PT1758610E - Métodos para o tratamento de cancro utilizando terapia com il-21 e anticorpos monoclonais - Google Patents

Description

1

DESCRIÇÃO "MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE CANCRO UTILIZANDO TERAPIA COM IL-21 E ANTICORPOS MONOCLONAIS"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

De um modo geral, as citoquinas estimulam a proliferação ou a diferenciação de células de linhagem hematopoiética ou participam nos mecanismos de resposta imunes e inflamatórios do corpo. As interleucinas constituem uma família de citoquinas que medeia as respostas imunológicas. A célula T desempenha um papel central para uma resposta imune, produzindo muitas citoquinas e afectando a imunidade adaptativa contra os antigénios. As citoquinas produzidas pelas células T foram classificadas como TH1 e TH2 (Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76: 300-317, 1998). As citoquinas de tipo 1 compreendem IL- 2, lFN-γ, LT-α e estão implicadas nas respostas inflamatórias, na imunidade virai, na imunidade contra parasitas intracelulares e na rejeição de aloenxertos. As citoquinas de tipo 2 compreendem IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 e estão implicadas nas respostas humorais, na imunidade contra helmintas e na resposta alérgica. As citoquinas partilhadas entre os tipos 1 e 2 compreendem IL- 3, GM-CSF e TNF-α. Existem algumas evidências que sugerem que populações de células T que produzem o tipo 1 e o tipo 2 migram preferencialmente para tipos diferentes de tecidos inflamados.

As células assassinas naturais (NK) possuem uma célula progenitora em comum com as células T e com as células B e desempenham um papel na vigilância imune. As células NK, as 2 quais compreendem até 15% dos linfócitos sanguíneos, não expressam receptores de antigénio, e representam um componente da imunidade inata. As células NK estão implicadas no reconhecimento e na morte de células tumorais e de células viralmente infectadas. In vivo, crê-se que as células NK necessitem de activação; no entanto, in vitro, as células NK têm demonstrado matar alguns tipos de células tumorais sem activação. 0 IL-21 tem demonstrado ser um potente modulador de células T e células NK citotóxicas. (Parrish-Novak, et al. Nature 408: 57-63, 2000; Parrish-Novak, et al., J. Leuk. Bio. 72: 856-863, 2002; Collins et al., Immunol. Res. 28: 131-140, 2003; Brady, et al. J. Immunol.: 2048-58, 2004). O IL-21 tem demonstrado co-estimular a expansão de células NK e tem demonstrado aumentar as funções efectoras destas células. As respostas de células T compreendem o aumento da resposta primária de antigénio como modulação das funções de memória de células T (Kasaian et al., Immunity 16: 559-569, 2002) .

Na terapia com anticorpos são utilizados antigénios que são expressos de um modo selectivo em determinados tipos de células. A terapia com anticorpos tem apresentado um êxito particular no tratamento de cancro visto que determinados tumores apresentam antigénios únicos, antigénios específicos de linhagem ou antigénios presentes em quantidades excessivas em relação a células normais. O desenvolvimento da terapia com anticorpos monoclonais (Mab) tem evoluído a partir da tecnologia de hibridomas em murganhos (Kohler et al., Nature 256: 495-497, 1975), a qual possuía uma utilidade terapêutica limitada devido a uma inaptidão para estimular a actividade de células 3 efectoras imunes humanas e a produção de anticorpos anti-murganho humanos (HAMA; Khazaeli et al., J. Immunother. 15: 42-52, 1994). Os anticorpos quiméricos manipulados, que eram menos antigénicos, foram alcançados utilizando regiões constantes humanas e regiões variáveis de murganhos. Estes anticorpos possuíam funções efectoras aumentadas e respostas HAMA reduzidas (Boulianne et al., Nature 312: 643-646, 1984). Os anticorpos monoclonais humanos foram desenvolvidos utilizando a tecnologia de apresentação de fagos (McCafferty et al., Nature 348: 552-554, 1990) e, mais recentemente, foram utilizados locais Ig humanos transformados em murganhos transgénicos para a produção de anticorpos monoclonais totalmente humanos (Green, J. Immunol. Methods 231: 11-23, 1999). Para informações sobre terapia de anticorpos monoclonais ver Brekke et al., Nat. Rev. Drug Discov. 2: 52-62, 2002.

No documento WO 03/103589 encontra-se descrita a utilização de IL-21 em cancro e em outras aplicações terapêuticas.

No documento WO 2004/032857 encontram-se descritas combinações de anticorpos anti-CEA e um agente terapêutico.

Clegg et ai., European Cytokine Network, Vol. 14(3), Setembro de 2003, página 28, descrevem oportunidades terapêuticas para IL-21.

No documento WO 2005/037306 encontra-se descrita uma terapia de combinação com IL-21. A presente invenção proporciona o aumento de actividade anti-tumoral para a terapia de anticorpos monoclonais com IL-21. A combinação de IL-21 e anticorpos monoclonais terapêuticos proporciona melhorias na terapia de anticorpos monoclonais por si só, em particular para 4 pacientes que não respondam à terapia de anticorpos monoclonais por si só ou em combinação com outros regimes de tratamento. Esta e outras utilizações serão evidentes para os especialistas na matéria a partir da descrição aqui apresentada.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito ao tratamento de cancro num sujeito, em particular em sujeitos humanos, o qual compreende a co-administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de rituximab e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipéptido de IL-21 conforme ilustrado na SEQ ID NO: 2, a partir do resíduo aminoácido 30 até ao resíduo 162. O anticorpo monoclonal é rituximab. De acordo com outra variante, a presente invenção diz respeito ao tratamento de linfoma não Hodgkin. Na presente invenção, o anticorpo monoclonal rituximab e o polipéptido de IL-21 são administrados uma vez por semana até oito semanas consecutivas. Uma outra variante da presente invenção proporciona uma dose de polipéptido de IL-21 compreendida entre 10 e 500 pg/kg/dose. De acordo com algumas variantes da presente invenção, o paciente foi tratado anteriormente com rituximab e não apresentou uma remissão ou regressão apreciável do tumor. De acordo com outras variantes, o paciente sofreu uma recaída após a administração de terapia com rituximab.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para o tratamento de cancro num sujeito, o qual compreende a co-administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal anti-CD20 e uma quantidade terapeuticamente 5 eficaz de um polipéptido de IL-21 ou de um fragmento de um polipéptido de IL-21, conforme ilustrado na SEQ ID NO: 2 desde o residuo aminoácido 30 até ao residuo 162, em que a administração de IL-21 proporciona uma resposta imunológica óptima.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para o tratamento de cancro num sujeito que compreende a co-administração de um anticorpo monoclonal que se liga a um receptor de Her-2/neu e de um polipéptido de IL-21, conforme ilustrado na SEQ ID NO: 2 desde o residuo aminoácido 30 até ao residuo 162. De acordo com outra variante, o sujeito é um paciente humano. De acordo com outra variante, o anticorpo monoclonal é trastuzumab.

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona um método para o tratamento de cancro num sujeito que compreende a co-administração de um anticorpo monoclonal que se liga a um antigénio 4 associado a linfócitos T citotóxicos (CTLA-4) e de um polipéptido de IL-21 ou um fragmento de um polipéptido 21, conforme ilustrado na SEQ ID NO:2 desde o residuo aminoácido 30 até ao residuo 162. De acordo com determinadas variantes, o sujeito é um paciente humano. De acordo com outra variante da presente invenção, o anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 é administrado numa dose de 3 mg/kg a cada três semanas durante quatro ciclos e o polipéptido de IL-21 ou fragmento é administrado uma a cinco vezes por semana até oito semanas. A presente invenção também proporciona variantes nas quais a dose em polipéptido de IL-21 está compreendida entre 10 e 500 pg/kg/ /dose. 6

DESCRIÇÃO ABREVIADA DAS FIGURAS A figura 1 ilustra as curvas de sobrevivência para murganhos com depleção de macrófagos, as quais são significativamente diferentes de murganhos sem depleção. A figura 2 mostra que os murganhos com depleção de granulócitos por injecções de MAb anti-Gr-1 apresentam uma sobrevivência reduzida em comparação com murganhos sem depleção. A figura 3 mostra que a combinação de anti-CTLA4 + IL21 possui um efeito anti-tumor no modelo RENCA.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Antes de se apresentar a invenção mais minuciosamente, poderá ser útil para a sua compreensão definir os termos seguintes. 0 termo "marcador de afinidade" é aqui utilizado para designar um segmento de polipéptido que pode ser ligado a um segundo polipéptido para proporcionar a purificação ou detecção do segundo polipéptido ou para proporcionar locais de ligação do segundo polipéptido a um substrato. Em principio, qualquer péptido ou proteína para os quais está disponível um anticorpo ou outro agente de ligação específico pode ser utilizado como marcador de afinidade. Os marcadores de afinidade compreendem um tracto de poli-histidina, uma proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991), uma glutationa-S-transferase (Smith e Johnson, Gene 67: 31, 1988), um marcador de afinidade Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 7952-4, 1985), uma substância P, um péptido Flag™ (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204-10, 1988), um péptido de ligação a estreptavidina 7 ou outro epítopo ou domínio de ligação antigénico. Ver Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Os marcadores de afinidade encontram-se disponíveis a partir de fornecedores comerciais (v.g., Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). O termo "variante alélica" é aqui utilizado para designar qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupar o mesmo local cromossómico. Uma variação alélica ocorre naturalmente através de mutação e pode provocar um polimorfismo fenotípico em populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (sem alterações no polipéptido codificado) ou podem codificar os polipéptidos que possuem a sequência de aminoácido alterada. O termo variante alélica também é aqui utilizado para designar uma proteína codificada por uma variante alélica de um gene.

Os termos "terminal amino" e "terminal carboxilo" são aqui utilizados para designar posições nos polipéptidos. Caso o contexto o permita, estes termos são utilizados como referência a uma sequência ou porção particular de um polipéptido para designar proximidade ou uma posição relativa. Por exemplo, uma determinada sequência posicionada no terminal carboxilo em relação a uma sequência de referência no polipéptido está localizada próxima do terminal carboxilo da sequência de referência, mas não está forçosamente no terminal carboxilo do polipéptido completo. 0 termo "cancro" ou "célula cancerígena" é aqui utilizado para designar um tecido ou células encontrado num neoplasma que possui características que o diferenciam de tecido normal ou de células de tecido. Entre tais características refere-se, mas sem que isso constitua 8 qualquer limitação: grau de anaplasia, irregularidade na forma, indistinção do contorno da célula, tamanho do núcleo, alterações na estrutura do núcleo ou citoplasma, outras alterações fenotipicas, presença de proteínas celulares que indicam um estado cancerígeno ou pré-cancerígeno, número aumentando de mitoses e aptidão para produzir metástases. Como palavras que pertencem ao âmbito de "cancro" refere-se carcinoma, sarcoma, tumor, epitelioma, leucemia, linfoma, pólipo e scirrus, transformação, neoplasma e semelhantes. 0 termo "co-administração" é aqui utilizado para designar que um polipéptido ou proteína de IL-21 e um anticorpo monoclonal terapêutico podem ser administrados em simultâneo ou em instantes diferentes. A co-administração pode ser uma co-administração única de IL-21 e do anticorpo monoclonal ou múltiplos ciclos de co-administração. A co-administração não necessita de ser as únicas vezes que o IL-21 ou o anticorpo monoclonal é administrado a um paciente, podendo qualquer agentes ser administrado por si só ou em combinação com agentes terapêuticos diferentes de IL-21. 0 termo "terapia de combinação" é aqui utilizado para designar que se administra ao sujeito pelo menos uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição de IL-21 ("IL-21") e de um anticorpo monoclonal terapêutico. A composição de IL-21 pode ser um polipéptido maduro, um seu fragmento, um produto de fusão ou conjugado que apresente a actividade biológica de IL-21. 0 termo "isolado", quando aplicado a um polinucleótido, designa que o polinucleótido foi removido do seu meio genético natural, estando assim livre de outras 9 sequências de codificação estranhas ou não desejadas e estando numa forma adequada para utilização em sistemas de produção de proteínas geneticamente modificadas. Tais moléculas isoladas são aquelas que são separadas a partir do seu ambiente natural e compreendem clones de ADNc e genómicos. As moléculas de ADN isoladas da presente invenção estão isentas de outros genes com os quais estão normalmente associadas, mas podem incluir regiões não traduzidas 5' e 3' que ocorrem naturalmente, tais como promotores e terminadores. A identificação de regiões associadas será evidente para um especialista na matéria (ver, por exemplo, Dynan e Tijan, Nature 316: 774-78, 1985).

Um polipéptido ou proteína "isolado" é um polipéptido ou proteína que se encontra num estado diferente do seu ambiente natural, tal como separado do sangue e de tecido animal. De acordo com uma forma preferida, o polipéptido isolado está praticamente isento de outros polipéptidos, em particular de outros polipéptidos de origem animal. É preferível proporcionar os polipéptidos numa forma bastante purificada, isto é, com uma pureza superior a 95% e mais preferencialmente com uma pureza superior a 99%. No caso de ser utilizado neste contexto, o termo "isolado" não exclui a presença do mesmo polipéptido em formas físicas alternativas, tais como dímeros, ou em formas alternativamente glicolisadas ou transformadas. 0 termo "nível" quando referido a propósito de células imunes, tais como células NK, células T, em particular células T citotóxicas, células B e semelhantes, um nível aumentado designa um número aumentado de células ou uma actividade aumentada da função celular. 10 O termo "nível" quando referido a propósito infecções virais designa uma alteração no nível de infecção virai e compreende, mas sem que isso constitua qualquer limitação, uma alteração no nível de CTL ou de células NK (conforme descrito antes), uma diminuição na carga virai, uma aumento no título de anticorpos antivirais, uma diminuição nos níveis serológicos de alanina-aminotransferase ou uma melhoria conforme determinado por exames histológicos de um tecido ou órgão alvo. A determinação do facto destas alterações nos níveis constituírem diferenças ou alterações significativas faz parte dos conhecimentos dos especialistas na matéria. O termo "neoplásico", quando referido a células, indica células que sofre de uma proliferação nova e anormal, em particular num tecido em que a proliferação é não controlada e progressiva, dando origem a um neoplasma. As células neoplásicas podem ser malignas, isto é, invasivas e metastáticas, ou benignas. O termo "dose imunológica óptima" é definido como a dose de IL-21 ou IL-21 em combinação com um anticorpo monoclonal que alcança a resposta imunológica óptima. 0 termo "resposta imunológica óptima" designa uma alteração numa resposta imunológica após a administração de IL-21 ou da combinação IL-21 + MAb em relação à observada quando o MAb é administrado por si só, e pode ser (1) um aumento no número de células T CD8 activadas ou específicas do tumor, (2) um aumento no número de células T CD8 activadas ou específicas do tumor que expressam níveis elevados de granzima B ou perforina ou IFNy, (3) um aumento por externalização do receptor Fcy (CD16, CD32 ou CD64) sobre células NK, monócitos ou neutrófilos, (4) um aumento 11 em CD25 solúvel no soro, (5) uma redução no nível sérico de proteínas libertado por células tumorais, (ver, Taro et al., J. Cell Physiol 203(1): 1-5. 2005), por exemplo, antigénio carcinoembriónico (CEA), igG, CA-19-9 ou antigénio do cancro do ovário (CAI25) , (6) um aumento no número de células NK que expressam níveis elevados de granzima B , perforina ou IFNy, (7) um aumento nos níveis de activação de citoquinas, tais como IL-18, IL-15, IFNy e quimioquinas, que permitem o repouso de células efectoras do tumor, tais como IP-10, RANTES, IL-8, MlPla ou MlPlb, (8) um aumento no número de macrófagos activados na periferia ou no local do tumor, em que a activação pode ser detectada pela expressão aumentada de MHC de classe I ou classe II, pela produção de IL-15, IL-18, IFNy ou IL-21 ou (9) a actividade de macrófagos conforme indicada pelo declínio na contagem de células vermelhas sanguíneas (gravidade de anemia).

Um "polinucleótido" é um polímero de cadeia única ou dupla de bases de desoxirribonucelótido ou ribonucleótido lidas a partida da extremidade 5' até à 3'. Os polinucleótidos compreendem ARN e ADN e podem ser isolados a partir fontes naturais, sintetizados in vitro ou preparados a partir de uma combinação de moléculas naturais e sintéticas. Os tamanhos dos polinucleótidos são expressos como pares de bases (abreviadamente "bp"), os nucleótidos ("nt") ou quilobases ("kb2). Caso o contexto o permita, estes dois últimos termos podem descrever polinucleótidos que possuam uma cadeia individual ou cadeia dupla. No caso do termo ser aplicado a moléculas de cadeia dupla, então é utilizado para designar o comprimento total e será entendido como sendo equivalente ao termo "pares de bases". 12

Será evidente para os especialistas na matéria que as duas cadeias de um polinucleótido de cadeia dupla podem ser ligeiramente diferentes em termos de tamanho e que as suas extremidades podem ser como resultado de clivagem enzimática; assim todos os nucleótidos numa molécula de polinucleótido de cadeia dupla podem não estar emparelhados.

Um "polipéptido" designa um polímero de resíduos de aminoácido unidos por ligações peptídicas, quer sejam produzidos por meios naturais ou sintéticos. Os polipéptido que possuem menos de 10 resíduos de aminoácido são normalmente designados como "péptidos".

Uma "proteína" designa uma macromolécula que compreende uma ou várias cadeias de polipéptidos. Uma proteína também pode compreender componentes não peptídicos, tais como grupos de hidratos de carbono. Os hidratos de carbono e outros substituintes não peptídicos podem ser adicionados a uma proteína pela célula na qual a proteína é produzida, e irao variar conforme o tipo de célula. As proteínas são aqui definidas em termos da sua estrutura principal de aminoácidos; os substituintes, tais como hidratos de carbono, não são normalmente especificados embora estejam mesmo assim presentes. O termo "receptor" designa uma proteína associada a células que se liga a uma molécula bioactiva (isto é, um ligando) e medeia o efeito do ligando na célula. Os receptores ligados à membrana são caraterizados por uma estrutura multi-peptídica que compreende um domínio de ligação a um ligando extracelular e um domínio efector intracelular que está tipicamente implicado na transdução do sinal. A ligação do ligando ao receptor resulta numa 13 alteração conformacional no receptor que provoca uma interacção entre o domínio efector e a(s) outra(s) molécula (s) na célula. Por sua vez, esta interacção dá origem a uma alteração no metabolismo da célula. Os eventos metabólicos associados a interacções receptor-ligando compreendem a transcrição de genes, a fosforilação, a desfosforilação, o aumento da produção de AMP cíclico, a mobilização de cálcio celular, a mobilização de lípidos da membrana, a adesão celular, a hidrólise de lípidos inositol e a hidrólise de fosfolípidos. De um modo geral, os receptores podem ser ligados à membrana, citossólicos ou nucleares; monoméricos (v.g., receptor da hormona estimuladora da tiróide, receptor beta-adrenérgico) ou multiméricos (v.g., receptor de PDGF, receptor da hormona de crescimento, receptor de IL-3, receptor de GM-CSF, receptor de G-CSF, receptor de eritropoietina e receptor de IL-6) . 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz" é definido como a quantidade de uma composição de IL-21 ou de uma composição de IL-21 em combinação com um anticorpo monoclonal que proporcione uma resposta completa, uma resposta parcial ou uma doença estável com um tempo aumentado de progressão ao longo da resposta média para a terapia com o anticorpo monoclonal na ausência de IL-21. 0 termo "antigénio associado ao tumor" designa um péptido ou um polipéptido ou um complexo peptídico que possui um perfil de expressão diferente do antigénio encontrando em células não tumorais. Por exemplo, um antigénio não tumoral pode ser expresso com uma frequência ou densidade mais elevada por células tumorais do que por células não tumorais. Um antigénio tumoral pode ser 14 diferente de um antigénio não tumoral em termos de estrutura, por exemplo, o antigénio pode ser expresso como um polipéptido truncado, possuir alguma mutação na sequência de aminoácido ou na sequência de polinucleótido que codifica o antigénio, pode ser mal dobrado ou modificado de um modo impróprio após translação. De um modo idêntico aos antigénios que estão presentes em células normais, as células não tumorais no organismo hospedeiro permitem que as células tumorais escapem dos mecanismos de vigilância imunológica do hospedeiro.

Os pesos moleculares e comprimentos dos polímeros determinados por métodos analíticos imprecisos (v.g., eletroforese em gel) irão ser entendidos como valores aproximados. No caso de um valor ser expresso como "cerca de" X ou "aproximadamente" X, então o valor referido de X irá ser preciso em ± 10%. A presente invenção tem por base a conclusão do facto de a administração de IL-21 em combinação com anticorpos monoclonais terapêuticos ser mais potente do que a administração dos anticorpos monoclonais por si sós. A. Descrição de IL-21 O IL-21 humano (SEQ ID NO:l e SEQ ID NO: 2) foi originalmente designado como ligando zalfall e encontra-se descrito nas patentes de invenção norte-americanas nos 6 307 024 e 6 686 178, da requerente. O receptor de IL-21 (anteriormente designado por zalfall) agora designado por IL-21R (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6) e o receptor heterodimérico de IL-21R/IL-2RY encontram-se descritos nas publicações de patente de invenção WIPO nos WO 0/17235 e WO 01/77171, da requerente. Conforme descrito nestas 15 publicações, o IL-21 foi isolado a partir de um banco de dados de ADNc gerado a partir de células de sangue periférico humanas activadas (hPBCs), as quais foram seleccionadas para CD3. 0 CD3 é um marcador de superfície de células único para células de origem linfoide e em particular de células T. A sequência de aminoácido para o IL-21R indica que o receptor codificado pertence à subfamília de receptores de citoquinas de classe I, a qual compreende, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os receptores para IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF e G-CSF (para uma descrição ver Cosman, "The Hematopoietin Receptor Superfamily" em Cytokine 5(2): 95-106, 1993). O receptor de IL-21 foi identificado em células NK, em células T e em células B, o que indica que o IL-21 actua sobre células de linhagem hematopoiética e, em particular, células progenitoras linfoides e células linfoides. Como outras citoquinas de entrelaçados de quatro hélices que actuam sobre as células linfoides refere-se IL-2, IL-4, IL-7 e IL-15. Para uma descrição de citoquinas de entrelaçados de quatro hélices ver Nicola et al., Advances in Protein Chemistry 52: 1-65, 1999 e Kelso, A., Immunol. Cell Biol. 76: 300-317, 1998.

Para IL-21, uma sequência de sinal secretória é constituída pelos resíduos de aminoácido 1 (Met) a 29 (Ser) e um polipéptido maduro é constituído pelos resíduos aminoácido 30 (Gin) a 162 (Ser) (conforme ilustrado na SEQ ID NO:2). A sequência de polinucleótido correspondente é ilustrada na SEQ ID NO:l. Será evidente para os especialistas na matéria que a sequência apresentada na SEQ ID NO:l representa um alelo individual de IL-21 humano e 16 que se espera que ocorra uma variação alélica e uma montagem alternativa. São aqui descritos polipéptidos de IL-21 isolados que possuem uma identidade de sequência substancialmente semelhante aos polipéptidos da SEQ ID NO: 2, ou dos seus ortólogos. 0 termo "identidade de sequência substancialmente semelhante2 é aqui utilizado para designar polipéptidos que compreendem uma identidade de sequência pelo menos de 80%, pelo menos de 90%, pelo menos de 95% ou superior a 95% em relação às sequências apresentadas na SEQ ID NO:2, ou os seus ortólogos. A presente memória descritiva também inclui polipéptidos que compreende uma sequência de aminoácido que possui uma identidade de sequência pelo menos de 80%, pelo menos de 90%, pelo menos de 95% ou superior a 95% em relação à sequência de resíduos de aminoácido 1 a 162 ou 30 a 162 da SEQ ID NO:2. A presente memória descritiva inclui ainda moléculas de ácido nucleico que codificam tais polipéptidos. Os métodos para a determinação da percentagem de identidade são conhecidos pelos especialistas na matéria.

De um modo geral, durante a concepção de modificações em moléculas ou durante a identificação de fragmentos específicos, a determinação da estrutura será acompanhada pela avaliação da actividade de moléculas modificada. Para uma descrição mais extensa sobre modificações no polinucleótido e polipéptido de IL-21, ver as patentes de invenção norte-americanas nos 6 307 024 e 6 686 178. A presente memória descritiva também inclui a administração de moléculas que possuem a actividade funcional de IL-21. Assim, a administração de fragmentos funcionais de polipéptidos funcionais modificados de 17 polipéptidos de IL-21 e de moléculas de ácido nucleico que codifiquem tais fragmentos funcionais e polipéptidos modificados está abrangida pela presente memória descritiva. Um IL-21 "funcional" ou um seu fragmento, conforme aqui definido, é caracterizado pela sua actividade de proliferação ou de diferenciação, pela sua aptidão para induzir ou inibir funções especializadas de células, em particular de células efectoras humanas, tais como células NK, células T, células B e células dendriticas. 0 IL-21 funcional também compreende a aptidão para exibir efeitos anti-cancro e anti-virais in vitro ou in vivo, ou pela sua aptidão de se ligar especificamente a um anticorpo anti-IL-21 ou um receptor IL-21 (solúvel ou imobilizado).

Também é possível utilizar diversas fusões de polipéptidos (e proteínas multiméricas associadas que compreendem um ou mais fusões de polipéptidos). Por exemplo, um polipéptido de IL-21 pode ser preparado como uma fusão para uma proteína de dimerização, conforme descrito nas patentes de invenção norte-americanas nos 5 155 027 e 5 567 584. Como proteínas de dimerização preferidas neste sentido refere-se os domínios de região constante de imunoglobulina. As fusões de imunoglobulina-polipéptido de 11-21 podem ser expressas em células geneticamente manipuladas (para produzir diversos análogos de 11-21 multiméricos) . Domínios auxiliares podem ser fundidos a polipéptidos de IL-21 para os dirigir para células, tecidos ou macromoléculas específicos. Por exemplo, um polipéptido ou proteína de IL-21 pode ser dirigida a um tipo pré-determinado de células por meio da fusão de um polipéptido de IL-21 a um ligando ou a um anticorpo monoclonal que se ligue especificamente a um 18 receptor sobre a superfície dessa célula alvo. Deste modo, os polipéptidos e as proteínas podem ser dirigidos para fins terapêuticos ou de diagnóstico. Um polipéptido de IL-21 pode ser fundido a dois ou mais radicais, tais como um marcador de afinidade para purificação e um domínio alvo. As fusões de polipéptidos também podem compreender um ou mais locais de clivagem, em particular entre domínios. Ver, Tuan et al., Connective Tissue Research 34: 1-9, 1996.

Independentemente da sequência de nucleótidos particular de uma variante de polinucleótido de IL-21, o polinucleótido codifica um polipéptido que é caracterizado pela sua actividade de proliferação e de diferenciação, pela sua aptidão para induzir ou inibir funções especializadas de células ou pela aptidão de se ligar especificamente a um anticorpo anti-IL-21 ou a um receptor de IL-21. Mais especificamente, as variantes de polinucleótidos de IL-21 irão codificar polipéptidos que exibam pelo menos 50% e, de acordo com determinadas variantes, superior a 70%, 80% ou 90% da actividade do polipéptido ilustrado na SEQ ID NO: 2.

Para qualquer polipéptido de IL-21, incluindo variantes e proteínas de fusão, para um especialista na matéria será fácil gerar uma sequência de polinucleótido totalmente degenerada que codifique essa variante, utilizando o código genético e os métodos conhecidos na especialidade.

Os polipéptidos de IL-21 utilizados na presente invenção podem ser produzidos em células hospedeiras geneticamente modificadas de acordo com técnicas convencionais. Como células hospedeiras adequadas refere-se os tipos de células que podem ser transformados ou 19 transfectados com ADN exógeno e desenvolvidas em cultura, e compreendem bactérias, células fúngicas e células eucarióticas superiores cultivadas. São preferíveis as células eucarióticas, em particular as células cultivadas de organismos multicelulares. As técnicas para a manipulação de moléculas de ADN clonado e para a introdução de ADN exógeno rem diversas células hospedeiras encontram-se descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, e por Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987. As construções de expressão e os métodos para a produção de IL-21 encontram-se descritos nas patentes de invenção norte-americanas nos 6 686 178 e PCT US 03/39764.

Os conjugados de IL-21 utilizados para terapia podem compreender radicais poliméricos solúveis em água farmaceuticamente aceitáveis. Como polímeros solúveis em água aceitáveis refere-se polietileno-glicol (PEG), monometoxi-PEG, mono-alcoxi(C1-C10)-PEG, ariloxi-PEG, poli-(N-vinil-pirrolidona)-PEG, tresil-monometoxi-PEG, PEG-propionaldeído, carbonato de bis-succinimidil-PEG, homopolímeros de propileno-glicol, um co-polímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (v.g., glicerol), álcool polivinílico, dextrano, celulose ou outros polímeros com base em hidratos de carbono. Um PEG adequado pode possuir um peso molecular compreendida entre cerca de 600 e cerca de 60000, incluindo, por exemplo, 5000, 12000, 20000 e 25000. Um conjugado de IL-21 também pode compreender uma mistura de tais polímeros solúveis em agua. 20 B. Utilização de IL-21 e de anticorpos monoclonais em terapia de combinação.

Um dos mecanismos associados com a actividade anti-tumor da terapia com anticorpos monoclonais é a citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC). Na ADCC, os anticorpos monoclonais ligam-se a uma célula alvo (v.g., uma células cancerígena) e os receptores que expressam células efectoras especificas para o anticorpo monoclonal (v.g., células NK, monócitos e granulócitos) ligam o complexo anticorpo monoclonal/célula alvo dando origem à morte da célula alvo. 0 IL-21 aumenta a função efectoras da célula, aumentando assim a eficácia da terapia com anticorpo monoclonal. A dose e o regime de administração de IL-21 em combinação com MAb tem por base a aptidão de IL-21 para elevar os parâmetros associados à diferenciação e à actividade funcional das populações celulares que medeiam a ADCC, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, células NK, macrófagos e neutrófilos. Estes parâmetros podem ser avaliados utilizando ensaios de NK, citotoxicidade de macrófagos e neutrófilos, ADCC (fracção de células NK ou células mononucleares totais) ou moléculas efectoras essenciais para a aptidão das células de implementarem ADCC (v.g., FasL, granzimas e perforina). O IL-21 também aumenta a produção de citoquina e de quimioquina por células NK quando combinado com Mab mais células tumorais (v.g., IFNy). A importância de células de Kupffer para a "limpeza" de células B revestidas com rituximab também foi demonstrada (Gong et al., J. Immunol. 174: 817-826, 2005).

Um outro mecanismo associado à actividade anti-tumor é a fagocitose de células tumorais revestidas com MAb. Tal é 21 também dependente do receptor de Fc e tem demonstrado influenciar a depleção de B anticorpos anti-CD20 (Uchida et ai., J. Exp. Med. 199(12): 1659-69, 2004). A dose e o regime dos MAb têm por base as propriedades farmacocinéticas e toxicocinéticas atribuídas ao anticorpo específico co-administrado, e deverão optimizar estes efeitos, minimizando, em simultâneo, qualquer toxicidade associada à administração de IL-21.

Com base nos resultados com rituximab e trastuzumab aqui descritos minuciosamente, outros anticorpos monoclonais que utilizem mecanismos mediados por células efectoras imunes para actividade anti-tumor também serão aumentados no caso de se utilizar o IL-21 em combinação com o anticorpo. Além disso, visto que o IL-21 aumenta a actividade anti-tumor mediada por células efectoras imunes, há determinados anticorpos monoclonais que apresentaram uma eficácia anti-tumor limitada quando utilizados por si sós que serão bons candidatos para terapia de combinação com IL-21. A terapia de combinação com IL-21 e um anticorpo monoclonal pode ser indicado no caso do insucesso de uma primeira abordagem de tratamento e pode ser considerada como uma segunda abordagem de tratamento. No entanto, com base na actividade anti-tumor aumentada de IL-21 em combinação com um anticorpo monoclonal, a presente memória descritiva também proporciona a utilização da combinação como primeira abordagem de tratamento em populações de pacientes que foram agora diagnosticadas e que não foram previamente tratadas com agentes anti-cancro "pacientes de novo" e de pacientes que não tenham sido ainda tratados com qualquer terapia de anticorpo monoclonal, "pacientes naive". 22 0 IL-21 também é útil em terapia de combinação com anticorpos monoclonais na ausência de qualquer ADCC directa mediada por anticorpo de células tumorais. Os anticorpos que bloqueiam um sinal inibitório no sistema imune podem dar origem a respostas imunes aumentadas. Como exemplos refere-se (1) anticorpos contra moléculas da família de B7R que possuem uma função inibitória, tais como antigénio 4 associado a linfócitos T citotóxicos (CTLA-4), morte 1 programada (PD-1), atenuador de linfócitos B e T (BTLA); (2) anticorpos contra citoquinas inibitórias, tais como IL-10, ΤΘΕβ; e (3) anticorpos que permitem a depleção ou que inibem as funções de células supressoras, tais como anti-CD25 ou CTLA-4. Por exemplo, crê-se que os Mab anti-CTLA4 em murganhos e em seres humanos suprimam a função de células T regulatórias supressoras de imunidade (Treg) ou inibam o sinal inibitório transmitido através da ligação de CTLA-4 em células T a moléculas B7-1 ou B7-2 em APC ou em células tumorais. O CTLA-4 é expresso transitoriamente sobre a superfície de células T activadas e é constitutivamente expresso em células Treg. A reticulação de CTLA-4 proporciona um sinal inibitório sobre células T activadas, e os anticorpos contra CTLA-4 bloqueiam o sinal inibitório sobre as células T proporcionando uma activação prolongada de células T (Phan et al., PNAS, 100: 8372-8377, 2003). Em modelos de murganhos, o tratamento anti-CTLA4 proporciona um aumento no número de células T CD8 específicas para o tumor activadas e de células NK dando origem a potentes respostas anti-tumor. O receptor para IL-21 (IL-21R) é expresso nestas células efectoras e o IL-21 pode aumentar a sua função efectoras ainda mais por meio da activação destas células através do IL-21R. Tal pode 23 proporcionar uma actividade anti-tumor mais potente. Estão a decorrer ensaios clínicos em que se administra anticorpos de bloqueio contra CTLA-4 aos pacientes em melanoma e em cancro do ovário e da próstata. No entanto, a eficácia tem vindo a ser correlacionado com eventos adversos graves (veja-se o documento US 2004/0241169), pelo que uma terapia de combinação que proporcionasse um tratamento menos tóxico seria vantajosa.

No quadro 1 é apresentada uma lista não exclusiva de anticorpos monoclonais aprovados ou em fase de teste para os quais é possível uma terapia de combinação com IL-21.

Quadro 1

Alvo Nome do fármaco Indicações clínicas Empresa IL- 2Ra(CD25) Zenapax transplante de rim Roche IL-1R AMG108 osteoartrite Amgen RANK-L AMG162 osteoporose Amgen Blys LympoSTAT-B SLE, RA HGS CD40L (CD39) initiatedAID Celltech/IDEC TRAIL-R1 HGS-ETR1 cancros HGS TRAIL-R2 HGS-ETR2 tumores sólidos HGS CD30 SGN30 Hodgkins, NHL Seattle Genetics CD40 SGN40 MM Seattle Genetics HER2 Herceptin cancro da mama Genentech EGF-R ABX-EGF CRC, NSCLC, RCC Abgenix EMD72000 tumores sólidos Merck

Alvo Nome do fármaco Indicações clínicas Empresa MDX-214 tumores positivos EGF-R Medarex Erbitux CRC Imclone VEGF-R CDP791 tumores sólidos Celltech PDGF-R CDP860 tumores sólidos Celltech/ZymoGenetics CDlla(aL) Raptiva psoríase Genentech a4- integrin Antegrin CD, MS PDL, Biogen-IDEC α4β7 integrin MLM0 2 CD, UC Millenium α5 β3 integrin Vitaxin psoríase, cancro da próstata AME/Lilly CD2 (LFA3/FC) Amevive psoríase Biogen/IDEC CD152 CTLA-4/Ig RA Bristol Meyers CD152 CTLA-4 cancros Medarex CD49a Integrina al RA/lúpus Biogen/IDEC CD49e Integrina a5 cancros Protein Design Labs MUC1 Theragyn MUC18 (TIM-like) ABX-MA1 melanoma TAG-72 Mucin Anatumomab cancros CD3 Ecromeximab melanoma Kyowa Hakko TRX4 IDDM tipo I TolerRx Nuvion UC PDL 25

Alvo Nome do fármaco Indicações clínicas Empresa 0rthoClone0KT3 transplante de orgãos Ortho biotech CD4 HuMax-CD4 linfoma de células T GenMab CD19 MT10 3 NHL Medimmune CD6 4 (Fc GR1) AntiCD6 4 cancros Medarex SIGLECs: CD3 3 MyloTarg AML Celltect/Wyeth ZAmyl AML Protein Design Labs CD2 2 linfócido NHL, AID Immunomedics CEA CEA-Cide cancros Immunomedics CD20 Rituxan NHL Genentech CD52 Campath MS, NHL, linfoma de células T Genzyme, IDEX CD4 4 Bivatuzumab cancros Boehringer Ingelheim CD2 3 (Fc Ep R) IDEC152 asma e rinite alérgicas Biogen/IDEC LRR: CD14 IC0SIC14 sépsis ICOS EpCAM Panorex cancro colo-rectal Centocor Lewis-Y- Ag SGN15 cancros Seattle Genetics CD8 0 B7.1 psoríase/NHL Biogen/IDEC 1. IL-21 e anticorpos monoclonais anti-CD20 0 CD20 é um antigénio de diferenciação restrita de linfócitos B humanos e é expresso como antigénio de superfície de células B, Bp35, uma proteína de 35 kD. 0 26 CD20 é encontrado em células B periféricas e pode ser identificado em células B em maturação até à etapa de células no plasma (Reff et ai., Blood 83: 435-445, 1994). Os anticorpos monoclonais anti-CD20 (MAb) foram testados clinicamente e pelo menos um Mab anti-CD-20 humanizado, rituximab, foi aprovado para tratamento de linfoma de não Hodgkins (NHL). 0 rituximab (RITUXAN®) liga-se a células de linfoma e pode induzir a apoptose directamente in vitro, embora também seja capaz de induzir diversos mecanismos efectores, tais como citotoxicidade dependente do complemento e citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (Shan et al., Blood 91: 1644-1652, 1998). 0 rituximab é normalmente utilizado como primeira abordagem de tratamento para NHL (Maloney et al., Blood 90: 2188-2195, 1997; patente US n° 5 736 137). O rituximab é um Mab geneticamente manipulado com regiões variáveis de cadeia leve e pesada de murino e regiões constantes de cadeia pesada gama I e cadeia leve kapa humanas (patente US n° 6 455 043). O anticorpo quimérico é constituído por duas cadeias pesadas de 451 aminoácidos e duas cadeias leves de 213 aminoácidos e possui um peso molecular aproximado de 145 kD. Em experiências pré-clínicas, o anticorpo inibiu o crescimento celular nas linhagens de células B, FL-18, Ramos e Raji e induziu a apoptose na linhagem de células B humanas DHL-4 de um modo dependente da dose (Demidem et al. Câncer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 12: 177-186, 1997). O MAb revelou ter um período de semi-vida relativamente longo no soro e um perfil de toxicidade relativamente reduzido.

No entanto, um população significativa de pacientes é refractória ou tornou-se resistente ao longo do tempo ao 27 tratamento com o anticorpo anti-CD20, mesmo quando combinado com outros tratamentos, tais como transplante de medula-óssea ou de células estaminais, radioterapia e quimioterapia. De um modo geral, tais pacientes não exibem uma remissão ou regressão apreciável de tumores após a administração de anticorpos anti-CD20 e poderiam beneficiar de novas terapias que aumentassem a responsividade aos anticorpos. Além disso, uma actividade anti-tumor aumentada também iria beneficiar as populações de pacientes que foram recentemente diagnosticados e que não foram previamente tratados com agentes anti-cancro, "paciente de novo" e pacientes que não tenham recebido previamente qualquer terapia com anticorpos monoclonais, "pacientes nalve".

Conforme referido antes, o IL-21 tem demonstrado expandir o número de células NK e potenciar os efeitos de citotoxicidade de células NK e de células T. Além disso, os receptores para IL-21 foram identificados em monócitos, células dendriticas, células B, células T e células NK (Parrish-Novak et al., J. Leuk. Biol. 72: 856-863, 2002). Provas suplementares demonstraram que o IL-21 afecta a proliferação e/ou diferenciação de células T e de células B in vivo. Muitas linhagens tumorais de células B humanas podem ser enxertadas em murganhos SCID e deixadas desenvolver de um modo localizado e disseminado. Em tais modelos, a medição do crescimento tumoral ou do tempo de sobrevivência do murganho hospedeiro proporciona um meio para avaliar a eficácia terapêutica potencial contra cancros de células B (Bonnefoix et al., Leukemia and Lymphoma 25: 169-178, 1997).

No caso de anticorpos mediarem um efeito anti-tumor através de ADCC por células com base na imunidade 28 (incluindo células NK, macrófagos e neutrófilos), as células cancerígenas que se encontram ligadas pelo complexo de anticorpo são mortas por células efectoras imunes. 0 IL-21 pode ser utilizado para aumentar a eficácia da terapia com anticorpo, em parte devido à sua actividade imunomodulatória. A terapia de combinação com rituximab e uma citoquina foi investigada utilizando IL-2, IL-12 ou IFN-α para o tratamento de linfoma de Hodgkin e não Hodgkin (Keilholz et ai., Leuk. Lymphoma 35: 641-2, 1999; Ansell et ai., Blood 99: 67-74, 2002; Carson et ai., Eur. J. Immunol. 31: 3016-25, 2001; e Sacchi et al., Haematologica 86: 951-8, 2001) .

Com base na aptidão de IL-21 para activar e diferenciar efectores de ADCC, em particular de células NK, foram realizados estudos in vitro e in vivo nos quais é combinado IL-21 com anticorpos e é avaliada a produção de citoquina, a citotoxicidade e a lise de células tumorais por células NK humanas, após exposição a IL-21 e ao anticorpo. Por exemplo, a lise de células tumorais pode ser avaliada utilizando células NK isoladas a partir de leucócitos de sangue periférico. Linhagens celulares de linfomas de células B humanas, tais como D0HH2, Raji ou Ramos, são carregadas com calceína-AM ou 51Cr, expostas a IL-21 durante 1 a 7 dias, sendo depois medida a lise celular mediada por células NK. Um outro ensaio mede a produção de citoquina. Tipicamente, em tais ensaios, células NK purificadas são expostas a IL-21 e mantidas em cultura in vitro com IgG aderido às placas. A presença de tais citoquinas, tais como INF-γ, TNF-α e IL-10, é medida. Uma descrição mais minuciosa destes tipos de ensaios pode ser encontrada na secção dos exemplos. São aqui descritos 29 estudos in vivo para a monitorização da sobrevivência de murganhos após um estimulo tumoral. Um outro objectivo para estes estudos in vivo pode compreender a perda de peso, a redução na massa de tumor ou a paralisia dos membros posteriores (HLP). Conforme mostrado mais minuciosamente na secção dos exemplos, os resultados destas experiências demonstraram que a actividade anti-tumor contra tumores de células B CD20+ B foi significativamente superior para a combinação de rituximab e IL-21 do que para o rituximab ou o IL-21 por si sós. Outras experiências em modelos animais suplementares, incluindo de primatas, proporcionam provas adicionais quanto ao aumento através de IL-21 da eficácia mediada por rituximab e constituem a base para os testes da combinação em pacientes com linfoma.

Os linfócitos, que compreendem as células B, as células T, as células NK e as células dendriticas e as suas progenitoras, possuem um ciclo de vida que implica a migração para e a partir de vários tecidos linfoides e não linfoides. Crê-se que todos os linfócitos amadureçam a partir de um progenitor linfoide multipotente localizado na medula-óssea. Os linfócitos naive circulam entre o sangue e os tecidos linfoides secundários até à morte das células ou até serem activados pelo antigénio. No caso dos linfócitos de células B ou T serem activados pelo antigénio, então as células activadas voltam para o sangue. Há evidências que sugerem que as quimioquinas desempenham um papel importante no tráfego de linfócitos. Crê-se que a expressão de quimioquinas especificas, tais como CXCR3, promove o tráfego de células B malignas de um local para outro, desempenhando um papel na migração de linfomas de células B para o sangue periférico, para os nódulos linfáticos, para 30 a medula-óssea e para outros órgãos (Trentin et al., J. of Clinicai Invest. 104: 115-121, 1999). O rituximab tem demonstrado conseguir efectuar a depleção de células B presentes no sangue periférico e nos nódulos linfáticos periféricos (Reff et al. Blood 83: 435-445, 1994), e a administração de um agente que dirija estas células CD20+ para estes tecidos iria proporcionar um mecanismo que fizesse com que estas células malignas anteriormente ficassem mais susceptíveis à morte mediada por rituximab. O IL-21 demonstrou possuir um efeito directo e indirecto sobre células B (Parrish-Novak et al., J. Leukoc. Biol. 72: 856-863, 2002; Mehta et al., J. Immunol 170: 4111-4118, 2003; Ozaki et al., J. Immunol. 173: 5361-5371, 2004) e sabe-se que afecta o processo de maturação em determinadas células imunes (Sivakumar et al., Immunol. 112: 177-182, 2004).

As experiências aqui descritas mostram as conclusões dos presentes inventores que a administração de IL-21 reduz inicialmente as células B, células T e células NK em circulação, seguindo-se um aumento e resolução prolongado antes no ciclo de dosagem seguinte. A inversão rápida de linfopenia e depleção de foliculos linfoides pode ser entendida como uma marginação transitória de linfócitos activados em combinação com um aumento na circulação a partir dos tecidos linfoides para o sangue. O aumento em células B periféricas foi mitigado quando se administrou IL-21 e rituximab, e foi observado um nadir em células B consistentemente inferior ao observado quando se administrou IL-21 ou rituximab por si sós. Assim, o IL-21 aumenta o potencial para a depleção de células B pelo rituximab, promovendo a recirculação de células B que são 31 susceptíveis a depleção. Além do mais, a administração de IL-21 proporcionou uma actividade de ADCC aumentada, com um número aumentado de células NK e de células fagociticas que expressam FcyRI e FcyRIII presentes durante a realização dos ensaios de ADCC.

Os neutrófilos demonstraram ser importantes para a actividade anti-tumor de rituximab em modelos de linfoma B xenogénico (Hernandez-Ilizaliturri Clin. Câncer Res. 9(16 Pt. 1): 5866-73, 2003). O papel dos granulócitos na actividade anti-tumor de mIL-21 + rituximab é demonstrado por depleção com um Mab anti-GR-1 MAb. Grupos de murganhos SCDI com depleção de granulócitos e sem depleção foram estimulados com células Raji e depois tratados com rituximab por si só ou com rituximab mais mIL-21, conforme descrito no exemplo 10. A depleção de granulócitos reduziu a sobrevivência de murganhos SCID tratados com rituximab por si só e com rituximab mais mIL-21. Comparando os grupos tratados com a terapia de combinação, a fracção de sobrevivência decorridos 125 dias foi reduzida de 0,67 para 0,0 para os animais com depleção de granulócitos. No entanto, a depleção de granulócitos não eliminou totalmente o beneficio de sobrevivência de IL-21 mais rituximab, uma vez que é evidente um atraso significativo no tempo médio de morte (TTD) versus o do grupo de controlo com veiculo.

Recentemente, os macrófagos demonstraram expressar os receptores de IL-21 (Pelletier et al. J. Immunol 173 (12): 7521-30, 2004) e desempenhar um papel na depleção de células B por Mab anti-CD20 (Uchida et al. J. Exp. Med. 199(12): 1659-69, 2004). Submeteu-se murganhos SCID a depleção de macrófagos utilizando clodronato de lipossomas e testou-se IL-21 mais rituximab no modelo de linfoma de 32

Raji disseminado. A depleção com clodronato de lipossomas eliminou 95% das células F4/80+ no fígado e 90% das células F4/80+ na polpa vermelha do baço. A depleção de macrófagos foi efectuada três dias após a injecção de células de RAJI e a depleção de macrófagos foi mantida pelo menos até 27 dias após a injecção de células tumorais por meio de injecções repetidas de clodronato de lipossoma. A depleção de macrófagos também reduziu a eficácia de mIL-21 mais rituximab. O TTD médio foi reduzido significativamente para os grupos tratados com clodronato de lipossoma. Além disso, observou-se uma queda dramática no tempo de sobrevivência médio para os murganhos SCID com depleção de macrófagos tratados com rituximab por si só em comparação com o grupo correspondente de murganhos sem depleção. A depleção de neutrófilos com anti-Gr-1 reduziu de um modo dramático a eficácia de rituximab por si só conforme registado por outros (Hernandez-Ilizaliturri, ibid. 2003) e as experiências mostraram que tal reduziu a fracção de murganhos sobreviventes após tratamento com IL-21 mais rituximab desde 0.67 até 0.0. O IL-21 pode actuar directamente sobre os neutrófilos de murganho, os quais, por sua vez, podem provocar a fagocitose de células tumorais, afectar a ADCC ou produzir intermediários de oxigénio citotóxicos. Mas a acção directa de IL-21 sobre os neutrófilos não é suportada por estudos sobre neutrófilos humanos (Pelletier, ibid.) em que não se detecta IL-21Ra e em que o IL-21 não modula as respostas de neutrófilos, incluindo a produção de superóxidos, a fagocitose, a quimiotaxia e a produção de citoquinas. Em vez disso, estes autores concluíram que o IL-21 induz a produção de IL-8 por meio de macrófagos humanos, o que pode proporcionar a 33 quimiotaxia e a activação de neutrófilos. No entanto, quando se realizaram experiências para suportar a presente invenção, a depleção de macrófagos utilizando clodronato de lipossomas apenas resultou numa perda parcial da actividade anti-tumor sinergistica apresentada por IL-21 e rituximab. Estes resultados sugerem que em murganhos SCID, os neutrófilos e os macrófagos desempenham um papel no prolongamento de sobrevivência com a terapia de combinação. Estudos recentes (Uchida et al., ibid.) da depleção de células B normais com MAb anti-CD20 também mostraram que os macrófagos de murganhos constituem as células efectoras principais necessárias e que as células NK não são essenciais; no entanto, os neutrófilos não foram investigados nesse estudo.

Estas conclusões demonstram que o IL-21 em combinação com rituximab possui uma actividade anti-tumor sinergistica em modelos de linfoma B xenogénico e que células efectoras imunes inatas auxiliam a mediação dos efeitos sinergisticos de IL-21 e rituximab. Estes resultados sugerem que, em murganhos SCID, os neutrófilos e macrófagos desempenham um papel no prolongamento da sobrevivência com a terapia de combinação. 0 IL-21 promove a actividade anti-tumor de rituximab sobre NHL e a acção de IL-21 sobre macrófagos, células NK, células T e nos próprios tumores de linfoma melhora a resposta à terapia com rituximab.

Assim sendo, a presente memória descritiva proporciona um método para o tratamento de paciente com linfoma que compreende a administração de IL-21 em combinação com rituximab a pacientes, para os quais a libertação de células malignas a partir de tecidos é necessária para a actividade anti-tumor mediada por rituximab. Além disso, os 34 regimes de dosagem que mantêm os níveis de IL-21 enquanto o rituximab está presente no sangue periférico do paciente serão vantajosos, estando incluídos na presente invenção. De acordo com determinadas variantes, a presente memória descritiva proporciona um método para o tratamento de linfoma num paciente que necessite de tal tratamento, o qual compreende a administração de IL-21 durante o período de tratamento para o qual o rituximab está presente no sangue periférico do paciente. De acordo com outras variantes, a presente memória descritiva proporciona um método para o tratamento de linfoma num paciente que necessite de tal tratamento, o qual compreende a administração de IL-21 um ou três vezes por semana durante a administração da terapia com rituximab. A classificação de linfomas não Hodgkin mais habitualmente utilizada é o sistema de classificação REAL (Ottensmeier, Chemico-Biological Interactions 135-136: 653-664, 2001). Foram identificados marcadores imunológicos específicos para a classificação de linfomas. Por exemplo, como marcadores de linfoma folicular refere-se CD20+, CD3-, CD10+, CD5-; como marcadores de linfoma linfocítico pequeno refere-se CD20+, CD3-, CD10-, CD5+, CD23+; como marcadores de linfomas de células B de zona marginal refere-se CD20+, CD3-, CD10-, CD23-; como marcadores de linfomas de células B largos difusos refere-se CD20+, CD3-; como marcadores de linfoma de células de cobertura refere-se CD20+, CD3-, CD10-, CD5+, CD23+; como marcadores de linfoma de células T periféricas refere-se CD20-, CD3+; como marcadores de células B largas do mediastino principal refere-se CD20+, CD3-, como marcados de linfoma linfoblástico refere-se CD20-, CD3+, Tdt+; e como marcadores de linfoma de Burkitt 35 refere-se CD20+, CD3-, CD10+, CD5- (Decision Resourses,

Non-Hodgkins Lymphoma, Waltham, MA., Feb. 2002). A classificação clinica de linfoma de não Hodgkin (NHL) pelo International Working Formulation divide a doença em subtipos: (1) doença de baixo grau (indolente) que inclui linfocitica pequena, consistente com leucemia linfocitica crónica (SC); folicular, predominantemente células clivadas pequenas (FSC); folicular, mistura de células pequenas e grandes clivadas (FM); (2) doença de grau intermédio que inclui folicular, predominantemente de células grandes (FL); difusa, células pequenas clivadas (DSC); difusa mista, células pequenas e grandes (DM); difusa, células grandes clivadas ou não clivadas (DL); e (3) doença de elevado grau que inclui immunoblástica, células grandes (IBL); linfoblástica, células convolutas e não convolutas (LL); e células pequenas não clivadas, de Burkitt ou não de Burkitt (SNC; (The Non-Hodgkin's Lymphoma Pathologic Classification Project, Câncer 49 (10): 2112-35, 1982). O sistema de Ann Arbor Staging é normalmente utilizado para distribuir por estados os pacientes com NHL. O estado I designa o envolvimento de uma região de nódulo linfático única ou o envolvimento localizado de um órgão ou local extralinfático individual. O estado II designa o envolvimento de duas ou mais regiões dos nódulos linfáticos no mesmo lado de um local ou órgão extranodular e uma ou várias regiões de nódulos linfáticos no mesmo lado do diafragma. O estado III designa o envolvimento de regiões dos nódulos linfáticos de ambos os lados do diafragma, possivelmente acompanhado pelo envolvimento localizado de um órgão ou local extranodular. O estado IV designa o envolvimento difuso ou disseminado de um ou vários órgãos 36 extranodulares distantes na presença ou na ausência do envolvimento associado de nódulos linfáticos ("Lymphoid neoplasms". Em: American Joint Committee on Câncer.: AJCC Câncer Staging Manual. 6a ed. New York, NY: Springer, 2002, págs. 393-406) . O rituximab demonstrou ser eficaz no tratamento de linfomas indolentes e foliculares (Boye et ai., Annals of Oncol. 14: 520-535, 2003). A actividade de IL-21 em combinação com anticorpos anti-CD20 sobre o crescimento e disseminação de células tumorais provenientes de malignidades hematológicas humanas pode ser medida in vivo. Foram desenvolvidos diversos modelos com murganhos em que células tumorais humanas são implantadas em murganhos imunodeficientes (colectivamente designados por modelos de xenoenxerto); ver, por exemplo, Cattan et al., Leuk. Res. 18: 513-22, 1994 e Flavell, Hematological Oncology 14: 67-82, 1996. As caracteristicas do modelo de doença variam com o tipo e com a quantidade de células administradas ao murganho, e são conhecidos na especialidade diversos modelos de animais. Por exemplo, linfomas de células B humanas (v.g., RL, Raji, TU2C) desenvolvidos e disseminados em murganhos SCID podem ser tratados com MAb e IL-21 para prolongar a sobrevivência, utilizando modelos conhecidos pelos especialistas na matéria. Para modelos exemplificativos, veja-se Funakoshi et al., J. Immunotherapy 19: 93-101, 1996; Funakoshi et al., Blood 83 : 2787-94, 1994; Cattan et al., Leukemia Res. 18: 513-522, 1994. Em alternativa, linhagens celulares de linfoma de células B de murganhos (A20, BCL, A31) podem ser implantadas e tratadas com MAb e IL-21 para prolongar a sobrevivência (French et al., Nat. Medicine 5: 548-553, 1999; Tutt et al. , J. Immunol. 161: 3176-3183, 1998). Num 37 modelo, células tumorais (v.g., células de Raji (ATCC No. CCL-86)) são mantidas em cultura e depois cerca de 1X106 células são injectadas por via intravenosa em diversos murganhos imunodeficientes graves combinados (SCID). Tais células tumorais proliferam rapidamente no animal e podem ser encontradas em circulação no sangue e em diversos sistemas de órgãos populosos. As terapias concebidas para matar ou para reduzir o crescimento de células tumorais utilizando IL-21 e MAb anti-CD20 são testadas por meio da administração de IL-21 e MAb aos murganhos que possuem as células tumorais. A eficácia do tratamento é determinada e avaliada em termos estatísticos como o aumento de sobrevivência na população tratada ao longo do tempo. A carga tumoral também pode ser monitorizada ao longo do tempo utilizando métodos bem conhecidos, tais como citometria de fluxo (ou PCR) para quantificar o número de células tumorais presentes numa amostra de sangue periférico.

Como modelos animais que podem ser utilizados para demonstrar a eficácia da terapia de combinação utilizando IL-21 e MAb anti-CD20 refere-se modelos não humanos de primatas de depleção de células B. por exemplo, por meio do tratamento de macacos Cynomolgus com veículo, 0,05 mg/kg ou 10,0 mg/kg de rituximab, foram identificadas diversas populações CD20, CD40 e CD21 de células B como sendo úteis para o estudo de terapêuticos anti-CD20 (Vugmeyster et al., Internat. Immunol. 3: 1477-1481, 2003). A terapia com rituximab para a doença indolente é normalmente constituída por quatro infusões uma vez por semana de 375 mg/m2. A taxa de infusão inicial é de 50 mg/horar e é aumentada progressivamente até um máximo de 38 40 0 mg/hora em incrementos de 50 mg a cada 3 0 minutos (McLaughlin et al., Clinicai Oncol. 16: 2825-2833, 1998). No entanto, o tratamento prolongado de oito semanas demonstrou alguma eficácia no tratamento de NHL de baixo grau ou folicular refractório ou de recaída (Piro et al., Ann. Oncol. 10: 619-621, 1999).

Para se estabelecer o nível de dose e o regime óptimo para a terapia de combinação com IL-21 e MAb anti-CD20 é necessário utilizar diversos meios, incluindo a farmacocinética e a farmacodinâmica da combinação, a sensibilidade das linhagens de linfoma de células B humanas e das espécies de linfomas primários para uma combinação de IL-21 e MAb anti-CD20 in vitro, as doses eficazes em modelos animais e a toxicidade da combinação. As medições farmacocinéticas directas podem ser realizadas em primatas. Além disso, o IL-21 e MAb anti-CD20 estimulam diversas respostas nos linfócitos normais, de modo que a eficácia clínica pode ser determinada em modelos animais normais. Além do mais, é possível utilizar marcadores de substituição para medir a actividade biológica da combinação de IL-21 e anti-CD20 MAb sobre células efectoras em pacientes. Como marcadores de substituição refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, diminuições significativas em populações de células B, aumento na população de células NK, activação de monócitos/macrófagos, aumento de FcRIII, aumento na citotoxicidade de células NK ou T em células CD20+ na presença do anticorpo anti-CD20. Os marcadores de substituição são importantes como indicadores da eficácia, visto que podem ser necessários meses a anos para se determinar as respostas terapêuticas tumorais, tais como um aumento na taxa de sobrevivência. 39 0 tratamento de linfoma, tal como NHL ou leucemia linfoblástica crónica (CLL), utilizando uma combinação de IL-21 e rituximab é demonstrado utilizando estudos clínicos, nos quais é investigada a segurança e a eficácia. Inicialmente, é demonstrada a segurança num estudo de fase I, o qual é um estudo aberto de doses que são aumentadas até se identificar uma dose máxima tolerada (MTD) ou uma dose imunológica óptima. Uma dose imunológica óptima é identificada como a dose de IL-21 ou de IL-21 em combinação com um anticorpo monoclonal que alcança a resposta imunológica óptima. Uma resposta imunológica óptima designa uma alteração na resposta imunológica após a administração de IL-21 ou da combinação de IL-21 + MAb em relação à observada no caso de se administrar MAb por si só, podendo ser determinada tal como aqui descrito.

Os participantes no estudo inicial de fase I são sujeitos com uma recaída de NHL CD20+ ou NHL CD20+ refractória. 0 aumento progressivo de dose é avaliado em grupos de 3 a 6 sujeitos num regime de aumento progressivo de dose padrão de 3 mais 3. Os grupos de 3 sujeitos são avaliados em termos de qualquer toxicidade limitadora de dose (DLT) que ocorra no final da quarta semana. Na ausência de DLT, ocorre o aumento progressivo de dose. No caso de se observar em 1 dos 3 sujeitos uma toxicidade limitadora de dose, então são inscritos 3 sujeitos suplementares nesse nível de dose. No caso de se observar que > 1 sujeitos num determinado grupos experimenta uma toxicidade limitadora de dose, então ocorre uma diminuição da dose e tratam-se 3 sujeitos com uma dose intermediária especificada por um Safety Monitoring Committee (SMC). A dose estará compreendida entre a dose que provocou a DLT e 40 no nível mais baixo seguinte de dose. No caso de 0 de 3 sujeitos apresentar uma DLT nessa dose intermediária, então a inscrição é interrompida e a dose intermediária é declarada como MTD. No caso de ^ 1 dos 3 sujeitos apresentar DLT para uma dose intermediária, então a inscrição é interrompida e o nível inferior seguinte de dose será declarado como MTD.

Administrou-se aos sujeitos rituximab, por via intravenosa (IV) a 375 mg/m2, uma vez por semana e administrou-se durante 4 ou durante oito semanas consecutivas. O IL-21 é administrado por injecção, administração por via IV, intramuscular (IM) ou subcutânea (SC) . Ao primeiro grupo é administrado pelo menos 1 pg/kg sendo depois as doses aumentadas progressivamente até à MTD ou até uma dose imunológica óptima, de um modo progressivo, por exemplo, aumentando desde 3-10, 10-100, 100-300, 300- 500, 500-900 e até 1000 pg/kg, uma a cinco vezes por semana. A presente memória descritiva proporciona composições de IL-21 em que cada dose está compreendida entre cerca de 1 pg/kg e 1000 pg/kg. De acordo com determinadas variantes, a dose de IL-21 está compreendida entre 10 e 300 pg/kg. A resposta tumoral é utilizada para avaliar a actividade clínica primária. Para se avaliar a resposta tumoral, determinam-se novas fases às semanas 4, 8 e 12, utilizando, por exemplo, o International Workshop to Standardize Response Criteria for Non-Hodgkin's Lymphomas (Cheson et al, J. Clin. Oncol. 17: 1244-1253, 1999). São utilizados marcadores farmacodinâmicos de IL-21 como indicadores secundários da actividade clínica. 41

Os eventos adversos e as avaliações laboratoriais de segurança padrão são utilizados para avaliar a segurança. A análise do soro quanto a anticorpos para IL-21 será realizada para avaliar a imunogenicidade. A toxicidade limitadora da dose é definida utilizando a Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) Versão 3, com data de 12 de Dezembro de 2003, como qualquer um dos seguintes eventos: • qualquer evento adverso de grau 4 ou 5, provável ou definitivamente associado ao agente em estudo; • eventos adversos de grau 3 não hematológicos, provável ou definitivamente associados ao agente em estudo com a EXCEPÇÃO dos associados a linfopenia com uma duração f 7 dias, vermelhidão tumoral, febre, mal-estar ou anormalidades laboratoriais de grau que não constituam um perigo de vida e que sejam clinicamente insignificantes. A eficácia e a segurança são ainda avaliadas em estudos clínicos de fase II e de fase III. Nestes estudos, podem ser caracterizadas as propriedades farmacocinéticas, farmacodinâmicas, farmacogenéticas, farmacogenómicas, imunogenicidade suplementares. Um primeiro objectivo é identificado de acordo com International Workshop to Standardize Response Criteria for Non-Hodgkin's Lymphomas (Cheson et al., ibid.), em conformidade com as linhas gerais regulatórias. Como objectivos secundários é possível referir a incidência e a gravidade de eventos adversos, o tempo até à progressão, o tempo de recaída para pacientes com respostas completas, a sobrevivência global e a incidência de qualquer desenvolvimento de anticorpo para IL-21. O estudo pode ser um estudo aleatório de dois ramos, no qual se efectua a comparação entre a monoterapia com 42 rituximab e rituximab combinado com IL-21 em pacientes que não toleram ou que optam por não receber quimioterapia. Os sujeitos irão receber rituximab, administrado por via IV a 375 mq/m2, uma vez por semana, durante quatro a oito semanas consecutivas. 0 IL-21 é administrado por via IV ou SC sob a forma de uma infusão sequencial no mesmo dia e até cinco dias consecutivamente, e as doses de IL-21 irão estar compreendidas entre 1-3, 3-10, 10-100, 100-300, 300-500, 500-900 e até 1000 pg/kg. Em alternativa, é possivel dar inicio a um estudo aleatório com três ramos para avaliar a segurança e a eficácia de IL-21 em combinação com rituximab vs. IL-21 por si só vs. rituximab por si só, utilizando critérios semelhantes para a concepção do ensaio. A concepção de um ensaio clinico é bem conhecida pelos especialistas na matéria, sendo as suas linhas gerais fornecidas pela Food and Drug Administration (FDA) , por exemplo, no sitio da FDA Oncology Tools. 0 DLT-21 e IL-15 ou IL-2 exibem efeitos sinérgicos sobre células NK in vitro no que diz respeito à citotoxicidade e proliferação da produção de IFN-γ (Parrish-Novak et al., J. Leuk. Biol. 72: 856-863, 2002). No entanto, a terapia com uma dose elevada de IL-2 é bastante tóxica e requer uma hospitalização extensiva. Foram já testados muitos regimes de doses reduzidas de IL-2 e concluiu-se que estas são melhor toleradas, embora apresentem poucas evidências de eficácia anti-tumor (Atkins, Semin. Oncol. 29 (3 Supl. 7): 12, 2002). A terapia de combinação de IL-2 e rituximab encontra-se descrita no documento WO 03/049694, no qual o IL-2 é administrado numa dose "de carga" superior, seguindo-se um ou vários doses inferiores de "manutenção". A necessidade de manter a 43 dosagem de IL-2 tem por base a manutenção de níveis de células NK superiores aos níveis normais, embora devido à toxicidade de IL-2, seja necessário um período de repouso no qual o IL-2 não é administrado. A administração da combinação de IL-2 e IL-21, para além de MAb anti-CD20, irá manter as células NK e permitir uma dosagem inferior ou menos frequente com IL-2. Determinados efeitos secundários observados para doses elevadas de IL-2 não foram observados durante a administração com IL-21. Por exemplo, no caso de se administrar IL-21 a murganhos na dose e no regime de IL-2 registados como provocando sindrome de fuga vascular em murganhos, a sindrome de fuga vascular não foi observada para este caso. Os resultados mostram claramente que o IL-21 não provoca a libertação de citoquinna e a vasculite associadas a uma dose com base numa massa equivalente de rIL-2 em murganhos (Heipel et ai., Blood 102 (11): N° 2845, 2003) . A combinação de uma dose reduzida de IL-2 com IL-21 e MAb anti-CD20 pode assim ser clinicamente útil, uma vez que aumenta a estimulação do sistema imune pela dose reduzida de IL-2 sem apresentar determinados efeitos secundários provocados por doses elevadas de IL-2. A administração de IL-21 em combinação com MAb anti-CD20, tais como rituximab, utilizando o método da presente memória descritiva irá proporcionar um efeito anti-tumor, também designado como uma resposta tumoral. As linhas gerais padrão para a avaliação da reposta a terapia para NHL são conhecidas pelos especialistas na matéria. Um conjunto exemplificativo de critérios uniformes encontra-se descrito por Cheson et al., J. of Clinicai Oncol. 17: 1244-1253, 1999. O International Working Group apresentou recomendações e definições para medições de respostas. No 44 quadro 2 sao apresentados resumidamente os critérios de resposta.

Quadro 2

Categoria da resposta Exame físico Nódulos linfáticos Massas nos nódulos linfáticos Medula óssea Resposta completa (CR) Normal Normal Normal Normal Resposta completa não confirmada (CRu) Normal Normal Normal Indeterminada Resposta parcial (PR) Normal Normal Normal Positiva PR Normal Diminuição >50% Diminuição >50% Irrelevante PR Diminuição no fígado/baço Diminuição >50% Diminuição >50% Irrelevante Recaída/ progressão Aumento no fígado/ baço; novos locais Novos ou aumentados Novos ou aumentados Reaparecimento

Também é possível utilizar marcadores de substituição para indicar uma actividade anti-tumor aumentada. Por exemplo, uma alteração nas enzimas no soro e uma biópsia podem mostrar uma diminuição na carga tumoral. 45

Uma medida da bioactividade que é possível utilizar como substituição para o efeito anti-tumoral é a manutenção dos níveis de células NK num nível que aumente o efeito anti-tumoral de um MAb anti-CD20 (Friedberg et al., Br. J. Hematol. 117: 828-834, 2002). Um outro marcador de substituição é o aumento do número de células T (Parrish-Novak et al., ibid. 2002). Em particular, o aumento do número de células para um subconjunto de células T tem sido correlacionado com o aumento de actividade citotóxica ou do efeito anti-tumoral. Uma outra medida da bioactividade que é possível utilizar como marcador de substituição é a depleção de células B (Reff et al., Blood 83: 435-445, 1994) . 2. Utilização de IL-21 e anticorpos monoclonais anti-Her-2/neu em terapia de combinação O produto génico Her-2/neu é uma fosfoglicoproteína de 185 kDa que está associada ao receptor do factor de crescimento epidérmico. O Her-2/neu actua como receptor de factor de crescimento e é muitas vezes expresso por tumores, tais como o cancro da mama, o cancro do ovário e o cancro do pulmão. O receptor de Her-2/neu é sobreexpresso em 25% a 30% dos cancros de mama humanos (Slamon et al. Science 235: 177-182, 1987; Slamon et al., Science 244: 707-712, 1989) e está associado a um prognóstico pobre nestes pacientes.

Existem diversos anticorpos monoclonais dirigidos a Her-2/neu, embora o HERCEPTIN®, nome comercial de trastuzumab (Genentech, Inc., San Francisco, CA) seja presentemente o único terapêutico aprovado para o tratamento de pacientes com cancro de Her-2/neu positivo. É 46 possível encontrar pequenas quantidades de Her-2/neu em muitos tipos de células normais e as células cancerígenas possuem uma expressão alterada que dá origem à sobreexpressão, um aumento da proliferação e diferenciação de células associado ao fenótipo das células cancerígenas. No entanto, o tratamento com sucesso com trastuzumab requer que a expressão de Her-2/neu seja bastante sobreexpressa. Os níveis de expressão de Her-2/neu podem ser determinados utilizando amostras de biópsia, as quais são fixas e manchadas imuno-histologicamente. Estes tipos de ensaios são bem conhecidos na especialidade e compreendem a avaliação imuno-histoquímica utilizando o anticorpo monoclonal 4D5 (LabCorp, Research Triangle Park, NC), HerceptTest® (DAKO, Glostrup, Denmark) e o estojo de sona de ADN HER-2 Vysis PathVysion™ (Fujisawa Healthcare, Inc., North Deerfield, IL) . De um modo geral, os níveis de Her-2/neu estão compreendidos entre 0 (normal) e 3+, tendo a terapia com trastuzumab mostrado ser eficaz em pacientes com níveis de expressão de 2+ ou superiores. 0 IL-21 demonstrou (v.g., exemplo 6) promover a actividade lítica em células T efectoras imunes e em células NK em modelos in vitro e in vivo com linhagens de células de cancro da mama humanas que expressem níveis elevados ou níveis reduzidos do receptor de Her-2/neu. A função efectora aumentada e mediada por IL-21 faz com que a terapia com trastuzumab seja eficaz mesmo no caso das células cancerígenas expressarem níveis reduzidos do receptor de Her-2/neu. Por exemplo, pacientes com níveis de sobreexpressão de 1+ ou 2+ tratados com IL-21 e com trastuzumab serão candidatos a tratamento, proporcionando uma terapia valiosa para populações de pacientes 47 previamente não tratadas. É possível utilizar murganhos que suportem carcinomas de murino que expressem Her-2/neu para testar IL-21 em combinação com MAb anti-Her-2/neu (Penichet, et ai., Lab Anim. Sei. 49: 179-188, 1999).

Embora cada protocolo possa definir avaliações diferentes da resposta tumoral, é possível encontrar linhas gerais exemplificativas em Clinicai Research Associates Manual, Southwest Oncology Group, CRAB, Seattle, WA, 6 de Outubro de 1998, actualizada em Agosto de 1999. De acordo com o manual CRA (ver, capitulo 7 "Response Accessment"), a resposta tumoral designa uma redução ou eliminação de todas as lesões ou metástases mensuráveis. De um modo geral, a doença é considerada mensurável caso compreenda lesões bidimensionalmente mensuráveis com contornos claramente definidos por meio de fotografias médicas ou raios-X, tomografia axial computorizada (TAC), imagiologia por ressonância magnética (IRM) ou por apalpação. As medições avaliáveis da doença designam que a doença compreende lesões unidimensionalmente mensuráveis, massas com margens não definidas claramente, lesões com diâmetros inferiores a 0,5 cm, lesões no varrimento com um diâmetro menor que a distância entre cortes, lesões palpáveis com um diâmetro inferior a 2 cm ou doenças ósseas. Com doenças não avaliáveis refere-se efusões pleurais, ascites e doenças documentadas por provas indirectas. As lesões previamente submetidas a radiação que não progrediram também são normalmente consideradas não avaliáveis.

Os critérios para o estado dos objectivos são necessários para avaliar a resposta de tumores sólidos. Como critério representativo compreende refere-se os seguintes: (1) resposta completa (CR), definida como um 48 desaparecimento completo de toda a doença mensurável e avaliável; sem novas lesões; sem sintomas associados à doença; sem evidências de doença não avaliável; (2) resposta parcial (PR), definida como superior ou igual a uma diminuição de 50% a partir da linha de base na soma dos produtos dos diâmetros perpendiculares de todas as lesões mensuráveis; sem progressão da doença avaliável; sem novas lesões; aplica-se a pacientes pelo menos com uma lesão mensurável; (3) progressão, definida como 50% ou um aumento de 10 cm2 na soma dos produtos das lesões mensuráveis ao longo da soma mais pequena observada utilizando as mesmas técnicas que utilizadas para a linha de base ou um deterioramento evidente de qualquer doença avaliável ou o re-aparecimento de qualquer lesão que tinha desaparecido ou incapacidade de comparência para avaliação devido a morte ou uma deterioração do estado geral (salvo quando não associado a este cancro); (4) estável ou sem resposta, definido como não qualificável para CR, PR ou progressão. (Ver, Clinicai Research Associates Manual, supra). A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1 IL-21 aumenta a actividade de células NK dependentes de anticorpo 49

Obteve-se sangue periférico e preparou-se células mononucleares (MNC) por centrifugação em ficoll. Purificou-se células assassinas naturais (NK) a partir da população de MNC por enriquecimento negativo, utilizando o estojo de enriquecimento negativo de células NK humanas StemSep™, 'Human NK Cell Stem Cell Technologies' (Vancouver, British Columbia). Resumidamente, marcou-se as MNC com anticorpos específicos da linhagem (excluindo a linhagem NK) e foram, à vez, marcadas magneticamente. Fez-se passar as MNC marcadas por uma coluna magnética, onde as células marcadas foram retidas e se deixou passar as células NK não marcadas.

Colocou-se em placas as células NK numa densidade de 5xl05 células/mL e manteve-se em cultura durante 3 dias em oí-MEM/10% de soro autólogo /β-mercaptoetanol 50 μΜ, com 0, 1, 10 ou 100 ng/mL de hIL-21 (A794F) ou 10 ng/mL de IL-12 (controlo positivo), todas elas na presença ou na ausência de estimulação com Fc. Proporcionou-se a estimulação com Fc colocando em placas 100 pg/mL de hlgG em PBS sobre plástico a 37°C durante 1 hora, depois removeu-se a solução de PBS/anticorpo e manteve-se em cultura as células NK sobre essa superfície. Após um período de cultura de 3 dias, recolheu-se os sobrenadantes. Quantificou-se o IFN-γ nos sobrenadantes utilizando o estojo ELISA de IFN-γ humana yBD OptEIA' (BD Biosciences, San Jose, CA). Os resultados foram registados sob a forma de um gráfico de barras, expressando ng/mL de IFN-γ por amostra.

Na presença de estimulação com Fc, o IL-21 provocou um aumento, dependente da dose, na produção de IFN-γ. Para a dose máxima de IL-21 testada nesta experiência (100 ng/mL), observou-se um aumento aproximado de 18 vezes com 50 comparação com o ensaio de fundo. Na ausência de estimulação com Fc, não se observou um aumento na produção de IFN—γ na presença de IL-21. B.

Obteve-se leucócitos de sangue periférico por leucoferese a partir de um programa de dadores. Preparou-se as células mononucleares (MNC) a partir de sangue submetido a aférese por centrifugação com ficoll. Purificou-se as células assassinas naturais (NK) a partir da população de MNC por enriquecimento negativo, utilizando o estojo de enriquecimento negativo de células NK humanas de Stem Cell Technologies. Resumidamente, marcou-se as MNC com anticorpos específicos de linhagem (excluindo a linhagem de NK) e depois marcou-se magneticamente, à vez. Fez-se então passar as MNC marcadas através de uma coluna magnética, onde as células marcadas foram retidas e as células NK não marcadas foram deixadas passar.

Colocou-se as células NK em placas com uma densidade de lxl06/mL e manteve-se em cultura durante 1, 2, 3, 4, 6 ou 7 dias em oí-MEM/10% de soro AB humano termicamente inactivado/beta-mercaptoetanol 50 μΜ/ITS (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, CA)/suplemento de transferina 150 pg/mL/ /BSA 5 mg/mL, na presença ou na ausência de 0,2, 1, 5, 25, ou 100 ng/mL de IL-21 humano. No final de cada período de cultura, colheu-se as células NK, lavou-se, contou-se e submeteu-se a um ensaio citolítico de citoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), utilizando uma linhagem celular de linfoma (Ramos, CRL 1596, American Type Culture Collection, Manassas, VA), como alvo citolítico. Antes do ensaio, marcou-se as células alvo por incubação durante 60 51 minutos a 37°C numa solução de soluto salino tamponada com solução de Hank (na ausência de Ca ou Mg) com 5% de FBS (HBSSF) e calceína AM 10 μΜ (Molecular Probes, n° de cat. C1430). As células alvo absorvem o pigmento fluorescente (calceína AM) e convertem-no citoplasmicamente no fluorocrómo activo, o qual é apenas libertado a partir da célula durante a lise. As células lisadas libertam o fluorocrómo no sobrenadante, o qual é então recolhido, sendo a quantidade de fluorescência quantificada num fluorómetro. A percentagem de lise celular foi calculada a partir da quantidade de fluorescência presente no sobrenadante, após a incubação durante 3 horas na presença ou na ausência de diversas quantidades de células NK (efectoras). Para o ensaio de ADCC, utilizou-se alvos sem a adição de anticorpo, IgG irrelevante a 1 pg/mL ou rituximab a 1 pg/mL.

Testou-se dois dadores. Manteve-se em cultura células NK do dador A em 0, 1, 5, 25 ou 100 ng/mL de IL-21 humano, com medições nos dias 1, 2, 3, 4 e 7. Manteve-se em cultura células NK do dador B em 0, 0,2, 1, 5 ou 25 ng/mL de IL-21 humano, com medições nos dias 1, 2, 3, 4, 6 e 7. Para ambos os dadores observou-se um aumento (3 a 10 vezes) na actividade citolítica contra células alvo na presença de, quando comparadas com o controlo com IgG irrelevante. Tal aumento na actividade citolítica foi ainda mais aumentado (2 a 10 vezes) no caso das células NK serem mantidas em cultura na presença de IL-21 antes do ensaio.

As culturas do dador A não apresentaram diferenças significativas no aumento de ADCC ao longo das doses testadas de IL-21 (1, 5, 25 ou 100 ng/mL), com a excepção do dia 7, em que a cultura de NK com 1 ng/mL de IL-21 52 apresentou um aumento de actividade de ADCC significativamente inferior em comparação com as outras doses. As culturas do dador B não apresentaram diferenças significativas no aumento de ADCC ao longo das doses testadas de IL-21 (0,2, 1, 5 ou 25 ng/mL) até ao dia 4 (mantendo-se ao longo do tempo restante), em que as culturas que continham 0,2 ng/mL de IL-21 apresentaram um aumento de actividade ADCC significativamente inferior em comparação com as outras doses testadas de IL-21. Ambos os dadores apresentaram um aumento de ADCC de IL-21 para todos os instantes testados, sendo o maior aumento respeitante ao aparente IgG irrelevante nos dias 6 ou 7. C.

Obteve-se sangue periférico a partir de um programa de dadores conforme descrito no exemplo IA. Colocou-se em placas células NK a uma densidade de 8,1-11 x 105 /mL e manteve-se em cultura durante 3 dias em a-MEM/10% de soro autólogo/ beta-mercaptoetanol 50 μΜ, na presença ou na ausência de 20 ng/mL de IL-21 humano. No final de cada período de cultura, colheu-se as células NK, lavou-se, contou-se e submeteu-se a um ensaio citolítico de citoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), utilizando a linhagem celular de linfoma DOHH2 (Kluin-Nelemans, H.C. et al. Leukemia 5: 221-224, 1991; Drexler, H.G. et al., DSMZ Catalogue of Cell Lines, 7a ed., Braunschweig, Germany, 1999) como alvo citolítico. Antes do ensaio, marcou-se as células DOHH2 por incubação durante 30 minutos numa solução de soluto salino tamponada com solução de Hank com 5% de FBS (HBSSF) , com calceína AM 25 μΜ (Molecular Probes) . Os alvos absorvem o pigmento 53 fluorescente (calceína AM) e convertem-no citoplasmicamente no fluorocrómo activo, o qual é apenas libertado durante a lise. As células lisadas libertam o fluorocrómo para o sobrenadante, o qual é então colhido e a quantidade de fluorescência é quantificada num fluorómetro. Calculou-se a percentagem (%) de lise celular a partir da quantidade de fluorescência presente no sobrenadante, após incubação durante 3 horas na presença ou na ausência de diversas quantidades de células NK (efectoras) . Para o ensaio de ADCC, utilizou-se alvos na ausência de adição de anticorpo, 2 Dg/mL de IgG irrelevante ou 0,002, 0,02, 0,2 ou 2 ypg/mL de rituximab.

Os resultados foram gerados a partir de dois dadores, sendo expressos como a proporção entre efector:alvo (E:T) vs. percentagem de lise. Para ambos os dadores, observou-se um aumento evidente (6 a 11 vezes para E:T = 3) na actividade citolitica contra as células DOHH2 na presença de 2 yg/mL de rituximab, em comparação com a ausência de adição de anticorpo ou com o controlo de IgG irrelevante. O aumento com rituximab foi idêntico a 2 yg/mL e 0,2 yg/mL, começou a cair para a E:T mais elevada testada (4 ou 6) a 0,02 yg/mL, e foi claramente inferior para todas as E:T testadas a 0,002 yg/mL. O aumento na actividade citolitica dependente de rituximab aumentou para todas as doses testadas de rituximab (1,5 a 3 vezes em comparação com a actividade aumentada com rituximab para um E:T = 3) no caso das células NK serem mantidas em cultura durante 3 dias na presença de IL-21, antes do ensaio citolitico.

Exemplo 2 54 IL-21 aumenta a expressão de granzima B em células NK humanas

Isolou-se células NK humanas a partir de células mononucleares purificadas com Ficoll-Paque por selecção negativa, utilizando um estojo de separação de esferas magnético (Miltenyi Biotech, CA). Manteve-se então em cultura células NK purificadas durante 48 horas em meio por si só ou em 20 ng/mL de IL-21 humano. Colheu-se as células, lavou-se e depois manchou-se com marcadores de superfície. Após a coloração dos marcadores de superfície, lavou-se as células e depois permeabilizou-se com tampão Cytofix/ /Cytoperm™ (BD Biosciences, San Jose, CA) durante 20 minutos. Manchou-se então as células com uma granzima B anti-humana marcada com APC ou com anticorpos de controlo de isotipo (Caltag, Burlingame, CA) em tampão 'Perm/Wash'. Lavou-se as células e depois efectuou-se a leitura num citómetro de fluxo FACSCalibur™. Analisou-se os dados utilizando a aplicação informática Cellquest™ (BD Biosciences). A figura 1 mostra que a incubação de NK humanas na presença de IL-21 provoca um grande aumento na expressão de granzima B, que é um mediador importante da morte com células NK. Tal sugere que por meio do aumento de granzima B, o IL-21 aumenta a aptidão das células NK para matar as suas células alvo.

Exemplo 3 55 IL-21 + rituximab aumenta a sobrevivência de murganhos

injectados com células de linfomas Sultan HS

Foi efectuado um estudo para avaliar se o crescimento tumoral era retardado em murganhos SCID CB-17 injectados com células Sultan HS tratadas com rituximab, com IL-21 de murganho (mIL-21) ou com uma combinação de mIL-21 e rituximab. 0 estudo foi concebido para caracterizar a sobrevivência de murganhos portadores de Sultan-HS em diversos grupos de tratamento.

Os protocolos foram semelhantes aos conhecidos na especialidade (ver, Cattan et al. Leuk Res. 18 (7) : 513- 522, 1994; Ozaki et al, Blood 90 (8) : 3179-86, 1997) . Aos murganhos SCID CD17 foi administrado 20 pg de rituximab (com doses a cada quatro dias num total de 5 injecções) , 100 pg de mIL-21 (com doses durante cinco dias) ou uma combinação de rituximab e mIL-21 por meio de injecções IP (doseados cinco vezes para cada tratamento).

Monitorizou-se os murganhos quanto a estados moribundos e de não sobrevivência, tais como paralisia ou perda de peso rápida. Mediu-se os pesos corporais duas vezes por semana durante o decurso do estudo. Registou-se o tempo de sobrevivência para todos os murganhos e comparou-se entre os grupos de tratamento por meio da representação das curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier, processando por computador as estatísticas de classificação log (Statview, SAS Institute, Cary, NC).

Foram utilizados os grupos seguintes: grupo 1 (n=10), 20 pg de rituximab a cada 4 dias num total de 5 injecções, com início no dia 1; 56 grupo 2 (n=10), 20 pg de rituximab a cada 4 dias num total de 5 injecções, com início no dia 3; grupo 3 (n=10), 20 pg de rituximab a cada 4 dias num total de 5 injecções, com início no dia 6; grupo 4 (n=10), veículo de controlo (PBS), administração IP, dias 1-5; grupo 5 (n=10), 100 pg de mIL-21 por via IP, diariamente durante 5 dias, com início no dia 1; grupo 6 (n=10), 100 pg de mIL-21 durante 5 dias com início no dia 1 + 20 pg de rituximab a cada 4 dias num total de 5 injecções, com início no dia 3.

Dividiu-se em seis grupos os murganhos (fêmeas, C.B-17 SCID, 9 semanas de idade; Harlan, Madison, WI) . No dia 0, colheu-se células Sultan-HS (n° ATCC CRL-1484) a partir da cultura e injectou-se intravenosamente, por meio da veia caudal, a todos os murganhos (1000000 células por murganho). Tratou-se então os murganhos com rituximab, com mIL-21 ou com uma combinação dos dois agentes, utilizando as doses e os regimes descritos nas descrições dos grupos de tratamento anteriores. Todos os tratamentos foram administrados por via de injecção intraperitoneal num volume de 0,1 mL.

Nos grupos de murganhos tratados com rituximab, observou-se um aumento significativo em termos de sobrevivência quando a dosagem teve início no dia 1 ou no dia 3, mas não no dia 6. O IL-21 de murino por si só não proporcionou qualquer aumento em termos de sobrevivência para os murganhos portadores de tumor. Os murganhos tratados com uma combinação de mIL-21 (100 ug/dia, dias 1-5) e rituximab (20 ug/dia, dias 3, 7, 11, 15, 19) apresentaram uma aumento bastante significativo em termos 57 de sobrevivência (P < 0, 0001 em comparação com o controlo com veiculo, P < 0,02 em comparação com rituximab com inicio no dia 3; teste de classificação log). No dia 120 do estudo, a sobrevivência cumulativa no grupo tratado com mIL-21 + rituximab era de 70%, em comparação com 20% no grupo tratado apenas com rituximab.

Exemplo 4 IL-21 + rituximab aumento na sobrevivência de murganhos injectados com células tumorais Raji

Foi efectuado um estudo para avaliar se o crescimento tumoral era retardado em murganhos SCID CD-17 com células Raji tratados com rituximab, com mIL-21 ou com uma combinação de mIL-21 e rituximab. O estudo foi concebido para caracterizar a sobrevivência de murganhos portadores de Raji em diversos grupos de tratamento. O protocolo encontra-se descrito no exemplo 3.

Foram utilizados os grupos seguintes: grupo 1 (n=8), controlo de veículo, PBS por via IP, dias 3-7; grupo 2 (n=8), 100 pg de mIL-21 por via IP, diariamente durante 5 dias com início no dia 1; grupo 3 (n=8), 100 pg de mIL-21, durante 5 dias com início no dia 3; grupo 4 (n=9), 20 pg de rituximab rituximab a cada 4 dias num total de 5 injecções, com início no dia 3; grupo 5 (n=9), 20 pg de rituximab rituximab a cada 4 dias num total de 5 injecções, com início no dia 5; grupo 6 (n=9), 100 pg de mIL-21 por via IP, diariamente durante 5 dias, com início no dia 1 + 20 pg de 58 rituximab a cada 4 dias num total de 5 injecções, com início no dia 3; grupo 7 (n=9), 100 pg de mIL-21 por via IP, diariamente durante 5 dias, com início no dia 3 + 20 pg de rituximab a cada 4 dias num total de 5 injecções, com início no dia 5.

Dividiu-se em sete grupos murganhos (fêmeas, C.B-17 SCID, 9 semanas de idade; Harlan, Madison, WI) . No dia 0, colheu-se células de Raji (n° ATCC CCL-86) a partir de cultura e injectou-se por via intravenosa, na veia caudal, a todos os murganhos (1000000 células por murganho). Tratou-se então os murganhos com rituximab, com mIL-21 ou com uma combinação dos dois agentes, utilizando as doses e os regimes descritos nas descrições dos grupos de tratamento anteriores. Todos os tratamentos foram administrados por via de injecção intraperitoneal num volume de 0,1 mL.

Nos grupos de murganhos tratados com rituximab, observou-se um aumento significativo em termos de sobrevivência quando a dosagem teve início no dia 3 ou no dia 5. A administração de IL-21 de murino por si só não proporcionou qualquer benefício em termos de sobrevivência para os murganhos portadores de tumor. Os murganhos tratados com uma combinação de mIL-21 (100 ug/dia, dias 3-7) e rituximab (20 ug/dia, dias 5, 9, 13, 17, 21) apresentaram um aumento significativamente superior em termos de sobrevivência (P < 0,0001 em comparação com o controlo de veículo, P < 0,03 em comparação com rituximab com início no dia 5; teste de classificação log) . No dia 100 do estudo, a sobrevivência cumulativa no grupo tratado 59 com mIL-21 + rituximab era de 55%, em comparação com 10% no grupo tratado apenas com rituximab.

Exemplo 5

Estudos de IL-21 + rituximab em primatas não humanos

Efectuou-se a co-administração de rituximab e rIL-21 por via intravenosa a grupos constituidos por três macacos cynomolgus machos, durante três periodos de dosagens constituidos por uma semana por período de dose. Deixou-se uma semana sem dosagem entre a segunda e a terceira semana de dosagem. Administrou-se o rituximab no primeiro dia de cada período de dosagem e administrou-se o rIL-21 durante três dias com início no primeiro da de cada período de dosagem. As excepções em termos de dosagem foram o grupo de controlo, administração com artigo de controlo, 0,9% de cloreto de sódio, o grupo 3, administração apenas com rituximab, e o grupo 2 ao qual se administrou apenas rlL-21. Ao grupo 5 administrou-se rIL-21 apenas no primeiro dia de cada período de dosagem, no entanto a dose semanal total foi equivalente à de outros grupos aos quais se administrou rIL-21. Ao grupo 7 administrou-se rIL-21 por via subcutânea em vez da via intravenosa. Ao grupo 4 não foi administrada uma dose durante o terceiro período de dosagem; a última dose foi administrada no dia 10. A última dose para todos os outros grupos foi no dia 24. A administração aos animais foi efectuada por injecção por via intravenosa na veia cefálica, safena ou outra veia adequada; por via subcutânea na área intra-escapular ou noutro local adequado. 60

Quadro 3

Regime do estudo e grupos Grupo Tratamento Via Níveis de Concentração Volume de Dias de dose dose (mg/kg) (mg/mL) doseb (mL/kg) 1 Artigo de IV 0,0 0, 0 3,0 1, 8, 22 2, 3, 9, controlo 0,5 10, 23, 24 2 rIL-21 IV 0,5 1,0 0,5 1-3, 8-10, 22-24 Artigo de 0,0 0,0 2,5 1, 8, 22 controlo 3 Rituxan c IV 0,0 0,0 0,5 1-3, 8-10, 22-24 Artigo de 0,05 0,1 0,5 1, 8, 22 controlo 4 rIL-21 IV 0,5 1,0 0,5 1-3, 8-10 1, 8 Rituxan IV 12 4,0 2,5 5 rIL-21 IV 1,5 3,0 0,5 1, 8, 22 2, 3, 9, Artigo de IV 0 0,0 0,5 10, 23, 24 1, 8, controlo IV 0,05 0,1 0,5 22 Rituxan c 6 rIL-21 IV 0,5 1,0 0,5 1-3, 8-10, 22-24 Rituxan c IV 0,05 0,1 0,5 1, 8, 22 7 rIL-21 SC 0,5 3, 0 0,17 1-3, 8-10, 22-24 Rituxan c IV 0,05 0, 1 0, 5 1, 8, 22 a Nos grupos com co-administração de rIL- 21 e Rituxan, s Rituxan foi administrado antes de rIL- 21. b 0 volume de dosagem individual para o animal (ml) foi calculado com base no peso corporal mais recente. Os volumes de dose foram ajustados para o incremento legível seguinte da seringa. ° A dose de Rituxan foi seguida por uma limpeza com soluto salino de 3,0 ml/kg.

Analisou-se subconjuntos de células de sangue periférico utilizando citometria de fluxo. Colocou-se cerca de 1,3 mL do sangue recolhido num tubo tratado com EDTA-2K, uma vez durante a aclimatização no dia -8, antes da dosagem e seis horas após a dosagem nos dias 1, 8 e 22. As amostras pré-dose foram recolhidas nos dias 3, 10 e 24. As amostras foram recolhidas uma vez nos dias 7, 14, 17 e 42. Colocou-se em aliquotas cerca de 0,5 mL de amostra para análise 61 hematológica e manteve-se a amostra restante à temperatura ambiente até à realização da citometria de fluxo.

Recolheu-se cerca de 2,0 mL de sangue total para tubos que continham heparina de litio, durante a aclimatização nos dias -8 e -4. Recolheu-se também antes da dosagem nos dias 3, 10, 22 e 24, e uma vez nos dias 7 e 14. Armazenou- se as amostras à temperatura ambiente até processamento por meio de análise por citometria de fluxo e ensaios de actividade ADCC.

Quadro 4

Marcadores de anticjénio Tipo de células identificado CD45/CD20/CD21/CD40 Células B CD45+/CD2CT/CD21 + Células B CD45+/CD20+/CD21" Células B CD45+/CD20+/CD21+ Células B CD45+/CD20elevâdo Células B CD45+/CD20elevado/CD21VCD4CT Células B CD45 + /CD20elevâdo/CD21"/CD40 + Células B CD45+/CD20elevâdo/CD21 + /CD40 + Células B CD45+/CD20reduzido Células B CD45+/CD20reduzido/CD20lowCD40 + Células B CD45+/CD20reduzido/CD21 + /CD40 + CD45/CD14/CD16/CD64 Células assassinas naturais CD45+/CD14"/CD16+ CD45+/CD14+/CD16" Monócitos CD45+/CD14+/CD16+ Monócitos CD45+/CD14+/CD64" Monócitos CD45+/CD14+/CD64+ Monócitos CD45+/CD64" Granulócitos CD45+/CD64+ Granulócitos 62

Marcadores de antigénio Tipo de células identificado CD45/CD3/CD8/CDllb + 11c Células T auxiliadoras CD45+/CD3+/CD8“ Células T citotóxicas CD45+/CD3+/CD8+ Células NK CD45 + /CD3VCD8 + Células NK CD45 + /CD14VCD16 + Todas as células CD45+/CDllb + llcturvo Todas as células CD45+/CDllb + llcbrllhante Todas as células CD45+/CD3"/CDllb + llcturvo Todas as células CD45+/CD3"/CDllb + nc^iihante Todas as células CD45+/CD3"/CDllb + llcneg 0 tratamento com IL-21 apresentou efeitos notórios sobre o fenótipo e sobre o número de leucócitos em circulação. Momentos após o tratamento com IL-21, observou-se uma diminuição em todas as populações de linfócitos. As células B recuperaram mais rapidamente do que as células T e do que as células NK. As células T regressaram até aos niveis base 4 a 6 dias após a dosagem e as células auxiliadoras T estavam ligeiramente elevadas 4 a 6 dias após o segundo ciclo de tratamento com IL-21. As células NK diminuíram para todos os grupos, apenas com uma recuperação parcial entre os ciclos de dosagem. 0 número de monócitos em circulação aumentou após o tratamento com IL-21, e tanto os monócitos como os granulócitos aumentaram a expressão do receptor de Fc. A. Efeitos dos linfócitos

As doses substituinte-clínicas de rituximab reduziram o número de células B em circulação até um nadir de 70% inferior à linha de base 6 horas após a dosagem. O tratamento com rIL-21 por si só reduziu inicialmente as células B, células T e células NK em circulação, seguindo-se um aumento controlado e resolução antes no ciclo de 63 dosagem seguinte. Com base na inversão rápida de linfopenia e observações prévias da depleção de foliculos linfoides com rIL-21, interpretou-se este efeito como marginação temporária de linfócitos activados em combinação com uma circulação aumentada a partir de tecidos linfoides para o sangue. 0 aumento em células B periféricas foi claramente mitigado nos animais tratados com rIL-21 e com rituximab, observando-se uma diminuição nadir consistentemente inferior de células B relativamente aos grupos tratados com rituximab ou com rIL-21 por si sós. As alterações noutros subconjuntos de linfócitos induzidas por rIL-21 não foram alteradas pelo tratamento com rituximab.

Quadro 5 Células B CD20 reduzido no sangue periférico (contagens por ul) Tratamento Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia -8 1 1,25 3 7 8 8,25 10 Controlo 918 605 1183 855 620 791 1285 965 Controlo 1545 980 1464 1416 1035 934 1999 1233 Controlo 1044 876 1648 1182 1179 807 1827 1145 IL-21 0,5 mg/kg 677 650 461 598 1043 731 292 1241 IL-21 0,5 mg/kg 3159 2254 1684 3418 9268 4208 2136 9414 IL-21 0,5 mg/kg 1310 1107 858 1486 4748 2378 1176 5343 Ritux 0,05 mg/kg 549 599 369 449 441 325 227 305 Ritux 0,05 mg/kg 2150 1892 657 1459 1993 1872 648 1580 Ritux 0,05 mg/kg 1430 1103 879 936 920 893 407 617 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 687 407 36 9 4 3 2 0 mg/kg IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 1214 1116 69 5 1 1 1 2 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 2072 1846 157 17 2 4 3 0 64 Células B CD20 reduzido no sangue periférico (contagens por ul) Tratamento Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia -8 1 1,25 3 7 8 8,25 10 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 597 603 283 356 1578 1386 14 511 IL-21 0,5 mg/kg + 897 782 331 1375 1622 1247 49 1393 Ritux mg/kg IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 729 134 565 1560 1779 9 533

Quadro 5 (cont.) Células B CD20 reduzido no sangue periférico (contagens por ul) Tratamento Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia 14 17 22 22,25 24 29 32 37 42 Controlo 805 863 1145 1240 838 777 815 882 739 Controlo 1050 1099 1027 1507 1235 1151 1202 947 909 Controlo 1275 1046 888 1732 1161 897 1053 1205 944 IL-21 0,5 mg/kg 871 835 507 231 307 717 553 380 426 IL-21 0,5 mg/kg 8355 5929 3887 1235 4702 7469 3657 3214 4338 IL-21 0,5 mg/kg 6210 4139 1970 769 1562 4227 3122 2298 2292 Ritux 0,05 mg/kg 331 397 390 669 394 634 381 534 419 Ritux 0,05 mg/kg 1830 1810 1965 1572 1757 2133 1949 1820 1446 Ritux 0,05 mg/kg 648 861 1015 1127 834 1160 1103 818 657 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 2 2 2 2 1 7 15 2 5 mg/kg IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 1 6 12 3 3 9 59 102 182 65 Células B CD20 reduzido no sangue periférico (contagens por ul) Tratamento Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia 14 17 22 22,25 24 29 32 37 42 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 0 3 12 12 12 110 192 564 707 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 6 46 488 512 169 222 699 564 546 540 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux mg/kg 944 661 540 148 726 468 354 798 706 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 780 745 669 148 812 1119 845 902 928

Quadro 6 Células B CD20 elevado no sangue periférico (contagens por ul) Tratamento Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia -8 1 1,25 3 7 8 8,25 10 Controlo 509 408 493 447 491 607 440 425 Controlo 2243 1808 1705 1764 1938 2594 1624 1482 Controlo 1414 1245 1384 1190 1438 1248 1225 1173 IL-21 0,5 mg/kg 949 701 576 452 581 584 242 396 IL-21 0,5 mg/kg 1945 1784 932 488 1790 1014 773 1582 IL-21 0,5 mg/kg 448 418 262 164 681 399 592 779 Ritux 0,05 mg/kg 541 500 0 4 57 57 0 3 Ritux 0,05 mg/kg 810 721 2 11 89 101 8 24 Ritux 0,05 mg/kg 2144 1579 0 18 170 141 1 16 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 618 518 0 0 0 0 0 0 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 954 882 0 0 0 0 0 0 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 1538 1333 0 0 0 0 0 0 66 Células B CD20 elevado no sangue periférico (contagens por ul) Tratamento Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia -8 1 1,25 3 7 8 8,25 10 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 1295 1240 0 10 111 339 0 7 IL-21 0,5 mg/kg + 778 764 9 39 55 71 0 6 Ritux 0,05 mg/kg IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 163 0 7 24 99 0 5

Quadro 6 (cont.) Células B CD20 elevado no sangue periférico (contagens por ul) Tratamento Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia 14 17 22 22,25 24 29 32 37 42 Controlo 386 393 594 423 430 387 4961 523 392 Controlo 1510 1529 1662 1578 1461 1542 1645 1626 1522 Controlo 1277 1183 1134 1418 1238 1080 1334 1147 952 IL-21 0,5 mg/kg 391 518 412 209 226 470 592 354 442 IL-21 0,5 mg/kg 2542 2886 2241 819 1468 1897 1956 996 2104 IL-21 0,5 mg/kg 1370 909 562 181 499 701 750 338 386 Ritux 0,05 mg/kg 67 78 160 224 147 97 304 299 152 Ritux 0,05 mg/kg 95 44 49 25 145 9 96 31 49 Ritux 0,05 mg/kg 79 68 88 380 265 32 167 227 240 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 0 0 0 0 0 0 13 4 6 67 Células B CD20 elevado no sangue periférico (contagens por ul) Tratamento Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia 14 17 22 22,25 24 29 32 37 42 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 0 0 0 1 1 0 18 16 64 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 189 6 426 132 64 6 86 148 475 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 100 62 161 23 97 1 20 34 70 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 63 102 161 46 18 1 5 7 18

Quadro 7 Células citotóxicas (CTL) no sangue periférico (contagens por ul) Tratamento Dia- Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia 8 1 1,25 3 7 8 8,25 10 Controlo 2760 2206 2498 2867 2629 2502 2433 2688 Controlo 3335 1891 1522 2212 2222 2051 2001 2099 Controlo 2462 2002 1933 2496 2359 1531 1976 2133 IL-21 0,5 mg/kg 1591 1171 650 996 1498 1377 668 568 IL-21 0,5 mg/kg 3916 3211 1307 830 3642 1782 1177 1331 IL-21 0,5 mg/kg 3508 2978 1135 1331 2481 1516 743 1260 Ritux 0,05 mg/kg 1201 1353 1093 975 1079 580 963 713 Ritux 0,05 mg/kg 4245 3338 1069 3741 3394 2492 1084 2975 Ritux 0,05 mg/kg 4417 2961 3737 3709 3412 3115 2790 3668 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 2990 2613 840 381 1502 1005 548 1093 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 3689 2888 1069 855 2323 1316 499 1480 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 2636 3410 654 790 3573 2615 863 1671 68 Células citotóxicas (CTL) no sangue periférico (contagens por ul) Tratamento Dia- Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia 8 1 1,25 3 7 8 8,25 10 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 1035 1233 453 435 970 1531 211 763 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 1555 1413 653 880 1150 1357 323 640 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 2244 781 672 1317 2156 362 679

Quadro 7 (cont.) Células citotóxicas (CTL) no sangue periférico (contagens por ul) Tratamento Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia 14 17 22 22,25 24 29 32 37 42 Controlo 2301 2926 3523 2705 2388 2064 2126 2662 2005 Controlo 2023 2438 1930 1983 2059 2141 2299 1977 2189 Controlo 2352 2302 1627 2411 2001 1623 2054 2087 1681 IL-21 0,5 mg/kg 1815 2928 978 527 591 2159 1914 1137 1156 IL-21 0,5 mg/kg 5046 6180 2705 1629 1020 4204 2785 2648 1674 IL-21 0,5 mg/kg 2728 3846 2702 1016 776 3604 3575 2658 2755 Ritux 0,05 mg/kg 795 1206 788 1037 512 683 503 996 644 Ritux 0,05 mg/kg 3166 3053 2830 1405 2294 2120 1804 2335 2078 Ritux 0,05 mg/kg 2572 3184 2778 3721 2582 2140 2316 2474 2335 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 2478 4025 4224 4392 2690 4328 2943 3346 2627 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 3742 4043 3372 3123 1705 3156 2541 4294 2321 69 Células citotóxicas (CTL) no sangue periférico (contagens por ul) Tratamento Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia 14 17 22 22,25 24 29 32 37 42 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 3470 3947 3325 2812 1737 3297 2092 2588 1813 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 1591 1576 1457 297 230 1087 1047 909 528 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 1273 716 892 304 183 571 452 800 570 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 1644 1883 2122 636 455 2021 1660 1652 1142

Quadro 8 Células T auxiliares no sangue periférico (contagens por ul) Tratamento Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia -8 1 1,25 3 7 8 8,25 10 Controlo 2163 2052 2156 2044 2178 2543 2676 2499 Controlo 4533 3187 2327 3400 3515 3659 3062 3303 Controlo 5205 4603 4403 4871 4798 4195 4516 5174 IL-21 0,5 mg/kg 2476 2489 1033 1734 2672 2400 904 1069 IL-21 0,5 mg/kg 5519 4727 2445 1475 5465 3086 1791 3498 IL-21 0,5 mg/kg 4181 3811 1505 2134 3428 2102 1173 2152 Ritux 0,05 mg/kg 1381 1439 1391 1228 1394 905 1439 1145 Ritux 0,05 mg/kg 5265 4916 2477 4685 4994 5234 2956 5037 Ritux 0,05 mg/kg 5378 4438 4687 5168 5362 5097 4099 5604 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 3160 2905 961 768 2057 1416 750 1790 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 3837 3166 1324 1288 2817 1725 626 1886 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 4053 4970 1414 1689 4844 3214 1012 2709 70 Células T auxiliares no sangue periférico (contagens por ul) Tratamento Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia -8 1 1,25 3 7 8 8,25 10 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 1842 2234 841 1159 2017 2764 536 1815 IL-21 0,5 mg/kg + 1953 1946 770 1171 1702 2360 430 894 Ritux 0,05 mg/kg IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 1647 329 779 1390 2683 550 780

Quadro 8 (cont.) Células T auxiliares no sangue periférico (contagens por ul Tratamento Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia 14 17 22 22,25 24 29 32 37 42 Controlo 2404 2504 3328 2392 2485 2254 2342 2692 1949 Controlo 3409 3845 3183 2768 3460 3493 3772 3244 3483 Controlo 4861 5336 4055 4887 4979 4189 5164 4672 3833 IL-21 0,5 mg/kg 2806 3834 2153 624 1455 3475 3179 2429 2336 IL-21 0,5 mg/kg 7522 8228 4390 2247 2904 5849 4633 4771 5752 IL-21 0,5 mg/kg 3814 4795 4109 1561 1942 4579 4988 3906 3619 Ritux 0,05 mg/kg 1219 1665 1345 1525 1048 1721 1471 1814 1121 Ritux 0,05 mg/kg 4991 5209 5112 2475 4826 5337 4818 5152 4455 Ritux 0,05 mg/kg 4144 4601 4638 4835 4405 5098 5032 4772 4062 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 3418 4019 4376 3457 3257 4825 3661 3669 2601 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 4039 3590 3038 2784 2185 3282 2665 3629 2742 71 Células T auxiliares no sangue periférico (contagens por ul) Tratamento Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia 14 17 22 22,25 24 29 32 37 42 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 5052 5337 4600 3659 2848 4858 3513 4056 3090 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 2945 2932 3005 698 898 2577 2482 2330 1650 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 2003 1904 2261 428 376 2806 2714 2298 1871 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 1536 1799 2485 605 783 2127 1944 1720 1504

B. Efeitos ADCC

As preparações MNC foram efectuadas com gradientes de densidade de Ficoll. As preparações de MNC provenientes de todos o animais tratados foram caracterizadas quanto ao imunofenotipo e quanto à actividade ADCC ex vivo durante o decurso deste estudo. Carregou-se as células alvo com calceina AM antes do ensaio, com uma libertação especifica das manchas intracelulares durante 3 horas de incubação como ponto final do ensaio. 0 tratamento de macacos cynomolgus com rIL-21 proporcionou alterações nas contagens de células NK em sangue periférico e na percentagem de células NK nas preparações de MNC. Inicialmente, observou-se uma diminuição nas células NK após o tratamento, com uma tendência para os valores da linha de base entre ciclos de dosagem. 72

As MNC de macacos cynomolgus tratados com rIL-21 ou com rituximab em combinação com rIL-21, mostraram uma actividade ADCC aumentada ex vivo, em comparação com as MNC de animais tratados com o grupo de veiculo e animais tratados apenas com rituximab. A actividade litica era reduzida no dia 3, estando correlacionada com o número muito pequeno de células NK na preparação de MNC. Nos dias 7 e 10, observou-se um aumento de ADCC em relação à linha base em animais tratados com rIL-21 e observou-se uma tendência semelhante para os animais tratados com rIL-21 mais rituximab. A actividade litica por célula NK foi mantida no dia 14 apesar do número reduzido de células NK nas preparações de MNC.

Quadro 9 Número de células NK no sangue periférico (contagens/ul) Tratamento Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia -8 1 3 7 8 8, 25 10 Controlo 210 211 224 224 326 223 202 Controlo 209 160 232 177 221 285 147 Controlo 339 470 565 525 388 443 462 IL-21 0,5 mg/kg 394 367 305 859 573 145 287 IL-21 0,5 mg/kg 452 546 196 594 546 141 502 IL-21 0,5 mg/kg 2135 183 122 927 198 550 9 0 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 268 211 89 179 271 26 242 0,05 mg/kg IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 231 164 211 133 211 23 241 0,05 mg/kg IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 286 149 528 506 38 277 0,05 mg/kg IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 579 399 153 365 218 81 408 10 mg/kg 73 Número de células NK no sangue periférico (contagens/ul) Tratamento Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia -8 1 3 7 8 8,25 10 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 726 476 236 555 240 56 355 10 mg/kg IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 337 442 310 310 154 67 525 10 mg/kg Ritux 0,05 mg/kg 235 240 191 179 183 67 137 Ritux 0,05 mg/kg 1265 794 948 824 712 125 795 Ritux 0,05 mg/kg 860 300 395 382 366 102 361

Quadro 9 (cont.) Número de células NK no sangue periférico (contagens/ul) Tratamento Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia 14 17 22 22,25 24 29 32 37 42 Controlo 147 204 368 196 181 126 190 149 180 Controlo 187 135 121 181 127 60 95 128 200 Controlo 533 560 335 381 496 263 476 531 290 IL-21 0,5 mg/kg 650 1077 355 84 182 365 332 249 210 IL-21 0,5 mg/kg 845 805 284 143 176 221 277 275 563 IL-21 0,5 mg/kg 1057 1249 1036 209 239 1104 852 1109 956 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 335 156 173 62 53 143 105 141 81 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 88 55 61 18 146 72 60 88 152 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 0,05 mg/kg 281 221 276 80 225 268 256 255 174 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 464 469 224 161 139 330 251 405 119 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 448 673 386 177 178 256 178 390 212 74 Número de células NK no sangue periférico (contagens/ul) Tratamento Dia 14 Dia 17 Dia 22 Dia 22,25 Dia 24 Dia 29 Dia 32 Dia 37 Dia 42 IL-21 0,5 mg/kg + Ritux 10 mg/kg 482 1570 220 170 53 221 118 166 167 Ritux 0,05 mg/kg 176 235 167 129 129 108 97 191 109 Ritux 0,05 mg/kg 836 638 745 398 623 681 542 741 615 Ritux 0,05 mg/kg 283 2944 290 225 268 223 175 210 276

Quadro 10 Células NK como percentagem da preparação de MNC totais Número do Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia -8 3 7 10 14 22 24 Controlo 3,6 3,2 3,5 2,9 3,05 4,5 6,6 Controlo 3,73 4, 05 4,8 4, 9 4,9 4,65 6, 05 Controlo 7, 87 7, 45 8,5 7, 25 7, 15 7,65 11, 45 IL-21 0,5 mg/kg 3d 8,03 1,9 4,6 1, 1 4,95 8,55 2,1 IL-21 0,5 mg/kg 3d 8,4 0,35 3,65 0,55 4,65 8, 15 0,65 IL-21 0,5 mg/kg 3d 17,97 2,95 5,4 1, 45 4,3 11,5 2,9 Rituxan 0,05 mg/kg 7, 77 6, 05 7 5 8, 75 8,1 8,2 Rituxan 0,05 mg/kg 7,63 6, 75 8, 45 6,35 9,3 8,35 9,55 Rituxan 0,05 mg/kg 6, 17 3,95 4, 4 2, 45 3,7 4,25 6,25 Rituxan 10 mg/kg + 10,03 0,95 2, 05 0,7 1,8 3,05 5,2 IL-21 0,5 mg/kg Rituxan 10 mg/kg + 9,6 0,35 2, 85 0,55 1, 75 5 6,3 IL-21 0,5 mg/kg Rituxan 10 mg/kg + 2,7 0,3 1, 05 0,55 1 2,25 0,9 IL-21 0,5 mg/kg Rituxan 0,05 mg/kg + 8,63 0, 45 1,5 1, 15 4, 15 4,8 0,45 IL21 0,5 mg/kg 75

Rituxan 0,05 mg/kg + IL21 0,5 mg/kg 6,17 0,5 0,95 0,3 1,8 2, 75 0,65 Rituxan 0,05 mg/kg + IL21 0,5 mg/kg 5,7 0,65 1,75 0,55 2,25 3,85 1

Quadro 11 ADCC em macacos cynomolgus tratados com rIL-21 A partir da preparação de MNC total, percentagem de lise na proporção E:T de 25. Tratamento Cyno Alvo Efector Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia _ID -4 3 7 10 14 22 24 Controlo Cyno BT474- MNC 8, 53 3, 87 12,24 10, 49 12,16 13, 74 15, 7 1 2 Controlo Cvno BT474- MNC 17, 07 12, 93 18, 02 16, 42 11,17 19, 27 13, 41 2 2 Controlo Cyno BT474- MNC 18,57 6,85 9,38 6, 71 13,67 16,36 19,63 3 2 rIL-21 0,5 Cyno BT474- MNC 23,13 9,45 46,34 25,28 29, 78 24,14 9, 72 mg/kg 4 2 rIL-21 0,5 Cyno BT474- MNC 30, 73 2,2 48, 52 13, 76 26, 92 29, 34 mg/kg 5 2 rIL-21 0,5 Cyno BT474- MNC 28, 72 21, 56 36, 07 21, 82 32, 01 34, 4 20, 91 mg/kg 6 2 rIL-21 0,5 Cyno BT474- MNC 28 8, 52 28, 87 45, 03 24, 43 28, 44 8, 5 mg/kg+ 16 2 Rituxan 0, 05 mg/kg rIL-21 0,5 Cyno BT474- MNC 26, 9 1, 57 17, 7 13,61 10,23 14, 8 2,21 mg/kg + 17 2 Rituxan 0,05 mg/kg rIL-21 0,5 Cyno BT474- MNC 33, 07 7, 55 17,63 20, 92 19, 81 14, 48 8, 95 mg/kg + 22 2 Rituxan 0,05 mg/kg rIL-21 0,5 Cyno BT474- MNC 34,37 7,19 34 27, 55 20, 57 23, 22 18, 01 mg/kg + 10 2 Rituxan 10 mg/kg 76 ADCC em macacos cynomolgus tratados com rIL-21. A partir da preparação de MNC total, percentagem de lise na proporção E:T de 25. Tratamento Cyno Alvo Efector Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia _ID -4 3 7 10 14 22 24 rIL-21 0,5 Cyno BT474- MNC 33, 82 5, 87 29 20, 84 15,24 30, 09 22, 44 mg/kg + 11 2 Rituxan 10 mg/kg rIL-21 0,5 Cyno BT474- MNC 13,43 9,42 19,69 15,35 8,03 9,31 7 mg/kg+ 12 2 Rituxan 10 mg/kg Rituxan Cyno BT474- MNC 27, 91 15, 51 30, 78 25,22 33, 84 25, 26 25, 86 0,05 mg/kg 7 2 Rituxan Cyno BT474- MNC 27, 98 17,37 23, 59 19, 79 16,26 29, 7 19,69 0,05 mg/kg 8 2 Rituxan Cyno BT474- MNC 33, 81 6, 78 20,15 16,21 14, 52 17, 47 26,16 0,05 mg/kg 9 2

Quadro 12

Percentagem de lise específica determinada utilizando 21. ADCC ajustado para NK para uma proporção E:T de 2. ADCC em macacos cynomolgus tratados com rIL- Tratamento Cyno_I Alvo Efector Dia Dia 3 Dia 7 Dia Dia Dia Dia D -4 10 14 22 24 Controlo Cyno 1 BT474-2 NK_L 9, 43 4, 71 16,24 18, 46 14, 41 14,35 15, 83 Controlo Cyno 2 BT474-2 NK_L 19, 07 15, 09 21,23 20,38 11,17 21,93 14, 04 Controlo Cyno 3 BT474-2 NK_L 18, 45 7,12 8, 98 7,51 13, 77 16,47 18, 88 rIL-21 0,5 mg/kg Cyno 4 BT474-2 NK_L 23,1 15, 98 52, 37 63, 06 31, 84 23,77 10,28 rIL-21 0,5 mq/kq Cyno 5 BT474-2 NK_L 30,52 2, 99 57, 41 49, 07 29, 02 29,32 rIL-21 0,5 mg/kg Cyno 6 BT474-2 NK_L 27,36 28,1 39, 81 24,36 37,28 31,91 32,19 rlL-21 0,5 mg/kg Cyno BT474-2 NK_L 27, 95 10,39 35, 81 57, 8 25,19 29,25 8,51 + Rituxan 0,05 16 mg/kg rIL-21 0,5 mg/kg Cyno BT474-2 NK_L 27,14 1,57 19,63 20, 07 10,23 17,33 + Rituxan 0,05 17 mg/kg Cyno rIL-21 0,5 mg/kg Cyno BT474-2 NK_L 31,2 7,57 23,16 21,63 21,63 14, 48 8, 95 + Rituxan 0,05 22 mg/kg 77

Percentagem de lise específica determinada utilizando ADCC em macacos cynomolgus tratados com rlL-21. ADCC ajustado para NK para uma proporção E:T de 2. Tratamento Cyno_I D Alvo Efector Dia -4 Dia 3 Dia 7 Dia 10 Dia 14 Dia 22 Dia 24 rIL-21 0,5 mg/kg + Rituxan 10 mg/kg Cyno 10 BI474-2 NK_L 33,53 9,87 46,66 30,62 26,89 25,51 19,54 rIL-21 0,5 mg/kg + Rituxan 10 mg/kg Cyno 11 BT474-2 NK_L 33,5 6, 71 37,37 27, 43 15, 89 31,52 22,95 rIL-21 0,5 mg/kg + Rituxan 10 mg/kg Cyno 12 BT474-2 NK_L 13,43 15,24 37,3 15,56 9,89 9,31 7 Rituxan 0,05 mg/kg Cyno 7 BT474-2 NK_L 27, 7 16,68 32,32 27,36 33,62 25,26 25, 82 Rituxan 0,05 mg/kg Cyno 8 BT474-2 NK_L 26,03 18,13 23,11 21,31 16,24 29,56 19,67 Rituxan 0,05 mg/kg Cyno 9 BT474-2 NK_L 34, 07 7,69 7,69 25, 72 22, 44 15, 06 21,03 26, 84 C. Objectivos suplementares 0 IL-2Ra solúvel (sCD25), um marcador de activação imune que aumentou rapidamente durante a dosagem com rlL-21, e perforina intracelular, uma enzima de grânulo lítica que aumentou mais lentamente, com a expressão mais elevada após o segundo intervalo de dosagem. FcyRI (CD64) e FcyRIII (CD16) aumentaram tanto nos monócitos como nos granulócitos. Mediu-se a perforina por citometria de fluxo em preparações de MNC. Para a medição de sCD25, recolheu-se sangue uma vez durante a aclimatização no dia -8 e uma vez nos dias 17, 29, 37 e 42. Recolheu-se também nos dias 1, 8 e 22 antes da dosagem, e cinco minutos, 30 minutos, duas horas e seis horas após a dose. Nos dias 3, 10 e 24, recolheu-se sangue 30 minutos após a dose.

Transferiu-se 0,75 mL de sangue para um tubo de coagulação SST. Deixou-se coagular a amostra à temperatura ambiente aproximadamente durante 40 a 60 minutos. Obteve-se 78 o soro por centrifugação (2000 x g) aproximadamente durante 15 minutos a 2°C-8°C e armazenou-se num congelador a -70°C. Capturou-se o CD25 solúvel presente no soro utilizando anticorpo anti-sCD25 moclonal de murino e detectou-se com anticorpo anti-sDC25 policlonal de cabra biotinilado. A estreptavidina-HRP e o substrato TMB permitiram a quantificação por colorimetria de sCD25 presente nas amostras e nos padrões.

Quadro 13

Teor em sCD25 no soro (ng/ml) Número do Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia -8 1 3 8 10 17 22 24 29 Controlo 0 0 0 0, 79 0,69 0,73 0 0 0,67 Controlo 1,01 1,14 0,91 1, 08 1,12 1,2 1,14 1, 08 1,04 Controlo 0,75 0, 73 0,85 0,85 0,97 0,98 0,97 0, 86 1,31 IL-21 0,5 mg/kg 0 0 2,58 1, 41 10,2 1,43 0 6, 54 0,97 IL-21 0,5 mg /kg 0 0, 81 4,58 1,64 8,37 1,21 0, 81 5,16 1,29 IL-210,5 mg/kg 0 0 2,49 1, 73 9,29 1,4 0, 8 5,65 1,43 Rituxan 0,05 mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Rituxan 0,05 mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Rituxan 0,05 mq/kg 0,75 0,7 0,67 0,67 0 0 0 0 0 Rituxan 10 mg/ml + IL-21 0,5 mg/kg 0 0 3,12 1,29 9,82 1, 11 0 0 0 Rituxan 10 mg/ml + IL-21 0,5 mg/kg 0 0 3,18 1,36 13,5 0,7 0 0 0 79

Teor em sCD25 no soro (ng/ml) Número do Dia Dia -8 Dia 1 Dia 3 Dia 8 Dia 10 Dia 17 Dia 22 Dia 24 Dia 29 Rituxan 10 mg/ml + IL-21 0,5 mg/kg 0 0 3,51 0, 83 8,31 0 0 0 0 Rituxan 0,05 mg/kg + IL21 0,5 mg/kg 0 0 1, 74 1,3 9,51 0 0 2, 76 0 Rituxan 0,05 mg/kg + IL21 0,5 mg/kg 0 0 4, 75 1, 83 13 0,95 0 7,98 0 Rituxan 0,05 mg/kg + IL21 0,5 mg/kg 0 0 3,39 1,29 6,75 1,48 0 5, 7 0

Quadro 14

Percentagem de CTL positivos para a expressão de perforina Número do Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia -8 3 7 10 14 22 24 29 Controlo 0,9 1,6 0,2 0 0,4 0 0 0,4 Controlo 2,3 1 1,2 1, 1 5,9 0,1 0,2 5,9 Controlo 3,8 1,7 2 2 4,2 0,1 0,7 3,5 IL-21 0,5 mg/kg 4,7 10,4 16,7 34, 7 28,3 0 0,2 20,1 IL-21 0,5 mg/kg 1,3 17,5 9,8 33,4 31,8 0 4,2 35,6, IL-21 0,5 mg/kg 4,2 7,6 19,6 39,4 24,6 0,2 12,3 21, 4 Rituxan reduzido 1,7 0,1 0,1 1 0,4 0,1 0 1, 7 Rituxan reduzido 1,3 0,3 0,1 2,4 1 0 0,1 3,9 Rituxan reduzido 2,6 1,3 0,6 0,4 7,2 0 0,1 5,9 Rituxan elevado + IL-21 0,5 mg/kg 0,3 0,2 1,2 16,8 26,8 0 0,1 0,9 Rituxan elevado + IL-21 0,5 mg/kg 2,1 1,8 5,1 13,8 25,2 0,1 0,2 Rituxan elevado + IL-21 0,5 mg/kg 1,1 14, 8 4,6 18,7 9,8 0 0 9,8 80

Percentagem de CTL positivos para a expressão de perforina Número do Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia -8 3 7 10 14 22 24 29 Rituxan reduzido + 3,1 16,5 16,2 34,6 51,6 0,2 19 58 IL-21 0,5 mg/kg Rituxan reduzido + 0,7 3,7 1,9 5, 8 9 0,1 5, 8 12,9 IL-21 0,5 mg/kg Rituxan reduzido + 3 6,5 7 12, 4 20,8 0,1 3,7 15 IL-21 0,5 mg/kg

Quadro 15

Percentagem de células NK positivas para expressões de perforina Número do Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia -8 3 7 10 14 22 24 29 Controlo 0,6 23,2 0,9 1,8 2,4 1,7 0,5 2,3 Controlo 3,5 4,5 3,1 3,3 22,2 3,1 0,6 13 Controlo 17 5, 8 3,5 6,3 19, 1 1 4, 6 29,8 IL-21 0,5 mg/kg 3d 1,6 6, 4 17,3 19,2 56,4 1,2 1, 4 23,6 IL-21 0,5 mg/kg 3d 0,9 14,5 4,3 11, 1 43,6 0,8 2,5 58,9 IL-21 0,5 mg/kg 3d 6,5 5, 4 23,9 49, 4 43,4 0,8 10,5 45,5 Rituxan reduzido 2,1 0,3 0,9 1,9 1,4 1,3 0, 4 5, 8 Rituxan reduzido 1,8 0,9 0,4 7 2,4 1,5 0,2 10,3 Rituxan reduzido 2,6 1,4 1,6 3,2 13,2 4, 7 0,3 5, 7 Rituxan elevado + IL-21 0,5 mg/kg 0,5 6,8 4,5 16,1 49,6 2,1 0,6 2,5 Rituxan elevado + IL-21 0,5 mg/kg 3,3 18, 1 4, 1 4, 4 51,1 1,7 1,5 Rituxan elevado + IL-21 0,5 mg/kg 0,8 25,9 3,2 3 22,3 7, 7 6, 7 32,6 Rituxan reduzido + IL21 0,5 mg/kg 2,1 15 7, 1 14,5 73,7 2,9 9,6 66 Rituxan reduzido + IL21 0,5 mg/kg 1,1 19,8 2,7 8,9 8,2 4,7 9,6 10,9 Rituxan reduzido + IL21 0,5 mg/kg 6,2 20,3 7,3 13,5 49 8,7 9,9 22,7 81

Quadro 16 a partir da Linha de base em CD64 MFI Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia 3 7 8 8,25 10 14 17 Controlo -14, 0 -3, 5 -12,9 -11, 8 -24,2 -2, 3 -8, 6 Controlo -1, 2 5, 6 -4,3 -9, 0 -2,1 6, 4 3, 2 Controlo -17, 0 22, 2 -12,3 -10, 8 -5,6 -2, 4 11,9 Controlo IL-21 0,5 -16, 3 -2, 4 -0, 7 -11,0 0, 0 25,9 19,6 mg/kg IL-21 0,5 mg/kg 65, 0 143, 1 81,4 110, 2 151,8 160, 2 123, 7 IL-21 0,5 mg/kg IL-21 0,5 mg/kg 68,3 34,2 39,8 76,2 74, 8 71, 1 Rituxan 0,05 mg/ml -0, 3 0, 7 10,3 9, 8 7, 9 2, 2 13, 5 Rituxan 0,05 mg/ml -11, 8 15, 6 -10, 0 -18, 0 -15,3 -4, 2 6, 1 Rituxan 0,05 mg/ml 0, 0 1, 8 -8, 7 0, 4 -9,5 -6, 4 20,8 Rituxan 10 mg/ml + 2, 9 41, 1 21,5 9, 5 35,3 83, 1 28,0 IL -21 0,5 mg/kg Rituxan 10 mg/ml + 5, 7 48, 3 16,2 10,9 41, 7 73, 2 60,6 IL-21 0,5 mg/kg Rituxan 10 mg/ml + -16, 5 76, 5 69,0 77,9 113,1 313, 4 144, 8 Rituxan 0,05 mg/ml + -1, 5 138, 8 130,6 101, 1 122,2 256, 0 176,2 IL21 0,5 mg/kg Rituxan 0,05 mg/ml + 26, 1 36, 2 26,0 21, 5 63,6 92, 9 68, 9 IL21 0,5 mg/kg Rituxan 0,05 mg/ml + 40, 7 30, 3 56,3 97,1 154, 5 251, 6 129, 8 IL21 0,5 mg/kg

Quadro 16 (cont.) a partir da Linha de base em CD64 MFI Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia 22 22,25 24 29 32 37 42 Controlo 5,3 -1, 0 -8, 5 -2, 9 0, 3 -19,6 -25, 8 Controlo 18,2 11,7 3,3 17,8 6, 6 4, 6 -1, 2 Controlo 41,0 20,9 24, 0 27,0 -15, 9 10, 2 -18, 3 Controlo IL-21 0, 5 mg/kg 9,3 9, 5 -13,3 2, 2 0, 4 -14, 2 -35, 6 IL-21 0,5 mg/kg 97,7 88, 0 77,6 88, 9 1, 9 16, 1 -10, 9 IL-21 0,5 mg/kg IL-21 0,5 mg/kg 74, 1 83, 1 64,2 41, 7 -9, 4 12, 9 -15, 2 Rituxan 0,05 mg/ml 10, 7 15,5 0, 1 21,1 8, 8 4, 7 -2, 0 82 a partir da Linha de base em CD64 MFI Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia 22 22,25 24 29 32 37 42 Rituxan 0,05 mg/ml 18,3 17,7 0, 0 22, 0 -10, 7 -1, 9 -31,5 Rituxan 0,05 mg/ml 21,3 22, 1 21,8 31,9 4, 1 0, 2 7, 7 Rituxan 10 mg/ml + 15, 9 21,9 26,2 -2, 4 -29,8 -14, 6 -10, 0 IL -21 0,5 mg/kg Rituxan 10 mg/ml + IL-21 45, 5 42, 2 24, 8 22, 1 -1, 3 2, 0 -5, 7 0,5 mg/kg Rituxan 10 mg/ml + 99, 1 137, 1 85, 8 15,3 -12, 9 -27,4 -11,6 Rituxan 0,05 mg/ml + 47, 8 35,7 42,2 162, 5 94,7 16,3 4, 0 IL21 0,5 mg/kg Rituxan 0,05 mg/ml + 41,9 57,9 46,3 12, 0 -3, 0 -2, 4 -11,6 IL21 0,5 mg/kg Rituxan 0,05 mg/ml + 35, 7 79, 1 43,9 92, 0 62, 2 57, 9 19,2 IL21 0,5 mg/kg

Quadro 17

Monócitos - Percentagem de alteração a partir da Linha de base em CD64 MFI Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia 3 7 8 8,25 10 14 17 Controlo -6, 0 -25, 1 -23, 8 -17, 8 -0, 2 -2, 1 3, 4 Controlo -12, 5 -18, 0 -30, 5 -6, 5 -10, 6 0, 9 12, 8 Controlo -13, 7 -13, 6 -23, 0 -10, 9 11,0 4, 6 10,0 IL-21 74, 2 32, 7 12, 1 36, 1 127, 6 35,4 10,2 IL-21 0,5 mg/kg 346, 4 119,0 39,3 122, 3 322, 5 112, 0 37,9 IL-21 0,5 mg/kg 65,4 23, 4 125, 1 230, 4 67,0 38,1 Rituxan 0,05 mg/ml -14, 8 -11, 5 -17, 3 -1,3 -3, 8 -8, 6 -10, 6 Rituxan 0,05 mg/ml -21,0 -3, 9 -16, 8 16, 6 -11,1 7, 3 5,6 Rituxan 0,05 mg/ml -6, 9 4, 4 -21, 1 2, 5 8, 2 16, 1 17,3 Rituxan 10 mg/ml + IL-21 0,5 mg/kg 236, 5 123, 6 77,5 182, 4 320, 9 114, 1 57,9 Rituxan 10 mg/ml + IL-21 249, 5 123, 3 68,1 173, 8 281, 8 62, 3 75, 7 Rituxan 10 mg/ml + IL-21 0,5 mg/kg 334, 9 105, 2 52, 6 115, 1 393, 7 135, 5 107, 4 Rituxan 0,05 mg/ml + IL21 0,5 mg/kg 225, 5 114, 3 76, 2 159, 7 304, 1 89, 9 46, 2 Rituxan 0,05 mg/ml + IL21 0,5 mg/kg 208, 9 1148,7 83, 3 194, 4 368, 5 89, 4 43, 0 83

Rituxan 0,05 mg/ml + 196, 9 183, 6 128, 5 303, 1 356, 7 108, 2 26, 5 IL21 0,5 mg/kg

Quadro 17 (cont.)

Monócitos - Percentagem de alteração a partir da Linha de base em CD64 MFI Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia 22 22, 25 24 29 32 37 42 Controlo 2,0 -1,2 -1, 5 10,1 -15, 5 -6, 7 -9, 8 Controlo 6,1 15,3 12, 4 13, 3 -35, 7 1, 2 8, 5 Controlo 10, 4 12,1 4, 1 6, 3 -31, 1 -17, 7 11, 6 IL-21 0,3 23,9 105, 2 2, 7 -22, 1 -1, 1 -25, 9 IL-21 0,5 mg/kg 19,2 54, 5 301, 2 66, 2 -10, 6 30, 7 7, 8 IL-21 0,5 mg/kg 18, 4 82,4 185, 2 39,5 -18, 6 -13, 6 13,9 Rituxan 0,05 mg/ml -6,3 7,3 -16, 0 -11,8 -12, 3 -8, 1 -2, 7 Rituxan 0,05 mg/ml 3,5 22,6 13, 7 9, 9 -12, 6 15,9 14,2 Rituxan 0,05 mg/ml 13,8 10, 8 15,6 24,2 -24, 1 25,4 50,6 Rituxan 10 mg/ml + 23,8 32,8 11,8 21,2 8, 0 31,0 60,5 IL-21 0,5 mg/kg Rituxan 10 mg/ml + 19,1 22,6 16, 4 26, 0 -2, 5 35, 2 5, 9 IL-21 Rituxan 10 mg/ml + 2, 7 8,3 5, 2 29, 1 -3, 0 21, 6 -3, 5 IL-21 0,5 mg/kg Rituxan 0,05 mg/ml + 33,1 58, 1 281, 6 58, 2 7, 6 21,3 13, 3 IL21 0,5 mg/kg Rituxan 0,05 mg/ml + 28,3 82,5 245, 1 39,0 -4, 6 9, 5 10,9 IL21 0,5 mg/kg Rituxan 0,05 mg/ml + 15,3 55, 9 193, 6 11,9 -10, 4 48, 8 20,8 IL21 0,5 mg/kg

Exemplo 6

Morte mediada por IL-21 e trastuzumab de linhagens celulares de cancro da mama que expressam Her-2/neu A.

Obteve-se 200 mL de sangue humano a partir de um programa de dadores. Recolheu-se 180 mL de sangue em tubos 84 de citrato de dextrose em ácido e recolheu-se 20 mL do mesmo dador em tubos de coagulação (BD Biosciences). Centrifugou-se o sangue nos tubos de coagulação a 2800 r.p.m. durante 30 minutos. Recolheu-se o soro do topo e utilizou-se em meio de cultura (ver a baixo). Reuniu-se 180 mL do sangue nos tubos ACD e diluiu-se a 1:2 em soluto salino tamponado com fosfato (PBS) e 2% de soro fetal de bovino (FBS). Colocou-se aliquotas de 30 mL de sangue em tubos de 50 mL. Colocou-se em camadas 12 mL de Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences) no fundo de cada um dos tubos de 50 mL com sangue. Centrifugou-se os tubos com sangue a 1800 r.p.m. durante 30 minutos. Recolheu-se a interface revestida tamponada a partir de cada tubo de 50 mL e reuniu-se. Lavou-se os materiais reunidos 2 a 3 vezes com um total de lOOx volume de PBS na célula, 2% de FBS. Colocou-se novamente em suspensão o aglomerado lavado final em 2 mL de PBS, 2% de FBS. Contou-se as células num homocitómetro.

Desenvolveu-se em cultura as células MNC purificadas conforme descrito antes a 5xl06 células/mL, em meio completo de SF (α-MEM com nucleósidos, B-mercaptoetanol 50 μΜ, insulina a 1:100, contribuindo com solução de reserva de selénio (Invitrogen) , 150 pg/mL de transferina adicional, 5 mg/mL de albumina de soro de bovino) com 4% de soro autólogo na presença ou na ausência de adição de 20 ng/mL de IL-21 humano, durante 4 dias a 37°C. No dia 4, colheu-se as células, contou-se no hemocitómetro e lavou-se com uma solução de sal tamponada com solução de Hank (HBSS sem Ca ou Mg) com 5% de soro bovino fetal (FBS), agora designada por HBSSF. Colocou-se novamente em suspensão os aglomerados de células em HBSSF até 5xl06 células/mL. 85

Marcou-se linhagens celulares alvo de cancro da mama, incluindo BT-474 (n° ATCC HTB-20), SK-BR-3 (n° ATCC HTB-30) ou MCF-7 (n° ATCC HTB-22), com calceína 10 μΜ em HBSSF durante 1 hora a 37°C. Lavou-se então os alvos com 10 volumes de HBSSF a 1100 r.p.m. durante 8 minutos. Colocou-se novamente em suspensão os aglomerados de células em HBSSF até 50000 células/mL. Centrifugou-se células efectoras MNC, pré-tratadas com ou sem IL-21 humano durante 4 dias conforme descrito antes, a 1100 r.p.m. durante 8 minutos e colocou-se novamente em suspensão os aglomerados de células em HBSSF até cerca de 5xl06 células/mL. Diluiu-se em série as células efectoras a 1:3 em placas de fundo redondo com 96 cavidades, em duplicado. Adicionou-se 100 pL de alvos a cada cavidade na presença de 2 pg/mL de IgG humana ou de 2,5 pg/mL de trastuzumab. Centrifugou-se placas com 96 cavidades a 500 r.p.m. durante 3 minutos. Manteve-se as placas a incubar a 37°C durante 3 horas e depois centrifugou-se a 1000 r.p.m. durante 5 minutos. Transferiu-se 100 pL de sobrenadante de cada cavidade para placas de fundo chato com 96 cavidades e efectuou-se a leitura num fluorómetro Wallac (Wallac) a 485/535 em intervalos de 1 segundo.

A linhagem celular de cancro de mama MCF-7 expressa o antigénio Her-2/neu em níveis reduzidos em comparação com a linhagem celular BT-474, a qual expressa este antigénio em níveis elevados. No ensaio ADCC descrito antes, no caso de se utilizarem alvos MCF-7 numa proporção efector:alvo (E:T) de 3, as células efectoras não tratadas na presença de trastuzumab não apresentaram uma actividade citolítica superior à de células efectoras não tratadas com IgG no ensaio. Na presença de trastuzumab, para uma proporção E:T 86 de 10, as células efectoras pré-tratadas com IL-21 apresentam uma actividade citolítica 4 vezes superior à de células efectoras não tratadas. Para uma proporção E:T de 10, na presença de IgG, as células efectoras pré-tratadas com IL-21 apresentaram um aumento de 0,5 vez na actividade citolítica em comparação com as efectoras não tratadas. No caso de se utilizarem células BT-474 como alvos, na presença de trastuzumab, para uma proporção E:T de 10, observou-se um aumento de 7 vezes na actividade citolítica de células efectoras não tratadas em comparação com aquelas não tratadas e com IgG presente no ensaio. Para uma proporção E:T de 10, o pré-tratamento com IL-21 faz aumentar esta actividade citolítica 2 vezes. Estes resultados são concordantes com o facto da linhagem celular MCF-7 ser uma fraca expressora de antigénio, visto que o trastuzumab por si só é ineficaz para aumentar a actividade citolítica efectora nesta linhagem celular. O trastuzumab por si só é eficaz para aumentar a actividade citolítica de células efectoras em alvos BT-474. O pré-tratamento com IL-21 aumenta ainda mais a actividade citolítica das células efectoras sobre estas duas linhagens celulares.

Quadro 18

Actividade ADCC de células NK humanas contra alvos de cancro da mama. 0 objectivo é a percentagem de lisados a uma proporção E:T de 3. Dador Alvo Controlo Pré-tratamento com rIL-21 A74 MCF-7 11,2943 22,71177 A7 4 SKBr 3 12,12149 39,34667 A7 4 MCF-7 0 25,9 B202 HCC142 8 27,76922 54,18124 B202 HCC3 8 27,4133 43,12007 B202 HCC3 8 9,00991 40,34685 87

Actividade ADCC de células NK humanas contra alvos de cancro da mama. 0 objectivo é a percentagem de lisados a uma proporção E:T de 3. Dador Alvo Controlo Pré-tratamento com rIL-21 B202 MCF7 13,73884 45,35621 B202 MCF7 8,487321 39,9608 B2 02 MCF7 8,739211 41,61529 B202 SKBR3 28,50026 53,7579 B202 SKBR3 14,84613 26,45897 C025 HCC142 8 18,60837 50,02053 C025 HCC142 8 14,20742 27,40921 C025 HCC38 16,89381 32,41753 C025 HCC38 7,033291 28,39438 C025 MCF7 14,40028 45,16213 C025 MCF7 6,009641 27,19668 C025 MCF7 8,491816 23,90491 C025 MCF7 11,2943 22,71177 C025 SKBR3 26,61171 48,15062 C025 SKBR3 18,33489 34,07056 C025 SKBR3 Β.

Obteve-se 200 mL de sangue humano a partir de um programa de dadores. Recolheu-se 180 mL de sangue em tubos de citrato de dextrose em ácido e recolheu-se 20 mL do mesmo dador em tubos de coagulação (BD Biosciences). Centrifugou-se o sangue nos tubos de coagulação a 2800 r.p.m. durante 30 minutos. Recolheu-se o soro do topo e utilizou-se em meio de cultura (ver a baixo). Reuniu-se 180 mL do sangue nos tubos ACD e diluiu-se a 1:2 em soluto salino tamponado com fosfato (PBS) e 2% de soro fetal de bovino (FBS) . Colocou-se aliquotas de 30 mL de sangue em tubos de 50 mL. Colocou-se em camadas 12 mL de Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences) no fundo de cada um dos tubos de 50 mL com sangue. Centrifugou-se os tubos com sangue a 88 1800 r.p.m. durante 30 minutos. Recolheu-se a interface revestida tamponada a partir de cada tubo de 5 0 mL e reuniu-se. Lavou-se os materiais reunidos 2 a 3 vezes com um total de lOOx volume de PBS na célula, 2% de FBS. Colocou-se novamente em suspensão o aglomerado lavado final em 2 mL de PBS, 2% de FBS. Contou-se as células num homocitómetro.

Diluiu-se MNC até 5 - 10 x 107 células/mL em PBS, 2% de FBS. Purificou-se as células NK utilizando um estojo de células NK humanas de enriquecimento 'StemCell Technologies'. Centrifugou-se as células NK a 1100 r.p.m. durante 8 minutos, colocou-se novamente em suspensão em 0,5 mL de PBS, 2% de FBS e efectuou-se a contagem num hemocitómetro.

Colocou-se em placas células BT-474 (n° ATCC HTB-20) a 125 xlO6 células/mL numa placa com 12 cavidades em DMEM (Gibco), 10% de FBS e deixou-se aderir durante 3 horas. Diluiu-se células NK purificadas conforme descrito antes até 1 - 2 x 106 células/mL em meio completo SF (α-MEM com nucleósidos, β-mercaptoetanol 50 μΜ, insulina a 1:100, contribuindo com solução de reserva de selénio (Invitrogen), 150 pg/mL de transferina adicional, 5 mg/mL de albumina de soro de bovino) mais 4% de soro AB humano termicamente inactivado. Aspirou-se o meio das células BT-474 e adicionou-se 2 mL de células NK diluídas às células de BT-474, formando assim a co-cultura. Adicionou-se nada, 2 pg/mL de trastuzumab, 20 ng/mL de IL-21 humano ou 2 pg/mL + 20 ng/mL de IL-21 humano à co-cultura. Manteve-se a co-cultura a incubar de um dia para o outro a 37°C. Após a co-cultura, colheu-se as células e efectuou-se a contagem num hemocitómetro. Lavou-se as células em HBSSF (ver abaixo) e 89 colocou-se novamente os aglomerados de células em 1 mL de HBSSF.

Adicionou-se 20 pg/mL de globulina gama de murganho (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. West Grove, PA) e anticorpo conjugado a 1:100 a 100000 - 200000 células NK em 100 pL de HBSSF. A combinação de anticorpo incluía CD25FITC, CD56PE, CDl6Cychrome e CD8APC (BD Pharmingen). Os controlos de isótipos incluíam 100000 - 200000 de células reunidas a partir de co-culturas de NK com cada anticorpo conjugado por si só. Manteve-se as células a incubar a 4°C durante 30 minutos no escuro. Lavou-se as células 1 vez em PBS, 2% de FBS e manteve-se em 200 pL de PBS, 2% de FBS. Adicionou-se paraformaldeído a 0,2% para fixar as células e manteve-se as células a 4°C até estarem prontas para análise por FACS. Realizou-se a análise por FACS num dispositivo 'Becton Dickinson FACS Calibur' após 3 a 4 dias de fixação.

Utilizou-se a aplicação informática Cellquest para analisar os dados de fluxo. Calculou-se o número total de células por meio da multiplicação do número de células por mL pelo volume de cultura.

Em todos os 4 dadores testados, observou-se um aumento na população CD56+/CD25+ de células quando o trastuzumab e IL-21 estavam presentes na co-cultura de células NK e da linhagem celular de cancro da mama, BT-474. Especificamente, quando comparado com as co-culturas apenas com meio (descritas antes), o trastuzumab por si só proporcionou um aumento de 2 a 20 vezes, o IL-21 por si só proporcionou um aumento de 2 a 4 vezes e, quando o IL-21 e o trastuzumab estavam presentes observou-se um aumento de 4 a 50 vezes na população de CD56+/CD25+. Em todos os 90 dadores, observou-se um aumento na população de CD56+/CD25+ na presença de IL-21 e de trastuzumab para todas as condições de co-cultura. C.

Obteve-se 200 mL de sangue humano a partir de um programa de dadores. Recolheu-se 180 mL de sangue em tubos ACD e recolheu-se 20 mL do mesmo dador em tubos de coagulação. Centrifugou-se o sangue nos tubos de coagulação a 2800 r.p.m. durante 30 minutos. Recolheu-se o soro do topo e utilizou-se em meio de cultura (ver a baixo) . Reuniu-se 180 mL do sangue nos tubos ACD e diluiu-se a 1:2 em soluto salino tamponado com fosfato (PBS) e 2% de soro fetal de bovino (FBS) . Colocou-se aliquotas de 30 mL de sangue em tubos de 50 mL. Colocou-se em camadas 12 mL de Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences) no fundo de cada um dos tubos de 50 mL com sangue. Centrifugou-se os tubos com sangue a 1800 r.p.m. durante 30 minutos. Recolheu-se a interface revestida tamponada a partir de cada tubo de 50 mL e reuniu-se. Lavou-se os materiais reunidos 2 a 3 vezes com um total de lOOx volume de PBS na célula, 2% de FBS. Colocou-se novamente em suspensão o aglomerado lavado final em 2 mL de PBS, 2% de FBS. Contou-se as células num homocitómetro.

Manteve-se em cultura as células MNC purificadas conforme descrito antes a 0,5xl06 células/mL em meio completo SF (α-MEM com nucleósidos, B-mercaptoetanol 50 μΜ, insulina a 1:100, contribuindo com solução de reserva de selénio (Gibco), 150 pg/mL de transferina adicional, 5 mg/mL de albumina de soro de bovino) mais 4% de soro autólogo na presença ou na ausência da adição de 20 ng/mL 91 de IL-21 humano, durante 4 dias a 37°C. No dia 4, colheu-se as células, efectuou-se a contagem no hemocitómetro e lavou-se com solução de sal tamponada com solução de Hank (HBSS sem Ca ou Mg) com 5% de soro fetal de bovino (FBS), agora designado por HBSSF. Colocou-se novamente em suspensão ao aglomerados de células em HBSSF até 0,5xl06 células/mL.

Marcou-se linhagens celulares alvo de cancro da mama, incluindo BT-474 ou MCF-7, com calceina 10 μΜ em HBSSF durante 1 hora a 37°C. Lavou-se então os alvos com 10 volumes de HBSSF a 1100 r.p.m. durante 8 minutos. Colocou-se novamente em suspensão os aglomerados de células em HBSSF até 50000 células/mL. Submeteu-se a centrifugação células efectoras MNC pré-tratadas com ou sem IL-21 durante 4 dias, conforme descrito antes, a 1100 r.p.m. durante 8 minutos e colocou-se novamente em suspensão os aglomerados de células em HBSSF até cerca de 0,5xl06 células/mL. Diluiu-se em séria a 1:3 os alvos em placas de fundo redondo com 96 cavidades, em duplicado. Adicionou-se 100 pL de alvos a cada cavidade na presença de 2 pg/ mL de IgG humana ou de 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62, 0,31 pg/mL de herceptin. Centrifugou-se as placas com 96 cavidades a 500 r.p.m. durante 3 minutos. Manteve-se as placas a incubar a 37°C durante 3 horas e depois centrifugou-se a 1000 r.p.m. durante 5 minutos. Transferiu-se 100 pL de sobrenadante de cada cavidade para placas de fundo liso com 96 cavidades e efectuou-se a leitura num fluorómetro Wallac a 485/535 com intervalos de 1 segundo.

Utilizando as linhagens celulares BT-474 ou MCF-7 como alvos num ensaio ADCC, verificou-se que as MNC pré-tratadas com IL-21 possuem mais actividade para todas as 92 concentrações testadas de trastuzumab do que as MNC não tratadas ou quando IgG está presente no ensaio. Para uma proporção efector:alvo (E:T) de 3, a actividade citolítica é máxima a 5 pg/mL de trastuzumab, no caso de se utilizar BT-474. Para uma E:T de 3, a actividade citolítica é máxima a 1,25 pg/mL, no caso de se utilizar MCF-7. D.

Recolheu-se sangue periférico de macacos cynomolgus para tubos de 5 mL com heparina de lítio e armazenou-se à temperatura ambiente até ao processamento da amostra. Diluiu-se as amostras com PBS que continha EDTA 1 mM e recolheu-se a fracção de células mononucleares (MNC) por centrifugação em 95% de Ficoll. Após lavagem, manteve-se as células em cultura durante 3 dias em meio de crescimento que continha rIL-21 a 20 ng/mL ou em meio de controlo. Após incubação, lavou-se as células, contou-se e efectuou-se a coloração das aliquotas para imunofenotipagem por citometria de fluxo. Utilizou-se uma aliquota de células para se efectuar os ensaios de citotoxicidade celular dependente do anticorpo do modo seguinte. Carregou-se as células alvo de cancro de mama BT-474 com pigmento calceína AM durante 60 minutos a 37°C, lavou-se e colocou-se 1000 células alo em cavidades que continham 2 pg/mL de Herceptin e 50000, 25000, 12500, 6250, 3125, 1563 ou 781 MNC.

Manteve-se a incubar as amostras de ensaio durante 3 horas no escuro a 37°C. Após esta incubação, mediu-se a libertação de calceína AM nos sobrenadantes e calculou-se a lise específica com base na libertação por lise total (detergente) e na libertação não específica na ausência de quaisquer células efectoras MNC. Repetiu-se duas vezes a 93 experiência para cada um dos 8 macacos cynomolgus dadores. Os dados são apresentados como percentagem da lise especifica por MNC para uma proporção E:T de 25 ou então os dados são normalizados para reflectir o número actual de células NK na preparação de MNC, com base na análise por citometria de fluxo. Para os dados ajustados de NK, a proporção E:T foi ajustada contra a percentagem de lisados utilizando uma curva sigmoidal de 4 parâmetros, e utilizou-se a equação de Hill para determinar a percentagem de lisados para uma proporção E:T de 3 NK por alvo BT-474. 0 tratamento in vitro de MNC de macacos cynomolgus com rIL-21 aumenta a actividade em ensaios ADCC mediados por Herceptin, utilizando alvos de cancro de mama BT-474. Alguns animais apresentaram uma resposta superior a rIL-21 do que outros, sendo esta resposta variável consistente por animal em experiências repetidas. Ajustou-se um modelo misto de efeitos utilizando Proc MIXED em SAS@ (Littell et al. SAS System for Mixed Models; SAS Institute, 1996) com tratamento com um efeito fixo e efeitos aleatórios para o dador e tratamento por interacção com o dador. A opção Kenward Roger em SAS® foi utilizada para determinar os graus de liberdade do denominador para o cálculo do valor P para tratamento. 0 termo de tratamento foi bastante significativo. 94

Quadro 19

Actividade ADCC de preparação de MNC cynolomolgus contra alvos de cancro da mama BT-474. 0 objectivo é a percentagem de lisados a uma proporção E:T de 25. Controlo-sem tratamento Pré-tratamento com rIL-21 Animal Ciclo 1 com controlo Ciclo 2 com controlo Ciclo 1 com rIL21 Ciclo 2 com rIL21 A 15,10089 34,57907 B 4,576255 6,457869 17,69686 15,00928 C 12,60543 4, 191629 29,77582 20,20712 D 25,48322 16,04117 32,51966 32,08234 E 20,77167 6,569754 32,82285 26,04751 F 15,85598 4,479947 22,39635 12,16969 G 31,07411 18,44403 54,5077 37,00462 H 26,21558 7,980985 29,85094 20,00046

Quadro 20

Actividade ADCC de preparação de MNC cynolomolgus contra alvos de cancro da mama BT-474. 0 objectivo é a percentagem de lisados a uma proporção E:T ajustada com NK de 3. Controlo-sem tratamento Pré-tratamento com rIL-21 Animal Controlo Controlo IL-21 IL-21 A 17,56976 36,4764 B 5,349258 7,43626 22,17732 17,10627 C 13,51977 3,109 31,55683 26,31246 D 24,98626 15,87297 31,02951 31,07489 E 19,4483 6,177042 38,98066 24,94877 F 16,14824 4,779288 24,31473 15,74664 G 31,54203 17,95528 53,47342 35,68798 H 23,98745 8,451089 32,60043 16,41115 95

Exemplo 7

Modelo de murganho com depleção de CD4/CD8 A depleção de células utilizando anticorpos contra os receptores de superfície de células tem sido utilizado há já diversos anos para se entender os papéis específicos para estas células nos mecanismos imunes. Os anticorpos contra antigénios CD4 e CD8 em linfócitos T, quando injectados em murganhos efectuam a depleção de subconjuntos de células T específicas por meio de um mecanismo que envolve ADCC e complementos. Os anticorpos em dose reduzida são injectados em murganhos para efectuar a depleção entre 20%-50% de células T CD4 ou CD8. A grupos de murganhos é administrado IL-21e a sua aptidão para aumentar a depleção é estudada seguindo as células T por citometria de fluxo. 0 aumento da depleção de células T com IL-21 indica a aptidão de IL-21 para aumentar a depleção de células mediada por anticorpos in vivo.

Utiliza-se CD4 anti-murganho de rato (clone GK1.5, ATCC) ou CD8 anti-murganho de rato (clone 53-6.72, ATCC) para estudos de depleção. A grupos de murganhos C57BL/16 com 8 a 12 semanas de idade (Charles River Laboratories) injecta-se por via i.p. anticorpo de controlo, 5-50 pg de Mab anti-CD4 ou anti-CD8 no dia 0. Aos grupos de murganhos administrou-se PBS ou 25 pg de mIL-21 com início dois dias antes dos sangramentos até ao dia um de i.p.. Faz-se sangrar os murganhos nos dias 1, 4 e 7. Avalia-se o número de células T CD4 e CD8 no sangue por citometria de fluxo. O aumento da depleção de células T com indica a aptidão de IL-21 para aumentar a depleção mediada por anticorpos de células in vivo, o que sugere que o IL-21 pode aumentar os efeitos mediados por anticorpos. 96

Exemplo 8

Ensaio de limpeza do pulmão

Os ensaios de limpeza do pulmão são utilizados para estudar a função de células NK in vivo. Injecta-se por via i.v. células RAJI marcadas com crómio 51 (51Cr) em murganhos. A grupos de murganhos é administrado PBS, mlL-21, rituximab por si só ou rituximab + IL-21. Sacrifica-se os murganhos 5 a 8 horas após a injecção por via i.v. e testa-se os ensaios quanto à quantidade de radioactividade utilizando um contador gama. Uma diminuição na radioactividade no pulmão constitui um indicador do aumento de limpeza (morte) de células tumorais pelas células NK. A aptidão de IL-21 para aumentar a limpeza de células tumorais na presença de rituximab constitui um indicador da aptidão de IL-21 para aumentar a actividade lítica mediada por anticorpos in vivo.

Marca-se células RAJI com 100 pCi de 51Cr durante 2 horas a 37°C. Lava-se as células duas vezes com PBS e coloca-se novamente em suspensão em PBS estéril, pH 7,2. Injecta-se por via i.v. os murganhos com 10 milhões de células RAJI marcadas no instante 0 (t = 0) . Aos grupos de murganhos é administrado 20 pg de anticorpo de controlo ou rituximab i.p. para t = 10 minutos. Aos grupos de murganhos é administrado PBS ou 25 pg de mIL-21 a t = -24 horas, t = 0 hora e t = 4 horas. Sacrifica-se os murganhos 5 a 8 horas após a injecção do tumor, isola-se os pulmões e efectua-se a contagem num contador gama. Apresenta-se a radioactividade como uma percentagem das injecções de controlo (células marcadas por si sós). 97

Uma diminuição na radioactividade no pulmão constitui um indicador do aumento na limpeza (morte) de células tumorais por células NK. A aptidão de IL-21 para aumentar a limpeza de células tumorais na presença de rituximab constitui um indicador da sua aptidão para aumentar a actividade lítica mediada por anticorpo in vivo.

Exemplo 9

Estudo de depleção de macrófagos Raji/SCID A combinação de IL-21 + rituximab (rituximab) possui uma actividade anti-tumor sinergistica num modelo tumoral de Raji/SCID disseminado. Crê-se que a ADCC desempenha um papel importante na actividade anti-tumoral de rituximab in vivo, sendo os macrófagos células efectoras importantes neste processo. 0 IL-21 pode influenciar a actividade ADCC de macrófagos em murganhos, originando a sinergia com o rituximab. Para se testar a importância dos macrófagos no efeito anti-tumoral de IL21 + rituximab, os macrófagos irão ser submetidos a depleção em murganhos, utilizando clodronato de lipossomas (Sigma, St. Louis, MO). A experiência mostra que os macrófagos são críticos para a actividade anti-tumoral sinergistica de IL-21 + rituximab, demonstrando que a depleção desta população de células nos murganhos reduziu a sobrevivência em relação a murganhos não submetidos a depleção.

Para se estudar a importância dos macrófagos na actividade anti-tumoral de IL21 + rituximab contra células Raji em murganhos SCID, foi realizada a seguinte experiência. Retardou-se o tratamento com rituximab para reduzir a sua eficácia (Funakoshi, Longo et ai. Blood, 83(10): 2787-94, 1994) e injectou-se mIL-21 durante 5 dias 98 consecutivos em torno da primeira injecção com rituximab. Utilizou-se células HS-Sultan e Raji uma vez que estas não sinalizam por via de STAT1 ou STAT3 e o seu crescimento não é inibido por IL-21 in vitro ou in vivo.

Grupo Estirpe N° de murganhos Tratamento 1. ) SCID 10 (1481-90) Clodronato de Lipossomas + IL-21 + + rituximab 2. ) SCID 10 (1491-1500) Lipossomas em PBS + IL-21 + rituximab 3. ) SCID 9 (1501-09) Clodronato de Lipossomas + rituximab 4. ) SCID 9 (1510-18) Lipossomas em PBS + rituximab 5. ) SCID 9 (1519-28) Clodronato de Lipossomas + PBS 1 X 106 células Raji injectadas por via IV no dia 0 do estudo 100 pg de IL-21 administrado por via IP nos dias 3-7 20 pg de rituximab administrado por via IP no dia 5, dia 9, dia 13, dia 17 e dia 21

Lipossomas administrados por via IV: dia 3 - 0,2 mL 100% de lipossomas dia 9 - 0,2 mL 50% de lipossomas dia 15 - 0,2 mL 50% de lipossomas dia 21 - 0,2 mL 50% de lipossomas. A figura 1 mostra que a depleção de macrófagos com clodronato de lipossomas (e.g., Clod. IL21 + R) reduziu dramaticamente os benefícios em termos de sobrevivência para murganhos SCID que suportam células de linfoma de Raji em comparação com murganhos injetados com lipossomas em PBS. Os murganhos submetidos a depleção de macrófagos e tratados com IL-21 + rituximab (Clod. IL21 + R) ou com rituximab (Clod. R) apresentaram uma sobrevivência significativamente mais curta (tempo médio até à morte) em 99 comparaçao com murganhos nao submetidos a depleção (PBS. IL21 + R e PBS. R, respectivamente).

Exemplo 10

Limpeza de tumor após IL-21 + rituximab em murganhos SCID com depleção de granulócitos 0 IL-21 em conjunto com rituximab é capaz de limpar eficientemente células tumorais RAJI in vivo melhor do que o rituximab por si só. As células RAJI irão ser injectadas em murganhos SCID CB17 submetidos a depleção de granulócitos. Estudou-se o efeito de rituximab por si só ou em combinação com IL-21.

Injectou-se murganhos SCID-CD17 com 1 x 106 de células Raji por via IV. Além disso, injectou-se alguns dos murganhos com anticorpo monoclonal Gr-1 (BD Biosciences, Paio Alto, CA). Tratou-se os murganhos com 20 pg de rituxan, 100 pg de mIL-21 ou com uma combinação de rituxan e mIL-21, por meio de injecções por via IP.

Monitorizou-se os murganhos quanto D a perdas consistentes ou rápidas de peso corporal de 20%, 2) a paralisia ou inaptidão para manter uma posição direita ou mobilidade, 3) a respiração cansada - em particular se acompanhada por descargas nasais ou cianose, 4) a letargia ou deficiência em responder a estímulos suaves. Os murganhos que satisfazem os critérios anteriores foram submetidos a eutanásia.

Para os tratamentos Ab foram administradas doses para os grupos 1 a 6 nos dias 5, 9, 13, 17 e 21. Os grupos 7 a 10 foram tratados nos dias 12, 19, 26, 33 e 40. A proteína foi administrada nos dias 3-7 para os grupos 1 a 6 e nos dias 10-14 para os grupos 7 a 10. 100

Murganho N° Depleção Tratamento Ab Proteina D C.b-17 SCID 8 nenhuma PBS PBS 2) C.B-17SCID 8 nenhuma 20pg de rituximab PBS 3) C.B-17 SCID 8 nenhuma 20pg de rituximab 100 ug de IL-21 4) C.B-17 SCID 8 Gr-1 PBS PBS 5) C.B-17 SCID 8 Gr-1 2 0μq de rituximab PBS 6) C.B-17 SCID 8 Gr-1 20pg de rituximab 100 ug de IL-21 A figura 2 mostra que a actividade anti -turno sinergística de IL-21 + rituximab é comprometida pela depleção de granulócitos com MAb anti-Gr-1. A sobrevivência de murganhos SCID portadores de Raji (fracção de sobrevivência após 100 dias) é significativamente reduzida para murganhos SCID com depleção de granulócitos (linhas a tracejado) em comparação com murganhos sem depleção (linhas a cheio).

Exemplo 11

IL-21 em combinação com anticorpos anti-CTLA4 A. Modelo de tumores de células RENCA

Para se testar se o IL-21 em combinação com MAb anti-CTLA4 mAb possui um efeito sobre o crescimento de tumores em murganhos, utilizou-se um modelo de tumores de células RENCA. Os modelos de murganhos de carcinoma de células renais Renal utilizando injecções de células Renca tem demonstrado estabelecer tumores metastáticos de células renais que respondem a tratamento com agentes imunoterapêuticos, tais como IL-12 e IL-2 (Wigginton et al.r J. of Nat. Câncer Inst. 88: 38-43, 1996). Injectou-se por via s.c. grupos de murganhos por via com o tumor RENCA 101 no dia 0. Injectou-se então murganhos apenas com veículo, com 50 ug ou 100 ug de MAb anti-CTLA4 (clone 9H10, eBiosciences, San Diego, CA), com 25 ug de mIL-21 por si só ou com 50 ug ou lOOug de anti-CTLA4 em combinação com 25 ug de mIL-21. Neste modelo é utilizada uma dose reduzida de 25 ug de mIL-21, que normalmente não possui um efeito anti-tumoral potente.

Murganhos BALB/c fêmeas com dez semanas de idade (Charles River Laboratories) foram injectados por via SC no seu flanco direito com 0,1 x 106 de células RENCA no dia 0. A grupos de murganhos foi administrado apenas veículo (PBS, pH 7,2) ou 25 ug de mIL-21 nos dias 5-9, 19-23. A grupos separados foi administrado 50 ug ou 100 ug de MAb anti-CTLA-4 por si só nos dias 0, 4 e 8 ou então foi administrado MAb anti-CTLA4 MAb (50 ug ou 100 ug) nos dias 0, 4 e 8 em combinação com 25 ug de mIL-21 nos dias 5-9, 19-23. Todas as injecções foram administradas por via intraperitoneal. Monitorizou-se o crescimento tumoral 3 vezes por semana durante 5 semanas utilizando medições de calibre. Calculou-se o volume do tumor utilizando a fórmula 1/2 * (B)2 * L (mm3) . A injecção de mIL-21 por si só ou de duas concentrações de MAb anti-CTLA4 por si só não apresentou um efeito substancial sobre o crescimento tumoral. Pelo contrário, a combinação de mIL21 com MAb anti-CTLA4 para qualquer uma das concentrações apresentou uma diminuição significativa no volume do tumor em comparação com os controlos (figura 1). Estes dados sugerem que a combinação de IL21 com MAb anti-CTLA4 possui uma actividade anti-tumor sinergística e constitui uma combinação terapêutica possível contra o cancro. 102

B. A administração terapêutica de IL-21 de murganho em combinação com anti-CTLA4 de murganho inibe o crescimento de tumor no modelo RENCA

Para se testar se a combinação de IL-21 com mAb anti-CTLA4 possui um efeito sobre o crescimento do tumor em murganhos quando administrada utilizando um regime terapêutico, grupos de murganhos são injectados por via s.c. com o tumor RENCA no dia 0. Os murganhos são então injectados com veiculo por si só, com 50 ug ou 100 ug de mAb anti-CTLA4 (clone 9H10, eBiosciences), com 25 ug de mIL-21 por si só ou com 50 ug ou 100 ug de MAb anti-CTLA4 em combinação com 25 ug de mIL-21 com início a um volume de tumor de 60-80 mm . E utilizada neste modelo uma dose reduzida de 25 ug de mIL-21, que normalmente não possui um efeito potente anti-tumor. O mAb anti-CTLA4 é administrado nos dias 1, 5, 9 e 13 após se atingir um volume de tumor de 60-80 mm3. Injecta-se mIL-21 nos dias 5-9, 19-23 ou a partir dos 1-10, após o volume de tumor ter atingido 60-80 mm3. Os efeitos anti-tumor observados nos grupos com a combinação de mIL-21 e MAb anti-CTLA4 sugerem um efeito anti-tumor sinergístico neste modelo quando administrados num regime terapêutico.

Murganhos BALB/c fêmeas com dez semanas de idade (Charles River Laboratories) foram injectados por via SC no flanco direito com 0,1 x 106 células de RENCA no dia. Aos grupos de murganhos foi administrado veículo por si só (PBS, pH 7,2) ou 25 ug de mIL-21 nos dias 5-9, 19-23 ou nos dias 1-10 após o volume de tumor atingir 60-80 mm3. Aos grupos separados foi administrado 50 ug ou 100 ug de MAb anti-CTLA por si só nos dias 1, 5, 9 e 13 ou foi 103 administrado MAb anti-CTLA4 (50 ug ou 100 ug) nos dias 1, 5, 9 e 13 em combinação com 25 ug de mIL-21 nos dias 5-9,

19-23 ou nos dias 1-10, após o volume do tumor ter atingido 60-80 mm3. Todas as injecções foram administradas por via Monitorizou-se o crescimento tumoral 3 vezes por semana durante 5 semanas utilizando medições de calibre. Calculou-se o volume do tumor utilizando a fórmula 1/2 * (B)2 * L (mm3) .

Os efeitos anti-tumor observados nos grupos com a combinação mIL-21 e MAb anti-CTLA4 sugerem um efeito anti-tumor sinergistico neste modelo, quando administrados num regime terapêutico. Estes dados sugerem que a combinação de IL21 com mAb anti-CTLA4 apresenta uma actividade anti-tumor sinergistica e constitui uma combinação terapêutica possivel contra o cancro. C. O tratamento com a combinação de mIL-21 e anti-CTLA4 de murganho inibe o crescimento tumoral no modelo de timoma E.G7

Para se testar se a combinação de mIL-21 e MAb anti-CTLA4 induz uma actividade anti-tumor, grupos de murganhos foram injectados por via s.c com o tumor E.G7 no dia 0 (Shrikant, P e Mescher, M, . J. Immunology 162: 2858-2866, 1999). Os murganhos foram então injectados com veículo por si só, com 50 ug ou 100 ug de mAb anti-CTLA4 (clone 9H10, eBiosciences), com 25 ug de mIL21 por si só ou com 50 ug ou 100 ug de anti-CTLA4 em combinação com 25 ug de mIL21. Neste modelo é utilizada uma dose reduzida de 25 ug de mIL21 que normalmente não possui um efeito potente anti-tumor. O mAb Anti-CTLA4 é administrado nos dias 0, 4 e 8. O mIL21 é injectado nos dias 5-9, 19-23 ou nos dias 2-20 a 104 cada dois dias (EOD) . Os efeitos anti-tumor observados no grupo da combinação de mIL21 e CTLA4 sugerem um efeito anti-tumor sinergistico neste modelo.

Murganhos C57L/6 fêmeas com dez semanas de idade (Charles River Laboratories) forma injectados por via SC no flanco direito com 0,4 x 106 células E.G7 (n° ATCC CRL-2113) no dia 0. Aos murganhos foi então injectado veiculo por si só, 50 ug ou 100 ug de mAb anti-CTLA4 (clone 9H10, eBiosciences), 25 ug de mIL-21 por si só ou 50 ug ou 100 ug de MAb anti-CTLA4 em combinação com 25 ug de mIL-21. Neste modelo é utilizada uma dose reduzida de 25 ug de mIL-21, que normalmente não possui um efeito potente anti-tumor. O mAb anti-CTLA4 é administrado nos dias 0, 4 e 8. O mIL-21 é injectado nos dias 5-9, 19-23 ou nos dias 2-20 a cada dois dias (EOD) . As injecções por via intraperitoneal foram administradas num volume total de 200 ul. Todos os reagentes são administrados por injecções por via intraperitoneal. Monitorizou-se o crescimento tumoral 3 vezes por semana durante 4 semanas utilizando medições de calibre. Calculou-se o volume do tumor utilizando a fórmula 1/2 * (B)2 * L (mm3) .

Os efeitos anti-tumor observados nos grupos com a combinação mIL-21 e MAb anti-CTLA4 sugerem um efeito anti-tumor sinergistico neste modelo. Estes dados sugerem que a combinação de IL21 com mAb anti-CTLA4 apresenta uma actividade anti-tumor sinergística e constitui uma combinação terapêutica possível contra o cancro. D. O tratamento com a combinação de mIL-21 e MAb anti-CTLA4 de murganho inibe o crescimento de tumor no modelo de melanoma B 16 105

Para se testar se a combinação de mIL-21 e MAb anti-CTLA4 induz a actividade anti-tumor em outros tumores, grupos de murganhos foram injectados por via s.c. com células de melanoma B16-F10 (n° ATCC CRL-6475) no dia 0. Aos murganhos foi então injectado veiculo por si só, 50 ug ou 100 ug de mAb anti-CTLA4 (clone 9H10, eBiosciences) , 25 ug de mIL-21 por si só ou 50 ug ou 100 ug de MAb anti-CTLA4 em combinação com 25 ug de mIL-21. O mAb anti-CTLA4 é administrado nos dias 0, 4 e 8. O mIL-21 é injectado nos dias 5-9, 19-23 ou nos dias 2-20 a cada dois dias (EOD). Os efeitos anti-tumor observados no grupo da combinação de mIL21 e MAb anti-CTLA4 sugerem um efeito anti-tumor sinergistico neste modelo.

Murganhos C57BL/6 fêmeas com dez semanas de idade (Charles River Laboratories) foram injectados por via SC no flanco direito com 0,5 x 106 células de melanoma B16 no dia 0. Os murganhos são então injectados com veiculo por si só, com 50 ug ou 100 ug de mAb anti-CTLA4 (clone 9H10, eBiosciences), com 25 ug de mIL-21 por si só ou com 50 ug ou 100 ug de MAb anti-CTLA4 em combinação com 25 ug de mlL-21. O mAB anti-CTLA4 é administrado nos dias 0, 4 e 8. O mIL21 é injectado nos dias 5-9, 19-23 ou nos dias 2-20 a cada dois dias (EOD) . As injecções intraperitoneais forma administradas num volume total de 200 ul. Todos os reagentes são administrados por injecções intraperitoneais. Monitorizou-se o crescimento tumoral 3 vezes por semana durante 4 semanas utilizando medições de calibre. Calculou-se o volume do tumor utilizando a fórmula 1/2 * (B)2 * L (mm3) .

Os efeitos anti-tumor observados nos grupos com a combinação mIL-21 e MAb anti-CTLA4 sugerem um efeito anti- 106 tumor sinergístico neste modelo. Estes dados sugerem que a combinação de IL21 com mAb anti-CTLA4 apresenta uma actividade anti-tumor sinergística e constitui uma combinação terapêutica possível contra o cancro.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> ZymoGenetics, Inc.

Kindsvogel, Wayne R.

Hughes, Steven D.

Holly, Richard D.

Clegg, Christopher H.

Foster, Donald C.

Johnson, Rebecca A.

Heipel, Mark D. ......Sivakumar, Pallavur V.

<120> MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE CANCRO UTILIZANDO TERAPIA COM IL-21 E ANTICORPOS MONOCLONAIS

<130> 04-03PC <160> 2 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 642 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> 107

<221> CDS <222> (47)...(532) <400> 1 fCfcgââfPg» áaàépapácC fcètáteptçg gtecfrt stp &m tSe 55 Kèt Arp ter m* oeí s&eí *tg g«g ar t gtc ale ctg stg 1 gxc are Ste 101 ter Pt® Qly ãb& $ mt fâu Arg 1$ 11® M 11® ey® teu 15 tet Vai 11® rhe £5:« ppp &e*i Ctf gte sr^· aas tes age ®cc e:aa ca® gat ege cae 1S1 teu Sl;y Thr teu 2 § Vál Hás tes IS Sár ter ter Sis 3Ô Slp tep Arg Bis IS stg ate a#3: sfes ug« Cáá ct;t a&a §at. ate gtr pst eag ctg mm- aat 100 tet lie Arg m-v *&9 m £ln teu XX® ASP lie 45 ¥al ASp Slã teu Pys §0 Ase tmt arfes m% f&e ug OSC Ote §aa ttt cr.g a::7 «Cá mt f«® 247 t^r mi ASp 55 leu Vai J^S· & Cyl'U m lisu Iro Ala Pro <llu 65 Asp Vai 0« «ca m& t<te «gg tca stt m:. ICC tgl «te cag áág gee caa sss $lsa Thr &s:n "' 0 Cys iSIu Trp ter Ala 7:5 lhe ter Cys Pbe <3«a Ala «la «ta ááp fcea. pz» sai aea ase uai pse ate SÍC aat teá SC® 141 teu Ly$s »S Ser Má ,&í Tàr siv 9Ú Asn Asm <Slu Arg tla SS iie Ate val Ser att aaa csg cfcg **« «gg a&s ®®& ec« icc «c® aafc gs:a afá apa lâi llá xm fcyà Lyá iuu tys> teg X§S hy$ Pú® mt Ur*? 1.10 Asss Alá «ly Ate Arg m m® áá® cáe áte «tá áS® t-ge e«t tca %m SAfe tet táfe Í5íiíí ááá a®« 41Ó «a» M» M'¥ teu ia& Tár €y» I:te ter Cps 12S mp te« Tyr 171« ly» 110 Lyá oce áte ££&& ttC cr. a ga» sg® etc aaa t.Cá Cte OIC cáá stç 407' Pro Pro &¥» Õla MS Phe teu $1« xm lhe a» l&M §ar teu .teu aiu 145 Ayu Mát att 11« OH* Mis: ea§ QUi 1 SS Cá« Bíá «te teu tce ter «et ter Mm hm i 55 uca. Vte c*c Slis im eiy aat Ssar aiu 140 ««t Asp tcc Sai" $1¾ #cfccgc»«rSfc gg®c$ctetg tt*«*.fc»3fc<í «.Aátetegte fcctctfc&gca ctcc&agtgg «ggagixcfca tsssgaa&t* S42 108

<210> 2 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 I &rg Sêp s®r iro s «ly MA mt Há 3ÃÓ Aéo. so siy fbr Meu ve.l ,às.p ?,rg Mis 35 Me n» Arg Set Aí g 43 l-«u Ay a so aao 'v'al Asã hm 5S Lè» AS Asp ¥al Cila Thr Asa éyis Gla Myís Ala «ia LíAa iys IS Sor Aio Asa Asa V.sl Sar 0¾ 10-3 Ay® l-ys t:..*u Lya «3y Arg Mrg li:l «la Ay® Mi® A.rg tee 133 Giu òe S^re fro Ly® Oík 13 S Mhe :GÍO LyO Se? mm- ll-a MiA Sla ISO Ais Aso G!« Arg 10 Hs «si He Cys líjgftL 1:S H 5. s as eys Ser Ser Aér «In 33 «ly «la Gin Leu lie Asp lie ¥&1 Asp «la ia Orà Glu 1*3# #3 IiSS:U faa Ala Mre trp Ala 13 Pbé 3®r eys Phé Glá §0 3¾ Gly IC Asa Asa «1-U Ary I lo §3 lie Arg im Ay* Arò fey Sér Thr 11.3 ÀSU Alá Tkt vyo. Mae Ser Cyo 125 Asp Ser fyr Lass. eiu Arg S%e 3 4õ Ays ier Aeu. Lao Ser 5#y Arg iSS t'hr Mis <3*y ser Gio. i§« 109

REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o EPO não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição • WO 03103589 A [0005] • WO 2004032857 A [0006] • WO 2005037306 A [0008] • US 6307024 B [0037] [0041] • US 6686178 B [0037] [0041] [0046] • WO 017235 A [0037] • WO 0177171 A [0037] • US 5155027 A [0043] • US 5567584 A [0043] • US 0339764 W [0046] • US 20040241169 A [0051] • US 5736137 A [0053] • US 6455043 B [0054] • WO 03049694 A [0079]

Literatura citada na descrição, para além das patentes de invenção • Kelso, A. Immun. Cell Biol., 1998, vol. 76, 300-317 [0001] • Parrish-Novak et al. Nature, 2000, vol. 408, 57-63 [0003] 110 • Parrish-Novak et al. J. Leuk. Bio., 2002, vol. 72, 856- 863 [0003] • Collins et al. Immunol. Res., 2003, vol. 28, 131-140 [0003] • Brady et al. J. Immunol, 2004, 2048-58 [0003] • Kasaian et al. Immunity, 2002, vol. 16, 559-569 [0003] • Kohler et al. Nature, 1975, vol. 256, 495-497 [0004] • Khazaeli et al. J. Immunother, 1994, vol. 15, 42-52 [0004] • Boulianne et al. Nature, 1984, vol. 312, 643-646 [0004] • McCafferty et al. Nature, 1990, vol. 348, 552-554 [0004] • Green. J. Immunol. Methods, 1999, vol. 231, 11-23 [0004] • Brekke et al. Nat. Rev. Drug Discov., 2002, vol. 2, 52-62 [0004] • Clegg et al. European Cytokine Network, September 2003, vol. 14 (3), 28 [0007] • Nilsson et al. EMBO J., 1985, vol. 4, 1075 [0016] • Nilsson et al. Methods Enzymol., 1991, vol. 198, 3 [0016] • Smith; Johnson. Gene, 1988, vol. 67, 31 [0016] • Grussenmeyer et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1985, vol. 82, 7952-4 [0016] • Hopp et al. Biotechnology, 1988, vol. 6, 1204-10 [0016] • Ford et al. Protein Expression and Purification, 1991, vol. 2, 95-107 [0016] • Dynan; Tijan. Nature, 1985, vol. 316, 774-78 [0022] • Taro et al. J. Cell Physiol, 2005, vol. 203 (1), 1-5 [0028] • Cosman. The Hematopoietin Receptor Superfamily. Cytokine, 1993, vol. 5 (2), 95-106 [0038] • Nicola et al. Advances in Protein Chemistry, 1999, vol. 52, 1-65 [0038] 111 • Kelso, A. Immunol. Cell Biol., 1998, vol. 76, 300-317 [0038] • Tuan et al. Connective Tissue Research, 1996, vol. 34, 1-9 [0043] • Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0046] • Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc, 1 987 [0046] • Gong et al. J. Immunol, 2005, vol. 174, 817-826 [0048] • Uchida et al. J. Exp. Med, 2004, vol. 199 (12), 1659-69 [0048] • Phan et al. PNAS, 2003, vol. 100, 8372-8377 [0051] • Reff et al. Blood, 1994, vol. 83, 435-445 [0053] [0059] [0082] • Shan et al. Blood, 1998, vol. 91, 1644-1652 [0053] • Maloney et al. Blood, 1997, vol. 90, 2188-2195 [0053] • Demidem et al. Câncer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 1997, vol. 12, 177-186 [0054] • Parrish-Novak et al. J. Leuk. Biol., 2002, vol. 72, 856-863 [0056] [0079] • Bonnefoix et al. Leukemia and Lymphoma, 1997, vol. 25, 169-178 [0056] • Keilholz et al. Leuk. Lymphoma, 1999, vol. 35, 641-2 [0057] • Ansell et al. Blood, 2002, vol. 99, 67-74 [0057] • Carson et al. Eur. J. Immunol., 2001, vol. 31, 3016-25 [0057] • Sacchi et al. Haematologica, 2001, vol. 86, 951-8 [0057] • Trentin et al. J. of Clinicai Invest., 1999, vol. 104, 115-121 [0059] 112 • Parrish-Novak et al. J. Leukoc. Biol., 2002, vol. 72, 856-863 [0059] • Mehta et al. J. Immunol, 2003, vol. 170, 4111-4118 [0059] • Ozaki et al. J. Immunol., 2004, vol. 173, 5361-5371 [0059] • Sivakumar et al. Immunol., 2004, vol. 112, 177-182 [0059] • Hernandez-Ilizaliturri. Clin. Câncer Res., 2003, vol. 9, 5866-73 [0061] • Pelletier et al. J. Immunol, 2004, vol. 173 (12), 7521-30 [0062] • Uchida et al. J. Exp. Med., 2004, vol. 199 (12), 1659-69 [0062] • Ottensmeier. Chemlco-Blologlcal Interactions, 2001, vol. 135-136, 653-664 [0066] • Decision Resourses. Non-Hodgkins Lymphoma, February 2002 [0066] • The Non-Hodgkin's Lymphoma Pathologic Classification Project. Câncer, 1982, vol. 49 (10), 2112-35 [0067] • Lymphoid neoplasms. American Joint Committee on Câncer.: AJCC Câncer Staging Manual. Springer, 2002, 393-406 [0067] • Boye et al. Annals of Oncol. 2003, vol. 14, 520-535 [0067] • Cattan et al. Leuk. Res., 1994, vol. 18, 513-22 [0068] • Flavell. Hematological Oncology, 1996, vol. 14, 67-82 [0068] • Funakoshi et al. J. Immunotherapy, 1996, vol. 19, 93-101 [0068] • Funakoshi et al. Blood, 1994, vol. 83, 2787-94 [0068] • Cattan et al. Leukemia Res., 1994, vol. 18, 513-522 [0068] • French et al. Nat. Medicine, 1999, vol. 5, 548-553 [0068] 113 • Tutt et al. J. Immunol, 1998, vol. 161, 3176-3183 [0068] • Vugmeyster et al. Internat. Immunol., 2003, vol. 3, 1477-1481 [0069] • McLaughlin et al. Clinicai Oncol., 1998, vol. 16, 2825- 2833 [0070]

Piro et al. Ann. Oncol. , 1999, vol. 10, 619-621 [0070] Cheson et al. J. Clin. Oncol. , 1999, vol. 17, 1244-1253 [0075] • Atkins. Semin. Oncol., 2002, vol. 29 (3), 12 [0079] • Heipel et al. Blood, 2003, vol. 102 (11), 2845 [0079] • Cheson et al. J. of Clinicai Oncol., 1999, vol. 17, 1244-1253 [0080] • Friedberg et al. Br. J. Hematol., 2002, vol. 117, 828 [0082] • Slamon et al . Science, 1987, vol. 235, 177-182 [0083] • Slamon et al . Science, 1989, vol. 244, 707-712[0083] • Penichet et al. Lab Anim. Sei., 1999, vol. 49, 179 [0085] • Clinicai Research Associates Manual. Southwest Oncology Group, 06 October 1998 [0086] • Kluin-Nelemans, H.C. et al. Leukemia, 1991, vol. 5, 221-224 [0096] • Drexler, H.G. et al. DSMZ Catalogue of Cell Lines. 1999 [0096] • Cattan et al. Leuk Res., 1994, vol. 18 (7), 513-522 [0101] • Ozaki et al. Blood, 1997, vol. 90 (8), 3179-86 [0101] • Funakoshi, Longo et al. Blood, 1994, vol. 83 (10), 2787-94 [0144] • Wigginton et al. J. of Nat. Câncer Inst., 1996, vol. 88, 38-43 [0151] 114 • Shrikant, P; Mescher, M. J. Immunology, 1999, vol. 162, 2858-2866 [0157]

Claims (7)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Rituximab e um polipéptido de IL-21 ou um fragmento de um polipéptido de IL-21, conforme ilustrado na SEQ ID NO:2 desde o resíduo aminoácido 30 até ao resíduo 162, para utilização no tratamento de cancro num sujeito, em que o rituximab e o polipéptido de IL-21 são administrados uma vez por semana até oito semanas consecutivas.

2. Rituximab e um polipéptido de IL-21 ou um fragmento para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o cancro é o linfoma não Hodgkin.

3. Rituximab e um polipéptido de IL-21 ou um fragmento para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou com a reivindicação 2, em que o sujeito é um paciente humano.

4. Rituximab e um polipéptido de IL-21 ou fragmento para utilização de acordo com a reivindicação 3, em que o paciente não mostrou previamente uma remissão ou regressão apreciável do tumor em resposta a rituximab.

5. Rituximab e um polipéptido de IL-21 ou fragmento para utilização de acordo com a reivindicação 3, em que o paciente sofreu uma recaída após a administração de terapia com rituximab.

6. Rituximab e um polipéptido de IL-21 ou fragmento para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a administração de IL-21 provoca uma resposta imunológica óptima. 2

7. Utilização de rituximab e de um polipéptido de IL-21 ou fragmento de um polipéptido de IL-21, conforme ilustrado na SEQ ID NO:2 desde o resíduo aminoácido 30 até ao resíduo 162, para a produção de um medicamento para o tratamento de cancro num sujeito, em que o rituximab e o polipéptido de IL-21 são administrados uma vez por semana até oito semanas consecutivas.