PT1664747E - Processo e equipamento para a detecção de quantidades muito pequenas de partículas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PROCESSO E EQUIPAMENTO PARA A DETECÇÃO DE QUANTIDADES MUITO PEQUENAS DE PARTÍCULAS" A presente invenção disponibiliza um processo e um equipamento para a detecção de quantidades de partículas na gama femtomolar e attomolar, através da detecção de produtos de reacção antigénio-anticorpo.

No estado da técnica, conhece-se diversos processos para a detecção de pequenas quantidades de partículas, como, por exemplo, os processos nefelométricos e turbimétricos, do mesmo modo como os processos denominados dynamic-light-scattering (DLS).

No caso dos processos nefelométricos e turbimétricos, faz-se uso do efeito Tyndall, em que a iluminação de uma pequena partícula liberta uma luz de dispersão de grande ângulo. A dispersão da luz pode ser determinada pela medição da redução de intensidade do feixe de luz descendente depois da passagem pelo meio de dispersão, ou por determinação da intensidade da luz desviada lateralmente. No primeiro caso, fala-se do método da turbidimetria ou da medição de extinção e, no segundo caso, da nefelometria ou da tyndall-metria propriamente dita.

Outra abordagem de procedimento é proporcionada por processos que são denominados processos de dynamic-light-scattering (DLS). Nestes processos considera-se apenas um ponto (ou poucos pontos) no cone luminoso transformador da partícula, e analisa-se ainda a modulação de luminosidade provocada pelo movimento molecular de Brown. Através da 2 focalização num diminuto volume de observação, tenta-se reduzir as inconvenientes sobreposições de luz de dispersão de várias partículas. Na sequência disto, uma partícula percorre um diminuto volume iluminado com grande rapidez, pelo que a electrónica óptica de análise tem de reconhecer frequências de flutuação consideráveis. No dispendioso processamento de sinal, encontram-se muitas informações disponíveis, pelo que estes sistemas apenas podem ser empregues de forma limitada para fins de análise quantitativa.

Os processos, em que a agregação de partículas por meio da ligação anticorpo-antigénio é empregue na medição de um objecto de análise, são por exemplo conhecidos a partir do US 5 534 441 e do US 5 100 805. Os métodos ópticos para a detecção dos agregados aí formados também são conhecidos do US 5 534 441 e contêm dispersão de luz e também medições de transmissão.

Além disso, conhece-se processos que determinam o tamanho de uma partícula em solução, através do tempo de difusão num pequeno cone luminoso (EIGEN M ET AL: "SORTING SINGLE MOLECULES: APPLICATION TO DIAGNOSTICS AND EVOLUTIONARY BIOTECHNOLOGY", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE, WASHINGTON, US, vol. 91, Junho de 1994 (1994-06), páginas 5740 - 5747).

Os processos de detecção do estado da técnica apresentam ainda outras desvantagens. Menciona-se primeiro que, embora a sensibilidade de detecção dos processos acima descritos tenha aumento muito nos últimos anos, existe ainda nas mais variadas áreas uma forte necessidade de processos de detecção com uma maior sensibilidade. Além disso, os 3 processos de detecção do estado da técnica requerem ainda quantidades de amostra comparativamente elevadas, o que pode estar ligado, sobretudo no caso de processos médicos técnicos, a uma sobrecarga da pessoa examinada.

Por conseguinte, a presente invenção tem por objectivo a preparação de um processo para a detecção de pequenas quantidades de partículas, o qual apresente uma maior sensibilidade do que os processos do estado da técnica. Além disso, um processo deste tipo deverá requerer uma menor diluição da amostra e/ou uma menor quantidade mínima de amostra, estar adequado à realização de análises de amostras à grande escala, e poder ser levado a cabo também por pessoas sem conhecimentos prévios especiais, depois dum ensinamento simples. Além disso, constitui um objectivo conforme a invenção a disponibilização dum equipamento para a detecção de pequenas quantidades de partículas.

Este objectivo é atingido pela preparação de um processo para a detecção de quantidades de partículas na gama femtomolar e attomolar, através da detecção de precipitados de antigénio-anticorpo, o qual inclui: preparação de um fluido de amostra, o qual contém essencialmente partículas com uma determinada granulometria máxima, apresentando as partículas pelo menos dois pontos de ligação de anticorpos; preparação de um fluido contendo anticorpos, o qual contém essencialmente partículas com uma determinada granulometria máxima; contacto do fluido de amostra com o fluido contendo anticorpos, obtendo-se um fluido de reacção, e podendo o anticorpo formar, na presença de uma partícula com pelo menos dois pontos de ligação de anticorpo, um precipitado de antigénio-anticorpo; condução de um feixe de luz através do fluido de reacção; detecção de um sinal através de 4 medição de extinção no limite claro-escuro do cone luminoso, que se origina na passagem da luz gerada pelo laser através da câmara de medição contendo o fluido de reacção, através dum fotorreceptor, estando a força de sinal dependente da dimensão e do número de precipitados de antigénio-anticorpo formados, e determinando-se o tamanho e o número das partículas pela medição do tempo de transição.

Além disso, a presente invenção disponibiliza um kit para a detecção qualitativa e/ou quantitativa de uma determinada partícula a ser detectada, apresentando a determinada partícula pelo menos dois pontos de ligação de anticorpo, e incluindo o kit: pelo menos um anticorpo, que se pode ligar especificamente à determinada partícula, e pelo menos um fluido adequado a colher a amostra, e um equipamento para detectar pequenas quantidades de partículas, o qual engloba: um laser, uma câmara de medição e um fotorreceptor concebido para a realização de uma medição de extinção no limite claro-escuro do cone luminoso, que se origina na passagem da luz gerada pelo laser através das partículas numa câmara de medição contendo fluido, estando o fotorreceptor disposto em relação ao laser de modo a que o raio laser passe rente ao fotorreceptor.

Breve descrição das figuras

As figuras la - d mostram em esquema as operações na formação de um precipitado de antigénio-anticorpo, mediante a utilização de um anticorpo bivalente. A figura 2a mostra o resultado de uma detecção mediante a utilização do processo segundo a invenção, tendo-se analisado um fluido de amostra abarcando uma partícula, 5 depois da filtração com um filtro com poros com um tamanho de 200 nm (antes da adição de anticorpos) . Os sinais correspondem a partículas cujo diâmetro é inferior ao tamanho de filtro utilizado. O eixo das abcissas mostra a granulometria e o eixo das ordenadas o número de partículas. A figura 2 mostra um resultado de uma detecção, em que se analisou a mistura de reacção, a qual se obtém depois da injecção em separado e ao mesmo tempo de soluções do fluido de amostra e do fluido de anticorpos, soluções essas filtradas com um filtro com poros com um tamanho de 200 nm. Nesta mistura de reacção, ocorre uma reacção e formam-se microprecipitações que têm um diâmetro superior ao do tamanho dos poros do filtro utilizado. O eixo dos x mostra a granulometria e o eixo do y mostra o número de partículas. A fig. 3 mostra um desenho em esquema de uma instalação para a realização do processo segundo a invenção.

Durante as inúmeras experiências que levaram à presente invenção, conseguiu-se a preparação de um processo, no qual a sensibilidade é 1 000 vezes superior à sensibilidade de processos equiparáveis do estado da técnica. Este forte aumento da sensibilidade tem a ver com um processo físico alterado de detecção, no qual a detecção de sinal ocorre através de uma medição de extinção no limite claro-escuro do cone luminoso, que se origina na passagem da luz gerada pelo laser através da câmara de medição contendo o fluido de reacção, através dum fotorreceptor, em interacção com uma preparação de amostra analítica a isso ajustada. 6

Além disso, a presente invenção permite uma redução do volume da câmara de medição em aproximadamente 30 a 50 vezes. Enquanto que, nos processos do estado da técnica, são necessárias câmaras de medição com volumes de, por exemplo, 1,6 ml, é possível utilizar no processo segundo a invenção, câmaras de medição com um volume na gama dos microlitros (por exemplo, 40 μΐ). Isto representa uma vantagem considerável, visto que cada amostra para a obtenção de uma matriz unitária - que apresenta, por exemplo, a mesma transparência, viscosidade, etc. - tem de ser diluída, de modo a que, num processo segundo a invenção, uma amostra tenha de ser menos diluída do que no caso dos processos do estado da técnica.

Além disso consegue-se, com o processo segundo a invenção, reduzir a quantidade mínima necessária de amostra. Enquanto os processos do estado da técnica necessitam mais de 100 μΐ, nos processos segundo a invenção são suficientes quantidades de amostra muitíssimo menores (por exemplo de 3,5 μΐ). O conceito "partícula" designa, no presente pedido, toda a estrutura tridimensional que tem um índice de refracção diferente do do meio de suporte. O conceito "precipitação" descreve no presente pedido a operação em que ocorre uma formação de um complexo de antigénio-anticorpo, aquando da reacção de antigénios solúveis com anticorpos específicos, complexo esse que apresenta uma menor solubilidade no solvente utilizado do que o antigénio utilizado ou do que o anticorpo utilizado, o que leva primeiramente a uma turvação da mistura de 7 reacção e, depois, a uma sedimentação deste complexo de antigénio-anticorpo. 0 processo segundo a invenção permite uma detecção de pequenas quantidades de partículas. Por exemplo, no caso de substâncias de baixo peso molecular, ou seja, no caso de substâncias com um peso molecular inferior a 500 g/mol, foi possível atingir, com a utilização do processo segundo a invenção, um limite de detecção na área do femtograma e do attograma por litro; enquanto o limite de detecção até à data era usualmente de micrograma, nanograma ou picograma por litro. No caso de substâncias com um peso molecular superior a 500 g/mol, o limite de detecção é superior, por exemplo no caso de substâncias com um peso molecular de 150 000 g/mol (por exemplo, anticorpos igG), o limite de detecção encontra-se aproximadamente nos 300 femtog/1. Isto significa que o fluido de amostra pode conter partículas na ordem de grandeza de femtomol ou de attomol por litro.

Numa primeira etapa parcial do processo segundo a invenção, ocorre a preparação de um fluido de amostra, que contém essencialmente partículas com uma determinada granulometria máxima. Isto pode, por exemplo, ocorrer por duas vias. Em conformidade com uma primeira variante, prepara-se neste intuito primeiro um fluido que contém essencialmente apenas partículas com uma determinada granulometria máxima; depois, uma amostra, que contém essencialmente partículas com uma determinada granulometria máxima, é introduzida no fluido. Em conformidade com uma segunda variante, o fluido de amostra pode ser obtido pela preparação primeiro de um fluido, introdução de uma amostra no fluido e posterior separação das partículas que ultrapassem uma certa granulometria. A granulometria máxima das partículas no fluido de amostra ou nos outros fluidos, que contêm essencialmente apenas partículas com uma determinada granulometria máxima, pode ser escolhida em função da aplicação pretendida. No caso da utilização de muitos anticorpos correntes, pode ocorrer a separação de partículas que sejam superiores a 20 - 450 nm, com maior preferência superiores a 100 - 300 nm, em particular superiores a 200 nm. Uma separação destas pode ser realizada, por exemplo, através de filtros com poros com um tamanho adequado de 20 - 450 nm, de preferência de 100 - 300 nm, em particular de 200 nm, ou através de outros processos conhecidos do especialista. Se a aglutinação for considerada aproximadamente como área, a metade do tamanho do filtro é o quádruplo relativamente ao número de moléculas que fornece produtos de reacção detectáveis. Caso se empregue, por exemplo, um filtro de 100 nm em vez de um filtro de 200 nm, será apenas necessário cerca de um quarto das moléculas de antigénio-anticorpo necessárias no caso da utilização de um filtro de 200 nm, as quais tenham de reagir umas com as outras de modo a obter um resultado detectável. Além disso existe, por exemplo no caso da utilização de filtros de 25 nm, a possibilidade de detectar trímeros de antigénio-anticorpo-antigénio. No caso de uma utilização de filtros com poros com um tamanho pequeno destes, será contudo necessário fazer-se atenção a um trabalho cuidado, visto que basta poucas moléculas para levarem a uma reacção detectável.

De modo a poder ocorrer uma reacção de reticulação, é necessário que as partículas contidas no fluido de amostra disponham de pelo menos dois pontos de ligação de anticorpos, podendo assim funcionar como antigénios. As figuras la a d mostram em esquema que as substâncias ou 9 partículas estranhas ao corpo - como, por exemplo, bactérias, vírus, toxinas, proteínas - funcionam como antigénios e reagem com um anticorpo de acordo com o "princípio de chave" (fig. lb). Um anticorpo bivalente, como, por exemplo, um anticorpo IgG, liga neste caso dois antigénios (fig. lc) . Visto que cada antigénio pode ligar vários anticorpos, ocorre aqui uma reticulação (precipitação), a qual é detectada no processo segundo a invenção (fig. ld). Para os anticorpos com uma maior valência, ocorre de modo análogo uma precipitação. Caso o antigénio utilizado disponibilize um maior número de pontos de ligação de anticorpos, este trará a vantagem de assim haver uma melhor garantia da ocorrência de uma reacção de reticulação. 0 processo segundo a invenção adequa-se a antigénios opcionais, desde que os mesmos apresentem pelo menos mais de dois pontos de ligação de anticorpos. Preferencialmente, as partículas analisadas deverão ser maiores do que cerca de 10 nm e deverão ao mesmo tempo ser inferiores ao tamanho máximo escolhido para as partículas. As moléculas que são inferiores a 10 nm podem funcionar como haptenos. Os haptenos são antigénios incompletos, ou seja, o respectivo tamanho molecular não chega para desencadear uma reposta imunitária ou para levar a uma aglutinação. Estas substâncias de baixo peso molecular são altamente específicas no ponto de ligação paratopo do anticorpo, mas não se salientam suficientemente para fora deste ponto de ligação, de modo a que um segundo anticorpo se possa ligar a elas. Elas bloqueiam o respectivo anticorpo sem ser possível ocorrer uma reacção de reticulação. Os antigénios maiores, como, por exemplo, as bactérias, têm de ser química ou fisicamente destroçados antes da medição, o que 10 pode ser feito com diversos processos conhecidos do especialista, como, por exemplo, através de um tratamento com ultra-sons, ácidos, lixívias, agentes tensioactivos. Isto acarreta a vantagem de assim ser possivel obter dúzias de fragmentos a partir de uma única bactéria, não sendo mais necessário deixar aglutinar diferentes bactérias umas às outras. Os fragmentos assim obtidos, por exemplo, as proteínas de superfície, representam de novo antigénios mais pequenos e podem provocar com o anticorpo apropriado uma reacção especificamente mensurável.

Além disso, o antigénio deverá ser essencialmente solúvel no tampão utilizado e deverá apresentar apenas uma ligeira tendência de adsorção nas paredes dos equipamentos e filtros utilizados. O processo de acordo com a invenção abrange ainda a preparação de um fluido contendo anticorpos.

No processo segundo a invenção, é em princípio possível utilizar todos os anticorpos pretendidos. Os anticorpos que deram mostras de ser particularmente favoráveis na realização de um processo segundo a invenção, tratam-se, por exemplo, da imunoglobulina bivalente G (IgG) ou da imunoglobulina decavalente M (IgM). De acordo com um processo conhecido do especialista, é possível neste caso obter anticorpos com uma determinada especificidade. Além disso, também é possível - consoante o tipo da partícula a ser detectada - utilizar outros anticorpos que entram noutra classe de anticorpos. Neste caso, os anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais. Aquando da utilização de anticorpos monoclonais, é possível empregar dois anticorpos monoclonais dirigidos a diferentes antigénios, 11 de modo a originar uma precipitação. Como anteriormente mencionado em relação ao antigénio, o anticorpo também deverá ser fundamentalmente solúvel no tampão utilizado e ter uma baixa tendência de adsorção nas paredes dos equipamentos e filtros utilizados.

No processo segundo a invenção, é possível impedir um excesso indesejado de antigénios ou de anticorpos de diferentes formas, através, por exemplo, da realização de séries de diluições apropriadas. Um excesso destes de antigénios ou de anticorpos demasiado grande poderá aliás levar a uma inibição da precipitação (a um denominado "efeito prozona"), visto que, no caso dum grande excesso de anticorpos, cada epitopo (ponto de ligação de antigénio) liga de forma monovalente apenas um único anticorpo, e uma reticulação cruzada deixa de ser possível; ou visto que, no caso de um excesso demasiado grande de antigénios, o trímero é com frequência formado por uma molécula de anticorpo e por duas moléculas de antigénio.

Como fluido - tanto para o fabrico do fluido de amostra como para o fabrico do fluido contendo anticorpos - é possível empregar em princípio qualquer gás ou líquido. É dada preferência a que o fluido seja um líquido. Muitas vezes o líquido trata-se de água ou de soluções tampão conhecidas no estado da técnica, como, por exemplo, PBS (phosphate buffered saline, solução salina tamponada com fosfato), em particular se o processo de análise assentar numa reacção bioquímica. Em princípio, o líquido também se pode tratar doutro líquido transparente, por exemplo, de hidrocarbonetos líquidos, ácidos ou lixívias.

No processo segundo a invenção, faz-se contactar, numa 12 primeira etapa, o fluido de amostra com o fluido contendo anticorpos, podendo o anticorpo formar, na presença de um antigénio, um precipitado de antigénio-anticorpo, que pode então ser, por exemplo, detectado com o equipamento segundo a invenção.

Além disso, é contudo muitas vezes de interesse determinar a existência de haptenos numa amostra. Os haptenos são antigénios não completos, ou seja, são demasiado pequenos para que mais do que um anticorpo possa ser ligado. Os haptenos podem sobretudo ser fármacos, drogas, pesticidas, venenos ambientais, hormonas esteróides ou micotoxinas. Os haptenos ligam-se especificamente a anticorpos. No entanto, bloqueiam apenas o ponto de ligação paratopo do anticorpo, sem que possa ocorrer uma reacção em cadeia. 0 tamanho minimo dos imunogénios (antigénios completos) vai de 5 a 10 kDa, ou seja > 30 radicais aminoácido, ou seja > 3 nm de comprimento, pois a partir deste tamanho podem acoplar-se pelo menos duas moléculas de anticorpo a estes antigénios com os pontos de ligação epitopos existentes em conformidade, e pode desencadear-se uma reacção em cadeia, que leva muitas vezes a uma precipitação.

Uma determinação de haptenos pode ser feita, por exemplo, com multiespaçadores macromoleculares hidrófilos (hmM) ou com compostos aparentados conhecidos do especialista. Os multiespaçadores macromoleculares hidrófilos são conhecidos no estado da técnica e abrangem uma macromolécula hidrófila, como, por exemplo, a albumina. A esta macromolécula hidrófila ligam-se quimicamente - com os espaçadores conhecidos no estado da técnica - as mesmas moléculas de hapteno ou diversas moléculas de hapteno. Caso um multiespaçador macromolecular hidrófilo apresente pelo 13 menos duas moléculas iguais de hapteno, este poderá ser empregue com vista a uma precipitação. Uma molécula destas pode ser utilizada num teste de pesquisa de anticorpos, que se baseie numa reacção de deslocamento. No caso dos haptenos, existe um principio de medição que se baseia numa reacção de deslocamento, como seguidamente descrito a titulo de exemplo, observando-se picos de reacção apenas em amostras negativas; ou seja, apenas em amostras negativas ocorre uma detecção de produtos de reacção.

Se uma amostra de sangue ou de saliva é para ser analisada quanto a um hapteno, por exemplo, cocaína, adicionar-se-á à gotícula de sangue ou de saliva diluída um anticorpo dirigido à cocaína. Depois de cerca de 1 minuto, adiciona-se uma pequena quantidade de um hmM de cocaína sintético, ou seja, uma macromolécula hidrófila, ligada por espaçadores a moléculas de cocaína.

Se a cocaína se encontrar na amostra, esta funcionará como hapteno e bloqueará os pontos de ligação de anticorpos. A adição posterior do hmM de cocaína não mostra qualquer acção. Se, contudo, não houvesse cocaína na amostra, não ocorreria o bloqueio de pontos de ligação de anticorpos e a adição de hmM de cocaína levaria a uma formação em cadeia, que pode ser medida na forma do crescimento de partículas, com o processo segundo a invenção, como, por exemplo, com o equipamento Q-MAP seguidamente descrito.

No processo segundo a invenção, irradia-se um feixe de luz, em particular luz coerente, como, por exemplo, um raio laser, através do líquido a ser analisado. Seguidamente, o processo segundo a invenção é descrito com referência a um feixe de luz laser, não indo contudo isto excluir que 14 também se possa empregar outras fontes de luz apropriadas conhecidas do especialista no processo segundo a invenção. A titulo de exemplo, é possível preparar um raio laser do equipamento segundo a invenção, posteriormente descrito em detalhe e que também é designado por Q-MAP (quantitative measurement of attomolar precipitation-products) . Em alternativa, também é contudo possível empregar outros equipamentos com base na divulgação da invenção aqui presente, os quais podem ser desenvolvidos por um especialista a partir do reivindicado pela presente invenção. 0 laser manda um feixe através do líquido a ser analisado e determina o número das partículas aí existentes e o respectivo tamanho. Neste caso, ocorre uma medição de extinção no limite claro-escuro do cone luminoso, que se origina na passagem da luz gerada pelo laser através da câmara de medição contendo o fluido de reacção, através dum fotorreceptor (podendo o fotorreceptor apresentar um reforço ajustável do sinal e um ponto de trabalho ajustável), funcionando o equipamento como uma "célula de detecção molecular". Um equipamento Q-MAP, como seguidamente descrito, pode por exemplo determinar granulometrias entre 20 nm e 5 μιη, não sendo contudo possível fazer afirmações a partir desta medição acerca do estado ou da composição das partículas medidas. O laser e o fotorreceptor estão praticamente dispostos num eixo. O raio laser passa bem rente ao fotorreceptor. A luz emitida para a frente forma um cone, em cujo limite de claro-escuro se ajusta o fotorreceptor .

Cada partícula que se encontra num fluido na câmara de medição e que passa pelo raio laser, produz um sinal, 15 correspondendo o número de sinais à distribuição estatística das partículas na câmara de medição. Quando as partículas, também partículas ínfimas, se deslocam no foco do laser através do cone luminoso, as mesmas escurecem-no, quase como uma sombra. A alteração da luminosidade original (sem sombras de partículas) é medida. Um processador rápido, por exemplo um processador Pentium, pode distinguir até 10 000 passagens de partículas por segundo. As partículas pequenas mexem-se com maior rapidez do que as grandes, sendo o tempo de transição uma medida directa do tamanho das partículas.

Caso estejam várias partículas em simultâneo no raio laser, apenas a maior é medida. Com base nas mais diversas velocidades a que passam as partículas pelo raio laser, é possível determinar a respectiva granulometria pela equação de Stokes-Einstein bem conhecida do especialista. Nesta medição é menos importante a granulometria absoluta do que a alteração granulométrica (provocada pelo crescimento das partículas). O respectivo filtro serve de medida para determinar o início do crescimento das partículas. Quanto maiores forem os poros do filtro, maiores deverão ser os precipitados, de modo a distinguirem-se de "ruído de fundo". No caso de filtros de 100 - 200 nm, muito poucas partículas em crescimento são suficientes para gerarem um sinal mensurável. Visto que as partículas se encontram distribuídas de forma estatística, também ocorre sempre um crescimento das partículas no foco do laser, que se encontra a meio da câmara de medição. A velocidade a que as partículas passam o raio laser é detectada, ao medir-se o tempo de transição em que a partícula percorre o feixe (do início da alteração de 16 luminosidade até ao fim da mesma).

Neste caso, verifica-se que quanto mais límpida for a solução, mais provável é que as partículas se encontrem individualmente no raio laser; ou então quanto mais turva estiver a solução, mais os sinais se sobrepõem, o que leva a uma reduzida sensibilidade. A força do sinal depende da dimensão e do número dos precipitados de antigénio-anticorpo.

No caso de uma concentração constante de anticorpos, a redução do sinal de medição está directamente relacionada com a concentração de antigénios.

Numa detecção segundo a invenção, é possível proceder, neste caso e por exemplo, da seguinte forma: todos os fluidos a serem analisados são injectados, através de filtros com poros com um determinado tamanho, na câmara de medição, pelo que, numa detecção do fluido de amostra ou do fluido de anticorpos, por sua vez sozinho, surgem numa análise apenas sinais que mostram partículas inferiores a uma determinada granulometria. No processo segundo a invenção, tanto os anticorpos utilizados como os antigénios utilizados mostram um tamanho inferior ao limite granulométrico determinado, sendo assim mais pequenos do que o tamanho dos poros do filtro utilizado na separação (por exemplo, inferiores a 200 nm), pelo que não são removidos aquando da separação.

Um exemplo de uma imagem que é obtida numa detecção deste tipo de um fluido de amostra à base de uma solução de NaCl, é mostrado pela figura 2a. Nestas imagens, a granulometria 17 encontra-se no eixo das abcissas e o número de partículas no eixo das ordenadas. Como se pode observar na fig. 2a, existem apenas partículas até uma granulometria máxima determinada, ocorrendo uma redução do número de partículas em função de quanto maior for a granulometria das partículas. Um resultado de detecção análogo é obtido para o fluido de anticorpos filtrado e, com isso, contendo fundamentalmente apenas partículas com uma determinada granulometria (não mostrado).

Depois de se injectar em separado e em simultâneo o fluido de amostra ou o fluido de anticorpos, ocorre uma reacção na câmara de medição mediante formação de microprecipitações, e ocorre uma detecção do tamanho e do número de precipitados formados de antigénio-anticorpo.

Um resultado de medição deste género encontra-se ilustrado, por exemplo, pela fig. 2b, onde é possível reconhecer o aparecimento de partículas que são maiores do que o limite granulométrico determinado de, por exemplo, 200 nm. A formação de partículas maiores mostra, portanto, que ocorreu uma reacção. Caso, em contrapartida, não ocorra qualquer reacção para partículas maiores, o líquido analisado estará isento do respectivo antigénio.

As medições podem ser iniciadas a qualquer momento, depois do enchimento da câmara de reacção com o fluido de amostra e o fluido de anticorpos. Em conformidade com uma forma de execução da presente invenção, as medições são iniciadas apenas, por exemplo, passados 60 segundos do enchimento da câmara de medição, visto que ligeiras oscilações na velocidade de injecção podem levar a diferenças de convecção na câmara de medição. Passados, por exemplo, mais 18 de 60 segundos, atinge-se o máximo de precipitação. A redução, que ocorre depois disso, do sinal de medição permite uma detecção ou uma avaliação quantitativa aproximada das diferentes concentrações de antigénios. Neste caso, a concentração de partida dos dois participantes de reacção desempenha um papel decisivo. Quanto maior forem estas concentrações de partida, maior será o tempo até à redução mensurável do máximo de precipitação.

Na realização do processo segundo a invenção, constitui uma vantagem que os fluidos utilizados tenham a maior pureza possível e que tenham sido, por exemplo, filtrados antes da respectiva utilização com um filtro com poros de tamanho adequado, por exemplo de 200 nm, de modo a eliminar ou a minimizar o ruído de fundo na detecção. Além disso, os materiais dos equipamentos, utilizados durante o processo segundo a invenção, deverão libertar o menor número de partículas possível. A título de exemplo, a câmara de medição pode ser de PTFE (politetrafluoroetileno) . De modo a impedir que os materiais utilizados (por exemplo, da câmara de medição) libertem com o tempo partículas, é ainda possível manter o tempo de medição o mais curto possível.

Além disso, as concentrações das soluções de antigénios ou de anticorpos utilizadas deverão ser baixas ao ponto de, face ao ocorrer duma reacção de antigénio-anticorpo, não se originem precipitados em demasiado número ou demasiado grandes, dado que, caso contrário, se podem encontrar várias partículas duma vez só no percurso do feixe, sendo apenas com grande dificuldade possível determinar um tempo de transição. A maior sensibilidade do processo de acordo com a invenção está na gama femtomolar e attomolar. 19 É particularmente favorável que o processo de acordo com a invenção também permita determinações quantitativas ou semiquantitativas. É possível utilizar, por exemplo, dois processos para avaliar uma detecção quantitativa. No primeiro processo de avaliação, determina-se a área (F) abaixo da curva de medição nos momentos tl e t2 (por exemplo no momento tl = 120 sequndos e t2 = 180 segundos), obtendo-se através de

Fn = (Fti + Ft2) : 2, um bom valor aproximado FN para uma área, a partir do qual se pode obter então um valor quantitativo para o número de partículas. No caso destas concentrações extremamente baixas, o crescimento das partículas é linear, ou seja e por exemplo, um duplicar da concentração leva ao dobro da área de um sinal de medição.

Um método alternativo e/ou complementar para obter uma determinação quantitativa, tem a ver com as soluções serem diluídas durante o tempo necessário até se atingir o limite cinético da reacção bimolecular. No caso de concentrações inferiores a 100 attomolar, os comprimentos de trajectória óptica livres dos participantes da reacção tornam-se demasiado grandes (> 100 pm), não ocorrendo precipitação mensurável no tempo de medição pré-estipulado. No caso de concentrações superiores a 10 nanomolar, o impedimento estérico começa através de produtos de reacção em demasiada quantidade e demasiado grandes e instala-se ainda o "efeito prozona" anteriormente descrito. No caso de uma solução, por exemplo, de 10 micromolar, o comprimento da trajectória óptica livre de uma partícula é apenas ainda de 100 nm. 20 O grau de diluição determinado neste ponto final fisico depende apenas ainda da temperatura e da convecção, dado que a viscosidade no caso de grandes diluições, por exemplo, em PBS (phosphate buffered saline, solução salina tamponada com fosfato) não desempenha qualquer papel. Quando estes dois parâmetros se mantêm constantes, a força da diluição das soluções de partida constitui uma medida directa da concentração das respectivas soluções.

Uma determinação exacta quantitativa da concentração de amostras é possível com o processo segundo a invenção, por meio de uma solução de calibração com uma concentração conhecida da respectiva proteina, aplicando-se um procedimento conhecido do especialista.

De acordo com outra concepção do processo, é possível realizar medições contínuas e/ou múltiplas de amostragem do fluido na câmara de medição. Deste modo, é sobretudo possível determinar o ponto final da reacção e formar valores médios das detecções. Preferencialmente, sujeita-se logo o fluido de suporte, essencialmente isento de partículas com uma granulometria superior ao valor determinado, antes da adição dos anticorpos e/ou da adição da amostra, a uma medição e utiliza-se o resultado desta medição como valor de referência para a medição do precipitado.

No processo segundo a invenção, chegam quantidades relativamente pequenas de fluido e é possível reduzir os custos para a remoção das substâncias, cujas partículas têm uma granulometria que ultrapassa um determinado valor, do fluido utilizado. Para a remoção destas substâncias, o fluido utilizado também pode ser conduzido através, por 21 exemplo, de ligação de equipamentos de válvula através dum bypass com um filtro, o qual filtra as substâncias em causa. A filtragem do fluido utilizado pode ser realizada antes da alimentação da amostra durante um certo tempo pré-determinado, de modo a garantir que já não existam substâncias que afectam a medição. É possível remover da amostra as substâncias cujas granulometrias excedem o valor determinado, em particular através de filtros, os quais se encontram integrados nos pontos de alimentação ou os precedem. 0 fluido de amostra assim obtido também pode ser filtrado depois da alimentação da amostra, durante um certo tempo, de modo a remover as substâncias prejudiciais, que com a amostra ou a partir do sistema de condução poderiam chegar ao fluido.

De acordo com outra concepção do processo, o fluido de suporte volta a ser filtrado, depois da adição de um anticorpo que tenha levado ou não à detecção de um antigénio, até se adicionar outro anticorpo. Deste modo, é possível remover substâncias que tenham entretanto entrado no fluido de suporte, as quais possam afectar a medição. Além disso, é deste modo possível remover um produto de reacção detectado do fluido utilizado, de modo a analisar outros eventuais componentes da amostra. 0 processo em conformidade com a invenção adequa-se a múltiplas aplicações na área da análise da água (detecção de constituintes e elementos nocivos), da tecnologia de bens alimentares (detecção de microorganismos, constituintes) ou em testes biológicos ou médicos (por exemplo, detecção de determinadas sequência de ADN ou de ARN, bactérias ou alergénios (testes de alergias)). Além disso, são ainda possíveis aplicações na área de 22 multiespaçadores macromoleculares hidrófilos, sondas de ADN ramificado ou de um PCR quantitativo. Em particular, o processo segundo a invenção pode ser igualmente utilizado na detecção da proteína prião infecciosa PrPSe no teste da BSE. Dado que, no processo segundo a invenção, é possível detectar quantidades extremamente pequenas destes priões, o processo segundo a invenção também se adequa a uma detecção da proteína prião infecciosa PrPSe a partir de sangue.

Além disso, o processo de medição Q-MAP segundo a invenção proporciona uma possibilidade rápida e simples de testar o comportamento de adsorção de diversas proteínas em diferentes superfícies. As superfícies muito polidas poderiam assim ser testadas sem problemas relativamente a um "valor de adsorção proteica", indo os desvios do valor teórico indicar um defeito da superfície. Assim, é possível detectar de forma simples e rápida defeitos em superfícies metálicas finas e vaporizadas.

Além disso, também é possível testar a imobilização completa de determinadas proteínas na respectiva superfície, o que tem grande peso, por exemplo, na área de análise de ADN e na tecnologia de biochips.

Outra possibilidade de aplicação do processo segundo a invenção pode ter a ver com poder-se determinar a influência de químicos sobre uma superfície. São sobretudo considerados, por exemplo, os testes de antes-e-depois para detectar alterações provocadas por um tratamento de superfícies, visto que uma área corroída apresenta uma maior superfície do que uma não corroída, estando assim passível de adsorção uma maior quantidade de material de antigénio, por exemplo proteínas, nesta superfície. Neste 23 caso, é possível determinar, por exemplo, a quantidade das proteínas que permanecem livremente em solução.

Ainda outra possibilidade de aplicação tem a ver com o facto de o processo segundo a invenção permitir poder-se também testar o estado da superfície interna de mangueiras e tubos.

Depois do fim do processo segundo a invenção, é possível dissolver as precipitações de antigénio-anticorpo com, por exemplo, a proteinase K no caso de substâncias que não são destruídas pela proteinase K (por exemplo, priões e substâncias que não contêm aminoácidos), e sujeitá-las a outras etapas de tratamento e de análise.

Outra vantagem importante do processo segundo a invenção, como acima expressamente descrito, é o de permitir igualmente detecções quantitativas. Além disso, o processo pode ser levado a cabo de forma totalmente automática, o que leva a uma clara economia de custos de trabalho, preparando-se assim um processo que pode ser realizado de forma comparativamente barata. 0 processo segundo a invenção permite ainda uma detecção de agentes patogénicos a partir de líquidos ou de excreções corporais, em particular do sangue, em quantidades muito reduzidas. Isto constitui uma vantagem muito importante, dado que pequenas quantidades de sangue, por exemplo uma gotícula de sangue (cerca de 10 - 20 μΐ) pode ser tirada de forma simples com um tubo da cabeça dum dedo ou do lóbulo duma orelha, sem que seja necessário para isso um médico ou um enfermeiro com formação. Os testes deste tipo podem ser por exemplo realizados de forma simples numa farmácia ou 24 então também em lares de idosos ou em clínicas de reabilitação, e fornecem de forma simples e rápida um diagnóstico acerca de se em causa está uma infecção provocada por uma certa bactéria. Especialmente vantajoso é o facto de tanto a colheita de amostra como também a realização do processo segundo a invenção com o equipamento segundo a invenção, não requererem pessoas de formação médica ou altamente qualificadas. Em alternativa, também é naturalmente possível determinar com um teste destes outras substâncias no sangue com anticorpos específicos, como, por exemplo, drogas ou medicamentos.

Enquanto que, nos equipamentos de medição correntes, a relação entre antigénio e anticorpo não pode diferir mais do que num factor de 2 ou 3, com o Q-MAP são ainda também possíveis medições quando existem desvios da relação de mistura ideal entre o antigénio e o anticorpo de 100. (Mantendo-se igual a concentração de anticorpos, a concentração ideal de antigénios foi baixada para 1% e aumentada até 10 000%. O mesmo foi também inversamente realizado, mantendo-se igual a concentração de antigénios). Este desvio interessante da "curva de Heidelberger" na gama femtomolar e attomolar, provocado pelos reduzidos impedimentos estéricos das moléculas, torna supérfluas séries de diluições morosas. O processo de acordo com a invenção adequa-se em particular a uma análise de amostras acumuladas (pools de amostras), o que tem interesse sobretudo em análises de sangue conservado (por exemplo em relação ao HIV ou à hepatite) e amostras de teste da BSE. Com o processo conforme a invenção, é possível realizar cerca de 50 medições por segundo, o que significa que, no caso de um dia de 8 - 10 25 horas, é possível realizar pelo menos 400 análises por dia ou mais de 80 000 medições por ano. No caso de 10 - 100 amostras acumuladas por medição, é portanto possível analisar 800 000 - 8 000 000 amostras com apenas um equipamento de medição por ano.

No caso de uma análise a sangue conservado, é possível adicionar, por exemplo, 10 anticorpos diferentes (contra 10 doenças diferentes) duma vez a uma unidade de sangue conservado, de modo a verificar se esta pode ser utilizada. No caso de uma reacção positiva, é necessário deitar fora esse sangue conservado, visto ser indiferente se este se encontra contaminado com HIV ou com hepatite. Caso ainda haja interesse em saber qual o agente patogénico que provocou a reacção positiva, será possível adicionar os anticorpos individualmente. Caso se faça o pool (acumulação), por exemplo, de 100 unidades de sangue conservado e se empregue ao mesmo tempo 10 anticorpos diferentes, será possível determinar com apenas uma medição, que dura cerca de 60 segundos, se todas as 100 unidades de sangue podem ser utilizadas.

Um teste em que é suficiente uma quantidade assim pequena de produto e que apresenta uma sensibilidade de forma correspondente elevada até à gama femtomolar ou attomolar, não é até à data conhecido do estado da técnica e representa um avanço importante.

Além disso, a presente invenção abrange um produto de programa de computador, o qual abrange meios de códigos de programa que são armazenados num meio de leitura informático, de modo a ser possível realizar o processo segundo a invenção se o produto de programa informático 26 correr num computador, num equipamento de rede ou num equipamento, em particular num equipamento de análise. Além disso, a presente invenção também disponibiliza um produto de programa de computador que inclui um código de programa e que pode ser descarregado dum servidor, de modo a ser possível realizar o processo segundo a invenção, se o produto de programa de computador correr num computador, num equipamento de rede ou num equipamento, em particular num equipamento de detecção de análise (por exemplo num equipamento de detecção descrito no presente pedido). A presente invenção é ainda relativa a um equipamento para a detecção de pequenas quantidades de partículas, o qual também é designado por equipamento Q-MAP (quantitative measurement of attomolar precipitation products).

Um equipamento deste tipo inclui uma fonte de luz, empregando-se preferencialmente um laser como fonte de luz. A câmara de medição dum equipamento deste tipo deverá ser fabricada num material que em princípio não liberte partículas e que permita a passagem de um feixe de luz, em particular dum raio laser. Este tipo de materiais é conhecido do especialista. A título de exemplo, a câmara de medição pode ser feita de PTFE (politetrafluoroetileno) . A câmara de medição apresenta um volume inferior a 100 μΐ, de preferência de 30 - 50 μΐ, em particular de 40 μΐ. O equipamento de acordo com a invenção apresenta em particular um fotorreceptor, o qual apresenta um reforço ajustável de sinal e um ponto de trabalho ajustável. O fotorreceptor pode ser escolhido, por exemplo, do grupo 27 composto por detectores térmicos, fotodiodos, em particular detectores de fotorresistência, detectores fotovoltaicos, díodos de avalanche, circuitos de diodos, fotomultiplicadores.

Um equipamento de detecção de acordo com a invenção permite sobretudo uma determinação de partículas entre 20 nm e 5 pm.

Adicionalmente, a presente invenção também disponibiliza um kit para a detecção qualitativa e/ou quantitativa de uma determinada partícula a ser detectada, como, por exemplo, de uma proteína ou hormona, apresentando as partículas em questão pelo menos dois pontos de ligação de anticorpos. O kit abrange um equipamento de detecção, como anteriormente descrito, pelo menos um anticorpo que se pode ligar especificamente à partícula em causa, e pelo menos um fluido apropriado para colheita da amostra. Um kit deste género pode estar concebido em especial para certas necessidades dum utilizador, e contém componentes conjugados e uma descrição correspondente para o utilizador, o qual pode com este kit realizar de imediato e de forma muito simples as detecções de acordo com a invenção. A título de exemplo, um kit deste género pode ser utilizado para determinar um certo agente patogénico numa pequena quantidade de sangue, ou nas aplicações acima descritas para análise de superfícies.

Descrição minuciosa da figura 3 A invenção é seguidamente explicada em maior detalhe com base no desenho em esquema anexo, o qual é exemplificativo e não restritivo, de uma instalação para a realização do 28 processo segundo a invenção. 0 dispositivo de troca de amostras 1 pode injectar tanto diferentes soluções de antigénios (por exemplo, amostras de sangue) como também diferentes soluções de anticorpos nos respectivos recipientes de mistura 2 ou 3, com vista a analisar uma amostra consecutivamente em relação a diversos agentes patogénicos possíveis. Os recipientes de mistura 2 ou 3 para as soluções de anticorpos ou de antigénios podem ser utilizados não só para diluição das respectivas soluções, como também para lavagem da câmara de medição com tampão (PBS) ou solução de anticorpos.

Os filtros 4 podem ser trocados e apresentam, por exemplo, poros com um tamanho de 200 nm. A válvula 5 pode ser ligada de modo a que as soluções possam fluir individualmente ou em conjunto para a câmara de medição 6, ocorrendo uma detecção com o equipamento de detecção de forma permanente, por colheita de amostra única ou múltipla. A bomba 7 é, por exemplo, uma pequena bomba de vácuo que aspira todas as soluções. Está coordenada com a válvula 5 e bombeia, depois de decorrida a medição, o conteúdo da câmara de medição para o recipiente colector 8. Este pode estar provido, por exemplo, dum liquido desinfectante ou germicida, de modo a tornar logo inócuas todas as substâncias possivelmente perigosas.

Caso o anticorpo alimentado com um antigénio da amostra reaja, passando a um precipitado de antigénio-anticorpo, formar-se-ão partículas com uma granulometria que excede o valor determinado. Estes precipitados produzem um sinal, que se distingue de forma clara dos sinais de partículas 29 com uma granulometria inferior ao valor determinado, que ainda eventualmente existam no fluido de suporte. Em consequência disto, os produtos de reacção são inequivocamente detectados pelo equipamento de detecção. Da detecção resulta que uma determinada substância se encontra na amostra e, eventualmente, também é possível determinar o respectivo teor de acordo com os métodos acima descritos.

Caso, depois da injecção de uma primeira solução de anticorpos, o equipamento de detecção não detecte partículas acima da granulometria determinada, ou caso se suspeite de outros antigénios que não provocam com o anticorpo utilizado uma reacção específica na amostra, é possível alimentar seguidamente outra solução de anticorpos. Antes disso, é possível remover precipitados eventualmente detectados, através da lavagem destes para fora da câmara de medição.

Os exemplos que se seguem servem para explicar a presente invenção. No entanto, de forma alguma se contempla uma restrição do âmbito de protecção da presente invenção ao objecto dos exemplos.

Exemplos

Exemplo 1: Teste de sangue da BSE A população de bovinos na Alemanha é de cerca de 15 milhões. 2 a 3 milhões de testes da BSE (ELISA e Western Blot) são realizados anualmente na Alemanha nos cérebros de animais mortos. Um teste rápido da BSE (ELISA ou Western Blot) dura actualmente 6 a 8 horas. Com o processo segundo a invenção, o agente patogénico da BSE pode ser detectado 30 no animal vivo com apenas uma gota de sangue, em dois minutos, sendo os custos apenas uma fracção.

Exemplo 2: Testar unidades de sangue conservado quanto à nova doença de Creutzfeld-Jakob (nCJD)

Existem diversas medidas para proteger a população do risco concebível de uma transmissão da nCJD através do sangue. A medida mais promissora era a de testar cada doação de sangue individualmente à procura de infecção, como no caso da hepatite ou da SIDA. Contudo, o agente patogénico encontra-se nos doentes apenas em quantidades muito baixas. Não existem testes fiáveis no estado da técnica. O processo segundo a invenção é capaz de detectar o agente patogénico no sangue ou em derivados sanguíneos.

Exemplo 3: Aplicações na industria de bens alimentares

As micotoxinas são produtos de degradação altamente tóxicos de certos fungos. As microtoxinas são haptenos e podem, por isso, ser detectadas de forma qualitativa e quantitativa com o processo de medição acima descrito.

Em análises de rastreio de, por exemplo, cargas inteiras de navios de café, chá, farinha ou nozes, é suficiente um teste qualitativo que pode ser realizado em cerca de 2 minutos no local.

De modo a determinar se um animal foi ilegalmente engordado com hormonas, é necessário analisar uma amostra de carne à procura de cerca de 15 hormonas em questão diferentes. As hormonas também são haptenos e podem ser detectadas de 31 forma qualitativa e quantitativa com o processo segundo a invenção. Também são necessários testes hormonais para, por exemplo, testes de gravidez e análises da glândula tiróide.

Dado que os maiores matadouros processam 2 000 - 3 000 bovinos por mês, são necessárias cerca de 50 - 100 colheitas de amostra, de modo a descobrir engorda ilegal. De momento, o preço de um teste hormonal (de 15 hormonas diferentes) é de 600 euros por pedaço de carne. Por isso, os matadouros realizam apenas 5 a 10 colheitas de amostra por mês, o que é demasiado pouco para detectar uma engorda ilegal. Em conversações com grandes matadouros, houve a manifestação de interesse em testes com um preço 10 vezes mais barato (cerca de 60 - 70 euros por pedaço de carne) com base no processo segundo a invenção. Os testes hormonais convencionais nunca conseguem este preço.

Exemplo 4: Detecção de fitofármacos

Monómeros de tubulina são pequenas esferas de albumina individuais, as quais crescem até formarem cadeias compridas, devido a uma reacção com o transporte energético GTP. Os inibidores e outras toxinas afectam ou impedem este crescimento em cadeias. As diferentes cadeias entrelaçam-se formando estruturas tipo corda, os denominados protofilamentos. Estes protofilamentos ligam-se, por seu lado, formando microtubos, que desempenham um papel decisivo na divisão celular. Ao impedir os monómeros de formar cadeias, influencia-se a divisão celular e mata-se o infestante.

Ao inverso, este processo também confere a possibilidade de detectar resíduos de fitofármacos em bens alimentares, 32 garantindo-se assim uma maior protecção do consumidor. Com o processo segundo a invenção, é possível medir directamente o crescimento em cadeia acima descrito ou o impedimento do mesmo.

Lisboa, 14 de Maio de 2007

Claims (10)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a detecção de quantidades de partículas na gama femtomolar e attomolar, através da detecção de precipitados de antigénio-anticorpo, o qual inclui: preparação de um fluido de amostra, que contém essencialmente partículas com uma determinada granulometria máxima, tendo as partículas pelo menos dois pontos de ligação de anticorpos; preparação de um fluido contendo anticorpos, o qual contém essencialmente partículas com uma determinada granulometria máxima; contacto do fluido de amostra com o fluido contendo anticorpos, obtendo-se um fluido de reacção, podendo o anticorpo formar, na presença de uma partícula com pelo menos dois pontos de ligação de anticorpo, um precipitado de antigénio-anticorpo; condução de um feixe de luz através do fluido de reacção; detecção de um sinal através de medição de extinção no limite claro-escuro do cone luminoso, que se origina na passagem da luz gerada pelo laser através da câmara de medição contendo o fluido de reacção, através dum fotorreceptor, estando a força de sinal dependente da dimensão e do número dos precipitados de antigénio-anticorpo formados, e determinando-se o tamanho e o número das partículas pela medição do tempo de transição. em que a que contém determinada uma Processo de acordo com a reivindicação 1, etapa de preparação de um fluido de amostra, essencialmente partículas com uma 2.

2 granulometria máxima, inclui: a) preparação de um fluido, introdução de uma amostra no fluido e separação das partículas que excedem uma determinada granulometria, para obtenção de um fluido de amostra que contenha essencialmente apenas partículas com uma determinada granulometria máxima, ou b) preparação de um fluido, que contém fundamentalmente partículas com uma determinada granulometria máxima, e introdução de uma amostra no fluido, que contém essencialmente partículas com uma determinada granulometria máxima, para obtenção de um fluido de amostra que contém essencialmente partículas com uma determinada granulometria máxima.

3. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores 1 e 2, em que a separação das partículas com um tamanho acima da granulometria máxima determinada ocorre por filtração, tendo o filtro preferencialmente poros com um tamanho de 20 - 450 nm, com maior preferência de 100 - 300 nm, em particular de 200 nm.

4. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores 1 a 3, empregando-se como anticorpos pelo menos dois anticorpos monoclonais ou um anticorpo policlonal.

5. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores 1 a 4, sendo o anticorpo escolhido do grupo composto por imunoglobulina G ou imunoglobulina M. 3

6. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores 1 a 5, permitindo o processo uma detecção quantitativa e semi-quantitativa da quantidade de partículas.

7. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores 1 a 6, em que, no caso de uma concentração constante de anticorpos, a redução do sinal de medição está directamente relacionada com a concentração de antigénios.

8. Produto de programa de computador, o qual abrange meios de código de programa que estão armazenados num meio de leitura informática, para executar o processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, se o produto de programa de computador correr num computador, num equipamento de rede ou num equipamento, em particular num equipamento de detecção analítico.

9. Produto de programa de computador, o qual inclui um código de programa e é descarregado de um servidor, para executar o processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, se o produto de programa de computador correr num computador, num equipamento de rede ou num equipamento, em particular num equipamento de detecção analítico.

10. Kit para a detecção qualitativa e/ou quantitativa de uma determinada partícula a ser detectada, apresentando a determinada partícula pelo menos dois pontos de ligação de anticorpos, e incluindo o kit: pelo menos um anticorpo, que se pode ligar de forma específica à determinada partícula, e 4 pelo menos um fluido adequado à colheita da amostra, e um equipamento para detectar pequenas quantidades de partículas, o qual engloba: um laser, uma câmara de medição, e um fotorreceptor, concebido para a realização da medição de extinção no limite claro-escuro do cone luminoso, que se origina na passagem da luz gerada pelo laser através das partículas numa câmara de medição contendo fluido, estando o fotorreceptor disposto em relação ao laser de modo a que o raio laser passe mesmo rente ao fotorreceptor. Lisboa, 14 de Maio de 2007