PT2046378E - Uso de polissacarídeos bacterianos para a inibição da formação de biofilmes - Google Patents

Description

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Descrição "Uso de polissacarídeos bacterianos para a inibição da formação de biofilmes" A presente invenção diz respeito à área da prevenção da formação de biofilmes. Em particular, a invenção disponibiliza novos componentes que podem evitar e/ou inibir a formação de biofilme bacteriano sobre várias superfícies.

Um biofilme é uma acumulação de microrganismos embebidos numa matriz de polissacarídeos e aderente a uma superfície biológica, ou não biótica. Vários microrganismos (bactérias, fungos e/ou protozoários com bacteriófagos associados e outros vírus) podem ser encontrados nestes biofilmes. Os biofilmes são ubíquos na natureza e são geralmente encontrados numa larga gama de ambientes, incluindo sistemas de água domésticos e industriais.

Os biofilmes são também agentes etiológicos de vários estados de doença em mamíferos. Exemplos incluem infecções dos tecidos macios orais, dentes, ouvido médio, tracto gastrointestinal, tracto urogenital, tecido das vias respiratórias/pulmões, membrana peritoneal e olho. Os biofilmes também se desenvolvem em dispositivos médicos internos, tais como implantes dentários, próteses do tracto urinário, cateteres peritoniais de diálise, cateteres internos para a hemodiálise e para administração crónica de agentes quimioterapêuticos (cateteres de Hickman), implantes cardíacos tais como pacemakers, válvulas do coração protéticas, dispositivos de assistência ventricular (VAD), enxertos vasculares sintéticos e stents (próteses tubulares), próteses, dispositivos de fixação interna, suturas percutâneas, e tubagem traqueal e para ventilador. 2 0 desenvolvimento de biofilmes em dispositivos industriais, tais como sistemas de água ou de plantas agroalimentares também levanta problemas de segurança.

Bactérias do plâncton (i.e. bactérias de célula única suspensas) em meio liquido são geralmente utilizadas como modelos para pesquisa e desenho de antibióticos. Contudo, bactérias em biofilmes são bastante mais resistentes a antibióticos do que os seus correspondentes no plâncton, e menos acessíveis ao sistema imunitário. Além disso, ocorre a conjugação a uma maior velocidade entre as células em biofilmes do que entre células do plâncton. Esta oportunidade acrescida para a transferência genética entre bactérias é importante, uma vez que bactérias resistentes a antimicrobianos ou biocidas químicos podem transferir os genes de resistência a bactérias susceptíveis vizinhas. A transferência genética pode também converter um organismo comensal previamente avirulento num patogénio altamente virulento. A formação do biofilme não se encontra limitada à ligação das bactérias à superfície. De facto, quando crescem em profundidade as bactérias do biofilme interagem mais umas com as outras do que com substrato físico real sobre o qual o biofilme se desenvolveu inicialmente. Num biofilme, as bactérias podem comunicar através de mecanismos de sinalização químicos, de modo que a comunidade sofre alterações fenotípicas quando se atinge uma densidade mínima no biofilme (o quórum). Este fenómeno designado por "detecção de quórum" pode ser responsável pela expressão de factores de virulência.

Para além dos polissacárideos de E. coli relacionados com o biofilme, tal como o polímero de ácido colânico, celulose e (1-6) β-Ν-acetilglucosamina. Isolados de E. coli também produzem dois polissacarídeos de superfície específicos de sorotipos: lipopolissacarídeo (LPS) o 3 antigénio 0 e polissacarídeo capsular antigénio K. Foi demonstrado que estas duas classes de polímeros polissacarídeos expostos à superfície desempenham papeis indirectos em biofilmes, protegendo da adesina da superfície bacteriana (Schembri et al., 2004).

As estratégias descritas até à data para evitar e/ou destruir biofilmes são baseadas principalmente em inibidores da detecção de quórum (Schachter, 2003). A presente invenção disponibiliza uma nova estratégia para inibir a formação de biofilmes, uma vez que os inventores demonstraram, que utilizando biofilme bacteriano de espécies misturadas in vitro que algumas bactérias libertam no sobrenadante da cultura um polissacarídeo capsular do grupo II solúvel que evita a formação de biofilmes por uma larga gama de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. Como descrito na parte experimental abaixo, estes componentes capsulares induzem alterações físico-químicas da superfície, conduzindo a uma redução dos contactos célula-célula que limitam tanto a adesão inicial, como o desenvolvimento do biofilme bacteriano.

Um primeiro objectivo da presente invenção é assim a utilização de um polissacarídeo capsular do tipo grupo II solúvel de uma estirpe bacteriana para a preparação de uma composição que evita ou inibe a adesão de microrganismos e/ou desenvolvimento de biofilmes, em particular de adesão bacteriana e/ou desenvolvimento de biofilme bacteriano. No que se segue, o termo "polissacarídeo", apesar de utilizado no singular pode designar uma mistura de diferentes polissacarídeos. Os polissacarídeos capsulares produzidos pelas bactérias são realmente de várias dimensões. De facto, cápsulas de E. coli que constituem a camada protectora mais exterior da superfície celular são classificadas em quatro grupos baseados em critérios genéticos e biossintéticos. A cápsula do grupo II é um dos 4 4 tipos capsulares descritos em E. coli, e é constituída por polímeros de elevado peso molecular e polímeros de polissacarídeos carregados produzidos pela Escherichia coli mais uropatogénica (UPEC) e a outra cápsula do Grupo II de E. coli extra-intestinal exibe uma organização genética modular conservada caracterizada por três regiões funcionais. Região I (kpsFEDCUS) e região 3 (kpsMT) são conservadas em todas as bactérias capsulares do grupo II e codificam para proteínas necessárias para a exportação dependente de ABC. A região 2 codifica para uma diversidade de componentes estruturais de polissacarídeos, tais como Kl, K2 (CFT073), serotipos capsulares K5 e K96 (Whitfield, 1006; Whitfield e Roberts, 1999). Cápsulas do tipo do grupo II foram também descritas em Hemophilus influenzae e em Neisseria meningitid.es (Roberts, 1996).

Numa concretização preferida da invenção é obtido um polissacarídeo capsular do tipo grupo II solúvel no sobrenadante de uma cultura de bactérias seleccionadas entre Escherichia coli, Hemophilus influenzae e Neisseria meningitidis. Contudo, no presente texto, a frase “polissacarídeos capsulares do tipo grupo II" pode designar polissacarídeos capsulares que são produzidos por outras bactérias desde que retenham as propriedades anti-biofilme observadas para os polissacarídeos capsulares produzidos pelas estirpes mencionadas acima. Por exemplo, polissacarídeos capsulares produzidas pela estirpe 47 da colecção ECOR (Ochman e Selander, 1984), são aqui consideradas como o "polissacarídeo capsular do tipo grupo II", apesar desta estirpe produzir aparentemente uma cápsula do grupo híbrido II/grupo III. A presente invenção pode ser efectuada com polissacarídeos de diferentes níveis de purificação. Por exemplo, o sobrenadante em bruto de uma cultura bacteriana (separada das bactérias por esterilização em filtro ou 5 centrifugação) pode ser utilizada de acordo com a invenção como uma composição compreendendo os polissacarideos capsulares do tipo grupo 11 solúvel. Contudo, para aumentar a actividade anti-biofilme da composição, assim como a sua segurança, o polissacarídeo capsular do tipo grupo II solúvel pode ser obtido como uma fracção purificada. Os três níveis de purificação são descritos na parte experimental abaixo como exemplos não limitativos. Alternativamente, uma composição de acordo com a invenção pode ser obtida directamente a partir da cultura bacteriana, por exemplo após a lise de bactérias.

Outro objectivo da presente invenção é uma composição para inibir a adesão bacteriana e/ou desenvolvimento de biofilme bacteriano que compreende um polissacarídeo capsular do tipo grupo II solúvel de uma estirpe bacteriana. Uma tal composição pode compreender polissacarideos possuindo diferentes níveis de purificação. Numa concretização preferida, uma tal composição compreende uma fracção purificada de um sobrenadante de uma cultura de bactérias seleccionadas entre E. coli, H. influenzae e N. meningitidis, compreendendo polissacarideos capsulares do tipo grupo II solúvel. A presente invenção também diz respeito a um processo para purificar um polissacarídeo capsular do tipo grupo II anti-biofilme a partir de uma estirpe bacteriana, compreendendo os passos seguintes: (i) separação do sobrenadante de uma cultura de uma estirpe bacteriana que expressa uma cápsula do tipo grupo II a partir de células bacterianas, (ii) precipitação de polissacarideos presentes no sobrenadante obtido, e (iii) opcionalmente suspender novamente o precipitado. 6 0 processo acima é realizado preferencialmente com uma estirpe bacteriana seleccionada entre E. coli, H. influenzae e N. meningitidis, mais preferencialmente com uma E. coli uropatogénica.

Neste processo, o passo (i) pode ser efectuado por centrifugação e/ou esterilização por filtro da cultura bacteriana de modo a eliminar as células bacterianas. Por exemplo, em processos industriais, a filtração tangencial pode ser efectuada sem qualquer centrifugação preliminar. A filtração tangencial pode ser efectuada de forma contínua. 0 perito no estado da técnica pode utilizar qualquer processo de precipitação conhecido do estado da técnica para efectuar o segundo passo do processo acima-descrito. Por exemplo a precipitação no passo (ii) pode ser efectuada com três volumes de etanol para um volume de sobrenadante.

Numa variante vantajosa do processo de acordo com a invenção, o precipitado é obtido no passo (ii) é primeiro novamente suspenso em água, sujeito a diálise em água desionizada, e depois liofilizado antes do passo (iii) . A ressuspensão no passo (iii) pode ser efectuada em água, ou em qualquer tampão adequado para a utilização pretendida. Como exemplo de um tampão que pode ser utilizado é Tris HC1 20 mM, pH 7,5 com 25% de propanol-1.

No final do passo (iii), os polissacarídeos anti-biofilme são obtidos como um produto semi-purifiçado que pode ser utilizado de acordo com a invenção, especialmente em aplicações que não necessitam de produtos de grau-médico .

Para purificar mais os polissacarídeos, o processo de purificação pode compreender um passo adicional (iv) de purificação por cromatografia, especialmente de cromatografia de permuta iónica utilizando por exemplo uma coluna de Sepharose de DEAE. Nesta concretização da 7 invenção, um passo de centrifugação adicional pode ser efectuado entre o passo (iii) e o passo (iv) para eliminar a fracção insolúvel. 0 perito no estado da técnica pode escolher, qualquer tampão adequado para efectuar o passo (iv) . Um exemplo de um tampão que pode ser utilizado é Tris HC1 20 mM, pH 7,5, com 25% de propanol-1. De acordo com uma concretização vantajosa do processo, o precipitado é novamente suspenso em Tris HC1 20 mM, pH 7,5 com 25% de propanol-1 no passo (iii), e a coluna utilizada no passo (iv) é equilibrada no mesmo tampão.

Quando se efectua um passo de purificação por cromatografia de permuta-iónica, os polissacarideos capsulares do tipo grupo II podem ser eluidos utilizando um gradiente salino, por exemplo um gradiente de NaCl. Numa concretização eficiente do processo, descrito na parte experimental os polissacarideos capsulares semelhantes ao grupo II são eluidos com 300 mM de NaCl em Tris HC1 20 mM, pH 7,5, 25% de propanol-1.

Podem ser utilizados evidentemente polissacarideos capsulares do tipo grupo II solúvel obtido através de um processo como acima descrito de acordo com a invenção para a preparação de uma composição que evita ou inibe a adesão bacteriana e/ou desenvolvimento de filme bacteriano. Uma composição anti-biofilme compreendendo tais polissacarideos purificados faz também parte da presente invenção.

Numa concretização particular, a composição da presente invenção é formulada para a administração preventiva ou terapêutica a um sujeito com necessidade. Exemplos não limitativos de composições de acordo com este aspecto da invenção são soluções orais, soluções para infusão no ouvido, colírio, pasta dentífrica ou dentífrico terapêutico etc. Estas composições podem ser utilizadas por exemplo, para evitar a (re)-colonização do intestino, dos 8 pulmões, do ouvido, do sinus, ou de qualquer outro orqão ou cavidade por bactérias patogénicas.

Numa outra concretização, a composição de acordo com a invenção é um liquido ou uma pasta, por exemplo uma tinta que pode ser aplicada em qualquer tipo de superfícies de modo a evitar a formação de biofilmes sobres estas superfícies.

Outro aspecto da presente invenção é um revestimento anti-biofilme, compreendendo um polissacarídeo capsular do tipo grupo II de uma estirpe bacteriana. Num tal revestimento, o polissacarídeo capsular do tipo grupo II pode possuir diferentes níveis de purificação como descrito acima. Numa concretização preferida do revestimento de acordo com a invenção o polissacarídeo capsular semelhante ao grupo 11 é de uma estirpe bacteriana seleccionada entre Escherichia coli, Hemophilus influenzae e Neisseria meningitidis. Este revestimento pode ser obtido, por exemplo, por aplicação de uma composição como acima descrito. Pode também ser obtido na forma de folhas que podem ser aplicadas a qualquer tipo de dispositivo em que a formação de biofilme tem que ser evitada.

Neste contexto, um dispositivo médico ou industrial que é pelo menos parcialmente revestido com um revestimento anti-biofilme compreendendo um polissacarídeo capsular do tipo grupo II a partir de uma estirpe bacteriana, é assim parte da presente invenção. Um tal objecto pode ser obtido, por exemplo, mergulhando parte do dispositivo ou do dispositivo completo numa composição líquida como descrito acima. 0 perito no estado da técnica pode escolher entre a duração da incubação, dependendo do material, da concentração da composição no polissacarídeo capsular do tipo grupo II, a utilização pretendida e semelhantes. Tipicamente a dita incubação pode durar de 10 segundos a 30 minutos. Incubações curtas são geralmente suficientes (< 1 9 a 5 minutos). Se necessário, o dispositivo revestido pode então ser esterilizado através de uma variedade de tratamentos sem destruir o revestimento. Por exemplo, pode ser lavado exaustivamente e/ou autoclavado. Qualquer tipo de dispositivo feito de vidro, pirex, PVC, policarbonato, polipropileno e semelhantes podem ser vantajosamente revestidos de acordo com este aspecto da invenção.

Sem ser limitativos os dispositivos médicos que podem ser revestidos vantajosamente de acordo com este aspecto da invenção são escalpelos, brocas dos dentistas e outros instrumentos de cirurgia e/ou de dentistas não descartáveis e dispositivos internos, tais como implantes dentários, próteses do tracto urinário, cateteres de diálise peritoniais, cateteres internos para hemodiálise e para administração crónica de agentes quimioterapêuticos (cateteres de Hickman), implantes cardíacos, tais como pacemakers, válvulas protéticas do coração, dispositivos de assistência ventricular (VAD), enxertos vasculares sintéticos e stents, próteses, dispositivos de fixação internos, suturas percutâneas, e tubagem traqueal e para ventilação.

Exemplos não limitativos de dispositivos industriais que podem ser vantajosamente revestidos de acordo com este aspecto da invenção são materiais para canalização, tal como tubos, válvulas e semelhantes, torres arrefecidas por ar, sistemas de água quente, circuitos de refrigeração de central nuclear, especialmente circuitos secundários e terciários, materiais agroalimentares, tais como silos, fermentadores, coadores, etc. elementos de mobília, tais como bancadas de laboratório, topos de contadores e semelhantes, especialmente para salas limpas etc. A invenção é ainda ilustrada pelas figuras seguintes e exemplos. 10

Legendas das Figuras

Figura 1: Efeito inibidor da formação de biofilme de CFT073. A, formação de biof ilme de MG1655 F' em micro fermentadores inoculados com 1 ou 10 DO600nm equivalentes de células de KS272 (cinzento) ou CFT073 (negro). Biofilme de apenas MG1655F' (0, branco). Os resultados são médias de 6 réplicas ±d.p. P<0,001 comparado com biofilme de MG1655F'. B, Biofilme de placa micro tituladora apenas de MG1655F (0) , ou na presença de sobrenadante de KS272 ou CFT073, (S. KS272 e S. CFT073, respectivamente) . C, biofilme de MG1655F em micro fermentadores com perfusão de meio sem sobrenadante(0) , ou com S. KS272 ou S.CFT073. D, Curvas de crescimento apenas de MG1655F (0), ou com S.KS272 ou S.CFT073. E, viabilidade apenas células MG1655F isoladas (0) , ou com S.KS272 ou S.CFT073 visualizada com coloração BacLight. F, análise quantitativa da formação de biofilme numa placa micro tituladora por diferentes bactérias na presença de sobrenadante CFT073 (S. CFT).

Figura 2: Efeito do sobrenadante de CFT073 na formação de biofilme bacteriano Gram-positivo e Gram-negativo. A,

Quantificação da formação de biofilme de uma placa micro tituladora de diferentes bactérias, isoladamente (0) , com sobrenadante de KS272 (S.KS) ou CFT073 (S.CFT). Níveis de violeta de cristal retido foram medidos espectrofotometricamente (D057Qnm)· Quantificação de biofilme formado por várias bactérias patogénicas em micro fermentadores utilizando meios não suplementados (0) , ou suplementados com S.CFT, ou S.KS. As barras de erro representam o desvio padrão de duas experiências independentes. C, efeito do sobrenadante CFT073 (S.CFT073) em biofilmes de mistura de E. coli (MG1655F) com P. aeruginoso (PAK), K. penumoniae (KP21), S. epidermitis (O- 11 47), S. aureus (15981) e S. epidermitis (0-47) com S. aureus (15981) e F. faecalis (54). 0 sobrenadante da estirpe de E. coli CFT073ÀkpsD (S. AkpsD) que não secretam qualquer cápsula do grupo II é utilizado como controlo negativo. D, Análise qualitativa de formação de biofilme de S. aureus e P. aeruginosa num micro fermentador utilizando meios que não são suplementados, ou suplementados com sobrenadante de CFT073.

Figura 3: relação entre produção de cápsulas e actividade anti-biofilme do sobrenadante CFT073. A, organização genética das regiões Rl, R2 e R3 da cápsula de CFT073. Genes com inserções de transposão estão marcados com um asterisco. B, formação de biofilme de MG1655F cultivado na presença dos sobrenadantes do mutante da cápsula. C, níveis de hexose nos sobrenadantes. kpsF, kpsU, c3692 e c3693 correspondem a mutantes que não prejudica a produção de cápsula. D, fase estacionária células de cápsulas bacterianas CFT073 ou CFT073A coradas com ferritina e examinadas por microscopia de transmissão electrónica (X100000; bar=0,2 μιη) (painel esquerdo); foram observadas respectivamente 125 e 105 células. A cápsula CFT073 corada é indicada por uma seta. No painel direito: micrografias de varrimento de fase estacionária CFT073 ou CFT073AkpsD (X50,000; bar=0,5 μιη) ; foram observadas respect ivamente 45 e 37 células.

Figura 4. Correlação entre a actividade anti-biofilme e cápsula de grupo II. Formação de biofilme de estirpes de E. coli MG1655F' e 1091, e da estirpe de S. aureus 15981 cultivada com: (A) sobrenadantes de E. coli exibindo actividade anti-biofilme (ver Tabela 1) (para além da estirpe 47, todas as estirpes testadas produzem cápsulas do grupo 11) (B) sobrenadantes de CFT073, U-9, estirpes U-15 e os seus mutantes kpsD respectivos. (C) Formação de biofilmes em micro fermentador de estirpes UPEC CFT073, U- 12 9, U-15 (negro) e os seus mutantes kpsD respectivos (cinzento) crescidos em M63B1 glu, e mutantes kpsD feitos crescer em meios suplementados com o seu sobrenadante correspondente do tipo selvagem (branco). Os biofilmes foram feitos crescer durante 36 h a 37°C. As barras de erro representam o desvio padrão da média. As estirpes identificadas por números simples correspondem aos da colecção EcoR (Ochman e Selander, 1984).

Figura 5. Efeito anti-biofilme do sobrenadante Neisseria meningitidis. Quantificação da formação de biofilme da placa microtituladora de MG1655F' na presença de S. Neisseria. DO570nm do corante violeta de cristal foi determinada como descrito em (0'Toole e Kolter, 1998). Figura 6: Propriedades Fisico-quimicas do sobrenadante CFT073. a , ζ potencial de coloides catiónicos incubados com os sobrenadantes dializados de: CFT073 (CFT), U-9, IHE3034 (IHE), EcoR72 (E-72) (cinzento escuro) e as suas cápsulas mutantes respectivas (cinzento claro) . (0) corresponde ao tratamento de M63Blglu. b , ângulo de contacto da gota de água na superfície incubada com CFT, U-9, IHE, E-72 (cinzento escuro) e as cápsulas mutantes (cinzento claro). c, adsorção de iodeto de propídio sobre partículas catiónicas incubadas com CFT, U-9, IHE, E-72, FR2 (fracção de sobrenadante purificado CFT073), (cinzento escuro) e as suas cápsulas mutantes respectivas (cinzento claro). A extensão de adsorção fornecida pela intensidade fluorescente (>670 nm). d , microscopia de fluorescência de partículas catiónicas incubadas com CFT, S.CFT073AR1 (0R1), FR2 e não incubado (0) . As barras de erro representam o desvio padrão da média.

Figura 7: Efeito do sobrenadante CFT073 na inibição do biofilme sobre superfícies revestidas. A formação de biofilme em micro fermentadores por várias bactérias utilizando: lamelas de vidro não tratadas (painel 13 superior), lamelas de vidro tratadas com sobrenadante CFT073 (painel médio) e lamelas de vidro tratadas com sobrenadante CFT073AkpsdD (painel inferior).

Figura 8. Impacto do tratamento da espátula revestida com sobrenadante S.CFT073 (S.CFT). Formação de biofilmes em micro fermentadores por MG1655F' utilizando lamelas de vidro não tratadas e lamelas de vidro tratadas com S.CFT ou com S.CFT cozido, e depois autoclavado ou submetido a uma lavagem intensa.

Figura 9: O sobrenadante CFT073 afecta a interacção célula- célula. A, formação de biofilme por MG1655F' em micro fermentadores com meios suplementados com sobrenadante CFT073 (S.CFT) nos intervalos de tempo Oh, 1 h, 6 h (24 h de cultura) e 24 h (48 h de cultura) . 0: sem adição de S.CFT. B, MG1655F' marcado com GFP inoculado numa célula de fluxo e monitorizado por microscopia confocal. Sobrenadantes CFT073 ou KS272 foram suplementados após 3 h de cultura e os biofilmens foram feitos crescer num total de 12 h. C, o ensaio de auto agregação com estirpes que se agregam através de diferentes mecanismos: MG 1655F' (expressão conjugativa de pilus F) ; MG1655ompR234 (sobre expressão enrolada) ; MG1655AoxyR (sobre expressão de adesina Ag43 auto transportadora) ; 10 9 4 (produção de celulose) . Foram diluídas células até uma DOgoO de 2 em 3 ml de M63B1 (triângulo). Sobrenadante de CFT073 (círculo) e sobrenadante AkpsD (rectângulo).

Figura 10. Actividade anti-biofilme da fracção FR2. A fracção purificada de sobrenadante CFT073 (FR2) foi adicionada à cultura MG1655F' em concentrações que vão de 0,5 a 500 μρ/ιηΐ. A formação de biofilme de MG1655F' foi visualizada após 24 h. A concentração de 50-100 μρ/ιηΐ inibiu o biofilme de MG1655 F'. 14

Figura 11. Colonização intestinal por CFT073 e CFT073áRl. a, as barras representam o erro padrão do loglO do número médio de CFU por grama de fezes; foi utilizado um teste de Mann-Whitney para análise estatística, o nível de significância estatística (*) foi colocado para valores de P <0,016. b, colonização do cólon e do ceco por CFT073 (círculos) e CFT073ÁR1 (triângulos). DL: Limite de detecção.

Figura 12. Efeito da fase de crescimento e detecção de quórum nas propriedades anti-biofilme do sobrenadante CFT073. Formação de biofilme de MG1655F' em placa micro tituladora na presença de sobrenadantes purificados a partir de células na fase exponencial, fase estacionária e mutante AluxS. 10^-0 células numa fase exponencial (DOgoOnm=Of 4) e na fase estacionária (DC>600nm=2) foram centrifugadas e os sobrenadantes foram precipitados com 3 volumes de etanol. O sobrenadante do mutante AluxS foi purificado a partir de uma cultura deixada de um dia para o outro.

Exemplos

Exemplo 1: Métodos

Estirpes bacterianas, condições de crescimento e análise microscópica

As estirpes bacterianas são listadas na Tabela 1 abaixo. Bactérias Gram-negativas foram feitas crescer a 37°C em meio mínimo M63B1 com 0,4% de glucose (M63Blglu) ou em meio LB rico. Bactérias Gram-positivas foram feitas crescer em TSB com 0,25% de glucose (TSBglu) a 37°C. O efeito do sobrenadante CFT073 no crescimento bacteriano e 15 taxa de viabilidade foi avaliado utilizando a curva de determinação de crescimento, contagem das unidades formadoras de colónias numa placa LB e coloração de viabilidade por BacLight Vivas/Mortas (Molecular Probes). Foi efectuada uma coloração com ferritina e microscopia de varrimento electrónico como descrito em (Bahrani-Mougeot et al., 2002). Foi adquirida epifluorescência e microscopia de luz transmitida utilizando um microscópio Nikon E400. Foram efectuados ensaios de auto agregação como descrito em (Beloin et al., 2006). 16

Tabela 1: estirpes utilizadas neste estudo

Estirpes Características relevantes Referências Estirpes de E. coli CFT073 Cápsula UPEC do grupo II (K2) (Mobley et al., 1990) MG1655F ' Plasmideo MG1655F'iet-ΔίraD (Ghico, 2001) KS272 E. coli comensal K-12 (Strauch e Beckwith, 1988) 1091 E. coli comensal C. Le Bouguenec 1092 E. coli comensal C. Le Bouguenec 1094 E. coli comensal (Da Re e Ghico, 2006) 1096 E. coli comensal C. Le Bouguenec 1097 E. coli comensal C. Le Bouguenec 1102 E. coli comensal C. Le Bouguenec 1103 E. coli comensal C. Le Bouguenec 1110 E. coli comensal C. Le Bouguenec 1125 E. coli comensal C. Le Bouguenec 1127 E. coli comensal C. Le Bouguenec U-l Cápsula UPEC do grupo II C. Forestier U-2 Cápsula UPEC do grupo II (K2) C. Forestier U-3 Cápsula UPEC não do grupo II C. Forestier U-4 Cápsula UPEC não do grupo II C. Forestier U-5 Cápsula UPEC do grupo 11 C. Forestier U-6 Cápsula UPEC do grupo II (K2) C. Forestier U-7 Cápsula UPEC não do grupo II C. Forestier U-8 Cápsula UPEC do grupo II C. Forestier U-9 Cápsula UPEC do grupo 11 C. Forestier U-10 Cápsula UPEC do grupo II C. Forestier U-ll Cápsula UPEC não do grupo II C. Forestier 17 (continuação) U-12 Cápsula UPEC do grupo II C. Forestier U-13 Cápsula UPEC do grupo II C. Forestier U-14 Cápsula UPEC não do grupo 11 C. Forestier U-15 Cápsula UPEC do grupo II C. Forestier U-16 Cápsula UPEC do grupo II C. Forestier U-17 Cápsula UPEC não do grupo II C. Forestier U-18 Cápsula UPEC não do grupo II C. Forestier \—1 1 D Cápsula UPEC do grupo II C. Forestier U-20 Cápsula UPEC do grupo II C. Forestier U-21 Cápsula UPEC do grupo II (K2) C. Forestier 984 Cápsula do grupo II de E. coli comensal (Kl) M. C. Ploy 988 Cápsula do grupo II de E. coli comensal (Kl) M. C. Ploy 9 9 9 Cápsula do grupo II de E. coli comensal (Kl) M. C. Ploy 1007 Cápsula do grupo II de E. coli comensal (Kl) M. C. Ploy 1014 Cápsula do grupo II de E. coli comensal (Kl) M. C. Ploy 1HE3034 Cápsula do grupo II de E. coli que provoca meningite (Kl) (Meier et al., 1996) Estirpes EcoR Colecção de referência (72 estirpes) de E. coli (Ochman e selander, 1984) Outras bactérias 15981 Estirpe clinica S. aureus (Valle et al., 2003) 18 (continuação) V329 Isolado sub-clínico de S. aureus de mastite de bovino (Cucarella et al., 2001) 0-47 Estirpe clínica de S. epidermis (Heilmann et al., 1996) CH845 Estirpe clínica BM94314 de S. epidermis (Galdbart et al., 2000) 54 Estirpe clínica de E. faecalis (Toledo-Arana et al., 2001) 11279 Estirpe clínica de E. faecalis (Toledo-Arana et al., 2001) KP21 Estirpe de Kl ebsiella pneumoniae C. Forestier ΡΑΚ Pseudomonas aeruginosa (Vasseur et al., 2005) 8013 Estirpe de Neisseria meningitidis, serogrupo C, classe 1 (Deghmane et al., 2002) Mutantes 44H3 CFT073 kpsD:: TnSCl8 9 Este estudo 25F11 CFT073 kpsD:: TnSCl8 9 Este estudo 23D5 CFT073 kpsU:: TnSCl8 9 Este estudo 16B9 CFT073 kpsU:: TnSCl8 9 Este estudo 14E12 CFT073 kpsC:: TnSCl8 9 Este estudo 76H1 CFT073 kpsS:: TnSCl8 9 Este estudo 30H8 CFT073 kpsM:: TnSCl8 9 Este estudo AkpsD CFT073 kpsD:: km Este estudo AkpsC CFT073 kpsC:: km Este estudo AkpsU CFT073 kpsU:: km Este estudo AkpsS CFT073 kpsD:: km Este estudo AkpsM CFT073 kpsM:: km Este estudo Δ36 92 CFT073 Δ3692:: km Este estudo 19 Δ3 6 93 CFTO73 Δ36 93:: km Este estudo Δ36 9 4 CFTO73 Δ3694:: km Este estudo Δ3695-96 CFTO 73 Δ3695Δ3696:: km Este estudo ARI CFT073 com uma supressão de kpsD a kpsS Este estudo Δ2 CFT073 com uma supressão de c3692 a c3696 Este estudo AR3 CFT073 com uma supressão de kpsT a kpsM Este estudo U-9 AkpsD U-9 kpsD::km Este estudo U-15 AkpsD U-15 kpsD::km Este estudo IHE3034 AkpsD IHE3034 kpsD::km Este estudo AluxS CFTO73 AluxS Este estudo CFTO 73gfp CFT073XAT-Tgfp Este estudo ARlgfp ARlXATTgfp Este estudo AoxyR MG1655 oxyR::km (Beloin et al., 2006) ompR23 4 MG1655 ompR234 malA::km (Vidal et al., 1998)

Procedimentos de formação de biofilme

Experiências em micro fermentadores: foi formado um biofilme como descrito anteriormente (Ghico, 2001). Culturas de biofilmes mistos: um biofilme de MG1655F' de 8 horas formado na lâmina de vidro interna dos micro fermentadores foi infectada com 1 equivalente de DOgoOnm de uma cultura de um dia para outro de CFT073-gfp. Após 24 horas de cultura contínua em M63Blglu, foram tiradas fotografias das lamelas de vidro. A massa do biofilme foi estimada determinando a DOgoOnm da ressuspensão do biofilme formado sobre a lâmina de vidro interna (Ghigo, 2001) . 20

Ensaios de inibição da formaçao de bio filme: o meio que entra foi misturado numa proporção 1:1 com sobrenadantes filtrados e conduzidos aos micro fermentadores a tempos diferentes após inoculação de bactérias (0, 1, 6, ou 2 4 horas). 0 biofilme foi ainda cultivado durante 24 horas adicionais antes da determinação da biomassa. Análise da interacção bacteriana com superfícies tratadas: as lâminas de vidro foram incubadas durante 1 min com sobrenadante CFT073 filtrado e lavadas uma vez com água desionizada antes da inoculação em micro fermentadores. A formação de biofilme na lâmina foi determinada após 24 horas.

Experiências em placa micro tituladora. Ensaios de formação de biofilme estáticos foram efectuados em placas micro tituladoras de PVC de 96 poços (Falcon) como descrito em (0'Toole e Kolter, 1998). Ensaios de inibição de biofilme: culturas deixadas de um dia para o outro foram ajustadas para DOgoOnm =0,04 antes da inoculação de 100 μΐ em placas de 96 poços na presença ou ausência de 50 μΐ de sobrenadante. Experiências na câmara de fluxo. Foram formados biofilmes em M63B1 glu a 37°C em células de fluxo de 3 canais (1x4x40 mm) . O sistema de fluxo foi montado e preparado como descrito em (Christensen et al., 1999). Os inóculos foram preparados como se segue: culturas deixadas de um dia para o outro de 16-20 horas em M63Blglu foram colhidas e novamente suspensas como diluições normalizadas (DOgoo=0'005). Injectou-se 300 μΐ em cada canal de fluxo. 0 meio de entrada foi misturado numa proporção de 1:1 com sobrenadante filtrado. O fluxo foi iniciado 1 hora após a inoculação a uma taxa constante de 3 ml h-1 utilizando uma bomba peristáltica Watson Marlow 205S. Todos os ensaios foram pelo menos efectuados em triplicado. 21

Purificação de sobrenadantes de CFT073 ou de estirpe capsular de outro grupo II que exibem actividade anti-biofilme

Foram testados três níveis de purificação: (i) Filtração (esterilização) dos sobrenadantes activos (S.CFT, utilizados em todas as experiências em placas micro tituladoras ou em micro fermentadores) • Culturas deixadas de um dia para o outro em glucose M63B1 0,4% foram centrifugadas durante 30 min a 5000 rpm a 4°C e filtradas através de um filtro de 0,25 μιη para eliminar bactérias. (ii) Precipitação de polissacarídeos contidos nos sobrenadantes activos • Os polissacarídeos contidos no sobrenadante filtrado foram precipitados com 3 volumes de etanol, novamente suspensos em água desionizada e dializados com água desionizada em cassettes de diálise de 10 kDa de peso molecular de corte (Pierce biochemical). (iii) purificação dos polissacarídeos capsulares da fracção activa (fracção capsular activa FR2) • A fracção activa do sobrenadante parcialmente purificada obtida no passo (ii) foi liofilizada e novamente suspensa em 80 ml de tampão Tris HC1 20 mM pH 7,5 contendo 25% de propanol-1. • esta ressuspensão foi centrifugada durante 10 minutos a 3000 rpm para eliminar as partículas insolúveis. • O sobrenadante solúvel foi carregado numa coluna de Sefarose-DEAE (30 ml, 2,6x6cm, Amersham) e equilibrada com Tris HC1 20 mM pH 7,5, 25% de tampão de propanol-1. 22 • A coluna foi lavada com Tris HC1 20 mm pH 7,5, 25% de tampão de propanol-1 a 25% a uma taxa de 20 ml/h. • Após a lavagem, a coluna foi eluída com um gradiente de NaCl (0 a 1 M em 400 ml) e a concentração de polissacarídeo de cada uma das fracções eluídas (4,5 ml) foi testada pelo método de Dubois (Dubois et al., 1956): 100 μΐ de fenol a 5% e 500 μΐ de ácido sulfúrico concentrado seguido por agitação com vortex e lido a 492 nm) • As fracções positivas (cerca de 10 fracções de 4,5 ml) foram reunidas e dializadas com água desionizada e liofilizadas • 1 mg de liofilizado foi novamente suspenso em 1 ml de água desionizada

Tratamento de sobrenadantes de cultura e análise de polissacarídeos

Culturas deixadas de um dia para o outro em M63Blglu a 37°C foram centrifugadas durante 30 minutos a 5000 rpm a 4°C. Após filtração do sobrenadante com um filtro de 0,2 μιη, as macromoléculas foram precipitadas com 3 volumes de etanol e dializadas contra água desionizada utilizando cassetes de 10 kDa (Pierce). Quantidades totais de fosfatos de açúcares neutros foram determinadas através dos métodos de molibdato de amónio/ ácido ascórbico e fenol/ácido sulfúrico, respectivamente. Composição de polissacarídeos foi determinada por HPLC (coluna de exclusão iónica) e por cromatografia gás-líquido, tal como em (d'Enfert e Fontaine, 1997; Fontaine et al., 2000). Fracção activa de sobrenadante CFT073, FR2 foi purificada utilizando uma coluna de DEAE-Sepharose (Amersham) e eluída com 300 mM de NaCl em 25% de propanol-1, 20 mM de TrisHCl pH 7,5. 0 peso molecular do polímero foi estimado por cromatografia de 23 filtração por gel em Superdex-200 (Amersham) utilizando dextrano como padrão. Foram efectuadas degradações de polissacarideos por hidrólise ácida total (ácido trifluoroacético, 4N, 4H, 100°C) ou através de ácido fluorídrico aquoso (48% aq. HF, 2 dias em gelo fundente).

Mutagénese e técnicas moleculares

Mutagénese de transposão de Mariner de E. coli CFT073 foi efectuada como descrito em (Da Re e Ghigo, 2006) . Os sobrenadantes de 10000 transposões mutantes foram incubados 24 h, em LB a 37°C e placas de microtitulação de 96 poços foram extraídos após centrifugação das placas durante 15 min a 10000 rpm e o seu efeito na formação de biofilme de MG1655F' foi analisado. Foram determinados locais de inserção de transposões como descrito em (Da Re e Ghigo, 2006). Foram efectuadas pesquisas de homologia utilizando Blast 2.0. Foram gerados mutantes de supressão como detalhado em h 11 ρ://www.ρ a s t eu ml, utilizando os .fr/recherche/unites/Ggb/3SPCRprotocc iniciadores apresentados na tabela 2. 24

Tabela 2: iniciadores utilizados neste estudo

Gene alvo Nome do Sequência SEQ iniciador ID NS Iniciadores utilizados para gerar mutações de supressões kpsD RpsD..SOCkS gaccagcttgcctttgcagaaacg 1 RpSU-MSsi-d tttv&n AR i 1 ctttttcagcattacgcggatagg 2 Kp&ii.o>b.s»-3 TGCTCGATGAGTTTTTCTAAGGAGT 3 KpsD.exR5 -TGAAatgagcaa KpsD.ext-4 gattttgagacacaacgtggctttC 4 -ATcacAAACTCATTCAGCGACA ttgcgcttaagtttaaccaaaccg 5 gctctggcatggactccggtaact 6 kpsU <psU.500--S atgaacgcagttcagctttatcgcc 7 <psU.P0lkR <m.& 1 AR 5 - R ccaaatttcggcttgaggattttc 8 § <PkU AR 1 A TGCTCGATGAGTTTTTCTAAcagga 9 • <p$U.exR5 actggctgaaaacgcatga <p$u .e&tks gatttttgagacacaacgtggcttt 10 CATTTCAACTCCttacaaagacaga tgcagaacggcgataccttaatcg 11 ctcggcaatcaaacgtactcgttg 12 kpsC K psC.S00-S gaggcagatatcaacattaacc 13 R K psC .pDORs -V. .V . “V ,<'N ΥΛ X £· fídu-. .1.-0 gttgaaggttttaagttctcaac 14 K psC. 08.1-3 TGCTCGATGAGTTTTTCTAAACAA- 15 R psC.RxGS TTTCATAGTTGACTATTAC K psC.dxiA gattttgagacacaacgtggcttt- 16 gagtaaatgccaatcatgcgttttc cgactcacattacgattatgcg 17 gaaaatgatttgtggtggcggtagc 18 kpsS k psSÂOO-o agagcaaccttgagttattacg 19 ¥ psSÃOO-3 psS.G8.L~5 aaagacaagggatagctttagg 20 R .psS.G8X~3 TGCTCGATGAGTTTTTCTAATTTAT 21 & pSS.6.xt-5 TCTAAATTATCAACG pSd.6X1-d gattttgagacacaacgtggctt- 22 CATAAATAATAATCTGTGTGTAATA 25 GTCAA agcgactggttgaaagcaaactg ttcgatgagtcaagactattgg 23 24 kpsM KpsM. 500-5 TTACTACGCATAAAATTCATGG 25 KpsM,5Q0-3 aatgccatgcttaaaccaaagcc 26 KpsMGS.L-5 KpsM.GB.L-3 TGCTCGATGAGTTTTTCTAAcaatg 27 KpsM.esá-5 ctgacatcatgattaagattg KpsM.exi-3 gattttgagacacaacgtggctttc 28 ttgccatTTGGTGATGTGATCCT TCGCATGCGTTCTGGTTTGAG 29 cacatcacaaaactctttcaatg 30 kps KpsD.50B-5 gaccagcttgcctttgcagaaacg 31 KpsS.500-3 KpsD.GB.L-3 aaagacaagggatagctttagg 32 Kps-S.-GB.L-3 gattttgagacacaacgtggcttt- 33 KpsD.exl-5 CATcacAAACTCATTCAGCGACA gattttgagacacaacgtggcttt- 34 CATAAATAATCTGTGTAATAGTCAA ttgcgcttaagtttaaccaaaccg 35 ttcgatgagtcaagactattg 36 Kps KpsR2.ôOO-§ atataggagtatggagcgaaac 37 KpsR2.500--3 Kp$R2.GB-L5 ttgagtaaggaatatggcttag 38 KpsR2-GB-L3 TGCTCGATGAGTTTTTCTAAGAAA- 39 KpsR2.exi.~5 TCAGACGAGTTTTC KpsR2.exi~3 gattttgagacacaacgtggctttc 40 ataacatACTATGTCCCCATGATT- ATT catgtactcatttcacgtaaag 41 tgctaaaattgcattattaggtc 42 Kps KpsM 500-5 TTACTACGCATAAAATTCATGG 43 RpsR3,S0Q--3 AATTAACCATATCTTTTGATTTGAG 44 KpsRS.GB-iS KpsM.GB.L-3 TGCTCGATGAGTTTTTCTAAatca- 45 Kp$Mext-S gacttgtctttatcag KpsR3.exí.~3 gatttgagacacaacgtggcttct- 46 26 tgccatTTGGTGATGTGATCCT TCGCATGCGTTCTGGTTTGAG 47 cctagcaacaaaatatttagcgac 48 Κρ9 5- Kps95-36.000-Kps96-96.S60-Rps95-9ô,G8- aaacaatatcatggccagtcgg aataacgttcaggtattgaagg 49 50 Kps95'96.G8·' TGCTCGATGAGTTTTTCTAAcctt- 51 KpsSS-GS.exi- gaGGTCTATATAACTGAA KpS9S-96.exl- Kps95"9€-5D0· gatttgagacacaacgtggctttca 52 tcaaatgtaccaaaggtgataac taaatcaacgttactgagaatg 53 gaatatccgagtgcataatacc 54 aaacaatatcatggccagtcgg 55 C3694 €3694560-6 C3&94.500--3 €3694 GB 1.-5 aagcattagaattggaaccc ctttccatgtattcctctccaag 56 57 €6694.681-3 TGCTCGATGAGTTTTTCTAAgtgca 58 €6694.0X6 5 agtatttcttgtaaccc C6694.0XL3 GAT T T T GAGACACAACGT GGC T T T C 59 ATatacgcatcaatagccttagccc gcggagagctattttaagcagg 60 cggaaaacgatatgacaatcctg 61 C3693 €3633 900-5 €3633 600-3 €3093 GB 6-5 gtttattgttgcaggcatccaag atgccgttagatagttttattcc 62 63 €3633 G8 L-3 TGCTCGATGAGTTTTTCTAAatgga 64 €3693.e.xí~5 tgctcaaaaggaggtacg c3693.ex63 GAT T T T GAGACACAACGT GGC T T T- 65 CATcagcattggttggtaat- gcatttg acatattaacagtaatataacc 66 ctacaaatttggatactgcaaatc 67 C3692 C3692.50Õ-5 €3692 503-3 ttatacttgcggtgatttgcag 68 69 ATGACTCATAAAAATATATTCC €6692 GB.L-S c3692.GB.L-3 TGCTCGATGAGTTTTTCTAAtatt- 70 €3692.0X05 tacagaataattattctgg 71 €3692 SXt-3 GATTTTGAGACACAAGCTGGCTTT- 27 CATtaagccaatagtcttgactca- tcg aattcatatgattgtagcaatg 72 CAACGTAGAATAAAAGCATTACC 73 luxS LuxS. 500-5 AAACTGCGCAGTTCCCGTTACC 74 LuxS.. 500-3 iuxS.GB-tS CCTGATTTTGTTCCCTGGGAGG 75 LuxS, GB-tS TGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAG- 76 LuxS.exi-S T GGAACAAAAGAAG LuxS.ext-3 gattttgagacacaacgtggctttc 77 atTTAGCCACCTCCGGTAATTT CTGGAACCGGGTGATCCTCGAAG 78 AGCAACAAT GC T GGGGAAAAAT GC 79 Iniciadores utilizados para Kps95-F aacgaaaattgcttgctctggc 80 Kps94-R Kps94-F cggtgccaagtttgaaataacg 81 Kps92-R gaaaatagtgtagacggtctcttc 82 Kps^if tttggatactgcaaatcaccgc 83 KpsK2r GCGCATTTGCTGATACTGTTG 84 AGGTAGTTCAGACTCACACCT 85 Iniciadores utilizados para verificar KmGB.veri TGGCTCCCTCACTTTCTGGC 86 f-5 KmGB.veri f 3ATATGGCTCATAACACCCCTTG 87 Iniciadores utilizados para ARBt ggCCACgCgTCgACTAgTAC,'NNN 88 ARBS ARB2 NNNNNNN gAT AT ÍR2 ggCCACgCgTCgACTAgTACNNNNN 89 SR2-60-5 NNNNNACgCC ggCCACgCgTCgACTAgTAC 90 CTgACCgCTTCCTCgTgCTTTACgg 91 TTCTGAgcggactctggggtacg 92 28

Análise das propriedades fisico-quimicas das fracções activas 0 potencial zeta foi medido, tal como em (Caruso et al., 1999) após 20 minutos de incubação de partículas de latex de coloides catiónicos de 10 μιη de diâmetro com sobrenadantes precipitados dializados (i.e. o nível(II) de purificação indicado acima). As partículas de latex suportam cargas totais positivas devido ao seu revestimento de polietilenoimina (PEI). A camada de PEI é um polímero ramificado de 6400 dalton de peso molecular que suporta aproximadamente 50% de funções quaternárias metiladas que conferem uma carga positiva estável à molécula. Este polímero foi depositado numa fase aquosa nas partículas inicialmente carboxiladas (Decher, 1997). As propriedades hidrofílicas dos sobrenadantes foram investigadas determinando o ângulo de contacto formado por uma gota de água ultra-pura de 2,5 μΐ com uma superfície de vidro plana previamente incubada nos sobrenadantes durante 20 minutos. As interacções de superfície foram analisadas monitorizando a adsorção de iodeto de propídio em colóides catiónicos tratados com sobrenadante. A afinidade das superfícies tratadas para a amostra fluorescente foi testada utilizando citometria de fluxo (Leboeuf e Henry, 2006) e microscopia de fluorescência. Todas as incubações de partículas com sobrenadantes foram realizadas para uma fracção baixa razão partícula/volume (ca. 0,2%) conduzindo provavelmente a uma saturação de superfície pelas espécies activas.

Experiências com ratinhos in vivo A colonização in vivo de CFT073 e CFT073AR1 foi efectuada como descrito anteriormente (Maroncle et al., 2006). Os ratinhos foram alimentados intra-gastricamente com 1010CFU. 29

As bactérias contidas nas amostras fecais foram numeradas em placas de agar. Para examinar o crescimento bacteriano no hospedeiro, os ratinhos foram sacrificados várias vezes após inoculação; o cólon e o ceco foram homogeneizados em soro fisiológico, e aplicados para determinar cfu por grama de tecido.

Exemplo 2: actividade de anti-biofilme do sobrenadante de CFT073

Para estudar as interacções UPEC num biofilme multicelular de comunidades bacterianas (Hall-Stoodley et al., 2004) foi desenvolvido um modelo in vitro de biofilme bacteriano misto em microfermentador (Ghigo, 2001). Utilizando este modelo, um biofilme de 8 horas formado pela estirpe comensal de E. coli K12 MG1655F' foi inoculado com diferentes títulos da estirpe UPEC CFT073, e cultivadas ainda durante 24 horas. Por aumento dos títulos de CFT073, foi observado uma forte redução no desenvolvimento do biofilme de E.coli K12MG1655F' que não foi observado, quando a estirpe comensal E. coli KS272 foi utilizada (Fig. IA). Isto sugeriu que CCFT073 poderia evitar a formação do biofilme de MG1655F' ou por contacto directo, ou por secreção de uma molécula inibidora. Para distinguir entre estas duas possibilidades, o sobrenadante da cultura de fase estacionária de CFT073 foi esterilizado por filtração e o seu efeito na formação de biofilme de E. coli foi testado. Na presença do sobrenadante CFT073, o biofilme de MG1655F' foi severamente afectado (Fig. 1B,C). Esta inibição do biofilme não resultou de um defeito de crescimento devido a uma actividade bactericida ou bacteriostática, uma vez que a taxa de crescimento e viabilidade celular não foram afectadas pelo sobrenadante CFT073 (Fig. 1D, E). 30

Para determinar o espectro da actividade anti-biofilme do sobrenadante CFT073 o seu efeito foi testado em várias bactérias aderentes (E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, S. epidermidis e Enterococcus faecalis). Esta análise mostra que o sobrenadante CFT073 era activo contra uma gama surpreendentemente larga de bactérias, mesmo em culturas mistas (Fig. 1F e Fig. 2).

Exemplo 3. Correlação entre actividade anti-biofilme e cápsula do tipo II

Para elucidar a base genética do efeito anti-biofilme, foi testada a actividade do sobrenadante de ca. 10000 mutantes de inserção de transposões mariner CFT073 aleatórios. Os inventores identificaram sete candidatos com uma capacidade reduzida de inibir a formação de biofilme MG1655F'. Todos estes mutantes mapeados em genes envolvidos na expressão do polissacarídeo capsular do grupo II, estrutura da superfície celular bacteriana mais exterior (Whitfield e Roberts, 1999). A cápsula do grupo II exibe uma organização genética modular conservada, caracterizada por 3 regiões funcionais (Roberts, 1996) (Fig. 3A) . Região 1 (kpsFEDCUS) e região 3 (kpsMT) são conservadas em todas as bactérias do grupo 11 capsulares e codificam para proteínas necessárias para a exportação dos polissacarídeos dependentes de ABC. A região 2 é variável e codifica para polissacarídeos de serotipos tais como Kl, K2 (CFT073), K5, K96 (Roberts, 1996). A região Rl, R2 ou R3 de cada gene kps individual foi suprimida e observou-se que com excepção de kpsU, c3692 e c3693, todos os mutantes perderam a capacidade de inibir a formação do biofilme de E. coli, que se correlacionou com uma quantidade reduzida de açúcares precipitados no sobrenadante (Fig. 3B, 3C) . 31

Enquanto que uma cápsula corada com ferritina podia ainda ser detectada à volta de células CFT073 (Fig. 3D), estes resultados indicaram que a cápsula de CFT073 sofre no entanto uma libertação significativa para o meio sobrenadante que é responsável pelo efeito anti-biofilme observado.

Para determinar se a inibição do biofilme era uma propriedade exclusiva do sobrenadante de E. coli CFT073, os inventores pesquisaram vários isolados clínicos bacterianos uropatogénicos de Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Morganella, Citrobacter e Serratia, assim como uma colecção de 110 estirpes de E. coli de diversas origens. Verificaram que apenas o sobrenadante filtrado de 40 E. coli, incluindo 17 UPEC inibiu a formação de biofilmes numa gama larga de bactérias sem afectar a taxa de crescimento (Fig. 4A). Além disso, como estirpe de E. coli CFT073 todas as estirpes activas são capazes de inibir a formação de biofilme de bactérias aderentes diferentes de E. coli (na Fig. 4A ver os dados do biofilme de 15981 S. aureus). Utilizando amostras específicas de PCR (Johnson e 0'Bryan, 2004) mostraram que 39 das 40 estirpes activas de E. coli transportavam genes de cápsulas do grupo II. A 40a bactéria EcoR47 parece de facto produzir uma cápsula híbrida de grupo II/grupo III. Verificou-se que esta estirpe transporta os genes KPS do grupo II (Boyd e Hartl, 1998). De forma consistente, a introdução da mutação de kpsD nos isolados clínicos de UPEC U-9 e U-15 aboliu o efeito inibidor do biofilme dos seus sobrenadantes (Fig. 4B) . É interessante que apesar de estirpes CFT073, U-9 e U-15 apresentarem uma capacidade muito limitada para formar um biofilme no modelo do biofilme do micro fermentador, os mutantes kpsD respectivos apresentaram um fenótipo de biofilme acrescido. Este fenótipo poderia ser revertido por 32 adição do sobrenadante CFT073, sugerindo que estas estirpes poderiam também auto-inibir a sua própria adesão (Fig. 4C).

Um teste de inibição de formação de um biofilme foi também efectuado com uma estirpe de Neisseria meningitidis, cuja cápsula é bioquimicamente muito semelhante à cápsula de E. coli do grupo II. É interessante o facto destes resultados mostrarem que o sobrenadante de N. meningitidis também inibe a formação de biofilme de E. coli MG1655F' (Fig. 5), demonstrando que a actividade de anti-biofilme é uma propriedade não apenas da cápsula do grupo II de E. coli, mas também de cápsulas conhecidas por serem semelhantes a esta última (i.e. cápsulas semelhantes ao grupo II).

Exemplo 4: Propriedades fisico-guímicas do sobrenadante CFT073

Quando os inventores analisaram a composição das fracções de polissacarídeos precipitadas a partir dos sobrenadantes activos de diferentes cápsulas do grupo II de serotipos de E. coli, incluindo CFT073(K2), U-9 (não-K2) e IHE3034 (Kl), observaram que de acordo com estudos anteriores (Jann et al., 1980; Silver e Vimir, 1984) que estas fracções exibiam composições significativamente diferentes (dados não apresentados). Isto sugere que apesar de serem bioquimicamente distintas as cápsulas do grupo II libertadas por estas estirpes poderiam partilhar um modo de acção semelhante conduzindo a inibição do biofilme. Para continuar a estudar os mecanismos, através dos quais as cápsulas do grupo II inibem a formação bacteriana do biofilme, estas fracções foram colocadas em contacto com colóides catiónicos compostos por partículas de látex de 10 μιη de diâmetro que possuem uma carga total positiva permanente devido ao seu revestimento de polietilenoimina. 33 A determinação do potencial de interface ζ (Zeta) mostrou que os sobrenadantes do tipo selvagem induziram uma forte inversão de carga dos colóides catiónicos, indicativos da sua natureza altamente aniónica, quando comparada com os sobrenadantes dos suas cápsulas mutantes respectivas (Fig. 6a) . Além disso, o tratamento de lâminas de vidro limpas com ácido com um sobrenadante activo baixou a energia interfacial água-lâmina, o que é indicativo da sua natureza hidrofilica (Fig. 6b).

Para analisar se a cápsula do grupo II poderia induzir modificações de superfície e afectar forças intermoleculares nas superfícies tratadas, os inventores monitorizaram a adsorção do iodeto de propídio, um ião catiónico ampifílico em colóides revestidos com os sobrenadantes activos ou inactivos. Eles mostraram primeiro que o sobrenadante aniónico mas inactivo de E. coli EcoR72 capsular não do grupo II exibiu uma forte afinidade para a sonda de fluorescência catiónica (Fig. 6c) . Apesar da sua elevada carga negativa, sobrenadantes activos exibiram uma afinidade para a amostra significativamente mais baixa do que os sobrenadantes inactivos de cápsulas mutantes, mas menos carregadas negativamente (Fig. 6c e 6d). Este efeito foi mesmo mais pronunciado com a fracção capsular activa de 500 kDa K2 (FR2) purificada a partir de CFT073 por cromatografia de permuta aniónica contendo galactose, fosfato de glicerol e acetato na proporção molar de 1:2:1:1 (Jann et al., 1980) (Fig. 6c e 6d). Por isso, estes resultados mostraram que para além de fortes modificações electrostáticas, os sobrenadantes activos também induziram uma remodelação profunda das propriedades de superfície dos colóides, incluindo possivelmente a hidratação de superfície e repulsão estérica. Estas análises confirmam que as modificações de superfície induzidas pela cápsula do 34 grupo 11 são mais críticas para a inibição da formação do biofilme do que a composição primária da cápsula.

Exemplo 5: Prevenção do desenvolvimento do biofilme

As propriedades físico-químicas exibidas pela cápsula do grupo II podem alterar profundamente a capacidade bacteriana para interagir com superfícies e por isso reduzirem drasticamente a adesão (Neu, 1996). Para testar esta hipótese, foi analisada a capacidade de MG1655F' e S. aureus de aderirem às superfícies de vidro pré-tratadas com o sobrenadante CFT073. Após 1 hora de incubação, E. coli MG1655F' e S. aureus 15981 exibiram uma redução de 3 vezes da sua adesão inicial sobre uma superfície tratada (dados não apresentados). De forma consistente, o pré-tratamento da lâmina de vidro interna do micro fermentador com sobrenadante CFT073 reduziu drasticamente a formação de biofilme por E. coli e uma larga gama de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (Fig. 7) . 0 mesmo efeito foi observado quando o sobrenadante CFT073 foi perfusionado no micro fermentador (Fig. 2B). Não foi observado nenhum efeito, quando um tratamento semelhante foi efectuado com sobrenadante CFT073AkpsD (Fig. 7) . Estes resultados por isso sugerem que as modificações de superfície induzidas por polissacarídeos capsulares libertadas no sobrenadante CFT073 poderiam interferir com a formação de biofilme reduzindo interacções iniciais bactérias-superfície.

Notoriamente o efeito anti-biofilme do sobrenadante CFT073 persistiu mesmo após tratamentos drásticos da lâmina de vidro (Fig. 8), que sugere que a cápsula do grupo II poderia ser utilizada em aplicações que necessitam de um passo de esterilização (tal como aplicações agro-industriais ou médicas). 35

Para investigar o efeito do sobrenadante CFT073 em biofilmes que já existem, micro fermentadores inoculados com MG1655F' em diferentes fases de maturação do biofilme foram suplementados com sobrenadante filtrado CFT073. Esta análise mostrou que enquanto o tratamento de um biofilme maduro de 24 h não induziu a dispersão do biofilme, a adição do sobrenadante CFT073 a 0,1 e 6 h após iniciação da formação de biofilme MG1655F' bloqueou a continuação do seu desenvolvimento (Fig. 9A) . Os inventores examinaram então as características in vitro do biofilme de um GFP marcado com MG1655F'' após adição de um sobrenadante CFT073 e microscopia de varrimento a laser confocal (CLSM). Após 3 h de inoculação post-inicial, a adição de sobrenadante exógeno de CFT073 activo sobre uma superfície regularmente coberta afectou profundamente o desenvolvimento da estrutura do biofilme maduro MG1655F' (Fig 9B) . Este efeito não foi observado após o tratamento do sobrenadante de controlo KS272. A contribuição directa das estruturas da superfície bacteriana na estrutura tridimensional do biofilme de E. coli foi amplamente demonstrada (Beloin et ai., 2005). Verificou-se que estas estruturas também medeiam a agregação bacteriana e formação de torrões em culturas em repouso. Para continuar a caracterizar o papel da cápsula do grupo II na maturação do biofilme, os inventores testaram os seus efeitos na agregação bacteriana mediada por vários factores diferentes expostos à superfície também envolvidos na formação de biofilme. Verificou-se que o sobrenadante CFT073 evita a formação de agregados bacterianos induzidos por diferentes tipos de estruturas de superfície bacteriana (Fig. 9C). A actividade anti-biofilme de diferentes concentrações da fracção FR2 foi testada em ensaios na placa 36 microtituladora. Isto mostrou que a fracção FR2 purificada é activa a concentrações a partir de 50 μρ/ιηΐ (Fig. 10) .

Tomados em conjunto estes resultados sugerem que as propriedades fisico-quimicas dos polissacarideos capsulares do grupo II afectam a formação do biofilme enfraquecendo os contactos célula-superficie (adesão inicial), mas também reduzindo as interacções célula-célula (maturação do biofilme).

Em conclusão, os inventores demonstraram que os polissacarideos capsulares do tipo grupo II são libertados no sobrenadante de cultura e apresentam propriedades anti-adesão contra uma larga gama de bactérias, incluindo patogéneos nosocomiais. Este estudo revela uma nova propriedades dos polissacarideos capsulares do grupo II que são habitualmente expressas por E. coli extra-intestinal, mas também por outros patogéneos tal como Neisseria meningitidis (Kaijser, 1973; Sandberg et al., 1988), cujo sobrenadante poderia também inibir a formação de biofilme de E. coli (dados não apresentados). Verificou-se que a cápsula do grupo II está envolvida na virulência UPEC aumentando a sua resistência à fagocitose e aos efeitos bactericidas do soro humano (Cross et al., 1986; Kaper et al., 2004; Pluschke et al., 1983; Russo et al., 1995). As cápsulas poderiam também desempenhar um papel biológico importante nas interacções UPEC com superfícies vivas e inertes. Em particular, para além da competição bacteriana, a inibição da própria adesão de UPEC pela secreção da cápsula do grupo II pode contribuir para a colonisação do tracto gastro-intestinal reduzindo as interacções bactérias-bactérias (Schembri et al., 2004) evitando deste modo a eliminação bacteriana devido à formação de agregados (Favre-Bonte et al., 1999). De forma consistente foi observado que o mutante CFT073ARI é incapaz de colonizar o intestino do ratinho (Fig. 11). 37

As análises in vitro indicam que a cápsula do grupo II pode induzir modificações de superfície tais como inversão de carga da superfície catiónica, molhabilidade acrescida da superfície e repulsão molecular, conduzindo a propriedades anti-adesivas não específicas. Uma vez que este efeito inibidor foi observado tanto em sobrenadantes na fase exponencial como na fase estacionária de crescimento, assim como num mutante AluxS de CFT073 que detecta o quórum (Fig. 12), isto sugere que o efeito anti-biofilme não envolve sinalização celular (Waters e Bassler, 2005), mas que actua pelo contrário através de alteração físico-químico tanto de superfícies abióticas ou bacterianas. Os polímeros que se juntam sobre as superfícies são conhecidos por provocar uma repulsão física forte dependendo da sua densidade, dimensão, solvatação e estrutura (de Gennes, 1987). Tais forças repulsivas criadas por polímeros de cápsulas poderiam limitar a adesão inicial bacteriana e desenvolvimento de biofilme interferindo com contactos célula-célula subsequentes. Finalmente, os inventores mostraram que a aplicação dos polissacarideos capsulares do grupo II em superfícies abióticas reduzem a adesão bacteriana inicial e possui uma duração do efeito suficientemente longa para inibir significativamente o desenvolvimento do biofilme maduro de um largo espectro de bactérias. Este facto pode ter implicações de longo alcance na concepção de estratégias terapêuticas para limitar a formação de biofilmes patogénicos, por exemplo, em implantes médicos. 38

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Lisboa, 4 de Junho de 2010.

Claims (22)

1 Reivindicações 1. Uso de um polissacarideo capsular do tipo grupo II solúvel proveniente de uma estirpe bacteriana para a preparação de uma composição que previne ou inibe a aderência bacteriana e/ou o desenvolvimento de um biofilme bacteriano.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que o dito polissacarideo capsular do tipo do grupo II solúvel é obtido no sobrenadante de uma cultura de bactérias escolhidas entre Escherichia coli, Hemophilus influenzae e Neisseria meningitidis.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, ou com a reivindicação 2, em que o dito polissacarideo capsular do tipo do grupo II solúvel é obtido sob a forma de uma fracção purificada.

4. Composição destinada à inibição da aderência bacteriana e/ou do desenvolvimento de um biofilme bacteriano, caracterizado por compreender um polissacarideo capsular do tipo do grupo II solúvel proveniente de uma estirpe bacteriana.

5. Composição de acordo com a reivindicação 4, que compreende uma fracção purificada do sobrenadante de uma cultura de bactérias escolhidas entre E. coli, H. influenzae e N. meningitidis.

6. Processo de purificação de um polissacarideo capsular do tipo do grupo II anti-biofilme proveniente de uma estirpe bacteriana compreendendo as etapas seguintes: 2 (i) separação do sobrenadante de uma cultura de uma estirpe bacteriana que expressa uma cápsula do tipo do grupo II a partir de células bacterianas, (ii) precipitação de polissacarideos presentes no sobrenadante obtido, e (iii) opcionalmente suspender novamente o precipitado.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, no qual a dita estirpe bacteriana que exprime uma cápsula do tipo grupo II é escolhida entre E. coli, H. influenzae e N. meningitidis.

8. Processo de acordo com a reivindicação 6, ou a reivindicação 7, em que a dita estirpe bacteriana é um E. coli uropatogéneo.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, em que a separação na etapa (i) é efectuada por esterilização em filtro e/ou por centrifugação da cultura.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, em que a precipitação na etapa (ii) é efectuada com três volumes de etanol por um volume de sobrenadante.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, em que o precipitado obtido na etapa (ii) é novamente suspenso em água, dializado contra água desionizada e de seguida liofilizado antes da etapa (iii) .

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11, compreendendo um passo suplementar de purificação (iv) por cromatografia de permuta iónica. 3

13. Processo de acordo com a reivindicação 12 em que a etapa (iv) é efectuada utilizando uma coluna de DEAE-Sepharose.

14. Processo de acordo com a reivindicação 12 ou a reivindicação 13, em que a ressuspensão no passo (iii) é efectuada em tris-HCl 20 mM, pH 7,5 com 25% de propan-l-ol e a coluna utilizada na etapa (iv) é equilibrada com o mesmo tampão.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, em que um passo de centrifugação é efectuado entre a etapa (iii) e a etapa (iv) para eliminar a fracção insolúvel.

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, no qual o dito polissacarideo capsular do tipo grupo II é eluido com 300 mM de NaCl em Tris-HCl 20 mM, pH 7,5 25% de propan-l-ol.

17. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou composição de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que o dito polissacarideo capsular do tipo grupo II solúvel é obtido através de um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 16.

18. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 4,5 e 17 que é formulada para uma administração preventiva ou terapêutica a um sujeito que tem necessidade dela.

19. Revestimento anti-biofilme caracterizado por compreender um polissacarideo capsular do tipo grupo II proveniente de uma estirpe bacteriana. 4

20. Revestimento anti-biofilme de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o dito polissacarídeo capsular do tipo grupo II ser proveniente de uma estirpe bacteriana escolhida entre Escherichia coli, Hemophilus influenzae e Neisseria meningitidis.

21. Revestimento anti-biofilme de acordo com a reivindicação 19 ou com a reivindicação 20, caracterizado por ser obtido por aplicação de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 4,5 e 17.

22. Dispositivo médico ou industrial, caracterizado por ser pelo menos parcialmente revestido com um revestimento anti-biofilme de acordo com qualquer uma das reivindicações 19, 20 e 21. Lisboa, 4 de Junho de 2010.