PT1706157T - Rocesso para a produção de transplantes de células de disco intervertebral e a sua utilização como material para transplante - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE TRANSPLANTES DE CÉLULAS DE DISCO INTERVERTEBRAL E A SUA UTILIZAÇÃO COMO MATERIAL PARA

TRANSPLANTE A invenção é relativa a um processo para a produção de transplantes autólogos de células de disco intervertebral mistas, como descrito nas reivindicações, bem como a um transplante autólogo de células de disco intervertebral mistas. A invenção é relativa a um processo para a produção in vitro de transplantes de condrócitos de disco intervertebral a partir de tecido de disco intervertebral lesionado de doentes e a sua aplicação como material de transplante para o tratamento de discos intervertebrais doentes. A invenção é ainda relativa a tecido de cartilagem de disco intervertebral tridimensional, vital e mecanicamente estável e à sua utilização como material de transplante para o tratamento de discos intervertebrais lesionados, bem como para testar substâncias ativas. A invenção tem ainda por objeto os transplantes de células de disco intervertebral produzidos e a técnica de transplante e o tecido da cartilagem de disco intervertebral produzido e preparações terapêuticas, como, por exemplo, soluções injetáveis, que contêm este tecido e os transplantes de células. A degeneração dos discos intervertebrais é desencadeada durante o envelhecimento ou devido a trauma e causa dores agudas e crónicas e instabilidades na coluna vertebral. Mais de 300.000 doentes na Europa padecem de doenças dos discos intervertebrais. Aproximadamente 70% dos doentes, que sofrem de um prolapso discai e que são tratados com discectomia, sofrem ainda de dores nas costas. Dores fortes persistentes tornam necessária outra intervenção cirúrgica em 10% destes doentes (Yorimitsu et al, 2001). O motivo disso é a redução da altura dos discos intervertebrais causada pela cirurgia, o aumento a isso associado da carga local do tecido discai (Brinckmann e Grootenboer, 1991) e sobretudo o défice na cura e na regeneração do tecido discai destruído e removido (Lundon e Bolton, 2001, Meakin et al., 2001) . Com o tempo, esta instabilidade do disco intervertebral em questão leva a modificações degenerativas nos discos intervertebrais adjacentes, tornando necessário outras intervenções cirúrgicas e, no pior dos casos, uma fusão das vértebras ou a colocação de uma prótese. Por isso, a reparação ou a regeneração biológica do disco intervertebral é o futuro do tratamento de discos intervertebrais degenerados.

Um método conhecido para a regeneração biológica de um tecido é o transplante de condrócitos mediante a utilização de células do próprio organismo, que se aplica no tratamento de defeitos na cartilagem articular. Neste caso, aproveita-se o potencial dos condrócitos articulares, de modo a gerar novo tecido in vivo após transplante das células. Para isso, ao doente faz-se uma biópsia da cartilagem articular, isola-se a partir daí os condrócitos, faz-se a multiplicação dos condrócitos através da sua cultura e transplanta-se depois para o doente na zona do defeito histológico, por exemplo, por meio de injeção. Aí geram novo tecido e preenchem assim o defeito na totalidade. Com estes processos, consegue-se gerar tecido após a aplicação de um transplante de células no corpo. Em princípio, este método não é aplicável ao tratamento da degeneração de discos intervertebrais, dado que por motivos éticos não se pode retirar ao doente matéria-prima de um disco intervertebral adjacente intacto e não se pode a priori utilizar tecido doente.

As primeiras preparações para a substituição biológica de um disco intervertebral têm por base a utilização de tecido saudável de disco intervertebral. Assim, Handley (US 6,080,579) e Ferree (US 6,340,369 Bl) descrevem a utilização de tecido normal de disco intervertebral para o isolamento de células de disco intervertebral e a combinação destas células com um suporte biorreabsorvivel. Igualmente muitos trabalhos científicos têm por base a utilização de tecido normal de disco intervertebral: Okuma et al., 2000, Gruber et al., 2000, Chelberg et al., 1995. No entanto, um disco intervertebral saudável de um doente não pode servir de fonte de tecido para o tratamento de outro disco intervertebral, dado que a remoção do tecido leva a uma destruição, à degeneração e assim a uma perda da função deste disco intervertebral.

Outra preparação é a utilização de tecido do núcleo polposo degenerado, que é removido do interior de um disco intervertebral degenerado e é manuseado. Nesta intervenção cirúrgica, ainda se destrói mais o disco intervertebral já degenerado e destruído. O tratamento do tecido leva a um proposto como desidratação (US 6,648,918) ou a combinação das células que aí se encontram com um material de suporte (US 6,569,442; US2001/0020476 Al) e o posterior transplante de volta nestes discos intervertebrais degenerados. Em todo o caso, o tecido desidratado não contém células vivas e não representa por isso um método de regeneração biológica. A combinação proposta de células do núcleo polposo ou de outras células com um material de suporte não representa igualmente um método biológico puro e obriga à utilização de um material de suporte apropriado, o qual tem por exemplo de ser adequado a nível biomecânico, devendo ser produzido na mesma proporção que o tecido novo, que não poderá impedir a formação de novo tecido ou não deverá induzir, por exemplo, uma reação imunológica em resultado dos materiais utilizados sintéticos, alogénicos ou xenogénicos.

Outra possibilidade de tratamento é a utilização de discos intervertebrais de outros doentes, tratando-se assim de um transplante alogénico (6,344,058; Keith DK et al., 2003) . Neste caso, a reação imunológica representa contudo um problema e, com a introdução unicamente de um disco intervertebral de dador, também não se induz provavelmente qualquer regeneração biológica do disco intervertebral em questão. O US2003165473 descreve a produção de tecido de disco intervertebral a partir de células do anel fibroso, do núcleo polposo e da placa motora.

Tendo por ponto de partida os problemas referidos, existem por isso para o tratamento de discos intervertebrais degenerados e para a regeneração dos discos intervertebrais os objetivos gerais: utilizar tecido inicial e amostra celular inicial representável a nível médico e ético, não destruir qualquer outro ou o disco intervertebral doente em questão do doente, utilizar apenas materiais do próprio doente (terapia autóloga), arranjar condições de isolamento de células e condições de cultura de células ótimas com vista à proliferação das células dos discos intervertebrais, e posterior produção da matriz do disco intervertebral, com vista a evitar reações imunitárias a materiais de suporte. É possível resolver estes problemas através da realização de um transplante de células autólogo especial ou através do transplante de um tecido de cartilagem de disco intervertebral tridimensional pré-acabado fora do corpo.

Por conseguinte, a presente invenção teve por objetivo arranjar um processo para a produção de transplantes de condrócitos discais e tecido da cartilagem de disco intervertebral vital estável, apropriados para o transplante autólogo, para a reconstrução rápida e para a manutenção da função do disco intervertebral. Neste caso, é essencial que a matéria-prima para a produção do transplante de células possa ser retirada a nível médico e com sentido ético e que as células de disco intervertebral cultivadas de modo autólogo mantenham as suas propriedades durante o período de tempo desde a remoção até ao transplante e que apresentem uma grande capacidade de proliferação e de diferenciação.

De forma surpreendente, conseguiu-se mostrar ser possível empregar tecido de disco intervertebral doente como matéria-prima. Até à data partia-se do princípio não ser possível isolar células adultas de tecido degenerado em número suficiente, as quais fossem vitais, capazes de proliferação em suficiente grau e que além disso ainda fossem capazes de diferenciação com especificidade histológica e produzissem tecido de disco intervertebral, dado que em tecidos, sujeitos a uma degeneração, as células com especificidade histológica sofrem uma modificação das suas propriedades em termos de síntese de matriz e também morrem, e são igualmente substituídas por outras células com outras propriedades sem especificidade histológica. De forma surpreendente, foi contudo possível isolar, em particular de tecido de disco intervertebral degenerado prolapsado, um número suficiente de células vitais. 0 tecido de disco intervertebral degenerado prolapsado consiste em partes discais de anel fibroso e núcleo polposo, em que as células isoladas das duas áreas de tecido (células do anel fibroso e células do núcleo polposo) também proliferam ainda sob as condições de cultura autólogas proporcionadas e se diferenciam com particular grande especificidade histológica. Desse modo, estes transplantes de células mistas são adequados a uma terapia de base celular, com vista ao restabelecimento da função do disco intervertebral.

Por conseguinte, descreve-se pela primeira vez um processo com o qual é possível produzir transplantes autólogos especiais de células de disco intervertebral mistas, que, após o transplante para um disco intervertebral lesionado/doente, permitem, através da produção de novo tecido de disco intervertebral, conservar o disco intervertebral e, com isso, restabelecer a função neurológica e mecânica da coluna vertebral no caso de uma doença do disco intervertebral ou após um prolapso do disco intervertebral.

Também no caso de progressão da degeneração do disco intervertebral, ou seja, também no caso de degeneração ou de lesão traumática da camada exterior do disco intervertebral (anel fibroso), torna-se possivel com a presente invenção restabelecer e manter a função neurológica, biológica e mecânica do disco intervertebral, caso se isole células de tecido mistas a partir de discos intervertebrais degenerados prolapsados, que são seguidamente cultivadas na forma de um tecido tridimensional autólogo sem a utilização de materiais de suporte. 0 tecido de disco intervertebral isolado, ou seja, as células de disco intervertebral são multiplicadas sob condições de cultura autólogas apenas com a adição de soro do próprio doente no meio de cultura em monocamada. Preferencialmente, faz-se a cultura das células de disco intervertebral isoladas do tecido de disco intervertebral prolapsado degenerado durante a multiplicação num meio de cultura de células, contendo 1-20% de adição de soro autóloga e a sua relação de meio alfa-MEM e meio HAM-F12 entre 2:1 e 1:2, e nos 36.8-37°C, com 5% de dióxido de carbono na fração de ar e com uma humidade do ar de 85-95%, não se modificando assim a sua síntese nas proteínas de matriz e marcadoras.

Prefere-se ainda que as células de disco intervertebral isoladas sejam cultivadas, após a sua multiplicação em monocamada, num meio de cultura de células contendo 1-20% de adição de soro autóloga e cuja relação de meio alfa-MEM e meio HAM-F12 é entre 2:1 e 1:2, e nos 36.8-37 °C, com 5% de dióxido de carbono na fração de ar e com uma humidade do ar de 85-95%, e sejam assim capazes de diferenciação e formem estruturas de matriz, que compreendem proteínas de matriz de disco intervertebral específicas.

Prefere-se ainda que as células de disco intervertebral isoladas sejam, após a sua multiplicação em monocamada, congeladas numa solução de 10% de DMSO, 20% de soro e 70% de meio de cultura e sejam de novo descongeladas, e que não ocorra assim qualquer alteração das suas propriedades em termos da síntese de componentes de matriz e marcadores específicos, e gerem estruturas histológicas in vitro e in vivo, compostas por proteínas de matriz específicas de disco intervertebral.

As características descritas da síntese não modificada de proteínas marcadoras e proteínas de matriz não representam qualquer objetivo ou função pretendida, que se deva atingir, mas sim a consequência das etapas de cultura. Apenas se nomeia estas características por motivos de clareza. Com a revelação destas características, dever-se-á em conformidade com isso clarificar quais as consequências que as etapas de utilização ou processuais de acordo com a invenção têm. A produção das estruturas de matriz, que compreendem proteínas de matriz de disco intervertebral específicas, não é por isso uma propriedade que se pretenda, mas sim a produção das estruturas de matriz referidas resulta das condições de cultura.

Preferencialmente, faz-se a cultura das células isoladas do tecido de disco intervertebral num recipiente de cultura com superfície hidrófoba e fundo que se estreita, obtendo-se com isso agregados celulares tridimensionais.

No tratamento com os transplantes de células de disco intervertebral de acordo com a invenção, constitui uma vantagem que, antes do transplante, o revestimento exterior do disco intervertebral, o anel fibroso, que foi danificado pela saída do tecido do disco intervertebral, seja curado de modo a que já não consiga sair mais líquido, como o transplante celular produzido, do interior do disco intervertebral. Este período de tempo depende do doente. Durante este período de tempo, produz-se os transplantes de células de disco intervertebral, indo as células de disco intervertebral mistas durante a multiplicação na cultura de células manter as suas propriedades com especificidade de tecido, em termos do respetivo potencial de diferenciação e com o isso o êxito do transplante. Em contrapartida, este potencial diminui na cultura separada das células do anel fibroso e do núcleo polposo, em que, após passagem para o ambiente tridimensional, não se expressam alguns marcadores específicos de disco intervertebral. Por isso, apenas as culturas mistas são particularmente apropriadas para produzir tecido de disco intervertebral após o seu transplante para um disco intervertebral degenerado.

Além disso, os transplantes celulares e tecidulares produzidos in vitro não deverão desencadear reações imunológicas no organismo que recebe o transplante. De forma surpreendente, constatou-se que as células e os tecidos produzidos de modo autólogo de acordo com a invenção não desencadeiam reações imunológicas. 0 tecido de disco intervertebral doente, próprio do doente retirado pode ser manuseado posteriormente de diferentes formas: (a) Das biópsias isola-se com métodos usuais as células mistas de disco intervertebral por meio de digestão enzimática do tecido, por meio de migração ou por meio de reagentes que reconhecem as células alvo. Faz-se depois a cultura destas células unicamente mediante a adição de soro do próprio organismo e sem adição de compostos promotores de crescimento exógenos e sem a adição de antibióticos, e com meio de cultura usual em recipientes de cultura de células, e a sua multiplicação ocorre até estar disponível uma quantidade suficiente de células (Fig. 2) . Mantem-se este período de tempo o mais curto possível, de modo a não alterar as suas propriedades fenotípicas. Após uma suficiente multiplicação das células, as mesmas são colhidas e o transplante celular, composto por uma suspensão de células de disco intervertebral, é preparado com vista a utilizações terapêuticas.

Em conformidade com a invenção, emprega-se as células de disco intervertebral isoladas na mistura, ou seja, as células não são separadas por células de anel fibroso e do núcleo polposo, cujos teores de tecido estão contidos no tecido de disco intervertebral prolapsado, e faz-se a sua cultura em separado ou apenas como tipo de célula individual. Precisamente sob estas condições de mistura, atinge-se uma posterior diferenciação melhorada das células especifica de disco intervertebral (ver a Fig. 3). Esta técnica de cultura mista autóloga para a multiplicação das células de disco intervertebral permite assim primeiro uma diferenciação específica de disco intervertebral destas células assim cultivadas, depois de estas terem sido transferidas para um ambiente tridimensional. (b) Noutro processo, faz-se a pré-cultura das células de disco intervertebral isoladas e faz-se a sua multiplicação apenas por pouco tempo sem passagem das células. Em seguida, colhe-se as células pré-cultivadas e congela-se as mesmas, e as mesmas são armazenadas no estado liofilizado até ao momento do transplante. Antes do transplante, descongela-se as células e continua-se a cultura das mesmas até se atingir um suficiente número de células com soro autólogo e em meio de cultura de células convencional. Após uma suficiente multiplicação das células, as mesmas são colhidas e prepara-se o transplante de células composto por uma suspensão de células de disco intervertebral. De modo surpreendente, constatou-se que as células de disco intervertebral não perdem com o congelamento e o descongelamento as suas propriedades específicas em termos de síntese de proteínas marcadoras e proteínas de matriz específicas (ver a Fig. 5). (c) Noutro processo preferido, utiliza-se igualmente como matéria-prima tecido de disco intervertebral doente do próprio doente. Das biópsias isola-se por métodos usuais as células produtoras de tecido do anel fibroso e do núcleo polposo por meio de digestão enzimática do tecido, por meio de migração ou por meio de reagentes, que reconhecem células alvo. Faz-se depois a cultura destas células mistas sob condições autólogas e com meio de cultura usual primeiro em monocamada, até se atingir um número suficiente de células e transfere-se depois para recipientes de cultura de células com superfície hidrófoba e fundo estreitado, e cultiva-se aí em suspensão até se originar um agregado celular tridimensional, contendo pelo menos 40% de volume, de preferência pelo menos 60% de volume até 99% de volume no máximo, de matriz extracelular sintetizada de novo (ECM), onde estão incorporadas células diferenciadas. O especialista consegue determinar estes valores por meio de remoção de amostras mais pequenas. O agregado celular originado apresenta uma área exterior, onde se encontram células capazes de proliferação e de migração (ver a Fig. D .

Em conformidade com a invenção, utiliza-se as células de disco intervertebral isoladas na mistura, ou seja, as células não são separadas por células de anel fibroso e de núcleo polposo, e faz-se a sua cultura em separado ou apenas como tipo de célula individual. Precisamente sob estas condições de mistura, promove-se na cultura tridimensional e, com isso, na formação do tecido de disco intervertebral tridimensional a diferenciação especifica de disco intervertebral das células mistas, sendo apenas possível atingir a expressão de marcadores específicos de disco intervertebral nestas culturas e promovendo-se a formação de tecido de disco intervertebral tridimensional no caso da utilização de culturas mistas (ver a Fig. 3) . Esta técnica de cultura mista autóloga permite assim em primeiro lugar a produção e a utilização de um transplante de tecido específico de disco intervertebral, que foi produzido de modo autólogo a partir de tecido de disco intervertebral prolapsado degenerado.

As células de disco intervertebral mistas, que são isoladas de tecido de disco intervertebral doente e com as quais se produz agregados de células de disco intervertebral tridimensionais autólogos, estando as células retiradas integradas num tecido sintetizado de novo, também sobrevivem com o decorrer do tempo de cultura, ou seja, as células no interior dos agregados não morrem. Como o passar do tempo de cultura, ocorre a diferenciação das células no interior dos agregados e formam-se tecidos de cartilagem de disco intervertebral, que consistem em ECM, células diferenciadas e numa zona de proliferação na margem (ver a Fig. 1) . Durante a diferenciação na cultura de células autóloga, a distância das células agregadas é cada vez maior devido à formação da matriz específica de tecido (ver a Fig. 3 comparação (3c) com (3d)). Origina-se no interior do tecido de disco intervertebral produzido in vitro uma histologia que é muito semelhante ao tecido natural. Durante a posterior produção do tecido de cartilagem de disco intervertebral, forma-se a "zona de proliferação" na sua margem. Esta zona tem a vantagem inestimável de, após introdução do tecido de cartilagem de disco intervertebral assim originado em discos intervertebrais degenerados, as células que se encontram nesta zona da margem serem capazes de migrar para fora e estabelecer ativamente contacto com o tecido envolvente ou permitir uma integração do tecido de cartilagem de disco intervertebral produzido in vitro no respetivo ambiente. Desse modo, os agregados celulares específicos de tecido produzidos adequam-se de modo extraordinário ao tratamento de discos intervertebrais degenerados e à reconstrução de tecido de disco intervertebral in vivo.

Devido à carga biomecânica dos discos intervertebrais diretamente após o tratamento, bem como tendo o objetivo de reconstruir o disco intervertebral em toda a sua altura também com o transplante do tecido de cartilagem de disco intervertebral, poderá ser vantajoso transplantar pedaços de tecido já maiores e mecanicamente estáveis. Neste caso, funde-se pelo menos dois, no entanto melhor ainda mais do que dois, dos tecidos de cartilagem de disco intervertebral obtidos in vitro, ao continuar-se a sua cultura em conjunto sob as mesma condições e nos mesmos recipientes de cultura como acima descrito, até ao tamanho pretendido (ver também a Fig. 4).

Como meio de cultura de células, é possível empregar o meio usual tanto para a cultura de suspensão como também para a cultura da monocamada, como, por exemplo, o MEM da Dulbecco, mediante a adição de soro. Preferencialmente, emprega-se DMEM e Hams na relação de 1:1. No entanto, de modo a evitar reações imunológicas do doente em relação ao tecido produzido in vitro, emprega-se como soro o soro autólogo do doente.

De acordo com a invenção, não se adiciona antibióticos, fungistáticos ou outras substâncias auxiliares ao meio de cultura. Verificou-se que apenas a cultura autóloga das células e dos agregados celulares, bem como a cultura sem antibióticos e fungistáticos permite uma proliferação não afetada, bem como uma diferenciação das células na cultura de monocamada, e uma produção sem problemas da matriz específica nos agregados celulares. Além disso, com a renúncia a aditivos durante a produção, consegue-se eliminar reações imunológicas após introdução do tecido produzido in vitro no organismo humano e também animal. 0 tamanho do tecido de disco intervertebral produzido depende do número de células introduzido por volume de meio de cultura. Caso se introduza, por exemplo, 1 x 107 células em 300 yL de meio de cultura, originar-se-á no período de 1 semana agregados de células de disco intervertebral tridimensionais de cerca de 500-700 pm de diâmetro. A outra possibilidade é a de aumentar a fusão in vitro dos agregados celulares peguenos - como acima descrito - e a sua introdução no disco intervertebral. Preferencialmente, emprega-se de acordo com a invenção entre 1 x 104 e 1 x 107 células em 300 pL de meio de cultura para a produção dos agregados de células pequenos, com particular preferência 1 x 105 células. Os tecidos de disco intervertebral originados passados alguns dias in vitro são depois postos em cultura durante pelo menos 2-4 semanas consoante o tipo de célula e as características específicas do doente, no meio de cultura apropriado, de modo a induzir a formação da matriz específica de tecido. Em certos casos, é possível que tecidos de disco intervertebral in vitro individuais se fundam passada cerca de uma semana de cultura, de modo a aumentar o tamanho do pedaço de tecido.

Como recipientes de cultura de células, entram em consideração para a cultura de acordo com a invenção em suspensão preferencialmente aqueles com superfície hidrófoba, portanto antiaderente, como, por exemplo, poliestireno ou teflon. Os recipientes de cultura de células com superfície não hidrófoba podem ser hidrofobizados por meio do revestimento com agar ou agarose. Não são necessários outros aditivos. Preferencialmente os recipientes de cultura de células são placas de poços. Neste caso, é possível empregar para a produção dos agregados celulares pequenos por exemplo placas de 96 poços e, para a produção dos agregados fundidos, placas de 24 poços.

Também se descreve a técnica cirúrgica para o transplante das células de disco intervertebral e do tecido de cartilagem de disco intervertebral tridimensional produzido in vitro no disco intervertebral lesionado. Realiza-se o transplante por meio de injeção das células de disco intervertebral sob controlo fluoroscópico após desinfeção da pele, cobertura estéril da área de pele e mediante anestesia local e, preferencialmente, evitando seguramente a utilização de meios de contraste. Para isso, os transplantes de células de disco intervertebral são deitados, em particular após a sua produção em laboratório, em tubos de transporte especiais com fundo estreitado, arredondado ou pontiagudo, e são aplicados no bloco cirúrgico por meio de agulha de punção com, por exemplo, saída de cânula oblíqua numa seringa. Sobretudo graças ao fundo obliquo do recipiente de transporte e à salda oblíqua da cânula, torna-se possível uma retirada completa da solução contendo as células. De modo a garantir a saída das células para o disco intervertebral sem danificar as células e com a menor perda possível de líquido e assim de células, a agulha de punção tem fundamentalmente um diâmetro interno de 0,4 a 2 mm. O transplante por meio de injeção das células de disco intervertebral no disco intervertebral a ser tratado tem lugar em especial no lado oposto ao lado previamente operado do disco intervertebral (remoção do prolapso do disco intervertebral) por meio de uma agulha de punção com salda obliqua. Realiza-se a injeção do transplante de células sob controlo fluoroscópico, dado ser necessário controlar a dispensa efetiva das células no interior do disco intervertebral. Convencionalmente, é possível empregar meios de contraste, os quais danificam porém as células, o que impede o êxito do transplante celular. Depois da dispensa das células de disco intervertebral no espaço do disco intervertebral, retira-se a agulha de punção do referido disco intervertebral. 0 doente permanece preferencialmente acamado de modo estrito durante 12 horas, seguindo-se um repouso normal de 12-24 horas, e depois acamado durante 24-48 horas com exercícios de fisioterapia. Em seguida, realiza-se, por exemplo durante algumas semanas, a estabilização da coluna vertebral por meio de uma órtese apropriada convencional.

Realiza-se os transplantes de cartilagem de disco intervertebral produzidos in vitro tridimensionais como para as células de disco intervertebral, em particular por meio de uma agulha de punção. Para garantir que não ocorram lesões mecânicas e assim biológicas dos transplantes de cartilagem de disco intervertebral durante a injeção, utiliza-se uma agulha de punção com um diâmetro de pelo menos 500 pm. Além disso, para se impedir lesões mecânicas dos transplantes de cartilagem de disco intervertebral ocorre essencialmente apenas uma única passagem pela agulha de punção. Por isso, os transplantes de cartilagem de disco intervertebral são logo transferidos, após a sua produção em laboratório, para uma seringa, na qual apenas se coloca ainda a agulha de punção no bloco operatório. Também neste caso é necessário que a agulha de punção apresente de acordo com a invenção uma ponta oblíqua, para permitir com essa área de saída maior uma dispensa rápida do transplante de cartilagem de disco intervertebral no menor volume possível de líquido (volume de dispensa). Em seguida, a injeção tem lugar como acima descrito para os transplantes de células. A invenção também tem por objeto preparações terapêuticas, compreendendo os transplantes de células de disco intervertebral de acordo com a invenção e o tecido de cartilagem de disco intervertebral, como, por exemplo, soluções injetáveis. A invenção tem igualmente por objeto a utilização do tecido de cartilagem de disco intervertebral de acordo com a invenção para testar substâncias ativas, que influenciam, por exemplo, a formação e a diferenciação de matriz e células. Para isso, produz-se os agregados de células de disco intervertebral de acordo com a invenção e junta-se os medicamentos a ser testados em diferentes estádios de maturação e caracteriza-se os mais variados parâmetros da produção e da maturação de tecido de disco intervertebral in vitro. Comparativamente aos testes de medicamentos convencionais em animais ou sistemas de células tumorais, estes testes são específicos do doente devido à utilização apenas de material autólogo e permitem um diagnóstico individual.

Seguidamente, deverá explicar-se a invenção em maior detalhe com base em exemplos de execução, sem com isso a limitar.

Exemplos de execução

Exemplo 1: Produção de transplantes de células de disco intervertebral

Do tecido de disco intervertebral doente isola-se, por meio de digestão enzimática através de incubação com solução de colagenase, os condrócitos de disco intervertebral do anel fibroso e do núcleo polposo. Após separação das células isoladas do tecido não digerido, as mesmas são transferidas como populações de células mistas para frascos de cultura de células e faz-se a sua incubação mediante a adição de meio de cultura DMEM / Hams F12 (1/1) e 10% de soro autólogo do doente nos 37°C e 5% de CO2. Realiza-se uma substituição do meio duas vezes por semana. Após se atingir o estádio confluente, lava-se a camada de células com solução fisiológica de sal de cozinha e faz-se a sua colheita com tripsina da superfície de cultura de células. Após outra lavagem, transfere-se as células de disco intervertebral para solução fisiológica de sal de cozinha e disponibiliza-se as mesmas para fins de transplante.

Num modelo in vitro foi possível mostrar o potencial de diferenciação das células de disco intervertebral contidas no transplante celular. Exprime-se proteínas de matriz e proteínas marcadoras específicas de disco intervertebral (Fig. 3) e produz-se desse modo uma estrutura tecidular específica de disco intervertebral.

Exemplo 2:_Transplante de condrócitos de disco intervertebral

Os transplantes de células de disco intervertebral produzidos no Exemplo 1 (1.000 de células no mínimo, 100 milhões de células no máximo), de preferência cerca de 1 milhão de condrócitos de disco intervertebral, foram deitados em solução fisiológica de sal de cozinha e foram injetados no disco intervertebral doente. Constatou-se, entre outros, um novo aumento do teor de água no disco intervertebral tratado, além de ser possível manter a altura do espaço intervertebral, devendo-se estas duas situações às proteínas de matriz sintetizadas pelos condrócitos de disco intervertebral.

Os transplantes de células de disco intervertebral produzidos in vitro de acordo com a invenção são absorvidos pelos doentes, garantem uma rápida integração das células capazes de proliferação e de migração, bem como uma regeneração do tecido de disco intervertebral graças à capacidade de diferenciação das células aí existentes. Desse modo, os transplantes de células de disco intervertebral permitem uma reconstrução rápida do tecido de disco intervertebral, uma rápida convalescença dos doentes e o restabelecimento da função dos discos intervertebrais.

Exemplo 3: Produção in vitro de tecido de cartilagem de disco intervertebral

Do tecido de disco intervertebral prolapsado isola-se, por meio de digestão enzimática através de incubação com solução de colagenase, os condrócitos de disco intervertebral do anel fibroso e do núcleo polposo. Após a separação das células isoladas do tecido não digerido, estas são transferidas como cultura mista para frascos de cultura de células e são incubadas mediante a adição de meio de cultura DMEM / Hams F12 (1/1) e soro autólogo a 10% do doente nos 37 °C e CO2 a 5%. Duas vezes por semana, realiza-se uma substituição do meio. Depois de se atingir o estádio confluente, lava-se a camada de células com solução fisiológica de sal de cozinha e faz-se a sua colheita com tripsina da superfície de cultura de células. Após outra lavagem, transfere-se 1 x 105 células para cada recipiente de cultura de células respetivamente, o qual se encontra revestido por agarose. Passado um dia, ocorreu a disposição das primeiras células em agregados. Estes agregados são alimentados periodicamente com meio fresco e faz-se a sua cultura durante pelo menos 2 semanas. A produção do tecido de cartilagem de disco intervertebral obtido é ilustrada pelo registo ao microscópio na Fig. 1, que mostra a secção de um tecido de disco intervertebral produzido de acordo com a invenção com ECM como zona de reduzida proliferação e formação de proteínas de matriz específicas de tecido e P como zona de proliferação exterior.

Nestes tecidos de disco intervertebral in vitro detetou-se a expressão e a deposição de componentes de matriz específicos de disco intervertebral e proteínas reguladoras, como aggrecan (Fig. 3a) , proteoglicanos específicos de hialina (Fig. 3b) , colagénio tipo I (Fig. 3c), colagénio tipo II (Fig. 3d) e colagénio tipo III (Fig. 3e). Estes são componentes do tecido de cartilagem de disco intervertebral nativo in vivo e representam as proteínas estruturais mais importantes, que são decisivas para a função da cartilagem discai.

Foi surpreendente que as células de disco intervertebral isoladas do tecido de disco intervertebral doente, caso estas tenham sido cultivadas como mistura de anel fibroso e núcleo polposo, apresentassem uma grande capacidade de proliferação (Fig. 2) , bem como um enorme potencial de diferenciação para a produção de proteínas reguladores e proteínas de matriz específicas de disco intervertebral (ver também a Fig. 3) e fosse possível manter as suas propriedades com o procedimento de congelamento e descongelamento (ver também a Fig. 5). Exemplo 4: Transplante de tecido de cartilagem de disco intervertebral 0 tecido de cartilagem de disco intervertebral produzido no Exemplo 3 (cerca de 10 a 1000 pedaços de tecido a partir de 1*105 células cada um) , de preferência 100 pedaços de tecido foram deitados em solução fisiológica de sal de cozinha logo numa seringa em laboratório e foram injetados no espaço intervertebral de discos intervertebrais doentes ou lesionados, por meio de uma agulha de punção com ponta oblíqua. O tecido de cartilagem de disco intervertebral produzido in vitro de acordo com a invenção é aceite pelos doentes e garante, além do cumprimento da função mecânica do tecido produzido, a integração rápida dos pedaços de tecido produzidos pelas células capazes de proliferação e de migração na camada exterior dos agregados, bem como uma regeneração do tecido de disco intervertebral por meio da capacidade de diferenciação das células aí presentes. Desse modo, a estrutura e a função dos pedaços de tecido permitem a rápida reconstrução de tecido de disco intervertebral, uma rápida convalescença dos doentes e o restabelecimento da função dos discos intervertebrais. A Fig. 4 mostra cinco tecidos de disco intervertebral fundidos. Observa-se que as esferas de tecido aderem umas às outras e fundem-se por assim dizer, deixando de se reconhecer o limite entre dois tecidos de disco intervertebral. Após um tempo de cultura mais prolongado, ocorre a fusão completa dos tecidos discais e origina-se um pedaço de tecido maior in vitro. A formação dos agregados celulares maiores assim obtidos é equiparável a tecido de disco intervertebral in vitro. Podem conter até 99% de ECM no máximo e as células ai existentes são vitais.

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 6080579 A [0005] • US 6340369 Bi [0005] • US 6648918 B [0005] • US 6569442 B [0005] • US 20010020476 AI [0005] • US 6344058 B, Keith DK [0005] • US 2003165473 A [0006]

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Processo para a produção de transplantes autólogos de células de disco intervertebral mistas, caracterizado por se isolar do tecido de disco intervertebral prolapsado degenerado e/ou do tecido de disco intervertebral doente, células de disco intervertebral vitais como mistura de partes de disco intervertebral do anel fibroso e do núcleo polposo, por se fazer a sua cultura apenas mediante a adição de soro do próprio organismo num meio de cultura de células sem a adição de compostos promotores de crescimento exógenos e sem a adição de antibióticos, como monocamada, e por se obter assim transplantes de células de disco intervertebral, que consistem numa suspensão de células de disco intervertebral.
2. 2. Processo para a produção de transplantes autólogos de células de disco intervertebral mistas de acordo com a reivindicação 1, ainda caracterizado por os referidos transplantes de células de disco intervertebral serem seguidamente cultivados sem a utilização de materiais de suporte, passando a um tecido tridimensional autólogo.
3. 3. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, ainda caracterizado por as células de disco intervertebral isoladas do tecido de disco intervertebral prolapsado degenerado serem cultivadas durante a multiplicação num meio de cultura de células, contendo 1-20% de adição de soro autóloga e cuja relação de meio alfa-MEM e meio HAM-F12 é entre 2:1 e 1:2, e nos 36.8-37°C, com 5% de dióxido de carbono na fração de ar e com uma humidade do ar de 85-95%.
4. 4. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por se fazer a cultura das células de disco intervertebral isoladas, após a sua multiplicação em monocamada, num meio de cultura de células contendo 1-20% de adição de soro autóloga e cuja relação de meio alfa-MEM e meio HAM-F12 é entre 2:1 e 1:2, e nos 36.8-37°C, com 5% de dióxido de carbono na fração de ar e com uma humidade do ar de 85-95%, e sendo as mesmas assim capazes de diferenciação e formando estruturas de matriz, que compreendem proteínas de matriz de disco intervertebral específicas.
5. 5. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado por as células de disco intervertebral isoladas serem congeladas, após a sua multiplicação em monocamada numa solução de 10% de DMSO, 20% de soro e 70% de meio de cultura, e voltarem a ser descongeladas, não ocorrendo uma modificação das duas propriedades em termos de síntese de componentes de matriz específicos e marcadores, e por se gerar estruturas histológicas in vitro e in vivo, compostas por proteínas de matriz específicas de disco intervertebral.
6. 6. Processo de acordo com uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado por as células isoladas do tecido de disco intervertebral serem cultivadas num recipiente de cultura com superfície hidrófoba e fundo que se estreita.
7. 7. Transplante autólogo de células de disco intervertebral mistas, que se pode obter de acordo com uma das reivindicações 1 a 6.
8. 8. Transplante autólogo de células de disco intervertebral mistas de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por se encontrar numa seringa para fins de transplante.
9. 9. Utilização do transplante autólogo de células de disco intervertebral mistas de acordo coma reivindicação 7, com vista ao teste in vitro de substâncias ativas.
10. 10. Preparações terapêuticas celulares compreendendo transplantes autólogos de células de disco intervertebral mistas de acordo com a reivindicação 7.
11. 11. Transplante autólogo de células de disco intervertebral mistas de acordo com uma das reivindicações 7 a 8, com vista a ser empregue no tratamento de defeitos de discos intervertebrais.