PT1979474E - Transcriptase inversa da telomerase aviária - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

TRANSCRIPTASE INVERSA DA TELOMERASE AVIÁRIA 0 presente invento refere-se notavelmente a novas transcriptases inversas da telomerase recombinantes, a moléculas de ácidos nucleicos que as codificam, a células compreendendo as ditas moléculas de ácidos nucleicos e ao uso das células para a produção de substância de interesse.

Em 1965 L. Hayflick descobriu que as células têm um momento programado de morte. Como uma explicação para o envelhecimento, ele sugeriu que o número de vezes que uma célula humana se pode dividir seja limitado (Exp Cell Res. 1965 Mar; 37: 614-36). Tal é conhecido por ser causado pelo encurtamento de telómeros à medida que a célula se divide. Os cromossomas são nivelados por telómeros que consistem em sequência de ADN hexamérico, conservado, com repetições em tandem, não-codificante associados a proteínas de ligação de cadeia simples e dupla. Os telómeros são responsáveis por funções de estabilidade do genoma e em particular replicação do terminal do cromossoma. A replicação da extremidade do cromossoma com sucesso requer tanto a estrutura do telómero única e a enzima especializada transcriptase inversa da telomerase, que é uma nucleoproteína que tem uma actividade enzimática de transcriptase inversa. A transcriptase inversa da telomerase é capaz de alongar o vector de repetição do telómero, permitindo replicação estendida da cadeia filha complementar. Nas células a que falta a transcriptase inversa da telomerase, o ADN telomérico encurta em sucessivas divisões pois as enzimas de síntese de ADN são incapazes de replicar completamente a extremidade dos cromossomas assim que o iniciador de ARN é removido. Numerosos trabalhos reportaram a evidência que o designado "relógio de telómero" 1 é uma característica importante do período de vida da célula humana. A hipótese do telómero do envelhecimento celular propõe que a redução do telómero está relacionada com uma falta de actividade da transcriptase inversa da telomerase durante e desencadeia instabilidade cromossómica, conduzindo, a senescência, apoptose. A actividade da transcriptase inversa da telomerase apresenta regulação negativa em linhagens de células somáticas durante o desenvolvimento in vivo e em células primárias in vitro correlacionando com o encurtamento do telómero. Ao contrário, a regulação positiva ou desregulação da actividade da transcriptase inversa da telomerase ocorre em células transformadas e tumores. Os ADNcs da transcriptase inversa da telomerase (TERT) de vários mamíferos e um anfíbio foram clonados e estudados (Nakamura et al. 1997. Science 277. 955 - 959; Greenberg et al. 1998 . Oncogene 16, 1723-1730).

Uma sobreexpressão de TERT numa célula conduz à imortalização da dita célula, foi proposto o uso de TERT para a produção de linhas celulares (McSharry et al., 2001 J Gen Virol. 82, 855-63). Contudo, a actividade de TERT é restringida à espécie. Por exemplo, a TERT humana é incompatível com o aparelho de manutenção do telómero aviário (Michailidis et al. 2005. Biochem Biophys Res Commun. 335 (1), 240-6). Assim, para desenvolver linhas celulares aviárias e mais particularmente de anatidae, existe uma necessidade de TERT que actue nestas células particulares.

Delany et al (Delany ME, Daniels LM. Gene. 2004 Sep 15;339:61-9) divulga um polipéptido TERT isolado de galinha Gallus domesticus (i.e., chTERT) que pertence à família Fasianidae e a sequência de ácidos nucleicos correspondente. Os autores mostram que polipéptidos TERT de vertebrados (i.e. 2 galinha, humano, Xenopus, ratinho, ratazana e hamster) apresentam conservação em regiões específicas. Contudo, os autores deste artigo não divulgam nem sugerem que a molécula de ácidos nucleicos que codifica o polipéptido chTERT pode ser utilizada para a imortalização de células, muito menos para a produção de vírus ou de moléculas de interesse. Delany et al nunca referem o interesse de clonar proteínas TERT aviárias adicionais.

Fragnet et al (Fragnet L, Kut E, o Rasschaert D. J Biol Chem. 2005 Jun 24; 280 (25) : 23502-15) é um artigo de revisão relativo à correlação entre vírus e activação da actividade da telomerase. Os autores mencionam que a actividade de telomerase pode estar associada com a carcinogénese, e apresenta a actividade da telomerase como um factor entre muitos outros no processo multifactor da tumorigénese, que envolve o desregulamento da expressão de várias proteínas celulares de ciclo e de sistemas de reparo de ADN.

As linhas celulares eucarióticas são fundamentais para o fabrico de vacinas virais e muitos produtos da biotecnologia. Os biológicos produzidos em culturas celulares incluem enzimas, hormonas, imunobiológicos (anticorpos monoclonais, interleucinas, linfocinas), e agentes anti-cancro. Embora possam ser produzidas muitas proteínas mais simples utilizando células bacterianas, proteínas mais complexas que são glicosiladas, devem ser actualmente feitas em células de eucarióticas.

As linhas celulares aviárias são particularmente úteis uma vez que vários vírus usados em composição farmacêutica são capazes de se reproduzir nelas. Mais notoriamente, vários vírus são apenas capazes de crescer em células aviárias. Tal 3 é por exemplo o caso do Vírus Ankara Modificado (MVA) que não é capaz de crescer na maioria das células de mamífero. Este poxvírus, que derivou de um Vírus Vaccinia por mais de 500 passagens em CEF foi usado nos anos setenta para vacinar pessoas com imunodeficiência contra Varíola. Actualmente, o MVA é principalmente utilizado como um vector para terapia génica e fins de imunoterapia. Por exemplo, o MVA é utilizado como um vector para o gene MUC1 para vacinar pacientes contra tumor que expressa este antigénio (Scholl et al., 2003, J Biomed Biotechnol., 2003, 3, 194-201). Os MVA que transportam o gene que codificam antigénios HPV são também utilizados como vector para o tratamento terapêutico de lesões cervicais de elevado grau. Mais recentemente, o MVA foi o vector de escolha para preparar tratamento profiláctico contra doenças emergentes recentes ou armas biológicas prováveis tais como o virus do Nilo ocidental e antraz.

Assim, existe uma necessidade para uma nova Transcriptase Inversa da Telomerase capaz de imortalizar células aviárias e mais particularmente células Anatidae.

Tal como é usado ao longo do pedido, os termos "um" e "uma" são utilizados no sentido que querem dizer "pelo menos um", "pelo menos um primeiro", "um ou mais" ou "uma pluralidade" dos componentes ou passos referenciados, a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma pluralidade de células, incluindo suas misturas. 0 termo "e/ou" onde quer que seja aqui utilizado inclui o significado de "e", "ou" e "todos ou qualquer outra combinação dos elementos ligados pelo dito termo." 4

Tal como é aqui utilizado, pretende-se que os termos "compreendendo" e "compreende" signifiquem que os produtos, composições, e métodos incluam os componentes ou passos referenciados, mas não excluam outros. "Que consiste essencialmente de" quando utilizado para definir produtos, composições e métodos, significará excluindo outros componentes ou passos de qualquer significado essencial. Assim, uma composição que consiste essencialmente dos componentes recitados não excluirá restos de contaminantes e portadores farmaceuticamente aceitáveis. "Que consiste em" deverá significar excluir mais do que restos de elementos de outros componentes ou passos. 0 presente invento refere-se a um polipéptido recombinante ou isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos à sequência de aminoácidos da transcriptase inversa da telomerase de Cairina moschata SEQ ID N°: 1. Num modo de execução mais preferido do invento, o polipéptido do invento compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade da sequência de aminoácidos a SEQ ID N°: 1. Num modo de execução mais preferido, o polipéptido do invento compreende a sequência de aminoácido exposta em SEQ ID N°: 1. O polipéptido do invento tem uma actividade TERT e permite a imortalização de uma célula que pertence à família Anatidae.

Tal como é aqui utilizado, o termo "isolado" e/ou "recombinante" significa que a molécula de ácidos nucleicos, ADN, ARN, polipéptidos ou proteínas assim designados foram produzidos em tal forma pela mão do homem, e assim estão separados do seu ambiente celular in vivo nativo. Como resultado desta intervenção humana, os ADNs, ARNS, 5 polipéptidos e proteínas recombinantes do invento são úteis de modos aqui descritos que os ADNs, ARNs, polipéptidos ou proteínas tal como ocorrem naturalmente o não são.

Noutro modo de execução, o presente invento refere-se a uma molécula de ácidos nucleicos recombinante ou isolada que codifica o polipéptido do invento.

Num modo de execução preferido do presente invento, a molécula de ácidos nucleicos que codifica o polipéptido do invento compreende uma sequência de ácidos nucleicos que apresenta pelo menos 90% de identidade de sequência de ácidos nucleicos à SEQ ID N°: 2. De preferência, a dita molécula de ácidos nucleicos apresenta pelo menos 95% de identidade da sequência de ácidos nucleicos exposta em SEQ ID N°: 2. As moléculas de ácidos nucleicos preferidas que codificam o polipéptido do invento compreendem a mesma sequência nucleotídica exposta em SEQ ID N°: 2. A molécula de ácidos nucleicos do invento pode ser um ARN, um ADNc ou uma sequência genómica de um tipo misto. Pode, onde apropriado, conter um ou mais intrões, sendo este de origem nativa, heteróloga (por exemplo o intrão dos genes da β-globina de coelho etc.) ou sintética, para aumentar a expressão nas células hospedeiras. O presente invento refere-se também a um vector que transposta uma molécula de ácidos nucleicos isolada ou recombinante de acordo com o invento.

Tal como é aqui utilizado, o termo "vector" é entendido significar um vector de origem plasmídica ou virai, e facultativamente um tal vector combinado com uma ou mais 6 substâncias melhora a eficácia de transfecção e/ou a estabilidade do dito vector e/ou a protecção do dito vector in vivo para o sistema imunitário do organismo hospedeiro. Estas substâncias encontram-se amplamente documentadas na literatura que está acessível a especialistas na técnica (ver por exemplo Felgner et al. , 1987, Proc. West. Farmacol. Soc. 32, 115-121; Hodgson e Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342; Remy et al., 1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647-654). A titulo de ilustração mas sem limitação, podem ser polímeros, lípidos, em particular lípidos catiónicos, lipossomas, proteínas nucleares ou virais ou lípidos neutros. Estas substâncias podem ser usadas sozinhas ou em combinação. Exemplos de tais compostos encontram-se disponíveis em particular nos pedidos de patente WO 98/08489, WO, 98/17693, WO 98/34910, WO 98/37916, WO 98/53853, EP 890362 ou WO 99/05183. Uma combinação que pode ser considerada é um vector plasmídico recombinante combinado com lípidos catiónicos conhecidos de um especialista na técnica e uma série deles encontra-se comercialmente disponível, mas é também possível construí-los ou modificá-los por técnicas de engenharia genética. Pode-se mencionar, a título de exemplo, os plasmídeos derivados do pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), pREP4, pCEP4 (Invitrogene) ou pPoly (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201). De preferência, um plasmídeo usado no contexto do presente invento contém uma origem de replicação que assegura a iniciação da replicação num célula produtora e/ou numa célula hospedeira (por exemplo, a origem CoIEl pode ser seleccionada para um plasmídeo pretendido ser produzido em E. coli e o sistema oriP/EBNAl pode ser seleccionado se for desejado que seja auto-replicativo numa célula hospedeira de mamífero, Lupton e Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542; Yates et al., Nature 313, 812-815). Pode compreender elementos adicionais 7 que melhoram a sua manutenção e/ou a sua estabilidade numa determinada célula (sequência cer que promove a manutenção monomérica de um plasmídeo (Summers e Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103, sequências para integração, no genoma da célula).

Relativamente a um vector virai, é possível considerar um vector derivado de um poxvírus (vírus vaccinia, em particular MVA, canarypox e semelhantes), de um adenovírus, de um retrovírus, de um herpesvírus, de um alfavírus, de um vírus espumoso ou de um vírus adeno-associado. Será utilizado de preferência um vector não-replicativo. A este respeito, os vectores adenovirais são mais particularmente adequados para levar a cabo o presente invento.

De acordo com um modo de execução preferido do invento, o vector de acordo com o invento compreende adicionalmente os elementos necessários para a expressão da molécula de ácidos nucleicos do invento numa célula hospedeira.

Os elementos necessários para a expressão consistem no conjunto de elementos que permitem a transcrição da sequência nucleotídica para o ARN e a tradução do ARNm a um polipéptido, em particular as sequências do promotor e/ou sequências reguladoras que são eficazes na dita célula, e facultativamente as sequências necessárias para permitir a excreção ou a expressão à superfície das células alvo para o dito polipéptido. Estes elementos podem ser reguláveis ou constitutivos. Evidentemente que o promotor é adaptado ao vector seleccionado e à célula hospedeira. Pode-se mencionar, a título de exemplo, os promotores eucarióticos dos genes PGK (Fosfo-Glicerato Cinase), MT (metalotioneína; Mclvor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848), oí-1 antitripsina, CFTR, os promotores do gene que codifica a creatina cinase do músculo, o tensioactivo pulmonar actina, imunoglobulina ou β-actina (Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 416-436), SRa (Takebe et al., 1988, Mol. Cell. 8, 466-472), o promotor precoce do vírus SV40 (Vírus de Símio) , o LTR do RSV (Vírus do Sarcoma de Rous), o Promotor de MPSV, o promotor de TK-HSV-1, o promotor precoce do vírus CMV (Citomegalovírus), os promotores do vírus vaccinia, p7.5K pH5R, pKIL, p28, p 11 e os promotores adenovirais EIA e MLP ou uma combinação dos ditos promotores. 0 promotor precoce do Citomegalovírus (CMV) é mais particularmente preferido.

De acordo com um modo de execução preferido, o vector do invento compreende adicionalmente duas sequências que são homólogas com porções contidas numa região de uma sequência de ADN alvo nativa para o genoma de um genoma de célula. A presença das ditas sequências homólogas permite a inserção específica num locus da molécula de ácidos nucleicos do invento na sequência de ADN alvo através de recombinação homóloga. 0 termo “recombinação homóloga" refere-se à troca de fragmentos de ADN entre duas moléculas de ADN no locus de sequências de nucleótidos essencialmente idênticas. De preferência, as sequências homólogas no vector são cem por cento homólogas à região da sequência alvo. Contudo, pode ser utilizada menor homologia de sequência. Assim, pode ser utilizada sequência de homologia tão baixo quanto aproximadamente 80%.

As sequências homólogas no vector compreendem pelo menos 25pb, são preferidas regiões mais compridas, de pelo menos 500 pb e mais preferivelmente pelo menos 5000 pb. 9

De acordo com um modo de execução mais preferido do invento, a molécula de ácidos nucleicos é rodeada pelas sequências homólogas no vector.

Tal como é aqui utilizado "rodeado" significa que uma das sequências homólogas encontra-se localizada a montante da molécula de ácidos nucleicos do invento e que uma das sequências homólogas fica localizada a jusante da molécula de ácidos nucleicos do invento. Tal como é aqui utilizado, "rodeado" não significa necessariamente que as duas sequências homólogas estão directamente ligadas às extremidades 3' ou 5' da molécula de ácidos nucleicos do invento, a molécula de ácidos nucleicos do invento e as sequências homólogas podem ser separadas por um número ilimitado de nucleótidos.

Tal como é aqui utilizado, "uma sequência de ADN alvo" é uma região dentro do genoma de uma célula que é marcada para modificação por recombinação homóloga com o vector. Sequências de ADN alvo incluem genes estruturais (i.e., sequências de ADN que codificam polipéptidos incluindo no caso de eucariotas, intrões e exões), sequências reguladoras tais como sequências facilitadoras, promotores e semelhantes e outras regiões no genoma de interesse. Uma sequência de ADN alvo também pode ser uma sequência que, quando marcada por um vector não tem efeito na função do genoma do hospedeiro.

Tal como é aqui utilizado, "inserido numa sequência de ADN alvo" significa amplamente que o processo de recombinação homóloga que conduz à inserção da molécula de ácidos nucleicos do invento introduz uma delecção ou um rompimento na sequência de ADN marcado. 10 0 especialista na técnica é capaz de escolher as sequências homólogas apropriadas com vista a marcar uma sequência de ADN especifica no genoma de uma célula. Por exemplo, uma sequência homóloga pode ser homóloga a uma parte da sequência de ADN marcado, em que a outra sequência homóloga é homóloga a uma sequência de ADN localizada a montante ou a jusante da sequência marcada. De acordo com outro exemplo, uma das sequências homólogas pode ser homóloga a uma sequência de ADN localizada a montante da sequência de ADN marcada, em que a outra sequência homóloga é homóloga a uma sequência de ADN localizada a jusante da sequência de ADN alvo. Noutro exemplo, ambas as sequências homólogas são homólogas a sequências localizadas na sequência de ADN alvo.

De acordo com um modo de execução preferido do invento, a sequência de ADN alvo é o gene HPRT (Hipoxantina fosforibosil transferase). A sequência genómica compreendendo o promotor do HPRT e o gene HPRT de cairina moschata encontra-se exposto em SEQ ID N°: 3. A sequência que codifica o HPRT começa no codão ATG na posição 8695 da sequência de ácidos nucleicos exposta em SEQ ID N°: 3, a sequência a montante deste codão de ATG é a sequência do promotor do HPRT. 0 especialista na técnica é capaz de escolher as sequências homólogas necessárias para a integração da molécula de ácidos nucleicos do invento no gene HPRT. Tal como entre os vários membros de uma família, as sequências genómicas que codificam HPRT são altamente homólogas entre aviários, o especialista na técnica é assim capaz de projectar as sequências homólogas necessárias para marcar o gene HPRT de outras células aviárias. 11

De acordo com um modo de execução mais preferida do invento, as sequências homólogas são parametrizadas para inserir a molécula de ácidos nucleicos do invento a jusante do promotor do HPRT. Neste modo de execução particular, a molécula de ácidos nucleicos do invento é ligada de modo operacional ao promotor do HPRT endógeno da célula. No contexto do presente invento, pretende-se que "ligado de modo operacional" signifique que a molécula de ácidos nucleicos seja ligada ao promotor de um modo que permite a sua expressão na célula.

De acordo com este modo de execução particular, a sequência homóloga, a montante da molécula de ácidos nucleicos do invento, tem de preferência uma sequência de ácidos nucleicos que é homóloga com pelo menos 500 pb contíguos e mais preferencialmente pelo menos 5000 pb contíguos da sequência de ácidos nucleicos que inicia no nucleótido na posição 1 e termina com o nucleótido na posição 8694 da sequência de ácidos nucleicos exposta em SEQ ID N°: 3, com a condição que a dita sequência homóloga não é homóloga com a sequência de ácidos nucleicos que inicia no nucleótido na posição 8695 e termina com o nucleótido na posição 26916 da sequência de ácidos nucleicos exposta em SEQ ID N°: 3. Além disso, esta sequência homóloga a montante está de preferência directamente ligada ao codão de iniciação da molécula de ácidos nucleicos de acordo com este invento. De acordo com um modo de execução do invento ainda mais preferido, a sequência homóloga a montante da molécula de ácidos nucleicos do invento consiste na sequência de ácidos nucleicos que inicia no nucleótido na posição 1383 e termina com o nucleótido na posição 8694 da sequência de ácidos nucleicos exposta em SEQ ID N° : 3. Por exemplo, o vector de acordo com o invento compreende a sequência de ácidos nucleicos que inicia no 12 nucleótido na posição 1 e termina com o nucleótido na posição 11227 da sequência de ácidos nucleicos exposta em SEQ ID N°: 4. A sequência homóloga, a jusante da molécula de ácidos nucleicos do invento, tem de preferência uma sequência de ácidos nucleicos que é homóloga com pelo menos 500 pb contíguos e mais preferivelmente pelo menos 5000 pb contíguos da sequência de ácidos nucleicos que inicia no nucleótido na posição 10581 e termina com o nucleótido na posição 17800 da sequência de ácidos nucleicos exposta em SEQ ID N°: 3. E mais preferencialmente, a dita sequência homóloga, a jusante da molécula de ácidos nucleicos do invento, consiste na sequência de ácidos nucleicos que inicia no nucleótido na posição 10581 e termina com o nucleótido na posição 17800 da sequência de ácidos nucleicos exposta em SEQ ID N° : 3.

De acordo com um modo de execução preferido, o vector do invento compreende um primeiro marcador de selecção, em que este primeiro marcador de selecção é um marcador de selecção positivo e em que o dito primeiro marcador de selecção e a molécula de ácidos nucleicos do invento são colocados na mesma secção do vector, sendo a dita secção delimitada pelas sequências homólogas.

Tal como é aqui utilizado, o termo "marcador de selecção positivo" refere-se notavelmente a um gene que codifica um produto que permite que apenas as células que transportam o gene sobrevivam e/ou cresçam sob determinadas condições. Marcadores de selecção típicos codificam proteínas que conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, e.g., ampicilina, neomicina, metotrexato, ou tetraciclina, deficiências auxotóficas de complemento, ou facultar nutrientes críticos não disponíveis de meio complexo. Num modo de execução preferido de acordo com o invento, o 13 primeiro marcador de selecçao codifica uma proteína que confere resistência a antibióticos.

De acordo com um modo de execução do invento mais preferido, o primeiro marcador de selecção, no vector, é rodeado por sequências que permitem a sua supressão. As ditas sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de selecção não rodeiam a molécula de ácidos nucleicos do invento. Quando o vector é circular, as sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de selecção, o primeiro marcador de selecção e a molécula de ácidos nucleicos do invento são colocados na mesma secção do vector de transferência, sendo a dita secção delimitada pelas sequências homólogas.

As sequências que permitem a supressão de um fragmento de ácido nucleico são bem conhecidas do especialista na técnica (Nunes-Duby, S. et al (1998) Nucleic Acids Res. 26:391-406). Estas sequências podem ser reconhecidas por uma ou mais enzimas específicas que induzem a supressão do ácido nucleico compreendido entre as ditas sequências, estas enzimas são designadas "recombinases". Por exemplo, três recombinases bem conhecidas que permitem a supressão de um fragmento de ácido nucleico são as recombinases FLP, ISCEI e Cre.

Uma recombinase locus-específica típica é a recombinase Cre. A Cre é um produto de 38-kDa do gene cre (recombinação por ciclização) do bacteriófago PI e é uma recombinase de ADN locus-específica da família Int. Stemberg, N., et al. (1986) J. Mol. Biol. 187: 197-212. A Cre reconhece um locus de 34-pb no genoma PI designado loxP (locus de X-over do PI) e catalisa de modo eficaz a recombinação de ADN conservativa recíproca entre pares de locus loxP. O locus loxP consiste em duas repetições invertidas de 13-pb que flanqueiam uma região 14 do núcleo 8-pb não palindrómico. A recombinação mediada por Cre entre dois locus loxP directamente repetidos resulta na excisão de ADN entre eles como um circulo covalentemente fechado. A recombinação mediada por Cre entre pares de locus loxP em orientação invertida resultará em inversão do ADN interveniente em vez de excisão. A quebra e junção de ADN são limitadas a posições discretas dentro da região do núcleo e prossegue em cadeia a uma altura por via do acoplamento de ADN fosfotirosina-proteina transiente com a enzima.

Outra recombinase locus-especifica é a I-Scel. Outra endonuclease intrão-retorno, por exemplo I-Tlil, I-Ceul, I-Creli, I-Ppol e PI-PspI, também podem ser substituídas por I-Seel. Muitos são listados por Belfort e Roberts ((1997) Nucleic Acid Research 25:3379-3388). Muitas destas endonucleases derivam de genomas de organelos nos quais o uso do codão difere do uso do codão nuclear padrão. Usar tais genes para expressão nuclear das suas endonucleases pode ser necessário para alterar a sequência de codificação para emparelhar com os genes nucleares. A I-Scel é uma endonuclease de cadeia dupla que cliva o ADN no seu locus de reconhecimento. A I-Scel gera um corte alternado de 4 pb com saliências 3ΌΗ. A enzima I-Scel tem um locus de reconhecimento conhecido. 0 locus de reconhecimento da I-Scel é uma sequência não- simétrica que se estende por mais de 18 pb. 5’ TAGGGATAACAGGGTAAT3' 3’ ATCCCTATTGTCCCATTA5

Assim, num modo de execução preferido do invento, as sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de selecção compreendem o locus de reconhecimento de I-Scel. 15

Outra recombinase locus-específica é a recombinase FLP. A recombinase FLP reconhece um locus mínimo de 34-pb distinto que tolera apenas degenerescência limitada da sua sequência de reconhecimento (Jayaram, 1985; Senecoff et al., 1988). A interacção entre a recombinase FLP e uma sequência FRT foi examinada (Panigrahi et al., 1992). Exemplos de sequências de FRT variantes são facultadas por Jayaram (1985) e Senecoff et al. (1988), e um ensaio para recombinação mediada por FLP em diferentes substratos é descrito em Snaith et al. (1996).

No modo de execução particular, onde o vector do invento compreende sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de selecção, o dito vector pode vantajosamente compreender uma primeira sequência de homologia A e uma segunda sequência de homologia B, em que as sequências de homologia A e B têm um comprimento suficiente e uma homologia suficiente que permite recombinação homóloga entre eles. Em relação às sequências de homologia A e B, "homologia suficiente," refere-se de preferência a sequências com pelo menos 70%, de preferência 80%, ainda preferencialmente pelo menos 90%, especialmente preferível pelo menos 95%, bastante especialmente preferível pelo menos 99%, mais preferível 100%, de homologia nestas sequências de homologia por um comprimento de pelo menos 20 pares de bases, de preferência pelo menos 50 pares de bases, especialmente preferível pelo menos 100 pares de bases, bastante especialmente preferível pelo menos 250 pares de bases, mais preferível pelo menos 500 pares de bases. Neste modo de execução, o vector do invento compreende nas orientações 5'- para 3'- como se segue a molécula de ácidos nucleicos do invento, a primeira sequência de homologia A, uma sequência que permite a supressão do primeiro marcador de selecção, o primeiro marcador de 16 selecçao, uma sequência que permite a supressão do primeiro marcador de selecção e a sequência de homologia B.

De acordo com um modo de execução preferido, o vector do invento compreende um segundo marcador de selecção que não é rodeado pelas ditas sequências homólogas, em que o dito segundo marcador de selecção é um marcador de selecção negativo. 0 dito segundo marcador de selecção é particularmente útil quando o vector do invento é circular. Quando o vector for circular, o facto que o segundo marcador de selecção não é rodeado pelas ditas sequências homólogos significa que o segundo marcador de selecção e a molécula de ácidos nucleicos do invento não são colocados na mesma secção do vector de transferência, sendo a dita secção delimitada pelas sequências homólogas.

De acordo com um modo de execução preferido do invento, o vector do invento compreende um terceiro marcador de selecção em que o dito terceiro marcador de selecção é um marcador de selecção negativo e em que o dito terceiro marcador de selecção encontra-se situado entre as sequências permitindo a supressão do primeiro marcador de selecção. Quando o vector for circular, o facto de o terceiro marcador de selecção estar situado entre as sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de selecção significa que o terceiro marcador de selecção e o primeiro marcador de selecção estão colocados na mesma secção do vector de transferência, sendo a dita secção delimitada pelas sequências permitindo a supressão do primeiro marcador de selecção.

Tal como é aqui utilizado, o termo “marcador de selecção negativo" refere-se notavelmente a um gene que codifica um produto que mata as células que transportam o gene sob certas 17 condições. Estes genes compreendem notavelmente "gene suicida". Os produtos codificados por estes genes são capazes de transformar um pró-fármaco num composto citotóxico. Diversos pares de gene suicida/pró-fármaco encontram-se actualmente disponíveis. Podem-se mencionar mais particularmente os pares: vírus herpes simplex tipo I timidina cinase (HSV-1 TK) e aciclovir ou ganciclovir (GCV) (Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 7024-7028;

Culver et al., 1992, Science 256, 1550-1552; Ram et al., 1997, Nat. Med. 3, 1354-1361,); citocromo p450 e ciclofosf ofamida (Wei et al., 1994,

Human Gene Therapy 5,969-978); purina nucleósido fosforilase de Escherichia coli (E. coli) e 6-metilpurina desoxirribonucleósido (Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1, 233-238); guanina fosforibosiltransferase de E. coli e 6-tioxantina (Mzoz e Moolten, 1993, Human Gene Therapy, 4, 589-595) e citosina desaminase (CDase) e 5-fluorocitosina (SFC). FCU1 e 5-fluoro-citosina (5FC) (W09954481). FCUI-8 e 5-fluoro-citosina (5FC) (W02005007857) 0 primeiro, segundo e terceiro marcadores de selecção podem ser usados separadamente. Por exemplo, o vector do invento pode compreender o primeiro e o terceiro marcador de selecção 18 mas nao o segundo, ou o segundo e o terceiro marcador selecção mas não o primeiro.

De acordo com um modo de execução preferido do invento, o primeiro, o segundo e/ou o terceiro marcador de selecção são colocados sob controlo dos elementos necessários para a sua expressão numa célula hospedeira.

Os elementos necessários para a expressão consistem no conjunto de elementos que permitem a transcrição da sequência nucleotidica para o ARN e a tradução do ARNm a um polipéptido, em particular as sequências do promotor e/ou sequências reguladoras que são eficazes na dita célula, e facultativamente as sequências necessárias para permitir a excreção ou a expressão à superfície das células hospedeiras do dito polipéptido. Estes elementos podem ser reguláveis ou constitutivos. Claro que o promotor é adaptado ao vector seleccionado e à célula hospedeira. Pode-se mencionar, a título de exemplo, os promotores eucariotas dos genes PGK (Fosfo Glicerato Cinase), MT (metalotioneína; Mclvor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848), a-1 antitripsina, CFTR, os promotores do gene que codifica creatina cinase do músculo, tensioactivo pulmonar actina, imunoglobulina ou β-actina (Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 416-436), SRa (Takebe et al. , 1988, Mol. Cell. 8, 466-472), o promotor precoce do vírus SV40 (Vírus de Símio) , o LTR do RSV (Vírus do Sarcoma de Rous), o Promotor de MPSV, o promotor de TK-HSV-1, o promotor precoce do vírus CMV (Citomegalovírus), os promotores do vírus vaccinia, p7.5K pll5R, pKlL, p28, p 11 e os promotores adenovirais EIA e MLP ou uma combinação dos ditos promotores. 0 promotor precoce do Citomegalovírus (CMV) é mais particularmente preferido. 19 0 presente invento refere-se também a uma célula aviária transfectada por uma molécula de ácidos nucleicos ou um vector de acordo com o invento e células aviárias suas derivadas. Tal como é aqui utilizado, o termo "derivado" refere-se a células que desenvolvem ou diferenciam de ou têm como antepassado uma célula transfectada por uma molécula de ácidos nucleicos de acordo com o invento. De preferência, a dita molécula de ácidos nucleicos é inserida no gene HPRT das ditas células primárias. 0 presente invento refere-se também ao uso dos polipéptidos, moléculas de ácidos nucleicos e a vectores de acordo com o invento para a imortalização de uma célula aviária.

Também é descrita uma célula aviária que compreende a molécula de ácidos nucleicos do invento, em que a dita molécula de ácidos nucleicos encontra-se ligada de modo operacional ao promotor do HPRT endógeno da célula aviária. Pretende-se que "ligado de modo operacional" signifique que a molécula de ácidos nucleicos está ligada ao promotor de um modo que permite a sua expressão na célula. Num modo de execução preferido, a célula aviária de acordo com o invento compreende a sequência de ácidos nucleicos exposta em SEQ ID N° : 4. 0 presente invento refere-se também a um processo para imortalizar uma célula aviária compreendendo o passo de transfectar um vector de acordo com o invento na dita célula aviária.

Uma célula imortalizada, tal como é aqui utilizado, refere-se a uma célula capaz de crescer em cultura durante mais de 35 passagens. 20 0 termo número de passagens refere-se ao número de vezes que uma população celular foi removida do recipiente de cultura e foi submetida um processo de subcultura (passagem) para manter as células numa densidade suficientemente baixa para estimule crescimento adicional.

Tal como é aqui utilizado, o termo "transfectado" refere-se à transfecção estável ou à transfecção transiente da célula aviária do invento. 0 termo “transfecção estável" ou "transfectado de modo estável" refere-se à introdução e integração de ADN estranho no genoma da célula transfectada. 0 termo "transfectante estável" refere-se a uma célula que integrou de modo estável ADN estranho no ADN genómico. 0 termo "transfecção transiente" ou "transientemente transfectado" refere-se à introdução de ADN estranho numa célula onde o ADN estranho falha na integração do genoma da célula transfectada. 0 ADN estranho persiste no núcleo da célula transfectada durante vários dias. 0 termo "transfectante transiente" refere-se a células que captaram ADN estranho mas falham na integração deste ADN.

De acordo com um modo de execução preferido do invento, a célula aviária do invento deriva de uma célula da família Anatidae ou da família Phasianidae. Entre a Anatidae, as células que pertencem ao género Cairina ou Anas são particularmente preferidas. Ainda mais preferencialmente as células de acordo com o invento pertencem às espécies Cairina moschata ou Anas platyrhynchos. 21

De preferência, a célula aviária de acordo com o invento deriva de um organismo embrionário. Os métodos que permitem o isolamento de células de um organismo vivo são bem conhecidos do especialista na técnica. Por exemplo, podem ser usados métodos descritos no exemplo 2. De acordo com um modo de execução preferido do invento, a célula aviária primária é isolada de um embrião que pertence à família Anatidae que tem entre 0 e 20 dias de idade, mais preferivelmente entre 5 e 15 dias de idade e ainda mais preferencialmente entre 11 e 14 dias de idade. 0 vector usado no processo do invento pode compreender um primeiro marcador de selecção. A integração do primeiro marcador de selecção permite a selecção das células que incorporaram a molécula de ácidos nucleicos do invento. Em conformidade, o processo de acordo com o invento pode compreender adicionalmente um passo em que as ditas células aviárias são cultivadas num meio que apenas permite o crescimento das células que incorporaram o primeiro marcador de selecção. Por exemplo num meio que compreende um antibiótico.

Quando o vector usado no processo do invento compreende sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de selecção, o processo de acordo com o invento pode compreender adicionalmente um passo que consiste em suprimir o primeiro marcador de selecção do genoma da dita célula aviária primária. Para suprimir o dito primeiro marcador de selecção, a célula aviária é transfectada pelo gene que codifica a recombinase específica para as sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de selecção. Métodos e vectores capazes de transferir o dito gene na célula são bem 22 conhecidos do especialista na técnica, por exemplo, pode ser usado o método descrito no exemplo 4 do presente pedido.

Quando o vector usado no processo do invento compreende um segundo marcador de selecção, o processo de acordo com o invento pode adicionalmente compreender um passo em que as células aviárias são cultivadas num meio que apenas permite o crescimento das células que não incorporaram o segundo marcador de selecção. 0 dito passo pode ser realizado simultaneamente com ou separadamente do passo em que as ditas células aviárias são cultivadas num meio que apenas permite o crescimento das células que incorporaram o primeiro marcador de selecção. 0 dito segundo marcador de selecção é particularmente útil quando o vector, usado no processo de acordo com o invento, é circular. A presença do dito segundo marcador de selecção permite a destruição das células aviárias nas quais o processo de recombinação homóloga conduz à introdução da secção do vector de transferência que não compreende a molécula de ácidos nucleicos do invento.

Quando o vector usado no processo do invento compreende um terceiro marcador de selecção, o processo de acordo com o invento pode adicionalmente compreender um passo no qual a dita célula aviária é cultivada num meio que não permite o crescimento das células que compreendem o terceiro marcador de selecção. Por exemplo, um meio que não permite o crescimento das células que compreendem FCU1 como um terceiro marcador de selecção, compreende 5-Fluorocitosina.

Este passo permite a selecção das células aviárias nas quais ocorreu a supressão do primeiro marcador de selecção. Tal 23 significa que o passo que consiste na supressão do primeiro marcador de selecção também conduzirá à supressão do terceiro marcador de selecção. A presença do terceiro marcador de selecção permite a destruição das células aviárias nas quais o primeiro marcador de selecção está presente. 0 presente invento refere-se mais particularmente, mas não está limitado a um processo para imortalizar uma célula aviaria compreendendo os passos de: - transferir para a célula aviária um vector compreendendo: uma molécula de ácidos nucleicos de acordo com o invento rodeada por sequências homólogas.

Um primeiro marcador de selecção em que o dito primeiro marcador de selecção é um marcador de selecção positivo e em que o dito primeiro marcador de selecção é rodeado pelas ditas sequências homólogas.

Sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de selecção.

Um segundo marcador de selecção que não é rodeado pelas ditas sequências homólogas, em que o dito marcador de selecção é um marcador de selecção negativo.

Um terceiro marcador de selecção em que o dito terceiro marcador de selecção é um marcador de selecção negativo e em que o dito terceiro marcador de selecção encontra-se localizado entre as sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de selecção. 24 - cultivar as ditas células aviárias num meio que apenas permite o crescimento das células que incorporaram o primeiro marcador de selecção. - cultivar as ditas células aviárias num meio que não permite o crescimento das células que incorporaram o segundo marcador de selecção. - excluir o primeiro marcador de selecção do genoma da dita célula aviária. - cultivar a dita célula aviária num meio que não permite o crescimento das células que compreendem o terceiro marcador de selecção.

Num modo de execução particularmente preferida, o invento refere-se a uma célula aviária imortalizada que deriva duma célula de um animal que pertence à espécie Cairina moschata e que compreende a transcriptase inversa da telomerase de Cairina moschata, sob controlo do promotor de HPRT de Cairina moschata, inserido no gene HPRT da célula. A célula aviária de acordo com o invento pode adicionalmente compreender uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que permitem a propagação de um vírus defectivo. "Vírus defectivo" refere-se a um vírus no qual um ou mais genes virais necessários para a sua replicação são deletados ou tornam-se não funcionais. 0 termo "sequência de ácidos nucleicos que permite a propagação de um vírus defectivo" refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos que faculta em trans a(s) função (ões) que permite a replicação do vírus defectivo. Noutras palavras, a(s) dita(s) sequência (s) de ácidos nucleicos codifica a(s) proteína(s) necessária(s) para 25 a replicação e encapsidação do dito vírus defectivo. A título de ilustração, para a produção de um vector adenoviral, a que falta a maior parte da região El, a célula aviária de acordo com o invento pode ser transfectada transientemente ou permanentemente com uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a região El. A célula aviária de acordo com o invento também pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma substância de interesse. Neste caso, a dita célula aviária de acordo com o invento pode ser usada para a produção da dita substância de interesse. Tal como é aqui utilizado, uma substância de interesse pode incluir, mas não está limitada a, uma proteína farmaceuticamente activa, por exemplo factores de crescimento, reguladores de crescimento, anticorpos, antigénios, os seus derivados úteis para imunização ou vacinação e semelhantes, interleucinas, insulina, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF ou combinações dos mesmos, interferões, por exemplo, interferão-a, interferão-β, interferão -, factores de coagulação do sangue, por exemplo, Factor VIII, Factor IX, ou tPA ou combinações dos mesmos. "Substância de interesse" refere-se também a enzimas industriais, por exemplo para uso na pasta de papel ou papel, modificação têxtil, ou produção de etanol. Finalmente, "substância de interesse" refere-se também a suplemento proteico ou um produto de valor acrescentado para alimentação animal.

As células aviárias obtidas pelo processo de acordo com o invento, a célula aviária do invento e as células aviárias suas derivadas são notavelmente úteis para a replicação de um vírus vivo, atenuado, ou recombinante. Mais preferivelmente, as ditas células são particularmente úteis para a replicação 26 de poxvírus (vírus vaccinia, em particular MVA, poxvírus de canário, etc.)? um adenovírus, um retrovírus, um herpesvírus, um alfavírus, um vírus espumoso ou de um vírus associado ao adenovírus.

Os retrovírus têm a propriedade de infectar, e na maioria dos casos integrar em células em divisão e a este respeito são particularmente apropriados para uso em relação ao cancro. Um retrovírus recombinante de acordo com o invento contém geralmente as sequências LTR, uma região de encapsidação e a sequência de nucleótidos de acordo com o invento, que é colocado sob controlo do LTR retroviral ou de um promotor interno tais como os abaixo descritos. Um vector retroviral pode conter modificações, em particular nos LTRs (substituição da região do promotor com um promotor eucariótico) ou a região de encapsidação (substituição com uma região de encapsidação heteróloga, por exemplo o tipo VL30) (ver pedidos Franceses 94 08300 e 97 05203).

Ao vector adenoviral pode faltar a totalidade ou parte de pelo menos uma região que é essencial para replicação e que é seleccionada das regiões El, E2, E4 e LI L5. Uma deleção da região El é preferida. Contudo, pode ser combinada com outra(s) modificação(ões)/deleção(ões) afectando, em particular, a totalidade ou parte das regiões E2, E4 e/ou LI L5. A título de ilustração, a deleção da parte principal da região El e da unidade de transcrição E4 é bastante particularmente vantajosa. Com a finalidade de aumentar as capacidades de clonagem, ao vector adenoviral pode adicionalmente faltar a totalidade ou parte da região não essencial E3. De acordo com outra alternativa, é possível fazer uso de um vector adenoviral mínimo que retém as sequências que são essenciais para encapsidação, 27 designadamente os ITRs (Repetição Terminal Invertida) 5' e 3', e a região de encapsidação. Os vários vectores adenovirais, e as técnicas para os preparar, são conhecidos (ver, por exemplo, Graham e Prevect, 1991, em Methods in Molecular Biology, Vol 7, p 109 128; Ed: E. J. Murey, The Human Press Inc). A família dos poxvírus compreende vírus das subfamílias Chordopoxvirus e Entomopoxvirus. Entre estes, o poxvírus de acordo com o invento é preferivelmente escolhido do grupo que compreende Orthopoxviruses, Parapoxviruses, Avipoxviruses, Capripoxviruses, Leporipoxviruses, Suipoxviruses, Molluscipoxviruses, Yatapoxviruses. De acordo com um modo de execução mais preferida, o poxvírus do invento é um orthopoxvirus. O Orthopoxvirus é de preferência um vírus vaccinia e mais preferivelmente um vírus vaccinia Ankara modificado (MVA) em particular MVA 575 (ECACC V00120707) e MVA-BN (ECACC V00083008). O termo "vírus recombinante" refere-se a um vírus que compreende uma sequência exógena inserida no seu genoma. Tal como é aqui utilizado, uma sequência exógena refere-se a um ácido nucleico que não está naturalmente presente no vírus progenitor.

Num modo de execução, a sequência exógena codifica uma molécula que tem uma função citotóxica directa ou indirecta. Por citotóxica "directa ou indirecta", queremos dizer que a molécula codificada pela sequência exógena pode ela própria ser tóxica (por exemplo ricina, factor de necrose tumoral, interleucina-2, interferão-gama, ribonuclease, desoxirri- 28 bonuclease, Exotoxina A de Pseudomonas) ou pode ser metabolizada para formar um produto tóxico, ou pode actuar em qualquer outra coisa para formar um produto tóxico. A sequência do ADNc da ricina é divulgada em Lamb et al (Eur. J. Biochem., 1985, 148, 265-270).

Num modo de execução preferido do invento, a sequência exógena é um gene suicida. Um gene suicida codifica uma proteína capaz de converter um pró-fármaco relativamente não-tóxico a um fármaco tóxico. Por exemplo, a enzima citosina desaminase converte 5-fluorocitosine (5FC) a 5-fluorouracil (5FU) (Mullen et al (1922) PNAS 89, 33); a enzima de herpes simplex timidina cinase sensibiliza células a tratamento com o agente antiviral ganciclovir (GCV) ou aciclovir (Moolten (1986) Câncer Res., 46, 5276; Ezzedine et al (1991) New Biol 3, 608). Pode ser utilizada a citosina desaminase de qualquer organismo, por exemplo, E. Coli ou Saccharomyces cerevisiae.

Assim, num modo de execução mais preferido do invento, o gene codifica uma proteína que tem uma actividade de citosina desaminase e ainda mais preferivelmente uma proteína como descrito nos pedidos de patente W02005007857 e W09954481

Num modo de execução adicional o gene exógeno codifica uma ribozima capaz de clivar ARN ou ADN marcado. O ARN ou ADN marcado para ser clivado pode ser ARN ou ADN que é essencial à função da célula e a sua clivagem resulta em morte celular ou o ARN ou ADN a ser clivado podem ser ARN ou ADN que codifica uma proteína indesejável, por exemplo um produto de oncogene, e a clivagem deste ARN ou ADN pode impedir que a célula se torne cancerosa. 29

Ainda num modo de execução adicional o gene exógeno codifica um ARN anti-sentido.

Por "ARN anti-sentido" queremos dizer uma molécula de ARN que hibridiza a, e interfere com a expressão de uma molécula de ARNm que codifica uma proteína ou a outra molécula de ARN dentro da célula tal como pre-ARNm ou ARNt ou ARNr, ou hibridiza, e interfere com a expressão de um gene.

Noutro modo de execução do invento, a sequência exógena substitui a função de um gene defectivo numa célula alvo. Existem diversos milhares de doenças genéticas hereditárias de mamíferos, incluindo humanos, que são causadas por genes defectivos. Exemplos de tais doenças genéticas incluem fibrose quística, onde se sabe haver uma mutação no gene CFTR; distrofia muscular de Duchenne onde se sabe haver uma mutação no gene distrofina; drepanocitose onde se sabe haver uma mutação no gene HbA. Muitos tipos de cancro são causados por genes defectivos, especialmente protooncogenes, e anti-oncogenes que sofreram mutação.

Exemplos de protooncogenes são o ras, src, bcl etc; exemplos de anti-oncogenes são o p53 e Rb.

Num modo de execução adicional do invento, a sequência exógena codifica Antigénio Associado a Tumor (TAA). TAA refere-se a uma molécula que é detectada a uma frequência ou densidade mais elevada em células tumorais do que em células não-tumorais do mesmo tipo de tecido. Exemplos de TAA incluem mas não estão limitadas a CEA, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, GP-100. MUC-1, MUC-2, oncogene ras mutado pontualmente, p53 normal ou mutado pontualmente, p53 sobre-expresso, CA-125, PSA, C-erb/B2, BRCA I, BRCA II, PSMA, tirosinase, TRP-1, TRP- 30 2, NY-ESO-1, TAG72, KSA, HER-2/neu, bcr-abl, pax3-fkhr, ews-fli-1, sobrevivente e LRP. De acordo com um modo de execução mais preferido o TAA é MUC 1. 0 vírus recombinante pode compreender mais do que uma sequência exógena e cada sequência exógena pode codificar mais do que uma molécula. Por exemplo, pode ser útil para associar num mesmo poxvirus recombinante, uma sequência exógena que codifica um TAA com uma sequência exógena que codifica uma citocina.

Noutro modo de execução do invento, o gene exógeno codifica um antigénio. Tal como é aqui utilizado, "antigénio" refere-se a um ligando que pode ser ligado por um anticorpo; um antigénio não necessita de ser imunogénico.

De preferência o antigénio é derivado de um vírus tal como por exemplo VIH-1, (tal como gp 120 ou gp 160), qualquer Vírus da imunodeficiência felino, humano ou vírus de herpes animal, tais como gD ou seus derivados ou proteína precoce imediata tal como ICP27 de HSV1 ou HSV2, citomegalovírus (tal como gB ou seus derivados) , Vírus Varicela Zoster (tais como gpl, II ou III), ou de um vírus da hepatite tal como vírus da hepatite B por exemplo antigénio de Superfície da Hepatite B ou um seu derivado, vírus da hepatite A, vírus da hepatite C (de preferência proteína não estrutural do genótipo lb estirpe ja) e vírus da hepatite E, ou de outros patógenos virais, tais como Vírus Sincicial Respiratório, Vírus do papiloma humano (de preferência a proteína E6 e E7 da estirpe HPV16) ou vírus influenza, ou derivados de patógenos bacterianos tais como Salmonela, Neisseria, Borrelia (por exemplo OspA ou OspB ou seus derivados) , ou Chlamidia, ou 31

Bordetella por exemplo P.69, PT e FHA, ou derivados de parasitas tais como plasmódio ou Toxoplasma.

Figura 1: Vector que compreende um gene que codifica a transcriptase inversa da telomerase.

Figura 2: Representação esquemática da inserção locus específica do gene que codifica a transcriptase inversa da telomerase no gene HPRT.

Figura 3: Representação esquemática da eliminação do primeiro e terceiro marcadores de selecção do genoma da célula imortalizada obtida pelo processo do invento

Exemplos:

Exemplo 1: Sistema de expressão da telomerase

Inserção aleatória

Utilizou-se para esta finalidade um plasmídeo que não partilha qualquer sequência específica de homologia com o genoma de pato (Figura 1).

Inserção marcada

Construiu-se um plasmídeo compreendendo dois fragmentos de 5kb homólogos ao gene HPRT de Cairina moschata que rodeia o gene da transcriptase inversa da telomerase de cairina moschata e dois marcadores de selecção. Seleccionou-se o gene HPRT que codifica a hipoxantina guanina fosforil transferase como um sitio adequado para a expressão constitutiva da telomerase de cairina moschata. 32

Estes dois marcadores de selecção são o gene FCU1 (Erbs et al. Câncer Res. 2000. 15. 60: 3813-22) sob controlo de um promotor do CMV (Thomsen et al. P.N.A.S. 1984. 81. 3: 659-63) e o gene de resistência à Neomicina colocado sob controlo de um promotor do SV40. A resistência à Neomicina e a cassete de expressão de FCU-1 são rodeados por locus de clivagem Scel que permitem a eliminação das cassetes de selecção da linha celular final. Fora dos braços do gene HPRT é inserido um marcador de selecção que codifica o HSVTK conduzido por um promotor do RSV (Figura 2) .

Exemplo 2: Preparação de lote de CEC de ovos de Cairina moschata com 12 dias e descrição de subpopulações. 33 transferir para azoto líquido para armazenamento a longo prazo, constituindo o banco celular inicial (50x1,5.107 células/frasco, 44x1.107 células/frasco) .

As células que permanecem em cultura são submetidas classicamente até 18 passagens, durante as 3 primeiras passagens as células não ligadas são recolhidas por centrifugação a baixa rotação do meio condicionado, novamente semeadas e passam adicionalmente do mesmo modo que a cultura inicial.

As subpopulações que exibem aspectos morfológicos diferentes característicos, foram reprodutivelmente isoladas durante a vida da cultura.

Exemplo 3; Métodos de transfecção. São conhecidos na arte um grande número de métodos de transfecção para introduzir um vector capaz de dirigir expressão de uma sequência de nucleótidos de interesse. Uma lista não limitativa destes métodos é apresentada a seguir: precipitação por CaP04, electroporação, método de transfecção por lipofectina. Um exemplo facultado é baseado no procedimento de precipitação por CaPC>4.

As células devem ter uma confluência de cerca de 80-50%. 0 meio é alterado duas horas antes da adição de CaP04/ADN. As 30 yg de ADN são ressuspendidas em 31 μΐ 2M CaCl2 - 161,3 mM Tris pH 7,6. Adiciona-se H20 para perfazer um volume final de 0,5 mL.

Por transfecção, distribuem-se 0, 5 mL de 2X HEBS em tubos Falcon esterilizados de 15 mL e adiciona-se a solução de ADN 34 gota a gota enquanto se submete cuidadosamente a vortex ou borbulhação a solução de ADN. A solução deve ficar leitosa. Deixa-se que a solução repouse à temperatura ambiente durante 10-30 min. Em seguida pipeta-se uma vez para dentro e para fora com pipeta esterilizada em cultura de tecido para quebrar flocos e aplica-se gota a gota às células. Incubam-se em seguida as células entre 6 horas até durante a noite a 37°C. Um precipitado fino deve cobrir a superfície celular. Para completar o procedimento de transfecção aquecer até 37°C a solução choque de glicerol. Aspira-se o meio, adicionam-se 5 mL de BME para lavar a camada celular, aspira-se em seguida o meio e adiciona-se 1 mL de solução de choque de glicerol durante 2 minutos ou menos. Subsequentemente adicionam-se lentamente 10 mL de BME para diluir o glicerol e remove-se completamente o BME-glicerol. Adiciona-se em seguida 10 mL de meio desejado e incubam-se placas à temperatura adequada.

Exemplo 4: Métodos de selecção.

Inserção aleatória:

Aplica-se pressão de selecção 48 horas após transfecção: dissociam-se as células com TrypLE select, centrifugam-se a baixa rotação e voltam-se a semear em BME com FCS 10%, e G418 800 yg/mL.

Passam-se as células em série até poderem ser isolados clones individuais em crescimento. Isolam-se os focos em multiplicação e amplificam-se antes da quantificação de actividade da telomerase com o estojo de detecção de telomerase TRAPeze®XL (S7707, Chemicon) e análises de manchas a sul para estabelecer a integração no locus especifico marcado. 35

Inserção marcada:

Aplica-se pressão de selecção 48 horas após transfecção: dissociam-se as células com TrypLE select, centrifugam-se a baixa rotação e voltam-se a semear em BME com FCS 10%, Ganciclovir 25 pg/mL, e G418 800 pg/mL.

Passam-se as células em série até poderem ser isolados clones individuais em crescimento. Isolam-se os focos em multiplicação e amplificam-se antes da quantificação de actividade da telomerase com o estojo de detecção de telomerase TRAPeze®XL (S7707, Chemicon) e análises de manchas a sul de oligos para estabelecer a integração no locus especifico marcado.

Os clones celulares com actividade em telomerase restaurada detectada e integração do locus HPRT marcado são subsequentemente transfectados um plasmideo de expressão da meganuclease I-Scel seguindo o método a seguir em baixo.

Para seleccionar a eliminação dos marcadores de selecção aplica-se 5-fluorocitosina (5-FC) 48 horas após transfecção: dissociam-se as células com TrypLE select, centrifugam-se a baixa rotação e voltam-se a semear em meio com 5-FC a concentração que varia de 10-3 a 1CT7 M mantém-se selecção de G418 (BME com FCS 10%, 5-FC, e G418800 pg/mL).

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> TRANSGENE SA ERBS Philippe BALLOUL Jean-Marc KAPFER Marina 36 SILVESTRE Nathalie <12 0> Transcriptase inversa da telomerase aviária <13 0> TG167PCT <15 0> EP 06360001.9 <151> 2006-01-05 <15 0> EP 06360047.2 <151> 2006-10-13 <16 0> 4 <1 7 0> Patent In versão 3.3 <21 0> 1 <211> 1304 <212> PRT <213> Cairina moschata <40 0> 1 37

Met Ala Gly Ala Glu Pro Phe Gly 1 s

Cys Tyr Ala Gin Ala Ala Pro teu 20

Glu ser Gly Ala Glu Glu Ala Glu 35 40

Cys Tyr Arg Thr Phe vai ser Gin 50 55

Ala Arg Asp Ile Pro Arg Pro phe 65 70

Ser Glu Vai Ile Ser Arg Vai Met 85

Lys Asn Ile Leu Thr Tyr Gly Tyr 100 HAa Phe Gin Ile Met Pro Leu ser 115 120

Thr .Ala Thr Glu Thr «et Arg xie 130 13S

Ser Arg Ile Gly Asp Asp Vai «et 145 150

Ile Phe «et Leu Vai Pro pro ser 165

Pro Ile Tyr Glu Leu Ile Ser Gin 180

Vai Lys Glft Arg Léu Ser Lys His 195 200

Thr Gin Lys Arg Leu Thr Phe His 210 215

Gin Ser Lys Arg Arg Gin Arg Leu 225 230

Asn Lya Thr Ser Asn Asn Ile Gin

Ala Vai Leu Gly Ala Leu Arg Asp 10 15

Glu Thr Phe Leu Arg Gly Leu Gly 25 30

Vai Vai Arg Asp Asp Asp Ala Ala 45

Cye vai Vai Gys Vai Pro His Gly SO Sér Leu Glu Gin Leu Ser Ser Gin 75 80

Gin Arg Leu Cys Gly Lys Lys Lys 90 95

Ser Leu Leu Asp Glu Asn Ser Ser 105 110

Asn Vai Tyr Ser Tyr Leu Pro Asn 125

Ser Gly Leu Trp Glu Thr Leu Leu 140

Met Tyr Leu Leu Glu His Cys Ala 155 160

Asn Cye Tyr Gin Vai Cys Gly Gin 170 175

Asn Vai Glu Ser Ala Pro Ala Phe 105 190

Lys Arg Ser Ser Leu Leu Lys Tyr 205

Arg Gin Tyr Leu Ser Lys Ser Arg 220

Glu Ala Asn Vai Ser Ser Met Arg 235 , 240

Ser Leu Gly Ser Ala Ala Leu Glu 38 24 S Lys Gin Ser Ser Ser Asn Ala Gly 260 Lya Arg Lys Leu Ala Arg Glu Gin 275 280 Arg teu Glu Glu Lya Glu Arg Glu 290 295 Aan Vai Asn Oiti Ser lie Pro Lys 305 310 Ser Arg ser vai Ser Leu lie Lya 32S Aan Ser Asp Met Ser Arg Pro Ser 340 Lya Lys ser vai Ala Asp Lya ser 3S5 360 Asn Arg Hia Leu Lys Pro Ser ile 370 375 Lys Arg Vai Glu lie His Arg Pro 385 390 ile Glu Pro Ala Glu Ser Ser Ser 405 Pro Leu Ala Hia Leu Ala Glu Glu 420 Thr Ile Tyr Ile Asp Arg Lys Phe 43S 440 Gly Glu Arg Phe Pro Lys Ser Phe 450 455 Glú Ala Gly Vai Lys Arg Leu Ile 465 470 Pro Phe Gly Gin Lys Arg Asn Gin 485 Lys Lys Lys Leu Pro Lys Arg Phe 500 250 255

Leu Ser Ala Thr Ala Pro Ser Leu 265 270

Leu Glu Vai Thr Ala Lys Arg Ala 285

Glu GÍn Ala Cya Asn Thr Ala Pro 300

Arg tyr Gly Thr Ser Cya Vai Ala 315 320

Glu Lya Tyr Ile Ser Gin Arg Ser 330 335

Leu Vai His Asn Ser His His Gly 345 350

Ser Phe Leu Gin Gly Alá Glu Ser 365

Glu Met Gin Ala Gly Ser Ser Arg 380 ile Pro Arg Leu Asp Trp Ile Pro 395 400

Ser Gly His Lys Lys Gin Glu Ser 410 415

Leu Pro Asn Arg Vai Leu Pro Ser 425 430

Leu Léu Tyr Ser Arg Arg Tyr Trp 445

Leu Leu Ase Arg Leu Lys Gly Ser 460

Glu Thr ile phe Leu Ser Gin Asn 475 480

Gly Leu Pro Gin Lys Lya Trp Arg 490 495

Trp Arg Met Arg Ser Thr Phe Gin 505 510

Lya Leu Leu Lys Asn His Gly Lya Phe Pro Tyr vai Ala Phe Leu Arg SIS 520 525

Gin Aan cya Pro Leu Arg Ile Ser Glu Thr Ile Leu Gly Lys Ala Lys 530 535 540

Leu Leu Ser Arg Ala Pro Leu Pro Gly Gin Ala Glu Ala His Lys Gin 545 SS0 555' 560

Ala Glu Gin Léu Gly Lys Glu Pro Ala Lys Arg Vai Ala Ser Ser Arg 565 570 575

Cye Glu ser Gly His Thr Aan Vai Pro Ser Ser Vai Arg Ala Pro Leu 58G 585 590

Ala Ala Ser Ala Cya Vai Glu Pro Gly Gly Glu Glu Gin. He Pro Ala 595 600 605

Glu Ala Ser Asp Ser Vàl Leu Arg Glu Leu Leu Lya Glu His Cys Sér 610 6X5 620

His Phe Gin Vai Tyr Leu Phe Vai Arg Glu Cys vai Glu Arg Vai Ile 625 630 635 640

Pro Ala Glu Leu Trp Gly Ser Aan Hia Asn Lys Arg Arg Phe Phe Lys 645 650 655

Asn Vai Lys Ala Phe Ile Ser Met Gly Lya Tyr Ala Lys Leu Ser Leu 660 665 670

Gin Vai Leu Met Trp Lya Met Arg. Vai Asn Asp Cys Met Trp Leu Arg 675 680 685

Leu Ala Lya Gly Asn His Phe Vai Pro Ala Ser Glu His Arg Tyr Arg 690 695 700

Glu Glu ile Leu Ala Lys Phe Leu Tyr Trp Leu Met Asp Thr Tyr vai 705 710 715 720

Vai Glu Leu Léu Arg Sér Phe Phe Tyr Ile Thr Glu Thr «et Phe Gin 725 730 735 39

Lys Asn Met Leu Phe 740 Tyr Tyr Arg Lys 745 Cys Ile Trp Ala Lys 750 Leu Gin Asp Ile Gly 75$ Ile Arg Lys pis Phe 760 Ala Lys Val Gin Leu 765 Arg PíO Leu Thr Ala 770 Glu Glu Met Glu Ala 775 ile His Gin Lya Lys 780 Tyr Leu Pro Met Ala 765 Ser Lys Leu Arg Phe ile 790 Pro Lys Val ser Gly 795 Leu Arg Pro Ile 800 vai Arg «et Ser Gly Val val 805 Glu Ala Gin 810 Thr Leu Ser Lys Glu 815 Ser Arg Ala Lys Lys Met 820 Asn His Tyr Asn 825 «et Gin Leu Lys Asn 830 Leu Phe Ser Val Leu 835 Asn Tyr Glu Arg Thr 840 Ile Asn Thr Ser Tyr 845 Ile Gly Ser Ser Vai 850 Phe Gly Arg Asp Asp 855 Ile: Tyr Lys Lys Trp 860 Lys Thr Phe Vai Lys 86$ Lys: Val Leu Lys Ser Asp 870 Gly Glu Ile Pro 875 His Phe Tyr Tyr Val 880 Lys Ala Asp Val Ser 885 Arg Ala Phe Asp Ser 890 Ile Pro His ASp Lys 8 95 Leu Vai Glu Val ile Ser SOO Gin val Leu Lys SOS Pro Glu Lys Lys Thr 910 Val Tyr Cys Ile Arg 315 Arg Tyr Ala val val 320 Met Ile Thr Gly Ser 925 Gly Lys Thr Arg tys 930 Leu Tyr Arg Arg His 935 val Ser Thr Phe Lys 940 Asp Phe Met Pro A8p 945 Met Lys Gin Phe Val Ser ::950 Arg Leu His GlU 955 Ser Thr ser Léu .Arg 960 Asp Ala ile. Ue val :9-65 Glu Gin Ser Leu Thr 970 Phe Asn Glu Thr Ser 975 Ala Ser Léu Phe Asn phe 980 Phe Leu Gin «et 985 Leu Asn Asn Asn Ue 990 Leu Glu Ile aiu Arg ser· -Tyr Tyr Leu Gin Cye Ser Gly Ile Pro Gla Gly Ser 995 1Q0Ô 1005

Leu Leu 1010 Ser Thr Leu Leu Cys 1015 Ser Leu Cys Tyr Gly 1020 Asp Met Glu Asn Lys 1025 Leu Phe Ser Gly Val 1030 Gin Lys Asp Gly Val 1035 Leu Ile Arg Leu Ile 1040 Asp Asp Phe Leu Leu 1045 Val Thr Pro His Leu 1050 Thr His Ala Arg Thr 1055 Phe Leu Arg Thr Leu 1060 Ala Met oly Ile Pro 1065 Glu Tyr Gly Phe Leu 1070 Ile Asn Pro Lys Lys 1075 Thr Vál val Asn Phe 1080 Ser val Asp Asp Ile 1085 Pro Glu Cys Ser Glu 1090 Phe Lys Gin Leu Pro 1095 Asn Cys Arg Leu ile 1100 Pro Trp Cys Gly Leu 1105 Leu Leu Asp Thr Gin 1110 Thr Leu Glu Val Tyr 1115 Cys Asp Tyr Ser Ser 1120 Tyr Ser Cys Thr Ser 1125 Ile Arg Ser Ser Léu 1130 Ser Phe Aan Ser Asn 1135 Arg Thr Ala Gly Lys 1140 Asn Met Lys His Lys 1145 Leu Val Ala Val Leu 11S0 Lys Léu Lys Cys His 11SS Gly Leu Phe Leu Asp U60 Leu Gin ile Asn Ser 1165 val Lys Thr Val Phe 1170 lie Asn Val Tyr Lys 1175 Ile Phe Leu Leu Gin 1180 Ala Tyr Arg Phe His 1185 Ala Cys Val ile Gin 1190 Leu Pro Phe Asn Gin 1195 Lys Val Arg Asn Asn 1200 Pro Asp phe Phe Leu Arg Val Ile Ala Glu Asm Ala Ser Cys Cys Tyr Ser Met 40 1205 l?10 Leu Lys 1220 Ala Lys Asn Pro Gíy 1225 Phe Thr Leu Gly Ser Gly 1235 Met Phe Pro Ser Glu 1249 Ala Ala Glu Trp Ala Phe 12 S0 Thr Vai Lys Leu Ser 1255 Asn His Lys Vai Leu Leu 1265 Lys Pro Leu Lys Phe 1270 Cys Met Thr Gin lie Pro 1280 Lys Asp Thr Lys Ala 1285 Leu Leu Lys Thr Ser lie cys Gin Asp Phe Lys Ala Xle Leu Asp 1295 1300 1215

As n Arg Gly Ala 1230

Leu cys Tyr His 1245

Vai Tyr Lys Cys 1260 Léu Phe Arg Lys 1275

Vai Thr Glu pro 1290 <210> 2 <211> 3915 <212> ADN <213> Cairina moschata <40 0> 2 41 atggcgggcg cggagccctt: cggcgccgcg çcgggcgccc tgcgggactg ctacgcgcag 60 gcggccccgc tggagacctt cctccggggg ctgggggaga gcggcgccga ggaagccgag 120 gtggtgcggg acgacgaegc cgcctgctac egcaccttcg fegtcecàgtg cgeggcgtgt 180 gtcccccaeg gcgcçcgcga catcccccgg cccttcaget tggagcagtfc afcctagfccag 240 agcgaagtca tctcaagagt catgcagagg cfcgtgtggga aaaagaagaa gaacatccfce 300 acatatggat actccctgct ggatgaaaac agttctcact tccaaatcat gccgctctca 360 aacgtgtaca gctacctgcc caacaccgca acagaaacca tgcgtatcag tggcctctgg 420 gaaacgctgc tgagcaggat aggggsegae gtgátgàfcgt; attfcattgga gcactgtgca 480 átctttatgc tggttccccc tagtaactgt taçeaagtct gtgggcaacc aatttatgaa 540 cttatttcgc aaaatgtaga atcagcccca gcgtttgtta aacaacggct ttcaaagcac 600 aaacgtagta gettget£âa gtataegcag aaaaggctaa egtfctcaeag acagtatctt 660 tcaaagtcac gtcagtegaa acgcaggcaa agacttgaag ctaatgtctc cagcatgaga 720 aataaaacca gcaafcaatat acaaagccta gggtccgctg ctctggaaaa acagagtagc 780 cceaatgcag gtttgtcagc tacagcacca feccttaaaaa ggaagcttge tagggaacaa 840 ctggaagtca cggctaagag ageaagatta gaagagaaâg agagggagga âcaggettgt 800 aatactgctc ctaatgtaaa ccagagtatt çccaagaggt atggaaccag ctgfcgtagca 360 tcaegttctg taagtçttat taaagaaaas tacatttctc aaagaagtaa cagtgatatg 1020 tçtcgtccfce ctttagttca caattctcat catgggaaga agcctgtggc agacaaaagc 1080 tctttcctgc aaggagctga gagtaacaga catttaaagc ccagcattga aacgcaagca 1240 ggatccagca ggaagagagt agagatacae aggcctatac ctcggttgga Utggatacca 1200 atcgaaccgg cggaaagcag ttcttcagga oacaaaaagc aggaaagtçc cctagctcat 1260 ctggcagagg agttaccaaa tagggttttg ccatctaeaa tataeattga caggaagttt 1120 cttctgtacc ctcgcaggta ctggggggaa cgtttoccaa aatccttcct attgaatcgc 1380 ctgaagggta gtgaggcagg tgtaaagcga ctaatagaaa cgatattctt aagccaaaat 1440 ccgtttgggc aaaagcgcaa ccaaggtctg ccacagaaaa aatggagaaa gaagaagett 1500 cccaaacgce totggagaat gagaagcacg tttcaaaaac tcttaaagaa teatggaaag 1560 ttecettacg tagcfcttctt gagacaaaat tgccetcttc ggatatctga aaccattttg 1620 ggaaaagcea agctgctcag tegggcaeet ttgcetgggc aagcagaggc ecacaagcaa 1680 gcagaacagc ccgggaagga gcccgccaag cgtgtggcaa gcagcagatg cgaaoctggt 1740 cacaccaacg tgcccagcag egcacgegct cetceegeag cáectgcgtg cgçggagçça 1800 gggggggagg agcagatccc tgcagaggcg tctgattcag tectcaggga gcttctcaag 2860 gagcaetgca gceacttcca ggtgtaectc tttgtgaggg agtgcgtgga gcgggcgatc 1820 cccgccgagc tcfcggggttc aaaccataac aagcgccggé tcttcaagaa egtgaaagca 1980 ttcatttcca tggggaagta cgctaagctt tccfctgeagg tgttgatgtg gaagatgaga 2040 gcaaatgaçt gçatgtggct tegtetggce aaaggtaatc actfetgtfcee tgectctgaa 2100 caccgttacc gtgaagaaat tttggctaaa ttcctatacc ggctgatgga tacgtatgtt 2160 gttgagttge teagatcatc tttccatacc accgagacca tgCtccagaa aaatatgcct 2220 ttctactacc gaaagtgcat ctgggccaag ttacaggaea ttggaattag aaagcatttt 2280 gccaaagtac agctacgCcc tttaactgca gaggagatgg aaçcgatcca tcagaaaaaa 2340 42 taecttecta tggcatcaaa gctccgtttc aetcccaaag teagtggaet aagacccatc 2400 gtcagaatga gcggtgtcgt tgaagcacaa acgttgagea aggaaagcag agcaaagaag 2460 atgaaccact acaacatgca actgaaaaat ceatttagtg egttaaatta tgaaegaacc 2520 ataaacaeca gtcaeatcgg ctcttcagtg tttgggagag atgaçatcta caagaagCgg 2S80 aagacatttg ttaaaaaggt tcttaaatca gatggcgaaa ttcctcattt ctactatgta 2640 aaggecgatg tgtccagggc ttttgacagc attcctcacg ataaacttgt ggaagfcgatt 2700 tcacaggtct taaaacctga gaaaaaaacc gcccactgca tacggcgcta tgeagCggtt 2760 atgatcaetg gaagtggaaa aaceaggaag tcatacagga gacatgtfctc tactttcaag 2820 gattttatgc cagacatgaa gcagtttgtg tcccggcttc atgagagtaç ctcattgcga 2880 gatgcaacaa eagttgaáca gagcfctaacfc ttcaatgaga caagtgccag tctatttaat 2940 ttfctttctce aaatgctaaà taataacatç ctggaaattf agcgçagcfca ceacttacag 3000 tgctctggaa ttccacaggg ctecctfcttg tcaaccttgc tttgcagctt gtgetatgga 3060 gacatggaaa acaaattat.t cagtggggta cagaaggatg gagtcctgat ccgtcccatt 3120 gatgactttt tgcttgtcac açcacactta açgcatgcaa gaaetttcct aaggactcta 3180' gcaatgggca ttcctgagta eggctttttg ataaacceca aaaagacggt ggtgaatttt 324o tctgttgacg atatcccaga gtgttccgaa Cttaaacagc tgccaaactg tcgttfcgafcc 3300 ccatggtgtg gcttattatt ggatacacag acacttgagg tttactgtga ttaccccagc 3360 tattcctgta cttctafceag atcaagtctfc tcetCcaatt Caaacagaac agctgggaaa 2420 aacatgaaac acaaattggt tgeagtcctfc aaactgaaat gceatggett gtttcfctgat 3480 ttacagacca atagcgttaa aaçagtCCtC attaacgtCS acaagafcatt cctacttcag 3540 gcttacaggt tccatgcctg tgttattcaa cttccattea accagâaâgt fcaggaaeaat 3600 cctgaCCtct tcctcagagt catcgctgag aatgcatcgt gctgctatte tatgctgaaa 3660 gctaaaaatc cagggtttac fcttaggtaac agaggfcgcat ctggcatgtt cccttctgag 3720 gcageagagt ggefcctgcta tcatgcctte actgtcaaac tgtcaaacca caaagttgtt 3780 cacaaangct tgcttaagcc cctgaagttc tgtatgacac agctattccg gaagatccca 3840 aaggatacta aggcactact gaagaqagtg acagaaccat Ctatttgtca agatttcaaa 3900

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REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido isolado ou recombinante compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácido SEQ ID N°: 1 da transcriptase inversa da telomerase de Cairina moschata, e tendo actividade TERT. 2. Molécula de ácidos nucleicos isolada ou recombinante que codifica um polipéptido de acordo com a reivindicação 1. 3. Molécula de ácidos nucleicos isolada ou recombinante de acordo com a reivindicação 2 em que a dita molécula de ácidos nucleicos compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência de ácidos nucleico com a SEQ ID N°: 2. 4. Vector que transporta uma molécula de ácidos nucleicos isolada ou recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 3. 5. Vector de acordo com a reivindicação 4, em que o dito vector compreende duas sequências homóloqas a uma sequência de ADN alvo. 6. Vector de acordo com a reivindicação 5, em que a dita molécula de ácidos nucleicos é rodeada pelas ditas sequências homólogas. 7. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 6, em que o dito vector compreende adicionalmente um primeiro marcador de selecção em que o dito primeiro marcador de selecção é um marcador de selecção positivo e em que o dito 1 primeiro marcador de selecção é rodeado pelas ditas sequências homólogas. 8. Vector de acordo com a reivindicação 7, em que o dito primeiro marcador de selecção é rodeado por sequências que permitem a sua supressão. 9. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, em que o dito vector compreende um segundo marcador de selecção que não é rodeado pelas ditas sequências homólogas e em que o dito marcador de selecção é um marcador de selecção negativo. 10. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, em que o dito vector compreende um terceiro marcador de selecção em que o dito terceiro marcador de selecção é um marcador de selecção negativo e em que o dito terceiro marcador de selecção fica situado entre as sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de selecção. 11. Célula aviária transfectada por uma molécula de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 3 . 12. Célula aviária de acordo com a reivindicação 11, em que a dita molécula de ácidos nucleicos é inserida no gene HPRT da dita célula aviária. 13. Célula aviária de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 12 em que a dita célula aviária deriva de um animal que pertence à família Anatidae, de preferência às espécies cairina moschata ou Anas platyrhynchos. 2 14. Célula aviária de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, que compreende adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma substância de interesse. 15. Célula aviária de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, que compreende adicionalmente uma cassete de complementação que permite a propagação de um virus defectivo. 16. Uso de um polipéptido de acordo com a reivindicação 1, de uma molécula de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 3 ou de um vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 10 para a imortalização de uma célula aviária. 17. Uso de uma célula aviária de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 para a replicação de um virus vivo, atenuado ou recombinante, escolhido de preferência do grupo que consiste em poxvirus, adenovirus, retrovirus, herpesvírus, alfavirus, virus espumoso, e virus adenovírus-associado. 18. Uso de um célula aviária de acordo com a reivindicação 17, em que o poxvirus é um vírus vaccinia, em particular um vírus vaccinia modificado Ankara (MVA). 19. Uso de uma célula aviária de acordo com a reivindicação 14 para a produção de uma substância de interesse. 20. Uso de uma célula aviária de acordo com a reivindicação 19, em que a dita substância de interesse é seleccionada do grupo que consiste em factores de crescimento, reguladores de 3 crescimento, anticorpos, antigénios, interleucinas, insulina, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF, interferões, factores de coagulação do sangue, e suas combinações. 21. Processo para imortalizar uma célula aviária compreendendo o passo de transfectar na dita célula um vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 10. 22. Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por compreender adicionalmente um passo em que as ditas células aviárias são cultivadas num meio que apenas permite o crescimento das células que incorporaram o primeiro marcador de selecção. 23. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 22 caracterizado por compreender adicionalmente um passo em que as ditas células aviárias são cultivadas num meio que não permite o crescimento das células que incorporaram o segundo marcador de selecção. 24. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, em que o dito processo compreende adicionalmente um passo que consiste em excluir o primeiro marcador de selecção do genoma da dita célula aviária. 25. Processo de acordo com a reivindicação 24 em que células aviárias, obtidas após o dito passo que consiste em excluir o primeiro marcador de selecção do genoma das ditas células aviárias, são cultivadas num meio que não permite o crescimento das células que compreendem o terceiro marcador de selecção. 4 26. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, em que a dita célula aviária é retirada de um organismo que pertence à família Anatidae, de preferência às espécies cairina moschata ou Anas platyrhynchos. 27. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26, em que a dita molécula de ácidos nucleicos é inserida numa sequência de ADN alvo da dita célula, de preferência no gene HPRT. 15-10-2010 5

Claims (27)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido isolado ou recombinante compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácido SEQ ID N°: 1 da transcriptase inversa da telomerase de Cairina moschata, e tendo actividade TERT.
2. 2. Molécula de ácidos nucleicos isolada ou recombinante que codifica um polipéptido de acordo com a reivindicação 1.
3. 3. Molécula de ácidos nucleicos isolada ou recombinante de acordo com a reivindicação 2 em que a dita molécula de ácidos nucleicos compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência de ácidos nucleico com a SEQ ID N°: 2.
4. 4. Vector que transporta uma molécula de ácidos nucleicos isolada ou recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 3.
5. 5. Vector de acordo com a reivindicação 4, em que o dito vector compreende duas sequências homóloqas a uma sequência de ADN alvo.
6. 6. Vector de acordo com a reivindicação 5, em que a dita molécula de ácidos nucleicos é rodeada pelas ditas sequências homólogas.
7. 7. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 6, em que o dito vector compreende adicionalmente um primeiro marcador de selecção em que o dito primeiro marcador de selecção é um marcador de selecção positivo e em que o dito 1 primeiro marcador de selecção é rodeado pelas ditas sequências homólogas.
8. 8. Vector de acordo com a reivindicação 7, em que o dito primeiro marcador de selecção é rodeado por sequências que permitem a sua supressão.
9. 9. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, em que o dito vector compreende um segundo marcador de selecção que não é rodeado pelas ditas sequências homólogas e em que o dito marcador de selecção é um marcador de selecção negativo.
10. 10. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, em que o dito vector compreende um terceiro marcador de selecção em que o dito terceiro marcador de selecção é um marcador de selecção negativo e em que o dito terceiro marcador de selecção fica situado entre as sequências que permitem a supressão do primeiro marcador de selecção.
11. 11. Célula aviária transfectada por uma molécula de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 3 .
12. 12. Célula aviária de acordo com a reivindicação 11, em que a dita molécula de ácidos nucleicos é inserida no gene HPRT da dita célula aviária.
13. 13. Célula aviária de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 12 em que a dita célula aviária deriva de um animal que pertence à família Anatidae, de preferência às espécies cairina moschata ou Anas platyrhynchos. 2
14. 14. Célula aviária de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, que compreende adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma substância de interesse.
15. 15. Célula aviária de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, que compreende adicionalmente uma cassete de complementação que permite a propagação de um virus defectivo.
16. 16. Uso de um polipéptido de acordo com a reivindicação 1, de uma molécula de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 3 ou de um vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 10 para a imortalização de uma célula aviária.
17. 17. Uso de uma célula aviária de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 para a replicação de um virus vivo, atenuado ou recombinante, escolhido de preferência do grupo que consiste em poxvirus, adenovirus, retrovirus, herpesvírus, alfavirus, virus espumoso, e virus adenovírus-associado.
18. 18. Uso de um célula aviária de acordo com a reivindicação 17, em que o poxvirus é um vírus vaccinia, em particular um vírus vaccinia modificado Ankara (MVA).
19. 19. Uso de uma célula aviária de acordo com a reivindicação 14 para a produção de uma substância de interesse.
20. 20. Uso de uma célula aviária de acordo com a reivindicação 19, em que a dita substância de interesse é seleccionada do grupo que consiste em factores de crescimento, reguladores de 3 crescimento, anticorpos, antigénios, interleucinas, insulina, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF, interferões, factores de coagulação do sangue, e suas combinações.
21. 21. Processo para imortalizar uma célula aviária compreendendo o passo de transfectar na dita célula um vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 10.
22. 22. Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por compreender adicionalmente um passo em que as ditas células aviárias são cultivadas num meio que apenas permite o crescimento das células que incorporaram o primeiro marcador de selecção.
23. 23. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 22 caracterizado por compreender adicionalmente um passo em que as ditas células aviárias são cultivadas num meio que não permite o crescimento das células que incorporaram o segundo marcador de selecção.
24. 24. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, em que o dito processo compreende adicionalmente um passo que consiste em excluir o primeiro marcador de selecção do genoma da dita célula aviária.
25. 25. Processo de acordo com a reivindicação 24 em que células aviárias, obtidas após o dito passo que consiste em excluir o primeiro marcador de selecção do genoma das ditas células aviárias, são cultivadas num meio que não permite o crescimento das células que compreendem o terceiro marcador de selecção. 4
26. 26. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, em que a dita célula aviária é retirada de um organismo que pertence à família Anatidae, de preferência às espécies cairina moschata ou Anas platyrhynchos.
27. 27. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26, em que a dita molécula de ácidos nucleicos é inserida numa sequência de ADN alvo da dita célula, de preferência no gene HPRT. 15-10-2010 5