor definido de 300 mOsm/L pode ser substituído por qualquer um da gama apropriada dos níveis de osmolaridade de lágrimas. Noutro modelo de realização, o nível basal da osmolaridade da lágrima pode ser medido para um paciente específico no início de um estudo, em tratamento prévio, numa idade precoce, ou antes da cirurgia para estabelecer um nível base personalizado da homeostase das lágrimas. No seguimento da passagem do tempo, de uma administração farmacêutica ou de cirurgia, o nível base personalizado pode ser substituído pelos definidos 300 mOsm/L. A FIGURA 20 é um fluxograma que ilustra o processamento de acordo com a técnica de normalização aqui descrita. Inicialmente, na caixa numerada 2002, uma alíquo-ta (tal como um volume em nanolitros de lágrima) de amostra de fluido é recolhida até uma amostra de zona de um amostra de chip. Seguidamente, na caixa 2004, um sinal de saída da osmolaridade é recebido a partir da amostra de zona que indica propriedades energéticas da amostra de fluido, onde o sinal de saída da osmolaridade está correlacionado com a osmolaridade da amostra de fluido. Seguidamente, na caixa 2006, um sinal de saída do marcador biológico é recebido da amostra de zona que indica as propriedades químicas do amostra de fluido, onde o sinal de saída do marcador biológico está correlacionado com a concentração em marcador biológico da amostra de fluido. Seguidamente, na caixa 2008, o sinal de saída da osmolaridade é processado para produzir um valor de osmolaridade para a amostra de fluido e o sinal de saída do marcador biológico é proces- 55 ΡΕ2142905 sado para produzir um valor da concentração em marcador biológico para a amostra de fluido. 0 processamento pode ser efectuado simultaneamente ou em série. Finalmente, na caixa 2010, é determinado o Nivel Ajustado de Marcador Biológico, que produz a normalização dos valores de concentração em marcador biológico. Tal como atrás fizemos notar, o nivel ajustado produz uma normalização dos valores de concentração em marcador biológico e pode corrigir a homeostase da lágrima especifica de um paciente e a variância da amostragem de lágrima induzida clinicamente em ligação com a obtenção da amostra de fluido. A operação ilustrada na FIGURA 20 pode ser efectuada por qualquer dos modelos de realização do sistema ilustrado nos desenhos (FIGURAS 1-11) com um processador configurado para efectuar as operações de normalização tal como aqui descritas.In accordance with the present invention, normalization of the biological markers is performed against an osmolarity measured to remove the impact of tear sample collection, and patient specific tear homeostasis, from the interpretation of biological marker concentration in tears. Standardization produces an Adjusted Level of Tear Biological Marker. 53 ΡΕ2142905 Traditional measurement of biological markers of tears such as immunoglobulins (IgE, IgA, IgG, IgM), glucose, insulin levels, lactoferrin, lacrimal lysozyme, cytokines, hormones, hormone metabolites, infectious disease phenotypes, nucleic, protein, or lipid fractions are performed without the simultaneous analysis of lacrimal osmolarity. Traditional means of measuring lacrimal osmolarity are incompatible with the analysis of the lacrimal biological marker. According to the present invention, a receiving substrate, zone sample and energetic transduction mechanism in a nanofluidic channel produce for the first time the possibility of measuring the tear osmolarity in the same undiluted tear sample as a biological marker. The combination of an integrated tear collection interface and a transducer produces a drag effect against evaporation that follows the sampling. The calculation of an Adjusted Biological Tear Marker Level is as follows. Normal osmolarity of tears is generally accepted as being close to 300 mOsm / L (with ranges of 280-316 mOsm / L). The Adjusted Level of Biological Tear Marker can be obtained from the following equation: Tear Biological Marker Adjusted Level = (300 mOsm / L * Tear Biological Marker Measured Level) / (Tear Osmolarity Measured Level) 54 ΡΕ2142905 The set value of 300 mOsm / L can be replaced by any of the appropriate range of tear osmolarity levels. In another embodiment, the basal level of tear osmolarity can be measured for a specific patient at the start of a study, prior treatment, at an early age, or prior to surgery to establish a personalized baseline level of tear homeostasis. Following the passage of time, a pharmaceutical administration or surgery, the customized base level can be replaced by defined 300 mOsm / L. FIGURE 20 is a flowchart illustrating processing according to the standardization technique described herein. Initially, in the numbered carton 2002, an aliquot (such as a tear nanoliter volume) of fluid sample is collected to a zone sample of a chip sample. Then, in the box 2004, an osmolarity output signal is received from the zone sample indicating energetic properties of the fluid sample, where the osmolarity output signal is correlated with the osmolarity of the fluid sample. Next, in box 2006, a biological marker output signal is received from the zone sample indicating the chemical properties of the fluid sample, where the biological marker signal output correlates with the biological marker concentration of the fluid sample. Then, in box 2008, the osmolarity output signal is processed to produce an osmolarity value for the fluid sample, and the biological marker output signal is processed to produce a biological marker concentration value for the sample of fluid. The processing may be carried out simultaneously or in series. Finally, in box 2010, the Adjusted Level of Biological Marker is determined, which produces the normalization of concentration values in biological marker. As noted above, the adjusted level produces a normalization of concentration values in a biological marker and can correct the patient's specific tear homeostasis and the clinically-induced tear sampling variance in connection with obtaining the fluid sample. The operation shown in FIGURE 20 may be performed by any of the embodiments of the system shown in the drawings (FIGURES 1-11) with a processor configured to perform the normalization operations as described herein.

Se assim se pretender, também é possível fazer um ajuste de circuito aberto, onde a constante de 300 mOsm/L não é usada, como na seguinte equação: Nível Ajustado de Marcador Biológico de Lágrima de Circuito Aberto = Nível Medido de Marcador Biológico de Lágrima/ (Nível Medido da Osmolaridade da Lágrima)If so desired, it is also possible to make an open circuit adjustment, where the constant of 300 mOsm / L is not used, as in the following equation: Open Circuit Tear Biological Marker Adjusted Level = Measured Biological Tear Marker Level / (Tear Osmolarity Measured Level)

Uma vantagem de se usar um modelo ou valor de osmolaridade base pessoal para comparação é a de que o Nível Ajustado de Marcador Biológico de Lágrima é expresso 56 ΡΕ2142905 em unidades idênticas ao Nivel Medido de Marcador Biológico de Lágrima. 0 ajustamento de circuito aberto resultaria num Nivel de Marcador Biológico/mOsms/L, que podia ser um parâmetro mais difícil de interpretar pelos clínicos, especialmente se o analito observado for comummente conhecido como tendo uma gama de unidades não normalizadas. Níveis Ajustados de Marcador Biológico de Lágrima similares podem ser efectuados usando níveis lineares, logaritmicos, exponenciais, ou através do uso de ajustes da curva de calibração. Por exemplo, um Nível de Marcador Biológico de Lágrima ajustado linearmente podia assumir a forma dada por: Nível Ajustado de Marcador Biológico de Lágrima Linear = Badj = Bm * (1 + (Alfa * (Osrtim - 300 mOsms/L))) onde Badj é o Nível Ajustado de Marcador Biológico de Lágrima Linear, Bm é o nível medido do marcador biológico, Alfa é o factor de correcção linear, e Osrnm é a osmolaridade medida. Tanto o Alfa como o ponto 300 mOsms/L podem ser alterados para se adequarem à curva específica do marcador biológico. A IgE, por exemplo, é sugerida como encontrando-se na ordem da gama de 50-60 ng/mL em indivíduos insensibilizados, e 100-300 ng/mL em pacientes com conjun-tivite primaveril, sazonal ou perene (ver publicações de Nomura, &quot;Tear IgE Concentrations in Allergic Conjuncti- 57 ΡΕ2142905 vitis&quot; em Eye, Vol. 12 (Parte 2), 1998 em 296-98; e Allansmith, &quot;Tissue, Tear, and Serum IgE Concentrations in Vernal Conjunctivitis&quot; em Am. J. of Ophthalmology, Vol. 81, n° 4, 1976, em 506-11). De Nomura: &quot;As concentrações de IgE mostraram aumentos significativos nos grupos de queratoconjuntivite primaveril (322,2 +/-45,7 ng/ml), conjuntivite alérgica sazonal (194,7 +/-21,7 ng/ml) e conjuntivite alérgica perene (134,8 +/-23,1 ng/ml) quando comparada com os controlos (52,1 +/-9,7 ng/ml, p&lt;0,01). Não se verificou diferença significativa entre os grupos de queratoconjuntivite epidémica (97,2 +/-11,7 ng/ml) e conjuntivite bacteriana (92,6 +/-13,8 ng/ml) e os controlos (p = 0,1).&quot;An advantage of using a personal base osmolarity model or value for comparison is that the Adjusted Tear Biological Marker Level is expressed 56 ΡΕ2142905 in units identical to the Measured Biological Tear Marker Level. Open circuit adjustment would result in a Biological Marker Level / mOsms / L, which could be a parameter more difficult to interpret by clinicians, especially if the observed analyte is commonly known to have a range of non-standard units. Adjusted levels of similar Tear Biological Marker can be performed using linear, logarithmic, exponential levels, or through the use of calibration curve adjustments. For example, a linearly adjusted Tear Biological Marker Level could take the form given by: Linear Tear Biological Marker Adjusted Level = Badj = Bm * (1 + (Osrtim - 300 mOsms / L)) where Badj is the Adjusted Level of Biological Linear Tear Marker, Bm is the measured level of the biological marker, Alpha is the linear correction factor, and Osrnm is the measured osmolarity. Both the alpha and the 300 mOsms / L point can be altered to fit the specific curve of the biological marker. IgE, for example, is suggested to be in the order of the range of 50-60 ng / mL in desensitized individuals, and 100-300 ng / mL in patients with spring, seasonal, or perennial conjunctivitis (see publications of Nomura , &quot; Tear IgE Concentrations in Allergic Conjunctivitis 57 ΡΕ2142905 vitis &quot; in Eye, Vol. 12 (Part 2), 1998, 296-98, and Allansmith, &quot; Tissue, Tear, and Serum IgE Concentrations in Vernal Conjunctivitis &quot; in Am J. of Ophthalmology, Vol. 81, no. 4, 1976, at 506-11). De Nomura: &quot; IgE concentrations showed significant increases in the groups of spring keratoconjunctivitis (322.2 +/- 45.7 ng / ml), seasonal allergic conjunctivitis (194.7 +/- 21.7 ng / ml) and perennial allergic conjunctivitis (134.8 +/- 23.1 ng / ml) when compared to controls (52.1 +/- 9.7 ng / ml, p <0.01). There was no significant difference between the groups of epidemic keratoconjunctivitis (97.2 +/- 11.7 ng / ml) and bacterial conjunctivitis (92.6 +/- 13.8 ng / ml) and the controls (p = 0, 1). &Quot;

Para os pacientes de DES com uma osmolaridade elevada de 400 mOsm/L, a determinação não normalizada dos niveis de IgE na lágrima pode facilmente conduzir a interpretação incorrecta. Uma conjuntivite bacteriana mais severa podia facilmente ser erradamente considerada uma conjuntivite alérgica perene relativamente ligeira baseada em IgE não normalizada. Similarmente, se um paciente normal com conjuntivite alérgica sazonal for super estimulado durante a recolha de lágrima e produzir lágrimas reflexas hipo osmolares, os seus niveis de IgE podiam facilmente ficar abaixo das indicações para a conjuntivite alérgica perene. A normalização pela osmolaridade medida da lágrima evita este tipo de falso diagnóstico. 58 ΡΕ2142905For DES patients with a high osmolarity of 400 mOsm / L, non-standard determination of tear IgE levels can easily lead to misinterpretation. More severe bacterial conjunctivitis could easily be mistakenly considered to be a relatively mild perennial allergic conjunctivitis based on non-normalized IgE. Similarly, if a normal patient with seasonal allergic conjunctivitis is over-stimulated during tear collection and produces hypo-osmolar reflex tears, their IgE levels could easily fall short of indications for perennial allergic conjunctivitis. Normalization by the measured osmolarity of the tear avoids this type of false diagnosis. 58 ΡΕ2142905

Num modelo de realização, uma pluralidade de eléctrodos contidos na amostra de zona do substrato de recepção pode ser funcionalizado com mecanismos de transdução de energia distintos; um conjunto de eléctrodos podia conter um transdutor de osmolaridade (por exemplo, um eléctrodo de metal não polarizante para análise de impedância da osmolaridade tal como ouro, platina, e afins, e um polímero condutor tal como polipirrole, poliacetileno, polianilina e afins) com outro conjunto de eléctrodos configurados como um transdutor electroquímico para um marcador biológico específico (por exemplo, uma sanduíche de ensaio competitiva compreendendo um eléctrodo de metal não revestido ou revestido com polímero condutor com química superficial correspondente para se ligar ao anticorpo, avicorpo, aptâmero, ou outro receptor para um ligando do marcador biológico). Neste modelo de realização, a osmolaridade é multiplexada no espaço. Um exemplo deste modelo de realização está apresentado na FIGURA 21, que é uma vista em plano do substrato de recepção 2100 mostrando a amostra de zona 2102. Uma vista pormenorizada dos eléctrodos 2104 na amostra de zona 2102 está produzida na FIGURA 22. Os eléctrodos 2104 ilustrados indicam um grupo de eléctrodos demarcados dentro da amostra de zona como grupo &quot;A&quot; com a função de marcador biológico e eléctrodos da osmolaridade do ouro demarcadas dentro da amostra de zona como grupo &quot;B&quot; para a função de osmolaridade. Um capilar 2106 recebe a amostra de fluido e distribui o fluido ao longo do seu comprimento para interacção com os eléctrodos A e B. 59 ΡΕ2142905In one embodiment, a plurality of electrodes contained in the zone sample of the receiving substrate can be functionalized with distinct energy transducing mechanisms; a set of electrodes could contain an osmolarity transducer (e.g., a non-polarizing metal electrode for osmolarity impedance analysis such as gold, platinum, and the like, and a conductive polymer such as polypyrrole, polyacetylene, polyaniline and the like) with another set of electrodes configured as an electrochemical transducer for a specific biological marker (for example, a competitive test sandwich comprising a conductive polymer coated or electrode coated metal electrode with corresponding surface chemistry to bind to the antibody, antibody, aptamer, or another receptor for a biological marker ligand). In this embodiment, osmolarity is multiplexed in space. An example of this embodiment is shown in FIGURE 21, which is a plan view of the receiving substrate 2100 showing the zone sample 2102. A detailed view of the electrodes 2104 in the zone sample 2102 is produced in FIGURE 22. The electrodes 2104 shown indicate a group of electrodes demarcated within the zone sample as &quot; A &quot; with the function of biological marker and gold osmolarity electrodes demarcated within the zone sample as group &quot; B &quot; for the osmolarity function. A capillary 2106 receives the sample of fluid and distributes the fluid along its length for interaction with electrodes A and B. 59 ΡΕ2142905

Ao depositar uma alíquota da amostra de fluido sobre a amostra de zona de um substrato (através de acção capilar, aspiração, ou técnicas similares), a energia conferida à amostra de fluido é convertida pela amostra de zona para produzir um sinal de sarda que indica as propriedades energéticas da amostra de fluido que estão correlacionadas com a osmolaridade da amostra de fluido. Simultaneamente, ou em operações paralelas, são usados métodos electroquimicos potenciométricos, amperométricos, de voltametria de impulsos, voltametria ciclica, resposta de frequência de banda larga, impedância e outros, para converter os sinais de saida dos eléctrodos modificados electroquimicamente para indicarem as propriedades quimicas da amostra de fluido que estão correlacionadas com a concentração em marcadores biológicos nas lágrimas. Assim, a osmolaridade e os sinais de saida dos marcadores biológicos são gerados ao mesmo tempo mas a partir de diferentes conjuntos de eléctrodos. Subsequentemente, é calculado um Nivel Ajustado de Marcador Biológico de Lágrima para compensar a possibilidade de o paciente apresentar hiperosmolaridade ou diluição introduzida pela amostragem da lágrima. Ou seja, o Nivel Ajustado de Marcador Biológico de Lágrima pode compensar e corrigir a homeostase da lágrima especifica do paciente e a variância da amostragem de lágrima induzida clinicamente em ligação com a obtenção da amostra de fluido.By depositing an aliquot of the fluid sample onto the zone sample of a substrate (by capillary action, aspiration, or the like), the energy imparted to the fluid sample is converted by the zone sample to produce a mackerel signal indicating the energetic properties of the fluid sample which are correlated with the osmolarity of the fluid sample. Simultaneously, or in parallel operations, potentiometric, amperometric, pulse voltammetric, cyclic voltammetry, bandwidth frequency response, impedance and other electrochemical methods are used to convert the output signals of the electrochemically modified electrodes to indicate the chemical properties of the electrode. which correlate with the concentration in biological markers in tears. Thus, the osmolarity and the exit signals of the biological markers are generated at the same time but from different sets of electrodes. Subsequently, an Adjusted Tear Biological Marker Level is calculated to compensate for the possibility of the patient exhibiting hyperosmolarity or dilution introduced by tear sampling. That is, the Adjusted Tear Biological Marker Level can compensate for and correct the specific tear homeostasis of the patient and the clinically-induced tear sampling variance in connection with obtaining the fluid sample.

Noutros modelos de realização, onde a osmolari- 60 ΡΕ2142905 dade está multiplexada no espaço, indicadores ópticos, tais como uma pluralidade de esferas de nanoescala com luminescência correlacionada com a osmolaridade da amostra de fluido são depositados num subconjunto da amostra de zona. Outros mecanismos de transdução óptica podem incluir esferas de nanoescala fluorescentes iontoforéticas, ou peliculas de metal que podem conduzir a ressonância plas-mónica superficial. Em paralelo, subconjuntos da amostra de zona são configurados para produzirem sinais de saida que indiquem propriedades quimicas da amostra de fluido que estejam correlacionadas com a concentração de um marcador biológico na lágrima. Os subconjuntos da amostra de zona podem incluir luminescência, fluorescência, quimiolumines-cência, transferência de energia ressonante, optoentropia, Raman potenciado à superfície, colorimetria, ressonância plasmónica superficial, plasmónica ou outros indicadores ópticos comummente usados para a transdução de marcadores biológicos. A seguir à iluminação por uma fonte de energia óptica que confere energia óptica à amostra de fluido, a energia óptica pode ser convertida pela amostra de zona para produzir um sinal de saída óptico que indique a energia e propriedades químicas da amostra de fluido que estejam correlacionadas com a osmolaridade e concentração em marcador biológico da lágrima, respectivamente. Um detector óptico recebe então o sinal de saída óptica da amostra de zona e um dispositivo de processamento processa o sinal de saída para produzir uma estimativa da osmolaridade da amostra de fluido e da concentração em marcador biológico. Subsequentemente, um Nível Ajustado de 61 ΡΕ2142905In other embodiments, where the osmolality is multiplexed in space, optical indicators such as a plurality of luminescence nanoscale beads correlated with the osmolarity of the fluid sample are deposited in a subset of the zone sample. Other optical transduction mechanisms may include iontophoretic fluorescent nanoscale beads, or metal films which may lead to surface plasmon resonance. In parallel, subsets of the zone sample are configured to produce exit signals indicating chemical properties of the fluid sample that are correlated with the concentration of a biological marker in the tear. Subunits of the zone sample may include luminescence, fluorescence, chemiluminescence, resonant energy transfer, optoentropy, surface-enhanced Raman, colorimetry, surface plasmon resonance, plasmon, or other commonly used optical indicators for the transduction of biological markers. Following illumination by an optical energy source that confers optical energy to the fluid sample, optical energy may be converted by the zone sample to produce an optical output signal indicating the energy and chemical properties of the correlated fluid sample with the osmolarity and concentration in tear biological marker, respectively. An optical detector then receives the optical output signal from the zone sample and a processing device processes the output signal to produce an estimate of the osmolarity of the fluid sample and the concentration in biological marker. Subsequently, an Adjusted Level of 61 ΡΕ2142905

Marcador Biológico de Lágrima é calculado para compensar a possibilidade de ter havido hiperosmolaridade ou diluição introduzida pela amostragem de lágrima do paciente.Biological Tear Marker is calculated to compensate for the possibility of hyperosmolarity or dilution introduced by the patient's tear sampling.

Ainda noutro modelo de realização, métodos para a determinação da osmolaridade, eléctricos, ópticos ou térmicos (por exemplo, depressão de ponto de congelação), no substrato de recepção podem ser combinados independentemente com métodos eléctricos ou ópticos de detecção da concentração em marcador biológico na lágrima. Por exemplo, determinações condutoras de osmolaridade podem ser combinadas com transdutores ópticos para a análise de marcadores biológicos da lágrima. A multiplexação espacial suporta múltiplos marcadores biológicos nesse formato.In yet another embodiment, methods for the determination of osmolarity, electrical, optical or thermal (eg, freezing point depression), on the receiving substrate may be combined independently with electrical or optical methods for detecting the concentration in biological marker on tear. For example, osmolarity conducting determinations can be combined with optical transducers for the analysis of biological tear markers. Spatial multiplexing supports multiple biological markers in this format.

Em modelos de realização de multiplexação espacial, a medição da osmolaridade da lágrima pode ser quer efectuada ao mesmo tempo que os ensaios de marcador biológico quer em série, modulando o tipo de energia de entrada.In embodiments of spatial multiplexing, the measurement of tear osmolarity can be either performed at the same time as the biological marker or serial assays, modulating the type of input energy.

Por exemplo, se tanto a osmolaridade como a análise de marcadores biológicos da lágrima estiverem multiplexados espacialmente por métodos ópticos, então, a osmolaridade da lágrima pode ser determinada por ressonância plasmónica superficial (isto é, o ângulo sobre uma pelicula de metal) e o marcador biológico da lágrima pode ser analisado por fluorescência. 62 ΡΕ2142905For example, if both the osmolarity and the analysis of biological tear markers are spatially multiplexed by optical methods, then tear osmolarity can be determined by surface plasmon resonance (i.e., the angle on a metal film) and the marker the tear can be analyzed by fluorescence. 62 ΡΕ2142905

Noutro modelo de realização, os eléctrodos cobertos com um sistema de ensaio competitivo podem ser interrogados em termos de condutividade para determinar a osmo-laridade, seguida pela absorvência de luz para quantificar a concentração em marcador biológico da lágrima.In another embodiment, electrodes covered with a competitive assay system may be interrogated in terms of conductivity to determine osmolality followed by light absorbency to quantitate the concentration in biological tear marker.

Se forem usadas esferas de nanoescala fluorescentes como marcador da osmolaridade e forem usados anticorpos relatores quimioluminescentes para converter a concentração em marcador biológico da lágrima, então a primeira entrada compreenderia uma luz de excitação apropriada e a segunda entrada de energia iria compreender o bombeamento de uma concentração conhecida de substrato luminescente e combustível através da amostra de zona (por exemplo, luminol e peróxido de hidrogénio).If fluorescent nanoscale beads are used as the osmolarity marker and chemofluorescent reporter antibodies are used to convert the concentration to biological tear marker, then the first entry would comprise an appropriate excitation light and the second energy input would comprise pumping a concentration known from the luminescent substrate and fuel through the zone sample (for example, luminol and hydrogen peroxide).

Noutro modelo de realização, uma &quot;régua molecular&quot; podia ser usada para converter a osmolaridade, por exemplo, um par plasmónico de esferas de metal de nanoescala ligadas a ADN poderia indicar a osmolaridade da massa do amostra de fluido por detecção óptica da alteração de absorvência a cerca de 520 nm. Em paralelo, se forem usados anticorpos secundário rotulados por fluorescência para rotular o analito em observação, a resposta fluorescente da luz de excitação seria lida a seguir à absorvência da régua molecular no mesmo fluido.In another embodiment, a &quot; molecular ruler &quot; could be used to convert to osmolarity, for example, a plasmid pair of DNA-linked nanoscale metal beads could indicate the osmolarity of the mass of the fluid sample by optical detection of the change in absorbance at about 520 nm. In parallel, if fluorescence labeled secondary antibodies are used to label the analyte under observation, the fluorescence response of the excitation light would be read following the absorbance of the molecular ruler in the same fluid.

Outras combinações de transdução eléctrica, óptica e térmica podem ser combinadas para se conseguirem 63 ΡΕ2142905 níveis de requisito de sensibilidade, especificidade e multiplexação enquanto se minimiza a necessidade de lavagem ou de interface externa da amostra de zona.Other combinations of electrical, optical and thermal transduction can be combined to achieve 63 ΡΕ2142905 levels of sensitivity, specificity and multiplexing requirement while minimizing the need for washing or external interface of the zone sample.

Estes métodos podem geralmente ser conduzidos até multiplexação espacial num sentido discreto, onde subconjuntos da amostra de zona são ortogonais dentro do plano superficial. Esses métodos também podem ser conduzidos a multiplexação espacial vertical onde, por exemplo, o transdutor do marcador biológico é construído por cima do transdutor de osmolaridade, tal como num ensaio fluorescente construído por cima de um polímero condutor.These methods can generally be conducted to spatial multiplexing in a discrete sense where subsets of the zone sample are orthogonal within the surface plane. Such methods may also be conducted in vertical spatial multiplexing where, for example, the biological marker transducer is constructed above the osmolarity transducer, such as in a fluorescent assay constructed above a conductive polymer.

Noutro modelo de realização, uma pluralidade de eléctrodos são configurados para a transdução electro-química do marcador biológico em observação, e a osmolaridade é multiplexada a tempo. Neste modelo de realização, todos os eléctrodos são funcionalizados com a mesma química superficial do ensaio de marcador biológico. Como há um tempo de difusão associado à ligação do ligando do marcador biológico da lágrima, a osmolaridade pode ser determinada imediatamente a seguir à introdução na amostra de zona, antes de os eléctrodos serem substancialmente afectados pela presença de analito. Num modelo de realização, os ensaios electroquímicos onde a camada de Debye é modulada pelo ensaio do marcador biológico da lágrima e é detectado por uma alteração da capacitância do sistema, a leitura de base pode ser correlacionada com a osmolaridade da lágrima, e a alteração dinâmica da capacitância pode, 64 ΡΕ2142905 com o passar do tempo, indicar os niveis de marcador biológico da lágrima. Assim, os sinais de saida da osmolaridade e de marcador biológico são produzidos a partir dos mesmos eléctrodos mas são separados no tempo, sendo que a produção da osmolaridade se dá substancialmente logo que a amostra de fluido é introduzida na amostra de zona e a produção do marcador biológico se dá a seguir ao tempo de difusão necessário à amostra de zona.In another embodiment, a plurality of electrodes are configured for electrochemical transduction of the biological marker under observation, and the osmolarity is multiplexed in time. In this embodiment, all electrodes are functionalized with the same surface chemistry as the biological marker assay. As there is a diffusion time associated with ligand binding of the tear biological marker, osmolarity can be determined immediately upon introduction into the zone sample, before the electrodes are substantially affected by the presence of analyte. In one embodiment, the electrochemical assays where the Debye layer is modulated by the biological tear marker assay and is detected by a system capacitance change, the base reading can be correlated with the tear osmolarity, and the dynamic change of the capacitance can, 64 ΡΕ2142905 over time, indicate the levels of the biological marker of the tear. Thus, the osmolarity and biomarker output signals are produced from the same electrodes but are time-separated, the osmolarity production occurring substantially as soon as the fluid sample is introduced into the zone sample and the production of the marker is given after the diffusion time required for the zone sample.

Outros modelos de realização permitem determinar a osmolaridade num espectro de frequências diferente do ensaio de marcador biológico. Por exemplo, a osmolaridade pode ser determinada por espectros de impedância de 10-100 kHz e a concentração em marcador biológico da lágrima é analisada por um DC ou uma medição estável amperométrica ou valtamétrica de baixa frequência. Alternativamente, a osmolaridade pode ser determinada por espectros de impedância de 10-100 kHz e a concentração em marcadores biológicos de lágrima é analisada por espectros de nanoestrutura excitados a 100 kHz-GHz, ou espectros de adsorção de THz. Outras combinações de medições electroquímicas por impulso ou sinusoidais, incluindo a adição de um pequeno sinal sinusoidal por cima de uma entrada de onda quadrada, podem ser usadas para essas análises.Other embodiments enable osmolarity to be determined in a frequency spectrum different from the biological marker assay. For example, osmolarity can be determined by impedance spectra of 10-100 kHz and the concentration in tear biological marker is analyzed by a DC or a stable amperometric or low-frequency valmetric measurement. Alternatively, osmolarity can be determined by impedance spectra of 10-100 kHz and concentration in biological tear markers is analyzed by 100 kHz-GHz excited nanostructure spectra, or THz adsorption spectra. Other combinations of pulse or sinusoidal electrochemical measurements, including addition of a small sinusoidal signal above a square wave input, can be used for these analyzes.

Outros aspectos de acordo com a invenção podem incluir a análise da osmolaridade da lágrima e dos marcadores biológicos da lágrima, para serem analisados em câmaras nanofluidicas paralelas e serem, então, normalizados por comparação. 65 ΡΕ2142905Other aspects according to the invention may include tear osmolarity analysis and biological tear markers for analysis in parallel nanofluidic chambers and are then normalized by comparison. 65 ΡΕ2142905

Ainda outros aspectos da invenção incluem para implementação duas amostras de lágrima separadas recolhidas e analisadas em série. As análises em série do marcador biológico da lágrima e da osmolaridade da lágrima dariam uma estimativa indirecta do impacto da amostragem. É possível que a análise sequencial, se for efectuada de maneira adequada, dê uma melhor indicação da homeostase da lágrima do que só a análise não normalizada do marcador biológico.Still other aspects of the invention include for implementation two separate tear samples collected and serially analyzed. Serial analyzes of the biological tear marker and tear osmolarity would provide an indirect estimate of the impact of sampling. It is possible that sequential analysis, if performed properly, would give a better indication of tear homeostasis than only non-standardized analysis of the biological marker.

Embora atrás tenham sido descritos certos modelos de realização deve entender-se que os modelos de realização foram descritos apenas a título de exemplo. Em conformidade, as invenções não devem ser limitadas com base nos modelos de realização descritos. De preferência, o âmbito das invenções aqui descritas deve apenas ser limitado à luz das reivindicações que se seguem quando consideradas em conjunto com a descrição atrás referida e com os desenhos em anexo.Although certain embodiments have been described above, it is to be understood that the embodiments have been described by way of example only. Accordingly, the inventions should not be limited based on the described embodiments. Preferably, the scope of the inventions described herein should only be limited in the light of the following claims when taken in conjunction with the above description and the accompanying drawings.

Lisboa, 16 de abril de 2013Lisbon, April 16, 2013

Claims (10)

ΡΕ2142905 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um sistema de medição de fluidos, compreendendo o sistema um dispositivo de medição que transfere energia para uma amostra de fluido numa amostra de chip compreendendo uma amostra de zona configurada para conter uma aliquota da amostra de fluido recolhido sobre a amostra de chip; um dispositivo de processamento que detecta a energia transferida para a amostra de fluido e processa um sinal de saida da osmolaridade na amostra de chip que indica propriedades energéticas da aliquota da amostra de fluido, onde o sinal de saida da osmolaridade da amostra de chip está correlacionado com a osmolaridade da amostra de fluido, caracterizado por o dispositivo de processamento receber ainda um sinal de saida do marcador biológico a partir da amostra de zona da amostra de chip que indica propriedades químicas da amostra de fluido, onde o sinal de saída do marcador biológico está correlacionado com a concentração em marcador biológico da amostra de fluido, e o dispositivo de processamento processa o sinal de saída da osmolaridade para produzir um valor de osmolaridade para a amostra de fluido e, então, processa o sinal de saída do marcador biológico para produzir um valor de concentração em marcador biológico para a amostra de fluido, e determina 2 ΡΕ2142905 um Nível Ajustado de Marcador Biológico que produz a normalização da concentração dos valores de marcador biológico baseadas num nível de osmolaridade basal.A fluid metering system, the system comprising a metering device which transfers energy to a sample of fluid in a sample chip comprising a zone sample configured to contain an aliquot of the fluid sample collected on the sample of chip; a processing device which detects the energy transferred to the fluid sample and processes an osmolarity output signal in the chip sample which indicates energetic properties of the aliquot of the fluid sample, wherein the osmolarity output signal of the chip sample is correlated with the osmolarity of the fluid sample, characterized in that the processing device further receives a biomarker output signal from the sample zone of the chip sample which indicates chemical properties of the fluid sample, wherein the biomarker output signal is correlated with the concentration in biological marker of the fluid sample, and the processing device processes the osmolarity output signal to produce an osmolarity value for the fluid sample and then processes the biological marker output signal to produce a biological marker concentration value for the fluid sample, and determines 2 ΡΕ2142 905 an Adjusted Biological Marker Level that produces normalization of the concentration of biological marker values based on a basal osmolarity level. 2. Um sistema de medição de fluidos de acordo com a reivindicação 1, onde a normalização dos valores da concentração em marcador biológico corrige a homeostase da lágrima específica do paciente; ou onde a normalização dos valores da concentração de marcador biológico corrige a variância de amostragem da lágrima induzida clinicamente em ligação com a obtenção da amostra de fluido; ou e dos marcadores ou onde as análises da osmolaridade biológicos são efectuadas simultaneamente; onde as análises da osmolaridade e dos marcadores biológicos são efectuadas em série; ou onde a normalização dos valores de concentração em marcador biológico é linear; ou onde a normalização dos valores de concentração em marcador biológico é raciométrica; ou onde a normalização dos valores de concentração em marcador biológico é exponencial; ou 3 ΡΕ2142905 onde a normalização dos valores de concentração em marcador biológico é baseada na curva de calibração; ou onde a amostra de zona contém um transdutor óptico.A fluid metering system according to claim 1, wherein normalizing the concentration values in biological marker corrects the patient's specific tear homeostasis; or where normalization of the biological marker concentration values corrects the clinically induced tear sampling variance in connection with obtaining the fluid sample; or of the markers or where the biological osmolarity analyzes are performed simultaneously; where the analyzes of osmolarity and biological markers are carried out in series; or where the normalization of the concentration values in biological marker is linear; or where the normalization of the concentration values in biological marker is ratiometric; or where the normalization of concentration values in biological marker is exponential; or 3 ΡΕ2142905 where the normalization of concentration values in biological marker is based on the calibration curve; or where the zone sample contains an optical transducer. 3. Um sistema de medição de fluidos de acordo com a reivindicação 1, onde a amostra de zona contém uma pluralidade de eléctrodos.A fluid metering system according to claim 1, wherein the zone sample contains a plurality of electrodes. 4. Um sistema de medição de fluidos de acordo com a reivindicação 3, onde a pluralidade de eléctrodos é construída a partir de um metal não polarizante; ou onde a pluralidade de eléctrodos está acoplada a um polímero condutor; ou onde a pluralidade de eléctrodos está acoplada a um transdutor electroquímico.A fluid metering system according to claim 3, wherein the plurality of electrodes is constructed from a non-polarizing metal; or wherein the plurality of electrodes is coupled to a conductive polymer; or wherein the plurality of electrodes is coupled to an electrochemical transducer. 5. Um sistema de medição de fluidos de acordo com a reivindicação 1, onde: o dispositivo de processamento recebe um sinal de saída da osmolaridade a partir da amostra de zona que indica propriedades energéticas da amostra de fluido, onde o sinal de saída da osmolaridade está correlacionado com a osmolaridade da amostra de fluido; 4 ΡΕ2142905 o dispositivo de processamento recebe um sinal de saida de um marcador biológico a partir da amostra de zona que indica as propriedades químicas da amostra de fluido, onde o sinal de saída do marcador biológico está correlacionado com a concentração em marcador biológico da amostra de fluido; e o dispositivo de processamento processa o sinal de saída da osmolaridade para produzir um valor de osmolaridade para a amostra de fluido e processa o sinal de saída do marcador biológico para produzir um valor da concentração em marcador biológico para a amostra de fluido.A fluid metering system according to claim 1, wherein: the processing device receives an osmolarity output signal from the zone sample indicating energetic properties of the fluid sample, wherein the osmolarity output signal is correlated with the osmolarity of the fluid sample; 4 ΡΕ2142905 the processing device receives an output signal from a biological marker from the zone sample indicating the chemical properties of the fluid sample, wherein the signal of the biological marker is correlated with the concentration in biological marker of the sample of fluid; and the processing device processes the osmolarity output signal to produce an osmolarity value for the fluid sample and processes the biological marker output signal to produce a biological marker concentration value for the fluid sample. 6. Um sistema de medição de fluidos de acordo com a reivindicação 5, onde os sinais de osmolaridade e de marcador biológico são multiplexados no espaço; ou onde os sinais de saída da osmolaridade e do marcador biológico são multiplexados no tempo; ou onde os sinais de saída da osmolaridade e do marcador biológico são multiplexados em frequência; ou onde os sinais de saída da osmolaridade e do marcador biológico são multiplexados no mecanismo de transdução.A fluid metering system according to claim 5, wherein the osmolarity and biological marker signals are multiplexed in space; or where the osmolarity and biological marker output signals are multiplexed in time; or where the osmolarity and biomarker output signals are frequency multiplexed; or where the osmolarity and biomarker output signals are multiplexed into the transduction mechanism. 7. Um método para medir uma amostra de fluido, compreendendo o método: 5 ΡΕ2142905 receber um sinal de saída da osmolaridade a partir de uma amostra de zona de uma amostra de chip de maneira que o sinal de saída da osmolaridade indique propriedades energéticas de uma alíquota da amostra do fluido recolhido sobre a amostra de chip, onde o sinal de saída da osmolaridade está correlacionado com a osmolaridade da amostra de fluido; caracterizado por receber um sinal de saída de um marcador biológico a partir da amostra de zona da amostra de chip de maneira que o sinal de saída do marcador biológico indique propriedades químicas da amostra de fluido, onde o sinal de saída do marcador biológico está correlacionado com a concentração em marcador biológico da amostra de fluido; processar o sinal de saída da osmolaridade para produzir um valor de osmolaridade para a amostra de fluido e processar o sinal de saída do marcador biológico para produzir um valor de concentração em marcador biológico para a amostra de fluido; e determinar um Nível de Ajuste de Marcador Biológico que produza normalização dos valores de concentração em marcador biológico baseado num nível de osmolaridade basal.A method for measuring a sample of fluid, the method comprising: ΔΕ2142905 receiving an osmolarity output signal from a sample zone of a chip sample so that the osmolarity output signal indicates energy properties of a aliquot of the sample of the fluid collected on the chip sample, where the osmolarity output signal is correlated with the osmolarity of the fluid sample; characterized by receiving an output signal from a biological marker from the chip sample zone sample so that the biological marker output signal indicates chemical properties of the fluid sample, wherein the biological marker output signal is correlated with the biological marker concentration of the fluid sample; processing the osmolarity output signal to produce an osmolarity value for the fluid sample and processing the biological marker output signal to produce a biological marker concentration value for the fluid sample; and determine a Biological Marker Adjustment Level that produces normalization of concentration values on a biological marker based on a basal osmolarity level. 8. Um método para medir de acordo com a reivindicação 7, onde a normalização dos valores de concentração em marcador biológico corrige a homeostase da lágrima específica do paciente; ou 6 ΡΕ2142905 onde a amostra de zona contém um transdutor óptico; ou onde os sinais de saída são multiplexados no espaço; ou onde os sinais de saída são multiplexados no tempo; ou onde os sinais de saída são multiplexados em frequência; ou onde os sinais de saída são multiplexados no mecanismo de transdução; onde a normalização dos valores de concentração em marcador biológico corrige a variância de amostragem da lágrima induzida clinicamente em ligação com a obtenção da amostra de fluido; ou onde o processamento do sinal de saida da osmo-laridade e o processamento do sinal de saída de marcador biológico são efectuados simultaneamente; ou onde o processamento do sinal de saída da osmo-laridade e o processamento do sinal de saída de marcador biológico são efectuados em série; ou 7 ΡΕ2142905 onde a normalização dos valores de concentração em marcador biológico é linear; ou onde a normalização dos valores de concentração em marcador biológico é raciométrico; ou onde a normalização dos valores de concentração em marcador biológico é exponencial; ou de concentração de calibração. onde a normalização dos valores em marcador biológico é baseada numa curvaA method for measuring according to claim 7, wherein normalizing the concentration values in biological marker corrects the patient's specific tear homeostasis; or 6 ΡΕ2142905 where the zone sample contains an optical transducer; or where the output signals are multiplexed in space; or where the output signals are multiplexed in time; or where the output signals are frequency multiplexed; or where the output signals are multiplexed in the transducer mechanism; where normalization of concentration values in biological marker corrects clinically induced tear sampling variance in connection with obtaining the fluid sample; or wherein the processing of the osmo-rity output signal and the processing of the biological marker output signal are effected simultaneously; or wherein the processing of the osmo-parity output signal and the processing of the biological marker output signal are performed in series; or 7 ΡΕ2142905 where normalization of concentration values in biological marker is linear; or where the normalization of concentration values in biological marker is ratiometric; or where the normalization of concentration values in biological marker is exponential; or calibration concentration. where the normalization of the values in biological marker is based on a curve 9. Um método de medição de acordo com a reivindicação 7, onde a amostra de zona contém uma pluralidade de eléctrodos.A method of measurement according to claim 7, wherein the zone sample contains a plurality of electrodes. 10. Um método de medição de acordo com a reivindicação 9, onde a pluralidade de eléctrodos são construídos a partir de um metal não polarizante, onde a pluralidade de eléctrodos estão acoplados a um polímero condutor; ou onde a pluralidade de eléctrodos é acoplada a um transdutor electroquimico. Lisboa, 16 de abril de 2013A method of measurement according to claim 9, wherein the plurality of electrodes are constructed from a non-polarizing metal, wherein the plurality of electrodes are coupled to a conductive polymer; or wherein the plurality of electrodes is coupled to an electrochemical transducer. Lisbon, April 16, 2013