PT1759013E - Identificação de antigénios associados à superfície para diagnóstico e terapia de tumores - Google Patents

Description

ΕΡ 1 759 013/ΡΤ DESCRIÇÃO "Identificação de antigénios associados à superfície para diagnóstico e terapia de tumores"

Apesar de abordagens interdisciplinares e da utilização exaustiva de procedimentos terapêuticos clássicos, os cancros estão ainda entre as causas principais de morte. Os conceitos terapêuticos mais recentes almejam a incorporação do sistema imunitário do paciente no conceito terapêutico global utilizando vacinas tumorais recombinantes e outras medidas especificas tais como terapia com anticorpos. Um pré-requisito para o sucesso desta estratégia é o reconhecimento de antigénios ou epítopos específicos de tumores ou associados a tumores pelo sistema imunitário do paciente cujas funções efectoras se pretendem intervencionalmente melhoradas. As células tumorais diferem substancialmente, do ponto de vista biológico, das suas células de origem não malignas. Estas diferenças devem-se a alterações genéticas adquiridas durante o desenvolvimento do tumor e resultam, inter alia, também na formação de estruturas moleculares qualitativa ou quantitativamente alteradas nas células cancerosas. As estruturas associadas a tumores deste tipo que são reconhecidas pelo sistema imunitário específico do hospedeiro portador do tumor são referidas como antigénios associados a tumores. 0 reconhecimento específico de antigénios associados a tumores envolve mecanismos celulares e humorais que são duas unidades funcionalmente interligadas: os linfócitos T CD4+ e CD8+ reconhecem os antigénios processados apresentados pelas moléculas do MHC (complexo principal de histocompatibilidade) das classes II e I, respectivamente, enquanto os linfócitos B produzem moléculas de anticorpos circulantes que se ligam directamente a antigénios não processados. A potencial importância clínico-terapêutica de antigénios associados a tumores resulta do facto de o 2 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ reconhecimento de antigénios em células neoplásicas pelo sistema imunitário conduzir à iniciação de mecanismos efectores citotóxicos e, na presença de células T auxiliares, poder causar a eliminação das células cancerosas (Pardoll, Nat. Med. 4:525-31, 1998). Assim, um objectivo central da imunologia tumoral é definir molecularmente estas estruturas. A natureza molecular destes antigénios foi enigmática durante muito tempo. Apenas após o desenvolvimento de técnicas de clonagem apropriadas foi possível rastrear sistematicamente bibliotecas de expressão de ADNc de tumores quanto a antigénios associados a tumores através da análise das estruturas alvo de linfócitos T citotóxicos (CTL) (van der Bruggen et al. , Science 254:1643-7, 1991) ou utilizando auto-anticorpos circulantes (Sahin et al., Curr. Opin. Immunol. 9:709-16, 1997) como sondas. Para este fim, prepararam-se bibliotecas de expressão de ADNc a partir de tecido tumoral fresco e expressaram-se recombinantemente na forma de proteínas em sistemas adequados. Imunoefectores isolados de pacientes, nomeadamente clones de CTL com padrões de lise específicos de tumores, ou auto-anticorpos circulantes foram utilizados para clonagem dos antigénios respectivos.

Em anos recentes foram definidos uma multiplicidade de antigénios em várias neoplasias através destas abordagens. A classe de antigénios do cancro/testículos (CTA) é de grande interesse aqui. Os CTA e os genes que os codificam (genes de cancro/testículos ou CTG) são definidos pelo seu padrão de expressão característico [Tureci et al., Mol. Med Today. 3:342-9, 1997]. Não se encontram em tecidos normais, excepto em células dos testículos e germinais, mas são expressos em vários malignomas humanos, não especificamente relativamente ao tipo de tumor mas com diferente frequência em entidades tumorais de muitas origens diferentes (Chen & Old, Câncer J. Scz. Am. 5:16-7, 1999). Não se encontram anticorpos contra CTA em indivíduos saudáveis mas sim em pacientes de tumores. Esta classe de antigénios, em particular devido à sua distribuição pelos tecidos, é particularmente valiosa para projectos imunoterapêuticos e está a ser testada em estudos 3

ΕΡ 1 759 013/PT clínicos com pacientes correntes (Marchand et al., Int. J. Câncer 80 :219-30, 1999; Knuth et al., Câncer Chemother. Pharmacol. 46:p46-51, 2000).

Contudo, as sondas utilizadas para a identificação de antigénios nos métodos clássicos acima ilustrados são imunoefectores (auto-anticorpos circulantes ou clones de CTL) de pacientes usualmente possuindo já cancro avançado. Vários dados indicam que os tumores podem conduzir, por exemplo, a tolerização e anergização de células T e que, durante o decorrer da doença, especialmente as especificidades que podem causar reconhecimento imunitário eficaz, são perdidas do repertório imunoefector. Os estudos de pacientes correntes ainda não produziram qualquer evidência sólida de uma real acção dos antigénios associados a tumores anteriormente encontrados e utilizados. Assim, não se pode excluir que proteínas que evocam respostas imunitárias espontâneas sejam as estruturas alvo erradas. DATABASE EMBL [Online] Maio 28, 2002, n.° de acesso na base de dados BQ427878, DATABASE EMBL [Online] Abril 15, 2003, n.° de acesso na base de dados AX714011, DATABASE EMBL [Online] Outubro 31, 2001, n.° de acesso na base de dados AK056023 e DATABASE UniProt [Online] Dezembro 1, 2001, n.° de acesso na base de dados Q96N35, são entradas de bases de dados que divulgam as sequências de ácido nucleico e uma sequência de aminoácidos, respectivamente. Nada é afirmado em relação à função ou a uma potencial utilização destas sequências. Em WO 03/076631 descrevem-se produtos génicos que são diferentemente expressos em tumores e a sua utilização. Em WO 03/000928 descrevem-se processos para a identificação de moléculas possuindo um grau diferente de expressão sobre a superfície de células cancerosas em relação a células não malignas.

Foi o objecto da presente invenção proporcionar estruturas alvo para um diagnóstico e terapia de cancros. 4

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De acordo com a invenção, este objecto é conseguido através da matéria objecto das reivindicações.

De acordo com a invenção, desenvolveu-se uma estratégia para identificar e proporcionar antigénios expressos em associação com um tumor e os ácidos nucleicos que os codificam. Esta estratégia baseia-se na avaliação de bases de dados de proteínas e ácidos nucleicos humanos em relação a potenciais antigénios específicos de cancros que são acessíveis na superfície celular. A definição dos critérios de selecção que são necessários para isto juntamente com uma metodologia de elevado rendimento para a análise de todos os genes, se possível, forma a parte central da invenção. 0 processamento dos dados ("data mining") produz primeiro uma lista que é tão completa quanto possível de todos os genes conhecidos que de acordo com o princípio básico "gene - ARNm - proteína" são examinados quanto à presença de um ou mais domínios transmembranares. Isto é seguido por uma busca de homologia, uma classificação das correspondências em grupos específicos de tecidos (entre outros tecidos tumorais) e uma inspecção da real existência do ARNm. Finalmente, as proteínas que são identificadas desta maneira são avaliadas quanto à sua activação aberrante em tumores, e.g. por análises da expressão e procedimentos de química das proteínas. A prospecção de dados ("data mining") é um método conhecido de identificação de genes associados a tumores. Nas estratégias convencionais, contudo, transcritomas de bibliotecas de tecidos normais são usualmente subtraídos electronicamente de bibliotecas de tecidos tumorais, com o pressuposto de que os genes restantes são específicos de tumores (Schmitt et al., Nucleic Acids Res. 27:4251-60, 1999; Vasmatzis et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 95:300-4, 1998; Scheurle et al., Câncer Res. 60:4037-43, 2000). 0 conceito da invenção, contudo, baseia-se na utilização de prospecção de dados ("data mining") para extrair electronicamente todos os genes que codificam para 5

ΕΡ 1 759 013/PT antigénios específicos de cancros que são acessíveis nas superfícies celulares e depois na avaliação dos referidos genes quanto a expressão ectópica em tumores. A estratégia para a identificação de genes diferencialmente expressos em tumores combina prospecção de dados ("data mining") em bibliotecas de sequências públicas ("in silico ) com subsequentes estudos experimentais em laboratório ("wet bench").

Uma estratégia combinada baseada em diferentes guiões bioinformáticos permitiu a identificação de genes que codificam para antigénios específicos de cancros que são acessíveis nas superfícies celulares. Estes genes associados a tumores e os produtos génicos por eles codificados foram identificados independentemente de uma acção imunogénica. A propriedade dos antigénios associados a tumores identificados estarem localizados sobre ou na superfície celular qualifica-os como alvos ou como meios adequados para terapia e diagnóstico. É especialmente adequada para isto uma parte dos antigénios associados a tumores identificados que corresponde à porção não transmembranar, em particular a porção extracelular, dos antigénios, ou é por ela constituída. Portanto, uma parte dos antigénios associados a tumores identificados que corresponde à porção não transmembranar dos antigénios ou é por ela constituída, ou uma parte correspondente dos ácidos nucleicos que codificam para os antigénios identificados são preferidas para terapia ou diagnóstico. Similarmente, é preferida a utilização de anticorpos que são dirigidos contra uma parte dos antigénios associados a tumores identificados que corresponde à porção não transmembranar dos antigénios ou é por ela constituída.

Num aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais componentes seleccionados do grupo que consiste em: 6 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ (i) um anticorpo que se liga a um antigénio associado a um tumor, (ii) um antigénio associado a um tumor ou um seu fragmento que compreende pelo menos 6 aminoácidos contíguos, (iii) um ácido nucleico que codifica um antigénio associado a um tumor ou um seu fragmento que compreende pelo menos seis aminoácidos contíguos, (iv) uma célula hospedeira que expressa um antigénio associado a um tumor ou um seu fragmento que compreende pelo menos seis aminoácidos contíguos e (v) complexos isolados de um antigénio associado a um tumor ou um seu fragmento e uma molécula de HLA, em que o antigénio associado a um tumor (a) compreende a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO:10 ou (b) possui uma sequência que é codificada por um ácido nucleico possuindo pelo menos 90% de identidade com o ácido nucleico de acordo com SEQ ID NO: 9 para o tratamento de, e/ou vacinação contra, um cancro caracterizado pela expressão ou expressão anormal do antigénio associado a um tumor, em que o cancro é seleccionado do grupo que consiste em tumor da mama, tumor do pulmão, tumor do esófago, tumor do cólon, tumor do estômago, tumor pancreático, tumor do fígado, tumor ovariano, tumor da próstata, tumor dos ouvidos, nariz e garganta (ONG), tumor renal, tumor cervical, tumor da pele e tumor uterino.

Numa concretização preferida, o anticorpo liga-se selectivamente ao antigénio associado a um tumor, tem actividade inibidora tumoral e é selectivo para células que expressam ou expressam anormalmente o antigénio associado a um tumor.

Numa concretização preferida, os componentes em (ii), (iii), (iv) e (v) aumentam selectivamente a quantidade de 7

ΕΡ 1 759 013/PT complexos de uma molécula de HLA e o antigénio associado a um tumor ou um seu fragmento.

Numa concretização preferida, o ácido nucleico em (iii) está presente num vector de expressão.

Numa concretização preferida, a célula hospedeira segrega o antigénio associado a um tumor ou o seu fragmento. Numa outra concretização preferida, a célula hospedeira adicionalmente expressa uma molécula de HLA que se liga ao antigénio associado a um tumor ou ao seu fragmento, em que a célula hospedeira expressa preferivelmente a molécula de HLA e/ou o antigénio associado a um tumor ou o seu fragmento de uma maneira recombinante ou expressa a molécula de HLA endogenamente. Preferivelmente, a célula hospedeira não é proliferativa. Preferivelmente, a célula hospedeira é uma célula apresentadora de antigénio.

Numa concretização preferida, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, quimérico ou humanizado ou um fragmento de um anticorpo. Preferivelmente, o anticorpo está acoplado a um agente terapêutico ou de diagnóstico.

Em concretizações particulares, um antigénio associado a um tumor, proporcionado por uma composição farmacêutica da invenção, seja directamente ou por via da expressão de um ácido nucleico, ou uma sua parte, liga-se a moléculas do MHC na superfície de células, a referida ligação causando preferivelmente uma resposta citolitica e/ou induzindo libertação de citoquinas.

Uma composição farmacêutica da invenção pode compreender um transportador e/ou um adjuvante farmaceuticamente compatíveis. O adjuvante pode ser seleccionado entre saponina, GM-CSF, oligonucleótidos CpG, ARN, uma citoquina ou uma quimioquina.

Num segundo aspecto, a invenção refere-se a um método para o diagnóstico de uma doença cancerosa caracterizada 8 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ pela expressão ou expressão anormal de um antigénio associado a um tumor compreendendo a detecção de: (i) um ácido nucleico que codifica o antigénio associado a um tumor e/ou (ii) o antigénio associado a um tumor numa amostra biológica isolada de um paciente, em que o antigénio associado a um tumor (a) compreende a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 10 ou (b) tem uma sequência que é codificada por um ácido nucleico possuindo pelo menos 90% de identidade com o ácido nucleico de acordo com SEQ ID NO: 9, em que a doença cancerosa é seleccionada do grupo que consiste em tumor da mama, tumor do pulmão, tumor do esófago, tumor do cólon, tumor do estômago, tumor pancreático, tumor do fígado, tumor ovariano, tumor da próstata, tumor dos ouvidos, nariz e garganta (ONG), tumor renal, tumor cervical, tumor da pele e tumor uterino.

Em concretizações particulares, a detecção compreende (i) o contacto da amostra biológica com um agente que se liga especificamente ao ácido nucleico que codifica para o antigénio associado a um tumor ou ao referido antigénio associado a um tumor e (ii) a detecção da formação de um complexo entre o agente e o ácido nucleico ou o antigénio associado a um tumor. Numa outra concretização, a amostra biológica isolada do paciente é comparada com uma amostra biológica normal comparável.

Num terceiro aspecto, a invenção refere-se a um método para determinar a regressão, a progressão ou o início de uma doença cancerosa caracterizada pela expressão ou expressão anormal de um antigénio associado a um tumor, o referido método compreendendo a monitoração de uma amostra obtida de um paciente possuindo a doença cancerosa ou que se suspeita 9

ΕΡ 1 759 013/PT que desenvolva a doença cancerosa, em relação a um ou mais parâmetros seleccionados do grupo que consiste em: (i) a quantidade do ácido nucleico que codifica o antigénio associado a um tumor e (ii) a quantidade do antigénio associado a um tumor, em que o antigénio associado a um tumor (a) compreende a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 10 ou (b) tem uma sequência que é codificada por um ácido nucleico possuindo pelo menos 90% de identidade com o ácido nucleico de acordo com SEQ ID NO: 9, em que a doença cancerosa é seleccionada do grupo que consiste em tumor da mama, tumor do pulmão, tumor do esófago, tumor do cólon, tumor do estômago, tumor pancreático, tumor do fígado, tumor ovariano, tumor da próstata, tumor dos ouvidos, nariz e garganta (ONG), tumor renal, tumor cervical, tumor da pele e tumor uterino.

Numa concretização preferida do método de acordo com o terceiro aspecto, o método compreende a determinação do parâmetro ou dos parâmetros num primeiro ponto de tempo numa primeira amostra e num segundo ponto de tempo numa outra amostra, em que a progressão da doença cancerosa é determinada por comparação de ambas as amostras.

Numa concretização preferida do método de acordo com os segundo e terceiro aspectos, a detecção ou a monitoração de acordo com (i) é efectuada amplificando selectivamente o ácido nucleico ou um seu fragmento ou utilizando uma sonda polinucleotídica que híbrida especificamente com o ácido nucleico. Numa concretização, a sonda polinucleotídica compreende uma sequência de 6-50, particularmente 10-30, 15-30 ou 20-30 nucleótidos contíguos do ácido nucleico.

Numa concretização preferida do método de acordo com o segundo e o terceiro aspectos, a detecção ou a monitoração 10 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ de acordo com (ii) é efectuada utilizando um anticorpo que se liga especificamente ao antigénio associado a um tumor. A sonda polinucleotídica ou o anticorpo, que se utilizam para a detecção ou monitoração, são preferivelmente marcados de uma maneira detectável. Em concretizações particulares, o marcador detectável é um marcador radioactivo ou um marcador enzimático.

Num quarto aspecto, a invenção refere-se à utilização de um anticorpo que se liga a um antigénio associado a um tumor e está acoplado a um agente terapêutico ou de diagnóstico para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento, diagnóstico ou monitoração de uma doença cancerosa caracterizada pela expressão ou expressão anormal do antigénio associado a um tumor, em que o antigénio associado a um tumor (a) compreende a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 10 ou (b) tem uma sequência que é codificada por um ácido nucleico possuindo pelo menos 90% de identidade com o ácido nucleico de acordo com SEQ ID NO: 9, em que a doença cancerosa é seleccionada do grupo que consiste em tumor da mama, tumor do pulmão, tumor do esófago, tumor do cólon, tumor do estômago, tumor pancreático, tumor do fígado, tumor ovariano, tumor da próstata, tumor dos ouvidos, nariz e garganta (ONG), tumor renal, tumor cervical, tumor da pele e tumor uterino.

Numa concretização preferida do método de acordo com a invenção ou da utilização de acordo com a invenção, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, quimérico ou humanizado ou um fragmento de um anticorpo.

Os oligonucleótidos que hibridam com um ácido nucleico identificado de acordo com a invenção podem ser utilizados como sondas genéticas. A hibridação pode ser realizada sob condições de pouco rigorosas, mais preferivelmente de 11

ΕΡ 1 759 013/PT medianamente rigorosas e o mais preferivelmente de rigorosas. A expressão "condições rigorosas" de acordo com a invenção refere-se a condições que permitem a hibridação especifica entre polinucleótidos.

Descrição detalhada da invenção

Os conceitos terapêuticos contemplam antigénios associados a tumores como marcadores que recrutam mecanismos efectores possuindo potencial para danificação celular, selectivamente para células tumorais. Portanto, a função da própria molécula alvo e o seu papel no desenvolvimento de tumores são totalmente irrelevantes. "Derivado" de um ácido nucleico significa de acordo com a invenção que estão presentes substituições, deleções e/ou adições de nucleótidos únicos ou múltiplos no referido ácido nucleico. Adicionalmente, o termo "derivado" compreende também derivatização química de um ácido nucleico numa base, num açúcar ou num fosfato de um nucleótido. 0 termo "derivado" compreende também ácidos nucleicos que contêm nucleótidos e análogos de nucleótidos que não ocorrem naturalmente.

De acordo com a invenção, um ácido nucleico é preferivelmente ácido desoxirribonucleico (ADN) ou ácido ribonucleico (ARN). Os ácidos nucleicos compreendem, de acordo com a invenção, ADN genómico, ADNc, ARNm, produzidos recombinantemente e moléculas sintetizadas quimicamente. De acordo com a invenção, um ácido nucleico pode estar presente na forma de uma molécula de cadeia simples ou de cadeia dupla e linear ou fechada covalentemente em forma circular.

Os ácidos nucleicos descritos de acordo com a invenção foram preferivelmente isolados. A expressão "ácido nucleico isolado" significa de acordo com a invenção que o ácido nucleico foi (i) amplificado in vitro, por exemplo por reacção em cadeia pela polimerase (PCR), (i i) produzido recombinantemente por clonagem, (iii) purificado, por 12

ΕΡ 1 759 013/PT exemplo por clivagem e fraccionamento electroforético em gel, ou (iv) sintetizado, por exemplo por síntese química. Um ácido nucleico isolado é um ácido nucleico que está disponível para manipulação por técnicas de ADN recombinante.

Um ácido nucleico é "complementar" a outro ácido nucleico se as duas sequências são capazes de hibridar e formar um duplex estável uma com a outra, sendo a hibridação preferivelmente realizada sob condições que permitem a hibridação específica entre polinucleótidos (condições rigorosas). As condições rigorosas estão descritas, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ou Current Protocolos in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York e referem-se, por exemplo, a hibridação a 65°C em tampão de hibridação (SSC 3,5x, Ficoll a 0,02%, polivinilpirrolidona a 0,02%, albumina sérica bovina a 0,02%, NaH2P04 2,5 mM (pH 7), SDS a 0,5%, EDTA 2 mM) . SSC é cloreto de sódio 0,15 M/citrato de sódio 0,15 M, pH 7. Após hibridação, a membrana para a qual o ADN foi transferido é lavada, por exemplo, com SSC 2x à temperatura ambiente e depois com SSC 0,l-0,5x/SDS 0,lx a temperaturas até 68°C.

De acordo com a invenção, ácidos nucleicos complementares possuem pelo menos 40%, em particular pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e preferivelmente pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, de nucleótidos idênticos.

Os ácidos nucleicos que codificam para antigénios associados a tumores podem, de acordo com a invenção, estar presentes isoladamente ou em combinação com outros ácidos nucleicos, em particular ácidos nucleicos heterólogos. Em concretizações preferidas, um ácido nucleico está funcionalmente ligado a sequências de controlo da expressão ou sequências reguladoras que podem ser homólogas ou 13

ΕΡ 1 759 013/PT heterólogas em relação ao referido ácido nucleico. Uma sequência de codificação e uma sequência reguladora estão "funcionalmente" ligadas uma à outra, se estão covalentemente ligadas uma à outra de tal maneira que a expressão ou a transcrição da referida sequência de codificação está sob o controlo ou sob a influência da referida sequência reguladora. Se a sequência de codificação se destina a ser traduzida numa proteína funcional, então, com uma sequência reguladora funcionalmente ligada à referida sequência de codificação, a indução da referida sequência reguladora resulta na transcrição da referida sequência de codificação, sem causar um desvio de enquadramento na sequência de codificação ou não ser a referida sequência de codificação capaz de ser traduzida na proteína ou no péptido desejados.

As expressões "sequência de controlo da expressão" ou "sequência reguladora" compreendem, de acordo com a invenção, promotores, potenciadores e outros elementos de controlo que regulam a expressão de um gene. Em concretizações particulares da invenção, as sequências de controlo da expressão podem ser reguladas. A estrutura exacta das sequências reguladoras pode variar em função da espécie ou do tipo celular, mas geralmente compreende sequências não transcritas a 5' e não traduzidas a 5' que estão envolvidas na iniciação da transcrição e da tradução, respectivamente, tais como a caixa TATA, sequências de remate, sequência CART, e semelhantes. Mais especificamente, as sequência reguladoras não transcritas a 5' compreendem uma região promotora que inclui uma sequência promotora para o controlo da transcrição do gene ligado funcionalmente. As sequências reguladoras podem também compreender sequências potenciadoras ou sequências activadoras a montante.

Assim, por um lado, os antigénios associados a tumores aqui ilustrados podem ser combinados com quaisquer sequências de controlo da expressão e promotoras. Por outro lado, contudo, os promotores dos produtos génicos associados a tumores aqui ilustrados podem, de acordo com a invenção, 14 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ ser combinados com quaisquer outros genes. Isto permite que a actividade selectiva destes promotores seja utilizada.

De acordo com a invenção, um ácido nucleico pode ainda estar presente em combinação com outro ácido nucleico que codifica para um polipéptido que controla a secreção da proteína ou do polipéptido codificados pelo referido ácido nucleico por uma célula hospedeira. De acordo com a invenção, um ácido nucleico pode também estar presente em combinação com outro ácido nucleico que codifica para um polipéptido que faz com que a proteína ou o polipéptido codificados fiquem ancorados à membrana celular da célula hospedeira ou compartimentalizados em organelos particulares da referida célula.

Numa concretização preferida, uma molécula de ADN recombinante é, de acordo com a invenção, um vector, se apropriado com um promotor, que controla a expressão de um ácido nucleico, por exemplo um ácido nucleico que codifica para um antigénio associado a um tumor da invenção. 0 termo "vector" é aqui utilizado com o seu significado mais geral e compreende qualquer veículo intermediário para um ácido nucleico que permita que o referido ácido nucleico, por exemplo, seja introduzido em células procariotas e/ou eucariotas e, se apropriado, seja integrado num genoma. Os vectores deste tipo são preferivelmente replicados e/ou expressos nas células. Um veículo intermediário pode ser adaptado, por exemplo, a utilização em electroporação, no bombardeamento com microprojécteis, em administração lipossómica, na transferência com o auxílio de agrobactérias ou na inserção por via de vírus de ADN ou ARN. Os vectores compreendem plasmídeos, fagemídeos, bacteriófagos ou genomas virais.

Os ácidos nucleicos que codificam para um antigénio associado a um tumor identificados de acordo com a invenção podem ser utilizados para a transfecção de células hospedeiras. Ácidos nucleicos aqui significam tanto ADN como ARN recombinantes. 0 ARN recombinante pode ser preparado por 15 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ transcrição in vitro de um molde de ADN. Adicionalmente, pode ser modificado por sequências estabilizantes, de remate e poliadenilação, antes da aplicação.

De acordo com a invenção, a expressão "célula hospedeira" refere-se a qualquer célula que possa ser transformada ou transfectada com um ácido nucleico exógeno. A expressão "células hospedeiras" compreende, de acordo com a invenção, células procariotas (e.g. E. coli) ou eucariotas (e.g. células dendriticas, células B, células CHO, células COS, células K562, células de levedura e células de insecto). É dada particular preferência a células de mamífero tais como células de seres humanos, ratinhos, hamsters, porcos, cabras, primatas. As células podem ser derivadas de uma multiplicidade de tipos de tecidos e compreendem células primárias e linhas celulares. Os exemplos específicos compreendem queratinócitos, leucócitos de sangue periférico, células estaminais da medula óssea e células estaminais embrionárias. Em outras concretizações, a célula hospedeira é uma célula apresentadora de antigénio, em particular uma célula dendritica, um monócito ou um macrófago. Um ácido nucleico pode estar presente na célula hospedeira na forma de uma única cópia ou de duas ou mais cópias e, numa concretização, é expresso na célula hospedeira.

De acordo com a invenção, o termo "expressão" é utilizado com o seu significado mais geral e compreende a produção de ARN ou de ARN e proteina. Compreende também a expressão parcial de ácidos nucleicos. Adicionalmente, a expressão pode ser realizada de forma transiente ou estável. Os sistemas de expressão preferidos em células de mamífero compreendem pcDNA3.1 e pRc/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA), que contêm um marcador selectivo tal como um gene que confere resistência a G418 (e assim permite que as linhas celulares estavelmente transfectadas sejam seleccionadas) e as sequências potenciadoras-promotoras de citomegalovírus (CMV). 16

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Nos casos da invenção em que uma molécula de HLA apresenta um antigénio associado a um tumor ou uma sua parte, um vector de expressão pode também compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica para a referida molécula de HLA. A sequência de ácido nucleico que codifica para a molécula de HLA pode estar presente no mesmo vector de expressão que o ácido nucleico que codifica para o antigénio associado a um tumor ou a sua parte, ou os dois ácidos nucleicos podem estar presentes em diferentes vectores de expressão. Neste último caso, os dois vectores de expressão podem ser co-transfectados para uma célula. Se uma célula hospedeira não expressa nem o antigénio associado a um tumor ou a sua parte nem a molécula de HLA, ambos os ácidos nucleicos que os codificam são transfectados para a célula, seja no mesmo vector de expressão ou em vectores de expressão diferentes. Se a célula já expressa a molécula de HLA, apenas a sequência de ácido nucleico que codifica para o antigénio associado a um tumor ou a sua parte pode ser transfectada para a célula.

Os kits para amplificação de um ácido nucleico que codifica para um antigénio associado a um tumor compreendem, por exemplo, um par de iniciadores de amplificação que hibridam com o ácido nucleico que codifica para o antigénio associado a um tumor. Os iniciadores preferivelmente compreendem uma sequência de 6-50, em particular 10-30, 15-30 e 20-30 nucleótidos contíguos do ácido nucleico e não são sobreponíveis, de modo a evitar a formação de dímeros do iniciador. Um dos iniciadores irá hibridar com uma cadeia do ácido nucleico que codifica para o antigénio associado a um tumor, e o outro iniciador irá hibridar com a cadeia complementar num arranjo que permita a amplificação do ácido nucleico que codifica para o antigénio associado a um tumor.

Preferivelmente, um oligonucleótido consiste em ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos ou numa sua combinação, estando a extremidade 5' de um nucleótido e a extremidade 3' de outro nucleótido ligadas uma à outra através de uma ligação fosfodiéster. Estes oligonucleótidos 17 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ podem ser sintetizados da maneira convencional ou produzidos recombinantemente.

Preferivelmente, um oligonucleótido é um oligonucleótido "modificado". Aqui, o oligonucleótido pode ser modificado de muitas maneiras diferentes, sem prejudicar a sua capacidade de se ligar ao seu alvo, de modo a melhorar, por exemplo, a sua estabilidade. De acordo com a invenção, a expressão "oligonucleótido modificado" significa um oligonucleótido em que (i) pelo menos dois dos seus nucleótidos estão ligados um ao outro através de uma ligação internucleosidica sintética (i.e. uma ligação internucleosidica que não é uma ligação fosfodiéster) e/ou (ii) um grupo químico que usualmente não é encontrado em ácidos nucleicos está covalentemente ligado ao oligonucleótido. As ligações internucleosídicas sintéticas preferidas são fosforotioatos, alquilfosfonatos, fosforoditioatos, ésteres de fosfato, alquilfosfonotioatos, fosforamidatos, carbamatos, carbonatos, triésteres de fosfato, acetamidatos, carboximetilésteres e péptidos. A expressão "oligonucleótido modificado" também compreende oligonucleótidos possuindo uma base e/ou um açúcar covalentemente modificados. Os "oligonucleótidos modificados" compreendem, por exemplo, oligonucleótidos com resíduos de açúcar que estão covalentemente ligados a grupos orgânicos de baixo peso molecular outros que não um grupo hidroxilo na posição 3' e um grupo fosfato na posição 5'. Os oligonucleótidos modificados podem compreender, por exemplo, um resíduo de ribose 2'-O-alquilado ou outro açúcar em vez de ribose, tal como arabinose.

Preferivelmente, isolaram-se as proteínas e polipéptidos descritos de acordo com a invenção. As expressões "proteína isolada" ou "polipéptido isolado" significam que a proteína ou o polipéptido foram separados do seu ambiente natural. Uma proteína ou um polipéptido isolados podem estar num estado essencialmente purificado. A expressão "essencialmente purificado" significa que a 18 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ proteína ou ο polipéptido estão essencialmente isentos de outras substâncias com as quais estão associados na natureza ou in vivo.

Estas proteínas e polipéptidos podem ser utilizados, por exemplo, na produção de anticorpos e num ensaio imunológico ou de diagnóstico ou como terapêuticos. As proteínas e os polipéptidos descritos de acordo com a invenção podem ser isolados de amostras biológicas tais como homogenatos de tecidos ou células e podem também ser expressos recombinantemente numa multiplicidade de sistemas de expressão procariotas ou eucariotas.

Para as finalidades da presente invenção, "derivados" de uma proteína ou de um polipéptido ou de uma sequência de aminoácidos, compreendem variantes de inserção de aminoácidos, variantes de deleção de aminoácidos e/ou variantes de substituição de aminoácidos.

As variantes de inserção de aminoácidos compreendem fusões amino- e/ou carboxi-terminais e também inserções de um ou dois ou mais aminoácidos numa sequência de aminoácidos particular. No caso de variantes de sequência de aminoácidos possuindo uma inserção, um ou mais resíduos de aminoácido são inseridos num local particular numa sequência de aminoácidos, embora também seja possível a inserção aleatória com rastreio apropriado do produto resultante. As variantes de deleção de aminoácidos são caracterizadas pela remoção de um ou mais aminoácidos da sequência. As variantes de substituição de aminoácidos são caracterizadas por pelo menos um resíduo na sequência ser removido e outro resíduo ser inserido no seu lugar. É dada preferência às modificações em posições na sequência de aminoácidos que não são conservadas entre proteínas ou polipéptidos homólogos. É dada preferência à substituição de aminoácidos por outros que possuem propriedades similares tais como hidrofobicidade, hidrofilicidade, electronegatividade, volume da cadeia lateral e similares (substituição conservativa). As substituições conservativas, por exemplo, 19

ΕΡ 1 759 013/PT referem-se à troca de um aminoácido por outro aminoácido listado adiante no mesmo grupo que o aminoácido que é substituído: 1. resíduos pequenos alifáticos, não polares ou ligeiramente polares: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly) 2. resíduos carregados negativamente e suas amidas: Asn, Asp, Glu, Gin 3. resíduos carregados positivamente: His, Arg, Lys 4. resíduos grandes alifáticos, não polares: Met, Leu, Ile, Vai (Cys) 5. resíduos grandes aromáticos: Phe, Tyr, Trp.

Devido ao seu papel particular na arquitectura da proteína, três resíduos estão apresentados entre parêntesis. Gly é o único resíduo sem uma cadeia lateral e portanto confere flexibilidade à cadeia. Pro possui uma geometria invulgar que restringe grandemente a cadeia. Cys pode formar uma ponte de dissulfureto.

As variantes de aminoácidos descritas acima podem ser prontamente preparadas com o auxílio de técnicas de síntese peptídica conhecidas tais como, por exemplo, por síntese em fase sólida (Merrifield, 1964) e métodos similares ou por manipulação de ADN recombinante. As técnicas para introdução de mutações de substituição em locais predeterminados em ADN que possui uma sequência conhecida ou parcialmente conhecida são bem conhecidas e compreendem mutagénese M13, por exemplo. A manipulação de sequências de ADN para a preparação de proteínas possuindo substituições, inserções ou deleções, está descrita em detalhe em Sambrook et al. (1989), por exemplo.

De acordo com a invenção, "derivados" de proteínas ou polipéptidos também compreendem substituições, deleções e/ou adições únicas ou múltiplas de quaisquer moléculas associadas com a enzima, tais como hidratos de carbono, lípidos e/ou proteínas ou polipéptidos. 0 termo "derivado" 20 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ também se estende a todos os equivalentes químicos funcionais das referidas proteínas ou polipéptidos.

De acordo com a invenção, uma parte ou fragmento de um antigénio associado a um tumor possui uma propriedade funcional do polipéptido do qual foi derivado. Estas propriedades funcionais compreendem a interacção com anticorpos, a interacção com outros polipéptidos ou proteínas, a ligação selectiva de ácidos nucleicos e uma actividade enzimática. Uma propriedade particular é a capacidade de formar um complexo com HLA e, quando apropriado, gerar uma resposta imunitária. Esta resposta imunitária pode ser baseada na estimulação de células T citotóxicas ou auxiliares. Uma parte ou fragmento de um antigénio associado a um tumor da invenção preferivelmente compreende uma sequência de pelo menos 6, em particular pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 30 ou pelo menos 50, aminoácidos consecutivos do antigénio associado a um tumor. Uma parte ou fragmento de um antigénio associado a um tumor é preferivelmente uma parte do antigénio associado a um tumor que corresponde à porção não transmembranar, em particular à porção extracelular do antigénio ou é por ela constituída.

Uma parte ou um fragmento de um ácido nucleico que codifica para um antigénio associado a um tumor refere-se, de acordo com a invenção, à parte do ácido nucleico que codifica pelo menos para o antigénio associado a um tumor e/ou para uma parte ou um fragmento do referido antigénio associado a um tumor, como definido acima. Preferivelmente, uma parte ou um fragmento de um ácido nucleico que codifica para um antigénio associado a um tumor é a parte que corresponde ao quadro de leitura aberto, em particular como indicado na listagem de sequências.

Os ácidos nucleicos que codificam antigénios associados a tumores podem ser determinados da maneira convencional, incluindo por reacção em cadeia pela polimerase ou hibridação com uma sonda marcada. Os antigénios associados a 21

ΕΡ 1 759 013/PT tumores podem ser determinados por rastreio de anti-soros de pacientes em relação ao reconhecimento do antigénio. Podem também ser determinados por rastreio de células T do paciente quanto a especificidades para com o correspondente antigénio associado a um tumor.

Podem ser utilizadas substâncias tais como polipéptidos que se ligam a antigénios associados a tumores, por exemplo, em ensaios de rastreio para detecção de antigénios associados a tumores e complexos de antigénios associados a tumores com os seus parceiros de ligação e numa purificação dos referidos antigénios associados a tumores e de seus complexos com os seus parceiros de ligação. Estas substâncias podem também ser utilizadas para inibição da actividade de antigénios associados a tumores, por exemplo por ligação a esses antigénios.

As substâncias de ligação que são capazes de se ligar selectivamente a antigénios associados a tumores compreendem anticorpos policlonais e monoclonais que são produzidos da maneira convencional.

Sabe-se que apenas uma pequena parte de uma molécula de anticorpo, o parátopo, está envolvida na ligação do anticorpo ao seu epítopo (cf. Clark, W.R. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991), Essential Immunology, 7th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford). As regiões pFc' e Fc são, por exemplo, efectores da cascata do complemento mas não estão envolvidas na ligação ao antigénio. Um anticorpo do qual a região pFc' foi removida enzimaticamente ou que foi produzido sem a região pFc', referido como fragmento F(ab')2/ é portador de ambos os locais de ligação ao antigénio de um anticorpo completo. Similarmente, um anticorpo do qual a região Fc foi removida enzimaticamente ou que foi produzido sem a referida região Fc, referido como fragmento Fab, é portador de um local de ligação ao antigénio de uma molécula de anticorpo intacta. Adicionalmente, os fragmentos Fab consistem numa cadeia leve 22

ΕΡ 1 759 013/PT de um anticorpo covalentemente ligada e parte da cadeia pesada do referido anticorpo, referidos como Fd. Os fragmentos Fd são os principais determinantes da especificidade do anticorpo (um fragmento Fd simples pode estar associado com até dez cadeias leves diferentes, sem alteração da especificidade do anticorpo) e os fragmentos Fd, quando isolados, retêm a capacidade de se ligar a um epitopo.

Localizadas no interior da parte de ligação ao antigénio de um anticorpo encontram-se regiões determinantes de complementaridade (CDR) que interactuam directamente com o epitopo do antigénio, e regiões estruturais (FR) que mantêm a estrutura terciária do parátopo. Ambos os fragmentos Fd da cadeia pesada e da cadeia leve de imunoglobulinas IgG contêm quatro regiões estruturais (FR1 a FR4) que estão separadas em cada caso por três regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3). As CDR e, em particular, as regiões CDR3 e, ainda mais particularmente, a região CDR3 da cadeia pesada, são responsáveis em grande escala pela especificidade do anticorpo.

Sabe-se que as regiões que não as CDR de um anticorpo de mamífero podem ser substituídas por regiões similares de anticorpos com a mesma especificidade ou uma especificidade diferente, sendo retida a especificidade para com o epitopo do anticorpo original. Isto torna possível o desenvolvimento de anticorpos "humanizados" em que CDR não humanas são covalentemente ligadas a regiões FR e/ou Fc/pFc' humanas para produzir um anticorpo funcional.

Em WO 92/04381 por exemplo, descreve-se a produção e a utilização de anticorpos para RSV murinos humanizados em que pelo menos parte das regiões FR murinas foram substituídas por regiões FR de origem humana. Os anticorpos deste tipo, incluindo fragmentos de anticorpos intactos com capacidade de ligação ao antigénio, são frequentemente referidos como anticorpos "quiméricos". 23

ΕΡ 1 759 013/PT A invenção também contempla fragmentos F(ab')2, Fab, Fv e Fd de anticorpos, anticorpos quiméricos, em que as regiões Fc e/ou FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 e/ou CDR3 da cadeia leve foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não humanas, anticorpos quiméricos de fragmento F(ab')2 em que as regiões FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 e/ou CDR3 da cadeia leve foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não humanas, anticorpos quiméricos de fragmento Fab em que as regiões FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 e/ou CDR3 da cadeia leve foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não humanas, e anticorpos quiméricos de fragmento Fd em que as regiões FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não humanas. A invenção também contempla anticorpos de "cadeia única".

Preferivelmente, um anticorpo utilizado de acordo com a invenção é dirigido contra uma das sequências de acordo com SEQ ID NO: 10, 17 e 18, ou uma sua parte ou derivado e/ou pode ser obtido por imunização utilizando estes péptidos.

Os polipéptidos que se ligam especificamente a antigénios associados a tumores podem ser proporcionados, por exemplo, por bibliotecas de péptidos degenerados que podem ser preparadas simplesmente em solução numa forma imobilizada ou na forma de bibliotecas de exibição em fagos. É do mesmo modo possível preparar bibliotecas combinatórias de péptidos com um ou mais aminoácidos. Bibliotecas de peptóides e resíduos sintéticos não peptídicos podem também ser preparadas. A exibição em fagos pode ser particularmente eficaz na identificação de péptidos de ligação. A este respeito, por exemplo, é preparada uma biblioteca de fagos (utilizando, por exemplo, os fagos M13, fd ou lambda) que apresenta inserções de 4 a cerca de 80 resíduos de aminoácido de comprimento. São depois seleccionados fagos que possuem inserções que se ligam ao antigénio associado a um tumor. Este processo pode ser repetido por via de dois ou mais 24

ΕΡ 1 759 013/PT ciclos de uma re-selecção de fagos que se ligam ao antigénio associado a um tumor. Ciclos repetidos resultam numa concentração de fagos possuidores de sequências particulares. Pode ser realizada uma análise das sequências de ADN de modo a identificar as sequências dos polipéptidos expressos. Pode ser determinada a menor porção linear da sequência que se liga ao antigénio associado a um tumor. 0 "sistema de dois híbridos" de levedura pode também ser utilizado para a identificação de polipéptidos que se ligam a um antigénio associado a um tumor. Os antigénios associados a tumores ou seus fragmentos podem ser utilizados para o rastreio de bibliotecas de péptidos, incluindo bibliotecas de exibição em fagos, de modo a identificar e seleccionar parceiros de ligação peptídicos dos antigénios associados a tumores. Estas moléculas podem ser utilizadas, por exemplo, para ensaios de rastreio, protocolos de purificação, para interferência com a função do antigénio associado a um tumor e para outros fins conhecidos dos peritos na especialidade.

Os anticorpos descritos acima e outras moléculas de ligação podem ser utilizados, por exemplo, para a identificação de tecido que expressa um antigénio associado a um tumor. Os anticorpos podem também ser acoplados a substâncias de diagnóstico específicas para exibir células e tecidos que expressam antigénios associados a tumores. Podem também ser acoplados a substâncias terapeuticamente úteis. As substâncias de diagnóstico compreendem, de maneira não limitante, sulfato de bário, ácido iocetâmico, ácido iopanóico, ipodato de cálcio, diatrizoato de sódio, diatrizoato de meglumina, metrizamida, tiropanoato de sódio e radiodiagnóstico, incluindo emissores de positrões tais como flúor-18 e carbono-11, emissores gama tais como iodo-123, tecnécio-99m, iodo-131 e índio-111, nuclidos para ressonância magnética nuclear, tais como flúor e gadolínio. De acordo com a invenção, a expressão "substância terapeuticamente útil" significa qualquer molécula terapêutica que, conforme desejado, seja selectivamente guiada para uma célula que expressa um ou mais antigénios 25

ΕΡ 1 759 013/PT associados a tumores, incluindo agentes anticancerosos, compostos marcados com iodo radioactivo, toxinas, fármacos citostáticos ou citoliticos, etc. Os agentes anticancerosos compreendem, por exemplo, aminoglutetimida, azatioprina, sulfato de bleomicina, bussulfano, carmustina, clorambucilo, cisplatina, ciclofosfamida, ciclosporina, citarabidina, dacarbazina, dactinomicina, daunorubina, doxorubicina, taxol, etoposido, fluorouracilo, interferão-a, lomustina, mercaptopurina, metotrexato, mitotano, procarbazina HC1, tioguanina, sulfato de vinblastina e sulfato de vincristina. Outros agentes anticancerosos estão descritos, por exemplo, em Goodman e Gilman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 8th Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc., em particular no Capitulo 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner). As toxinas podem ser proteínas tais como proteína antiviral de fitolaca, toxina da cólera, toxina da pertussis, ricina, gelonina, abrina, exotoxina da difteria ou exotoxina de Pseudomonas. Os resíduos de toxinas podem também ser radionuclidos altamente emissores de energia tais como cobalto-60. 0 termo "paciente" significa, de acordo com a invenção, um ser humano, um primata não humano ou outro animal, em particular um mamífero tal como uma vaca, um cavalo, um porco, uma ovelha, uma cabra, um cão, um gato ou um roedor tal como um ratinho e um rato. Numa concretização particularmente preferida, o paciente é um ser humano. "Expressão anormal" significa, de acordo com a invenção, que a expressão está alterada, preferivelmente aumentada, comparativamente com o estado num indivíduo saudável. Um aumento na expressão refere-se a um aumento de pelo menos 10%, em particular pelo menos 20%, pelo menos 50% ou pelo menos 100%. Numa concretização, o antigénio associado a um tumor é expresso apenas em tecido de um indivíduo doente, enquanto a expressão num indivíduo saudável é reprimida.

De acordo com a invenção, uma amostra biológica pode ser uma amostra de tecido e/ou uma amostra celular e pode 26

ΕΡ 1 759 013/PT ser obtida da maneira convencional tal como por biópsia de tecido, incluindo biópsia de punctura, e por colheita de sangue, aspirado brônquico, urina, fezes ou outros fluidos corporais, para utilização nos vários métodos aqui descritos.

De acordo com a invenção, a expressão "célula imunorreactiva" significa uma célula que pode maturar numa célula imunitária (tal como uma célula B, uma célula T auxiliar ou uma célula T citolitica) com estimulo adequado. As células imunorreactivas compreendem células estaminais hematopoiéticas CD34+, células T imaturas e maduras e células B imaturas e maduras. Se for desejada a produção de células T auxiliares ou citoliticas que reconhecem um antigénio associado a um tumor, a célula imunorreactiva é colocada em contacto com uma célula que expressa um antigénio associado a um tumor sob condições que favorecem a produção, a diferenciação e/ou a selecção de células T citoliticas T e de células T auxiliares. A diferenciação de precursores de células T numa célula T citolitica, quando expostos a um antigénio, é similar à selecção clonal do sistema imunitário.

Alguns métodos terapêuticos são baseados numa reacção do sistema imunitário de um paciente, que resulta numa lise de células apresentadoras de antigénio tais como células cancerosas que apresentam um ou mais antigénios associados a tumores. A este respeito, por exemplo linfócitos T citotóxicos autólogos específicos para um complexo de um antigénio associado a um tumor e uma molécula de MHC, são administrados a um paciente possuindo uma anomalia celular. É conhecida a produção destes linfócitos T citotóxicos in vitro. Um exemplo de um método de diferenciação de células T pode ser encontrado em WO-A-9 6 / 3 3 2 6 5 . Geralmente, uma amostra contendo células tais como células sanguíneas, é tomada do paciente e as células são colocadas em contacto com uma célula que apresenta o complexo e que pode causar a propagação de linfócitos T citotóxicos (e.g. células dendríticas). A célula alvo pode ser uma célula transfectada 27 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ tal como uma célula COS. Estas células transfectadas apresentam o complexo desejado sobre as suas superfícies e, quando em contacto com linfócitos T citotóxicos, estimulam a propagação destes últimos. Os linfócitos T citotóxicos autólogos expandidos clonalmente são então administrados ao paciente.

Noutro método de selecção linfócitos T citotóxicos específicos do antigénio, são utilizados tetrâmeros fluorogénicos de complexos molécula de MHC de classe I/péptido, para a detecção de clones específicos de linfócitos T citotóxicos (Altman et al., Science 274:94-96, 1996; Dunbar et al. , Curr. Biol . 8:413-416, 1998). As moléculas do MHC de classe I solúveis são dobradas in vitro na presença de β2-microglobulina e um antigénio peptídico que se liga à referida molécula de classe I. Os complexos MHC/péptido são purificados e depois marcados com biotina. Os tetrâmeros são formados misturando os complexos péptido-MHC biotinilados com avidina marcada (e.g. ficoeritrina) numa razão molar de 4:1. Os tetrâmeros são então colocados em contacto com linfócitos T citotóxicos tais como sangue periférico ou nódulos linfáticos. Os tetrâmeros ligam-se a linfócitos T citotóxicos que reconhecem o complexo antigénio peptídico/MHC de classe I. As células que estão ligadas aos tetrâmeros podem ser classificadas por classificação de células controlada por fluorescência para isolar linfócitos T citotóxicos reactivos. Os linfócitos T citotóxicos isolados podem então ser propagados in vitro.

Num método terapêutico referido como transferência adoptiva (Greenberg, J. Immunol. 136(5):1917, 1986; Riddel et al., Science 257:238, 1992; Lynch et al., Eur. J. Immunol. 21:1403-1410, 1991; Kast et al., Cell 59:603-614, 1989), as células que apresentam o complexo desejado (e.g. células dendríticas) são combinadas com linfócitos T citotóxicos do paciente que vai ser tratado, resultando uma propagação de linfócitos T citotóxicos específicos. Os linfócitos T citotóxicos propagados são então administrados a um paciente possuindo uma anomalia celular caracterizada 28

ΕΡ 1 759 013/PT por células anormais particulares apresentarem o complexo específico. Os linfócitos T citotóxicos lisam então as células anómalas, desse modo conseguindo um efeito terapêutico desejado.

Frequentemente, do repertório de células T de um paciente, apenas células T com baixa afinidade para com um complexo especifico deste tipo podem ser propagadas, pois as que têm elevada afinidade foram extintas devido ao desenvolvimento de tolerância. Uma alternativa aqui pode ser uma transferência do próprio receptor de células T. Para isto também, as células que apresentam o complexo desejado (e.g. células dendríticas) são combinadas com linfócitos T citotóxicos de indivíduos saudáveis. Isto resulta na propagação de linfócitos T citotóxicos específicos com elevada afinidade se o dador não teve previamente contacto com o complexo específico. 0 receptor de células T de elevada afinidade destes linfócitos T específicos propagados é clonado e pode ser transduzido por transferência génica, por exemplo utilizando vectores retrovirais, para células T de outros pacientes, conforme desejado. A transferência adoptiva é então realizada utilizando estes linfócitos T geneticamente alterados (Stanislawski et al., Nat Immunol. 2:96270, 2001; Kessels et al., Nat Immunol. 2:957-61, 2001).

Os aspectos terapêuticos anteriores partem do facto de pelo menos algumas das células anómalas do paciente apresentarem um complexo de um antigénio associado a um tumor e uma molécula de HLA. Estas células podem ser identificadas de uma maneira conhecida per se. Logo que as células que apresentam o complexo tenham sido identificadas, podem ser combinadas com uma amostra do paciente, que contém linfócitos T citotóxicos. Se os linfócitos T citotóxicos lisam as células que apresentam o complexo, pode assumir-se que é apresentado um antigénio associado a um tumor. A transferência adoptiva não é a única forma de terapia que pode ser aplicada. Os linfócitos T citotóxicos podem também ser gerados in vivo de uma maneira conhecida per se. 29

ΕΡ 1 759 013/PT

Um método utiliza células não proliferativas que expressam o complexo. As células aqui utilizadas serão aquelas que usualmente expressam o complexo, tais como células tumorais irradiadas ou células transfectadas com um ou ambos os genes necessários para a apresentação do complexo (i.e. o péptido antigénico e a molécula apresentadora de HLA). Podem ser utilizados vários tipos de células. Adicionalmente, é possível utilizar vectores que são portadores de um ou de ambos os genes de interesse. É dada particular preferência a vectores virais ou bacterianos. Por exemplo, os ácidos nucleicos que codificam para um antigénio associado a um tumor ou para uma sua parte podem ser funcionalmente ligados a sequências promotoras e potenciadoras que controlam a expressão do referido antigénio associado a um tumor ou um seu fragmento, em tecidos ou tipos celulares particulares. 0 ácido nucleico pode ser incorporado num vector de expressão. Os vectores de expressão podem ser ácidos nucleicos extracromossómicos não modificados, plasmídeos ou genomas virais nos quais podem ser inseridos ácidos nucleicos exógenos. Os ácidos nucleicos que codificam para um antigénio associado a um tumor podem também ser inseridos num genoma retroviral, desse modo permitindo que o ácido nucleico seja integrado no genoma do tecido alvo ou da célula alvo. Nestes sistemas, um microorganismo tal como vírus vaccinia, poxvírus, vírus do Herpes simplex, retrovírus ou adenovírus, é portador do gene de interesse e de facto "infecta" as células hospedeiras. Outra forma preferida consiste na introdução do antigénio associado a um tumor na forma de ARN recombinante que pode ser introduzido em células por transferência lipossómica ou por electroporação, por exemplo. As células resultantes apresentam o complexo de interesse e são reconhecidas por linfócitos T citotóxicos autólogos que depois se propagam.

Pode conseguir-se um efeito similar combinando o antigénio associado a um tumor ou um seu fragmento com um adjuvante de modo a tornar possível a incorporação em células apresentadoras de antigénio in vivo. O antigénio associado a um tumor ou um seu fragmento podem estar 30 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ representados na forma de proteína, de ADN (e.g. dentro de um vector) ou de ARN. O antigénio associado a um tumor é processado para produzir um parceiro peptídico para a molécula de HLA, enquanto um seu fragmento pode ser apresentado sem a necessidade de processamento adicional.

Este último é o caso particular em que aqueles se podem ligar a moléculas de HLA. É dada preferência a formas de administração em que o antigénio completo é processado in vivo por uma célula dendrítica, uma vez que isto pode também produzir respostas de células T auxiliares que são necessárias para uma resposta imunitária eficaz (Ossendorp et al., Immunol Lett. 74:75-9, 2000; Ossendorp et al., J.

Exp. Med. 187:693-702, 1998). Em geral, é possível administrar uma quantidade eficaz do antigénio associado a um tumor a um paciente por injecção intradérmica, por exemplo. Contudo, a injecção pode também ser realizada intranodalmente num nódulo linfático (Maloy et ai., Prod Natl Acad Sei USA 98:3299-303, 2001). Pode também ser realizada em combinação com reagentes que facilitam a assimilação por células dendríticas. Os antigénios associados a tumores preferidos compreendem aqueles que reagem com anti-soros cancerosos alogénicos ou com células T de muitos pacientes cancerosos. São de particular interesse, contudo, aqueles contra os quais não pré-existe nenhuma resposta imunitária espontânea. Evidentemente, é possível induzir contra estes respostas imunitárias que podem lisar tumores (Keogh et ai., J. Immunol. 167:787-96, 2001; Appella et al., Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1 : 177-84, 1995; Wentworth et ai., .Hol Immunol. 32:603-12, 1995).

As composições farmacêuticas descritas de acordo com a invenção podem também ser utilizadas como vacinas para imunização. De acordo com a invenção, os termos "imunização" ou "vacinação" significam um aumento ou uma activação de uma resposta imunitária a um antigénio. É possível utilizar modelos animais para testar um efeito imunizante no cancro utilizando um antigénio associado a um tumor ou um ácido nucleico que o codifica. Por exemplo, células cancerosas humanas podem ser introduzidas num ratinho para gerar um 31 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ tumor, e podem ser administrados um ou mais ácidos nucleicos que codificam para antigénios associados a tumores. 0 efeito sobre as células cancerosas (por exemplo uma redução na dimensão do tumor) pode ser medido como uma medida da eficácia de uma imunização pelo ácido nucleico.

Como parte da composição de uma imunização, um ou mais antigénios associados a tumores, ou seus fragmentos estimulantes, são administrados em conjunto com um ou mais adjuvantes para indução de uma resposta imunitária ou para aumentar uma resposta imunitária. Um adjuvante é uma substância que é incorporada no antigénio ou administrada juntamente com este último e que aumenta a resposta imunitária. Os adjuvantes podem aumentar a resposta imunitária proporcionando um reservatório de antigénios (extracelularmente ou em macrófagos) , activando macrófagos e estimulando linfócitos particulares. Os adjuvantes são conhecidos e compreendem, de uma maneira não limitante, monofosforil-lipido A (MPL, SmithKline Beecham), saponinas tais como QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 e QS-L1 (So et al., Mol. Cells 7:178-186, 1997), adjuvante incompleto de Freund, adjuvante completo de Freund, vitamina E, montanida, alúmen, oligonucleótidos CpG (cf. Krieg et al., Nature 374:546-9, 1995) e várias emulsões de água-em-óleo preparadas a partir de óleos biologicamente degradáveis tais como esqualeno e/ou tocoferol. Preferivelmente, os péptidos são administrados numa mistura com DQS21/MPL. A razão de DQS21 para MPL é tipicamente de cerca de 1:10 a 10:1, preferivelmente cerca de 1:5 a 5:1 e em particular cerca de 1:1. Para administração a seres humanos, uma formulação de vacina contém tipicamente DQS21 e MPL numa gama de cerca de 1 yg a cerca de 100 yg.

Outras substâncias que estimulam uma resposta imunitária do paciente podem também ser administradas. É possível, por exemplo, utilizar citoquinas numa vacinação, devido às suas propriedades reguladoras sobre linfócitos. Estas citoquinas compreendem, por exemplo, interleucina-12 32

ΕΡ 1 759 013/PT (1L-12) que se mostrou aumentar as acçoes protectoras de vacinas (cf. Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF e IL-18.

Existem vários compostos que melhoram uma resposta imunitária e que portanto podem ser utilizados numa vacinação. Os referidos compostos compreendem moléculas co-estimulantes proporcionadas na forma de proteínas ou ácidos nucleicos. Os exemplos destas moléculas co-estimulantes são B7-1 e B7-2 (CD80 e CD86, respectivamente) que são expressas em células dendríticas (DC) e interactuam com a molécula de CD28 expressa sobre as células T. Esta interacção proporciona uma co-estimulação (sinal 2) para uma célula T estimulada por antigénio/MHC/TCR (sinal 1), desse modo aumentando a propagação da referida célula T e melhorando a função efectora. B7 também interactua com CTLA4 (CD152) em células T, e estudos envolvendo ligandos CTLA4 e B7 demonstram que a interacção B7-CTLA4 pode melhorar a imunidade antitumoral e a propagação de CTL (Zheng, P. et al.r Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95(11):6284-6289 {1998)).

Tipicamente, B7 não é expresso em células tumorais de modo que estas não são células apresentadoras de antigénio (APC) eficazes para células T. A indução de expressão de B7 permitiria que as células tumorais estimulassem mais eficazmente a propagação de linfócitos T citotóxicos e uma função efectora. A co-estimulação por uma combinação de B7/IL-6/IL-12 revelou a indução de um perfil de IFN-gama e citoquina-Thl numa população de células T, resultando numa ainda mais melhorada actividade de células T (Gajewski et al., J. Immunol. 154:5637-5648 (1995) ) .

Uma activação completa de linfócitos T citotóxicos e uma função efectora completa requerem um envolvimento de células T auxiliares através da interacção entre o ligando CD40 nas referidas células T auxiliares e a molécula de CD40 expressa por células dendríticas (Ridge et ai., Nature 393:474 (1998), Bennett et al., Nature 393:478 (1998), Schõnberger et al., Nature 393: 480 (1 998) ) . 0 mecanismo 33 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ deste sinal de co-estimulação refere-se provavelmente ao aumento da produção de B7 e produção associada de IL6/IL-12 pelas referidas células dendriticas (células apresentadoras de antigénio) . A interacção CD40-CD40L complementa assim a interacção do sinal 1 (antigénio/MHC-TCR) e do sinal 2 (B7-CD28).

Seria de esperar que a utilização de anticorpos anti-CD4 0 para a estimulação de células dendriticas aumentasse directamente uma resposta a antigénios tumorais que estão usualmente fora da gama de uma resposta inflamatória ou que são apresentados por células apresentadoras de antigénio não profissionais (células tumorais). Nestas situações, não são proporcionados sinais co-estimulantes de B7 e T auxiliares. Este mecanismo pode ser utilizado em ligação com terapias baseadas em células dendriticas pulsadas com antigénio ou em situações em que epítopos T auxiliares não foram definidos em precursores de TRA conhecidos.

Os polipéptidos e péptidos podem ser administrados de uma maneira conhecida per se. Numa concretização, ácidos nucleicos são administrados por métodos ex vivo, i.e. por remoção de células de um paciente, modificação genética das referidas células de modo a incorporar um antigénio associado a um tumor e reintrodução das células alteradas no paciente. Isto geralmente compreende a introdução de uma cópia funcional de um gene nas células de um paciente in vitro e reintrodução das células geneticamente alteradas no paciente. A cópia funcional do gene está sob o controlo funcional de elementos reguladores que permitem que o gene seja expresso nas células geneticamente alteradas. São conhecidos pelos especialistas métodos de transfecção e transdução. A invenção também proporciona a administração de ácidos nucleicos in vivo utilizando vectores tais como vírus e lipossomas controlados pelo alvo.

Numa concretização preferida, um vector virai para administração de um ácido nucleico que codifica para um antigénio associado a um tumor é seleccionado do grupo que 34

ΕΡ 1 759 013/PT consiste em adenovírus, vírus adeno-associados, poxvírus, incluindo vírus vaccinia e poxvírus atenuados, vírus da floresta de Semliki, retrovírus, vírus Sindbis e partículas semelhantes a vírus Ty. É dada particular preferência a adenovírus e retrovírus. Os retrovírus são tipicamente deficientes para replicação (i.e. são incapazes de gerar partículas infecciosas).

Podem ser utilizados vários métodos de modo a introduzir de acordo com a invenção ácidos nucleicos em células in vitro ou in vivo. Os métodos deste tipo compreendem a transfecção de precipitado de ácido nucleico com CaP04, transfecção de ácidos nucleicos associados com DEAE, transfecção ou infecção com os vírus anteriores portadores dos ácidos nucleicos de interesse, transfecção mediada por lipossomas, e semelhantes. Em concretizações particulares, é dada preferência a dirigir o ácido nucleico para células particulares. Nestas concretizações, um transportador utilizado para administração de um ácido nucleico a uma célula (e.g. um retrovírus ou um lipossoma) pode ter uma molécula de controlo do alvo ligada. Por exemplo, uma molécula tal como um anticorpo específico para uma proteína da membrana da superfície na célula alvo ou um ligando para um receptor na célula alvo, pode ser incorporada ou ligada ao transportador de ácido nucleico. Os anticorpos preferidos compreendem anticorpos que se ligam selectivamente a um antigénio associado a um tumor. Se for pretendida a administração de um ácido nucleico através de lipossomas, proteínas que se ligam a uma proteína da membrana da superfície associadas a endocitose podem ser incorporadas na formulação de lipossomas de modo a tornar possível o controlo do alvo e/ou a assimilação. Estas proteínas compreendem proteínas da cápside ou seus fragmentos que são específicos para um tipo celular particular, anticorpos contra proteínas que são internalizadas, proteínas que abordam um local intracelular, e similares. 35 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ

As composições terapêuticas da invenção podem ser administradas em preparações farmaceuticamente compatíveis. Estas preparações podem usualmente conter concentrações farmaceuticamente compatíveis de sais, substâncias tampão, conservantes, transportadores, suplementação com substâncias melhoradoras da imunidade tais como adjuvantes (e.g. oligonucleótidos CpG) e citoquinas e, quando apropriado, outros compostos terapeuticamente activos.

Os compostos terapeuticamente activos podem ser administrados através de qualquer via convencional, incluindo por injecção ou infusão. A administração pode ser realizada, por exemplo, oralmente, intravenosamente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutaneamente ou transdermicamente. Preferivelmente, os anticorpos são terapeuticamente administrados por meio de um aerossol pulmonar.

As composições da invenção são administradas em quantidades eficazes. Uma "quantidade eficaz" refere-se à quantidade que consegue uma reacção desejada ou um efeito desejado sozinha ou em conjunto com outras doses. No caso de tratamento de uma doença particular ou de uma condição particular caracterizadas pela expressão de um ou mais antigénios associados a tumores, a reacção desejada refere-se à inibição da progressão da doença. Isto compreende o atraso na progressão da doença e, em particular, a interrupção da progressão da doença. A reacção desejada num tratamento de uma doença ou de uma condição pode também ser o atraso do início ou uma prevenção do início da referida doença ou da referida condição.

Uma quantidade eficaz de uma composição da invenção dependerá da condição a tratar, da gravidade da doença, dos parâmetros individuais do paciente, incluindo idade, condição fisiológica, tamanho e peso, da duração do tratamento, do tipo de uma terapia acompanhante (se presente), da via específica de administração e de factores similares. 36 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ

As composições farmacêuticas da invenção são preferivelmente estéreis e contêm uma quantidade eficaz da substância terapeuticamente activa para gerar a desejada reacção ou o desejado efeito.

As doses administradas das composições da invenção podem depender de vários parâmetros tais como do tipo de administração, da condição do paciente, do período desejado de administração, etc. No caso de uma reacção num paciente ser insuficiente com uma dose inicial, podem utilizar-se doses superiores (ou doses eficazmente superiores conseguidas por uma via de administração diferente, mais localizada).

Geralmente, doses do antigénio associado a um tumor de 1 ng a 1 mg, preferivelmente de 10 ng a 100 pg, são formuladas e administradas para um tratamento ou para gerar ou melhorar uma resposta imunitária. Se for pretendida a administração de ácidos nucleicos (ADN e ARN) que codificam para antigénios associados a tumores, são formuladas e administradas doses de 1 ng a 0,1 mg.

As composições farmacêuticas da invenção são geralmente administradas em quantidades farmaceuticamente compatíveis e em composições farmaceuticamente compatíveis. A expressão "farmaceuticamente compatível" refere-se a um material não tóxico que não interactua com a acção do componente activo da composição farmacêutica. As preparações deste tipo podem usualmente conter sais, substâncias tampão, conservantes, transportadores e, quando apropriado, outros compostos terapeuticamente activos. Quando utilizados em medicina, os sais deverão ser farmaceuticamente compatíveis. Contudo, podem utilizar-se sais que não são farmaceuticamente compatíveis para a preparação de sais farmaceuticamente compatíveis e estes estão incluídos na invenção. Os sais farmacológica e farmaceuticamente compatíveis deste tipo compreendem, a título não limitante, os que são preparados a partir dos seguintes ácidos: ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico, e similares. Os sais 37

ΕΡ 1 759 013/PT farmaceuticamente compatíveis podem também ser preparados na forma de sais de metais alcalinos ou sais de metais alcalino-terrosos, tais como sais de sódio, sais de potássio ou sais de cálcio.

Uma composição farmacêutica da invenção pode compreender um transportador farmaceuticamente compatível. De acordo com a invenção, a expressão "transportador farmaceuticamente compatível" refere-se a um ou mais enchimentos, diluentes ou substâncias encapsulantes, sólidos ou líquidos, compatíveis, que sejam adequados para administração a seres humanos. 0 termo "transportador" refere-se a um componente orqânico ou inorqânico, de natureza natural ou sintética, com que o componente activo é combinado de modo a facilitar a aplicação. Os componentes da composição farmacêutica da invenção são usualmente tais que não ocorre qualquer interacção que substancialmente prejudique a eficácia farmacêutica desejada.

As composições farmacêuticas da invenção podem conter substâncias tampão adequadas tais como ácido acético num sal, ácido cítrico num sal, ácido bórico num sal e ácido fosfórico num sal.

As composições farmacêuticas podem, quando apropriado, também conter conservantes adequados tais como cloreto de benzalcónio, clorobutanol, parabenos e timerosal.

As composições farmacêuticas são usualmente proporcionadas numa forma de dosagem uniforme e podem ser preparadas de uma maneira conhecida per se. As composições farmacêuticas da invenção podem estar na forma de cápsulas, comprimidos, pastilhas, soluções, suspensões, xaropes, elixires ou na forma de uma emulsão, por exemplo.

As composições adequadas para administração parentérica usualmente compreendem uma preparação estéril, aquosa ou não aquosa, do composto activo, que é preferivelmente isotónica com o sangue do beneficiário. São exemplos de 38

ΕΡ 1 759 013/PT transportadores e solventes compatíveis a solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotónica. Em adição, utilizam-se usualmente óleos fixados estéreis como meio de solução ou suspensão. A presente invenção é descrita em detalhe pelas figuras e exemplos que se seguem, que são utilizados apenas para fins de ilustração e não se pretendem limitantes. Devido à descrição e aos exemplos, outras concretizações que estão do mesmo modo incluídas na invenção estão acessíveis aos especialistas.

Figuras:

Figura 1: Análise por PCR do gene FLJ31461 A: Análise quantitativa da expressão de FLJ31461 em tecidos normais (esquerda) e em vários tumores (conjuntos que consistem em 3-4 amostras individuais cada, direita) numa representação logarítmica da expressão relativa (número de vezes de activação). Na maioria dos tumores observa-se uma sobre-expressão de pelo menos 100 vezes de FLJ31461 em comparação com o nível de expressão em tecidos saudáveis. B: Imagem no gel de uma análise convencional por RT-PCR de FLJ31461 em tumores da mama, dos pulmões e do ouvido, nariz e garganta com os tecidos normais apropriados Nx; M: marcador de comprimento do ADN. C: Análise quantitativa da expressão em vários tecidos normais (esquerda) e em tumores da mama numa representação logarítmica da expressão relativa (número de vezes de activação). Em quase todos os tumores da mama observa-se uma sobre-expressão de pelo menos 100 vezes de FLJ31461 em comparação com o nível de expressão em tecidos saudáveis. D: Sumário da expressão específica de FLJ31461 em vários tumores analisados. É mostrado o número de amostras tumorais com teste positivo relativamente ao número total de amostras tumorais analisadas. Embora nenhum dos tecidos somáticos normais investigados (3-10 tecidos cada, dependendo do tipo 39

ΕΡ 1 759 013/PT de tecido) exiba expressão de FLJ31461, o gene é expresso em muitos tumores com frequência variável.

Figura 2: Localização da proteína

Representação da localização celular da proteína FLJ31461. A figura mostra a expressão da proteína endógena da linha celular de tumor da mama MCF7.

Figura 3: Análise imuno-histoquímica A: Tecido normal de testículos (localização na membrana positiva), cólon e rim (localização na membrana negativa). B: Detecção da proteína FLJ31461 num carcinoma brônquico, num carcinoma cervical assim como numa metástase nos nódulos linfáticos de um tumor da mama numa vista global (coluna da esquerda) e em detalhe (coluna da direita). C: Sumário das análises imuno-histoquímicas da proteína FLJ31461. É mostrado o número de amostras tumorais com teste positivo em relação ao número total de amostras tumorais analisadas. Embora nenhum dos tecidos somáticos normais investigados exiba qualquer expressão de FLJ31461, a proteína é detectada em muitos dos tumores com frequência variável na superfície celular.

Exemplos:

Materiais e métodos

Os termos "in silico" e "electrónico" referem-se somente à utilização de métodos baseados em bases de dados, que podem também ser utilizados para simular processos experimentais laboratoriais. A menos que expressamente definido de outro modo, todos os outros termos e expressões são utilizados de modo a serem entendidos pelo perito na especialidade. As técnicas e métodos mencionados são aplicados de uma maneira conhecida per se e estão descritos, por exemplo, em Sambrook et al.r Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989), 40

ΕΡ 1 759 013/PT

Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Todos os métodos incluindo a utilização de kits e reagentes são realizados de acordo com a informação dos fabricantes. A. Estratégia baseada em prospecção de dados para a identificação de antigénios associados a tumores

Rastrearam-se bases de dados públicas de proteínas e ácidos nucleicos humanos em relação a antigénios específicos do cancro acessíveis na superfície celular. A definição dos critérios de rastreio necessários, juntamente com métodos de elevado rendimento para a análise, se possível, de todas as proteínas, formaram a componente central desta estratégia. 0 ponto de partida consistiu nas entradas de proteínas (NP) validadas e, respectivamente, nos correspondentes ARNm (NM) que foram depositados na base de dados RefSeq (Pruitt et ai., Trends Genet. Jan; 16(1):44-47, 2000) do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Seguindo o princípio fundamental de gene -► ARNm ->· proteína, as proteínas foram primeiro estudadas quanto à presença de um mais domínios transmembranares. Para este fim, utilizou-se o programa de análise de proteínas TMHMM server v. 2.0 {Krogh et al., Journal of Molecular Biology 305 (3):567-580, 2001) e os resultados foram depois novamente verificados utilizando o programa ALOM 2 (Nakai et al., Genomics 14:897-911, 1992). A previsão de outras sequências de sinal que influenciavam a localização intracelular de proteínas foi realizada utilizando os programas PSORT II (Horton et al., Intelligent Systems for Molecular Biology 4:109-115, 1996) e iPSORT (Bannai et al., Bioinformatics, 18(2):298-305, 2002). A fracção de NP humana possuindo um total de 19 110 entradas proporcionou 4634 proteínas filtradas. O ARNm correspondente de cada uma destas 4634 proteínas, respectivamente, foi então submetido a uma pesquisa de homologia na base de dados de EST (Boguski et al . , Nat . Genet. 4 (4): 332-333, 1993) do NCBI com o auxílio do algoritmo BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids 41

ΕΡ 1 759 013/PT

Res. 25:3389-3402, 1997). Os critérios de rastreio nesta pesquisa foram estabelecidos num valor e < 10e-20 e uma identidade de sequências mínima de 93% de tal maneira que as correspondências daí resultantes com elevada probabilidade apenas podiam derivadas do ARNm respectivo mas não dos transcritos homólogos. Quase todos os ARNm proporcionaram pelo menos uma correspondência na base de dados de EST sendo que em alguns casos o número de correspondência excedeu 4000 .

Subsequentemente, a origem específica dos tecidos da biblioteca de ADNc subjacente assim como o nome da biblioteca foram determinados para cada uma destas correspondências válidas. Os tecidos daí resultantes foram divididos em 4 grupos diferentes variando desde os órgãos dispensáveis (grupo 3) até órgãos absolutamente essenciais (grupo 0). Outro grupo, o grupo 4, consistiu em quaisquer amostras obtidas de tecido canceroso. A distribuição destas correspondências pelos cinco grupos foi registada numa tabela que foi classificada de acordo com a melhor razão entre a soma dos grupos 3 e 4 e a soma dos grupos 0-2 . Os ARNm cujas correspondências na EST foram originadas exclusivamente em tecido canceroso atingiram uma posição de topo, seguidos pelos que podem adicionalmente ser encontrados também em tecidos de órgãos dispensáveis do grupo 3. Um outro critério para a significância desta distribuição foi o número das bibliotecas de ADNc independentes das quais as EST foram obtidas e foi registado numa coluna separada da tabela.

Como os transcritos determinados na primeira abordagem e as proteínas correspondentes são primeiramente construções hipotéticas, utilizaram-se outros critérios de rastreio com a intenção de provar a real existência dos ARNm e consequentemente também das proteínas. Para este fim, cada ARNm foi comparado com o locus do gene previsto utilizando o programa "Spidey" (Wheelan et al., Genome Res. 11(11) : 1 952-1 95 7 , 2 0 0 1) . Apenas os transcritos que têm pelo menos um processo de splicing, i.e. que se estendem em pelo 42 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ menos 2 exões, foram utilizados para análises mais detalhadas. A aplicação sequencial de todos os filtros mencionados conduziu aos antigénios associados a tumores que podem ser considerados extracelularmente acessíveis, devido a um domínio transmembranar previsto e à topologia com ele relacionada. 0 perfil de expressão derivado dos dados de EST indica, em todos os casos, expressão específica do cancro que pode no máximo estender-se apenas a órgãos dispensáveis. B. Estratégia de validação dos antigénios associados a tumores identificados por análise in silico

De modo a utilizar os antigénios para fins imunoterapêuticos (terapia de anticorpos por meio de anticorpos monoclonais, vacinação, abordagens terapêuticas mediadas por receptores de células T; cf. EP-B-0 879 282), em terapia do cancro assim como para problemas de diagnóstico, a validação dos antigénios identificados é de importância central. A este respeito, a validação é realizada por análise da expressão tanto ao nível do ARN como da proteína.

1. Exame da expressão de ARN

Os antigénios tumorais identificados são primeiro validados com o auxílio de ARN que é obtido de vários tecidos ou de linhas celulares específicas de tecidos. Como o padrão de expressão diferencial de tecido saudável em comparação com tecido tumoral é de importância decisiva para a subsequente aplicação terapêutica, os genes alvo são preferivelmente caracterizados com o auxílio destas amostras de tecido. 0 ARN total é isolado de amostras de tecido nativo ou de linhas celulares tumorais por métodos padrão de biologia molecular. 0 referido isolamento pode ser realizado, por exemplo, com o auxílio do kit RNeasy Maxi (Qiagen, n.° de 43 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ

Cat. 75162) de acordo com as instruções do fabricante. Este método de isolamento baseia-se na utilização do reagente caotrópico isotiocianato de guanidinio. Alternativamente, pode utilizar-se fenol ácido para o isolamento (Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156-159, 1987). Depois de o tecido ter sido tratado por meio de isotiocianato de guanidinio, extraiu-se o ARN com fenol ácido, subsequentemente precipita-se com isopropanol e toma-se em água tratada com DEPC.

Subsequentemente, 2-4 pg do ARN isolado desta maneira são transcritos em ADNc, por exemplo por meio de Superscript II (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. A síntese de ADNc é iniciada com o auxílio de hexâmeros aleatórios (e.g. Roche Diagnostics) de acordo com protocolos padrão do fabricante relevante. Para o controlo de qualidade, os ADNc são amplificados ao longo de 30 ciclos, utilizando iniciadores específicos para o gene de p53 que é expresso apenas inferiormente. Apenas amostras de ADNc positivas para p53 serão utilizadas para os passos reaccionais subsequentes.

Os antigénios são analisados em detalhe realizando uma análise da expressão por meio de PCR ou PCR quantitativa (qPCR) com base num arquivo de ADNc que foi isolado de vários tecidos normais e tumorais e de linhas celulares tumorais. Para este fim, amplificam-se 0,5 μΐ de ADNc da mistura reaccional anterior através de uma ADN-polimerase (e.g. 1 U de ADN-polimerase HotStarTaq, Qiagen) de acordo com os protocolos do fabricante particular (volume total da mistura reaccional: 25-50 μΐ). Para além da referida polimerase, a mistura de amplificação compreende 0,3 mM dos dNTP, tampão de reacção (concentração final lx, dependendo do fabricante da ADN-polimerase) e em cada caso 0,3 mM de iniciadores específicos do gene, directo e inverso.

Os iniciadores específicos do gene alvo são, tanto quanto possível, seleccionados de maneira a que estejam localizados em dois exões diferentes de modo a que 44 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ contaminações genómicas não conduzam a resultados falsos positivos. Numa PCR não quantitativa de ponto final, o ADNc é tipicamente incubado a 95°C durante 15 minutos de modo a desnaturar o ADN e a activar a enzima Hot-Start.

Subsequentemente, o ADN é amplificado ao longo de 35 ciclos (1 min a 95°C, 1 min à temperatura de hibridação especifica do iniciador (aprox. 55-65°C), 1 min a 72°C para alongar os amplicões). Subsequentemente, aplicam-se 10 μΐ da mistura de PCR em géis de agarose e fraccionam-se no campo eléctrico. O ADN é tornado visível nos géis por coloração com brometo de etídio e o resultado da PCR é documentado por meio de uma fotografia.

Como alternativa à PCR convencional, a expressão de um gene alvo pode também ser analisada por PCR quantitativa em tempo real. Entretanto estão disponíveis vários sistemas analíticos para esta análise, dos quais os mais bem conhecidos são o sistema de detecção de sequências ABI 7900 HT (Applied Biosystems), o iCycler (Biorad) e o Light cycler (Roche Diagnostics). Como acima descrito, uma mistura de PCR específica é submetida a uma operação nos instrumentos de tempo real. Adicionando um corante de intercalação no ADN (e.g. brometo de etídio, CybrGreen), o ADN recém-sintetizado é tornado visível por excitação de luz específica (de acordo com a informação do fabricante do corante). Uma multiplicidade de pontos medidos durante a amplificação permite que seja monitorado todo o processo e determinar a concentração de ácido nucleico do gene alvo quantitativamente. A mistura de PCR é normalizada medindo um gene housekeeping (e.g. ARN 18S, β-actina, GAPDH). Estratégias alternativas por via de sondas de ADN marcadas por fluorescência permitem do mesmo modo a determinação quantitativa do gene alvo de uma amostra de tecido específico (veja-se aplicações de TaqMan da Applied

Biosystems). 2. Clonagem O gene alvo completo que é necessário para uma caracterização adicional do antigénio tumoral é clonado de 45

ΕΡ 1 759 013/PT acordo com métodos biológico-moleculares comuns (e.g. em "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Ltd., Wiley InterScience). De modo a clonar o gene alvo ou a analisar esta sequência, o referido gene é primeiro amplificado através de uma ADN-polimerase possuindo uma função de revisão (e.g. pfu, Roche Diagnostics). O amplicão é então ligado por métodos padrão num vector de clonagem. Os clones positivos são identificados por análise da sequência e subsequentemente são caracterizados com o auxilio de programas de previsão e algoritmos conhecidos. 3. Produção de anticorpos

Os antigénios associados a tumores identificados são caracterizados, por exemplo, utilizando anticorpos. A invenção compreende ainda a utilização em diagnóstico ou terapêutica de anticorpos. Os anticorpos podem reconhecer proteínas no estado nativo e/ou desnaturado (Anderson et ai., J. Immunol. 143 : 1899-1904, 1989 ; Gardsvoll, J.

Immunol. Methods 234:1 0 7-116 , 2000 ; Kayyem et al., Eur. J. Biochem. 208:1-8, 1992; Spiller et al. , J. Immunol .

Methods 224:51-60, 1999).

Anti-soros compreendendo anticorpos específicos que se ligam especificamente à proteína alvo podem ser preparados por vários métodos padrão; cf., por exemplo, "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" de Phillip Shepherd,

Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9, "Antibodies: A

Laboratory Manual" de Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142 e "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" de Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447. É também possível aqui gerar anticorpos afins e específicos que reconhecem proteínas de membrana complexas na sua forma nativa (Azorsa et al., J. Immunol. Methods 229:35-48 , 1999; Anderson et al., J. Immunol. 143:1899- 1904, 1989 ; Gardsvoll, J. Immunol. Methods. 234:107- 116, 2000). Isto é especialmente importante na preparação de anticorpos que se destinam a ser utilizados terapeuticamente mas também para muitas aplicações de 46

ΕΡ 1 759 013/PT diagnóstico. Para este fim, tanto a proteína completa como sequências parciais extracelulares podem ser utilizadas para imunização.

Imunização e produção de anticorpos policlonais.

Foram publicados vários protocolos de imunização. Uma espécie (e.g. coelhos, ratinhos) é imunizada através de uma primeira injecção da proteína alvo desejada. A resposta imunitária do animal ao imunogénio pode ser melhorada através de uma segunda ou terceira imunizações dentro de um período definido de tempo (aprox. 2-4 semanas após a imunização prévia). Toma-se sangue dos referidos animais e obtém-se o soro imune, novamente após vários intervalos de tempo definidos (Ia sangria após 4 semanas, depois a cada 2-3 semanas, até 5 tomas). 0 soro imune tomado desta maneira compreende anticorpos policlonais que podem ser utilizados para detectar e caracterizar a proteína alvo em Western blotting, por citometria de fluxo, imunofluorescência ou imuno-histoquímica.

Os animais são usualmente imunizados através de um de quatro métodos bem estabelecidos, existindo também outros métodos. A imunização pode ser realizada utilizando péptidos específicos para a proteína alvo, utilizando a proteína completa, utilizando sequências parciais extracelulares de uma proteína que possa ser identificada experimentalmente ou por via de programas de previsão. Como os programas de previsão nem sempre funcionam perfeitamente, é também possível empregar dois domínios separados um do outro por um domínio transmembranar. Neste caso, um dos dois domínios tem que ser extracelular, o que pode depois ser provado experimentalmente (veja-se adiante). A imunização é proporcionada por vários fornecedores de serviços comerciais. (1) No primeiro caso, péptidos (comprimento: 8- 12 aminoácidos) são sintetizados por métodos in vitro (possivelmente realizados por um serviço comercial), e 47 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ os referidos péptidos são utilizados para imunização. Normalmente, são realizadas 3 imunizações (e.g. com uma concentração de 5-100 yg/imunização). (2) Alternativamente, a imunização pode ser realizada utilizando proteínas recombinantes. Para este fim, o ADN clonado do gene alvo é clonado num vector de expressão e a proteína alvo é sintetizada, por exemplo, isenta de células in vitro, em bactérias (e.g. E. coli), em levedura (e.g. S. pombe), em células de insecto ou em células de mamífero, de acordo com as condições do fabricante particular (e.g. Roche Diagnostics, Invitrogen, Clontech, Qiagen). É também possível sintetizar a proteína alvo com o auxílio de sistemas de expressão virais (e.g. baculovírus, vírus vaccinia, adenovírus). Após ter sido sintetizada num dos referidos sistemas, a proteína alvo é purificada, normalmente empregando métodos cromatográficos. Neste contexto, é também possível utilizar para imunização proteínas que possuem uma âncora molecular como auxiliar para a purificação (e.g. marcador His, Qiagen; marcador FLAG, Roche Diagnostics; proteínas de fusão com GST) . Pode encontrar-se uma multiplicidade de protocolos, por exemplo, em "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Ltd., Wiley InterScience. Após a proteína alvo ter sido purificada, é realizada uma imunização como descrito acima. (3) Se estiver disponível uma linha celular que sintetiza a proteína desejada endogenamente, é também possível utilizar esta linha celular directamente para a preparação do anti-soro específico. Neste caso, a imunização é realizada através de 1-3 injecções, em cada caso com aprox. 1-5 x 101 2 3 4 células. 1

A imunização pode também ser realizada injectando ADN 2 (imunização por ADN) . Para este fim, o gene alvo é 3 primeiro clonado num vector de expressão de modo a que 4 a sequência alvo fique sob o controlo de um promotor 48

ΕΡ 1 759 013/PT eucariota forte (e.g., promotor de CMV). Subsequentemente, o ADN (e.g. 1-10 pg por injecção) é transferido como imunogénio utilizando um canhão de genes para regiões capilares com um forte fluxo sanguíneo num organismo (e.g. ratinho, coelho). O ADN transferido é tomado pelas células do animal, o gene alvo é expresso, e o animal finalmente desenvolve uma resposta imunitária à proteína alvo (Jung et al., Mol. Cells 12 : 4 1-49 , 2 0 0 1 ; Kasinrerk et al., Hybrid

Hybridomics 21 : 287-253, 2 0 0 2) .

Produção de anticorpos monoclonais

Os anticorpos monoclonais são tradicionalmente produzidos com o auxílio da tecnologia dos hibridomas (detalhes técnicos: veja-se "Monoclonal Antibodies: A

Practical Approach" de Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; "Antibodies: A Laboratory Manual" de Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142, "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" de Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447) . Um novo método que é também utilizado é a tecnologia "SLAM". Aqui, células B são isoladas de sangue completo e as células são tornadas monoclonais. Subsequentemente, o sobrenadante da célula B isolada é analisado quanto à sua especificidade de anticorpos. Em contraste com a tecnologia dos hibridomas, a região variável do gene do anticorpo é então amplificada por PCR de célula única e clonado num vector adequado. Deste modo a produção de anticorpos monoclonais é acelerada (de Wildt et al., J. Immunol. Methods 207:61-67, 1997). 4. Validação dos alvos por métodos de química das proteínas utilizando anticorpos

Os anticorpos que podem ser produzidos como descrito acima podem ser utilizados para tirar várias conclusões importantes acerca da proteína alvo. Especificamente, são úteis as seguintes análises de validação da proteína alvo: 49 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ

Especificidade do anticorpo

Ensaios baseados em cultura celular com subsequente Western blotting são os mais adequados para demonstrar o facto de que um anticorpo se liga especificamente apenas à proteína alvo desejada (são descritas várias variações, por exemplo, em "Current Protocols in Protein chemistry", John Wiley & Sons Ltd., Wiley InterScience) . Para esta demonstração, as células são transfectadas com um ADNc para a proteína alvo, que está sob o controlo de um promotor eucariota forte (e.g. promotor de citomegalovírus; CMV). Uma ampla variedade de métodos (e.g. electroporação, transfecção à base de lipossomas, precipitação com fosfato de cálcio) estão bem estabelecidos para a transfecção de linhas celulares com ADN (e.g. Lemoine et al., Methods Mol. Biol. 75 : 441-7, 1 9 9 7) . Em alternativa, é também possível utilizar linhas celulares que expressam o gene alvo endogenamente (detecção por RT-PCR específica do gene alvo). Como controlo, no caso ideal, são co-transfectados genes homólogos na experiência, de modo a ser possível demonstrar no Western blot subsequente a especificidade do anticorpo analisado.

No subsequente Western blotting, células de cultura celular ou amostras de tecido que possam conter a proteína alvo são lisados numa solução de SDS com 1% de força, e as proteínas são desnaturadas no processo. Os lisados são fraccionados de acordo com o tamanho por electroforese em géis de poliacrilamida desnaturantes com 8-15% de força (contêm 1% de SDS) (electrof orese em gel de SDS-poliacrilamida, SDS-PAGE). As proteínas são então transferidas por um de uma pluralidade de métodos de transferência (e.g. electroblot semi-seco; Biorad) para uma membrana específica (e.g. nitrocelulose, Schleicher E. Schull). A proteína desejada pode ser visualizada nesta membrana. Para este fim, a membrana é primeiro incubada com o anticorpo que reconhece a proteína alvo (diluição aprox. 1:20-1:200, dependendo da especificidade do referido anticorpo), durante 60 minutos. Após um passo de lavagem, a 50

ΕΡ 1 759 013/PT membrana é incubada com um segundo anticorpo que está acoplado a um marcador (e.g. enzimas tais como peroxidase ou fosfatase alcalina) e que reconhece o primeiro anticorpo. É então possível tornar a proteína alvo visível sobre a membrana numa reacção corada ou quimioluminescente (e.g. ECL, Amersham Bioscience). Um anticorpo com uma elevada especificidade para com a proteína alvo deverá, no caso ideal, apenas reconhecer a própria proteína desejada.

Localização da proteína alvo São utilizados vários métodos para confirmar a localização na membrana, identificada na abordagem in silico, da proteína alvo. Um importante e bem estabelecido método utilizando os anticorpos descritos acima é a imunofluorescência (IF). Para este fim, utilizam-se células de linhas celulares estabelecidas que sintetizam a proteína alvo (detecção do ARN por RT-PCR ou da proteína por Western blotting) ou então foram transfectadas com ADN plasmídico. Uma ampla variedade de métodos (e.g. electroporação, transfecção à base de lipossomas, precipitação com fosfato de cálcio) estão bem estabelecidos para a transfecção de linhas celulares com ADN (e.g. Lemoine et al., Methods Mol. Biol. 75:441-7, 1997). 0 plasmídeo transfectado, em imunofluorescência, pode codificar a proteína não modificada ou então acoplar diferentes marcadores de aminoácidos na proteína alvo. Os principais marcadores são, por exemplo, a proteína verde fluorescente (GFP) em várias formas diferencialmente fluorescentes, sequências peptídicas curtas de 6-12 aminoácidos para as quais estão disponíveis anticorpos específicos e de elevada afinidade, ou a sequência de aminoácidos curta Cys-Cys-X-X-Cys-Cys que pode ligar, através das suas cisteínas, substâncias fluorescentes específicas (Invitrogen). As células que sintetizam a proteína alvo são fixadas, por exemplo, com paraformaldeído ou metanol. As células podem então, se necessário, ser permeabilizadas por incubação com detergentes (e.g. Triton X—100 a 0,2%) . As células são então incubadas com um anticorpo primário que é dirigido contra a proteína alvo ou 51 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ contra um dos marcadores acoplados. Após um passo de lavagem, a mistura é incubada com um segundo anticorpo acoplado a um marcador fluorescente (e.g. fluoresceina, Vermelho do Texas, Dako), que se liga ao primeiro anticorpo. As células marcadas desta maneira são então dispostas em sobrecamada com glicerol e analisadas com o auxilio de um microscópio de fluorescência de acordo com a informação do fabricante. São conseguidas emissões de fluorescência especificas neste caso por excitação especifica dependente das substâncias empregues. A análise usualmente permite a localização fiável da proteína alvo, sendo a qualidade do anticorpo e a proteína alvo confirmadas em colorações duplas onde, em adição à proteína alvo, também os marcadores de aminoácidos acoplados ou outras proteínas marcadoras cuja localização tenha sido já descrita na literatura são corados. A GFP e seus derivados representam um caso especial, sendo directamente excitáveis e eles próprios fluorescentes. A permeabilidade da membrana que pode ser controlada através da utilização de detergentes, em imunofluorescência, permite a demonstração de se um epítopo imunogénico está localizado no interior ou no exterior da célula. A previsão das proteínas seleccionadas pode assim ser suportada experimentalmente. Uma possibilidade alternativa consiste em detectar domínios extracelulares por meio de citometria de fluxo. Para este fim, as células são fixadas sob condições não permeabilizantes (e.g. com PBS/ azida de Na/FCS a 2%/EDTA 5 mM) e analisadas num citómetro de fluxo de acordo com as instruções do fabricante. Apenas epítopos extracelular podem ser reconhecidos pelo anticorpo a analisar neste método. Uma diferença relativamente à imunofluorescência é que é possível distinguir entre células mortas e vivas utilizando, por exemplo, iodeto de propídio ou azul de Tripano, e assim evitar resultados falsos positivos.

Outra importante detecção é por imuno-histoquímica (IHC) em amostras de tecido específicas. 0 objectivo deste método consiste em identificar a localização de uma proteína num agregado de tecido funcionalmente intacto. A 52

ΕΡ 1 759 013/PT IHC serve especificamente para (1) ser capaz de estimar a quantidade de proteína alvo em tecidos tumorais e normais, (2) analisar quantas células em tecidos tumorais e saudáveis expressam o gene alvo, e (3) definir o tipo de células num tecido (células tumorais, saudáveis) em que a proteína alvo é detectável. Alternativamente, as quantidades de proteína de um gene alvo podem ser quantificadas por imunofluorescência de tecidos utilizando uma câmara digital e software adequado (e.g. Tillvision, Till-photonics, Alemanha) . Tem sido frequentemente publicada a tecnologia, e detalhes de coloração e microscopia podem portanto encontrar-se, por exemplo, em "Diagnostic Immunohistochemistry" de David J., MD Dabbs ISBN: 0443065667 ou em "Microscopy, Immunohistochemistry, and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy" ISBN: 0306467704. Deverá notar-se que, devido às propriedades dos anticorpos, têm que ser utilizados diferentes protocolos (um exemplo é descrito adiante) de modo a obter um resultado significativo.

Normalmente, são empregues em IHC tecidos tumorais histologicamente definidos e, como referência, tecidos saudáveis comparáveis. É também possível utilizar como controlos positivos e negativos linhas celulares em que a presença do gene alvo é conhecida através de análises RT-PCR. Tem sempre que ser incluído um controlo de ruído de fundo.

Peças de tecido fixado em formalina (é também possível outro método de fixação, por exemplo com metanol} e embebidas em parafina, com uma espessura de 4 pm, são aplicadas num suporte de vidro e desparafinadas com xileno, por exemplo. As amostras são lavadas com TBS-T e bloqueadas em soro. Isto é seguido por incubação com o primeiro anticorpo (diluição: 1:2 a 1:2000) durante 1-18 horas, sendo normalmente utilizados anticorpos purificados por afinidade. Um passo de lavagem é seguido por incubação com um segundo anticorpo que é acoplado a uma fosfatase alcalina (alternativa: por exemplo peroxidase} e dirigido contra o 53

ΕΡ 1 759 013/PT primeiro anticorpo, durante aprox. 30-60 minutos. Isto é seguido por uma reacção colorida utilizando a referida fosfatase alcalina (cf., por exemplo, Shi et al., J. Histochem. Cytochem. 39: 741-748, 1991; Shin et al., Lab. Invest. 64: 693-702, 1991) . Para demonstrar a especificidades do anticorpo, a reacção pode ser bloqueada por adição prévia do imunogénio.

Análise de modificações na proteina

Modificações secundárias na proteina tais como, por exemplo, N- e O-glicosilações ou miristilações, podem prejudicar ou mesmo impedir completamente a acessibilidade de epitopos imunogénicos e portanto colocar em causa a eficácia de terapias com anticorpos. Adicionalmente, foi frequentemente demonstrado que o tipo e a quantidade de modificações secundárias diferem em tecidos normais e tumorais (e.g. Durand & Seta, 2000; Clin. Chem. 46:795-805; Hakomori, 1996; Câncer Res. 56:5309-18). A análise destas modificações é portanto essencial para o sucesso terapêutico de um anticorpo. Os potenciais locais de ligação podem ser previstos por algoritmos específicos. A análise de modificações nas proteínas usualmente é realizada por Western blotting (veja-se acima). As glicosilações que usualmente têm uma dimensão de vários kDa, especialmente conduzem a uma massa total superior da proteína alvo, que pode ser fraccionada em SDS-PAGE. Para detectar ligações O- e N-glicosídicas específicas, lisados da proteína são incubados antes da desnaturação por SDS com O- ou N-glicosilases (de acordo com as instruções do fabricante respectivo, e.g. PNgase, endoglicosidase F, endoglicosidase H, Roche Diagnostics). Isto é seguido por Western blotting como descrito acima. Assim, se houver uma redução na dimensão de uma proteína alvo após incubação com uma glicosidase, é possível detectar uma glicosilação específica e, desta maneira, também analisar a especificidade tumoral de uma modificação. 54

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Análise funcional do gene alvo A função da molécula alvo pode ser crucial para a sua utilidade terapêutica, de modo que análises funcionais são uma componente importante na caracterização de moléculas terapeuticamente utilizáveis. A análise funcional pode ocorrer em células, em experiências de cultura celular ou então in vivo com o auxilio de modelos animais. Isto envolve o "desligar" do gene da molécula alvo por mutação (knockout) ou inserção da sequência alvo na célula ou no organismo (knockin). Assim, é possível analisar modificações funcionais num contexto celular num primeiro caso por meio da perda de função do gene a analisar (perda de função) . No segundo caso, podem ser analisadas modificações causadas por adição do gene analisado (ganho de função). a. Análise funcional em células

Transfecção. De modo a analisar o ganho de função, o gene da molécula alvo tem que ser transferido para a célula. Para este fim, as células são transfectadas com um ADN que permite a síntese da molécula alvo. Normalmente, o gene da molécula alvo aqui está sob o controlo de um promotor eucariota forte (e.g. promotor de citomegalovírus; CMV) . Uma ampla variedade de métodos (e.g. electroporação, transfecção à base de lipossomas, precipitação com fosfato de cálcio) estão bem estabelecidos para a transfecção de linhas celulares com ADN (e.g. Lemoine et al., Methods Mol. Biol. 75:441-7, 1997). 0 gene pode ser sintetizado quer transientemente, sem integração genómica, quer estavelmente, com integração genómica após selecção com neomicina, por exemplo.

Interferência de ARN (ARNip). Uma inibição da expressão do gene alvo, que pode induzir uma perda completa de função da molécula alvo em células, pode ser gerada pela tecnologia de interferência de ARN (ARNip) em células (Hannon, GJ. 2002. RN A interference. Nature 418:244-51; Czauderna et al. 2003. Nucl. Acid Res. 3 1:670-82). Para este fim, as células são transfectadas com moléculas de ARN curtas de 55 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ cadeia dupla de aprox. 20-25 nucleótidos de comprimento, que são especificas para a molécula alvo. Um processo enzimático resulta então na degradação do ARN especifico do gene alvo e assim numa inibição da função da proteína alvo e consequentemente permite que o gene alvo seja funcionalmente analisado.

Linhas celulares que foram modificadas por meio de transfecção ou ARNpi podem subsequentemente ser analisadas de diferentes maneiras. Os exemplos mais comuns estão enumerados adiante. 1. Proliferação

Uma multiplicidade de métodos para análise da proliferação celular estão estabelecidos e são comercialmente fornecidos por várias companhias (e.g. Roche Diagnostics, Invitrogen; os detalhes dos métodos de ensaio estão descritos nos numerosos protocolos de aplicação). O número de células em experiências de cultura celular pode ser determinado por simples contagem ou por ensaios colorimétricos que medem a actividade metabólica das células (e.g. wst-1, Roche Diagnostics). Os métodos de ensaio metabólicos medem o número de células numa experiência indirectamente por via de marcadores enzimáticos. A proliferação celular pode ser medida directamente por análise da taxa de síntese de ADN, por exemplo por adição de bromodesoxiuridina (BrdU), sendo a BrdU integrada detectada colorimetricamente por via de anticorpos específicos. 2. Apoptose e citotoxicidade

Estão disponíveis um grande número de sistemas de ensaio para detecção da apoptose e citotoxicidade celulares. Uma característica decisiva é a fragmentação específica, dependente de enzimas, do ADN genómico, que é irreversível e resulta em qualquer caso na morte da célula. Os métodos para detecção destes fragmentos de ADN específicos são obteníveis comercialmente. Um método adicional disponível é o ensaio TUNEL que consegue detectar quebras de ADN de cadeia simples 56 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ também em secções de tecido. A citotoxicidade é principalmente detectada através de uma permeabilidade celular alterada que serve como marcador do estado de vitalidade das células. Isto envolve por um lado a análise de marcadores que podem tipicamente ser encontrados intracelularmente no sobrenadante da cultura celular. Por outro lado, é também possível analisar a absorbabilidade de marcadores corados que não são absorvidos por células intactas. Os exemplos mais bem conhecidos de marcadores corados são o azul de Tripano e o iodeto de propídio, um marcador intracelular comum é a lactato-desidroqenase que pode ser detectada enzimaticamente no sobrenadante. Estão disponíveis diferentes sistemas de ensaio de vários fornecedores comerciais (e.g. Roche Diagnostics, Invitrogen). 3. Ensaio de migração A capacidade das células migrarem é analisada num ensaio de migração específica, preferivelmente com o auxílio de uma câmara de Boyden (Corning Costar) (Cinamon G., Alon R.J. Immunol. Methods. 2003 Feb; 273(1-2):53-62; Stockton et al. 2001. Mol. Biol. Cell. 12:1937-56). Para este fim, as células são cultivadas num filtro com uma dimensão de poro específica. As células que podem migrar são capazes de migrar através deste filtro para outro vaso de cultura por baixo. A subsequente análise microscópica permite então a determinação de um comportamento de migração possivelmente alterado induzido pelo ganho de função ou perda de função da molécula alvo. b. Análise funcional em modelos animais

Uma possível alternativa de experiências de cultura celular para a análise da função do gene alvo são as complicadas experiências in vivo em modelos animais. Em comparação com os métodos à base de células, estes modelos têm a vantagem de serem capazes de detectar desenvolvimentos incorrectos ou doenças que são detectáveis apenas no contexto do organismo completo. Estão actualmente 57 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ disponíveis uma multiplicidade de modelos para desordens humanas (Abate-Shen & Shen. 2002. Trends in Genetics Sl-5; Matsusue et al. 2003. J. Clin. Invest. 111:73 7-47) . Vários modelos animais tais como, por exemplo, levedura, nemátodos ou peixe-zebra têm sido caracterizados intensivamente. Contudo, os modelos que são preferidos sobre outras espécies são modelos animais tais como, por exemplo, ratinhos (Mus musculus) porque oferecem a melhor possibilidade de reprodução dos processos biológicos num contexto humano. Para ratinhos, por outro lado, têm sido estabelecidos nos últimos anos métodos transgénicos que integram novos genes no genoma do ratinho (ganho de função; Jegstrup I. et al. 2003. Lab Anim. 2003 Jan.; 37(1):1-9). Por outro lado, outras abordagens metódicas "desligam" genes no genoma do ratinho e assim induzem uma perda de função de um gene desejado (modelos knockout, perda de função; Zambrowicz BP & Sands AT. 2003. Nat. Rev. Drug Discov. 2003 Jan; 2(1):38-51; Niwa H. 2001. Cell Struct. Funct. 2001 Jun; 26 (3) :137-48); foram publicados detalhes técnicos em grande número.

Após os modelos de ratinho terem sido gerados, alterações induzidas pelo transgene ou pela perda de função de um gene podem ser analisadas no contexto do organismo completo (Balling R, 2001. Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:463-92). Assim, é possível realizar, por exemplo, testes de comportamento assim como estudar bioquimicamente parâmetros sanguíneos estabelecidos. Análises histológicas, imuno-histoquímicas ou a microscopia electrónica, permitem a caracterização de alterações ao nível celular. O padrão de expressão específico de um gene pode ser detectado por hibridação in situ (Peters et al. 2003. Hum. Mol. Genet 12:2109-20).

Exemplo 1: Identificação da proteína hipotética FLJ31461 como alvo de diagnóstico e terapêutico do cancro

Utilizando programas de previsão de genes, determinou-se o FLJ31461 (SEQ ID NO:l) depositada com o número de acesso no Genebank NM_152454 como um gene 58 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ funcionalmente putativo não previamente caracterizado no cromossoma 15 (15g25.3). Resultam dois possíveis quadros de leitura abertos da sequência depositada no Genebank. 0 primeiro quadro de leitura codifica uma proteína com um comprimento de 136 aminoácidos. 0 produto génico (SEQ ID NO:2) que foi depositado na base de dados RefSeq do NCBI com o número NP_689667, tem consequentemente um peso molecular calculado de cerca de 15 kDa. 0 segundo quadro de leitura codifica uma proteína com um comprimento de 100 aminoácidos (sequência de nucleótido: SEQ ID NO:7; sequência de aminoácidos: SEQ ID NO:8).

Em análises da sequência do gene FLJ31461 clonado por nós, fomos surpreendidos ao verificar a inserção de um nucleótido na região de codificação em comparação com as sequências depositadas na base de dados. Isto resulta no desvio do quadro de leitura. Dois quadros de leitura abertos completamente novos, que não podem ser derivados das sequências já depositadas em bases de dados de sequências, são o resultado. Assim, o novo quadro de leitura (SEQ ID NO: 9) codifica uma nova proteína hipotética com um comprimento de 96 aminoácidos (SEQ ID NO:10). A SEQ ID NO:11 codifica uma proteína hipotética com o comprimento de 133 aminoácidos (SEQ ID NO:12). Porque temos que assumir, que os depósitos originais nas bases de dados estão incorrectos, focámos investigações adicionais nas SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:ll e SEQ ID NO:12.

De acordo com a invenção, após o estabelecimento de RT-PCR quantitativa específica de FLJ31461 (iniciador com a SEQ ID NO: 3, 4, 13, 14, 15, 16) a quantidade de transcritos específicos do gene foi investigada em tecido saudável e em amostras de carcinoma (Figura 1). Com a excepção dos testículos, o FLJ31461 não pôde ser detectada em nenhum dos tecidos normais investigados por nós (Figura IA). O FLJ31461 é portanto com grande probabilidade um produto génico fortemente específico de gâmetas. Surpreendentemente, verificámos durante a análise de tumores que FLJ31461 está "ligado" em muitos tipos de tumores, enquanto está abaixo do 59

ΕΡ 1 759 013/PT limite de detecção nos tecidos normais correspondentes (Figura 1A-D). Isto não se aplica apenas a virtualmente todos os tumores da mama investigados por nós (Figura 1C) ou a uma série de tumores do pulmão e carcinomas do nariz e garganta, como também a outras neoplasias com várias frequências (Figura 1D). FLJ31461 é portanto um marcador molecular altamente especifico para tecidos tumorais, que pode ser utilizado em diagnóstico assim como terapeuticamente. A título de um representante típico da classe dos denominados antigénios de cancro/testículos, que devido à sua selectiva distribuição nos tecidos servem de marcadores, este produto génico pode por exemplo garantir o direccionamento preciso para células tumorais sem danificar os tecidos normais. Os genes de cancro/testículos são considerados como estruturas alvo atractivas para terapias direccionadas e estão já testados para abordagens imunoterapêuticas específicas em doenças cancerosas em estudos de fase I/II (i.e. Scanlan MJ, Gure AO, Jungbluth AA, Old LJ, Chen YT. 2002. Immunol. Rev. 2002 Oct; 188: 22-32).

De modo a confirmar estes dados ao nível da proteína, foram gerados anticorpos ou soros imunes específicos por imunização de animais. A topologia da proteína foi prevista por análise dos domínios transmembranares de SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO:12 com ferramentas de bioinformática (TMHMM, TMPRED). Desta maneira, para SEQ ID NO:10 por exemplo, foram previstos dois domínios transmembranares; o terminal N e o terminal C da proteína são extracelulares.

De acordo com a invenção, escolheram-se epítopos peptídicos para a imunização, particularmente epítopos peptídicos extracelulares, que são específicos para ambas as variantes da proteína.

Entre outros, os péptidos seguintes foram seleccionados para imunização para produzir anticorpos: SEQ ID NO:5, 6, 17 e 18. 60 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ A título de exemplo são apresentados os dados para o anticorpo produzido por imunização utilizando SEQ ID NO:17. 0 anticorpo específico pode ser utilizado sob várias condições de fixação para investigações de imunofluorescência. Em coloração comparativa de linhas celulares positivas em RT-PCR assim como em negativas, a proteína respectiva está em quantidade bem detectável específica entre outras nas linhas celulares de carcinoma da mama que foram tipificadas positivas utilizando RT-PCR quantitativa (Figura 2). A proteína endógena neste caso apresenta-se localizada na membrana.

Estes anticorpos são adequados para coloração imuno-histoquímica de secções de tecidos humanos. Fomos capazes, em grande extensão, de confirmar a distribuição nos tecidos encontrada ao nível do transcrito. Embora dificilmente observássemos qualquer reactividade do anticorpo em tecido normal com a excepção do tecido dos testículos (Figura 3A) , os anticorpos contra FLJ31461 coloram várias preparações de tumores humanos, entre estes os tumores da mama e do pulmão (Figura 3B) . A coloração das células ocorre acentuada nas membranas, o que indica uma localização da proteína na superfície celular. Surpreendentemente, verificámos que particularmente metástases de tumores (Figura 3B) expressam esta proteína com particular frequência e numa elevada proporção de células.

Estes dados indicam por um lado, que este gene encontrado por nós forma de facto uma proteína, que esta proteína é altamente específica para tumores humanos e que está presente na membrana da superfície destas células tumorais. Portanto, esta proteína é acessível particularmente a anticorpos terapêuticos. Do mesmo modo, os nossos dados provam, que podem ser produzidos anticorpos específicos contra esta proteína. Estes anticorpos ligam-se selectivamente através do marcador FLJ31461 a células tumorais. 61 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ

De acordo com a invenção estes anticorpos podem ser utilizados para fins de diagnóstico por exemplo imuno-histologia. Em particular, estes anticorpos podem ser utilizados terapeuticamente. Os anticorpos produzidos podem também ser utilizados directamente para a produção de anticorpos recombinantes quiméricos ou humanizados. Isto pode também ser realizado directamente com anticorpos obtidos de coelhos (cf. J Biol Chem. 2000 May 5; 275(18):13668-76 por Rader C, Ritter G, Nathan S, Elia M, Gout I, Jungbluth AA, Cohen LS, Welt S, Old LJ, Barbas CF 3rd "The rabbitt antibody repertoire as a novel source for the generation of therapeutic human antibodies"). De modo a conseguir isto, tomaram-se linfócitos de animais imunizados. FLJ31461 é também um alvo altamente atractivo para procedimentos imunoterapêuticos, tais como vacinas ou a transferência adoptiva de linfócitos T específicos do antigénio. 62 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Ganymed Pharmaceuticals AG <120> Identificação de antigénios associados à superfície para diagnóstico e terapia de tumores

<130> 342-20 PCT EP <150> DE 10 2004 023 187.7 <151> 2004-05-11 <160> 18

<170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 1785 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (204)..(614) <400> 1 actcagctct ctcaccatgc gattgccctg caacaccttg gaactctgca gagagtcccc ' 60 agcaggaagg tctcacctga ggtgaacctt cgaccttgga cttctcagcc tccagaatga 120 agaatggcaa ccatcaaatc aagaaattgg cccaaagccc tacagtctgc aaacatcata 180 acaattcatc ctgaagtttc tcc atg aat tgt gat gct ttg cta cat cat tct 233

Met Asn cys Asp Ala Leu Leu His His ser 1 5 10 gca Ala ate Xle cca Pro gaa Glu gat ASD 15 ttt phe ttg Leu cat Hi s att Ile ttt Phe 20 ttg Leu cta Leu tta Leu cag Gin aaa Lys 25 ate ile tca Ser gtc Vai tcc Ser ctc Leu 30 cct Pro ctc Leu tct ser ctc Leu tct ser 35 caa Glfl tct ser tgt cys ctc Leu 40 ttt phe tac Tyr tcc Ser ata lie tct Ser 45 ctg Leu tgt cys tct ser ctt Leu 50 tta Leu ctc Leu cat His ate Ile tct Ser 55 ctg Leu tgt cys gtg val tct Ser gtt Vai 60 tat Tyr gtc Vai tct Ser ctc Leu tct ser 65 ctc Leu tca Ser tcc Ser ttc Phe cca Pro 70 tgt cys ttc Phe tct Ser ctc Leu aca Thr 75 cac His aca Thr cac His act Thr cat His .80 tca Ser cag Gin ctt Leu tca Ser aaa Lys 85 gac Asp acg Thr tct Ser gtc Val ctt Leu 90 acc Thr ttc Phe act Thr ttt Phe tgt Cys 95 ttt Phe aaa Lys cag Gin cac Hi s act Thr 100 cac Hi s ttt Phe act Thr ctg Leu aac Asn 105 tat Tyr acc Thr tca Ser cat His gca Ala 110 cac His gag Glu ctt Leu tct ser gct Ala 115 cca pro tct ser gtt Vai cat Hi s ccc pro 120 aca Thr tgt Cys gtc Vai ttc Phe aca Thr 125 ttc Phe aaa Lys gca Ala gca Ala cct pro 130 tcc Ser cca Pro aga Arg cca Pro gct Ala 135 acc Thr taa 281 329 377 425 473 521 569 614 63 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ ccacctccca cctceacccc atccctagtc agaggaaggc ctggttccca cctgaattca' 674 gctttgtcaa agagcctcct ggaaagctgt catcttcagt tagtagggat' aatgggatta 734 ttctatctgt gtaataataa catgttcaat ttaaagaaaa aaatctgaag ccacttaaaa 794 gctactgttt ggcaccgata cattattcca gtaatgaata atcattaaag atattattct 854 ggatgcagtt accatgcagt gatgtgaata aaatgcatta gatggaaaat tgtatttcaa 914 gtaaatatat gcactggtag aaatgTatta ccaeccacta atatgtatta atteaaaacc 974 aaatgecaac tggagttcgc ctacacgggt ttgaatggca ggcagtgatt tggaagtggg 1034 aggaaatagg tttggatttg gtcaaataga ctgagaagtg atagtggggg cgggggttta 1094 tgactcaaac tttaacaggt gagaagacta tgccatggac agaacaggca tgaggggctc 1154 ccctcctacg cctctttaag agatttttat ctctgactaa ggattactgg tagttgttga 1214 catttctgaa geagtggatc tttttccttt ttcactatct gcatcttcaa atattctttt 1274 ctgaagaaag ttaaaaggaa gcctgtacat ttttcgctaa ggtaaatgcc ttgccatctt 1334 atttcatttt ctcatttttt tcttcagtgc aeaacàtaag eaaetgtect ecttgtcata 1394 ctcaagatga gcttggcata tccgaaatct gcagggattt tctcattagc acagggttcc 1454 aagcccaaac cgtgaagatg gagttttcat ttttaaatgg cacatcttca agttcttgcc 1514 ctgtcctcac tttagtatgc cccagaggaa gtcaaagata tggaeactct aagactcaga 1574 agaactttct caggcattca ttttcctatc tattttgagc cattttattt aaaaggttac 1634 aattttaaac CtctCtttaa ttaaaagata ccagagttac aatgcaatac tatrtggcaa 1694 tcaaaactaa tgaagcacag atgcatgcta caacacgaat gaactttgaa acgttgtgtt 1754 aagtgaaata aaccagttat tatacaagge c 1785

<210> 2 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Asn cys ASp Ala Leu Leu His HÍS ser Ala Ile Pro Glu Asp Phe 1 5 10 15 Leu His Ile Phe Leu Leu Leu Gin Lys Ile Ser val Ser Leu Pro Leu 20 25 30 ser Leu Ser Gin ser val cys Leu phe Tyr Ser Ile ser Leu cys Val 35 40 4.5 Ser Leu Leu Leu His ile Ser Leu cys Vai Ser vai Tyr Val ser Leu 50 55 60 ser Leu ser Ser Phe Pro cys Phe ser Leu Thr His Thr His Thr His 65 70 75 80 ser Gin Leu ser uys Asp Thr ser vai Leu Thr Phe Thr phe cys Phe 85 90 95

Lys Gin His Thr His phe Thr Leu Asn Tyr Thr ser His Ala His Glu 100 105 110

Leu Ser Ala Pro Ser vai His Pro Thr cys Vai Phe Thr Phe Lys Ala 115 120 125

Ala Pro Ser Pro Arg Pro Ala Thr 130 135 64 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ

<210> 3 <211> 21 <212> ADN <213> sequência artificial <220> oligonucleótido <223> Descrição da sequência artificial: <400> 3 cagcctccag aatgaagaat g 21

<210> 4 <211> 18 <212> ADN <213> sequência artificial <220> oligonucleótido <223> Descrição da sequência artificial: <400> 4 ggagggagac tgagattt 18 <210> 5 <211 > 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Lys lie Ser Vai Ser Leu Pro Leu ser Leu Ser Gin Ser Vai Cys 15 10 15 <210> 6 <211 > 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Gin Leu ser Lys Asp Thr Ser vai Leu Thr Phe Thr phe Cys 1 5 10 <210> 7 <211 > 303 <212> ADN <213> Homo <220> <221> CDS <222> (D · · (303) 65 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ <400> 7 atg ctt tgc tac ate att ctg caa tcc cag aag att ttt tgc ata ttt 48 Met Leu Cys Tyr Ile Ile Leu Gin Ser Gin Lys Ile Phe Cys Ile Phe 1 5 10 15 ttt tgc tat tac aga aaa tct cag tct ccc tcc ctc tct ctc tct ctc 96 Phe cys Tyr Tyr 20 Arg Lys Ser Gin Ser 25 Pro Ser Leu Ser Leu 30 Ser •Leu aat ctg tgt gtc tct ttt act cca tat ctc tgt gtg tgt ctc ttt tac 144 Asn Leu Cys vai Ser Phe Thr Pro Tyr Leu cys Val Cys Leu . Phe Tyr 35 40 45 tcc ata tct ctc tgt gtg tgt ctg ttt atg tct ctc tct ctc tct cat 192 Ser ile Ser Leu cys vai cys Leu Phe Met Ser Leu Ser Leu Ser His 50 55 60 CCt tcc cat gtt tct ctc tea caC aca cac aca ctc att cac age ttt 240 Pro ser His Vai Ser Leu ser His Thr His Thr Leu ile His ser Phe 65 70 75 80 caa aag aca cgt ctg tcc tta cct tea ctt ttt gtt tta aac age aca 288 Gin Lys Thr Arg Leu Ser Leu Pro Ser Leu Phe Val Leu Asn Ser Thr 85 90 95 ctc act tta ctc tga 303 Leu Thr Leu Leu 100

<210> 8 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Met Leu cys Tyr Ile Ile Leu Gin Ser Gin Lys Ile Phe cys Ile Phe 1 S 10 15 phe Cys Tyr Tyr Arg Lys Ser Gin Ser pro ser Leu ser Leu Ser Leu 20 25 30.

Asn Leu Cys Vai Ser Phe Thr Pro Tyr Leu Cys Vai Cys Leu Phe Tyr 35 40 45

Ser Ile Ser Leu Cys Vai Cys Leu Phe Met Ser Leu Ser Leu ser His 50 55 60 pro ser hís vai ser Leu Ser hís Thr hís Thr Leu ile His ser Phe 65 70 75 80

Gin Lys Thr Arg Leu 5er Leu Pro Ser Leu Phe vai Leu Asn Ser Thr 85 90 95

Leu Thr Leu Leu 100

<210> 9 <211> 1786 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (204)..(494) < 4 Ο Ο > 9 actcagctct ctcaccatgc gattgccctg caacaccttg gaactctgca gagagtcccc 60 agcaggaagg tctcacctga ggtgaaeett cgaccttgga cttctcagcc tccagaatga 120 agaatggeaa ccatcaaatc aagaaattgg cccaaagccc tacagtctgc aaacatcata 180 acaattcatc ctgaagtttc tcc atg aat tgt gat gct ttg cta cat cat tet 233

Met Asn Cys Asp Ala Leu Leu Mis His Ser 1 S 10 gca Ala ate lie cca Pro gaa Glu gat ASp 15 ttt phe ttg Leu cat His att ile ttt phe 20 ttg Leu cta Leu tta Leu cag Gin aaa Lys 25 aat Asn 281 ctc Leu agt ser ctc Leu cct Pro 30 ccc ΡΓΟ tet ser ctc Leu tet ser ctc Leu 35 tea ser ate il e tgt Cys K? tet ser 40 Ctt Leu tta Leu 329 ctc Leu cat His ate xle 45 tet Ser gtg Val tgt Cys 9 tf Vai tet ser 50 ttt act Phe Thr cca tat Pro Tyr ctc Leu 55 tet ser gtg vai tgt cys 377 gtc vai tgt SP tta Leu tgt Cys ctc Leu tet ser ctc Leu 65 tet ser ctc Leu ate Xle ctt Leu ccc Pro 70 atg Met ttt Phe ctc Leu tet Ser 425 cac His 75 aca Thr cac His aca Thr cac His tea ser 80 ttc phe aca Thr gct Ala ttc phe aaa Lys 85 aga Arg cac His gtc vai tgt Cys cct Pro 90 473 tac Tyr ctt Leu cac His ttt Phe ttg Leu nc ttt Phe taa acagcacact cactttactc tgaactatac 524 95 ctcacatgca cacgagcttt ctgctccatc tgttcatccc acatgtgtct tcacattcaa 584 agcagcacct tccccaagac cagctaccta accacctccc acctccaccc catccctagt 644 cagaggaagg cctggttccc acctgaattc agctttgtca aagagcctcc tggaaagctg 704 teatetteag ttagtaggga taatgggatt attctatctg tgtaataata acatgttcaa 764 tttaaagaaa aaaatctgaa gccacttaaa agctactgtt tggcaccgat acattattcc 824 agtaatgaat aatcattaaa gatattatte tggatgcagt taccatgcag tgatgtgaat 884 aaaatgcatt agatggaaaa ttgtatttca agtaaatata tgcactggta gaaatgtatt 944 accacccact aatatgtatt aattcaaaac caaatgccaa ctggagtteg cctacacggg 1004 tttgaatggc aogcagtgat ttggaagtgg gaggaaatag gtttggattt ggtcaaatag 1064 actgagaagt gatagtgggg gcgggggttt atgactcaaa ctttaacagg tgagaagact 1124 atgccatgga cagaacaggc atgaggggct cccctcctac gcctctttaa gagattttta 1184 tctctgacta açgattactg gtagttgttg acatttctga agcagtggat ctttttcctt 1244 ttteactate tgeatettea aatattcttt tctgaagaaa gttaaaagga agcctgtaca 1304 ttttttgcta aggtaaatgc cttgccatct tatttcattt tctcattttt ttcttcagtg 1364 cacaacataa gcaactgtcc tccttgtcat actcaagatg agcttggcat atctgaaatc 1424 tgcagggatt ttctcattag eacagggttc caagcccaaa ccgtgaagat ggagttttca 1484 tttttaaatg gcacatcttc aagttcttgc cctgtcctca ctttagtatg ceccagagga 1544 agtcaaagat atggacactc taagactcag aagaactttc tcaggcattc attttcctat 1604 ctattttgag ccattttatt taaaaggtta caattttaaa cctctcttta attaaaagat 1664 accagagtta caatgcàata ctatttggca atcaaaacta atgaagcaca gatgcatgct 1724 acaacacgaa tgaactttga aacgttgtgt taagtgaaat aaaccagtta ttatacaagg 1784 « 1786

<210> 10 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens 67 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ < 4 Ο Ο > 10

Met Asn Cys Asp Ala Leu Leu His His ser Ala He pro clu Asp Phe 1 5 io is

Leu His lie phe Leu Leu Leu Gin Lys Asn Leu ser Leu Pro Pro Ser 20 25 30

Leu Ser Leu ser He cys val Ser Leu Leu Leu His He ser Vai Cys ” 40 45 val Ser Phe Thr Pro Tyr Leu Ser Vai Cys Vai Cys Leu Cys LeU Ser 50 55 60

Leu ser Leu He Leu Pro Met Phe Leu Ser His Thr His Thr His Ser 65 70 75 80

Phe Thr Ala Phe Lys Arg His val Cys pro Tyr Leu His Phe Leu Phe aS 90 95

<210> 11 <211> 402 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(402) <400> 11 atg ctt tgc tac ate att ctg caa tcc cag aag att ttt tgc ata ttt 48 Met Leu cys Tyr ile Ile Leu Gin ser Gin Lys ile Phe cys Ile Phe 1 5 10 15 ttt tgc tat tac aga aaa ate tea gtc tcc ctc CCT ctc tct ctc tct 96 Phe cys Tyr Tyr Arg Lys ile ser val Ser Leu Pro Leu ser Leu ser 20 25 30 caa tct gta tgt ctc ttt tac tcc ata tct ctg tgt gtg tct ctt tta 144 Gin Ser val cys Leu phe Tyr ser Πβ ser Leu cys Val ser Leu Leu 35 40 45 ctc cat ate tct ctg tgt gtg tct gtt tat gtc tct ctc tct ctc tea 192 Leu Hi s Ile Ser Leu cys Val Ser val Tyr Val Ser Leu Ser Leu Ser 50 55 60 tcc ttc cca tgt ttc tct ctc aca cac aca cac act cat tea cag ctt 240 Ser Phe Pro Cys phe Ser Leu Thr Hi s Thr Hi 5 Thr HIS Ser Gin Leu 65 70 75 SO tea aaa gac acg tct gtc ctt acc ttc act ttt tgt ttt aaa cag cac 2SS ser Lys Asp Thr Ser Val Leu Thr Phe Thr phe cys Phe Lys Gin His S5 90 95 act cac ttt act ctg aac tat acc tea cat gea cac gag ctt tct g« 336 Thr His Phe Thr Leu Asn Tyr Thr Ser His Ala His Glu Leu ser Ala 100 105 110 cca tct gtt cat ccc aca tgt gtc ttc aca ttc aaa gea gea cct tcc 384 pro ser val His Pro Thr cys val Phe Thr Phe Lys Ala Ala pro ser US 120 125 cca aga cca gçt acc taa 402 pro Arg pro Ala Thr 130

<210> 12 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens 68 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ <400> 12 Met Leu cys Tyr lie He 1 5

Phe Cys Tyr Tyr Arg Lys 20 Gin Ser vai cys Leu phe 35 Leu His ile ser Leu cys 50 Ser Phe Pro Cys Phe Ser 65 70 ser Lys Asp Thr ser vai 85 Thr His Phe Thr Leu Asn 100 pro Ser Vai His Pro Thr 115 Leu Gin Ser Gin Lys ile Phe cys lie Phe 10 15 lie Ser vai Ser Leu pro Leu ser Leu Ser 25 30 Tyr Ser lie Ser Leu cys vai ser Leu Leu 40 45 vai Ser vai Tyr Vai Ser Leu ser Leu ser 55 60 Leu Thr His Thr His Thr Hi s ser Gin Leu 75 80 Leu Thr Phe Thr Phe cys Phe Lys Gin His 90 95 Tyr Thr Ser His Ala His Glu Leu Ser Ala 105 110 cys vai phe Thr Phe Lys Ala Ala Pro Ser 120 125 pro Arg Pro Ala Thr 130 <210> 13 <211> 26 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência <400> 13 caccatgaat tgtgatgctt tgctac <210> 14 <211> 22 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência <400> 14 ctaggtagct ggtcttgggg aa 22 <210> 15 <211> 21 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência <400> 15 ttctcagcct ccagaatgaa g artificial: oligonucleótido 26 artificial: oligonucleótido artificial: oligonucleótido 21 69 ΕΡ 1 759 013/ΡΤ

<210> 16 <211> 21 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 16 gaaggtaagg acagacgtgt c 21

<210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Thr His Ser phe thr Ala phe Lys Arg ui s Vai cys 1 5 10 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Asn Leu Ser Leu Pro pro Ser Leu Ser Leu ser lie cys 1 S 10 Lisbo; a, O C\l 10-08-09

Claims (18)

1. ΕΡ 1 759 013/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica compreendendo um ou mais componentes seleccionados do grupo que consiste em: (i) um anticorpo que se liga a um antigénio associado a um tumor, (ii) um antigénio associado a um tumor ou um seu fragmento que compreende pelo menos 6 aminoácidos contíguos, (iii) um ácido nucleico que codifica um antigénio associado a um tumor ou um seu fragmento que compreende pelo menos seis aminoácidos contíguos, (iv) uma célula hospedeira que expressa um antigénio associado a um tumor ou um seu fragmento que compreende pelo menos seis aminoácidos contíguos e (v) complexos isolados de um antigénio associado a um tumor ou um seu fragmento e uma molécula de HLA, em que o antigénio associado a um tumor (a) compreende a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO:10 ou (b) possui uma sequência que é codificada por um ácido nucleico possuindo pelo menos 90% de identidade com o ácido nucleico de acordo com SEQ ID NO:9 para o tratamento de, e/ou vacinação contra, um cancro caracterizado pela expressão ou expressão anormal do antigénio associado a um tumor, em que o cancro é seleccionado do grupo que consiste em tumor da mama, tumor do pulmão, tumor do esófago, tumor do cólon, tumor do estômago, tumor pancreático, tumor do fígado, tumor ovariano, tumor da próstata, tumor dos ouvidos, nariz e garganta (ONG), tumor renal, tumor cervical, tumor da pele e tumor uterino.
2. 2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo se liga selectivamente ao antigénio associado a um tumor, possui actividade de ΕΡ 1 759 013/PT 2/5 inibição tumoral e é selectivo para células que expressam ou expressam anormalmente o antigénio associado a um tumor.
3. 3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que as componentes em (ii), (iii) , (iv) e (v) aumentam selectivamente a quantidade de complexos de uma molécula de HLA e o antigénio associado a um tumor ou um seu fragmento.
4. 4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 3, em que o ácido nucleico em (iii) está presente num vector de expressão.
5. 5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 3, em que a célula hospedeira segrega o antigénio associado a um tumor ou o seu fragmento.
6. 6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 3, em que a célula hospedeira adicionalmente expressa uma molécula de HLA que se liga ao antigénio associado a um tumor ou o seu fragmento.
7. 7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, em que a célula hospedeira expressa a molécula de HLA e/ou o antigénio associado a um tumor ou o seu fragmento, de uma maneira recombinante.
8. 8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, em que a célula hospedeira expressa a molécula de HLA endogenamente.
9. 9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, 3, 6 ou 8, em que a célula hospedeira é uma célula apresentadora de antigénio.
10. 10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, quimérico ou humanizado ou um fragmento de um anticorpo. ΕΡ 1 759 013/PT 3/5
11. 11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o anticorpo está acoplado a um agente terapêutico ou de diagnóstico.
12. 12. Método para o diagnóstico de uma doença cancerosa caracterizada pela expressão ou expressão anormal de um antigénio associado a um tumor, compreendendo a detecção de: (i) um ácido nucleico que codifica o antigénio associado a um tumor e/ou (ii) o antigénio associado a um tumor numa amostra biológica isolada de um paciente, em que o antigénio associado a um tumor (a) compreende a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO:10 ou (b) possui uma sequência que é codificada por um ácido nucleico possuindo pelo menos 90% de identidade com o ácido nucleico de acordo com SEQ ID NO:9, em que a doença cancerosa é seleccionada do grupo que consiste em tumor da mama, tumor do pulmão, tumor do esófago, tumor do cólon, tumor do estômago, tumor pancreático, tumor do fígado, tumor ovariano, tumor da próstata, tumor dos ouvidos, nariz e garganta (ONG), tumor renal, tumor cervical, tumor da pele e tumor uterino.
13. 13. Método para determinação da regressão, progressão ou início de uma doença cancerosa caracterizada pela expressão ou expressão anormal de um antigénio associado a um tumor, o referido método compreendendo a monitoração de uma amostra obtida de um paciente possuindo a doença cancerosa ou que se suspeita que desenvolva a doença cancerosa, em relação a um ou mais parâmetros seleccionados do grupo que consiste em: (i) a quantidade do ácido nucleico que codifica o antigénio associado a um tumor e ΕΡ 1 759 013/PT 4/5 (ii) a quantidade do antigénio associado a um tumor, em que o antiqénio associado a um tumor (a) compreende a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO:10 ou (b) possui uma sequência que é codificada por um ácido nucleico possuindo pelo menos 90% de identidade com o ácido nucleico de acordo com SEQ ID NO:9, em que a doença cancerosa é seleccionada do grupo que consiste em tumor da mama, tumor do pulmão, tumor do esófago, tumor do cólon, tumor do estômago, tumor pancreático, tumor do fígado, tumor ovariano, tumor da próstata, tumor dos ouvidos, nariz e garganta (ONG), tumor renal, tumor cervical, tumor da pele e tumor uterino.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o método compreende a determinação do parâmetro ou dos parâmetros num primeiro ponto de tempo numa primeira amostra e num segundo ponto de tempo numa outra amostra, em que a progressão da doença cancerosa é determinada por comparação de ambas as amostras.
15. 15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12-14, em que a detecção ou a monitoração de acordo com (i) é efectuada por amplificação selectiva do ácido nucleico ou de um seu fragmento ou utilizando uma sonda polinucleotídica que híbrida especificamente com o ácido nucleico.
16. 16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12-14, em que a detecção ou a monitoração de acordo com (ii) é efectuada utilizando um anticorpo que se liga especificamente ao antigénio associado a um tumor.
17. 17. Utilização de um anticorpo que se liga a um antigénio associado a um tumor e está acoplado a um agente terapêutico ou de diagnóstico, para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento, diagnóstico ou ΕΡ 1 759 013/PT 5/5 monitoração de uma doença cancerosa caracterizada pela expressão ou expressão anormal do antigénio associado a um tumor, em que o antigénio associado a um tumor (a) compreende a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO:10 ou (b) possui uma sequência que é codificada por um ácido nucleico possuindo pelo menos 90% de identidade com o ácido nucleico de acordo com SEQ ID NO:9, em que a doença cancerosa é seleccionada do grupo que consiste em tumor da mama, tumor do pulmão, tumor do esófago, tumor do cólon, tumor do estômago, tumor pancreático, tumor do fígado, tumor ovariano, tumor da próstata, tumor dos ouvidos, nariz e garganta (ONG), tumor renal, tumor cervical, tumor da pele e tumor uterino.
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 16 ou utilização de acordo com a reivindicação 17, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, quimérico ou humanizado ou um fragmento de um anticorpo. Lisboa, 2010-08-09