PT1824986E - Biomaterial capaz de efectuar sucessivamente uma transição solução/gel e depois uma transição gel/solução - Google Patents

Description

ΡΕ1824986 1 DESCRIÇÃO "BIOMATERIAL CAPAZ DE EFECTUAR SUCESSIVAMENTE UMA TRANSIÇAO SOLUÇÃO/GEL E DEPOIS UMA TRANSIÇÃO GEL/SOLUÇÃO" 0 presente invento refere-se a, para o dominio da gelificação, um biomaterial capaz de efectuar sucessivamente uma transição controlada solução/gel e depois gel/solução e a um processo de preparação de um tal biomaterial.

Os géis são utilizados devidos às suas particulares propriedades em numerosos domínios, nomeadamente alimentar, cosmético ou farmacêutico. Um gel é composto por, pelo menos, dois compostos dos quais um, muito grandemente maioritário, corresponde ao solvente líquido e o outro é um composto que se pode qualificar de sólido disperso no seio do solvente. A partir de uma solução ou de uma dispersão no estado líquido, a formação do gel é o resultado de uma agregação parcial de partículas sólidas. Chama-se a esta transformação a transição solução/gel. São bem conhecidas da arte anterior composições para obter géis "físicos". Um gel físico corresponde a uma montagem macromolecular constituída por monómeros ligados entre eles através de ligações de fraca energia (Van der Walls, ligações de hidrogénio, polares, etc) . A estabi- 2 ΡΕ1824986 lidade desta montagem está associada a uma certa gama de condições fisico-quimicas (pH, concentração em monómeros, temperatura, qualidade do solvente, força iónica, etc.). Para lá desta gama o gel volta a ser uma solução. A transição solução/gel é assim reversível para os géis fisicos. Assim, a estrutura dos géis fisicos é muito sensível ao ambiente fisico-quimico uma aleração muito ligeira da qualidade do solvente pode destruir completamente a estrutura e induzir assim uma transição gel-solução. Inver-samente, a associação polimérica que conduz ao gel pode ser efectuada através de uma alteração ligeira da qualidade do solvente.

Conhecem-se igualmente da arte anterior géis qualificados de "químicos". Um gel químico corresponde igualmente a uma montagem macromolecular e, por isso, os monómeros estão associados através de ligações de forte energia (covalentes). A estabilidade desta montagem é assim muito grande. Por este facto, se os géis químicos apresentam uma estabilidade melhorada, o único meio de efectuar uma transição gel/solução consiste em destruir as ligações covalentes do polímero. É por isso que a transição gel/solução deste tipo de polímero é dita irreversível.

Uma família de géis químicos corresponde aos géis catalisados enzimticamente. Este modo de gelificação é sobretudo observado nos grandes processos biológicos. A coagulação sanguínea, a cicatrização, a formação de pele, a montagem de matrizes extracelulares são processos bioló- 3 ΡΕ1824986 gicos onde a passagem de proteínas solúveis no estado de gel é indispensável e possuem em comum uma família de enzimas: as transglutaminases (Tgases), as quais são indispensáveis aos processos de gelificação. Esta família de proteínas é ubíqua e encontra-se tão bem nas procariotas como nas eucariotas. Existem assim 8 Tgases diferentes no homem. Estes enzimas possuem a propriedade de incorporar grupos amino nas cadeias laterais glutaminilo das proteínas. Esta actividade permite ligar as proteínas de maneira covalente. As Tgases catalisam assim a poli-merização das proteínas desponsáveis pela formação de redes gelifiçadas biológicas. As Tgases permitem obter géis a partir de numerosas proteínas na indústria alimentar e nomeadamente para a produção de surimi (bastonetes de pasta de peixe) ou o endurecimento de numerosos derivados de carne (fiambre, comida reconstituída, etc) . Pode-se citar, a título de exemplo de proteínas polimerizáveis, a gelatina, a fibrina, a gliadina, a miosina, a globulina (7S e 11S), a actina, a mioglobina, as proteínas do soro do leite, nomeadamente as caseínas e a lactoglobulina, as proteínas da soja, do trigo e, nomeadamente, a glutenina, da clara e da gema do ovo e, nomeadamente, a ovalbumina.

Um dos géis proteicos mais utilizados é o gel da gelatina. A gelatina é obtida a partir do colagénio que é uma proteína de estrutura ubíqua. 0 colagénio pode encontrar-se no estado solúvel sob a forma de monómeros ou de trímeros associados em hélices triplas. Estas hélices triplas podem associar em fibrilas que podem associar-se em 4 ΡΕ1824986 fibras. A hélice tripla de colagénio é instável à temperatura do corpo. A gelatina é obtida por desnaturação do colagénio. Os tecidos que contêm colagénio sofrem um tratamento ácido ou alcalino que conduz à desnaturação da hélice tripla do colagénio. A possibilidade de fazer fibras é assim totalmente perdida. Um tratamento ácido conduz à formação de gelatina do tipo A e um tratamento alcalino a uma gelatina do tipo B. A solução de gelatina é assim composta por cadeias isoladas de colagénio (monómeros de colagénio) . Para as utilizações de gelatina sendo múltiplas, é por vezes necessário criar géis de gelatina em condições em que os géis físicos não existem (altas temperaturas, pH extremo ou força iónica particular). Para formar uma rede necessária ao gel, as cadeias de gelatina são então ligadas por ligações covalentes e, nomeadamente, por acção das Tgases. Os géis assim obtidos são géis químicos.

Hoje numerosos domínios necessitam de utilização de géis químicos devido à sua melhor estabilidade. Contudo, a sua "irreversibilidade" limita as suas utilizações potenciais nos domínios cosméticos, alimentares ou ainda farmacêuticos. Um maior domínio das propriedades mecânicas de diferentes géis químicos constitui assim um aspecto essencial para aumentar a sua potencialidade. A análise in vivo revelou a existência de sistemas extremamente dinâmicos. Nos tecidos vivos, as células estão em interacção com uma estrutura denominada 5 ΡΕ1824986 por matriz extracelular (MEC) que é rica em proteínas. Esta estrutura está principalmente localizada em células epiteliais e à volta dos tecidos conjuntivos. As células podem sintetizar diferentes compostos da matriz extracelular tais como o colagénio que intervém na elasticidade ou a fibronectina que intervém em mecanismos de aderência. Paralelamente, a célula produz igualmente proteases que intervêem em mecanismos de aderência. Paralelamente, a célula produz igualmente proteases que intervêem na degradação da matriz extracelular. A célula intervém assim simultaneamente na construção e na degradação da matriz extracelular. A estrutura da matriz extracelular não é assim uma estrutura irreversível e estática mas corresponde a um equilíbrio dinâmico que resulta do balanço entre as actividades de construção e de degradação das proteínas sintetizadas pela célula.

Da mesma maneira, os coágulos formados em resposta ao mecanismo de coagulação constituem igualmente sistemas dinâmicos. Assim, através da síntese de uma cascata de factores enzimáticos, assiste-se à formação de um coágulo insolúvel que nasce da formação de uma rede de proteínas solúveis. Este coágulo será em seguida eliminado no decurso da reacção de cicatrização.

Nestes equilíbrios dinâmicos, as redes de proteínas associam-se para se tornarem insolúveis e formar géis, o que pode ser assimilado a transições solução/gel. Ao mesmo tempo, as redes proteicas são igualmente des- 6 ΡΕ1824986 truídas pela acção de proteases, este tipo de transição pode, por sua vez, ser assimilado a transições gel/solução. Assiste-se assim, por vezes, a transições sucessivas como na coagulação onde o coágulo é formado em primeiro lugar e depois degrada-se para dar lugar a outras reacções segundo mecanismos mal compreendidos. A transição solução/gel nestes processos biológicos é, muito frequentemente, associada à familia das transglutaminases previamente descritas. A transição oposta, a saber gel/solução está por seu lado associada à actividade antagonista de enzimas do tipo proteolitico.

Uma das famílias mais estudadas é a das metalo-proteinases da matriz (MMP). Estas formam uma família de endopeptidases dependentes do zinco que degradam a maior parte das proteínas da matriz extracelular. Existe, todavia, um grande número de famílias de proteases diferentes. Pode-se citar, a título de exemplo, famílias de proteases, as serinas proteases, tais como a tripsina, a matriptase, as cisteínas e aspartato proteases, tais como as catepsinas B e L e as catepsunas D e G e a família ADAM.

Um grande número de enzimas que orquestram este tipo de reacção, como as transglutaminases ou ainda as metaloproteases são caracterizadas pelos bioquímicos e os enzimologistas. A descrição destes enzimas e, nomeadamente, das diferentes constantes que lhe estão associadas está assim bem controlada. Por isso o seu comportamento, se for 7 ΡΕ1824986 conhecido em solução e de maneira isolada, não o é em meios do tipo gel e na presença de uma actividade antagonista. 0 trabalho de modelização dos inventores e de outras equipas permitiu compreender melhor os parâmetros que intervêm neste equilíbrio dinâmico que existe in vivo. Os últimos trabalhos de modelização e de experimentação realizados pelos inventores permitiram-lhes desenvolver um novo modelo deste equilíbrio dinâmico que integra com mais justiça os parâmetros implicados neste.

De modo surpreendente, as modelizações efectuadas pelos inventores colocaram em evidência que era possível obter "in vitro" os tais equilíbrios dinâmicos. Os inventores poderam assim obter géis proteicos que são capazes de efectuar, sucessivamente, uma transição solução/gel e depois gel/solução em condições determinadas e, nomeadamente, segundo uma cinética determinada.

Em consequência, um primeiro objectivo do invento refere-se a um biomaterial obtido por um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e que compreende, pelo menos, um monómero capaz de formar polímeros, de preferência através de ligações de energia fraca, ou uma mistura dos referidos monómeros e seus polímeros e um primeiro tipo de enzima capaz de degradar os referidos polímeros, apresentando-se o referido biomaterial quer sob a forma de gel quer sob a forma de uma solução e sendo susceptível de efectuar, sucessivamente, uma primeira ΡΕ1824986 transição solução/gel e depois sob a acção do primeiro tipo de enzima, uma segunda transição gel/solução.

Um tal biomaterial permite assim desenvolver estes produtos que apresentam propriedades até então desconhecidas nos dominios cosméticos, alimentares ou farmacêuticos.

No domínio cosmético, o biomaterial de acordo com o invento pode assim permitir realizar novos cosméticos, tais como máscaras de beleza que podem adoptar a textura de um gel durante o tempo de aplicação necessário antes de voltar ao estado de solução para permitir uma eliminação simplificada e agradável para o utilizador.

No domínio agro-alimentar, o biomaterial de acordo com o invento pode assim permitir realizar novos produtos com texturas desconhecidas, tais como biscoitos ou guloseimas recheadas, em que o recheio pode tomar a forma de um gel durante o revestimento antes de voltar ao estado de solução mais ou menos viscosa uma vez que tenha terminado o revestimento.

No domínio farmacêutico ou cosmético, o biomaterial de acordo com o invento pode igualmente permitir obter géis, que encerram um princípio activo, capazes de libertar o referido princípio ao passar ao estado em solução com uma cinética determinada. A utilização de enzimas capazes de degradar as proteínas (i) polimerizadas 9 ΡΕ1824986 em condições de temperatura, de pH, de concentrações iónicas específicas (cálcio, magnésio ou outro) ou na presença de co-factores determinados pode permitir adoptar esta libertação num dado ambiente (intestino, estômago, etc.).

As composições cosméticas, farmacêuticas ou alimentares podem, para além disso, conter outros agentes, tais como agentes activos para as composições cosméticas ou farmacológicas, ou agentes de formulação para as composições alimentares. 0 monómero compreendido no biomaterial do invento é uma proteína ou um sacárido, o qual é de origem natural ou sintética. 0 primeiro tipo de enzima está presente no biomaterial sob uma forma não activada. 0 primeiro tipo de enzima capaz de degradar os polímeros pode estar sob uma forma activa no biomaterial, seja sob uma forma activável em condições específicas, tal como um dado pH, na presença de uma espécie iónica ou de um co-factor específico de modo a obter a transição gel/solução em condições especificas, tais como um órgão particular (estômago, intestino, cavidade bocal, etc.) ou num ambiente particular. 0 biomaterial do invento compreende, para além disso, um solvente adequado para permitir a polimerização do monómero e a degradação do polímero formado pelo 10 ΡΕ1824986 primeiro tipo de enzima. Preferencialmente, o solvente utilizado é um solvente aquoso, tal como água ou soluções tampão ao pH desejado (tampão fosfato ou tris).

Segundo um primeiro modo de realização particular do biomaterial do invento, o referido biomaterial sob a forma de gel foi liofilizado segundo técnicas conhecidas pelos especialistas na matéria. O biomaterial não compreende então solvente. A segunda transição gel/solução efectua-se então somente após o referido biomaterial ser colocado em contacto com um solvente adequado. Este modo de realização permite assim associar a duração da vida do gel, após o seu fabrico, à presença num ambiente particular ou num órgão especifico (estômago, intestino, cavidade bocal, etc.).

De acordo com uma forma de realização preferida do invento, o biomatarial compreende ainda, pelo menos, um segundo tipo de enzima capaz de efectuar ligações cova-lentes entre os referidos monómeros, o referido biomaterial é então susceptivel de efectuar sucessivamente uma primeira transição solução/gel sob a acção do segundo tipo de enzima e depois uma segunda transição gel/solução sob a acção do primeiro tipo de enzima.

Com vantagem, estes dois tipos de enzima estão presentes simultaneamente no biomaterial sob uma forma não activada. 11 ΡΕ1824986

Com vantagem ainda os enzimas são repartidos de modo homogéneo no biomaterial.

Segundo uma segunda forma de realização particular do biomaterial do invento, o biomaterial compreende um monómero de natureza proteica. A quase totalidade das proteínas é capaz de formar géis fisicos devido às suas propriedades de polielectrólitos. As proteínas susceptiveis de polimerizar para formar géis fisicos e utilizáveis nos processos segundo o invento são: o colagénio e os seus derivados, tais como a gelatina, a fibrina, a gliadina, a miosina, a globulina (7S e 11S), a actina, a mioglobina, as proteínas do soro do leite, nomeadamente as caseínas e a lactoglobulina, as proteínas da soja, do trigo e nomeadamente a glutenina, da clara e da gema do ovo e, nomeadamente, a ovalbumina. Preferencialmente, as proteínas polimerizáveis utilizadas são escolhidas de entre a fibrina e o colagénio e os seus derivados, tais como a gelatina do tipo A e B. Na presença de enzima capazes de efectuar ligações covalentes entre os monómeros proteicos, é possível utilizar proteínas que não polimerizam naturalmente. A concentração de proteínas polimerizáveis, sob a forma de monómeros ou de uma mistura dos referidos monómeros e seus polímeros, no biomaterial é função da natureza da proteína utilizada. Preferencialmente, a concentração em proteína polimerizável está compreendida entre 0,1 e 30% em peso em relação ao peso total do biomaterial, preferencialmente entre 0,2 e 20%, preferen- 12 ΡΕ1824986 cialmente ainda entre 0,5 e 15% e de maneira particularmente preferida entre 1 e 10%.

Numerosos enzimas capazes de degradar polímeros proteicos (proteases) são conhecidos pelos especialistas na matéria. A titulo de exemplo de tais enzimas, podem-se citar as metaloproteinases, tais como as metaloproteinases da familia do tipo MMP ou as metaloproteinases semelhantes, tais como a termolisina, as serinas proteases, tais como a tripsina e a matriptase, as cisternas e aspartato proteases, tais como as catepsinas B e L e as catepsinas D e G e a familia ADAM. Preferencialmente, o enzima capaz de degradar os polímeros de proteínas é uma metaloproteinase, preferencialmente uma termolisina, nomeadamente bacteriana e, de maneira particularmente preferida, uma termolisina isolada a partir de Bacillus thermoproteolyticus rokko. A concentração em enzima capaz de degradar os polímeros proteicos depende do monómero de proteína utilizado e da concentração deste. Esta concentração de enzima pode ser calculada simplesmente por um tipo de monómero proteico dado e a uma dada concentração, segundo um protocolo descrito nos exemplos gue se seguem. Assim, no caso da termolisina de Bacillus thermoproteolyticus rokko e para o gel de gelatina do tipo A a 5%, a concentração em termolisina é superior ou igual a 10“4 U/ml, preferencialmente superior ou igual a 10~3 U/ml.

Numerosas proteínas que são igualmente capazes de 13 ΡΕ1824986 efectuar ligações covalentes entre proteínas são conhecidas pelos especialistas da matéria. A título de exemplo de tais proteínas, pode-se citar a família das lisiloxidases e a família das transglutaminase, preferencialmente uma trans-glutaminase bacteriana e de maneira particularmente preferida uma transglutaminase isolada a partir de Streptover-ticillium sp.

As concentrações em enzima capazes de efectuar ligações covalentes entre as proteínas e o enzima capaz de degradar polímeros proteicos dependendo, por um lado, pela razão da concentração do enzima capaz de efectuar ligações covalentes entre as proteínas em relação à concentração em enzima capaz de degradar os polímeros proteicos e, por outro lado, da proteína polimerizável utilizada e da concentração desta. Estas concentrações de enzimas podem ser calculadas simplesmente segundo o protocolo descrito nos exemplos. A razão das concentrações enzimáticas e as concentrações enzimáticas utilizadas dependerão igualmente do tempo de gelificação (transição solução/gel) e a da duração da vida dos géis desejados.

Com vantagem a razão da concentração do enzima capaz de efectuar as ligações covalentes entre as proteínas em relação à concentração do enzima capaz de degradar os polímeros proteicos é superior ou igual a 1, preferencialmente superior ou igual a 10 e, de maneira particularmente preferida, superior ou igual a 20. 14 ΡΕ1824986

Com vantagem ainda, e no caso de uma solução de gelatina do tipo A a 5%, na presença da transglutaminase de Streptoverticilium sp e da termolisina de Bacillus thermo-proteolyticus rokko, a razão da concentração de transglutaminase em U/ml em relação à concentração em termolisina em U/ml é superior a 75, preferencialmente superior ou igual a 80. Para além disso, a concentração em transglutaminase é superior ou igual a a 0,01 U/ml, preferencialmente superior ou igual a 0,1 U/ml e, de maneira particularmente preferida, superior ou igual a 0,4 U/ml.

Segundo uma terceira forma de concretização particular do presente invento, o biomaterial de acordo com o invento compreende um monómero de natureza sacaridica. Os sacáridos utilizáveis para o biomaterial de acordo com o invento são: as carragenanas, os alginatos, as pectinas, o quitosano, a celulose, a quitina, o clicogénio ou ainda o amido. A concentração em sacáridos polimerizáveis, sob a forma de monómeros ou de uma mistura dos referidos monómeros e dos seus polímeros no biomaterial é função da natureza do sacárido utilizado. Preferencialmente, a concentração em sacárido polimerizável está compreendido entre 0,1 e 30% em peso em relação ao peso total do biomaterial, preferencialmente entre 0,2 e 20%, preferencialmente ainda entre 0,5 e 15% e de maneira particularmente preferida entre 1 e 10%. 15 ΡΕ1824986

Numerosos enzimas capazes de degradar os polissa-cáridos são conhecidos pelos especialistas na matéria. A título de exemplo de tais enzimas podem-se citar as carra-genases para as carragenanas, as pectinas liases, as poli-galacturonases e as pectinas estearase para as pectinas, os alginatos liases para os alginatos, as celulases para a celulose ou ainda a fosforilase para o glicogénio. A concentração em enzima capaz de degradar os polissacáridos depende do monómero utilizado e da concentração deste. Esta concentração de enzima pode ser calculada simplesmente para um dado tipo de monómero e uma dada concentração, segundo o protocolo descrito nos exemplos.

Numerosos enzimas que são igualmente capazes de efectuar ligações covalentes entre os sacáridos são conhecidos pelos especialistas na matéria. A título de exemplo de tais enzimas, pode-se citar a família dos alginatos epimerases para os alginatos, as sintases para a celulose ou ainda a glicogénio sintase para o glicogénio.

As concentrações de enzima capazes de efectuar ligações covalentes entre os sacáridos e de enzima capaz de degradar os polissacáridos dependem por um lado da razão da concentração do enzima capaz de efectuar ligações covalentes entre os sacáridos em relação à concentração de enzima capaz de degradar os polissacáridos e, por outro lado, do sacárido polimerizado utilizado e da concentração 16 ΡΕ1824986 deste. Estas concentrações de enzimas podem ser calculadas simplesmente segundo o protocolo descrito nos exemplos.

Como anteriormente, a razão das concentrações enzimáticas e as concentrações enzimáticas utilizadas dependerão, igualmente, do tempo de gelificação (transição solução/gel) e da duração da vida do gel desejados.

Com vantagem, a razão (concentração de enzima capaz de efectuar ligações covalentes entre os sacári-dos)/(concentração em enzima capaz de degradar polissacá-ridos) é superior ou igual a 1, preferencialmente superior ou igual a 10 e, de maneira particularmente preferida, superior ou igual a 20.

Ainda com vantagem, a concentração em enzima capaz de efectuar ligações covalentes entre os sacáridos é superior a 0,001 U/ml, preferencialmente superior a 0,01 U/ml e de maneira particularmente preferida superior a 0,1 U/ml.

Segunda uma quarta forma de realização particular do invento, o biomaterial de acordo com o invento compreende um monómero de natureza sacaridica e um monómero de natureza proteica. Um tal composto permite obter um gel que apresenta propriedades reológicas especificas e, potencialmente, um gel que apresenta uma textura pesquisada. O biomaterial pode igualmente compreender um ou 17 ΡΕ1824986 vários compostos adicionais correntemente utilizados nos dominios cosméticos, farmacêuticos ou alimentares.

Um segundo objectivo do invento refere-se a um processo de preparação de um biomaterial segundo a reivindicação 1, apresentando-se o biomaterial sob a forma de um gel, apresentando-se sob a forma de uma solução e sendo susceptível de efectuar sucessivamente uma transição solução/gel e depois uma segunda transição gel/solução, caracterizado por este compreender a mistura num solvente adeguado: (i) de, pelo menos, um monómero capaz de formar polímeros, preferencialmente através de ligações de energia fraca; (ii) um primeiro tipo de enzima capaz de degradar os referidos polímeros. A concentração em monómeros capazes de formar polímeros, preferencialmente através de ligações de energia fraca e a concentração de enzima capaz de degradar os referidos polímeros para obter um biomaterial que apresenta o tempo de gelificação e a duração da vida do gel adequados são determinados segundo o protocolo descrito nos exemplos. A título de exemplo, um biomaterial que compreende 5% de gelatina do tipo A, a título de monómero capaz de formar polímeros através de ligações de energia fraca, e 18 ΡΕ1824986 termolisina isolada a partir de Bacillus thermoproteolyti-cus rokko e que apresenta um tempo de gelificação de 68 minutos e uma duração da vida do gel de 254 minutos, pode ser obtido a 27°C utilizando 0,0085 U/ml de termolisina.

Segundo uma forma de realização preferida, o processo de acordo com o invento compreende, para além disto, a mistura: (iii)de um segundo tipo de enzima capaz de efectuar ligações covalentes entre os monómeros. A concentração de monómeros capazes de formar polímeros, opcionalmente através de ligações de fraca energia, a concentração em energia capaz de degradar os referidos polímeros e a concentração de enzima capaz de efectuar ligações covalentes entre os referidos monómeros, para obter um biomaterial que apresenta o tempo de gelificação e a duração de vida do gel desejados, são determinados segundo o protocolo descrito nos exemplos. O processo é realizado a uma temperatura à qual os dois tipos de enzimas são activados. Com vantagem, o processo é realizado a uma temperatura compreendida entre 0 e 100°C, preferencialmente entre 5 e 75°C, por exemplo, entre 10 e 50°C ou entre 15 e 45°C e, de maneira particularmente preferida, entre 20 e 40°C.

Com vantagem, a quantidade de monómeros capazes 19 ΡΕ1824986 de formar polímeros está compreendida entre 0,1 e 30% em peso, em relação ao peso total do biomaterial, preferencialmente entre 0,2 e 20%, preferencialmente ainda entre 0,5 e 15% e, de maneira particularmente preferida, entre 1 e 10%.

Com vantagem ainda, a razão da concentração de enzima capaz de efectuar ligações covalentes entre os monómeros em relação à concentração de enzimas capazes de degradra os polímeros é superior ou igual a 1, preferencialmente superior ou igual 10 e, de maneira particularmente preferida, superior ou igual a 20.

Preferencialmente, a concentração de enzima capaz de efectuar ligações covalentes entre os monómeros é superior a 0,001 U/ml, preferencialmente superior a 0,01 U/ml e, de maneira particularmente preferida, superior a 0,1 U/ml.

De acordo com o processo do invento, a concentração de monómeros capazes de formar polímeros, a concentração de enzima capaz de degradar os referidos polímeros e, eventualmente, a concentração de enzima capaz de efectuar ligações covalentes entre os referidos monómeros são escolhidos de forma a que a resolução das equações (I), (II), (III) e (IV) seguintes:

(D (Jçf dt x g + Vf x s + Va KT + s 20 ΡΕ1824986 ds « v. x g - % χ s - χ « - y, csi) dt Jff + g ity + s Kj, + s djf * V'. x a <XXX) dt jrF + a gt·*· st* f* *se (xv) descrevendo aquelas equações respectivamente a evolução do número de monómeros ligados (dg) (I), a evolução do número de monómeros em solução (ds) (II) e a evolução do número de monómeros degradados (df) em função do tempo (dt) (III) e a equação de conservação da massa (IV), em que: g corresponde à quantidade de monómeros sob forma ligada, t corresponde ao tempo,

Vp corresponde à velocidade do enzima capaz de degradar os polímeros expressos em quantidade de monómeros ligados levados à sua forma livre pelo referido enzima e por unidade de tempo, KP representa a constante de Michaelis do enzima capaz de degradar os polímeros, s representa a quantidade de monómeros sob forma livre, VT corresponde à velocidade do enzima capaz de efectuar ligações covalentes entre os monómeros expressa em quantidade de monómeros sob forma livre ligados pelo referido enzima e por unidade de tempo, 21 ΡΕ1824986 KT representa a constante de Michaelis do enzima capaz de efectuar ligações covalentes entre os monómeros. VH representa a velocidade de ligação, para ligações de fraca energia e por unidade de tempo, de monómeros sob forma livre, no cado de monómeros capazes de poli-merizar através de tais ligações, V'P corresponde à velocidade do enzima capaz de degradar monómeros sob forma livre expressa em quantidade de monómeros degradados, os quais não podem mais poli-merizar, gerados pelo referido enzima e por unidade de tempo, gt corresponde à quantidade de monómeros sob forma ligada no tempo t, st corresponde à quantidade de monómeros sob forma livre no tempo t, ft corresponde à quantidade de monómeros degradados que não são capazes de formar polímeros no tempo t,

So corresponde à quantidade inicial de monómeros, permitem obter um tempo de gelificação e a duração do gel desejados.

Os inventores puderam demonstrar com diferentes tipos de enzimas, que era possível obter biomateriais que apresentam uma cinética de transição solução/gel e depois gel/solução determinada.

As constantes para estes diferentes enzimas são bem conhecidos pelos especialistas na matéria. A título de 22 ΡΕ1824986 exemplo pode-se citar a base de dados http:// www.branda.uni-koeln.de/ que descreve as tais constantes enzimáticas. Em todo o caso, um especialista na matéria poderá determinar simplesmente estas diferentes constantes para os enzimas dados segundo métodos bem conhecidos, tais como os descritos em http://www.branda.uni-koeln.de/ e em PRICE e STEVEN, Fundamentais of Enzymology: The Cell and Molecular Biology of Catalytic Proteins, Oxford University Press.

Nestas equações, VP e VT são assim calculados segundo as fórmulas seguintes:

Vp = kCAT-p[P] e VT = kCAT-T[T], onde [P] e [T] representam, respectivamente, as concentrações de enzima capaz de degradar os polímeros e de enzima capaz de efectuar ligações covalentes entre os monómeros e kCAT_P e kCAT_T representam as constantes catalíticas para estes enzimas.

Em qualquer caso, um especialista na matéria poderá determinar simplesmente e sem experimentação excessiva, sequindo os protocolos descritos nos exemplos, as diferentes concentrações de monómeros e de enzima para se obter um biomaterial que apresenta as cinéticas de transição sucessivas solução/gel e gel/solução pretendidas. A titulo de exemplo, um biomaterial compreendendo 5% de gelatina do tipo A, a titulo de monómeros capazes de formarem polímeros através de ligações de fraca energia, a termolisina isolada a partir de Bacillus thermopro- 23 ΡΕ1824986 teolyticus rokko, a transglutaminase isolada a partir de Streptoverticilium sp e que apresenta um tempo de gelificação de 19 minutos e uma duração de vida do gel de 743 minutos pode ser obtido a 40°C utilizando 1 U/ml de transglutaminase e 0,0125 U/ml de termolisina.

Ainda a titulo de exemplo, um biomaterial compreendendo 5% de gelatina do tipo A, a titulo de monómeros capazes de formarem polímeros através de ligações de fraca energia, a termolisina isolada a partir de Bacillus thermoproteolyticus rokko, a transglutaminase isolada a partir de Streptoverticilium sp e que apresenta um tempo de gelificação de 2 minutos e uma duração de vida do gel superior a 5000 minutos, pode ser obtido a 27°C utilizando 1 U/ml de transglutaminase e 0,0125 U/ml de termolisina.

Com vantagem, o processo de acordo com o invento compreende, para além disso, uma etapa de liofilização do biomaterial sob a forma de gel.

Outras características do invento aparecem nos exemplos que se seguem, sem que isso constitua qualquer limitação do invento.

Exemplo 1 Gel químico: 1-1 desenvolvimento de um modelo teórico.

Um estudo do equilíbrio dinâmico que corresponde à matriz extracelular permitiu estabelecer um modelo 24 ΡΕ1824986 matemático simplificado de um tal sistema dinâmico no qual se realizam duas reacções enzimáticas antagonistas. Uma é catalisada por um enzima capaz de efectuar ligações covalentes entre os monómeros solúveis (s) para obter uma rede de monómeros ligados (g) . A outra é catalisada por um enzima (P) que hidroliza a rede de monómeros ligados (g) em monómeros solúveis (s). Finalmente, e em certos casos, uma terceira reacção também catalisada pelo enzima (P) consiste na hidrólise de monómeros solúveis em monómeros degradados (f) de dimensão muito pequena para participar na rede ou que não podem servir de substrato ao enzima que liga os monómeros solúveis (s) através de ligações covalentes (T) . Esta última reacção que se traduz por uma fuga de monómeros do ciclo é igualmente adicionada ao modelo. 0 modelo pode ser simplesmente representado segundo o seguinte esquema reaccional:

Esquema I:

Easima que degrada as cadeias da monómeros ligados

Enrima que degrada as cadeias de monómeros ligados íFjt

Cadeias de Monómeros em ^..................^.Monámeros rnsmémero» ligados fg> «oluglo (m) (-''degradado® {£]

Snsima que liga os monómeros «través de ligaçSes oovalenfc.es 25 ΡΕ1824986

Este mecanismo reaccional pode ser simplesmente descrito por três equações diferenciais que se seguem, em que as reacções enzimáticas são equiparadas às reacções michaelianas simples e por uma quarta equação de conservação da massa. A equação diferencial que permite descrever a evolução do número de cadeias de monómeros ligados (g) em função do tempo, é a seguinte: de ~ ~ V» x g + v» x & dt Kr + 9 + 3 A equação diferencial que permite descrever a evolução do número de monómeros em solução (S) em função do tempo é a seguinte: ás ~ yc x §· - x s - ν'„ x s dt Kp + g Jk + β k9 + s A equação diferencial que permite descrever a evolução dos monómeros degradados (f) em função do tempo é a seguinte: Óf * Vfn X 8 dt KP -f s

Finalmente, a equação de conservação em massa é a seguinte

Nestas equações diferenciais, VP e VT representam 26 ΡΕ1824986 as velocidades máximas para os enzimas P e T respectivamente, representando KP e KT as constantes de Michaelis para os enzimas P e T, respectivamente.

Nestas equações VP e VT são calculadas de acordo com as equações seguintes: ν'ρ w Kc»m> 1¾ e VT ** [T]

Na transposição desta equação para um sistema in vitro, os diferentes valores de [P] e [T], VP( VT, KP e KT correspondem a constantes.

As concentrações de substratos são calculados para cada enzima no inicio, são em seguida determinadas do decurso da reacção com a ajuda de diferentes equações diferenciais. 1-2: modelização da formação de um gel de gelatina na presença de uma transglutaminase e de termolisina:

Este modelo teórico foi aplicado à formação de um gel físico de proteína e, mais precisamente, de gelatina a 40°C, na presença de uma transglutaminase bacteriana, que liga os monómeros de gelatina através de ligações covalentes, e de uma protease: a termolisina. A concentração de gelatina utilizada é de 5%, ou seja 50 g.l-1. A partir da sequência peptídica da gelatina, 27 ΡΕ1824986 é possível determinar simplesmente a concentração de cadeias laterais, a saber 0,45 mol.l-1.

Enzimas utilizados:

As diferentes constantes para a protease e a transglutaminase são conhecidas na literatura ou podem ser determinadas simplesmente segundo técnicas bem conhecidas pelos especialistas na matéria (SEGEL, Wiley Classics Library, Enzyme Kinetics, 1993). 1-Protease: 1.1- Fonte: A protease utilizada é uma metalo-protease bacetriana, a termolisina, comercializada pela SUGMA (REF: P-1512) . Este enzima é uma protease do tipo X com origem em Bacillus thermoproteolyticus rokko, que é uma estirpe bacteriana termófila. Este enzima reconhece especificamente os resíduos Ile, Leu, Vai, Phe, Met e Ala. Muito estável à temperatura ambiente, este enzima apresenta uma massa molar de 34 kDa para 316 aminoácidos. 2.2- Actividade: Para a termolisina, a sua constante de Michaelis (de dissociação) é conhecida para diferentes substratos proteicos e peptídicos na literatura (MATSUBARA et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 21, p: 242-247, 1965). A partir destes dados, é possível deduzir um valor médio de KP igual a 1 mM. A literatura descreve igualmente valores de kcat da termolisina para 28 ΡΕ1824986 diferentes substratos (LIGNE et al., Biochem. Biophys. Acta, vol. 1337, p: 143-148, 1997). A partir destes dados, é igualmente possivel determinar um valor médio de kcat igual a 1000 min"1. Sendo conhecida a especificidade da termolisina, a análise da sequência da gelatina permite determinar que, no sistema estudado, a concentração inicial de substrato para a termolisina é assim de 0,15 x 0,45 = 0,68 mol.l-1 = 68 mM ou seja 68 KP. Estando esta concentração próxima de uma concentração saturante em substrato, o substrato não é assim limitante da reacção da termolisina.

As diferentes constantes enzimáticas deste enzima podem ser igualmente medidas utilizando a N-(3-[2-furil]-acriloil)-glicina-leucina-amida (SIGMA) como substrato, para a formação de furil-acrolil-glicina e de leucina-amida. O desaparecimento do substrato no decurso da hidrólise traduz-se numa diminuição da densidade óptica medida a 345 nm. 2-Transglutaminase: 2.1-Fonte: A transglutaminase utilizada é produzida pela empresa AJINOMOTO sob a denominação ACTIVA WM®. Este enzima bacteriano é produzido no meio de cultura de Streptoverticilium sp. Este enzima corresponde a uma cadeia polipetídica de 331 aminoácidos para um PM de 38 000 Da. O residuo cisteina na posição 64 corresponde ao sitio activo. 29 ΡΕ1824986 2.2-Activado: Este enzima reconhece os resíduos lisina e catalisa a formação de ligações covalentes entre as cadeias laterais dos resíduos lisinas e as cadeias laterais de outros resíduos. A actividade deste enzima é óptima a uma temperatura de 50-55°C (100 U.g-1 a 40°C) e numa gama larga de pH (actividade de 4,5 a 9 com um óptimo entre 6 e 7). A actividade deste enzima é medida a partir da quantidade de enzima necessária para catalisar a formação de uma micromole de ácido hidroxiamico durante um minuto a 40°C, a partir de Να-CBZ.Gln-Gly (SIGMA) e de hidroxilamina. O protocolo que permite determinar a actividade deste enzima é o seguinte. μΐ de enzima no tampão acetato a pH 6 400 μΐ NH20H 2M 25 μΐ Να-CBZ 0,1M 75 μΐ 10 min a 37°C TCA 10% FeC13 3% 500 μΐ Centrifugação 400 g 15 min DO 525 nm (branco com solução sem enzima) A actividade é em seguida calculada pela equação seguinte:

Actividade (U/mL/min) = [lOOx (DO 525/238)]/Vol de enzima (mL) 30 ΡΕ1824986

Reacções diferentes com este substrato permitiram determinar uma constante de dissociação KT de 8 mM e um kcat de 100 min”1 utilizando a gelatina como substrato. A gelatina contém somente 4% de lisina, a concentração inicial em substrato para a transglutaminase é assim de 17 mM.

Modelização: A partir de diferentes valores anteriormente determinados, é possível seguir o comportamento da fracção ligada em função do tempo aplicando o método de Euler de ajuste das equações diferenciais (BRONSON, Eqiations Difefèrentielles, Mc Graw-Hill ed, 1994). Nesta primeira modelização, a razão das actividades entre a transglutaminase e a protease é de 10 (com uma concentração em transglutaminase de 1 U/ml). Admite-se, para além disso, go=0 e So=68 mM. Os dados da literatura mostram que um gel de gelatina é obtido por acção da transglutaminase quando 18% das ligações teóricas são efectivamente realizadas (FUCHSBAUER et al. , Biomaterials, vol.17, p: 1481-1488, 1999).

As diferentes modelizações efectuadas demonstram que a variação de V'P em relação a VP é de pouca importância e que a cinética do aparecimento das proteínas ligadas apresenta um forte aumento inicial até valores próximos de 100% e depois um decrescimento muito lento que depende da velocidade de aparecimento de pequenos fragmentos. Um exemplo de modelização da evolução da 31 ΡΕ1824986 fracção ligada em função do tempo, com uma razão V'P/VP de 0,1, é apresentado na figura 1. 1-3: formação de um gel na presença de uma transglutaminase só:

Para validar este modelo teórico, os inventores começaram por efectuar uma primeira série de experiências na qual a formação de um gel de gelatina foi seguido na presença de diferentes qualidades de transglutaminase unicamente.

Proteínas polimerizáveis utilizadas: A gelatina do tipo A utilizada (G2500) é extraída a partir de pele de porco segundo um protocolo ácido (SIGMA). As concentrações de gelatina na solução são expressas em percentagem (peso/volume). Assim, uma solução de 1% de gelatina corresponde a uma solução de 1 g de gelatina em 100 ml de solução. As concentrações de gelatina utilizadas variaram nas experiências entre 2 e 10% e a temperatura de gelificação era de 40°C. A transglutaminase utilizada corresponde à transglutaminase descrita previamente (ver 1-2) . As concentrações de transglutaminase utilizadas nestas experiências variaram entre 0,1 U/ml e 1 U/ml.

Seguimento das transições solução/gel e gel/so- 32 ΡΕ1824986 lução A formação de um gel é seguida com a ajuda de um reómetro AR1000 (TA INSTRUMENT) ou RS 150 (THERMORHEO). Estes reómetros foram montados com geometrias do tipo cones/plano de 60 mm e 2° de ângulo. Um cone em aço é utilizado no AR1000 e um cone em titânio é utilizado no RS150 .

Estes reómetros permitem efectuar uma análise oscilatória, ou análise dinâmica, que consiste em impor à amostra um cisalhamento oscilatório de pulsação dada ω. No decurso deste movimento, a tensão e o gradiente de cisalhamento evoluem sinusoidalmente no decurso do tempo, com a mesma pulsação, mas com um certo desfasamento de um em relação ao outro. Os reómetros que permitem medir numerosos parâmetros permitem seguir a gelificação. O módulo de cisalhamento (G*(ra)) é um número complexo que exprime a componente viscosa e elástica da amostra e responde à fórmula seguinte: ® {«·)** ® <eej *· ® í«*> G designa-se por módulo de conservação (Storage Modulus) e G" designa-se por módulo de perda (Loss Modulus). Estes dois módulos são expressos em Pascais (Pa). Num liquido newtoniano, o módulo de conservação é nulo, só o módulo de perda existe, é por isso que o módulo de perda é por vezes igualmente qualificado como módulo viscoso. Ao 33 ΡΕ1824986 contrário, só o módulo de conservação existe num sólido elástico, é por isso que por vezes este é qualificado como mósulo elástico. Pode-se relacionar o módulo de cisalha-mento aos módulos de perda e de conservação segundo as fórmulas seguintes: G‘~ G* cos S e G’ * G*sen δ

Nas quais δ representa o desfasamento entre a tensão e a deformação de cisalhamento. A partir destas fórmulas pode-se deduzir a relação seguinte:

Tan δ ~ G* / G'

Tan δ é então um valor pertinente que permite caracterizar a gelificação da amostra. Quando a amostra é liquida G" > G' e Tan δ >1. Inversamente, a amostra é geli-fiçada quando G" > G' e Tan δ <1. Nas diferentes experiências que se seguem, a razão dos módulos G"/G' para diferentes soluções é expressa em função do tempo, com o valor G"/G'=l correspondendo ao "ponto de gel".

Resultados: A evolução das propriedades viscoelásticas, seguidas com a ajuda de um reómetro, de uma solução de gelatina a 5% a 40°C e na presença de concentrações diferentes de transglutaminase (0,lm 0,15, 0,2, 0,5 e 1 U/ml) é apresentada na figura 2. Observa-se que, em todas 34 ΡΕ1824986 as condições testadas, a amostra é líquida no início da experiência (G"/G'<1) e depois forma-se um gel (G"/G'>1) e evolui com o decurso do tempo. As experiências mostram para além disso que após o ponto de gel e sem importar qual a concentração de enzima, o módulo G" atinge um patamar à volta de 1 Pa. Os valores do módulo G' são então dependentes da concentração do enzima. As variações da razão G"/G' observadas após o ponto de gel reflectem assim as variações de G'. A Figura 3 representa a velocidade de gelificação (inverso do tempo de gelificação) de soluções de gelatina a 5% a 40°c em função da concentração de transglutaminase. Os resultados mostram que a curva de gelificação está conforme o modelo teórico, incluindo unicamente a etapa com a transglutaminase e isto até ao ponto de gel onde G"/G'=l. A figura 4 representa a velocidade de reacção enzimática em função da concentração do enzima a 40°C, após o ponto de gel. Os resultados mostram que para lá do ponto de gel a curva de gelificação não está mais conforme o modelo teórico. Observa-se então que as curvas não são mais extrapoláveis por regressão linear, mas seguem um 185 comportamento em lei de potência da equação y = 15x ' (curva a pontilhado na figura) com um R2 de 0,98. Após o ponto de gel, a reacção enzimática está dentro de um regime limitado pela difusão do enzima no gel. O impacto da difusão materializa-se nesta equação de velocidade através de um coeficiente de 1,85 que afecta a concentração da 35 ΡΕ1824986 transglutaminase. A figura 5 mostra a evolução em função do tempo, da quantidade de transglutaminase activa no gel, tendo em conta a difusão por 1 unidade () e 0,4 unidades (♦) de enzima em solução. Estas experiências permitiram assim mostrar que após a formação do gel, o valor do coeficiente de difusão para a transglutaminase evolui progressivamente até atingir um valor de 1,85. Esta evolução do coeficiente de difusão pode ser determinada simplesmente a partir desta curva e em função do tempo.

Parece assim que a acção enzimática na altura da gelificação segue dois regimes sucessivos. O primeiro, do estado liquido até perto do ponto de gel não é limitado pela difusão e as regras da enzimologia clássica podem aplicar-se. A velocidade da reacção é então uma função linear da concentração de enzima. O segundo, após o ponto de gel, é um meio não convencional onde a velocidade de difusão do enzima não é mais negligenciável e limita a velocidade de reacção aparente.

Experiências efectuadas com géis de gelatina de 2 e de 10% na presença de diferentes concentrações de transglutaminase permitiram confirmar um comportamento semelhante no decurso da gelificação. Nestas condições, cada tipo de gel beneficia de um coeficiente de difusão especifico que pode ser determinado simplesmente como 36 ΡΕ1824986 previamente descrito. 1-4 nova modelização da formação de um gel de gelatina na presença de uma transglutaminase e de termo-lisina

Um gel de gelatina foi modelizado utilizando os mesmo parâmetros que descritos previamente (ver 1-2) e utilizando a razão VT/Vp de 10 e uma razão V'p /VP de 0, LO O todavia, o efeito da tensão difusional de um gel de gelatina a 5% na velocidade de reacção do enzima foi integrado nas equações diferenciais descritas previamente (ver 1-2). Assim, a concentração em transglutaminase foi afectada por um expoente de 1,85 nas equações que se referem ao equilíbrio reaccional desde que o ponto de gel tenha sido ultrapassado, segundo a fórmula seguinte: “ ^CAT-T M1'8'

Estudos previamente realizados permitiram mostrar que a difusão controlava a hidrólise dos géis unicamente na presença de uma concentração muito baixa de enzima, a saber, inferior a 1 nM (FADDA et al., Biophys. J., vol. 85(5), p: 2808-2817, 2003), mas não a concentrações muito importantes (BERRY et al., Biochim. Biophys. Acta., vol. 1524, p: 110-117, 2000; GIRAUDIER et al., Biomacro- molecules, vol. 5(5), p: 1662-1666, 2004). Em consequência, não foi aplicado nenhum coeficiente à concentração de 37 ΡΕ1824986 termolisina nas equações. A figura 6 representa o resultado de uma modelização da evolução da fracção ligada em função do tempo com uma limitação difusional e uma razão VT/VP de 10 (concentração de transglutaminase de 1 U/ml). Verifica-se que, após esta modelização, o meio proteico efectua, sucessivamente, uma transição solução/gel, com uma primeira passagem do ponto de gel aos 80 minutos e depois uma transição gel/solução, com uma segunda passagem do ponto de gel aos 330 minutos. Segundo o modelo estabelecido pelos inventores, o meio proteico susceptivel de ser obtido apresenta propriedades novas, com uma capacidade de efectuar sucessivamente uma transição solução/gel e depois gel/solução, com um estado de gel mantido durante uma duração de 250 minutos.

Por isso, o efeito difusional foi considerado como tudo ou nada, a saber sem limitação antes da transição de gelificação e com uma limitação total para lá desta transição. As experiências previamente realizadas (ver 1-3) permitiram mostrar que as tensões difusionais aumentam à medida que a rede de ligações covalentes se desenvolve no gel. Este efeito progressivo foi tomado em linha de conta no modelo utilizando a fórmula seguinte:

Vt = kcAT-τ [To r em que α varia em função do tempo de forma hiperbólica de 1,1 a 1,85 (ver figura 5). 38 ΡΕ1824986 A Figura 7 representa o resultado de uma modelização da evolução da fracção ligada em função do tempo com uma limitação difusional progressiva e diferentes razões VT/VP (concentração de transglutaminase de 1 U/ml). Os resultados mostram mesmo assim transições solução/gel e depois gel/solução para as diferentes razões VT/VP representadas. Para a razão VT/VP de 10, o meio proteico atinge o ponto de gel em 15 minutos, o gel efectua de seguida uma transição gel/solução após 165 minutos. Em relação à modelização precedente, a consideração de uma limitação difusional progressiva prediz a obtenção de um gel durante 150 minutos em vez dos 250 minutos previamente. 1-5: formação de um gel na presença de transglutaminase e de termolisina simultaneamente:

Para validar o modelo teórico previamente descrito (ver 1-4), foram efectuadas diferentes experiências utilizando gelatina e transglutaminase nas mesmas condições que as previamente utilizadas (ver 1-3) . Para além disso, uma protease, a termolisina foi igualmente associada à solução de partida. A formação de géis foi seguida em função do tempo e a 40°C em função das concentrações de transglutaminase e de termolisina utilizadas. Os resultados obtidos, em comparação com as previsões do modelo teórico, são representados na tabela I seguinte:

Tabela I 39 ΡΕ1824986

Razão Tgase/ termo lisina Tgase (em U/ml) Termoli-sina (em U/ml) Teórico Experimental Formação de um gel Tempo de geli-ficação (min) Duração de vida do gel (min) Formação de um gel Tempo de geli-ficação (min) Duração de vida do gel (min) 10 0,4 0,04 sim 35 270 não - - 10 1 0,1 sim 15 150 Não - - 60 0,4 0,0067 sim 35 1600 Não - - 60 1 0,0167 sim 15 875 Não - - 75 0,4 0,0053 sim 35 2000 Não - - 75 1 0,013 sim 15 1150 Não - - 80 0,4 0,005 sim 40 3000 Sim 56 >4800 80 1 0,0125 sim 15 1200 sim 19 743

Os resultados mostram que, de acordo com o modelo teórico desenvolvido, é possível obter experimentalmente a partir de uma solução de monómeros polimerizáveis por ligações covalentes na presença de duas actividades enzi-máticas antagonistas (neste caso uma solução de gelatina a 5% na presença de diferentes concentrações de transgluta-minase e de termolisina) uma transição solução/gel e depois uma transição gel/solução, sucessivamente.

Se um tal gel for obtido em todas as simulações no final de um tempo que não dependa senão da actividade da Transglutaminase, as diferentes experiências mostram que existe uma razão VT/VP que constitui um valor limite para a primeira transição solução/gel. No caso de uma solução de gelatina a 5% na presença da transglutaminase e de termolisina, a razão VT/VP crítica para obter esta primeira 40 ΡΕ1824986 transição solução/gel está compreendida entre 75 e 80.

As diferentes experiências confirmam, para além disso o tempo de gelificação e a duração de vida do gel dependente da concentração de transglutaminase e de termolisina, respectivamente. A figura 7 mostra a evolução experimental das propriedades viscoelásticas de soluções de gelatina a 5% na presença de diferentes concentrações de transglutaminase e de termolisina a 40°C.

Em relação ao modelo teórico desenvolvido, é assim possivel obter um biomaterial capaz de efectuar sucessivamente uma transição solução/gel e depois gel/so-lução. Para isso, é suficiente determinar experimentalmente a razão critica de enzima que liga os monómeros/enzima que degrada os monómeros ligados para obter esta primeira transição solução/gel em função do monómero e dos enzimas utilizados. O modelo teórico permite em seguida adaptar, pelo menos, as diferentes concentrações enzimáticas de forma a obter um gel que apresente por um lado o tempo de gelificação e por outro lado a duração de vida desejados.

Foram realizadas experiências complementares nas quais a gelatina a 5% é adicionada de 1% de alginato ou de oligoalginato. Obtém-se, mesmo assim, uma transição solução/gel e depois gel/solução. 1-6 formação de um gel de gelatina na presença, 41 ΡΕ1824986 simultaneamente, de transglutaminase e de diferentes pro-teases:

Para confirmar o modelo desenvolvido, foram utilizadas diferentes proteases. A tripsina, EC 3-4-21-4 é uma serina protease que hidrolisa as ligações peptidicas das lisinas e argininas. A tripsina utilizada é de origem pancreática de bovino e comercializada pela SIGMA (T-1426). A actividade deste enzima é medido de acordo com a quantidade de enzima necessário para catalisar a hidrólise do éster metilico de p-tosil-arginina (Sigma T4626). A colagenase (EC 3.4.24.3) hidrolisa especi-ficamente as ligações peptidicas X-Gly das sequências Pro-X-Gly-Pro, que se encontra nomeadamente nas cadeias α do colagénio. A colagenase utilizada é obtida a partir de Clostridium histolyticum Tipo IA e comercializada pela Sigma (C-9891). A actividade deste enzima é medida de acordo com quantidade de enzima necessária para catalisar a hidrólise do N-(3-[2-furil]acriloil)-Leu-Gly-Pro-Ala ou FALGPA (Sigma F-5135).

Estas actividades enzimáticas foram medidas em relação à hidrólise de péptidos de sintese tendo um grupo cromóforo, para uma melhor comparação, a actividade da termolisina foi medida em relação à hidrólise de N-(3-[2-furil]acriloil)-Gly-Leu-amida (Sigma N-7383) . É esta actividade que é registada nas tabelas com várias 42 ΡΕ1824986 proteases.

Para os géis, a concentração de gelatina era de 7% e a temperatura de gelificação era de 40°C. A trans-glutaminase utilizada corresponde à transglutaminase descrita previamente. 0 seguimento dos géis com o tempo foi efectuado como em 1-5. Os resultados obtidos são representados na tabela II seguinte:

Tabela II

Razão Tgase/ protease Tgase (em U/ml) Protease (em U/ml) Experimental Formação de um gel Tempo de gelificação (min) Duração de vida do gel (min) 375 1,5 0,004 (16 nM termolisina) Sim 24 546 48 1,5 0,031 (31 nM tripsina) Sim 14 396 520 1,5 0,003 (16 nM colagenase) Sim 8 492

Os resultados mostram assim que o modelo é generalizado a outras proteases.

Exemplo 2: Gel físico: 2-1: desenvolvimento de um modelo teórico:

Este modelo dá conta do equilíbrio dinâmico observado no caso da formação de um gel físico unicamente 43 ΡΕ1824986 na presença de uma única actividade enzimática. A geli-ficação resulta então unicamente da formação de ligações de fraca energia (Van der Walls, ligações de hidrogénio, hidrófobas, etc.; H) entre os monómeros em solução (s) . No caso das proteínas, por exemplo, as suas propriedades de polielectrólitos fazem com que estas sejam quase todas capazes de formar géis fisicos. A degradação de polímeros que correspondem às cadeias de monómeros ligados (g) do gel é catalisada por um enzima (P) que os hidrolisa em monómeros solúveis (s) . Finalmente, existe em certos caso uma terceira reacção também catalisada pelo enzima (P) que consiste na hidrólise dos monómeros solúveis em monómeros degradados (f) de dimensão muito pequena para participar na rede ou que não podem formar ligações com outros monómeros solúveis. Esta última reacção que se traduz por uma fuga de monómeros do ciclo é igualmente ajustada ao modelo. 0 modelo pode ser simplesmente representado segundo o esquema reaccional seguinte:

Esquema II:

Sn s ima que degrada a» cadeias de moRémeros ligados

Cadeias de monémexoa ligados Cg} iaziffià que degrada as cadeias de monómeros ligados CF}

Monómeros em solução C»} 14+.·* .44.4» A': j,.*' · * *í jf ΣΖ

Sonômeros legxadados (£’

Formação- de ligações não cova lentes {£étnicas, hidrófobas, etc.} (H) 44 ΡΕ1824986

Neste último caso, o mecanismo reaccional pode ser simplesmente descrito pelas três equações diferenciais que se sequem, em que as reacções enzimáticas são equiparadas a reacções michaelianas simples e por uma quarta equação de conservação da massa. A equação diferencial permite descrever a evolução do número de cadeias de monómeros liqados (g) em função do tempo é a seguinte: dg ~ - v; x g + vs dt + g A equação diferencial que permite descrever a evolução do número de monómeros em solução (s) em função do tempo é a seguinte: ds « x g ~........V'. x s ~ vs dt Kp + g Kp + b A equação diferencial que permite descrever a evolução do número de monómeros degradados (f) em função do tempo é a seguinte: df » Vr{ x s dt KF + a

Finalmente, a equação de conservação da massa permanece inalterada: 45 ΡΕ1824986 + a* + ft «Só

Nestas equações diferenciais, VP representa a velocidade máxima para o enzima que degrada os monómeros e KP representa a constante de Michaelis para este mesmo enzima.

Nestas equações diferenciais, VP é calculado segundo a equação seguinte: V, ** D? ã

Para além disso, VH que representa a velocidade de formação das ligações de fraca energia, depende do monómero utilizado.

Na tansposição desta equação para um sistema in vitro, os diferentes valores de [P], VP, Vh e KP correspondem a constantes.

As concentrações de substratos são calculados no principio, estas são em seguida determinadas no decurso da reacção com a ajuda das diferentes equações diferenciais. 2-2 modelização da formação de um gel físico de gelatina a 27eC na presença de termolisina:

Este modelo teórico foi aplicado à formação de um gel fisico de proteínas e, mais precisamente, de gelatina a 46 ΡΕ1824986 27°C e na presença de termolisina. A esta temperatura, a gelatina forma um gel por associação parcial de monómeros em hélices triplas. Estas hélices triplas, estabilizadas por ligações de hidrogénio, aparecem por abaixamento da temperatura.

Gelatina: 1-Descritivo: A gelatina é obtida a partir de colagénio. 0 colagénio é sintetizado sob a forma de precursores de grande dimensão; as pro-cadeias α. A formação de pro-colagénio é acompanhada por uma ligação de três pro-cadeias α através de ligações de hidrogénio e de hidroxilação de certos resíduos prolina e lisina para formar hidroxiprolina e hidroxilisina respectivamente. Finalmente, após secreção do pro-colagénio no meio extracelular, o pro-colagénio é maturado por clivagem dos pro-péptidos para formar o colagénio. Este último é então susceptível de se associar com outras moléculas de colagénio para formar fibrilas de colagénio, as quais se agregam para formar fibras de colagénio. A estabilidade de hélice tripla formada por associação das três pro-cadeias α é função do organismo de onde é originada. A temperatura de desnaturação (Tm) vai assim de 41,5°C para certos mamíferos a 6°C para certos peixes que vivem nas águas do Ártico. A variação de Tm está correlacionada com a taxa de hidroxiprolina na molécula (PERSIKOV et al., Biochemistry, vol. 39, p: 14960-14967, 2000). 47 ΡΕ1824986 A gelatina é obtida por tratamento ácido ou alcalino de tecidos que contêm colagénio, que conduz à desnaturação da hélice tripla do colagénio (PEZRON, Physical Networks, Londres Elsevier Applied Science, 1990) . Neste estudo, as gelatinas utilizadas correspondem a gelatinas do tipo A obtidas através de um tratamento ácido.

Quando a solução de gelatina semi-diluida é arrefecida abaixo da temperatura de desnaturação das cadeias de colagénio, forma-se um gel. As cadeias associam-se então para formar porções de hélices triplas semelhantes às do colagénio nativo. Esta transição conformacional permite a criação de uma rede tridimensional que retém as moléculas de água presentes. O gel formado é então um gel fisico, as hélices triplas não são estabilizadas se não através de ligações de hidrogénio (ligações fracas). Estas ligações são desestabilizadas aumentando a temperatura o que provoca a dissolução do gel: este fenómeno de gelificação é assim reversível.

Estudos precedentes mostraram que a elasticidade deste gel está ligada unicamente à concentração de hélices da amostra (JOLY-DUHAMEL et al. , Langmuir, vol. 18, p: 7158-7166, 2002; JOLY-DUHAMEL et al., Langmuir, vol. 18, p: 7208-7217, 2002) . 48 ΡΕ1824986 2- Concentração: A concentração de gelatina utilizada é a mesma que determinada pelo exemplo 1. 3- Velocidade de formação das hélices: A determinação da velocidade de formação das hélices triplas (VH) foi efectuada seguindo a mudança de conformação nove-lo/hélice por polarimetria em função do tempo ou da temperatura. Com efeito, a ligeira torção que resulta da formação da hélice tripla ocasiona uma ligeira rotação de uma luz polarizada que atravessa a amostra. Este estudo foi efectuado com a ajuda de um polarimetro PERKIN ELMER 341 ou de um polarimetro JASCO 1100. As medições foram efectuadas a 436 nm. O estudo por polarimetria da cinética de formação de gel de gelatina do tipo A (tipo A ou AP1) permitiu determinar, para cada gelatina, a evolução da percentagem de hélices em função do tempo e a 27°C. A figura 9 mostra a evolução da percentagem de hélices de soluções a 5% das duas gelatinas do tipo A utilizadas (tipo A e AP1) em função do tempo e com um arrefecimento de 40°C a 27°C a uma velocidade de 0,5°C/minuto.

Os resultados mostram que as cinéticas de aparecimento são globalmente idênticas nas duas amostras. No tempo de gelificação, a percentagem das hélices é idêntica para as duas gelatinas (6,4% aos 40 minutos). 49 ΡΕ1824986 A velocidade de formação das hélices pode ser calculada simplesmente a partir da figura 9. A figura 10 mostra igualmente a evolução da percentagem das hélices em função do tempo e da temperatura para um gel físico sem transglutaminase (quadrados a cheio) e para um gel químico obtido na presença da transglutaminase (círculos não cheios). A velocidade de aparecimento das hélices foi determinada para diferentes intervalos de tempo e utilizada no modelo. Assim, para a figura 10 e para o gel físico, VH é de 45 10-5 M.min-1 durante 10 minutos, 21 10-5 M.min-1 durante 10 minutos, 9 10-5 M.min-1 durante 20 minutos e depois de 4,5 10"5 M.min-1 durante os 90 minutos seguintes e finalmente 2,5 10-5 M.min-1.

Experiências semelhantes foram efectuadas com géis de gelatina de 2 a 10%.

Enzimas: A protease utilizada corresponde à termolisina utilizada no exemplo 1. os parâmetros utilizados são assim os mesmos que anteriormente. Todavia, foi tomado em linha de conta a sensibilidade diferente dos dois enzimas a esta temperatura: * para TL (Vi40°c = 1,66 Vi27°c) * para TG (V14o°c = 2,68 Vi27°c) ΡΕ1824986 50

Modelização : A partir dos diferentes valores previamente determinados, é possível seguir o comportamento da fracção ligada em função do tempo aplicando o método de aproximação de Euler para resolver as equações diferenciais como anteriormente. Várias experiências de modelização foram efectuadas utilizando diferentes concentrações de termo-lisina. A figura 11 apresenta alguns exemplos de modelização da evolução da percentagem de cadeias ligadas na presença de diferentes concentrações de termolisina a 27°C (o limite de gel corresponde a 6,4% de hélice). Os resultados obtidos mostram que para certos valores de VP uma transição é possível e que, em todos os casos, a fuga devida à hidrólise de pequenos fragmentos conduza à degradação da rede e assim à solubilização do gel formado. 2-3: formação de um gel físico de gelatina na presença de termolisina

Para validar este modelo teórico, foram realizadas diferentes experiências segundo o mesmo protocolo que descrito anteriormente (ver 2-2) e ajudando diferentes concentrações de termolisina. Os resultados obtidos, em comparação com as previsões do modelo teórico, são apresentados na tabela III seguinte: ΡΕ1824986 51

Tabela III

Termolisina (em U/ml) Teórico Experimental Formação de um gel Tempo de gelificação (min) Duração de vida do gel (unidades) Formação de um gel Tempo de gelificação (min) Duração de vida do gel (min) 0,1 Não 0,02 Não 0,015 Não 0,0125 Sim 110 5000 0,01 Sim 110 6000 Não - - 0,004 110 20 000 Sim 45 Cerca 4300 0,0085 110 9000 Sim 68 254

Os resultados mostram, mesmo assim, que de acordo com o modelo teórico desenvolvido, é possível obter experimentalmente uma transição solução/gel e depois uma transição gel/solução sucessivamente, e isto a partir de uma solução de monómeros capazes de polimerizar através da formação de ligações de fraca energia e na presença de um enzima capaz de degradar as cadeias de polímeros ligadas (neste caso, uma solução de gelatina a 5% e a 27°C na presença de diferentes concentrações de termolisina).

Verifica-se que para todas as concentrações de termolisina testadas (de 0,001 a 0,1 U/ml) , o gel, se for formado, acaba por fundir, o que está de acordo com o modelo teórico desenvolvido.

No caso de uma solução de gelatina a 5% a 27°C e na presença de termolisina, a concentração de termolisina 52 ΡΕ1824986 crítica para obter uma primeira transição solução/gel é de 0,01 unidade. O tempo de gelificação depende então igualmente da concentração em termolisina utilizada. A figura 12 mostra a evolução experimental das propriedades viscoelásticas da solução de gelatina a 5% na presença de diferentes concentrações de termolisina e a 27 °C.

Em relação ao modelo teórico desenvolvido, é assim possível obter um biomaterial capaz de efectuar sucessivamente uma transição solução/gel e depois gel/so-lução. Para isso, é suficiente determinar a concentração crítica de enzima capaz de degradar as cadeias de monómeros ligadas através de interacções de fraca energia. O modelo teórico permite em seguida adaptar a concentração enzi-mática para obter um gel que apresente por um lado o tempo de gelificação e por outro lado a duração de vida desej ados.

Exemplo 3 Gel misto: 3-1. desenvolvimento de vim modelo teórico

Este modelo completo corresponde ao equilíbrio dinâmico obtido pela formação de um gel misto (físico e químico) na presença de duas actividades enzimáticas 53 ΡΕ1824986 antagonistas. 0 modelo pode ser simplesmente representado segundo o esquema reaccional seguinte (integrando os dados dos esquemas I e II):

Esquema III:

Bin^i®® que degreda a» cadeias d© no&émezos ligados (F)

Cadeia» d© moRémeros ligados fg)

Enrista que degrada as cadeia» de saonómeros ligado» fF}

Jionómsros © soluç&o {m)

Sonómeros íegradsdo s

Enzima que liga os jsouómeros através de ligações covalentas (T)

Form&gfto de ligações n&o covaientes (iónicas, hidrófobas, etc.}(H)

Neste terceiro caso, o mecanismo reaccional pode ser simplesmente descrito através das três equações diferenciais que se seguem, em que as reacções enzimáticas são equiparadas a reacções michaelianas simples e por uma quarta equação de conservação da massa. A equação diferencial permite descrever a evolução do número de cadeias de monómeros ligados (g) em função do tempo é a seguinte: 54 ΡΕ1824986

áâL ~ -_V*........... x g + x a + R cft Jíp + g- JTy + s A equação diferencial que permite descrever a evolução do número de monómeros em solução (s) em função do tempo é a seguinte: ásL · r rr- - * g ~ * s - p'» x b - r* í* + g JCr + s K# 4· s A equação diferencial que permite descrever a evolução do número de monómeros degradados (f) em função do tempo é a seguinte: df « V'n X 3 dt JTy + s

Finalmente, a equação de conservação da massa permanece é a seguinte: gfc + s« + f* «S6

Nestas equações diferenciais, VH representa a velocidade de formação das ligações de fraca energia e depende do monómero utilizado, VP e VT representam as velocidades máximas para o enzima P e T respectivamente, KP e KT representam as constantes de Michaelis para o enzima P e T, respectivamente.

Na transição desta equação para um sistema in vitro, os diferentes valores de [P], [T], VP, VT, KP e KT correspondem a constantes. 55 ΡΕ1824986 3-2 modelização da formação de um gel misto de gelatina a 27aC na presença de transglutaminase e de termolisina:

Este modelo teórico foi aplicado à formação de um gel misto de proteina e, mais especificamente, de gelatina a 27°C e na presença de transglutaminase e de termolisina.

Gelatina: A concentração de gelatina utilizada é a mesma que nos exemplos 1 e 2. A transglutaminase é a mesma que utilizada no exemplo 1. Os coeficientes de difusão foram integrados tal como descrito no exemplo 1 para ter em conta o efeito da difusão na actividade da transglutaminase.

Os parâmetros utilizados para estes dois enzimas são assim os mesmos que os descritos previamente.

Modelização: A partir dos diferentes valores previamente determinados, é possível seguir o comportamento da fracção ligada em função do tempo aplicando o método de Euler de ajuste das equações diferenciais como anteriormente. Várias experiências de modelização foram efectuadas utilizando 56 ΡΕ1824986 diferentes concentrações de transgultaminase e de termolisina. Foi aplicado um coeficiente de difusão para a transglutaminase tal como descrito para o exemplo 1. A figura 13 mostra a evolução da fracção de monómeros ligados em função do tempo e para diferentes razões VT/VP (com uma concentração de transglutaminase de 1 U/ml).

Os resultados sugerem, por um lado, que a gelificação é mais rápida que nos exemplos anteriores e, por outro lado, que a fracção de monómeros ligados e a estabilidade dos géis são mais importantes do que nos géis fisicos ou qimicos. 3-3: formação de um gel misto de gelatina na presença da termolisina:

Para validar o modelo teórico previamente descrito, foi efectuada uma experiência com uma amostra de gelatina a 5% e a 40°C, na presença de dois enzimas, transglutaminase e termolisina, com uma razão Transglutami-naseG/Termolisina de 80 e uma concentração de transglutaminase de 1 U/ml. A solução foi arrefecida de 40°C a 27°C com uma velocidade de 0,5°C por minuto. A evolução da solução de gelatina é seguida simultaneamente através de reologia e polarimetria, tal como previamente descrito. O resultado obtido, em comparação com as previsões do modelo teórico, está representado na tabela IV seguinte ΡΕ1824986 57

Tabela IV

Razão Tgase/ Termolisina Tgase (em U/ml) Termolisina (em U/ml) Teórico Experimental Formação de um gel Tempo de gelifica-ção (min) Duração de vida do gel (min) Formação de um gel Tempo de gelifica-ção (min) Duração de vida do gel (min) 80 1 0,0125 Sim <5 15000 Sim 2 >5000 80 0,4 0,005 Sim 15 >17000 nd 50 1 0,02 Sim <5 5000 nd 50 0,4 0,008 Sim 15 9000 nd 10 1 0,1 Sim <5 750 nd 10 0,4 0,04 Sim 15 1000 nd nd: não determinado

Os resultados mostram que, de acordo com o modelo teórico desenvolvido, é possível obter experimentalmente a partir de uma solução de monómeros polimerizáveis através de ligações de baixa energia e através de ligações covalentes e na presença de duas actividades enzimáticas antagonistas (neste caso, uma solução de gelatina a 5%, a 27°C e na presença de diferentes concentrações de transglu-taminase e de termolisina) uma transição solução/gel e depois uma transição gel/solução sucessivamente.

De acordo com o modelo teórico desenvolvido, o tempo de formação do gel é muito rápido. Para além disso, a estabilidade e a duração de vida do gel "misto" obtido é muito importante em relação aos géis físicos e igualmente químicos. A figura 14 mostra a evolução simultânea das 58 ΡΕ1824986 propriedades viscoelásticas e da percentagem de hélice de uma solução de gelatina a 5% na presença de transgluta-minase e de termolisina, com uma razão de transgluta-minase/termolisina de 80 e uma concentração de transglu-taminase de 1 U/ml e a 27°C.

Em relação ao modelo teórico desenvolvido, que é baseado nos modelos teóricos precedentes, é possivel obter um biomaterial capaz de efectuar, sucessivamente, uma transição solução/gel e de pois gel/solução. Para isso é suficiente determinar experimentalmente a razão critica de enzima que liga os monómeros/enzima que degrada os monó-meros ligados como no exemplo 1 para se obter uma primeira transição solução/gel em função dos monómeros e dos enzimas utilizados. O modelo teórico permite em seguida adaptar as diferentes concentrações enzimáticas de forma a obter um gel que apresente, por um lado, o tempo de gelificação e, por outro lado, a duração de vida desejados. 3-4: formação de um gel de gelatina na presença de diferentes proteases:

Para confirmar os resultados obtidos em 3-3 foram efectuadas experiências com amostras de gelatina a 7% e a 40°C, na presença de transglutaminase e de diferentes proteases com uma concentração de transglutaminase de 1,5 U/ml. A solução foi arrefecida de 40°C a 27°C com a velocidade de 0,5°C por minuto. A evolução da solução de gelatina é seguida simultaneamente em reologia e em 59 ΡΕ1824986 polarimetria, tal como descrito previamente. Os resultados obtidos são representados na tabela V seguinte:

Tabela IV

Razão Tgase/ protease Tgase (em U/ml) Protease (em U/ml) Experimental Formação de um gel Tempo de gelificação (min) Duração de vida do gel (min) 115 1,5 0,013 termolisina Sim 46 404 14 1,5 0,11 tripsina Sim 48 >1500 3750 1,5 0,0004 colagenase Sim 26 475

Os resultados mostram mesmo assim que o modelo desenvolvido é generalizável a outros enzimas.

Lisboa, 1 de Abril de 2010

Claims (14)

1. ΡΕ1824986 1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo de preparação de um biomaterial compreendendo: - pelo menos um monómero capaz de formar polímeros ou uma mistura dos referidos monómeros e seus polímeros, em que o referido monómero é uma proteína escolhida do grupo compreendendo a fibrina, a gliadina, a miosina, a globulina (7 S e HS), a actina, a mioglobina, o colagénio e seus derivados, as proteínas do soro do leite, as proteíns da soja e do trigo, e as proteínas da gema e da clara do ovo e/ou um sacárido capaz de formar os polímeros escolhidos do grupo compreendendo as carragenanas, os alginatos, as pectinas, o quitosano, a celulose, a quitina, o glicogénio e o amido, um primeiro tipo de enzima capaz de degradar os referidos polímeros, sendo o referido primeiro tipo de enzima capaz de degradar os referidos polímeros escolhido em função da natureza proteica ou sacarídica dos referidos polímeros, no grupo compreendendo os enzimas da família das metaloproteinases, a família das serinas proteases, a família ds cisternas e aspartato proteases e a família ADAM, as carragenases, as pectinas liases, as poligalacturonases, as pectinas estearases, as alginatos liases e as fosforilases e 2 ΡΕ1824986 - eventualmente um segundo tipo de enzima capaz de efectuar ligações covalentes entre os referidos monómeros, apresentando-se o referido biomaterial quer sob a forma de um gel quer sob a forma de uma solução e sendo susceptivel de efectuar sucessivamente uma transição solução/gel eventualmente sob a acção do segundo tipo de enzima e depois sob a acção do primeiro tipo de enzima, uma segunda transição gel/solução, sendo o referido processo caracterizado por compreender a mistura no seio de um solvente adequado: (i) pelo menos um monómero capaz de formar polímeros; (ii) um primeiro tipo de enzima capaz de degradar os referidos polímeros; e eventualmente (iii) um segundo tipo de enzima capaz de efectuar ligações covalentes entre os referidos monómeros; mistura na qual a concentração em monómeros capazes de formar polímeros, a concentração em enzima capaz de degradar os referidos polímeros e eventualmente a concentração do enzima capaz de efectuar as ligações covalentes entre os referidos monómeros são escolhidos de forma a que a resolução das equações (I), (II), (III) e (IV) seguintes: âSL <fÉ <1> 1 1 x g + Vj, x a + Ve KT ♦ B 3 ΡΕ1824986 ds * . ν’» x g - x a ~ V', x s - ve <xi> dt jTj, + g j:y s itj, + s d/ » x: β <I*X) dfc Kp. + a gt + St + f« »3« ' (XV) equações essas que descrevem, respectivamente, a evolução do número de monómeros ligados (dg) (I), a evolução do número de monómeros em solução (ds) (II) e a evolução de monómeros degradados (df) em função do tempo (dt) (III) e a equação de conservação da massa (IV), em que: - g corresponde à quantidade de monómeros sob forma ligada, - t corresponde ao tempo, - Vp corresponde à velocidade do enzima capaz de degradar os polímeros expressos em quantidade de monómeros ligados levados à sua forma livre pelo referido enzima e por unidade de tempo, - KP representa a constante de Michaelis do enzima capaz de degradar os polímeros, - s representa a quantidade de monómeros sob forma livre, VT corresponde à velocidade do enzima capaz de efectuar ligações covalentes entre os monómeros expressa em quantidade de monómeros sob forma livre ligados pelo referido enzima e por unidade de tempo, - KT representa a constante de Michaelis do enzima 4 ΡΕ1824986 capaz de efectuar ligações covalentes entre os monó-meros. - VH representa a velocidade de ligação, para ligações de fraca energia e por unidade de tempo, de monómeros sob forma livre, no caso de monómeros capazes de polimerizar através de tais ligações, - V'P corresponde à velocidade do enzima capaz de degradar monómeros sob forma livre expressa em quantidade de monómeros degradados, os quais não podem mais polimerizar, gerados pelo referido enzima e por unidade de tempo, - gt corresponde à quantidade de monómeros sob forma ligada no tempo t, - st corresponde à quantidade de monómeros sob forma livre no tempo t, - ft corresponde à quantidade de monómeros degradados que não são capazes de formar polímeros no tempo t, - So corresponde à quantidade inicial de monómeros, e permitem obter um tempo de gelificação e a duração do gel adequados.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, na qual o solvente adequado é um solvente aquoso.
3. 3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, no qual a quantidade de monómeros capazes de formar polímeros está compreendida entre 0,1 e 30% em peso em relação ao peso total do biomaterial. 5 ΡΕ1824986
4. 4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, no qual a razão da concentração em enzima capaz de efectuar as ligações covalentes entre os monómeros em relação à concentração de enzimas capazes de degradar os polímeros é superior ou igual a 1.
5. 5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, no qual a concentração de enzima capaz de efectuar ligações covalentes entre os monómeros é superior a 0,001 U/ml.
6. 6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, compreendendo para além disso uma etapa de liofilização do biomaterial sob a forma de gel.
7. 7. Biomaterial obtido por um processo de cordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
8. 8. Biomaterial de acordo com a reivindicação 7, no qual os dois tipos de enzimas estão presentes simultaneamente numa forma não activada.
9. 9. Biomaterial de acordo com a reivindicação 8, no qual o enzima é uma metaloproteinase.
10. 10. Biomaterial de acordo com a reivindicação 9, no qual o enzima é uma termolisina bacteriana. 6 ΡΕ1824986
11. 11. Biomaterial de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, no qual o referido monómero é uma proteina capaz de formar polimeros e o segundo tipo de enzima capaz de efectuar ligações covalentes entre os monómeros das proteínas é escolhido do grupo que compreende a família das lisil oxidases e a família das transglu-taminases.
12. 12. Biomaterial de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, no qual a razão da concentração do segundo tipo de enzima em relação à concentração do primeiro tipo de enzima é superior ou igual a 1.
13. 13. Biomaterial de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, que compreende para além disto um solvente aquoso.
14. 14. Biomaterial de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13, que se encontra sob a forma de um gel liofilizado. Lisboa, 1 de Abril de 2010