PT2027263E - Processo para a separação e a determinação da carga viral numa amostra de pancreatina - Google Patents

Description

ΡΕ2027263 1 DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A SEPARAÇÃO E A DETERMINAÇÃO DA CARGA VIRAL NUMA AMOSTRA DE PANCREATINA" A presente invenção refere-se a um processo para separar substancialmente e quantitativamente a carga virai de uma amostra de pancreatina e a um processo para a determinação quantitativa da carga virai desta amostra de pancreatina. A pancreatina é uma mistura conhecida há muito tempo de vários constituintes fisiologicamente activos obtidos das glândulas pancreáticas de mamíferos. Os constituintes principais da pancreatina são enzimas digestivos, em particular lipase pancreática, mas também amilases e proteases. Graças às suas propriedades terapêuticas valiosas e elevada segurança de utilização, a pancreatina tem sido há muito tempo utilizada com muito sucesso como preparação farmacêutica em terapia de substituição enzimática. A lipase pancreática é aqui do maior significado, mas as amilases e proteases também contribuem consideravelmente para os benefícios terapêuticos da pancreatina. A pancreatina para fins terapêuticos é geralmente obtida de gado bovino ("pancreatina bovina") ou porcos ("pancreatina porcina"), sendo a pancreatina porcina a mais significativa em termos quantitativos. Os 2 ΡΕ2027263 métodos para a produção da pancreatina para fins terapêuticos são conhecidos per se, por exemplo da publicação EP 0 115 023 A.

Devido à natureza da pancreatina derivada de animais, os materiais de partida podem tipicamente ser acompanhados por componentes biológicos indesejados, tais como contaminantes bacterianos ou virais. No entanto, durante mais de 100 anos de comercialização dos produtos farmacêuticos contendo pancreatina, não foi registado nenhum caso em gue os pacientes tenham sido afectados por pancreatina com contaminação virai. No entanto, empresas gue produzem produtos farmacêuticos derivados de tecidos biológicos e/ou fluidos corporais estão cada vez mais pressionados pelas autoridades regulamentares para aumentar o nivel de segurança dos seus produtos através da redução de todos os contaminantes ao nível mais baixo possível, independentemente de qualquer contaminante em consideração seja considerado um patogénio humano ou não. Para a aplicação da pancreatina em produtos farmacêuticos, é assim desejável ter métodos analíticos fiáveis para a detecção e a quantificação de tais contaminantes biológicos.

Até à data, não foi desenvolvido nenhum método para a detecção quantitativa ou a separação de contaminantes virais numa amostra de pancreatina. Isto é provavelmente devido ao facto dos constituintes enzima-ticamente activos da pancreatina serem incompatíveis com as linhas celulares tipicamente usadas para multiplicar vírus 3 ΡΕ2027263 utilizando técnicas conhecidas por uma pessoa com perícia na técnica, tornando assim mais difícil ou mesmo impossível determinar o título virai numa amostra de pancreatina.

Foi deste modo o objecto da invenção proporcionar um processo para separar quantitativamente de forma substancial a carga virai de uma amostra de pancreatina e um processo para a determinação quantitativa da carga virai desta amostra e pancreatina. Em particular, foi um objecto da invenção proporcionar um processo para a separação quantitativa substancial de uma carga virai infecciosa de uma mostra de pancreatina e um processo para a determinação quantitativa da carga virai infecciosa desta amostra de pancreatina.

Descobriu-se agora surpreendentemente que a carga virai, em particular da carga virai infecciosa, de uma amostra de pancreatina pode ser substancialmente quantitativamente determinada se a carga virai for primeiro separada da amostra de pancreatina num processo de centrifugação em vários passos e a carga virai separada é então determinada quantitativamente utilizando métodos de virologia conhecidas per se. A publicação JP 12856990 já divulgou um método para a concentração ou o isolamento de vírus de hepatite através de uma combinação não específica de centrifugação de baixa velocidade e de ultracentrifugação. 4 ΡΕ2027263

Numa primeira realização, a invenção refere-se a um processo para a separação da carga virai para uma amostra de pancreatina, compreendendo os passos processuais de: a) produzir uma amostra de teste de pancreatina liquida adequada para centrifugação a partir da amostra de pancreatina sem com tal alterar a sua carga virai, b) submeter pelo menos uma parte definida da amostra de teste de pancreatina a partir do passo a) do processo a pelo menos uma centrifugação em baixa velocidade sob condições, sob as quais os virus com constantes de sedimentação de > 120 S não formam ainda um sedimento, c) descartar qualquer depósito sólido opcionalmente proveniente no passo b) do processo durante uma centrifugação de baixa velocidade e reter um sobrenadante com a amostra de teste de pancreatina, d) submeter pelo menos uma parte definida do sobrenadante com a amostra de teste de pancreatina obtido no passo c) do processo a uma ultracentrifugação num meio com gradiente descontinuo, em que a duração da ultracentrifugação e a força centrífuga relativa para a ultracentrifugação são seleccionadas de tal modo que a carga virai é quantitativamente transportada para fora do sobrenadante com a amostra de teste de pancreatina numa fracção alvo situada acima ou na 5 ΡΕ2027263 camada limite entre a componente superior de menor concentração e a componente inferior de gradiente de concentração mais elevada, e e) separar quantitativamente a fracção alvo contendo a carga virai do sobrenadante com a amostra de teste de pancreatina.

Numa segunda realização, a invenção refere-se a um processo para a determinação quantitativa da carga virai da amostra de pancreatina, em particular a carga virai infecciosa da amostra de pancreatina. Nesta segunda realização, além do processo de acordo com a primeira realização, num passo suplementar f) do processo, após o passo e) do processo, a determinação quantitativa da carga virai da amostra de pancreatina é levada a cabo através da determinação do titulo de infecção virai na fracção alvo contendo a carga virai.

Excepto se aqui especificado de outro modo, quaisquer termos técnicos e científicos apresentados abaixo terão em cada caso o mesmo significado convencionalmente percepcionado por um perito no campo particular da técnica. As gamas de temperatura aqui de seguida citadas no formato de por exemplo "0-15°C" denominam a gama de temperatura de desde 0°C a 15°C estando em cada caso os limites da gama incluidos. As gamas de tempo aqui de seguida citadas no formato de por exemplo "30-120 minutos" denominam a gama de tempo de desde 30 minutos a 120 minutos estando em cada 6 ΡΕ2027263 caso os limites da gama incluídos. As gamas de tempo aqui de seguida citadas no formato de por exemplo "2-8 horas" denominam a gama de tempo de desde 2 horas a 8 horas estando em cada caso os limites da gama incluídos. As gamas de força centrífuga relativa aqui de seguida citadas no formato de por exemplo "1500-5000 x g" denominam a gama de força centrífuga relativa de desde 1500 x g a 5000 x g estando em cada caso os limites da gama incluídos. As gamas de volume aqui de seguida citadas no formato de por exemplo "10-15 mL" denominam a gama de volume de desde 10 mililitros a 15 mililitros estando em cada caso os limites da gama incluídos. As gamas de comprimento aqui de seguida citadas no formato de por exemplo "80-100 mm" denominam a gama de comprimento de desde 80 milímetros a loO milímetros estando em cada caso os limites da gama incluídos. O processo de acordo com a invenção é adequado para todos os tipos de pancreatina de origem animal e pode em particular ser levado a cabo em pancreatinas porcinas e em pancreatinas bovinas comerciais. O processo é preferentemente levado a cabo em amostras de pancreatina porcinas. O processo de acordo com a invenção é geralmente adequado para separar a carga virai de uma amostra de pancreatina e para subsequentemente determinar de forma quantitativa a carga virai de uma amostra de pancreatina. Em particular, o processo é adequado para a separação e para a determinação quantitativa da carga virai de amostras 7 ΡΕ2027263 de pancreatina, nas quais a carga virai compreende o rotavirus bovino A, o virus da encefalomiocardite (= EMCV), o circovirus porcino (= PCV), o parvovirus porcino (= PPV) , o rotavirus porcino A, o tescovirus porcino e/ou o virus da doença vesicular suina (= SVDV). Graças às suas propriedades muito similares, o coxsackievirus humano B 5/1 pode ser usado como um modelo para verificar a adequação do processo de acordo com a invenção para separar e/ou determinar quantitativamente SVDV. Graças às suas propriedades muito similares, o rotavirus bovino A (por exemplo a estirpe B 223) pode ser usada como modelo para verificar a adequação do processo de acordo com a invenção para separar e/ou determinar quantitativamente o rotavirus porcino A.

No passo a) do processo do processo de acordo com a invenção, uma amostra de teste de pancreatina liquida adequada para centrifugação é produzida a partir de uma amostra de pancreatina sem através do qual se alterar ou modificar a sua carga virai, em particular a sua carga virai infecciosa. Isto pode, por exemplo, proceder-se através da produção de uma suspensão de amostra de teste da pancreatina a partir da amostra de pancreatina. A suspensão de amostra de teste da pancreatina é produzida através da combinação da amostra de pancreatina com um meio de cultura de células que é adequado para a linha celular usada para cultivar a espécie de virus a ser investigada e com um ou mais antibióticos adequados para o efeito. Geralmente, todos os antibióticos são adequados para a produção de uma solução de antibióticos opcionalmente usada no passo a) do ΡΕ2027263 processo. Como regra geral, utilizam-se antibióticos de largo espectro ou misturas de tais antibióticos de largo espectro. Antibióticos adequados podem ser, por exemplo, seleccionados do grupo compreendendo antibióticos β-lactâmicos tais como penicilinas, cefalosporinas (incluindo oxacefemes e carbacefemes), carbapenemes e monobactamas; estreptomicina (incluindo sulfato de estreptomicina); neo-micinas (incluindo neomicina A, neomicina B e paromo-micina); canamicinas (incluindo canamicina, gentamicina, amicacina e tobramicina); espectinomicina; tetraciclinas (incluindo tetraciclina, oxitetraciclina, doxiciclina e minociclina); antibióticos macrólidos (incluindo eritromi-cina, claritromicina, roxitromicina, azitromicina, josami-cina e espiramicina); inibidores da girase (incluindo o ácido nalidixico, cinoxacina, ácido pipemídico, norfloxa-cina, pefloxacina, ciprofloxacina, ofloxacina e fleroxa-cina; antagonistas do ácido fólico (incluindo antibióticos sulfonamida, diamino benzilpirimidinas e as suas combinações) ; cloramfenicol; lincosamidas; antibióticos glicope-ptídicos (incluindo vancomicina e teicoplanina); fosfomici-na; antibióticos polipeptídicos (incluindo polimixina B, colistina, bacitracina e tiroticina) e mupirocina. Antibióticos preferidos são o sulfato de estreptomicina e a penicilina e misturas de sulfato de estreptomicina e de penicilina, por exemplo na forma de um "cocktail" de antibióticos. 0 um ou mais antibióticos podem ser por exemplo usados numa solução de um solvente que seja adequado para o um ou mais antibióticos em cada caso, ou seja, na forma de uma solução antibiótica. 9 ΡΕ2027263 A suspensão da amostra de teste da pancreatina é convencionalmente produzida com arrefecimento a uma temperatura de 0-15°C, por exemplo a uma temperatura de 4-10°C. Os constituintes para a produção da suspensão da amostra de teste de pancreatina são convencionalmente agitados com arrefecimento em gelo e durante pelos menos 30 minutos, por exemplo 30-120 minutos, preferentemente 45-90 minutos, em particular 50 minutos ou 60 minutos. O objec-tivo do arrefecimento da amostra de teste da pancreatina e do arrefecimento em todos os passos subsequentes é em cada caso evitar ou pelo menos reduzir substancialmente qualquer desactivação indesejada da carga virai pelos constituintes enzimaticamente activos da amostra de pancreatina. Numa realização, a invenção também proporciona uma suspensão da amostra de teste da pancreatina que pode ser produzida de acordo com o passo a) do processo. A escolha dos meios de cultura que são em cada caso usados para a produção da suspensão da amostra de teste de pancreatina num passo a) do processo é determinada pela espécie de vírus que se pretende separar e/ou determinar de forma quantitativa pelo processo de acordo com a invenção. Utilizam-se culturas de células permissivas nas quais a espécie de vírus investigada se possível inicia um efeito citopático (= CPE) que são usadas para cultivar e detectar uma espécie de vírus específica. CPE é uma modificação de células infectadas com vírus que pode ser reconhecida através de microscopia óptica. Se uma espécie 10 ΡΕ2027263 de vírus se multiplica na célula em cultura sem CPE, esta multiplicação pode em geral no entanto ser identificada por métodos de detecção indirectos conhecidos per se.

Se, por exemplo, se pretende separar e/ou determinar de forma quantitativa o rotavírus bovino A, pode-se usar para a sua cultura, por exemplo, células de rim fetais de macaco (= células MA-104). Neste caso, o meio de Eagle modificado por Dulbecco conhecido per se (= meio de Dulbecco) é, por exemplo, adequado como meio de cultura. Se for pretendido separar e/ou determinar quantitativamente EMCV, podem-se usar para a sua cultura células de rim porcinas (= células PK-15) ou células de rim porcinas embrionárias (= células SPEV). No caso de células PK-15, é por exemplo adequado o Meio Essencial Mínimo (= MEM) conhecido per se como meio de cultura de células. No caso de células SPEV, o meio de Dulbecco é, por exemplo, adequado como meio de cultura de células. Se, por exemplo, se pretende separar e/ou determinar quantitativamente PCV, podem-se utilizar, por exemplo, células PK-15 para os cultivar. Se, por exemplo, se pretende separar e/ou determinar quantitativamente PPV, podem-se utilizar, por exemplo, células de rim porcino (células SK-6), para os cultivar. Neste caso, o meio de Dulbecco é, por exemplo, adequado como meio de cultura. Se, por exemplo, se pretende separar e/ou determinar quantitativamente rotavírus porcino A, podem-se usar, por exemplo, células MA-104, para o cultivar. Se, por exemplo, se pretende separar e/ou determinar quantitativamente tescovírus porcino, podem-se 11 ΡΕ2027263 usar, por exemplo células PK-15, para a sua cultura. Se, por exemplo, se pretende separar e/ou determinar quantitativamente SVDV, podem-se usar, por exemplo, células SPEV, para a sua cultura. 0 perito na técnica conhece linhas celulares adequadas para a cultura de espécies de virus particulares e os meios de cultura de células adequados correspondentes. As espécies de virus utilizáveis de acordo com a presente invenção e as linhas celulares correspondentes podem ser obtidas a partir de fontes apropriadas, por exemplo da "American Type Culture Collection", Ma-nassas, EUA (= ATCC), da "Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH", Braunschweig, Alemanha (= DSMZ), a "Friedrich-Lõffler-Institut", Instituto Federal de Investigação para a Saúde Humana, Inel Riems, Alemanha (= FLI) ou a "Veterinary Service Division" do "Department of Agriculture and Rural Development", Belfast, Reino Unido (=DARD).

No passo b) do processo, a amostra de teste de pancreatina obtida no passo a) do processo pode ou ser usada na sua totalidade, ou uma parte definida da amostra de teste da pancreatina, em particular pode ser usado um volume definido desta amostra de teste da pancreatina. A amostra de teste da pancreatina obtida no passo a) do processo é preferentemente utilizada na sua totalidade.

No passo b) do processo, no caso de centrifugações de baixa velocidade, podem ser estabelecidas condições sob as quais virus com constantes de sedimentação 12 ΡΕ2027263 de ^ 120 S, em particular de ^ 120 S a 5000 S, não formam ainda um sedimento. Geralmente, virus com constantes de sedimentação de ^ 120 S, em particular virus com constantes de sedimentação de ^ 120 S a 5000 S, não formam ainda sedimentos quando as centrifugações a baixa velocidade são levadas a cabo com uma força centrífuga relativa de em cada caso inferiores a 10000 x g, preferentemente de em cada caso 1500-5000 x g, particularmente preferentemente de em cada caso 2000-3500 x g, por exemplo de em cada caso 2700 x g. A duração de um passo de centrifugação de baixa velocidade convencionalmente chega a pelo menos 5 minutos, geralmente 5-60 minutos, em particular 10-45 minutos, preferentemente 10-30 minutos, por exemplo 15 minutos. Numa realização preferida do passo b) do processo, os passos de centrifugação a baixa velocidade são levados a cabo com arrefecimento a uma temperatura de 0-15°C, por exemplo a uma temperatura de 4-10°C, preferentemente numa centrífuga refrigerada. O objectivo dos passos de centrifugação a baixa velocidade no passo b) do processo é primeiramente remover da suspensão de pancreatina aqueles constituintes da pancreatina tais como partículas insolúveis, etc. que interferem na separação e/ou na determinação quantitativa da carga virai de uma amostra de pancreatina de modo a obter um sobrenadante de amostra de teste de pancreatina que seja adequada para processamento suplementar. Os depósitos sólidos opcionalmente obtidos nos passos de centrifugação de baixa velocidade são assim geralmente 13 ΡΕ2027263 descartados no passo c) do processo, enquanto que o sobrenadante é usado para o passo d) do processo. Os passos de centrifugação a baixa velocidade com o subsequente descarte de depósitos sólidos opcionalmente obtidos são convencionalmente repetidos até deixar de se observar a formação de depósitos sólidos. Geralmente, não serão necessárias mais repetições após 1-3 repetições, em particular após apenas uma repetição, de passos de centrifugação de baixa velocidade com subsequente descarte de depósitos sólidos opcionalmente obtidos. Numa realização da invenção, um depósito sólido tal como obtido no passo b) do processo pode ser um sedimento. Numa realização da invenção, o depósito sólido obtido em passos de centrifugação a baixa velocidade é lavado uma vez ou mais, por exemplo 1-3 vezes, com um fluido de lavagem antes de ser descartado. Um fluido de lavagem é, por exemplo, o sobrenadante da amostra de teste de pancreatina obtido após a própria centrifugação a baixa velocidade, que pode ser então usado no passo d) do processo. Se for usado um fluido de lavagem diferente do próprio sobrenadante da amostra de teste de pancreatina, o referido fluido de lavagem é combinado, uma vez completa a lavagem do depósito, com o sobrenadante da amostra de teste de pancreatina e depois usado no passo d) do processo. É particularmente vantajoso lavar o depósito do modo acima mencionado no passo d) do processo, se a carga virai da amostra de pancreatina compreende EMCV.

Utiliza-se convencionalmente um gradiente de 14 ΡΕ2027263 sacarose em duas fases descontínuas como meio de gradiente descontínuo no passo d) do processo. 0 meio de gradiente descontínuo compreende preferentemente um gradiente preparado a partir de uma solução de sacarose a 50% (peso/vol.) tamponizada e uma solução de sacarose a 20% (peso/vol.)tamponizada. Os tampões neutros (isto é que tamponizam à volta de um valor de pH de 7) podem, por exemplo, ser usados como tampão para as soluções de sacarose. Usa-se preferentemente um tampão de PBS (= tampão "fosfato salino", pH 7,2). Utilizam-se normalmente meios de gradiente estéreis. Um gradiente de sacarose descontínuo de duas fases do tipo acima apresentado proporciona uma sedimentação particularmente adequada e deste modo podem ser encontradas condições de separação para os vírus. Os gradientes de sacarose descontínuos, em particular um gradiente tal como descrito acima preparado a partir de uma solução de sacarose a 50% (peso/vol.) opcionalmente tamponizada e uma solução de sacarose a 20% (peso/vol.) tamponizada, apresenta além disso condições osmóticas adequadas de modo a não desactivar qualquer carga virai opcionalmente presente. A ultracentrifugaçao de acordo com o passo d) do processo assegura, por exemplo, que a carga virai originada da amostra da pancreatina é substancialmente quantitativamente transferida do sobrenadante da amostra de teste de pancreatina para o meio de gradiente descontínuo. Substancialmente quantitativo significa aqui que uma carga virai anteriormente adicionada a uma amostra de teste é de tal modo completamente recuperada que a diferença de teor na carga virai adicionada e aquela que é 15 ΡΕ2027263 recuperada após a centrifugação ter sido realizada é inferior ou igual a meio passo do logaritmo de base de titulo de virus (= 0,5 log passos). A ultracentrifugação de acordo com o processo do passo d) assegura ainda que a carga virai é transportada para uma fracção alvo que se situa suficientemente da amostra de teste de pancreatina para permitir a sua separação mecânica da amostra de teste de pancreatina sem ser possível qualquer nova mistura das fases que prejudiquem a realização da separação. O passo d) do processo é convencionalmente levado a cabo através da introdução de um volume do meio de gradiente da concentração mais elevada num tubo de ultracentrífuga sobro o qual se coloca um estrato de um volume do meio de gradiente com a concentração mais baixa seguinte. Este processo é repetido tantas vezes quanto desejadas para obter um meio de gradiente multifásico em que a camada final (do topo) é um volume da amostra de teste de pancreatina líquida adequada para centrifugação a partir da qual a carga vira se pretende separar. No caso de um meio de gradiente de duas fases, o volume do meio de gradiente com a concentração mais baixa seguinte é então imediatamente sobreposto com um volume de líquido de amostra de teste de pancreatina ou de uma suspensão de amostra de teste de pancreatina (volume da amostra de teste de pancreatina) que é adequado para a centrifugação. No caso de um meio de gradiente de duas fases, isto resulta numa sequência de fases no tubo de ultracentrífuga do topo até à base de uma primeira camada compreendendo o volume da 16 ΡΕ2027263 amostra de teste de pancreatina (topo), então o volume do meio de gradiente da concentração mais baixa (meio; por exemplo uma solução de sacarose a 20% (peso/vol) tampo-nizada) e finalmente o volume do meio do gradiente com a concentração mais elevada (fundo, cobrindo o fundo do tubo de ultracentrífuga; por exemplo uma solução de sacarose a 50% (peso/vol.) tamponizada). Quando se sobrepõem os volumes individuais, é necessário ter cuidado para assegurar que não ocorre turbulência ou mistura nas respectivas fronteiras. A fracção alvo no passo d) do processo compreende (i) uma parte do meio do gradiente com concentração mais baixa suficientemente afastado e remoto do volume da amostra de teste de pancreatina e (ii) o volume completo do mais do gradiente da concentração mais elevada seguinte. No caso de um meio de gradiente de duas fases a fracção alvo compreende, por exemplo, uma parte do meio do gradiente de menor concentração afastado e remoto do volume da amostra de teste de pancreatina e o volume completo do meio de gradiente de concentração mais elevada que se estende para baixo até ao fundo do tubo de ultracentrífuga.

Quando se calcula a localização de uma fracção alvo que é suficientemente removida do volume da amostra de teste de pancreatina permitindo assim a separação subsequente, dever-se-á ter em atenção que os valores calculados para a posição das partículas (isto é, a posição das partículas virais separadas da amostra de pancreatina) 17 ΡΕ2027263 geralmente denotam os vértices de uma distribuição Gaussiana. Como tal, as partículas serão distribuídas tanto acima como abaixo da sua posição calculada. É assim necessário quando se determina a distância desejada da fracção alvo do volume da amostra teste de pancreatina incluir uma margem adicional para ter em conta a distribuição Gaussiana das localizações da partícula. A carga virai é convenientemente transportada para uma fracção alvo que é suficientemente distante do volume da amostra de teste da pancreatina para a separação subsequente se partículas com uma constante de sedimentação de ^ 120 S, em particular de h 120 S a 5000 S, migraram do volume da amostra de teste da pancreatina em pelo menos 10 mm, por exemplo pelo menos 15 mm, pelo menos 20 mm, pelo menos 25 mm ou pelo menos 30 mm, para o meio do gradiente com a concentração mais baixa devido à ultracentrifugação. No caso do meio de gradiente de duas fases previamente descrito, o meio do gradiente de concentração mais baixa é a solução de sacarose a 20% (peso/vol.) tamponizada. Numa variante do passo de ultracentrifugação, substancialmente todas as partículas com uma constante de sedimentação de h 120 S, em particular de ^ 120 S a 5000 S, passaram completamente através do meio do gradiente de menor concentração e são concentradas na camada limite para o meio do gradiente de concentração mais elevada seguinte (isto é, numa "almofada de sacarose"). O perito na técnica conhece meios adequados para calcular e implementar as condições correspondentes para a ultracentrifugação. As condições adequadas para a ultracentrifugação podem ser 18 ΡΕ2027263 determinadas com base nas características do ou dos vírus a serem separados da amostra de pancreatina (por exemplo, densidade e constante de sedimentação) , quando aplicável assumindo simplificações conhecidas per se (ver por exemplo, Lebowitz et al., "Modern analytical ultracen-trifugation in protein Science: A tutorial review"; Protein Science 11 (2002) 2067-2079).

Desde que as ultracentrifugações sejam levadas a cabo utilizando razões de volume convencionais e no meio de gradiente descontínuo, preferentemente no gradiente de sacarose descontínuo de duas fases, a carga virai é convencionalmente transportada para uma fracção alvo adequada para separação subsequente, se a ultracen-trifugação é levada a cabo durante pelo menos 1 hora, geralmente pelo menos 2 horas, por exemplo durante 2-8 horas, em particular durante 3-6 horas. Uma força centrífuga relativa adequada para a ultracentrifugação de acordo com a invenção é pelo menos 10000 x g, por exemplo 200000-350000 x g. Numa realização do passo de ultracentrifugação, o referido passo é levado a cabo durante 3-6 horas com uma força centrífuga relativa de 200000-350000 x g em razões de volume convencionais para levar a cabo a ultracentrifugação e num gradiente preparado a partir de uma solução de sacarose a 50% (peso/vol.) tamponizada e uma solução de sacarose a 20% (peso/vol.) tamponizada. Noutra realização do passo de ultracentrifugação, o referido passo é levado a cabo durante 3,5-4,5 horas com uma força 19 ΡΕ2027263 centrífuga relativa de 250000-300000 x g em razões de volume convencionais para levar a cabo a ultracentrifugação e num gradiente preparado a partir de uma solução de sacarose a 50% (peso/vol.) tamponizada e uma solução de sacarose a 20% (peso/vol.) tamponizada. Obtêm-se razões de volume convencionais para levar a cabo a ultracentrifugação, por exemplo, se forem utilizados tubos de ultracentrífuga convencionais. Tubos de ultracentrífuga convencionais são aqui, por exemplo, aqueles com um volume de 10-15 mL, em particular 12-13 mL; um raio interno de 6-8 mm, em particular de 7 mm; e uma altura de 80-100 mm, em particular de 85-95 mm. Desde que se utilize um tubo de ultracentrífuga convencional no passo d) do processo, o volume do meio do gradiente de concentração mais elevado (por exemplo, uma solução de sacarose a 50% (peso/vol.) pode ascender a 0,5 mL, o volume da concentração mais baixa seguinte do meio de gradiente (por exemplo uma solução de sacarose a 20% (peso/vol.) tamponizada) pode ascender a 4,5 mL e o volume da amostra de teste de pancreatina pode ascender, por exemplo, a 5 mL.

Numa variante preferida das realizações do passo d) do processo, independentemente das condições de outro modo seleccionadas, a ultracentrifugação é levada a cabo com arrefecimento a uma temperatura de 0-15°C, preferentemente a uma temperatura de 4-10°C.

Centrífugas refrigeradas convencionais que podem 20 ΡΕ2027263 ser utilizadas neste passo do processo são conhecidas do perito na técnica. Uma ultracentrifuga comercial convencional é convencionalmente usada no passo d) do processo, tal como uma ultracentrifuga refrigerada com um rotor de oscilação livre, por exemplo uma ultracentrifuga da Sorvall® com um rotor de oscilação livre modelo "TH-641" . A descrição realizada acima dos passos de centrifugação a baixa velocidade e de ultracentrifugação de acordo com a invenção podem ser implementados a escalas superiores ou inferiores em qualquer grau desejado pelo perito na técnica, em particular com o auxilio de informação técnica suplementar apresentada na descrição da presente invenção.

No passo e) do processo, a fracção alvo contendo a carga virai é separada quantitativamente do sobrenadante da amostra de teste da pancreatina. A separação geralmente ocorre colocando uma marca no tubo de ultracentrifuga na altura do limite previamente determinada da fracção alvo. A totalidade do volume acima do limite é então separado do volume restante, por exemplo por aspiração. A aspiração pode, por exemplo, ser realizada com uma bomba peristáltica convencional, cujas tubagens e capilares foram previamente e convenientemente esterilizados. Um caudal de bombagem adequado é, por exemplo, um caudal de 2 mL/minuto. Durante a aspiração, deve ter-se cuidado para assegurar que o capilar da bomba peristáltica esteja sempre localizado no 21 ΡΕ2027263 limite superior do liquido. A fracção alvo que permanece no tubo de ultracentrifuqa pode ser então removida do tubo de ultracentrifuqa de um modo conhecido per se com uma pipeta monocanal, preferentemente com uma ponta estéril. Qualquer sedimento eventualmente ainda remanescente no tubo de ultracentrifuqa pode ser removido simultaneamente, por exemplo através da repetida recolha e ressuspensão com a pipeta monocanal.

Se for pretendido levar a cabo um processo para a determinação quantitativa da carga virai da amostra de pancreatina, um passo f) do processo segue o passo e) do processo. No passo f) do processo, a carga virai da amostra de pancreatina é determinada quantitativamente através da determinação da taxa de infecção do vírus na fracção alvo contendo a carga virai. A determinação quantitativa da taxa de infecção do vírus na fracção alvo pode aqui prosseguir de acordo com processo de execução conhecidos per se em virologia, por exemplo, de acordo com o princípio conhecido per se de determinação da taxa de infecção virai (= VITD).

Se for pretendido levar a cabo um processo para a determinação quantitativa da carga virai da amostra de pancreatina, um passo f) do processo segue o passo e) do processo. No passo f) do processo, a carga virai da amostra de pancreatina é determinada quantitativamente através da determinação da taxa de infecção do vírus na fracção alvo contendo a carga virai. A determinação quantitativa da taxa 22 ΡΕ2027263 de infecção do vírus na fracção alvo pode aqui prosseguir de acordo com processo de execução conhecidos per se em virologia, por exemplo, de acordo com o princípio conhecido per se de determinação da taxa de infecção virai (= VITD). A fracçao alvo pode, por exemplo, ser diluída numa razão adequada com um meio de cultura de células adequado de modo a obter uma amostra de teste de determinação de vírus. Meios de cultura adequados são aqueles mencionados acima como podendo ser usados, em cada caso como função da espécie de vírus sob investigação. Numa realização da invenção para eliminar falsos positivos de infecções virais, a fracçao alvo diluída ou não diluída pode ser filtrada através de um microfiltro antes de se levar a cabo a determinação quantitativa da carga virai no passo f) do processo.

Uma diluição adequada pode, por exemplo, ser conseguida através da diluição da fracção alvo com o meio de cultura de células ao volume original do sobrenadante da amostra de teste da pancreatina tal como usado no passo d) do processo. Depois, num primeiro passo, uma série de diluições das amostras de teste da determinação do vírus pode ser primeiramente produzida de um modo conhecido per se, por exemplo, em passos de diluição de 1:2, 1:5 ou 1:10 ou também em combinações destes passos de diluição, de modo a levar a cabo uma VITD quantitativa. Depois, num segundo passo, uma suspensão celular adequada pode ser inoculada de um modo conhecido per se com as amostras de teste de 23 ΡΕ2027263 determinação do vírus de diferentes concentrações da série de diluição, em que se permite a formação de uma camada celular nas amostras de teste de determinação de vírus de diferentes concentrações. Para eliminar falsos positivos de infecção virai que poderiam ser causados pela presença de micróbios tais como micoplasmas ou bactérias inertes, é então qeralmente apropriado filtrar as amostras para determinação virai antes de inoculá-las nas células detectoras. Para tal, uma amostra de teste para determinação virai ou uma amostra de teste para determinação virai diluída pode ser filtrada através de um filtro de tamanho de poro adequado, tal como um microfiltro, por exemplo, um microfiltro de tamanho de poro de 0,1 a 10 ym (estando incluídos os limites da gama; = microfiltração), geralmente um microfiltro de tamanho de poro de 0,1 a 1 ym. O filtrado pode então ser usado como uma amostra de teste para investigações subsequentes. Depois, num terceiro passo, as amostras de teste inoculadas são lidas relativamente aos seus graus de infecção dependendo do modo como a sua infecção é indicada. Quando, por exemplo, se pode usar CPE como indicador da infecção de uma camada de células, lê-se CPE de um modo conhecido per se após aproximadamente 4-7 dias. A titulação (diluição limite) das amostras do teste de determinação virai permite aqui uma determinação quantitativa da dose de infecção originalmente presente. A titulação prossegue convencionalmente através de uma diluição de um factor de 10, isto é, com base no logaritmo de base dez. Na prática, geralmente calcula-se uma dose de infecção de 50% (= ID50) . No caso de lotes múltiplos em - 24 - ΡΕ2027263 paralelo, o valor de ID50 identificado corresponde então àquele da diluição (recíproca) mais elevada da amostra de teste de determinação virai à qual é detectável uma CPA em exactamente metade dos lotes. Os resultados podem ser opcionalmente adicionalmente corrigidos computacionalmente ou interpolados de um modo conhecido per se. Os métodos mais comuns usados para o cálculo do teor virai são aqueles de acordo com Spearman e Kárber (ver Spearman, Br. J. Psychol. 2 (1908) 227-242 e G. Karber, Arch. Exp. Path. Pharmak. 162 (1931) 480-483; também Bundesanzeiger [Gazeta federal] no. 84, 4 de Maio de 1994) ou de acordo com Reed e Muench (ver Reed, L. J., Muench, H. Am. J. Hyg. 2_7 (1938) 493-497) .

Podem também ser utilizados outros indicadores de uma infecção da camada de células, por exemplo a indução de antigénios virais ou a indução de formação de placa. O perito na técnica está familiarizado com estes métodos e as suas aplicações ao presente caso, por exemplo, através de livros de texto de virologia tais como "Medizinische Virologie" de H. W. Doerr e W. H. Gerlich, Georg Thieme Verlag Stuttgart, Nova Iorque, Ia edição 2002 ou em cada caso as suas edições mais recentes.

EXEMPLOS em laboratórios de

Todas as tarefas nos Exemplos seguintes foram levadas a cabo sob condições estéreis numa bancada estéril. Os procedimentos convencionais 25 ΡΕ2027263 virologia, por exemplo os procedimentos de segurança devem ser observados. Foram usados, entre outros, os seguintes materiais: 1. Solução de antibiótico, 1,0 g de sulfato de estreptomicina e 1,2 g de penicilina são dissolvidos em 20 mL de água bidestilada e filtrada através de um filtro de 0,2 ym. Os filtrados são então divididos em aliquotas de 1 mL e opcionalmente armazenados a -20°C até à utilização; 2. Meio de Dulbecco, meio de cultura de células para células SK 6, células SPEV e células MA 104; 3. Pipeta monocanal, com pontas estéreis; 4. FCS, soro fetal bovino da Bio Whittaker (= soro). 5. Frascos de cultura de tecidos, estéreis, a área da base do frasco em cada caso 25, 75 ou 175 cm2; 6. MEM, meio de cultura de células para células PK-15 com 1,5 g/L de bicarbonato de sódio e 1 mM de piruvato; 7. Microplacas, estéreis com 96 poços e tampa; 8. Suspensão PAN, 10% de pancreatina; 1,0 g de pancreatina porcina (excepto se indicado de outro modo) pesada sob condições estéreis para um balção, combinado com 1 mL de solução de antibiótico e (excepto se indicado de outro modo) 8,0 mL do meio de cultura de células particular correspondente e (excepto se indicado de outro modo) suspendida em 60 minutos num banho de gelo com agitação; 9. Tampão de Pardee, tampão de dióxido de carbono de Pardee; 10. PBS, solução de "tampão fosfato salino" estéril (pH 7,2); 11. Pipetas, estéreis; 26 ΡΕ2027263 12. Pontas de pipetas, estéreis em suportes estéreis; 13. Bolsas plásticas, impermeável ao CO2 com fecho ("Anaerocult®" , da Merck); 14. Anticorpos policlonais anti-PPV, conjugado do isotiocianato de fluoresceina (= FITC), da NatuTec GmbH; 15. Tubos, estéril 15 e 50 mL; 16. Solução de sacarose, 20%, PBS tamponizado, estéril; a concentração é ajustada de um modo conhecido per se com o auxilio de um refractómetro convencional; 17. Soluções de sacarose, 50%, PBS tamponizado, estéril; a concentração é ajustada de um modo conhecido per se com o auxilio de um refractómetro convencional; 18. Tubos com tampa de rosca, estéril; 19. Solução de tripsina, "TrypL Express®", da INVITROGEN; 20. Bomba peristáltica, da "IsmaTec", caudal de bombagem até 5,8 mL/minuto; 21. Ultracentrifuga refrigerada, "Sorvall® Pro 80" com o rotor "TH-641"; 22. Tubos de ultracentrifuga, estéril, capacidade de 11 mL, dimensões 9 x 90 mm 23. Blocos de diluição, 96 poços, cada um de 1,0 mL; 24. Células MA-104: fornecido por FLI; 25. Células PK-15: fornecido por DARD; 26. Células SK-6: fornecido por FLI; 27. Células SPEV: fornecido por FLI; 28. Suspensões de células das células SK 6, SPEV e PK-15 a serem testadas com 200000 células/mL em meios de culturas de células com 10% de FCS;

29. Microtubos Falcon estéreis, capacidade de 15 mL 27 ΡΕ2027263

Exemplo 1: Investigação do efeito prejudicial da pancreatina em várias linhas celulares

Para o fim de detecção de vírus em amostras de material de teste utilizando culturas de células, o efeito prejudicial da amostra de pancreatina a ser investigada em células deverá ser determinado de modo a possibilitar a exclusão de resultados falsos negativos quando se avaliam CPEs. Como referido abaixo, investigações para determinar o efeito prejudicial de uma suspensão de amostra de teste de pancreatina foram deste modo levadas a cabo em várias linhas celulares.

Porções de 0,5 mL de uma suspensão PAN produzida como acima foram tomadas para testar o efeito prejudicial e designadas "amostra de teste de suspensão de pancreatina".

Centrifugação a baixa velocidade: A suspensão PAN remanescente foi centrifugada durante 15 minutos a 4000 rpm (2700 x g) e 4°C numa centrífuga refrigerada convencional (Megafuge® 1.0R, Heraeus SEPATECH® com um rotor de oscilação livre no. 2704). O sobrenadante após centrifugação a baixa velocidade foi então centrifugado durante mais 15 minutos a 4000 rpm e 4°C e, designado "sobrenadante após centrifugação a baixa velocidade", utilizado para titulação virai e ultracentrifugação. Os dois sedimentos obtidos em cada caso após as centrifugações a baixa velocidade foram combinados (em conjunto 1 mL) , ressuspendidos em 9 mL do 28 ΡΕ2027263 meio de cultura respectivamente adequado e designados "sedimento".

Ultracentrifugação: tomaram-se 5,0 mL da amostra de teste "sobrenadante após centrifugação a baixa velocidade" e submeteram-se a ultracentrifugação numa ultracentrífuga. Com este fim, introduziu-se 0,5 mL de uma solução de sacarose a 50% por intermédio de uma pipeta no número de tubos de ultracentrifuga necessário para levar a cabo o teste. Com o tubo de ultracentrifuga mantido num ângulo obliquo, esta camada foi cuidadosamente sobreposta com 4,5 mL de uma solução de sacarose a 20%, sendo discernivel uma camada de separação entre as duas soluções. Foi então colocada uma camada de 5,0 mL da amostra de teste do "sobrenadante após centrifugação a baixa velocidade" tomada como referido acima, de novo com cuidado e evitando turbulência e mistura, na solução de sacarose a 20%. Os tubos de ultracentrifuga foram então suspendidos no rotor de ultracentrifuga. Com este fim, os dois tubos de ultracentrifuga em posições opostas do rotor foram em cada caso contrabalançados com PBS, inseridos nos suportes correspondentes, e bem fechados com a tampa associada. Uma vez inseridos os suportes no rotor, as amostras de teste foram centrifugadas durante 4 horas a 10°C e 40000 rpm (237,799 x g) . Após a ultracentrifugação, os tubos de ultracentrifuga foram removidos dos suportes na bancada estéril e proporcionados com uma marca a uma altura de 1,5 cm, medida desde o fundo do tubo de ultracentrifuga. Utilizando uma bomba peristáltica, cujas tubagens e 29 ΡΕ2027263 capilares foram previamente esterilizados, o liquido acima da marca foi aspirado do tubo de ultracentrifuga a um caudal de 2 mL/min, sendo o capilar sempre localizado no limite superior do liquido. Esta primeira fracção obtida deste modo foi designada "fracção superior após centrifugação". A "fracção inferior após centrifugação" remanescente (1,5 mL) no tubo de ultracentrifuga foi em cada caso removida do tubo de ultracentrifuga com o auxílio de uma pipeta monocanal. Qualquer sedimento eventualmente remanescente no fundo do tubo de ultracentrifuga foi ressuspendido através da recolha repetida com uma pipeta monocanal e removido do mesmo modo. A "fracção inferior após ultracentrifugação" foi ajustada a 5,0 mL, correspondendo ao volume da amostra de teste contendo vírus originalmente utilizada, num tubo graduado estéril com um meio de cultura celular respectivamente adequado. Até processamento suplementar, as duas fracções resultantes foram armazenadas a 4°C ou, no caso de armazenamento prolongado, a -20°C.

As amostras de teste "amostra de teste de suspensão de pancreatina", "sobrenadante após centrifugação a baixa velocidade", "sedimento" (após centrifugação de baixa velocidade), "fracção superior após ultracentrifugação" e "fracção inferior após ultracentrifugação" (após se ajustar a 5,0 mL) foram então testadas relativamente ao seu efeito prejudicial relativamente a várias linhas celulares. Para tal, foram produzidas em cada caso diluições em série das amostras de teste a serem testadas. 30 ΡΕ2027263

Todas as amostras em teste a serem testadas foram ainda diluídas por um factor de 2 a partir de uma diluição de 1:5 com o meio de cultura celular respectivamente adequado. Em microplacas, foram adicionadas a porções de 100 pL de suspensão celular compreendendo células PK-15, SPEV ou SK 6 por poço em 8 réplicas, 100 pL das diluições da amostra de teste produzidas a em cada caso 100 pL de suspensão celular produzida de fresco. Quando se testaram células MA 104, foram usadas as microplacas com uma camada de células com 24 horas de idade. Para tal, o meio de cultura celular foi em cada caso removido dos poços e substituído com 100 pL de meio de cultura fresco sem soro, para originar as diluições das amostras de teste finais de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, etc. Como controlo, introduziu-se 100 pL de meio de cultura celular em oito poços de cada microplaca em vez de 100 pL da diluição em série. Colocaram-se pares de placas em conjunto com um tubo contendo 4 mL de tampão de Pardee e papel de filtro em bolsas herméticas e seladas com um clip de selagem. As placas foram então incubadas a 30±1°C durante até 7 dias. Ao longo do período de incubação, as placas foram inspeccionadas diariamente com um microscópio durante a duração de CPE, isto é, para detecção de lise celular e/ou degeneração das células e a ausência de formação de uma camada celular como resultado do efeito prejudicial da pancreatina. A avaliação final foi levada a cabo após sete dias. A titulação foi repetida se a degeneração celular tivesse já ocorrido nos controlos na leitura final. 31 ΡΕ2027263 A Tabela 1 apresenta os resultados do teste de diferentes amostras de teste relativamente ao seu efeito prejudicial em relação a várias linhas celulares. Se uma amostra de teste foi prejudicial até à diluição final de por exemplo 1:640, mas deixou de ser prejudicial a uma diluição de 1:1280, então o resultado apresentado para esta amostra na Tabela é "amostra de teste prejudicial ^ 1:640, mas < 1:1280".

Tabela 1: Resultados de teste de suspensões de pancreatina e suas sub-fracções para o seu carácter prejudicial em relação a várias linhas celulares

Linhas celulares PK-15 MA-104 SK 6 SPEV Amostras de teste Amostras de teste prejudiciais até uma diluição de: Amostra de teste de > 1:640 > 1:160 > 1:320 > 1:320 suspensão de pancreatina < 1:1280 < 1:320 < 1:640 < 1:640 Sobrenadante após > 1:640 > 1:160 > 1:320 > 1:320 centrifugação a baixa velocidade < 1:1280 < 1:320 < 1:640 < 1:640 Sedimento > 1:160 > 1:80 > 1:80 > 1:40 < 1:320 < 1:160 < 1:160 < 1:80 Fracção superior após > 1:320 > 1:160 > 1:320 > 1:320 ultracentrifugação < 1:640 < 1:320 < 1:640 < 1:640 Fracção inferior após > 1:40 > 1:20 > 1:20 > 1:20 ultracentrifugação < 1:80 < 1:40 < 1:40 < 1:40 32 ΡΕ2027263 É evidente dos resultados apresentados na Tabela 1 que, na "fracção inferior após ultracentrifugação", que foi submetida a um passo de ultracentrifugação de acordo com a invenção e na qual a carga virai foi concentrada, existe uma redução considerável do efeito prejudicial relativamente às linhas celulares investigadas em comparação com todas as outras amostras de teste investigadas.

Se o efeito prejudicial da amostra de teste da suspensão de pancreatina não tratada for comparado com aquele das fracções inferiores após ultracentrifugação, foi possível no teste acima descrito para células MA-104 reduzir o efeito prejudicial num factor de 8, e num factor de 16 no caso das três outras células testadas. 0 sobrenadante foi ainda ligeiramente turvo após se submeter a amostra de teste da suspensão de pancreatina duas vezes a centrifugação de baixa velocidade. Durante a ultracentrifugação, estas partículas insolúveis sedimentam na forma de um depósito fino no fundo do tubo de ultracentrífuga. 0 depósito foi também ressuspendido e foi um constituinte da "fracção inferior após ultracentrifugação". Pode ser assim assumido que este depósito contribui para o efeito prejudicial residual da "fracção inferior após ultracentrifugação" e que o seu efeito prejudicial residual pode ser ainda mais reduzido através da separação e não mais ressuspender o depósito acima mencionado. 33 ΡΕ2027263

Exemplo 2: Investigação das amostras de pancreatina com adição de um teor virai elevado 0 objectivo das investigações das amostras de pancreatina com adição de um teor virai elevado (: "testes de administração elevada") foi, entre outros, mostrar que o processo de acordo com a invenção é adequado para a separação quantitativa da carga virai da amostra de pancreatina e dos seus constituintes que pode ser prejudicial para células vivas. Para tal, prepararam-se "preparações com adição de vírus" de cada um dos virus a serem investigados de modos conhecidos. "Elevado teor" deveria aqui em particular (como função da espécie de virus utilizada) em cada caso ser tomado como significando um teor da preparação com administração de virus de pelo menos 4 passos do logaritmo de base dez (= log) de metade da "Dose Infecciosa de Cultura de Tecidos" por mL da amostra de teste investigada (= TCID5o/mL) . As preparações com adição de elevado teor de PCV podem, por exemplo, ser obtidas de acordo com o método de I. Tischer et al., Arch. Virol. 96 (1987) 39-57, através do pré-tratamento das células PK-15 usadas para cultura com solução de D-(+)-glucosamina. a. Teste de administração elevada de EMCV (estirpe LC 75)

Adicionou-se 0,75 mL de uma preparação virai com 34 ΡΕ2027263 adição de elevado teor (7,7010,10 log TCID50/inL) de EMCV (estirpe LC 75) e 0,75 mL de solução de antibiótico a uma suspensão PAN (produzida por adição de 4,5 mL de meio Dulbecco a 0,75 g de pancreatina e 50 minutos de agitação com arrefecimento com gelo) e a suspensão resultante foi agitada durante mais 10 minutos. Recolheu-se 0,5 mL desta suspensão para titulação virai e armazenou-se a 4°C até titulação (= "fracção elevada 1 de EMCV"). A suspensão remanescente foi centrifugada durante 15 minutos a 4000 rpm (= 2700 x g) e 4°C. O sobrenadante após a centrifugação foi de novo centrifugado num novo tubo de centrífuga durante 15 minutos a 4°C e 4000 rpm. O sobrenadante após a segunda centrifugação foi transferido quantitativamente para um tubo estéril (= "fracção elevada 2 de EMCV") . Os dois sedimentos após centrifugação a baixa velocidade foram ressuspendidos com um total de 6,5 mL de meio de Dulbecco, combinados e de novo centrifugados durante 15 minutos a 4000 rpm e 4°C. O sobrenadante resultante foi transferido para um tubo estéril. A lavagem do sedimento foi repetida mais duas vezes, cada vez com uma porção de 6,5 mL de meio de Dulbecco fresco. As três soluções de lavagem foram combinadas e utilizadas para a titulação virai (= "fracção elevada 3 de EMCV") . Após três lavagens, o sedimento foi ressuspendido em 6,5 mL de meio de Dulbecco e depois titulado (= "fracção elevada 4 de EMCV").

Submeteu-se 5,0 mL de fracção elevada 2 de EMCV a 35 ΡΕ2027263 uma ultracentrifugação no gradiente de sacarose descontínuo tal como descrito acima no Exemplo 1. Após ultracentrifugação, as fracções superior (= "fracção elevada 5 de EMCV") e inferior (= "fracção elevada 6 de EMCV") foram obtidas de forma separada e tituladas.

As séries de diluição virai por um factor de 3 foram produzidas e transferidas cada uma com 12 passos de diluição em 12 réplicas para microplacas com suspensão de células SPEV. A titulação da adição de vírus - titulação de diluição IO'3; fracção elevada 1 de EMCV - titulação da diluição IO'2; fracção elevada 2 de EMCV - titulação da diluição IO"2; fracção elevada 4 de EMCV - titulação da diluição IO"1; fracção elevada 3 de EMCV - titulação da diluição IO-2; fracção elevada 5 de EMCV - titulação da amostra de teste não diluída; fracção elevada 6 de EMCV -titulação em triplicado da diluição 10“3.

As microplacas foram incubadas a 36±1°C numa atmosfera de aprox. 5% de CO2 e, ao longo de 6-7 dias, avaliadas microscopicamente relativamente ao desenvolvimento de CPE nos poços. 0 título é calculado nas amostras de teste de acordo com o método de Spearman-Kãrber. Os resultados do teste de adição elevada com EMCV são apresentados na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2: Resultados dos testes de adições elevadas com EMCV em suspensões de pancreatina 36 ΡΕ2027263

Amostra de teste Teor log TCIDso/mL11 Volume da mostra de teste [iriL] Carga virai [log TCIDso/mL + log volume]2) Adição de virus (EMCV) 7,70±0,10 0,75 7,58+0,20 Fracção elevada 1 de EMCV 7,14±0,10 7,5 8,02+0,20 Fracção elevada 2 de EMCV 7,38±0,09 5 8,08+0,18 Fracção elevada 4 de EMCV 3,32±0,08 7,5 4,20+0,16 Fracção elevada 3 de EMCV 5,67±0,10 19,5 6,96+0,20 Fracção elevada 5 de EMCV 4,71±0,10 8,5 5,64+0,20 Fracção elevada 6 de EMCV (1) 6,99+0,11 5 7,69+0,22 Fracção elevada 6 de EMCV (2) 7,07+0,10 5 7,77+0,20 Fracção elevada 6 de EMCV (3) 6,99+0,10 5 7,69+0,20 Média das 3 fracções para a fracção elevada 6 de EMCV3) 7, 02+0, 053) 5 7,72+0,10 υ 0 valor é o desvio padrão da titulação individual; 2) 0 valor é o intervalo com 95% de confiança; 3 0 valor é o desvio padrão de 3 determinações É evidente da Tabela 2 que, quando o processo de acordo com a invenção é levado a cabo, a carga virai das amostras de teste de adição não tratada (fracções elevadas 1 e 2 de EMCV) , tendo em conta uma gama de variação geralmente aceite de 0,5 passos log, foi pelo menos aproxi-madamente quantitativamente recuperada na fracção inferior após a ultracentrifugação (fracção elevada 6 de EMCV). Pode além disso ser concluído dos resultados do teste que a 37 ΡΕ2027263 própria amostra de pancreatina não apresentava qualquer acção de inibição ou de inactivação no EMCV. b. Teste de adição elevada com parvovirus porcino 0 parvovirus porcino (PPV) pode ser cultivado em células SK 6 em crescimento. Se o rendimento do virus for demasiado baixo, o virus é concentrado após cultivo.

Adicionou-se 1,0 mL de uma preparação de virus PPV inoculada com um elevado teor (4,75±0,06 log TCID5o/mL) a uma suspensão PAN (produzida pela adição de 7,0 mL de meio de Dulbecco e 50 minutos de agitação com arrefecimento com gelo) e a suspensão resultante foi agitada durante mais 10 minutos. Recolheu-se 0,5 mL desta suspensão para titulação virai e armazenou-se a 4°C até à titulação (= "fracção elevada 1 de PPV"). A suspensão remanescente foi centrifugada durante 15 minutos a 4000 rpm (= 2700 x g) e 4°C. O sobrenadante após a centrifugação foi de novo centrifugado num novo tubo de centrífuga durante 15 minutos a 4°C e 4000 rpm. O sobrenadante após a segunda centrifugação foi transferido quantitativamente para um tubo estéril (= "fracção elevada 2 de PPV"). Os dois sedimentos após centrifugação a baixa velocidade foram ressuspendidos com um total de 9 mL de meio de Dulbecco, combinados e de novo centrifugados durante 15 minutos a 4000 rpm e 4°C. O sobrenadante resultante foi transferido para um tubo estéril. A lavagem do sedimento foi repetida mais duas vezes, cada vez com uma porção de 9 mL de meio de 38 ΡΕ2027263

Dulbecco fresco. As três soluções de lavagem foram combinadas e utilizadas para a titulação virai (= "fracção elevada 3 de PPV") . Após três lavagens, o sedimento foi ressuspendido em 9 mL de meio de Dulbecco e depois titulado (= "fracção elevada 4 de PPV").

Submeteu-se 5,0 mL de fracção elevada 2 de PPV a uma ultracentrifugação no gradiente de sacarose descontinuo tal como descrito acima no Exemplo 1. Após ultracentrifugação, as fracções superior (= "fracção elevada 5 de PPV") e inferior (= "fracção elevada 6 de PPV") foram obtidas de forma separada e tituladas.

As séries de diluição virai por um factor de 3 foram produzidas e transferidas cada uma com 12 passos de diluição em 12 réplicas para microplacas com suspensão de células SK 6. As microplacas foram incubadas a 36±1°C numa atmosfera de aprox. 5% de CO2 e, ao longo de 6-7 dias, avaliadas microscopicamente relativamente ao desenvolvimento de CPE nos poços. Após este período de incubação, as placas foram fixadas através da adição de uma mistura de acetona/metanol gelada e os poços com CPE incerta foram incubados para a determinação final do título com anticorpo anti-PPV marcado com FITC e depois avaliados sob um microscópio de luz UV. O título é calculado nas amostras de teste de acordo com o método de Spearman-Kãrber.

Tabela 3: Resultados dos testes de adições elevadas com PPV em suspensões de pancreatina 39 ΡΕ2027263

Amostra de teste Teor log TCIDso/mL1’ Volume da mostra de teste [mL] Carga virai [log TCIDso/mL + log volume]2) Adição de vírus (PPV) 4,9510,15 1 4,9510,30 Fracção elevada 1 de PPV 3,56±0,08 10 4,5610,16 Fracção elevada 2 de PPV 4,47±0,08 5 5,1710,16 Fracção elevada 4 de PPV 2,0810,11 10 3,0810,22 Fracção elevada 3 de PPV 2,3810,09 27 3,8110,18 Fracção elevada 5 de PPV < 3,15 LO OO < 4,08 Fracção elevada 6 de PPV (1) 4,6710 5 5,3710 Fracção elevada 6 de PPV (2) 4,4310,08 5 5,1310,16 Fracção elevada 6 de PPV (3) 4,4710,08 5 5,1710,16 Média das 3 fracções para a fracção elevada 6 de PPV3) 4,5610, 133) 5 5,2210,26 1] 0 valor é o desvio padrão da titulação individual; 0 valor é o intervalo com 95% de confiança; 3 0 padrão de 3 determinações valor é o desvio 40 ΡΕ2027263 É evidente da Tabela 3 que, tal como ilustrado acima na experiência de administração de um elevado teor de EMCV, se o processo de acordo com a invenção é implementado com sucesso, a carga virai das amostras de teste de administradas com virus não tratadas (fracções elevadas 1 e 2 de PPV), tendo em conta uma gama de variação geralmente aceite de 0,5 passos log, é pelo menos aproximadamente quantitativamente recuperada na fracção inferior após a ultracentrifugação (fracção elevada 6 de PPV). Na fracção elevada 1 de PPV, isto é, na presença de substâncias insolúveis, é determinado um titulo inferior num passo log do que na fracção elevada 2 de PPV. A presença de constituintes insolúveis parece deste modo perturbar a titulação. Pode além disso ser concluído dos resultados do teste que a própria amostra de pancreatina não apresentava qualquer acção de inibição ou de inactivação no PPV.

Exemplo 2: Investigação de amostras de pancreatina com adição de um baixo teor de vírus O objectivo das investigações das amostras de pancreatina com adição de teores de vírus decrescentes (= "testes de adição baixa") foi entre outros determinar o limite de detecção do processo de acordo com a invenção para o vírus utilizado em cada caso. A detecção quantitativa da carga virai nas amostras de teste individuais com um teor de vírus decrescente terá sucesso se o teor virai da preparação original adicionada contendo o vírus, tendo em conta uma gama de variação geralmente 41 ΡΕ2027263 aceite de passos de 0,5 log, é pelo menos aproximadamente quantitativamente recolhida nas fracções inferiores após ultracentrifugação.

a. Teste de baixo pico com EMCV

Produziu-se uma suspensão PAN (com 2,5 g de pancreatina porcina, 2,5 mL de solução de antibiótico, 20 mL de meio de Dulbecco) . O teste de baixo pico foi então levado a cabo em duplicado em testes mutuamente independentes:

No primeiro teste, os lotes mencionados abaixo foram produzidos a partir de suspensão PAN mais da solução de pico de virus EMCV: LO \—1 mL de suspensão de pancreatina + LO O mL de uma diluição a 10' ”3 de pico de virus; diluição resultante de 10 4; 2) 4,5 mL de suspensão de pancreatina + 0,5 mL de uma diluição a 10' "4 de pico de virus; diluição resultante de 10 5; 3) 4,5 mL de suspensão de pancreatina + 0,5 mL de uma diluição a 10"5 de pico de virus ; etc. 4) 4,5 mL de suspensão de pancreatina + 0,5 mL de uma diluição a IO-6 de pico de virus r 5) 4,5 mL de suspensão de pancreatina + 0,5 mL de uma diluição a 10"7 de pico de virus r 6) 4,5 mL de suspensão de pancreatina + 0,5 mL de uma diluição a 10"8 de pico de virus φ 42 ΡΕ2027263

Todos os lotes foram incubados durante 1 hora à temperatura ambiente e depois submetidos a uma centrifugação a baixa velocidade durante 15 minutos a 4°C e 4000 rpm (2700 x g) . Os sobrenadantes após a centrifugação a baixa velocidade foram em cada caso transferidos para tubos de centrífuga novos e submetidos a outra centrifugação de baixa velocidade sob as mesmas condições. Os sobrenadantes após as centrifugações de baixa velocidade foram, se necessário, ajustados a um volume de 5,0 mL com meio de cultura celular e em cada caso 5,0 mL dos sobrenadantes após centrifugações de baixa velocidade foram submetidos a ultracentrifugação no gradiente de sacarose descontínuo tal como descrito acima no Exemplo 1. Após a ultracentrifugação, as fracções superiores (= "fracção baixa 2 de EMCV"; até 1,5 cm do topo do tubo de ultracentrífuga) foram em cada caso removidos por bombagem com uma bomba peristáltica e as respectivas fracções inferiores (= "fracção baixa 3 de EMCV") foram removidas do tubo de ultracentrífuga com uma pipeta. As fracções inferiores após ultracentrifugação foram em cada caso ajustadas a 5,0 mL com MEM e depois usadas para as titulações ou cultura em frascos de cultura de tecidos. Séries de diluição virai por um factor de 3 foram então produzidas a partir de cada um dos lotes 1) a 3) acima referidos e cada um transferido com 12 passos de diluição em 12 réplicas em microplacas com suspensão de células SPEV (porção de 100 yL por poço de suspensão 43 ΡΕ2027263 celular de células SPEV preparadas de fresco com 200000 células/mL). As amostras de teste da fracção baixa 3 de EMCV de todos os lotes foram adicionalmente transferidos para frascos de cultura celular com uma área de base de 25 cm2 e porções de 10 mL de suspensão celular de células SPEV preparadas de fresco com 200000 células/mL. Para tal, infectaram-se 6 frascos de cultura de tecidos para cada amostra de teste com uma porção de 0,2 mL da amostra de teste da fracção baixa 3 de EMCV. Em paralelo, proporcionou-se um controlo por um frasco de cultura de tecidos sem qualquer adição. A totalidade das placas de titulação e dos frascos de cultura de tecidos foram incubados a 36±1°C e, ao longo de 6-7 dias, avaliados por microscopia relativamente ao desenvolvimento de CPE em poços ou frascos de cultura de tecidos. O titulo é calculado nas amostras de teste tituladas de acordo com o método de Spearman-Kãrber.

Se não se observou CPE em nenhum dos 6 frascos de cultura de tecidos de um lote ao fim de 7 dias, estes frascos foram congelados a -70°C por três vezes e de novo descongelados. O conteúdo de todos os frascos de cultura de tecidos foram combinados e filtrados através de um filtro de 0,1 ym (tamanho de poro) . 0 filtrado resultante foi usado para preparar uma segunda passagem na suspensão celular SPEV: infectaram-se 2 frascos de culturas de tecidos cada um compreendendo 10 mL de suspensão de células de SPEV fresca com 2 mL da suspensão obtidas da Ia passagem e igualmente incubados durante até 7 dias a 36±1°C e 44 ΡΕ2027263 observados relativamente ao desenvolvimento de CPE. Se não se observou CPE também na 2a passagem, foi adicionalmente levada a cabo uma 3a passagem. Se for também encontrado um resultado negativo na 3a passagem, a amostra de teste original pode ser considerada como livre de EMCV.

Um limite de detecção do processo de acordo com a invenção de uma unidade infecciosa de EMCV por 0,1 g de amostra de pancreatina usada foi determinado nos testes acima referidos de baixo pico com diluições graduadas de EMCV.

b. Teste de baixo pico com PPV

Produziu-se uma suspensão PAN (com 2,5 g de pancreatina porcina, 2,5 mL de solução de antibiótico, 20 mL de meio de Dulbecco) . O teste de baixo pico foi então levado a cabo em duplicado em testes mutuamente independentes:

Para tal, os lotes mencionados abaixo foram produzidos a partir de suspensão PAN mais da solução de pico de virus PPV: 45 ΡΕ2027263 4) 4,5 mL de suspensão de pancreatina + 0,5 mL de uma diluição a 10“4 de pico de vírus;

Todos os lotes foram incubados durante 1 hora à temperatura ambiente e depois submetidos a uma centrifugação a baixa velocidade durante 15 minutos a 4°C e 4000 rpm (2700 x g) . Os sobrenadantes após a centrifugação a baixa velocidade foram em cada caso transferidos para tubos de centrífuga novos e submetidos a outra centrifugação de baixa velocidade sob as mesmas condições. Os sobrenadantes após as centrifugações de baixa velocidade foram, se necessário, ajustados a um volume de 5,0 mL com meio de cultura celular e em cada caso 5,0 mL dos sobrenadantes após centrifugações de baixa velocidade foram submetidos a ultracentrifugação no gradiente de sacarose descontinuo tal como descrito acima no Exemplo 1. Após a ultracentrifugação, as fracções superiores (= "fracção baixa 2 de PPV"; até 1,5 cm do topo do tubo de ultracentrifuga) foram em cada caso removidos por bombagem com uma bomba peristáltica e as respectivas fracções inferiores (= "fracção baixa 3 de PPV") foram removidas do tubo de ultracentrifuga com uma pipeta. As fracções inferiores após ultracentrifugação foram em cada caso ajustadas a 5,0 mL com meio de Dulbecco e depois usadas para as titulações ou cultura em frascos de cultura de tecidos. Séries de diluição virai por um factor de 3 foram então produzidas a partir de cada um dos lotes 1) a 3) acima referidos e cada um transferido com 12 passos de 46 ΡΕ2027263 diluição em 8 réplicas em microplacas com suspensão de células SK-6 (porção de 100 yL por poço de suspensão celular de células SK-β preparadas de fresco com 200000 células/mL).

Infectaram-se 6 frascos de cultura de tecidos para cada amostra de teste com uma porção de 0,2 mL da amostra de teste da fracção baixa 3 de PPV. Em paralelo, proporcionou-se um controlo por um frasco de cultura de tecidos sem qualquer adição. A totalidade das placas de titulação e dos frascos de cultura de tecidos foram incubados a 36±1°C e, ao longo de 6-7 dias, avaliados por microscopia relativamente ao desenvolvimento de CPE em poços ou frascos de cultura de tecidos. O titulo é calculado nas amostras de teste tituladas de acordo com o método de Spearman-Kãrber.

Se não se observou CPE em nenhum dos 6 frascos de cultura de tecidos de um lote ao fim de 7 dias, estes frascos foram congelados a -70°C por três vezes e de novo descongelados. O conteúdo de todos os frascos de cultura de tecidos foram combinados e filtrados através de um filtro de 0,1 ym (tamanho de poro). O filtrado resultante foi usado para preparar uma segunda passagem na suspensão celular SK-β: infectaram-se 2 frascos de culturas de tecidos cada um compreendendo 10 mL de suspensão de células de SK-6 fresca com 2 mL da suspensão obtidas da Ia passagem e igualmente incubados durante até 7 dias a 36±1°C e observados relativamente ao desenvolvimento de CPE. Se não 47 ΡΕ2027263 se observou CPE também na 2a passagem, foi adicionalmente levada a cabo uma 3a passagem. Se também não se observou CPE também na 3a passagem, o meio de cultura celular foi removido dos frascos da 3a passagem após 7 dias e a camada celular foi fixada com acetona/metanol (80:20 vol/vol) gelada. As células infectadas foram então detectadas nos frascos de cultura de tecido por intermédio de anticorpo anti-PPV marcado com FITC (com 1 mL de solução de anticorpo por frasco; incubação durante 60 minutos a 37°C, lavagem com tampão de lavagem e subsequente avaliação por microscópio sob luz UV) . Se os frascos da 3a passagem estavam livres de células infectadas, a amostra de teste original pode ser considerada como livre de PPV.

Um limite de detecção do processo de acordo com a invenção de uma unidade infecciosa de PPV por 0,1 g de amostra de pancreatina usada foi determinado nos testes acima referidos de baixo pico com diluições graduadas de PPV.

Lisboa, 5 de Setembro de 2012

Claims (8)

1. ΡΕ2027263 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para a separação da carga virai para uma amostra de pancreatina, compreendendo os passos processuais de: a) produzir uma amostra de teste de pancreatina liquida adequada para centrifugação a partir da amostra de pancreatina sem com tal alterar a sua carga virai, b) submeter pelo menos uma parte definida da amostra de teste de pancreatina a partir do passo a) do processo a pelo menos uma centrifugação em baixa velocidade sob condições, sob as quais os virus com constantes de sedimentação de > 120 S não formam ainda um sedimento, c) descartar qualquer depósito sólido opcionalmente proveniente no passo b) do processo durante uma centrifugação de baixa velocidade e reter um sobrenadante com a amostra de teste de pancreatina, d) submeter pelo menos uma parte definida do sobrenadante com a amostra de teste de pancreatina obtido no passo c) do processo a uma ultracentrifugação num meio com gradiente descontinuo durante pelo menos 1 hora, em que a força centrífuga relativa é pelo menos 100000 x g, e e) separar quantitativamente a fracção alvo contendo a carga virai do sobrenadante com a amostra de teste de pancreatina. 2 ΡΕ2027263 2. 0 processo reivindicado na reivindicação 1, em que adicionalmente num passo suplementar f) do processo, após o passo e) do processo, leva-se a cabo uma determinação quantitativa da carga virai da amostra de pan-creatina é levada a cabo através da determinação do titulo de infecção virai na fracção alvo contendo a carga virai. 3. 0 processo tal como reivindicado na reivindicação 2, no qual a fracção alvo diluida ou não diluida é filtrada através de um microfiltro antes de se levar a cabo a determinação quantitativa da carga virai. 4. 0 processo tal como reivindicado na reivindicação 1, em que o passo a) do processo da amostra de teste da pancreatina é produzido como uma suspensão de amostra de teste de pancreatina através da combinação da amostra de pancreatina com um meio de cultura celular que é adequada para a linha celular para cultivar o tipo de virus a ser investigado e com um ou mais antibióticos. 5. 0 processo tal como reivindicado na reivindicação 4, no qual a produção da suspensão de amostra de teste de pancreatina processa-se com arrefecimento a uma temperatura de 0-15°C. 6. 0 processo tal como reivindicado na reivindicação 1, no qual as centrifugações de baixa velocidade no passo b) do processo são em cada caso levadas a cabo com uma força centrífuga de menos de 10000 x g. 3 ΡΕ2027263 7. 0 processo tal como reivindicado na reivindicação 1, no qual as centrifugações de baixa velocidade no passo b) do processo são em cada caso levadas a cabo com uma força centrífuga de menos de 1500-5000 x g.
2. 8. O processo tal como reivindicado na reivindicação 1, no qual as centrifugações de baixa velocidade no passo b) do processo são levadas a cabo durante pelo menos 5 minutos.
3. 9. O processo tal como reivindicado na reivindicação 8, no qual a ultracentrifugação no passo d) do processo é levada a cabo durante 2-8 horas e a força centrífuga relativa é 200000-300000 x g.
4. 10. O processo tal como reivindicado na reivindicação 1, no qual as centrifugações de baixa velocidade no passo b) do processo e a ultracentrifugação no passo d) do processo é em cada caso levado a cabo com arrefecimento a uma temperatura de 0-15°C.
5. 11. O processo tal como reivindicado na reivindicação 1, no qual o meio gradiente descontinuo introduzido no passo d) do processo num gradiente de sacarose descontinuo de duas fases.
6. 12. O processo tal como reivindicado na reivindicação 11, em que o meio de gradiente descontínuo é um 4 ΡΕ2027263 gradiente preparado a partir de uma solução tamponizada de sacarose a 50% (peso/vol.) e uma solução tamponizada de sacarose a 20% (peso/vol.).
7. 13. Um processo tal como reivindicado na reivindicação 1, em que a amostra de pancreatina é uma amostra de pancreatina porcina.
8. 14. O processo tal como reivindicado na reivindicação 1, em que a carga virai da amostra de teste da pancreatina compreende o rotavirus bovino A, o virus da encefalomiocardite, o circovirus porcino, o parvovirus porcino, o rotavirus porcino A, o tescovirus porcino e/ou o virus da doença vesicular suina. Lisboa, 5 de Setembro de 2012 1 ΡΕ2027263 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição * EP 0115023 A * JP128B8S8QB Literatura que não é de patentes citada na Descrição LEBQWITZ st ai, Modero ansiytei uÉ»eenftifaga-tk»» In proteto Science: A tutorfei . ftoásô? Sd- OT, 2002, VOi. 11,2067-2079 C, SPEARMAM. Sr. J. P&ychti,. 1908, vá. 2, 227-242 G. MÀRBER. Araft. Βφ.. Psíti. PhsmaK., 1931, yoi 162, 480-4S3 REED, L,J.; fSSUEfiGH, H. Am. J. Myg1938, voí. 27, 483-497 H.W. DOE RR: W.H. SERLiCH, Môdta^sche Viros- ogíe. Seorg Tftseroe Verisg, 2002 {."tíSCHER et ai. Ardi. W, 1987, voi, 86, 38-57