PT1957484E - Preparação e utilizações terapêuticas de antagonistas do receptor de glucagon - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"PREPARAÇÃO E UTILIZAÇÕES TERAPÊUTICAS DE ANTAGONISTAS DO RECEPTOR DE GLUCAGON"

Este pedido de patente reivindica o beneficio do Pedido Provisório de Patente dos Estados Unidos N° 60/739.692 apresentado 23 de Novembro de 2005.

Esta invenção refere-se a compostos que são antagonistas ou agonistas inversos do receptor de glucagon e a suas composições farmacológicas e a utilizações destes compostos e composições no tratamento de corpo humano ou animal. Os presentes compostos mostram uma grande afinidade e ligação selectiva para o receptor de glucagon e como tal são úteis no tratamento de distúrbios sensíveis à modulação dos receptores glucagon, como sejam diabetes e outros distúrbios metabólicos relacionados com o glucagon e semelhantes.

Glucagon é um agente hormonal chave que, em cooperação com a insulina, media a regulação homeostática da quantidade de glucose no sangue. Glucagon actua primeiramente estimulando certas células (entre estas são as importantes células do fígado) para libertar glucose quando caem os níveis de glucose no sangue. A acção do glucagon é oposta à da insulina a qual estimula as células 2 ΡΕ1957484 para a captação e armazenagem de glucose sempre que os níveis de glucose no sangue sobem. Tanto o glucagon como a insulina são hormonas peptídicas. Glucagon é produzido nas ilhotas das células alfa do pâncreas e a insulina é produzida nas ilhotas das células beta do pâncreas. Glucagon exerce a sua acção por ligação e activação do seu receptor, o qual é um membro do braço Glucagon-Secretina da família dos receptores acoplados da proteína-G 7-transmembranar. 0 receptor funciona por activação do sistema segundo mensageiro ciclase de adenililo resultando num aumento nos níveis de cAMP. 0 receptor de glucagon, ou as variantes de ocorrência natural do receptor, podem possuir actividade constitutiva intrínseca, in vitro, bem como in vivo (i. e., actividade na ausência de um agonista). Compostos que actuam como agonistas inversos podem inibir esta actividade. Diabetes mellitus é um distúrbio comum do metabolismo da glucose. A doença é caracterizada por hiperglicémia e pode ser classificada como diabetes do tipo 1, a forma insulina dependente ou diabetes do tipo 2, a qual tem caracter não insulina dependente. Sujeitos com diabetes do tipo 1 são hiper-glicémicos e hipoinsulinémicos e o tratamento convencional para esta forma da doença é providenciar insulina. No entanto, em alguns doentes com diabetes do tipo 1 ou do tipo 2, mostrou-se que os níveis de glucagon relativa ou absolutamente elevados contribuem para o estado hiperglicémico. A remoção de glucagon circulante tanto em animais saudáveis de controlo como em animais modelo de diabetes do tipo 1 e do tipo 2 com anticorpos selectivos e 3 ΡΕ1957484 específicos resultou na redução do nível de glicémia. Murganhos com uma delação homozigótica do receptor de glucagon apresentam aumento de tolerância à glucose. Também, a inibição da expressão do receptor de glucagon utilizando oligonucleótidos anti-sentido melhora o síndroma diabético em murganhos db/db. Estes estudos sugerem que a supressão de glucagon ou uma acção que antagonize glucagon podem ser um adjunto útil para o tratamento convencional da hiperglicémia em doentes diabéticos. A acção de glucagon pode ser suprimida providenciando um antagonista ou um agonista inverso, i.e., substâncias que inibem ou previnem respostas mediadas pelo receptor de glucagon constitutivas ou induzidas pelo glucagon. Várias publicações apresentam péptidos que se afirma actuarem como antagonistas do glucagon. Péptidos antagonistas de hormonas peptídicas são frequentemente potentes; no entanto, são geralmente conhecidas por não estarem disponíveis oralmente devido à degradação por enzimas fisiológicas e distribuição pobre in vivo. Portanto, são geralmente preferidos antagonistas não peptídicos de hormonas peptídicas oralmente disponíveis. 9, páginas 2047-2050, 2004, cada um

Em anos recentes têm aparecido numerosas publicações referindo agentes não peptídicos que actuam no receptor de glucagon. Por exemplo, WO 03/048109, WO 2004/002480 e Kurukulasuriya et al., "Biaryl amide glucagon receptor antagonists" Bioorganíc & Medicinal Chemistry Letters, vol., n° 4 ΡΕ1957484 apresenta compostos não peptídicos tendo alegadamente actividade antagonista do receptor de glucagon. Apesar do número de tratamentos para doenças que envolvem glucagon, as terapias correntes sofrem de mais do que uma anomalia, incluindo eficácia pobre ou inadequada, efeitos secundários inaceitáveis e contra-indicações para certas populações de doentes. Assim, permanece uma necessidade para um tratamento melhorado utilizando agentes farmacológicos alternativos ou melhorados que poderiam beneficiar da modulação do receptor de glucagon. A presente invenção providencia uma tal contribuição à técnica baseada na descoberta que uma nova classe de compostos tem actividade no receptor de glucagon com elevada afinidade, selectiva e potente inibição. A presente invenção é distinta nas estruturas particulares e suas actividades.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção providencia um composto estruturalmente representado pela Fórmula I:

O

ou um seu sal farmacologicamente aceitável, em que: 5 ΡΕ1957484

Rl e R2 são independentemente -H ou -halogénio R3 é - (Ci-Cs)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios), - (C3-C7) cicloalquilo, - (Ci-C6)alquil- (C3-C7) ci-cloalquilo ou -(C3-C7)cicloalquil-(Ci-Cg)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios); R4 e R5 são independentemente -H, -halogénio, hidroxi, hidroximetilo, -CN, —(Ci— C7)alcoxi, - (C2-C7) alquenilo ou - (Ci—C6)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios); R6 é

em que a marca em zig-zag mostra o ponto de ligação à molécula-mãe; R7 e R8 são independentemente -H, -halogénio, - (Ci-C6) alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios), - (C1—Ce)alcoxi, —(C3— C7) cicloalquilo, -C(0)RlO, -COORlO, -OC(O)Rl0, -OS(O)2Rl0, -SR10, -S(0)RIO, -S(0)2RlO ou -0 (C2-C7) alquenilo; 6 ΡΕ1957484 R9 é independentemente -H, -halogénio, -CN, - (C3-C7) cicloalquilo, -C(0)R10, -COORIO, -OC(O)RIO, -OS(0)2RlO, -SR10, -S(O)Rl0, -S(0)2R10 ou -(C2-C7)alquenilo, - (Ci-C6) alcoxi (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios) ou -(Ci-C6)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios) e RIO é independentemente em cada ocorrência -hidrogénio ou - (Ci-Cs)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios). A presente invenção providencia compostos que são úteis como antagonistas ou agonistas inversos do receptor de glucagon. A presente invenção providencia ainda compostos que são antagonistas ou agonistas inversos selectivos do receptor de glucagon sobre o receptor GLP-1. A presente invenção providencia ainda uma composição farmacológica a qual inclui um composto de Fórmula I ou um seu sal farmacologicamente aceitável e um excipiente, transportador ou diluente farmacologicamente aceitável. A presente invenção providencia ainda métodos de utilização destes compostos e composições no tratamento de distúrbios sensíveis à modulação dos receptores glucagon, como sejam diabetes e outros distúrbios metabólicos relacionados com o glucagon. 7 ΡΕ1957484

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Numa forma de realização, a presente invenção providencia compostos de Fórmula I como descritos em detalhe aqui neste documento. Apesar de todos os compostos da presente invenção serem úteis, certos compostos são particularmente interessantes e são preferidos. A seguinte lista apresenta vários grupos de compostos preferidos. Será entendido que cada uma das listagens pode ser combinada com outras listagens para criar grupos adicionais de formas de realização preferidas como indicado aqui neste documento.

Noutra forma de realização a invenção providencia um composto de Fórmula I em que Rl e R2 são -H; R3 é -(Ci-Cs)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios), - (C3-C6) cicloalquilo, - (Ci-C6) alquil-(C3-C6) ci-cloalquilo ou -(C3-C6)cicloalquil-(Ci-C6)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios); R4 e R5 são independentemente -H, -halogénio ou - (Ci-C6) alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios); R6 é ΡΕ1957484

em que a marca em zig-zag mostra o ponto de ligação à molécula-mãe; R7 e R8 são independentemente -H, -halogénio, -(C1-C3)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios) ou -(C1-C3)alcoxi; e R9 é independentemente -H, -halogénio ou - (Ci-Cê) alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios)

Noutra forma de realização a invenção providencia um composto de Fórmula I em que

Rl e R2 são -H; R3 é - (Ci—Cg) alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios), - (C3-C6) cicloalquilo, - (Ci—C6) alquil-(C3-C6) ci-cloalquilo ou -(C3-C6)cicloalquil-(Ci-C6)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios); 9 ΡΕ1957484 R4 e R5 são independentemente -H, -halogénio ou -CH3 (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios); R6 é

em que a marca em zig-zag mostra o ponto de ligação à molécula-mãe; R7 e R8 são independentemente -H ou -halogénio; e R9 é independentemente - (Ci-Cê)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios).

Noutra forma de realização a invenção providencia um composto de Fórmula I em que

Rl e R2 são -H; R3 é - (Ci-C8) alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios), -(C3-C6)cicloalquilo, -(Ci-C 6)a1qu i1—(C 3—C 6) cicloalquilo ou -(C3-C6)cicloalquil-(Ci — Οε)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios); R4 e R5 são -CH3 (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios) e cada um ocupa uma posição adjacente a R6 no anel fenilo ao qual R6 está ligado; ΡΕ1957484 10 R6 é

em que a marca em zig-zag mostra o ponto de ligação à molécula-mãe; R7 e R8 são -H, -halogénio; e R9 é independentemente — (Ci— Cê)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halo-génios) .

Noutra forma de realização a invenção providencia um composto de Fórmula I em que Rl e R2 são independentemente hidrogénio ou halogénio; R3 é metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, 3,3-dimetilbutilo, 2-metilpropilo, 3-metil-butilo, tert-butilo, 4-metilpentilo, 2,2-dimetil-propilo, 3,3,3-trifluoropropilo, 4,4,4-trifluorobutilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo ou ciclo-hexilo; R4 e R5 são independentemente hidrogénio, metilo, etilo, tert-butilo, ciclo-hexilo, pentilo, isopropoxi, cloro, fluoro, bromo, hidroxi, trifluorometilo, -CN, metoxi, hidroximetilo, 4-metilpentiloxi ou pentiloxi; R7 e R8 são independentemente hidrogénio, fluoro, cloro, metilo, etilo, pentilo, isopropilo, tert-butilo, trifluorometilo, acetilo, 2-metilpropilo, metoxi, ciclo-hexilo ou trifluorometoxi; R9 é hidrogénio, bromo, fluoro, metilo, tert-butilo, trifluorometilo ou isopropilo. 11 ΡΕ1957484

Outras formas de realização da invenção estão providenciadas aqui neste documento onde cada uma das formas de realização descritas anteriormente neste documento é mais estreitada como descrito nas seguintes preferências. Especificamente, cada uma das preferências em seguida é independentemente combinada com cada uma das formas de realização anteriores e a combinação particular providencia outra forma de realização na qual a variável indicada na preferência é estreitada de acordo com a preferência.

Preferivelmente Rl é -H. Preferivelmente RI é fluoro. Preferivelmente Rl é cloro. Preferivelmente R2 é -H. Preferivelmente R2 é fluoro. Preferivelmente R2 é cloro. Preferivelmente Rl e R2 são -H. Preferivelmente Rl é fluoro e R2 é fluoro.

Preferivelmente R3 é - (Ci—Cg)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios). Preferivelmente R3 é etilo, propilo, isopropilo, butilo, tert-butilo, 3-metil-butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, 3,3-dimetilbutilo, 2-metilpropilo, 4-metilpentilo, 2,2-dimetil-propilo, 3,3,3-trifluoropropilo ou 4,4,4-trifluorobutilo. Preferivelmente R3 é isopropilo, butilo, tert-butilo, 3-metil-butilo, pentilo, 3,3-dimetilbutilo, 2-metilpropilo, 4-metilpentilo, 2,2-dimetil-propilo, 3,3,3-trifluoropropilo ou 4,4,4-trifluorobutilo. Preferivelmente R3 é isopropilo, 3-metil-butilo, trifluoropropilo ou 4,4,4-trifluorobutilo. 12 ΡΕ1957484

Preferivelmente R3 é -(C3-C7)cicloalquilo. Preferivelmente R3 é ciclopropilo. Preferivelmente R3 é ciclo-butilo. Preferivelmente R3 é ciclopentilo. Preferivelmente R3 é ciclo-hexilo. Preferivelmente R3 é — (Ci—C6) — alquilo-(C3-C7)cicloalquilo. Preferivelmente R3 é — (Ci— C3)alquilo-(C3-C6)cicloalquilo. Preferivelmente R3 é -(Ci-C3)alquilo-ciclopropilo. Preferivelmente R3 é -(Ci-C3)al-quilo-ciclobutilo. Preferivelmente R3 é —(Ci—C3) alquilo-ciclopentilo. Preferivelmente R3 é -(Ci-C3)alquilo-ciclo-hexilo.

Preferivelmente R3 é - (C3-C7) cicloalquilo-(Ci— Ce)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halo-génios). Preferivelmente R3 é ciclopropilo- (Ci-C6) alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios). Preferivelmente R3 é ciclobutilo-(Ci-Cê) alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios). Preferivelmente R3 é ciclopentilo-(Ci-C6)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios). Preferivelmente R3 é ciclo-hexil-(Ci—C6) alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios) .

Preferivelmente R4 é -H, -halogénio, -hidroxi, -hidroximetilo ou (Ci-C6)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios) . Preferivelmente R4 é -H, -halogénio ou (Ci—C3)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios). Preferivelmente R4 é -H, -halogénio ou 13 ΡΕ1957484 -CH3. Preferivelmente R4 é -H. Preferivelmente R4 é fluoro, cloro ou bromo. Preferivelmente R4 é -CH3.

Preferivelmente R5 é -H, -halogénio, -hidroxi, -hidroximetilo ou (Ci-C6)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios) . Preferivelmente R5 é -H, -halogénio ou (Ci—C3)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios). Preferivelmente R5 é -H, -halogénio ou -CH3. Preferivelmente R5 é -H. Preferivelmente R5 é fluoro, cloro ou bromo. Preferivelmente R5 é -CH3.

Preferivelmente R4 e R5 são -H. Preferivelmente R4 é halogénio e R5 -H. Preferivelmente R4 e R5 são -CH3. Preferivelmente R4 e R5 são -CH3 e cada um ocupa uma posição adjacente a R6 no anel fenilo ao qual R6 está ligado.

Preferivelmente R7 é -halogénio, - (Ci-Cô) alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios), - (Ci—C6)alcoxi, - (C3-C7) cicloalquilo, -C(O)R10, -COORIO, -0C(0)RlO, -OS(O)2Rl0, -SRlO, -S(0)R10, -S(0)2RlO ou -0(C2-C7)alquenilo. Preferivelmente R7 é -halogénio, -(Ci-C6)-alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios) ou - (C1-C6) alcoxi. Preferivelmente R7 é -H ou -halogénio. Preferivelmente R7 é -H.

Preferivelmente R8 é -halogénio, -(Ci-C6)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios), - (Ci-C6)alcoxi, - (C3-C7) cicloalquilo, -C(0)R10, -COORIO, 14 ΡΕ1957484 -OC(O) RIO, -OS(O)2Rl0, -SRlO, -S(O)Rl0, -S(0)2RlO OU -0(C2-C7)alquenilo. Preferivelmente R8 é -halogénio, -(Ci~Ce)~ alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios) ou - (Ci-C6) alcoxi. Preferivelmente R8 é -H ou -halogénio. Preferivelmente R8 é -H. Preferivelmente R7 é -H e R8 é -H,

Preferivelmente R9 é -(C1—C6)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios). Preferivelmente R9 é metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, tert-butilo, trifluorometilo, 3-metil-butilo, pentilo, hexilo, 3,3-dimetilbutilo, 2-metilpropilo, 4-metilpentilo, 2,2-dimetilpropilo, 3-trifluoropropilo ou 4-trifluorobutilo. Preferivelmente R9 é isopropilo, tert-butilo ou trifluoro-metilo.

Preferivelmente R7 é -H, R8 é -H e R9 é isopropilo, tert-butilo ou trifluorometilo. RIO é independentemente em cada ocorrência — (Ci— C8)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios ) .

Outras formas de realização da invenção incluem compostos de fórmulas XI até xil. Uma outra forma de realização da invenção é qualquer preparação intermédia nova descrita aqui neste documento que seja útil para a preparação de antagonistas ou agonistas inversos do receptor de glucagon de fórmulas I ou XI até Xll. ΡΕ1957484 15

Tabela 1

ΡΕ1957484 16 (continuação)

N° Fórmula Estrutura X7 H> NH 'N X8 Λ' 0 %NH X9 N,„ f« N X10 rr ° ^}J'S>X)A jpy* %nh .. XI1 Ύ s o (i. NH 'N

Devido à sua interacção com o receptor de glucagon, os presentes compostos são úteis no tratamento de uma grande gama de condições e distúrbios nos quais é benéfico uma interacção com o receptor de glucagon. Estas condições e distúrbios são definidas aqui neste documento 17 ΡΕ1957484 como "diabetes e outros distúrbios metabólicos relacionados com o glucagon". Um especialista na técnica é capaz de identificar "diabetes e outros distúrbios metabólicos relacionados com o glucagon" pela sinalização mediada pelo envolvimento do receptor de glucagon tanto na patofisiologia do distúrbio como na resposta homeostática ao distúrbio. Assim, os compostos podem ter utilidade para por exemplo evitar, tratar ou aliviar doenças ou condições ou sintomas associados ou sequelas, do sistema endocrinológico, do sistema nervoso central, do sistema periférico nervoso, do sistema vascular, do sistema pulmonar e do sistema gastrointestinal, enquanto que reduz e ou elimina um ou mais dos efeitos secundários não desejados associados com os tratamentos correntes. "Diabetes e outros distúrbios metabólicos relacionados com o glucagon" incluem, mas não estão limitados a, diabetes, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, hiperglicémia, hiper insulinémia, acumulação de células beta, melhoramento da função das células beta pelo restabelecimento da resposta da primeira fase, hiperglicémia prandial, prevenir a apoptose, deficiência de glucose em jejum (IFG), sindroma metabólico, hipoglicémia, hiper/hipocalémia, normalização dos níveis de glucagon, melhoramento da razão LDL/HDL, redução de ingestão de aperitivos, distúrbios alimentares, perda de peso, síndroma dos ovários poliquísticos (PCOS), obesidade como consequência da diabetes, diabetes autoimunes latente em adultos (LADA), insulite, transplante de ilhéus, diabetes pediátrica, diabetes gestacional, complicações de diabetes tardias, micro/macro albuminúria, 18 ΡΕ1957484 neuropatia, úlceras diabéticas nos pés, mobilidade intestinal reduzida devido a administração de glucagon, síndroma do intestino curto, antidiarreico, segregação gástrica aumentada, fluxo de sangue diminuído, disfunção eréctil, glaucoma, stress pós cirurgia, melhoramento de lesão do tecido de órgãos causada por reperfusão do fluxo sanguíneo depois de isquémia, lesão cardíaca isquémia, insuficiência cardíaca, falha cardíaca congestiva, síncope, enfarte do miocárdio, arritmia, morte prematura, anti-apoptose, cicatrização de feridas, deficiência de tolerância à glucose (IGT), síndromas resistentes à insulina, síndroma X, hiperlipidémia, dislipidémia, hiper-trigliceridémia, hiperlipoproteinémia, hiper-colesterolé-mia, arteriosclerose incluindo aterosclerose, glucagonomas, pancreatite aguda, doenças cardiovasculares, hipertensão, hipertrofia cardíaca, distúrbios gastro-intestinais, obesidade, diabetes em consequência de obesidade, dislipidémia diabética, etc.

Adicionalmente, a presente invenção providencia um composto de Fórmula I ou um seu sal farmacológico ou uma composição farmacológica a qual inclui um composto de Fórmula I ou um seu sal farmacológico e um transportador, diluente ou excipiente farmacologicamente aceitável: para utilização na inibição da resposta celular mediada pelo receptor de glucagon num mamífero; para utilização na redução do nível de glicémia num mamífero; para utilização no tratamento de uma doença que surge do excesso de glucagon; para utilização no tratamento de diabetes e 19 ΡΕ1957484 outros distúrbios metabólicos relacionados com o glucagon num mamífero e para utilização no tratamento da diabetes, obesidade, hiperglicémia, aterosclerose, lesão cardíaca isquémia, síncope, neuropatia e cicatrização de feridas. Assim, os métodos desta invenção englobam uma administração profiláctica e terapêutica de um composto de Fórmula I. A presente invenção providência ainda a utilização de um composto de Fórmula I ou um seu sal farmacológico para a preparação de um medicamento para a inibição do receptor de glucagon; para a preparação de um medicamento para a utilização na inibição da resposta celular mediada pelo receptor de glucagon num mamífero; para a preparação de um medicamento para redução do nível de glicémia num mamífero; para a preparação de um medicamento para tratamento de uma doença que surge do excesso de glucagon; para a preparação de um medicamento para tratamento de diabetes e outros distúrbios metabólicos relacionados com o glucagon num mamífero e para a preparação de um medicamento para evitar ou tratamento da diabetes, obesidade, hiperglicémia, aterosclerose, lesão cardíaca isquémia, síncope, neuropatia e cicatrização imprópria de feridas.

Adicionalmente, a presente invenção providência uma composição farmacológica a qual inclui um composto de Fórmula I ou um seu sal farmacológico e um transportador, diluente ou excipiente farmacologicamente aceitável: adaptada para utilização na inibição do receptor de 20 ΡΕ1957484 glucagon; adaptada para utilização na inibição da resposta celular mediada pelo receptor de glucagon num mamífero; adaptada para utilização na redução do nível de glicémia num mamífero; adaptada para utilização no tratamento de diabetes e outros distúrbios metabólicos relacionados com o glucagon num mamífero e adaptada para utilização na prevenção ou tratamento da diabetes, obesidade, hiperglicémia, aterosclerose, lesão cardíaca isquémia, síncope, neuropatia e cicatrização imprópria de feridas. 0 composto ou sal da presente invenção providência ainda um agente de diagnóstico para identificação de doentes tendo um defeito no receptor de glucagon, como uma terapia para aumentar as segregações ácidas gástricas e para reverter a hipomobilidade intestinal devido à administração de glucagon.

Noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos são utilizados para a preparação de um medicamento para o tratamento de quaisquer condições e doenças mediadas pelo glucagon. Noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos são utilizados para a preparação de um medicamento para o tratamento de hiperglicémia. Ainda noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos são utilizados para a preparação de um medicamento para baixar a glucose no sangue de um mamífero. Os presentes compostos são efectivos na redução da glucose no sangue, tanto em jejum como num estado pós-prandial. Ainda noutra forma de realização da invenção, os presentes 21 ΡΕ1957484 compostos são utilizados para a preparação de uma composição farmacológica para o tratamento de IGT. Ainda noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos são utilizados para a preparação de uma composição farmacológica para o tratamento de diabetes tipo 2. Ainda noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos são utilizados para a preparação de uma composição farmacológica para o retardamento ou prevenção da progressão de IGT para diabetes tipo 2. Ainda noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos são utilizados para a preparação de uma composição farmacológica para o retardamento ou prevenção da progressão de diabetes tipo 2 não requerendo insulina para diabetes tipo 2 requerendo insulina. Ainda noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos são utilizados para a preparação de uma composição farmacológica para o tratamento de diabetes tipo 1. Tal tratamento é normalmente acompanhado por terapia com insulina. Ainda noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos são utilizados para a preparação de uma composição farmacológica para o tratamento da obesidade. Ainda noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos são utilizados para a preparação de uma composição farmacológica para o tratamento de distúrbios do metabolismo lipidico. Ainda noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos são utilizados para a preparação de uma composição farmacológica para o tratamento de um distúrbio na regulação do apetite ou gasto de energia. Ainda noutra forma de realização da invenção o tratamento de um doente 22 ΡΕ1957484 com os presentes compostos é combinado com dieta e/ou exercício.

Ainda noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos são administrados em combinação com uma ou mais outras substâncias activas em quaisquer razões adequadas. Tais outras substâncias activas podem ser seleccionadas por exemplo entre anti-diabéticos, aqentes anti-obesidade, agentes anti-hipertensão, agentes para o tratamento de complicações resultantes ou associados com a diabetes e agentes para o tratamento de complicações e distúrbios resultantes ou associados com a obesidade. A seguinte lista apresenta vários grupos de combinações. Será entendido que cada um dos agentes nomeado pode ser combinado com outros agentes nomeados para criar mais combinações .

Assim, ainda noutra forma de realização da invenção os presentes compostos podem ser administrados em combinação com um ou mais anti-diabéticos.

Agentes anti-diabéticos adequados incluem insulina, análogos da insulina e derivados como sejam os referidos em EP 792290 (Novo Nordisk A/S), por exemplo NSB29-tetradecanoil des(B30) insulina de humano, EP 214 826 e EP 705 275 (Novo Nordisk A/S), por exemplo AspB28 insulina de humano, US 5.505.188 (Eli Lilly), por exemplo, LysB28ProB29 insulina de humano, EP 368 187 (Aventis), por exemplo Lantus®, os quais são todos aqui neste documento 23 ΡΕ1957484 incorporados por referência, GLP-1 e derivados de GLP-1 como sejam os referidos em WO 98/08871 (Novo Nordisk A/S), o qual é aqui neste documento incorporados por referência, bem como agentes hipoglicémicos oralmente activos.

Os agentes hipoglicémicos oralmente activos incluem imidazolinas, sulfonilureias, biguaninas, megliti-nidas, oxadiazolidinedionas, tiazolidinedionas, activadores da insulina, segregadores de insulina, como sejam glimepiridina, inibidores da α-glucosidase, agentes que actuam no canal de potássio dependente de ATP das células β, por exemplo abridores do canal de potássio como aqueles referidos em WO 97/26265, WO 99/03861 e WO/OO/37474 (Novo Nordisk A/S), os quais estão aqui neste documento incorporados por referência ou mitiglinida ou um bloqueador do canal de potássio, como seja BTS-67582, nateglinida, antagonistas de GLP-1, inibidores de DPP-IV (dipeptidil peptidase -IV), inibidores da PTPase (proteína tirosina fosfatase), inibidores dos enzimas hepáticos envolvidos na estimulação da gluconeogenése e/ou glicogenólise, modula-dores da captação de glucose, activadores da glucocinase (GK) como sejam aqueles referidos em WO 00/58293, WO 01/44216, WO 01/83465, WO 01/83478, WO 01/85706, WO 01/85707 e WO 02/08209 (Hoffman-La Roche) i ou aqueles referidos em WO 03/00262, WO 03/00267 e WO 03/15774 (AstraZeneca), os quais estão aqui neste documento incorporados por referência, inibidores de GSK-3 (glicogene sintase cinase-3), compostos modificadores do metabolismo lipídico como sejam os agentes anti-lipidémicos como sejam 24 ΡΕ1957484 os inibidores de HMG CoA (estatinas), compostos que diminuem o consumo de comida, ligandos de PPAR (receptor activado proliferador da Peroxisoma) incluindo os sub-tipos PPAR-alfa, PPAR-gama e PPAR-delta e agonistas de RXR (receptor do retinoide X) como sejam ALRT-268, LG-1268 ou LG-1069 .

Ainda noutra forma de realização, os presentes compostos podem ser administrados em combinação com insulina ou um análogo ou derivado da insulina como sejam

cT3 O Q TjOQ N -tetradecanoil des(B30) insulina de humano, Asp insulina de humano, Lys Pro insulina de humano, Lantus® ou uma preparação de mistura incluindo um ou mais destes.

Noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos são administrados em combinação com uma sulfonilureia como seja glibenclamida, glipizida, tolbau-tamida, cloropamidem, tolazamida, glimeprida, glicazida e gliburida.

Noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos são administrados em combinação com uma biguanida, por exemplo metformina.

Ainda noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos são administrados em combinação com uma meglitinida, por exemplo, repaglinida ou nateglinida.

Ainda noutra forma de realização da invenção, os 25 ΡΕ1957484 presentes compostos são administrados em combinação com um sensibilizador da tiazolidinadiona insulina, por exemplo, troglitazona, ciglitazona, piolitazona, rosiglitazona, isaglitazona, darglitazona, englitazona, CS-011/CI-1037 ou T 174 ou os compostos referidos em WO 97/41097, WO 97/41119, WO 97/41120, WO 97/41121 e WO 97/41122 (Dr. Reddy's Research Foundation), os quais estão aqui neste documento incorporados por referência.

Ainda noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos são administrados em combinação com um sensibilizador da insulina, tais como por exemplo, GI 262570, YM-440, MCC-555, JTT-501, AR-H039242, KRP-297, GW-409544, CRE-16336, AR-H049020, LY510929, MBX-102, CLX-0940, GW-501516 ou os compostos referidos em WO 99/19313, WO 00/50414, WO 00/63191, WO 00/63192, WO 00/63193 como seja ragaglitazar (NN 622 ou (-)DRF 2725) (Dr. Reddy's Research Foundation) e WO 00/23425, WO 00/23415, WO 00/23451, WO 00/23445, WO 00/23417, WO 00/23416, WO 00/63153, WO 00/63196, WO 00/63209, WO 00/63190 e WO 00/63189 (Novo Nordisk A/S), os quais estão aqui neste documento incorporados por referência.

Ainda noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos são administrados em combinação com um inibidor da a-glucosidase, por exemplo, voglibose, emiglitato, miglitol ou acarbose.

Noutra forma de realização da invenção, os 26 ΡΕ1957484 presentes compostos são administrados em combinação com um agente actuando no canal de potássio dependente de ATP das células β, por exemplo, tolbutamida, glibenclamida, glipizida, glicazida, BTS-67582 ou repaglinida.

Ainda noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos são administrados em combinação com nateglidina.

Ainda noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos são administrados em combinação com um agente anti-lipidémico ou agente anti-hiperlipidémico, por exemplo colestiramina, colestipol, clofibrato, gemfibrozil, lovastatina, pravastatina, simvastatina, pitavastatina, rosuvastatina, probucol, dextrotiroxina, fenofibrato ou atorvastina.

Ainda noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos são administrados em combinação com compostos que diminuem o consumo de comida.

Ainda noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos são administrados em combinação com mais do que um dos compostos mencionados anteriormente, por exemplo em combinação com metformina e uma sulfonilureia como seja gliburida; uma sulfonilureia e acarbose; nate-glinida e metformina; repaglinida e metformina; acarbose e metformina; uma sulfonilureia, metformina e troglitazona; insulina e uma sulfonilureia; insulina e metformina; 27 ΡΕ1957484 insulina, metformina e uma sulfonilureia; insulina e tro-glitazona; insulina e lovastatina; etc.

Ainda noutra forma de realização da invenção, os presentes compostos podem ser administrados em combinação com um ou mais agentes anti-obesidade ou agentes reguladores de apetite.

Tais agentes podem ser seleccionados a partir de um grupo consistindo em agonistas de CART (transcripto regulado pela anfetamina ***a), antagonistas de NPY (neuropéptido Y), agonistas de MC4 (melanocortina 4), agonistas de MC3 (melanocortina 3), antagonistas de orexina, agonistas de TNF (factor de necrose tumoral), agonistas de CRF (factor de libertação de corticotropina), antagonistas de CRFBP (proteína de ligação ao factor de libertação de corticotropina), agonistas de urocortina, agonistas adrenérgicos de β3 como sejam CL-316243, AJ-9677, GW-0604, LY362884, LY377267 ou agonistas de AZ-40140 MSH (hormona de estimulação de melanocito), antagonistas de MCH (hormona de concentração de melanocito), agonistas de CCK (colecistocinina), inibidores da recaptação de serotonina como sejam fluoxetina, seroxate ou citalopram, inibidores da recaptação de serotonina e noradrenalina, compostos mistos de serotonina e noradrenérgicos, agonistas de 5HT (serotonina), agonistas de bombesina, antagonistas de galanina, hormona de crescimento, factores de crescimento como sejam a prolactina ou lactogene placental, compostos de libertação da hormona de crescimento, agonistas de TRH 28 ΡΕ1957484 (hormona de libertação de tireotropina), moduladores de UCP 2 ou 3 (proteína não acoplada 2 ou 3), agonistas de leptina, agonistas de DA (bromocriptina, doprexina), inibidores de lipase/amilase, moduladores de PPAR (receptor activado proliferador de peroxisoma), moduladores de RXR (receptor retinóide X), agonistas de TR β, inibidores de AGRP (proteína relacionada com Agouti), antagonistas da histamina H3, antagonistas de opióide (como seja naltrexona), exendin-4, GLP-1 e factor ciliar neurotrófico (como seja axoquina), antagonistas do receptor canabóide por exemplo CB-1 (como seja rimonabante). Noutra forma de realização o agente anti-obesidade é dexanfetamina ou anfetamina. Noutra forma de realização o agente anti-obesidade é leptina. Noutra forma de realização o agente anti-obesidade é fenfluramina ou exfenfluramina. Ainda noutra forma de realização o agente anti-obesidade é sibutramina. Ainda noutra forma de realização é orlistate. Ainda noutra forma de realização o agente anti-obesidade é mazindol ou fentermina. Ainda noutra forma de realização o agente anti-obesidade éfendimetrazina, dietilpropion, fluoxetina, bupropion, topiramate ou ecopipan.

Além disso os presentes compostos podem ser administrados em combinação com um ou mais agentes anti-hipertensão. Exemplos de agentes anti-hipertensão são bloqueadores β, como sejam alprenolol, atenolol, timolol, pindolol, propanolol e metoprolol, inibidores SCE (enzima de conversão da angiotensina) como sejam benazepril, captopril, enalapril, fosinopril, lisinopril, quinapril e 29 ΡΕ1957484 ramipril, bloqueadores do canal de cálcio como sejam nifedipina, felodipina, nicardipina, isradipina, nimodi-pina, diltiazem e verapamil e α-bloqueadores como sejam doxazosina, urapidil, prazosina e terazosina. Outras referências podem ser feitas a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995.

Os compostos da presente invenção podem ser administrados em combinação com inibidores FAS.

Os compostos da presente invenção podem também ser administrados em combinação com não acopladores químicos, hormona sensível ao inibidor lipase, imidazolinas, inibidores ΙΙ-β-hidroxiesteróide desidrogenase, activador da lipoproteína lipase, activadores AMPK, fármacos imunossupressores, nicotinamida, ASIS, anti-androgéneos ou inibidores da carbopeptidase.

Deve ser entendido que qualquer combinação adequada dos compostos de acordo com a invenção com dieta e/ou exercício, um ou mais dos compostos anteriormente mencionados é considerada estar dentro do âmbito da presente invenção.

Os termos gerais utilizados na descrição dos compostos, composições e métodos descritos aqui neste documento têm o seu significado usual. Ao longo da presente aplicação, os seguintes termos têm os significados indicados: 30 ΡΕ1957484 "GLP-1" significa péptido do tipo glucagon 1. O termo "receptor de glucagon" significa um ou mais receptores que interagem especificamente com glucagon para resultar num sinal biológico. O termo "receptor GLP-1" significa um ou mais receptores que interagem especifi-camente com péptido do tipo glucagon 1 para resultar num sinal biológico. O termo "antagonista do receptor de glucagon" significa um composto da presente invenção com a capacidade de bloquear a produção de cAMP em resposta a glucagon. O termo "agonista inversa do receptor de glucagon" significa um composto da presente invenção com a capacidade para inibir a actividade constitutiva do receptor de glucagon. compostos da presente invenção compostos da presente invenção. O termo antagonista "selectivo" ou agonista inverso significa um composto com maior afinidade para o receptor de glucagon quando comparado com a afinidade para o receptor GLP-1.

Nas fórmulas gerais do presente documento, os termos químicos gerais têm os seus significados usuais. Por exemplo: "Halogénio" ou "halo" significa fluoro, cloro, bromo e iodo. O termo "alquilo" a não ser que seja indicado de 31 ΡΕ1957484 outra forma, refere-se àqueles grupos alquilo com um número designado de átomos de carbono com uma configuração saturada tanto linear como ramificada. Como utilizado aqui neste documento, "(C1-C3)alquilo" são um até três átomos de carbono, como sejam metilo, etilo, propilo, n-propilo, isopropilo e semelhantes e suas formas ramificadas ou isoméricas e opcionalmente podem ser substituídas com um até três halogénios ou um número designado de substituintes como se apresentou nas formas de realização recitadas aqui neste documento. " (Ci—C6) alquilo" são um até seis átomos de carbono, como sejam metilo, etilo, propilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo e tert-butilo, pentilo, isopentilo, hexilo e semelhantes e suas formas ramificadas ou isoméricas e opcionalmente podem ser substituídas com um até três halogénios ou um número designado de substituintes como se apresentou nas formas de realização recitadas aqui neste documento. " (Ci-C8)alquilo" são um até oito átomos de carbono, como sejam metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo e semelhantes e suas formas ramificadas ou isoméricas e opcionalmente podem ser substituídas com um até três halogénios ou um número designado de substituintes como se apresentou nas formas de realização recitadas aqui neste documento. 0 termo "(C3-C7)cicloalquilo" refere-se a um carbociclo saturado contendo um ou mais anéis de desde 3 até 7 átomos de carbono. Exemplos de (C3-C7) cicloalquilo incluem, mas não estão limitados a ciclopropilo, 32 ΡΕ1957484 ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo e ciclo-heptilo. 0 termo " (C3-C6) cicloalquilo" refere-se a um carbociclo saturado contendo um ou mais anéis de desde 3 até 6 átomos de carbono. Exemplos de (C3—C6)cicloalquilo incluem, mas não estão limitados a ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo e ciclo-hexilo. 0 termo " (C1-C3) alcoxi" representa um grupo alquilo de um até três átomos de carbono ligados através de uma ponte por oxigénio, como sejam metoxi, etoxi, propoxi e semelhantes. 0 termo "(Ci—C6)alcoxi" representa um grupo alquilo de um até seis átomos de carbono ligados através de uma ponte por oxigénio, como sejam metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, tert-butoxi, pentoxi e semelhantes. 0 termo "(C1-C7)alcoxi" representa um grupo alquilo de um até sete átomos de carbono ligados através de uma ponte por oxigénio, como sejam metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, tert-butoxi, pentoxi e semelhantes e opcionalmente podem ser substituídas com três halogénios como se descreveu nas formas de realização apresentadas aqui neste documento . 0 termo "(C2-C7)alquenilo" significa uma cadeia hidrocarbonada de dois até sete átomos de carbono com uma configuração saturada tanto linear como ramificada, tendo pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono a qual pode ocorrer em qualquer ponto ao longo da cadeia como sejam etenilo, propenilo, butenilo, pentenilo, vinilo, alquilo, 2-butenilo e semelhantes e opcionalmente podem ser substi- 33 ΡΕ1957484 tuídas com três halogénios como se descreveu nas formas de realização apresentadas aqui neste documento. 0 termo "opcionalmente substituído" ou "substi-tuintes opcionais", como utilizado aqui neste documento significa que os grupos em questão tanto são não substituídos como substituídos com um ou mais dos substituintes especificados. Quando os grupos em questão são substutuídos com mais do que um substituinte, os substituintes podem ser o mesmo ou diferentes. Além disso, quando se utiliza os termos "independentemente", "são independentemente" e "independentemente, seleccionados entre" significa que os grupos em questão podem ser o mesmo ou diferentes. Certos termos dos definidos aqui neste documento podem ocorrer mais do que uma vez nas fórmulas estruturais e quando essa situação acontecer cada termo deverá ser definido independentemente do outro. 0 termo "doente" inclui animais humano e não humano, como sejam animais domésticos (cães, gatos e semelhantes) e gado. Gado são animais criados para produção de comida. São exemplos de gado, animais ruminantes ou "cud-chewing" como seja as vacas, touros, vitelas, novilhos, ovelhas, búfalos, bisontes, cabras e antílopes. Outros exemplos de gado incluem porcos e animais de aviário (aves domésticas) como sejam galinhas, patos, perus e gansos. Ainda outros exemplos de gado incluem peixes, marisco e crustáceos criados em aquacultura. Estão também incluídos animais exóticos utilizados na produção de comida 34 ΡΕ1957484 como sejam crocodilos, búfalos de água e ratites (e.g.., emus, ema ou ostras) . 0 doente a ser tratado é preferivelmente um mamífero em particular um ser humano. 0 termo "resposta celular mediada pelo receptor de glucagon" inclui várias respostas por células de mamíferos à estimulação de glucagon ou actividade do receptor de glucagon. Por exemplo, "respostas celulares mediada pelo receptor de glucagon" incluem, mas não estão limitadas a, libertação de glucagon do fígado ou outras células em resposta à estimulação de glucagon ou actividade do receptor de glucagon. Um vulgar especialista na técnica pode facilmente identificar outras respostas celulares mediadas pela actividade do receptor de glucagon, por exemplo, pela observação da alteração do ponto final da resposta celular depois do contacto da célula com uma dose efectiva de glucagon.

Os termos "tratamento", "tratar" e "tratamento" como utilizados aqui neste documento, incluem os seus significados geralmente aceites, i.e., a gestão e cuidado de um doente com o propósito de evitar, proibir, restringir, aliviar, melhorar, retardar, parar, atrasar ou reverter a progressão ou gravidade de uma doença, distúrbio ou condição patológica, aqui neste documento descrita, incluindo o alívio ou redução dos sintomas ou complicações ou a cura ou eliminação da doença, distúrbio ou condição.

Composição" significa uma composição farmacoló- 35 ΡΕ1957484 gica e pretende-se que inclua um produto farmacológico incluindo a(s) substância(s) activa(s) incluindo composto (s) de Fórmula I e substância(s) inerte (s) que constituem o excipiente. De acordo, as composições farmacológicas da presente invenção englobam qualquer composição preparada pela mistura de um composto da presente invenção e um excipiente farmacologicamente aceitável. 0 termo "solvente adequado" refere-se a qualquer solvente ou misturas de solventes, inertes ao procedimento da reacção que solubilize suficientemente os reagentes para se obter um meio dentro do qual se efectue a reacção desejada. 0 termo "forma de doseamento unitário" significa unidades fisicamente discretas adequadas como doseamentos unitários para sujeitos humanos e outros animais não humanos, contendo cada unidade uma quantidade pré determinada de material activo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com um excipiente farmacologicamente aceitável.

Os compostos da presente invenção podem ser quirais e entende-se que estão incluidos dentro do âmbito da invenção quaisquer enantiómeros, sejam puros, parcialmente purificados ou misturas racémicas. Além disso, podem ser formados diastereómeros quando está presente na molécula uma dupla ligação ou um sistema de anel total ou parcialmente saturado ou mais do que um centro de 36 ΡΕ1957484 assimetria ou uma ligação com rotabilidade restrita. Pretende-se que quaisquer diastereómeros, sejam separados, diastereómeros puros ou parcialmente puros ou suas misturas estejam incluídos dentro do âmbito da invenção. Além disso, alguns dos compostos da presente invenção podem existir em diferentes formas tautoméricas e pretende-se que quaisquer formas tautoméricas, que os compostos sejam capazes de formar, estejam incluídas dentro do âmbito da presente invenção. A invenção inclui também tautómeros, enantiómeros e outros estereoisómeros dos compostos de Fórmula I. Tais variações são contemplados para estar dentro do âmbito da invenção.

Quando os compostos de Fórmula I existem como uma mistura de diastereómeros, podem ser separados em pares de enantiómeros diasteroméricos por, por exemplo, cristalização fraccional a partir de um solvente adequado, por exemplo metanol ou acetato de etilo ou uma sua mistura. 0 par de enantiómeros assim obtidos pode ser separado em estereómeros individuais por meios convencionais, por exemplo, pela utilização de um ácido opticamente activo como um agente de resolução. Em alternativa, pode ser obtido qualquer enantiómero de um composto de Fórmula I por síntese estereoespecífica utilizando reagentes de partida opticamente puros ou reagentes de configuração conhecida ou através de síntese enantioselectiva. 0 termo "enriquecimento enantiomérico" como utilizado aqui neste documento refere-se a um aumento na 37 ΡΕ1957484 quantidade de um enantiómero quando comparado com o outro. Um método conveniente de expressar o enriquecimento enantiomérico é o conceito de excesso enantiomérico, ou "ee", o qual se encontra na seguinte equação: çc ~ES -E2 X 300 e - r

Em que E1 é a quantidade do primeiro enantiómero e E2 é a quantidade do segundo enantiómero. Assim, se a razão inicial dos dois enantiómeros é 50:50, tal como está presente numa mistura racémica e se consegue um enriquecimento enantiomérico suficiente para produzir uma razão final de 70:30, o ee respeitante ao primeiro enantiómero é 40 %. No entanto, se a razão final é de 90:10, o ee respeitante ao primeiro enantiómero é 80 %. É preferido um ee superior a 90 %, é o mais preferido um ee superior a 95 % e um ee superior a 99 % é o mais especialmente preferido. O enriquecimento enantiomérico é facilmente determinado por um vulgar especialista na técnica utilizando técnicas e procedimentos padrão, como sejam cromatografia gasosa ou liquida de alta precisão com coluna quiral. A escolha da coluna quiral apropriada, eluente e condições necessárias para efectuar a separação do par enantiomérico está bem dentro do conhecimento de um vulgar especialista na técnica. Adicionalmente, os estereoisómeros e enantiómeros específicos dos compostos de Fórmula I, podem ser preparados por um vulgar especialista na técnica utilizando técnicas e processos bem conhecidos, como aqueles 38 ΡΕ1957484 publicados por J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates and Resolutions" John Wiley and Sons, Inc., 1981 e E.L.Eliel and S.H. Wilen, "Stereochemistry of Orqanic Compounds" (Wiley-Interscience 1994) e Aplicação de Patente Europeia N° EP-A-838448, publicada em 29 de Abril de 1998. Exemplos de resoluções incluem técnicas de recristalização ou cromatografia quiral. A não ser que seja indicado em contrário, um composto indicado ser "isómero 1" será o primeiro isómero a eluir da coluna de separação quiral e "isómero 2" será o segundo.

Na generalidade, o termo "farmacológico" quando utilizado como um adjectivo, significa substancialmente não tóxico para organismos vivos. Por exemplo, o termo "sal farmacológico" como utilizado aqui neste documento, refere-se a sais de compostos de Fórmula I os quais são substancialmente não tóxico para organismos vivos. A presente invenção engloba também sais farmacologicamente aceitáveis dos presentes compostos. Sais farmacologicamente aceitáveis e a metodologia comum para os preparar são bem conhecidos na técnica. Ver e.g.., P. Stahl, et al., "Handbook Of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, " (VCHA/Wiley-VCH, 2002); Berge, S.M, Bighley, L.D., e Monkhouse, D.C., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sei., 66:1, 1977.

Os compostos de Fórmula I podem ser preparados por um vulgar especialista na técnica seguindo variados procedimentos, estando alguns dos quais ilustrados nos 39 ΡΕ1957484 procedimentos e esquemas apresentados em seguida. A ordem particular dos passos necessários para produzir os compostos de Fórmula I é dependente dos compostos particulares a serem sintetizados, dos compostos de partida e relativa caracteristica dos grupos substituintes. Os reagentes ou compostos de partida estão facilmente disponíveis a um vulgar especialista na técnica e no caso de não estarem disponíveis comercialmente, são facilmente sintetizados por um vulgar especialista na técnica seguindo procedimentos padrão comuns utilizados na técnica, em conjunto com os vários procedimentos e esquemas apresentados em seguida.

Os Esquemas, Preparações, Exemplos e Procedimentos seguintes são providenciados para melhor evidenciar a prática da presente invenção e não devem ser interpretados em nenhum modo como limitantes do âmbito da mesma. Aqueles especialistas na técnica irão reconhecer que podem ser realizadas várias modificações sem sair do espirito e âmbito da invenção. Todas as publicações mencionadas na especificação são indicadoras do nivel daquele especialista na técnica para o qual a invenção diz respeito. 0 tempo óptimo para realizar as reacções dos Esquemas, Preparações, Exemplos e Procedimentos pode ser determinado pela monitorização do progresso da reacção por técnicas convencionais de cromatografia. Além disso, é preferível conduzir as reacções da invenção sob uma atmosfera inerte, como seja por exemplo, árgon ou 40 ΡΕ1957484 particularmente azoto. A escolha do solvente geralmente não é crítica desde que o solvente escolhido seja inerte ao desenvolvimento da reacção e solubilize suficientemente os reagentes para a efectuação da reacção desejada. Os compostos são isolados e purificados preferivelmente antes da sua utilização nas reacções seguintes. Alguns compostos podem cristalizar da solução reaccional durante a sua formação e podem ser removidos por extracção, evaporação ou decantação. Os intermediários e produtos finais de Fórmula I podem ainda ser purificados, se desejado, por técnicas comuns como seja a recristalização ou cromatografia em suportes sólidos como seja a sílica gel ou alumina.

Os especialista na técnica irão apreciar que nem todos os substituintes sejam compatíveis com todas as condições reaccionais. Estes compostos podem ser protegidos ou modificados num ponto conveniente da síntese por métodos bem conhecidos na técnica.

Os termos e abreviaturas utilizados nos actuais Esquemas, Preparações, Exemplos e Procedimentos têm o seu significado normal a não ser que seja designado de outra forma. Por exemplo, como utilizado aqui neste documento, os seguintes termos têm os significados indicados: "psi" refere-se a libras por polegada quadrada; "min" refere-se a minutos; "h" ou "hr" refere-se a horas; "TLC" refere-se a cromatografia em camada fina; "HPLC" refere-se a cromatografia líquida de alta precisão; "Rf" refere-se a factor de retenção; "Rt" refere-se a tempo de retenção; "δ" 41 ΡΕ1957484 refere-se a partes por milhão a campo mais baixo a partir do tetrametilsilano; "MS" refere-se a espectrometria de massa; "EM(EP)" refere-se a espectrometria de massa de spray electrónico; "UV" refere-se a espectrometria de ultravioleta; nlH NMR" refere-se a espectrometria de ressonância magnética nuclear de protão. Adicionalmente, "TA" refere-se a temperatura ambiente; "DEAD" refere-se a dietilazodicarboxilato; "PPh3" refere-se a trifenilfosfina; "ADDP" refere-se a 1,1'-(azodicarbonil)dipiperidina; "Pbu3" refere-se a tributilfosfina; "OTF" refere-se a triflato; "LAH" refere-se a hidreto de alumínio e lítio; "dibal-h" refere-se a hidreto de diisobutilaluminio; "KOtBu" refere-se a tert-butoxido de potássio; "THF" refere-se a tetra-hidrofurano; "TBP" refere-se a tributilfosfina; "EDC1" refere-se a cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiamina; "DMAP" refere-se a dimetilaminopiridina; "HNMe(Ome) refere-se a Ν,Ν-dimetil-hidroxiamina; "CDMT" refere-se a 2-cloro-4,6-dimetoxi-[1,3,5]triazina; "NMM" refere-se a N-metilmorfolina; "DCM" refere-se a diclo-rometano; "DMSO" refere-se a dimetilsulfóxido; "Et3N" refere-se a trietilamina; "DMF" refere-se a dimetilfor-mamida; "PBr3" refere-se a tribrometo de fósforo; "Et" numa fórmula refere-se a etilo, por exemplo Et20 refere-se a éter dietílico e EtOAc refere-se a acetato de etilo; "PyBOP" refere-se a hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino fosfónio; "Me" refere-se a metilo como em MeOH o qual é metanol; "Pd/C" refere-se a 10 % de paládio em carbono. A não ser que seja indicado de outro modo, o isómero 1 refere-se ao primeiro isómero a ser eluido numa 42 ΡΕ1957484 separação quiral e o isómero 2 refere-se ao segundo isómero a ser eluido numa separação quiral.

ESQUEMAS GERAIS

Todos os compostos da presente invenção podem ser preparados quimicamente, por exemplo, pelas seguintes vias sintéticas apresentadas nos seguintes Esquemas e/ou nas Preparações e Exemplos. No entanto, a seguinte discussão não pretende ser limitante do âmbito da presente invenção em qualquer modo. Por exemplo, os passos sintéticos específicos para cada uma das vias descritas podem ser combinados em maneiras diferentes ou em conjunto com passos de esquemas diferentes, para preparar outros compostos de Fórmula I.

Esquema I

RsshwS

No Esquema I, Passo A, acoplou-se um 4-halofenol de fórmula (1), (X=l ou Br) com um ácido fenil borónico de 43 ΡΕ1957484 fórmula (2), utilizando uma reacção de Suzuki para providenciar um bifenil-hidroxi de fórmula (3). Será reconhecido por um especialista na técnica que tais acoplamentos de Suzuki utilizando haletos de arilo e ácidos fenil borónicos podem ser efectuados utilizando uma larga variedade de condições reaccionais. Condições preferidas utilizam oxidi-2,1-fenileno)bis(difenilfosfina) na presença de acetato de paládio e fluoreto de potássio num solvente inerte, como seja o tetra-hidrofurano. A reacção é aquecida à temperatura de 50°C para a temperatura de refluxo do solvente durante cerca de 4 até 48 horas sob atmosfera de azoto.

Em alternativa a reacção de Suzuki pode ser efectuada utilizando tetraquis(trifenilfosfina)paládio com fluoreto de potássio sob atmosfera de azoto. A reacção prossegue num solvente inerte, como seja o tolueno ou benzeno e água a uma temperatura de 40°C para a temperatura de refluxo do solvente durante cerca de 4 até 48 horas.

No Esquema I, Passo B, acoplou-se um bifenil-hidroxi de fórmula (3) com cloreto de dimetiltiocarbamoilo, sofre um rearranjo térmico e subsequente solvólise do intermediário éster dimetilico do ácido tiocarbâmico para se obter um tiol bifenilo de fórmula (4) . Conseguiu-se a reacção de acoplamento para se obter o tiocarbamato na presença de 4-dimetilaminapiridina com uma amina orgânica como seja a trietilamina ou diisopropiletilamina. Realizou- 44 ΡΕ1957484 se a reacção num solvente inerte, como seja o dioxano, tetra-hidrofurano, benzeno ou tolueno, sendo o dioxano o preferido à temperatura de 65°C para a temperatura de refluxo do solvente. O tiocarbamato resultante sofreu um rearranjo térmico em tetradecano a uma temperatura de 200 até 250°C, sendo a temperatura preferida cerca de 245°C para se obter um éster dimetilico do ácido tiocarbâmico. A solvólise com metoxido de sódio em metanol ou etoxido de sódio em etanol dá origem ao tiol bifenilo de fórmula (4).

Esquema II

45 ΡΕ1957484

No Esquema II, Passo A, alquilou-se um tiofeno 2-carboxilato de etilo de fórmula (5) com um aldeído (R3CH0) para se obter um álcool secundário de fórmula (6). Tratou-se um tiofeno 2-carboxilato de etilo de fórmula (5) com litio diisopropilamida a uma temperatura de -80 até -70°C e em seguida tratou-se com um aldeído num solvente inerte como seja o tetra-hidrofurano. Deixou-se a reacção aquecer para a temperatura ambiente ao longo de cerca de 12 até 24 horas e isolou-se o produto utilizando técnicas extractivas para se obter o álcool secundário de fórmula (6).

No Esquema II, Passo B, acoplou-se um álcool secundário de fórmula (6) com um 4-halotiofenol (X= Br ou I) de fórmula (7), para se obter um 4-halofenil tioéter de fórmula (8) . Efectuou-se o acoplamento com um ácido se Lewis, como seja iodeto de zinco (Znl2) num solvente inerte como seja o diclormetano ou dicloroetano a uma temperatura de 0 até 50°C sendo as condições preferidas dicloroetano à temperatura ambiente. Isolou-se o produto utilizando técnicas de extracção comuns para se obter o 4-halofenil tioéter de fórmula (8).

Em alternativa, pode-se realizar o acoplamento do álcool secundário com o tiofenol utilizando as condições de Mitsinobu. Para efectuar a transformação podem ser utilizados sistemas comuns de redox, conhecidos por aqueles especialistas na técnica, como sejam azodicarboxilato de -46 - ΡΕ1957484 dietilo (DEAD)/trifenilfosfina, N, N,N', N'-tetrametilazo-dicarboxamida (TMAD)/tributilfosfina ou 1,1'-(azodicarbo-nil)dipiperidina (ADDP)/tributilfosfina.

No Esquema II, Passo C, acoplou-se um 4-halofenil tioéter de fórmula (8) com um ácido fenil borónico de fórmula (2), numa reacção de Suzuki para providenciar um bifenil tioéter de fórmula (9), utilizando as condições descritas para o Esquema I, Passo A.

Em alternativa, no Esquema II, Passo D, acoplou-se um bifenil tiol de fórmula (3) utilizando as condições descritas para o Esquema II, Passo B para se obter um bifenil tioéter de fórmula (9).

No Esquema II, Passo E, hidrolizou-se o éster etilico do ácido tiofeno carboxílico de fórmula (9) para um ácido tiofeno carboxílico de fórmula (10). Hidrolizou-se o éster num solvente apropriado solúvel em água, como seja etanol, metanol, dioxano ou tetra-hidrofurano, sendo preferido o etanol. Tratou-se o éster com uma base inorgânica como seja o hidróxido de potássio ou sódio, sendo preferido o hidróxido de sódio, à temperatura ambiente para a temperatura de refluxo do solvente durante 2 até 48 horas. Isolou-se o ácido tiofeno carboxílico de fórmula (10) por neutralização com ácido clorídrico seguido por técnicas de extracção comuns. ΡΕ1957484 47

Esquema III

02)

ΪΓ\ N m

Passo 8

N-N m

No Esquema III, Passo A, acilou-se um ácido tiofeno carboxílico de fórmula (11) para se obter uma amida de fórmula (12) . Será reconhecido por um especialista na técnica que existem inúmeras condições para a formação da ligação amida entre um ácido carboxílico e uma amina. Tais métodos podem ser encontrados no texto de R.C. Larock em "Comprehensive Organic Transformations", VCH Publishers, 1989, p. 972-976. As condições preferidas utilizam uma quantidade catalítica de 4-dimetilaminapiridina (DMAP), cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiamina (EDCI) e uma base orgânica como seja a diisopropiletilamina ou trietilamina num solvente inerte como seja o diclorometano ou tetra-hidrofurano. Tratou-se o éster activo com cloridrato de aminoacetonitrilo à temperatura de 0 até à temperatura de refluxo do solvente, mas preferivelmente à temperatura ambiente durante cerca de 4 até 48 horas. 48 ΡΕ1957484

Em alternativa, no Esquema III, Passo A, outro conjunto de condições preferidas utiliza 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina para se formar o éster activo na presença de uma base orgânica como seja a N-metil morfolina num solvente inerte como seja o tetra-hidrofurano. Tratou-se o éster activo com cloridrato de aminoacetonitrilo à temperatura de 0 até 50°C durante 4 até 48 horas para se formar a amida de fórmula (12).

No Esquema III, Passo B, ciclizou-se uma amida de fórmula (12) para um tetrazole de fórmula (13). Será reconhecido por um especialista na técnica que reagentes úteis para formar tetrazoles a partir de nitrilos incluem azidotrimetilsilano, azidotributilestanho e azeto de sódio. As condições preferidas utilizam azeto de sódio na presença de um cloridrato de alquil amina como sejam cloridrato de trietilamina ou de diisopropiletilamina num solvente inerte como seja o tolueno, benzeno, dimetilformamida, tetra-hidrofurano ou dioxano. As condições preferidas utilizam tolueno à temperatura de 0 até à temperatura de refluxo do solvente durante um período de 4 até 48 horas. Isolou-se o produto por acidificação com ácido clorídrico e extracção num solvente apropriado, como seja acetato de etilo.

PREPARAÇÕES E EXEMPLOS

Os Exemplos providenciados aqui neste documento são ilustrativos da invenção reivindicada aqui neste documento e não têm a intenção de limitar o âmbito da invenção 49 ΡΕ1957484 reivindicada em qualquer maneira. Os nomes das preparações e exemplos são derivados utilizando ChemDraw.

Os espectros de 1HRMN foram registados num espectrómetro Varian 400 MHz à temperatura ambiente. Os dados são registados da seguinte maneira: desvio quimico em ppm a partir do padrão interno tetrametilsilano na (escala, multiplicidade (lg=largo, s=singuleto, d=dubleto, t=triple-to, q=quarteto, qn=quinteto e m=multipleto), integração, constante de acoplamento (Hz) e atribuição. 1HRMN indica que se conseguiu um espectro de RMN satisfatório para o composto descrito. Obtiveram-se dados de espectroscopia de massa monoisotópica num instrumento Agilent G1956B MSD quadrapolo único utilizando ionização de electropul-verização (IEP ou EP). Realizou-se cromatografia em camada fina analítica em placas EM Reagent 0,25 mm sílica gel 60-F. Conseguiu-se visualização com luz UV. Todos os exemplos são racémicos, a não ser que se diga em contrário.

Preparação 1 2,6-dimetil-4'-(trifluorometil)bifenil-4-ol

Adicionou-se 4-bromo-3,5-dimetilfenol (115,00 g, 571,96 mmol), ácido 4-(trifluorometil)fenil borónico (130,36 g, 686,35 mmol), (oxidi-2,1-fenileno)bis(difenil-fosfina) (126,00 g, 233,96 mmol), fluoreto de potássio (99,69 g, 1,72 mol) e Pd(OAc)2 (25,68 g, 114,39 mmol) para tetra-hidrofurano (3,0 L) espargido com azoto e aqueceu-se para a temperatura de refluxo. Monitorizou-se o consumo do 50 ΡΕ1957484 material de partida 4-bromo-3,5-dimetilfenol por GC. Manteve-se o refluxo até o 4-bromo-3,5-dimetilfenol se ter consumido e está geralmente completo ao fim de 18 h. Depois da reacção estar completa, arrefeceu-se a reacção para a temperatura de aproximadamente 25°C. Absorveu-se a mistura reaccional impura em silica (-500 g) e eluiu-se sobre silica (1,5 kg) com acetato de etilo a 10% em heptano para se obter o produto como um sólido (132,9 g, 87,3 %) .

Cristalizou-se o produto de heptano (23 L/kg) e isopropanol (0,4 L/kg) para se obter o composto em titulo (119,5 g; rendimento 78,5 %) como um sólido esbranquiçado. EM(EP): 265,21 [M-l]~. RMN (400 MHz, CDC13) : δ 7,68 (d, 2H), 7,26 (d, 2H), 6,62 (s, 2H), 4,73 (s, 1H), 1,97 (s, 6H).

Preparação 2 4'-tert-butil-2,6-dimetilbifenil-4-ol

Preparou-se o composto em titulo essencialmente seguindo o procedimento como descrito na Preparação 1, utilizando ácido 4-tert-butilfenilborónico.

Preparação 3 Éster etílico do ácido (R,S)-5-(l-hidroxi-3-metil-butil)- tiofeno-2-carboxílico

Arrefeceu-se para a temperatura de -78°C uma solução de diisopropilamina (8,55 mL, 60 mmol) em THF (350 mL) sob atmosfera de N2 e tratou-se com n-butillítio (2,5 M 51 ΡΕ1957484 em hexanos, 24 mL). Em seguida aqueceu-se a mistura para a temperatura de 0°C durante 10 min, arrefeceu-se de volta para a temperatura de -78°C, tratou-se gotejando uma solução de éster etilico do ácido tiofeno-2-carboxílico (7,8 g, 50 mmol) em THF (150 mL) e agitou-se durante 5 min. Em seguida adicionou-se 3-metil-butiraldeído (6,48 mL, 60 mmol) e deixou-se a reacção aquecer para a temperatura ambiente enquanto se agitou durante a noite. Adicionou-se tampão aquoso (pH=7) e extraiu-se o produto com acetato de etilo (3x). Secaram-se as fases orgânicas combinadas, filtrou-se e concentrou-se. Aplicou-se o resíduo resultante em sílica gel e eluiu-se utilizando hexanos com um gradiente de acetato de etilo desde 0 % até 60 % para se obter o composto em título (8,03 g) .

Preparações de 4 a 9 são preparadas de uma maneira substancialmente semelhante como descrito na Preparação 3.

Preparação 4 Éster etílico do ácido (R,S)-5-(1-hidroxi-propil)-tiofeno-2-carboxílico

Preparação 5 Éster etílico do ácido (R,S)-5-(1-hidroxi-butil)-tiofeno-2-carboxílico 52 ΡΕ1957484

Preparação 6 Éster etílico do ácido (R,S)-5-(1-hidroxi-pentil)-tiofeno-2-carboxílico

Preparação 7 Éster etílico do ácido (R,S)-5-(l-hidroxi-2,2-dimetil-propil)-tiofeno-2-carboxílico

Preparação 8 Éster etílico do ácido (R,S)-5-(l-hidroxi-2-metil-propil)- tiofeno-2-carboxílico

Preparação 9 Éster etílico do ácido (R,S)-5-(l-hidroxi-3,3-dimetil-butil)-tiofeno-2-carboxílico

Preparação 10 4'-tert-Butil-2,6-dimetilbifenil-4-tiol

Passo A. Éster 0-(4'-tert-butil-2,6-dimetilbifenil-4-ílico) do ácido dimetil-tiocarbâmico

Adicionou-se 4-dimetilaminapiridina (476 mg, 3,9 mmol), trietilamina (10 mL, 78,6 mmol) e cloreto de dimetiltiocarbamoilo (6,1 g, 49,1 mmol) para uma solução de 53 ΡΕ1957484 4'-tert-Butil-2,6-dimetilbifenil-4-ol (10 g, 37,3 mmol) em dioxano (157 mL) . Aqueceu-se a mistura reaccional para a temperatura de refluxo durante a noite. Depois de arrefecer para a temperatura ambiente, fraccionou-se a mistura reaccional entre acetato de etilo e água. Voltou-se a extrair a fase aquosa com acetato de etilo, secaram-se as fases orgânicas combinadas e concentrou-se. Aplicou-se o residuo resultante em silica gel e eluiu-se utilizando acetato de etilo 20 % em hexanos para se obter éster 0-(4'-tert-butil-2,6-dimetilbifenil-4-ilico) do ácido dimetil-tiocarbâmico (12,2 g).

Passo B. Éster S-(4'-tert-butil-2,6-dimetilbifenil-4-ílico) do ácido dimetil-tiocarbâmico

Aqueceu-se à temperatura de 245°C durante 16h uma suspensão de éster O-(4'-tert-butil-2,6-dimetilbifenil-4-ilico) do ácido dimetil-tiocarbâmico em tetradecano (80 mL) . Depois de arrefecimento para a temperatura ambiente filtrou-se um precipitado sólido, lavou-se com heptano e secou-se sob vácuo à temperatura de 40°C. Aplicou-se o residuo resultante em silica gel e eluiu-se utilizando hexanos com gradiente de acetato de etilo desde 0 % até 60 % para se obter éster S-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-ílico) do ácido dimetil-tiocarbâmico (8,86 g) .

Passo C. 4'-tert-Butil-2,6-dimetilbifenil-4-tiol

Adicionou-se metoxido de sódio (1,39 g, 25,8 mmol) para uma solução de éster S-(4'-tert-butil-2,6- 54 ΡΕ1957484 dimetil-bifenil-4-ílico) do ácido dimetil-tiocarbâmico em metanol (65 mL). Aqueceu-se a mistura reaccional para a temperatura de refluxo durante a noite. Depois de arrefecer para a temperatura ambiente, neutralizou-se a mistura reaccional com HC1 5N, concentrou-se para 1/3 do volume, tratou-se com solução aquosa saturada de cloreto de sódio e extraiu-se com diclorometano. Voltou-se a extrair a fase aquosa com diclorometano, secaram-se as fases orgânicas combinadas e concentrou-se. Aplicou-se o resíduo resultante em silica gel e eluiu-se utilizando hexanos com gradiente de acetato de etilo desde 0 % até 50 % para se obter o composto em titulo (5,84 g).

Preparação 11 2,6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-tiol

Preparou-se o composto em titulo de uma maneira substancialmente semelhante à descrita na Preparação 10 utilizando 2, 6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-ol. EM (EP): 281,1 [M-H]-.

Exemplo 1 (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (R,S)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-2-metil-propil]- tiofeno-2-carboxílico

55 ΡΕ1957484

Passo A. Éster etílico do ácido (R,S)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-2-metil-propil]-tiofeno-2-carboxílico

Tratou-se uma solução de éster etílico do ácido (R,S)-5- (l-hidroxi-2-metil-propil)-tiofeno-2-carboxílico (1,26 g, 5,52 mmol) e tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-tiol (1,64 g, 6,07 mmol) em 1,2-dicloroetano (22 mL) com iodeto de zinco (1,76 g, 5,52 mmol) e agitou-se durante a noite à temperatura ambiente. Em seguida fraccionou-se a mistura reaccional entre água e dicloromentano. Voltou-se a extrair a fase aquosa com diclorometano, secaram-se as fases orgânicas combinadas, filtrou-se e concentrou-se. Aplicou-se o resíduo resultante em sílica gel e eluiu-se utilizando hexanos com gradiente de acetato de etilo desde 0 % até 40 % para se obter éster etílico do ácido (R,S)-5-[1-(4'-tert-butil-2, 6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-2-metil-propil]-tiofeno-2-carboxílico (2,08 g) . EM (EP): 481,1 [M+H] + .

Passo B. Ácido (R, S)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bife-nil-4-il-sulfanil)-2-metil-propil]-tiofeno-2-carboxílico

Adicionou-se hidróxido de sódio (solução aquosa 5N, 4,33 mL) para uma mistura de éster etílico do ácido (R,S)-5-[1-(4'-tert-butil-2, 6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-2-metil-propil]-tiofeno-2-carboxílico (2,08 g, 4,33 mmol) em etanol (43 mL) à temperatura ambiente e 56 ΡΕ1957484 agitou-se durante a noite. Acidificou-se a mistura com HC1 IN (4,42 mL), extraiu-se para acetato de etilo, secou-se e concentrou-se, em seguida secou-se sob vácuo para se obter ácido (R,S)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-2-metil-propil]-tiofeno-2-carboxílico (1,82 g). EM (EP): 451,2 [M-H]

Passo C. Cianometil-amida do ácido (R,S)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-2-metil-propil]-tiofeno-2-carboxilico

Adicionou-se cloridrato de N-(3-dimetilamino-propil)-N'-etilcarbodiimina (290 mg, 1,512 mmol), hidrato de 1-hidroxibenzotriazole (123 mg, 0,907 mmol) e diisopro-piletilamina (0,264 mL, 1,512 mmol) para uma mistura de ácido (R,S)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-2-metil-propil]-tiofeno-2-carboxílico (342 mg, 0, 756 mmol) em DMF (7,6 mL) à temperatura ambiente e agitou-se durante 10 min. Em seguida tratou-se a mistura com cloridrato de aminoacetonitrilo (84 mg, 0,907 mmol) e agitou-se durante a noite. Tratou-se a mistura reaccional com HC1 0,1 N e extraiu-se para acetato de etilo duas vezes. Lavaram-se as fases orgânicas combinadas com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secaram-se, concentraram-se e aplicou-se o resíduo resultante em sílica gel e eluiu-se utilizando hexanos com gradiente de acetato de etilo desde 0 % até 70 % para se obter cianometil-amida do ácido (R,S)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il- 57 ΡΕ1957484 sulfanil)-2-metil-propil]-tiofeno-2-carboxílico (289 mg). EM (EP) : 491,1 [M+H]+.

Passo D. (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (R,S)-5-[l-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-2-metil-propil] -tiofeno-2-carboxílico

Tratou-se uma solução de cianometil-amida do ácido (R, S)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-2-metil-propil]-tiofeno-2-carboxílico (195 mg, 0,397 mmol) em tolueno (8 mL) com cloridrato de trietil-amina (275 mg, 2 mmol) e azeto de sódio (130 mg, 2 mmol), em seguida aqueceu-se à temperatura de refluxo durante a noite (condições térmicas) ou em alternativa colocou-se num reactor de microondas CEM durante 20 minutos (300 W, 180°C, arrefecimento a N2) (condições de microondas). Depois de arrefecimento para a temperatura ambiente, fraccionou-se a mistura reaccional entre acetato de etilo e água. Voltou-se a extrair a fase aguosa com acetato de etilo, secaram-se as fases orgânicas combinadas e concentrou-se; carregou-se o resíduo resultante numa Ci8 e eluiu-se utilizando água com um gradiente de acetato de etilo desde 15 % até 100 % para se obter o composto em título (91 mg). EM (EP) : 534,2 [M+H]+.

Exemplos de 2 a 7 são preparadas de uma maneira substancialmente semelhante utilizando as condições térmicas como descrito no Exemplo 1, Passo D. ΡΕ1957484 58

Exemplo 2 (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-propil]-tiofeno-2- carboxílico

EM (EP): 520,3 [M+H]+.

Exemplo 3 (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-butil]-tiofeno-2- carboxílico

r V. EM (EP): 534,3 [M+H]+.

Exemplo 4 (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-pentil]-tiofeno-2-carboxilico 59 ΡΕ1957484

Íf%H Η*. ΝΗ EM (ΕΡ): 548,3 [Μ+Η]+.

Exemplo 5 (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-3-metil-butil]- tiofeno-2-carboxílico

EM (EP): 548,0 [M+H]+.

Exemplo 6 (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-3,3-dimetil-butil]-tiofeno-2-carboxílico

EM (EP): 562,0 [M+H]+. 60 ΡΕ1957484

Exemplo 7 (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-2,2-dimetil-propil]-tiofeno-2-carboxílico

EM (EP): 548,3 [M+H]+.

Exemplos de 8 a 13 são preparadas de uma maneira substancialmente semelhante utilizando as condições de microondas como descrito no Exemplo 1, Passo D.

Exemplo 8 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)—5—[1—(2,6— dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-butil]- tiofeno-2-carboxílico

EM (EP): 546,0 [M+H]+. ΡΕ1957484 61

Exemplo 9 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)-5-[1-(2,6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-2-metil propil]-tiofeno-2-carboxílico

Exemplo 10 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)-5-[1-(2,6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-2,2-dimetil-propil]-tiofeno-2-carboxilico

EM (EP) : 560, 0 [M+H] + .

Exemplo 11 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)—5—[1—(2,6— dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-3-metil butil]-tiofeno-2-carboxilico

EM (EP): 560,0 [M+H]+. 62 ΡΕ1957484

Exemplo 12 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)—5—[1—(2,6— dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-3,3-dimetil-butil]-tiofeno-2-carboxílico

EM (EP): 574,0 [M+H]+.

Exemplo 13 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)—5—[1—(2,6— dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-pentil]- tiofeno-2-carboxílico

EM (EP): 560,0 [M+H]+.

Exemplo 14 (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil -bifenil-4-il-sulfanil)-2,2-dimetil-propil]-tiofeno-2-carboxílico (Isómero 1) 63 ΡΕ1957484

Passo A. Cianometil-amida do ácido 5-[l-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-2,2-dimetil-propil]-tiofeno-2-carboxílico (Isómero 1)

Separou-se a cianometil-amida do ácido (±)—5—[1— (4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-2,2-dimetil-propil]-tiofeno-2-carboxilico (500 mg) por HPLC quiral (coluna Chiralpak AD 4,6 x 150 mm; eluente: 15/85 3a etanol/heptano com 12 % de dimetiletilamina; velocidade de fluxo 0,6 mL/min; comprimento de onda de absorvância no UV: 300 nm) para se obter cianometil-amida do ácido 5—[l—(4'— tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-2,2-dimetil-propil] -tiofeno-2-carboxílico (Isómero 1) (220 mg).

Passo B. Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1—(4'-tert-butil-2, 6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-2,2-dimetil-propil] -tiof eno-2-carboxilico (2H-(Isómero 1)

Tratou-se uma solução de cianometil-amida do ácido 5-[1-(4'-tert-butil-2, 6-dimetil-bifenil-4-il-sulfa-nil)-2,2-dimetil-propil]-tiofeno-2-carboxílico (Isómero 1) (220 mg, 0,436 mmol) em tolueno (8,7 mL) com cloridrato de 64 ΡΕ1957484 trietilamina (300 mg, 2,18 mmol) e azeto de sódio (142 mg, 2,18 mmol), em seguida aqueceu-se para a temperatura de refluxo durante a noite (condições térmicas) ou em alternativa, colocou-se num reactor de microondas CEM durante 20 minutos (300 W, 180°C, arrefecimento a N2) (condições de microondas). Depois de arrefecimento para a temperatura ambiente, fraccionou-se a mistura reaccional entre acetato de etilo e água. Voltou-se a extrair a fase aquosa com acetato de etilo, secaram-se as fases orgânicas combinadas e concentrou-se para se obter o composto em titulo (105 mg). EM (EP): 548,3 [M+H]+.

Exemplos de 15 a 17 são preparadas de uma maneira substancialmente semelhante utilizando as condições térmicas como descrito no Exemplo 14, Passo B.

Exemplo 15

Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5—[1—(4'-tert-butil-2,6-dimetil -bifenil-4-il-sulfanil)-2,2-dimetil-propil]-tiofeno-2-carboxílico (2H-(Isómero 2)

EM (EP): 548, 3 [M+H]+ . 65 ΡΕ1957484

Exemplo 16 (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-propil]-tiofeno-2-carboxílico (Isómero 1)

Quiral

EM (EP) : 519, 8 [M+H]+ .

Exemplo 17 (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-propil]-tiofeno-2-carboxilico (isómero 2)

EM (EP): 520,3 [M+H]+.

Exemplos de 18 a 29 são preparadas de uma maneira substancialmente semelhante utilizando as condições de microondas como descrito no Exemplo 14, Passo B. 66 ΡΕ1957484

Exemplo 18 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(2,6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-butil]-tiofeno-2- carboxílico (Isómero 1)

p

zU m Ή EM (EP): 546,0 [M+H]+.

Exemplo 19 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5—[1—(2,6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-butil]-tiofeno-2- carboxílico (Isómero 2)

EM (EP): 546,0 [M+H]+.

Exemplo 20 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(2,6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-2-metil-propil]-tiofeno-2-carboxílico (Isómero 1) 67 ΡΕ1957484

F,C

EM (EP) : 546,0 [M+H]+ .

Exemplo 21 (lH-Ttetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(2,6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-2-metil-propil]-tiofeno-2-carboxílico (Isómero 2)

EM (EP): 546,0 [M+H] + .

Exemplo 22 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(2,6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-2,2-dimetil-propil]-tiofeno-2-carboxílico (Isómero 1)

EM (EP): 559,8 [M+H]+. ΡΕ1957484 68

Exemplo 23 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(2,6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-2-metil-propil]-tiofeno-2-carboxílico (Isómero 2)

EM (EP): 559,8 [M+H]+.

Exemplo 24 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(2,6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-3-metil-butil]-tiofeno-2-carboxílico (Isómero 1)

EM (EP) : 560, 0 [M+H] + .

Exemplo 25 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(2,6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-3-metil-butil]-tiofeno-2-carboxílico (Isómero 2) 69 ΡΕ1957484

EM (EP): 560,0 [M+H]+.

Exemplo 26 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(2,6-dimetil 4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-3,3-dimetil-butil]-tiofeno-2-carboxílico (Isómero 1)

EM (EP): 573,8 [M+H]+.

Exemplo 27 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(2,6-dimetil 4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-3,3-dimetil-butil]-tiofeno-2-carboxílico (Isómero 2)

EM (EP): 573,8 [M+H]+. ΡΕ1957484 70

Exemplo 28 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(2,6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-pentil]-tiofeno-2- carboxílico (Isómero 1)

EM (EP): 559,8 [M+H]+.

Exemplo 29 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(2,6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-pentil]-tiofeno-2- carboxílico (Isómero 2)

EM (EP): 559,8 [M+H]+. 0 composto de Fórmula I é formulado preferivelmente numa forma de dose unitária antes da administração. Portanto, ainda outra forma de realização da presente invenção é uma composição farmacológica incluindo um composto de Fórmula I e um ou mais transportadores, diluentes ou excipientes farmacologicamente aceitáveis. Numa tal 71 ΡΕ1957484 forma, a preparação é subdividida em doses unitárias dimensionadas de forma adequada contendo quantidades apropriadas dos componentes activos, e.g.., uma quantidade efectiva para alcançar o propósito desejado. Tais composições farmacológicas e processos para preparação das mesmas são bem conhecidas na técnica. Ver. P.ex., REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, et al. , eds., 19th ed., Mack Publishing Co., 1995). Assim, a dosagem particular de um composto de fórmula (I) ou um seu sal farmacologicamente aceitável necessária para constituir uma quantidade efectiva de acordo com esta invenção irá depender das circunstâncias particulares das condições a serem tratadas. Preferivelmente o composto é administrado oralmente. A quantidade da composição activa da invenção numa dose unitária da preparação pode ser geralmente variada ou ajustada desde cerca de 0,01 miligramas até cerca de 1.000 miligramas, preferivelmente desde cerca de 0,01 miligramas até cerca de 950 miligramas, mais preferivelmente desde cerca de 0,01 miligramas até cerca de 500 miligramas e tipicamente desde cerca de 1 miligramas até cerca de 250 miligramas, de acordo com a aplicação em particular. A dosagem actual utilizada pode ser variada dependendo da idade, sexo e peso do doente e da gravidade da condição a ser tratada. Tais técnicas são bem conhecidas daqueles especialistas na técnica. Geralmente, a forma de doseamento oral de humano contendo as substâncias activas pode ser administrada 1 ou 2 vezes por dia. Considerações como sejam o doseamento, vias de administração e frequência de doseamento são decididas da melhor forma pelo médico assistente. 72 ΡΕ1957484

As composições da invenção podem ser formuladas de modo a providenciar libertação rápida, sustentada ou retardada da substância activa depois da administração ao adoente. As composições da presente invenção podem ser formuladas numa forma de libertação sustentada para providenciar a velocidade de libertação controlada de qualquer do ou demais componentes ou substâncias activas para optimizar os efeitos terapêuticos, i.e., a actividade antagonista do receptor de glucagon e semelhante. Formas de doseamento adequado para a libertação sustentada incluem comprimidos em camadas contendo camadas de variadas velocidades de desintegração ou matrizes poliméricas de libertação controlada impregnadas com os componentes activos e moldados na forma de comprimidos ou cápsulas contendo tais matrizes poliméricas porosas impregnadas ou encapsuladas.

Existe uma evidência aumentada de que o glucagon tem um papel importante na homeostase da glucose. Os compostos de Fórmula I são eficientes como antagonistas ou agonistas inversos do receptor de glucagon, e portanto inibem a actividade do receptor de glucagon. Mais particularmente, estes compostos são antagonistas ou agonistas inversos selectivos do receptor de glucagon. Como antagonistas ou agonistas inversos selectivos, os compostos de Fórmula I são úteis no tratamento de doenças, distúrbios ou condições sensíveis à inactivação do receptor de glucagon, incluindo mas não limitado a diabetes e outros distúrbios relacionados com o glucagon. Espera-se que antagonistas ou 73 ΡΕ1957484 agonistas inversos selectivos do receptor de glucagon baixem os níveis de glucose no plasma e por isso evitem ou tratem a diabetes e outros distúrbios metabólicos relacionados com o glucagon.

MÉTODOS FARMACOLÓGICOS

Na seguinte secção são descritos ensaios de ligação bem como ensaios funcionais úteis para avaliar a eficiência dos compostos da invenção. A ligação dos compostos ao receptor de glucagon pode ser determinada num ensaio de competição de ligação utilizando o receptor de glucagon de humano clonado e selectividade contra o receptor hGlpl. 0 antagonismo pode ser determinado como a capacidade dos compostos de inibir a quantidade de cAMP formada no ensaio na presença de glucagon 5 nM.

Ensaio de Ligação ao Receptor de glucagon (hGlucR) 0 ensaio de ligação utiliza receptor de glucagon de humano clonado (Lok S, Kuijper JL, Jelinek LJ, Kramer JM, Whitmore TE, Sprecher CA, Mathewes S, Grant FJ, Biggs SH, Rosenberg GB et al., Gene 140 (2), 203-209 (1994)) isolado de membranas 293HEK. O cDNA de hGlucR é subclonado no plasmídeo de expressão phD (Expressão transactivada do recombinante de humano da proteína C completamente gama carboxilada, um factor anti-trombótico. Grinnell, B.W., Berg, D.T., Walls, J. e Yan, S.B. Bio/Technology 5: 1189-1192 (1987)). Este plasmídeo DNA é transfectado em células 293 HEK e seleccionado com Higromicina 200 pg/mL. 74 ΡΕ1957484

Prepararam-se as membranas de plasma brutas utilizando células de uma cultura em suspensão. Lisaram-se as células em gelo em tampão hipotónico contendo 25 mM de Tris HCL, pH 7,5, MgCl2 1 mM, DNAsel, 20 u/mL e Inibidores Completos-sem EDTA Roche. Homogeneizou-se a suspensão de células com um homogeneizador "dounce" de vidro utilizando um pistão de teflon para 25 pancadas. Centrifugou-se o homogenato à temperatura de 4°C à velocidade de 1800 x g durante 15 min. Recolheu-se o sobrenadante e voltou-se a suspender o sedimento num tampão hipotónico e voltou-se a homogeneizar. Centrifugou-se a mistura à velocidade de 1800 x g durante 15 min. Combinou-se o segundo sobrenadante com o primeiro sobrenadante. Centrifugaram-se os sobrenadantes combinados à velocidade de 1800 x g durante 15 min para clarificar. Transferiu-se o sobrenadante clarificado para tubos de alta velocidade e centrifugou-se à velocidade de 25000 x g durante 30 minutos à temperatura de 4°C. Voltou-se a suspender o sedimento de membrana num tampão de homogeneização e armazenou-se como aliquotas congeladas num congelador à temperatura de -80°C até serem utilizadas.

Radioinodizou-se o glucagon pelo procedimento I-125-lactoperoxidase e purificou-se por HPLC de fase reversa num Perkin-Elmer/NEN (NEX207). A actividade especifica é 2200 Ci/mmol. Realizou-se a determinação de Kd por competição homóloga em vez de ligação saturada devido ao elevado conteúdo em propanol no material glucagon 1-125. Estimou-se o valor de 3 nM para Kd e utilizou-se para calcular valores de Ki para todos os compostos testados. 75 ΡΕ1957484

Realizaram-se os ensaios de ligação utilizando um Ensaio de Proximidade de Cintilação (Amersham) com esferas WGA bloqueadas previamente com 1 % de BSA livre de ácido gordo (ICN) . 0 tampão de ligação contém HEPES 25 mM, pH 7,4, 2,5 mM CaCl2, MgCl2 1 mM, 1 % de BSA livre de ácido gordo (ICN), 0,003 % tween-20 e Inibidores Completos Roche sem EDTA. Dissolveu-se glucagon em HC1 0,01 N a 1 mg/mL e congelou-se imediatamente à temperatura de -80°C em aliquotas de 30 pL. Diluiu-se a aliquota de glucagon e utilizou-se em ensaios de ligação dentro de uma hora. Dissolveram-se os compostos em teste em DMSO e diluiram-se em série em MSO. Transferiram-se 10 μΐ de compostos diluídos ou DMSO para placas de ensaio de fundo opaco claro Corning 3632 contendo 90 pL de tampão de ligação de ensaio ou glucagon gelado (NSB a 1 μΜ final). Adicionaram-se 50 pL de glucagon 1-125 (0,15 nM final na reacção), 50 pL de membranas (300 pg/poço) e 40 pL de esferas WGA (150 mgs/poço), cobriram-se e misturaram-se topo com topo. Leram-se as placas com um Microbeta depois de 14 horas de tempo de repouso à temperatura ambiente.

Calcularam-se os resultados como uma percentagem de ligação específica de glucagon 1-125 na presença de composto. A dose de composto absoluta EC50 é derivada por regressão não linear da percentagem de ligação específica de glucagon 1-125 vs a dose de composto adicionada. Converteu-se a dose EC50 para Ki utilizando a equação Cheng-Prusoff (Cheng Y., Prusoff W.H ., Biochem. Pharmocol. 22, 3099-3108, 1973). 76 ΡΕ1957484

Ensaio de Ligação do Receptor Péptido - Tipo - Glucagon (Glpl-R) 0 ensaio de ligação utiliza receptor péptido do tipo glucagon de humano clonado (hGlpl-R) (Graziano MP, Hey PJ, Borkowski D, Chicchi GG, Strader CD, Biochem Biophys Res Commun. 1993 Oct 15; 196(1):141-6) isolado de membranas 293HEK. 0 hGlpl-R cDNA é subclonado no plasmideo de expressão phD (Expressão transactivada do recombinante de proteína C de humano completamente gama carboxilada, um factor anti-trombótico. Grinnell, B.W., Berg, D.T., Walls, J. e Yan, S.B. Bio/Technology 5: 1189-1192 (1987)). Este plasmideo DNA é transfectado em células 293 HEK e selec-cionado com Higromicina 200 μg/mL.

Prepararam-se as membranas de plasma brutas utilizando células de uma cultura em suspensão. Lisaram-se as células em gelo em tampão hipotónico contendo 25 mM de Tris HCL, pH 7,5, MgCl2 1 mM, DNAse, 20 μ/mL e Inibidores Completos sem EDTA Roche. Homogeneizou-se a suspensão de células com um homogeneizador "dounce" de vidro utilizando um pistão de teflon para 25 pancadas. Centrifugou-se o homogenato à temperatura de 4°C à velocidade de 1800 x g durante 15 min. Recolheu-se o sobrenadante e voltou-se a suspender o sedimento num tampão hipotónico e voltou-se a homogeneizar. Centrifugou-se a mistura à velocidade de 1800 x g durante 15 min. Combinou-se o segundo sobrenadante com o primeiro sobrenadante. Centrifugaram-se os sobrenadantes 77 ΡΕ1957484 combinados à velocidade de 1800 x g durante 15 min para clarificar. Transferiu-se o sobrenadante clarificado para tubos de alta velocidade e centrifugou-se à velocidade de 25000 x g durante 30 minutos à temperatura de 4°C. Voltou-se a suspender o sedimento de membrana num tampão de homogeneização e armazenou-se como alíquotas congeladas num congelador à temperatura de -80°C até serem utilizadas.

Radioiodou-se o péptido do tipo glucagon 1/Glp-l) pelo procedimento Ι-125-lactoperoxidase e purificou-se por HPLC de fase reversa num Perkin-Elmer/NEN (NEX207). A actividade especifica é 2200 Ci/mmol. Realizou-se a determinação de Kd por competição homóloga em vez de ligação saturada devido ao elevado conteúdo em propanol no material 1-125 Glp-1. Estimou-se o valor de 3 nM para Kd e utilizou-se para calcular valores de Ki para todos os compostos testados.

Realizaram-se os ensaios de ligação utilizando um Ensaio de Proximidade de Cintilação (Amersham) com esferas aglutinina de germe de trigo (WGA) bloqueadas previamente com 1 % de BSA livre de ácido gordo (ICN) . O tampão de ligação contém HEPES 25 mM, pH 7,4, 2,5 mM CaCl2, MgCl2 1 mM, 1 % de BSA livre de ácido gordo (ICN), 0,003 % tween-20 e Inibidores Completos Roche sem EDTA. Dissolveu-se péptido do tipo glucagon em PBS a 1 mg/mL e congelou-se imediatamente à temperatura de -80°C em aliquotas de 30 pL. Diluiu-se a aliquota de péptido do tipo glucagon e utili- 78 ΡΕ1957484 zou-se em ensaios de ligação dentro de uma hora. Dissolveram-se os compostos em teste em DMSO e diluiram-se em série em MSO. Transferiram-se 10 μΐ de compostos diluídos ou DMSO para placas de ensaio de fundo opaco claro Corning 3632 contendo 90 μί de tampão de ligação de ensaio ou péptido do tipo glucagon 1 gelado (NSB a 1 μΜ final) . Adicionaram-se 50 μί de péptido do tipo glucagon 1 1-125 (0,15 nM final na reacção), 50 μΙ. de membranas (600 μg/poço) e 40 μί de esferas WGA (150 μgs/poço), cobriram-se e misturaram-se topo com topo. Leram-se as placas com um Microbeta depois de 14 horas de tempo de repouso à temperatura ambiente.

Calcularam-se os resultados como uma percentagem de ligação específica do péptido do tipo glucagon 1 1-125 na presença de composto. A dose de composto absoluta EC50 é derivada por regressão não linear da percentagem de ligação específica do péptido do tipo glucagon 1-125 vs a dose de composto adicionada. Converteu-se a dose EC50 para Ki utilizando a equação Cheng-Prusoff (Cheng Y., Prusoff W.H., Biochem. Pharmocol. 22_, 3099-3108, 1973).

Ensaio Antagonista Funcional do cAMP Estimulado pelo Glucagon O ensaio funcional cAMP utiliza a mesma linha celular isolada do receptor de glucagon de humano clonado para o ensaio de ligação do hGlucR descrito anteriormente. 79 ΡΕ1957484

Estimularam-se as células com uma mistura de uma dose EC80 de glucagon na presença do composto. Quantificou-se o cAMP gerado dentro da célula utilizando um Ensaio Homogéneo de Proximidade de Cintilação, Alpha Screen, da Perkin Elmer (6760625R).

Brevemente, o cAMP dentro da célula compete para a ligação de cAMP biotinilado do conjunto para esferas revestidas com Aceitador anticorpo anti-cAMP e esferas Dador revestidas com estrepavidina. Enquanto o nivel de cAMP dentro da célula aumenta, ocorre uma ruptura do complexo de esferas de Aceitador-cAMP biotinilado-esferas de Dador e decresce o sinal.

Dissolveu-se o glucagon em HC1 0,01 N a 1 mg/mL e congelou-se imediatamente à temperatura de -80°C em aliquo-tas de 30 μΐ. Diluiu-se a alíquota de glucagon e utilizou-se no ensaio funcional dentro de uma hora. Recolheram-se as células das placas de cultura de tecido sub confluente com Solução de Dissociação de Células Livre de Enzimas, (Specialty Media 5-004-B). Sedimentaram-se as células a baixa velocidade e lavaram-se 3 vezes com tampão de ensaio [HEPES 25 mM em HBSS com Mg e Ca (GIBCO, 14025-092) com 1 % de BSA livre de ácido gordo (ICN)] em seguida diluiu-se para uma concentração final de 250.000 células por mL. Diluiram-se os compostos em série em DMSO em seguida diluiram-se em tampão de ensaio com uma concentração 3X de glucagon e 3 % DMSO. Pré determinou-se o EC80 de glucagon a 80 ΡΕ1957484 partir de uma resposta de dose de glucagon total e representa a dose na qual glucagon produz 80 % da resposta máxima de glucagon. Preparou-se uma mistura de cAMP biotinilada (1 unidade/poço final) a partir do Alpha Screen Kit e 3X IBMX (1500 μΜ) num Tampão Ensaio.

Realizou-se o ensaio funcional em Costar Plates (3688) de 96 poços, baixo volume, branco, poliestireno. Colocou-se a mistura cAMP biotinilada/IBMX, 0,02 mLs em cada poço, seguido pela adição de 0,02 mLs de resposta de dose de glucagon, curva padrão de cAMP ou misturas composto/glucagon. Iniciou-se a reacção pela adição de 0,02 mLs de células (5000/poço final). Depois de 60 minutos à temperatura ambiente, parou-se a reacção pela adição de 0,03 mLs de Tampão Lysis [HEPES 25 mM, pH 7,4, 1 % NP40 e 0,01 % de BSA livre de ácido gordo (ICN) contendo 1 unidade cada/poço de esferas Aceitador e Dador do Alpha Screen Kit] . Realizou-se a adição de Tampão Lysis sob uma luz verde para evitar a perda de sinal das esferas de detecção. Embrulharam-se os pratos em película metalizada e deixaram-se a equilibrar durante da noite à temperatura ambiente. Leram-se os pratos num instrumento Packard Fusion -a.

Converteram-se unidades Alpha screen para pmols de cAMP gerado por poço baseado na curva padrão de cAMP. Converteram-se os pmols de cAMP produzidos na presença de composto para % de resposta máxima só com a dose EC80 de glucagon. Determinou-se com cada experiência a dose de 81 ΡΕ1957484 glucagon necessária para produzir uma resposta de 50 % de pmols de cAMP. Utilizou-se esta dose EC50 para normalizar os resultados para um Kb utilizando uma modificação da equação Cheng-Prusoff (Cheng Y., Prusoff W.H., Biochem. Pharmocol. 22_, 3099-3108, 1973), em que Kb = (EC50 composto)/[1 + (pM glucagon utilizado/EC50 em pM para a resposta de dose de glucagon)].

Os compostos de acordo com a invenção têm preferivelmente um valor de Ki não superior a 50 μΜ como determinado pelo Ensaio de Ligação ao Receptor de glucagon (hGlucR) aqui neste documento apresentado. Mais preferivelmente, os compostos de acordo com a invenção têm um valor de Ki inferior a 5 μΜ, preferivelmente um valor inferior a 500 nM e ainda mais preferivelmente, um valor inferior a 100 nM, como determinado pelo Ensaio de Ligação ao Receptor de glucagon (hGlucR) aqui neste documento apresentado. Geralmente os compostos de acordo com a invenção apresentam uma afinidade superior para o receptor de glucagon comparado com o receptor GLP-1 e têm preferivelmente uma afinidade de ligação superior ao receptor de glucagon do que ao receptor GLP-1. Todos os exemplos aqui referidos neste documento têm um valor de Ki inferior a 10 μΜ.

Os resultados são apresentados em seguida para o composto indicado. ΡΕ1957484 82

Lisboa, 22 de Março de 2010

Claims (11)

1. ΡΕ1957484 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto estruturalmente representado pela Fórmula I:

   ffl ou um seu sal farmacologicamente aceitável, em que: Rl e R2 são independentemente -H ou -halogénio; R3 é -(Ci-Cs)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios), - (C3-C7) cicloalquilo, - (Ci-C6) alquil-(C3-C7) ci-cloalquilo ou - (C3—C7) cicloalquil- (Ci-C6) alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios); R4 e R5 são independentemente -H, -halogénio, hidroxi, hidroximetilo, -CN, - (Ci-C7) alcoxi, - (C2-C7) alquenilo ou - (Ci-C6)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios); R6 é

   2 ΡΕ1957484 em que a marca em zig-zag mostra o ponto de ligação à molécula-mãe; R7 e R8 são independentemente -H, -halogénio, -(Ci-C6)-alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios), - (Ci-C6)alcoxi, - (C3-C7) cicloalquilo, -C(O)R10, -COORIO, -0C(0)RIO, -OS(O)2Rl0, -SR10, -S(O)R10, -S(O)2R10 ou -0(C2-C7)alquenilo; R9 é independentemente -H, -halogénio, -CN, - (C3-C7) cicloalquilo, -C(0)RlO, -COORIO, -OC(0)RlO, -OS(O)2Rl0, -SR10, -S(0)R10, -S(0)2RlO ou - (C2-C7) alquenilo, - (Ci-C6) alcoxi (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios) ou —(Ci— C6)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios) e RlO é independentemente em cada ocorrência -hidrogénio ou - (Ci-Cs)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios).
2. 2. Um composto da reivindicação 1 ou um seu sal farmacologicamente aceitável, em que: RI e R2 são -H; R3 é -(Ci-C8)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios), - (C3-C6) cicloalquilo, - (Ci-C6) alquil- (C3-C6) cicloalquilo ou - (C3-C6) cicloalquil-(Ci-Cê) alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios); 3 ΡΕ1957484 R4 e R5 são independentemente -H, -halogénio ou -(Ci-Cô)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios); R6 é

   em que a marca em zig-zag mostra o ponto de ligação à molécula-mãe; R7 e R8 são independentemente -H, -halogénio, -(Ci-C3)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios) ou - (C1-C3)alcoxi; e R9 é independentemente -H, -halogénio ou - (Ci-C6) alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios)
3. 3. Um composto da reivindicação 1 ou um seu sal farmacologicamente aceitável, em que: RI e R2 são -H; R3 é - (Ci—C8) alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios), - (C3-C6) cicloalquilo, - (Ci-C6) alquil- (C3-C6) ci-cloalquilo ou -(C3-C6)cicloalquil-(Ci-Cô)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios); 4 ΡΕ1957484 R4 e R5 são independentemente -H, -halogénio ou -CH3 (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios); R6 é

   em que a marca em zig-zag mostra o ponto de ligação à molécula-mãe; R7 e R8 são independentemente -H ou -halogénio; e R9 é independentemente - (Ci—C6)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios).
4. 4. Um composto da reivindicação 1 ou um seu sal farmacologicamente aceitável, em que: RI e R2 são -H; R3 é -(Ci-C8)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios), - (C3-C6) cicloalquilo, — (Ci— Cê) alquil— (C3—Cê) cicloalquilo ou - (C3-C6) cicloalquil- (Ci-C6)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios); R4 e R5 são —CH3 (opcionalmente substituído com 1 até 3 halogénios) e cada um ocupa uma posição adjacente a R6 no anel fenilo ao qual R6 está ligado; R6 é 5 ΡΕ1957484

   em que a marca em zig-zag mostra o ponto de ligação à molécula-mãe; R7 e R8 são -H, -halogénio; e R9 é independentemente — (Ci— C6)alquilo (opcionalmente substituído com 1 até 3 halo-génios) .
5. 5. Um composto da reivindicação 1 ou um seu sal farmacologicamente aceitável, em que: Rl e R2 são independentemente hidrogénio ou halogénio; R3 é metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, 3,3-dimetilbutilo, 2-metilpropilo, 3-metil-butilo, tert-butilo, 4-metilpentilo, 2,2-dimetil-propilo, 3,3,3-trifluoropropilo, 4,4,4-trifluorobutilo, ci-clopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo ou ciclo-hexilo; R4 e R5 são independentemente hidrogénio, metilo, etilo, tert-butilo, ciclo-hexilo, pentilo, isopropoxi, cloro, fluoro, bromo, hidroxi, trifluorometilo, -CN, metoxi, hidroxi-metilo, 4-metilpentiloxi ou pentiloxi; R7 e R8 são independentemente hidrogénio, fluoro, cloro, metilo, etilo, pentilo, isopropilo, tert-butilo, trifluorometilo, acetilo, 2-metilpropilo, metoxi, ciclo-hexilo ou trifluorometoxi; R9 é hidrogénio, bromo, fluoro, metilo, tert-butilo, trifluo-rometilo ou isopropilo. 6 ΡΕ1957484
6. 6. Um composto da reivindicação 1 seleccionado a partir de um grupo consistindo de fórmulas XI até Xll:

   ΡΕ1957484 7 (continuação) N° F órmula Estrutura X7 'V 0 "'N X8 ( s ° Γ>ν. X9 w N X10 F:ícyy V o N„ NH -N ΧΠ F$cyir^\\-_ s 0 fL NH N ou um seu sal farmacologicamente aceitável
7. 7. Um composto da reivindicação 1 seleccionado a partir de um grupo consistindo em 8 ΡΕ1957484 (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (R,S)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-2-metil-propil]-tiofeno-2-carboxilico; (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-propil]-tiofeno-2-carboxilico; (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-butil]-tiofeno-2-carboxilico; (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-pentil]-tiofeno-2-carboxilico; (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-3-metil-butil]-tiofeno-2-carboxilico; (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-3,3-dimetil-butil]-tiofeno-2-carboxilico; (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)-5-[1-(4'-tert-butil-2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-2,2-dimetil-propil]-tiofeno-2-carboxilico; 9 ΡΕ1957484 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)—5—[1—(2,6 dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-butil]-tiofeno-2-carboxilico; (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)-5-[1-(2,6 dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-2-metil-propil]-tiofeno-2-carboxilico; (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)-5-[1-(2,6 dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-2, 2-dimetil-propil]-tiofeno-2-carboxilico; (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)—5—[1—(2,6 dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-3-metil-butil]-tiofeno-2-carboxilico; (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)—5—[1—(2,6 dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-3, 3-dimetil-butil]-tiofeno-2-carboxílico; (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido (±)-5-[1-(2,6 dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-pentil]-tiofeno-2-carboxilico; (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(4'-tert-butil 2,6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-2,2-dimetil-propil]-tiofeno-2-carboxílico (Isómero 1); 10 ΡΕ1957484 (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(4'-tert-butil- 2.6- dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-2,2-dimetil-propil]-tiofeno-2-carboxílico (Isómero 2); (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(4'-tert-butil-2, 6-dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-propil]-tiofeno-2-carboxílico (Isómero 1); (2H-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(4'-tert-butil- 2.6- dimetil-bifenil-4-il-sulfanil)-propil]-tiofeno-2-carboxilico (Isómero 2); (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(2,6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-butil]-tiofeno-2-carboxilico (Isómero 1); (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(2,6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-butil]-tiofeno-2-carboxilico (Isómero 2); (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(2,6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-2-metil-propil]-tiofeno-2-carboxilico (Isómero 1); (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(2,6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-2-metil-propil]-tiofeno-2-carboxilico (Isómero 2); 11 ΡΕ1957484 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil) propil]-tiofeno-2-carboxílico (Isómero 1 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil) tiofeno-2-carboxilico (Isómero 2); (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida (Isómero (2, 6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4 metil-butil]-tiofeno-2-carboxilico; (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil) tiofeno-2-carboxilico (Isómero 2); (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil) butil]-tiofeno-2-carboxilico (Isómero 1) (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil) butil]-tiofeno-2-carboxilico (Isómero 2) (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida (Isómero (2,6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4 pentil]-tiofeno-2-carboxilico; 5-[1-(2,6-dimetil--2,2-dimetil-); 5-[1-(2,6-dimetil--2-metil-propil]- 1) do ácido 5 — [ 1 — -il-sulfanil)-3- 5-[1-(2,6-dimetil--3-metil-butil]- 5-[1-(2,6-dimetil--3,3-dimetil- r 5- [1-{2, 6-dimetil--3,3-dimetil- r 1) do ácido 5 — [ 1 — -il-sulfanil)- 12 ΡΕ1957484 (lH-Tetrazol-5-ilmetil)-amida do ácido 5-[1-(2,6-dimetil-4'-trifluorometil-bifenil-4-il-sulfanil)-pentil]-tiofeno-2-carboxílico (Isómero 2); ou um seu sal farmacologicamente aceitável
8. 8. Uma composição farmacológica a qual inclui um composto de qualquer uma das reivindicações 1-7 e um excipiente farmacologicamente aceitável.
9. 9. Um composto de qualquer uma das reivindicações 1-7 ou um seu sal farmacologicamente aceitável para utilização como um medicamento.
10. 10. Um composto de fórmula I ou um seu sal farmacologicamente aceitável como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-7, para utilização no tratamento de diabetes, obesidade, hiperglicémia, aterosclerose, lesão cardíaca isquémia, sincope, neuropatia e cicatrização imprópria de feridas.
11. 11. Um composto de acordo com a reivindicação 10 ou um seu sal farmacologicamente como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-7, para utilização no tratamento de diabetes tipo II. Lisboa, 22 de Março de 2010 1 ΡΕ1957484 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição * WOS741SS7A * WO 9741119 Â * WO 9741128 A * WO 0041121 A * WO SS4S2S2 A * WO §91931:3 A * WO SÕS0414 A * WO 0033191 A * WOOOS31S2A * WO 0083133 A * WO (023425 A « WG0CS341SA * WOOÕ234S1Â * WO 8023445 A * WO 0823417 A » WO 5X123418 A » WO 9868153 A * WO 93195 A * WO 00832G8 A * WO 8SSS1S0 A * WOSQ8S1S8Â * EP 835448 A * (J8S873&S028 * WO <>3048109 A * WD2SC4GS248&A * EP 7922SS A * EP 21482S Â * EP7SS275A * US55S4188Ã * £P 388137 A * WG 9888871A « WO 9726285 A * WO 9853881 A * WDQ887474À * WO 0358283 A * WO 0144218 A * WO 0183485 A * WD 0183478 A * W0 01S57SSA * WO 018570? À « WO 02S8239 A * WO 0350082 A * WO 03S52S? A * WO 0315774 A Literatura que não é de patentes citada na Descrição * KupafoííssMHys et aí» Ei&ryi anlicfe gacsgsm wsap-ísf sssfc5gc®i$ís. Sccfgmic $ MsMcmt CÉeftás&y Lsh&% 2004, V0É. 14 (Si-, 2047-2050 * RisraiagSsís·. Tfe» Science ard P*&c£ce of PasífnsEy. MackPíibilAfssÍ-sgOc:·. 1935 * <L Jasquss «4 si.- BísrffcnsBrs, Bssssnstes, srd F»s-sks&c;os. ..dote mwrniSem ir», 1981 * E,t» WM; S.H. Wiien. Steasetenáaíiy· «4 Orgasis C^potiJ-ds., Wilgy-:nls?soteívs®, 1884 * P.StaM et ®L HsíldtessR Of Pterasc-stiliasí: Ssiís; Pyqperties, SeSwta, má :Uss, VCH&WSey-VCH, aoss * Berçe, SJ*: Bigfoíey. L.ES.; ®QBfcfKw*et B.C. PíiSRTiacsuSsai SaSs, J. Piwm. Sd„ 1977. voí. 86, t « R.C. Larosit, C&mprehsr?ís.Afe Otgsrac Tiarss&»raa-8ons» VCH PisbBs&ftfS. 1989. 972-978 * LoS: s, κ«ί|ρ« «IL; deiiftefc Ld % KrafsetdíS; w» more TE ; Spjwehs» GA ; Saíhess®s S; Sranl Fd ; Bigga §H; ftocwnberg SB eí sai» Gsm, 1884, vssi, 1:40 í2), 203-209 ♦ ©sírs*», fikWv í asm D»T,; Waiíe, d.; ¥a», S.B. 18S7, yd. 5, 1189-1132 * Cteig ¥»; Prisaoff W, H. Btocism. Fftsfimm'., 1373, vã. 22, 3889-3108 [SI 48] ♦ Graate» MP; Hey FJ i BetteamM D; Cfrfeshí G6; Stafer CD. SòcíwmBkphvs ftes Csfíwmn., tiOctcÉer im, vd. 198 (% 141-8