PT1585770E

PT1585770E - Moléculas de reconhecimento para o tratamento e detecção de tumores

Info

Publication number: PT1585770E
Application number: PT04704545T
Authority: PT
Inventors: Steffen Goletz; Uwe Karsten; Renate Stahn; Antje Danielczyk
Original assignee: Glycotope Gmbh
Priority date: 2003-01-23
Filing date: 2004-01-23
Publication date: 2009-03-18
Also published as: DK1585770T3; EP2053063A1; SI2053063T1; CY1114409T1; ES2427832T3; US20150005474A1; EP2053063B1; DE10303664A1; US20060292643A1; DK2053063T3; US9845361B2; ATE421537T1; CY1108965T1; SI1585770T1; PT2053063E; DE502004008910D1; EP1585770B1; ES2321298T3; WO2004065423A2; EP1585770A2

Description

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DESCRIÇÃO "MOLÉCULAS DE RECONHECIMENTO PARA O TRATAMENTO E DETECÇÃO DE TUMORES" A invenção diz respeito a moléculas de reconhecimento direcionadas para tumores, e também diz respeito a composições farmacêuticas que compreendem as referidas moléculas de reconhecimento, métodos para a produção das referidas moléculas de reconhecimento, e à utilização das referidas moléculas de reconhecimento no diagnóstico e terapia de doenças tumorais.

As doenças tumorais pertencem às doenças mais frequentes dos organismos, especialmente de mamíferos tais como os seres humanos. Em particular, um tratamento bem sucedido de uma doença tumoral depende do estado do desenvolvimento tumoral em que a terapia foi iniciada. É vantajoso quando a terapia pode ser iniciada em um ponto no tempo em que o tumor tem uma expansão e difusão mínimas dentro do corpo, com a expansão a ser entendida como sendo o tamanho individual de um tecido tumoral, e a difusão sendo entendida como sendo a metastasização ou infiltração possíveis em órgãos circundantes. Um organismo que sofre de uma doença tumoral secrega, substâncias bastante complexas ou moléculas bastante simples particulares que podem ser utilizadas no diagnóstico de tumores em fase precoce da doença, isto é, de tumores relativamente pequenos em tamanho. Os mais conhecidos dentre estas estruturas são os marcadores tumorais. Em geral, os marcadores tumorais são substâncias químicas que são mais ou menos específicas para um determinado tipo de tumor ou que apresentem maior presença, em associação com um tumor. Por exemplo, os marcadores tumorais podem ser celulares na natureza, tais como oncogenes, determinados 2 receptores hormonais ou antigénios de membrana, tais como o CA 2, CA 3, CA 19-19 e outros. No entanto, os marcadores tumorais também podem ser marcadores humorais sendo quer produzidos por um tumor ou induzidos por um tumor. Mais especificamente, o grupo de marcadores tumorais que produziu tumores inclui antigénios, hormonas, enzimas e outros compostos associados a tumores. Por exemplo, os marcadores tumorais humorais induzidos por tumores são enzimas, tal como a fosfatase alcalina ou por exemplo, a proteína de fase aguda (por exemplo, a ferritina). Na técnica anterior, os marcadores tumorais são detectados preferencialmente utilizando métodos imunológicos, razão pela qual o sinónimo "antigénio de tumor" é frequentemente utilizado para designar os marcadores tumorais. Os antigénios tumorais bem conhecidos são antigénios oncofetais, antigénios associados ao tipo de sangue, antigénios específicos de órgãos e outros antigénios, tal como o CA 15-3, por exemplo.

Os diagnósticos de cancro utilizando marcadores tumorais envolve várias desvantagens. Assim, alguns marcadores tumorais podem também estar presentes em doenças não-cancerígenas, pelo que as moléculas de reconhecimento empregues indicam uma reacção positiva; além disso, as moléculas de reconhecimento de não-interacção não indicam a ausência de uma doença tumoral. Uma outra desvantagem é que as moléculas de reconhecimento bem conhecidas são normalmente não-específicas. Ou seja, a detecção positiva raramente indica um tipo específico de doença tumoral. Além disso, uma outra desvantagem e crucial de moléculas de reconhecimento bem conhecidas é a sua utilidade limitada na monitorização do desenvolvimento de tumores, por exemplo posteriores à cirurgia. Como regra, a utilização de marcadores tumorais bem conhecidos, portanto, não é possível no reconhecimento precoce ou na reabilitação, especialmente na profilaxia. 3

Para além das desvantagens gerais acima, existem algumas desvantagens especificas nas moléculas de reconhecimento orientadas para antigénios tumorais diferindo apenas na sua glicosilação de um antigénio correspondente no tecido normal. Os anticorpos são requeridos para serem dependentes da glicosilação e devem reflectir a alteração no estado de glicosilação do antigénio em um tumor. Assim, por exemplo, a glicosilação de MUC1 nas células tumorais da mama é alterada. Há uma redução massiva no comprimento da cadeia de O-glicanos e uma redução de ácido siálico de O-acetilação.

Uma outra desvantagem das moléculas de reconhecimento bem conhecidas para os marcadores tumorais é que não tornam o tumor reconhecível até que ele já tenha atingido uma dimensão critica. Ou seja, as fases iniciais de crescimento tumoral não podem ser determinadas com as moléculas de reconhecimento bem conhecidas orientadas para os marcadores tumorais. A mucina MUC1 epitelial polimórfica, na forma da molécula global, é um marcador tumoral bem-estabelecido. Von Price M. et al., Tumor Biology 1989, 19 (1): 1-20, analisam um grande número de anticorpos monoclonais contra a mucina MUC1 descrita. Como consequência da complexidade da molécula, que é muito grande, altamente glicosilada, consiste essencialmente de um grande número de repetições paralelas polimórficas de resíduos de 20 aminoácidos no estado extracelular, e tem glicosilação heterogénea no que diz respeito às repetições paralelas, o MUC1 tem uma variedade de epítopos. Uma desvantagem existente é o facto de que não se sabe qual o epítopo no MUC1 que tem uma adequabilidade óptima como uma estrutura alvo para a terapia e o diagnóstico tumoral. Uma outra desvantagem é que os anticorpos específicos de MUC1 convencional (que fornecem relativamente bom reconhecimento de MUC1 nos tumores particulares) também dão elevados níveis de reconhecimento de tal 4 MUC1 libertado no soro por células tumorais (contagioso). Obviamente, tais niveis elevados de ligação da MUC1 presente no soro em pacientes com tumores é desvantajoso na terapia de doenças tumorais utilizando tais anticorpos específicos de MUC1. Um outro inconveniente é que a maioria dos anticorpos específicos de MUC1 apresentam também, ligação a vários tecidos normais. 0 objectivo da invenção é, portanto, o de fornecer moléculas de reconhecimento que, por um lado, permitem a fácil, fiável e eficaz detecção de tumores, e, além disso, podem ser usadas na profilaxia, terapia e/ou reabilitação de tumores e dar nenhuns ou somente baixos níveis de ligação ao MUC1 libertado no soro e nenhuns ou baixos níveis de ligação ao tecido normal. A invenção resolve o problema técnico acima, proporcionando moléculas de reconhecimento que compreendem uma sequência de aminoácidos a qual contém a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 1 ou 2 e a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 3 ou 4, e a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 5 ou 6, ligando especif icamente as referidas moléculas de reconhecimento o epítopo do tumor de MUC1 glicosilado de forma que a força da ligação comparada com a ligação do péptido não-glicosilado igual em comprimento e a sequência de péptido por um fator de > 20 é aumentada.

Com as mudanças necessárias, as definições dos termos dados a seguir também se aplicam às declarações dadas acima, àquelas dadas aqui e a seguir.

De acordo com a invenção, o termo molécula de reconhecimento é entendido como referindo-se a uma molécula a qual, especialmente sob condições estritas, especificamente liga o epítopo do tumor de MUC1 glicosilado. Por exemplo, condições estritas são concentrações 5 elevadas de sal e lavagem excessiva usando detergentes leves, tais como o NP-40 ou o Tween.

De acordo com a invenção, "epítopo do tumor de MUC1 glicosilado" é entendido como sendo um epitopo o qual compreende pelo menos uma sequência de PDTRP de repetição paralela de MUC1 e é glicosilado com GalNAc ou Gal-GalNAc na treonina de PDTRP.

De acordo com a invenção, a ligação especifica do epitopo do tumor de MUC1 glicosilado é entendida como sendo a ligação das moléculas de reconhecimento da invenção, que compreende uma combinação das seguintes propriedades de ligação: a) A ligação nos métodos de ensaio, conforme descrito no Exemplo 5 à região de PDTRP glicosilada dentro de uma sequência de repetição paralela de MUC1 consiste de 1 a 1,5 repetições paralelas (molécula composta de 30 aminoácidos, ver o exemplo 5) e é glicosilada com GalNAcalphal-O-Thr (referido como GalNAc aqui a seguir) ou Galbetal-3GalNAcalfal-O-Thr (designado por Gal-GalNAc aqui a seguir) na treonina, a força de ligação sendo aumentada muitas vezes quando comparada com o péptido não-glicosilado do mesmo comprimento e a sequência de péptido. Conforme definido aqui, "multiplicado várias vezes" significa que a proporção da ligação do glicopéptido de MUC1 glicosilado por PDTRP para o péptido não-glicosilado atinge um factor de > 4,5 em um ensaio, como descrito no Exemplo 5.1 (utilizando o glicopéptido ou o péptido de MUC1 nele descritos, tendo um comprimento de 30 aminoácidos, o qual corresponde a repetições paralelas de 1,5). b) A ligação em métodos de ensaio, como descrito no exemplo 5.2 para multiplicar repetições paralelas de MUC1 não glicosiladas que 6 consistem de pelo menos 3 repetições paralelas, preferivelmente 5 repetições paralelas. c) Estatisticamente a ligação significativamente reduzida às células libertadas de MUC1 do tumor, presentes no soro de pacientes com carcinoma do cólon, em comparação com os anticorpos do teste CA15-3 (Exemplo 11) e de HMFG-1 (também em comparação com o Exemplo 11) . 0 método de teste utilizado para este efeito é ilustrado com mais pormenor no Exemplo 11. d) Conforme descrito no Exemplo 6, a interacção entre o antigénio e a molécula de reconhecimento é quer aumentada ou não influenciada pelo tratamento de neuraminidase. e) Não há nenhuma ou quase nenhuma ligação detectável ao tecido normal do cólon e ligação forte especifica ao tecido tumoral do cólon (ver o Exemplo 6).

Devido as sequências de aminoácidos a serem incluídas de acordo com a invenção, especificadas acima e a seguir, as moléculas de reconhecimento da invenção têm uma estrutura a qual provoca a interacção específica das moléculas de reconhecimento com o MUC1 na forma de ligação específica do epítopo do tumor de MUC1 glicosilado com propriedades de ligação, como descrito.

Em uma forma de realização preferida da invenção a molécula de reconhecimento compreende uma sequência de aminoácidos a qual contém a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 1, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 3, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 5, em que a referida molécula de reconhecimento liga especificamente o epítopo do tumor de MUC1 glicosilado. 7

Em uma outra forma de realização preferida da invenção a molécula de reconhecimento compreende uma sequência de aminoácidos a qual contém a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 2, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 4, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 6, em que a referida molécula de reconhecimento liga especificamente o epitopo do tumor de MUC1 glicosilado. Vantajosamente, as referidas moléculas de reconhecimento têm um aumento na ligação por um fator de > 20 de acordo com a) . As moléculas de reconhecimento presentes também têm, pelo menos uma das seguintes propriedades: f) uma ligação a múltiplas repetições paralelas não-glicosiladas como em b) com um factor da proporção de ligação a uma repetição paralela de MUC1 não-glicosilada com 5 repetições paralelas a um péptido de MUC1 não-glicosilado com uma repetição paralela de > 8 (sequência de péptidos e do método de ensaio, ver o exemplo 5). O método de ensaio para a determinação do referido factor é ilustrado em maior detalhe no Exemplo 5.2. g) um aumento de força de ligação, por se aumentar o número de repetições paralelas glicosiladas (região de PDTR múltipla glicosilada) (ver o Exemplo 5.3).

Vantajosamente, outras moléculas de reconhecimento preferidas possuem todas as propriedades de ligação de a) até g).

As moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção combinam as propriedades acima descritas, sendo assim vantajosas no diagnóstico e na terapia de tumores. Elas diferem de anticorpos bem conhecidos não só como um resultado das suas novas sequências, mas também como um resultado da sua excelente especificidade para o MUC1 por ligar especificamente o epitopo do tumor de MUC1 glicosilado, apresentando menor ligação ao MUC1 no soro de pacientes com carcinoma do cólon, praticamente nenhuma ligação ao tecido normal do cólon e forte ligação ao tecido do tumor do cólon. Além disso, as moléculas de reconhecimento da invenção reconhecem os tumores do cólon já como carcinomas in situ, mas não conseguem reconhecer displasias ligeiras, distinguindo assim, entre tumores perigosos e doenças benignas. Dadas essas propriedades e a sua elevada afinidade, elas são particularmente adequadas para a utilização na terapêutica, bem como no diagnóstico, oferecendo assim vantagens sobre os anticorpos de MUC1 bem conhecidos.

Entre a grande variedade de anticorpos de MUC1 bem conhecidos, não houve nenhum anticorpo que tivesse propriedades correspondentes até agora, e é por isso que a combinação das propriedades das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção é surpreendente.

Como pode ser visto a partir do exposto, as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção são superiores aos anticorpos de MUC1 convencionais.

Consequentemente, os anticorpos convencionais têm desvantagens significativas em comparação com as moléculas de reconhecimento da invenção, tal como irá ser brevemente exemplificado a seguir.

Exemplos de diferenças em excelente especificidade: nas investigações estabelecidas no Exemplo 5.1, o HMFG-1 (patentes norte-americanas No. 5804187, 6315997) e o C595 (patente WO 02/44217) ligam-se aos péptidos de MUC1 independentemente de qualquer glicosilação e, portanto, não se ligam ao epítopo do tumor de MUC1 glicosilado. Por exemplo, o HMFG-1 também se liga ao tecido normal do cólon. Como pode ser visto, eles não apresentam a ligação 9 vantajosa das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção. De acordo com o teste no Exemplo 5.1, o SM3 (patente norte-americana No. 5683674) obtido pela imunização com MUC1 derivado de material não-tumor humano (goticulas de gordura do leite) liga os péptidos derivados de MUC1 glicosilados e não glicosilados praticamente na mesma medida, com um ligeiro aumento por um factor de cerca de 1,5, faltando assim apresentar tal ligação vantajosa ao epitopo do tumor. Além disso, o SM3 não demonstra qualquer dependência acentuada em relação ao número de repetições paralelas de MUC1, nem àquelas glicosiladas nem não glicosiladas (Exemplos 5.2 e 5.3). 0 DF3 tem sido descrito como um anticorpo especifico de MUC1 que selaga aos péptidos derivados de MUC1 preferivelmente em uma forma independente da glicosilação (patente WO 93/20841, patente norte-americana No. 5506343). Além disso, a ligação do DF3 a MUC1 ou a células tumorais que influenciam o MUC1 é dramaticamente reduzida ou completamente inibida pelo tratamento com a neuraminidase (Dai J. et al., 1998; Hinoda et al., 1992). Além disso, o HMFG-1 e o DF3 dão uma forte ligação ao MUC1 do tumor no soro, especialmente em pacientes com carcinoma mamário, mas também em pacientes com carcinoma do cólon (ver o Exemplo 11) . Assim, eles não apresentam as propriedades de ligação vantajosas das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção.

As moléculas de reconhecimento são caracterizadas de acordo com a definição exposta, essencialmente, através das suas propriedades de ligação no que diz respeito aos tecidos do cólon normal e tumorais. Como pode ser visto, as referidas moléculas de reconhecimento são vantajosas na terapia e diagnóstico de tumores do cólon e das suas metástases, quando comparado com anticorpos anti-MUCl convencionais. No entanto, as referidas moléculas de reconhecimento são vantajosas não somente no tratamento e no diagnóstico de carcinomas do cólon e outros tumores gastrointestinais, mas também 10 em outras doenças tumorais e metástases, preferencialmente doenças tumorais positivas para MUC1 e metástases, por exemplo, carcinomas mamários, tumores gastrointestinais, incluindo carcinomas do cólon, carcinomas do estômago, cancro do intestino grosso e cancro do intestino delgado, carcinomas do pâncreas, carcinomas dos ovários, cancro do pulmão, carcinomas de células renais, mielomas múltiplos e/ou as suas metástases. Isto é comprovado pelos dados do Exemplo 6, demonstrando a ligação especifica das moléculas de reconhecimento às células tumorais em várias doenças tumorais. A descrição detalhada das propriedades de ligação com relação aos carcinomas do cólon é de fundamentar as vantagens e estabelecer parâmetros adequados para as caracteristicas de ligação das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção.

Em uma forma de realização preferida uma molécula de reconhecimento da invenção que liga especif icamente o epitopo do tumor de MUC1 glicosilado, inclui: a) uma primeira sequência de aminoácidos a qual contém a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 1 ou 2 e a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 3 ou 4, e a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 5 ou 6; e b) uma segunda sequência de aminoácidos a qual contém a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 7 ou 8 e a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 9 ou 10 e a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 11 ou 12. A primeira e a segunda sequência de aminoácidos pode estar presente em um ou mais e preferivelmente em dois polipéptidos.

Por razões de simplicidade, as moléculas de reconhecimento da invenção que ligam especificamente o epitopo do tumor de MUC1 glicosilado no sentido da invenção, serão também referidas como 11 moléculas de reconhecimento específicas ou de ligação de MUC1, aqui a seguir.

As moléculas de reconhecimento de ligação ao MUC1 preferidas, de acordo com a invenção, são caracterizadas pelo facto de um conjunto definido de sequências de aminoácidos singulares estar aí incluído. A combinação das sequências de aminoácidos resulta em uma estrutura das referidas moléculas de reconhecimento, as quais, como uma propriedade, apresentam a combinação acima descrita das propriedades de ligação no que diz respeito ao epítopo do tumor de MUC1 glicosilado. A sequência de aminoácidos das referidas moléculas de reconhecimento inclui um ou dois tripletos de sequências definidas. Estas sequências representam os domínios de ligação e definem a especificidade das moléculas de reconhecimento. A molécula de reconhecimento do tripleto 1 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 1 ou 2, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 3 ou 4, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 5 ou 6. As moléculas de reconhecimento específicas de MUC1 definidas por dois tripletos compreendem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 1 ou 2, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 3 ou 4, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 5 ou 6 para o primeiro tripleto, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 7 ou 8, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 9 ou 10 e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 11 ou 12 para o segundo tripleto. O primeiro e o segundo tripleto pode estar presente tanto em uma ou em mais cadeias de polipéptidos, que, neste último caso, em conjunto formam a molécula de reconhecimento de ligação. Além disso, no sentido da invenção, estes tripletos referem-se ao tripleto da sequência 1 para a primeira sequência de aminoácidos a ser incluída e como tripleto da sequência 2 para a segunda sequência de aminoácidos a ser incluída, ver a definição a) e b) da descrição acima. De acordo com a invenção, a molécula de reconhecimento pode ser um anticorpo, 12 particularmente um IgG ou IgM de murino, quimérico ou humano, uma estrutura de scFv ou um outro fragmento derivado de anticorpo, tal como fragmentos de Fab, F(ab)2, Fv ou F(v)2.

Em uma forma de realização preferida as moléculas de reconhecimento de ligação de MUC1 da invenção compreendem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 1, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 3, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 5 como uma sequência 1 tripleto.

Em uma outra forma de realização preferida as moléculas de reconhecimento de ligação de MUC1 da invenção compreendem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 2, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 4, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 6 como a sequência 1 tripleto.

Em uma forma de realização preferida as moléculas de reconhecimento de ligação de MUC1 da invenção compreendem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 1, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 3, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 5 como a sequência 1 tripleto, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 7, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 9 e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 11 como a sequência 2 tripleto.

Em uma outra forma de realização preferida as moléculas de reconhecimento de ligação de MUC1 da invenção compreendem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 2, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 4, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 6 como a sequência 1 tripleto, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 8, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 10 e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 12 como a sequência 2 tripleto.

Em uma forma de realização adicional a modificação de uma molécula de reconhecimento é efectuada por uma ou mais mutações em uma ou 13 mais sequências de aminoácidos seleccionadas a partir SEQ ID NO. 1 a 12, em que os aminoácidos individuais são substituidos por aminoácidos que têm propriedades fisico-quimicas semelhantes os quais vantajosamente não modificam fundamentalmente a estrutura tri-dimensional do dominio de ligação nas moléculas de reconhecimento, para que a especificidade de MUC1 das moléculas de reconhecimento seja mantida. Os aminoácidos que têm propriedades fisico-quimicas semelhantes no sentido da invenção podem ser resumidos em 6 grupos diferentes, e estão ilustradsos na Tabela 1.

Tabela 1 Aminoácidos com propriedades fisico-quimicas análogas, independentemente do tamanho da molécula.

Propriedade ou aminoácidos

Grupo funcional

Glicina

Alifático

Alanina

Valina

Leucina

Isoleucina

Serina

Grupo hidroxilo

Grupo carboxilo

Grupo amida

Grupo amino

Tréonina Ácido aspártico Ácido glutâmico Asparagina Glutamina Lisina

Arginina aromático

Fenilalanina

Tirosina

Triptofano 14

As sequências de aminoácidos SEQ ID N.os 1 a 12 ou as suas modificações em uma molécula de reconhecimento especifica de MUC1, no sentido da invenção formam estruturas espaciais, por exemplo, os chamados circuitos que se caracterizam por possuírem uma estrutura terciária definível e /ou uma estrutura quaternária. A região de de ligação de uma molécula de reconhecimento com o antigénio de MUC1 é formada por resíduos de aminoácidos, os quais são fornecidos por até seis ansas variáveis na superfície da molécula e, interagem especificamente com o MUC1.

Em uma outra forma de realização da invenção, as moléculas de reconhecimento que se ligam especificamente a MUC1 são fornecidas, em que pelo menos uma sequência das sequências tripleto não envolvida imediatamente na interacção com o antigénio de MUC1 é omitida.

Em uma outra forma de realização, as moléculas de reconhecimento compreendem pelo menos uma das sequências de aminoácidos SEQ ID Nos 1 a 12 ou as suas variantes acima descritas, em duplicado ou multiplicado, e tais duplicados também podem estar presentes na forma de variantes da mesma sequência de aminoácido. Todas as moléculas de reconhecimento descritas nesta secção reconhecem vantajosamente o antigénio de MUC1 de uma maneira específica. Para facilitar a compreensão, também as moléculas de reconhecimento, as quais, estritamente falando, não têm quaiquer sequências tripleto como um resultado das sequências de multiplicação ou de omissão, serão, no entanto, referidas como a seqiência 1 tripleto ou a sequência 2 tripleto a seguir.

Em uma outra forma de realização as moléculas de reconhecimento da invenção que ligam especificamente o epítopo do tumor de MUC1 glicosilado compreendem as sequências de aminoácidos que têm uma 15 homologia de pelo menos 60%, preferivelmente 70%, mais preferivelmente 80%, especialmente preferivelmente 90%, com respeito às sequências SEQ ID Nos 1 a 12.

Além disso, as moléculas de reconhecimento, no significado da invenção, podem compreender sequências de estrutura as quais separam as sequências de aminoácidos compreendidas, ou seja, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 1 ou 2 e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 3 ou 4 e a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 5 ou 6, ou as suas variantes acima descritas, e as sequências de estrutura as quais separam a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 7 ou 8 e a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 9 ou 10 e a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 11 ou 12, ou as suas variantes, acima descritas. A primeira e a segunda sequência de aminoácidos podem estar presentes em um ou mais e, preferivelmente, duas cadeias de polipéptidos. No significado da invenção, tais sequências de estrutura também são referidas como separadores e podem variar em comprimento e em sequência. Isto inclui expressamente aquelas moléculas de reconhecimento em que nem todas as sequências de aminoácidos SEQ ID Nos 1 a 12 ou as suas variantes acima descritas, são separadas por espaçadores. Além disso, as moléculas de reconhecimento têm preferivelmente sequências de aminoácidos de flanqueamento adicionais como referido da mesma maneira para as sequências de estrutura, no sentido da invenção.

Mais especificamente, as sequências de estrutura têm a função de formar as sequências de aminoácidos acima descritas responsáveis por ou envolvidas em moléculas de reconhecimento de ligação especificas de MUC1 em uma configuração adequada e estrutura espacial de modo a permitir uma ligação a MUC1. Pode ser previsto que as sequências de aminoácidos SEQ ID NO. 1 a NO. 12 sem pelo menos uma sequência de aminoácidos adicional como sequência de 16 estrutura são incapazes de ligarem o antigénio de MUC1 de uma maneira especifica, no sentido da invenção. Além disso, as sequências de estrutura podem fornecer as moléculas de reconhecimento com, por exemplo, a estabilidade quimica e biológica necessárias, de modo a que a estrutura espacial possa ser construída de forma eficaz e mantida para funcionar e utilizar em uma forma adequada funcional a qual inclui a ligação a MUC1.

Em uma forma de realização preferida as sequências tripleto são introduzidas em proteínas existentes pela substituição das sequências de aminoácidos e/ou por outro lado, as sequências protéicas existentes servem como sequências de estrutura no sentido da invenção, ou as sequências de estrutura a serem tomadas a partir de proteínas adequadas. Por exemplo, essas sequências de estrutura podem ser modificadas por meio de mutações, delecções ou inserções. OS métodos de biologia molecular, bioquímica e engenharia de proteína em si conhecidas dos especialistas na técnica podem ser empregues para esse fim. As proteínas preferidas para esse efeito são as proteínas da superfamília das imunoglobulinas, os inibidores da protease, as lectinas, proteínas de conjunto de hélices e lipocalinas, tais como as divulgado em: Nygren e Uhlen, 1997; Nuttall SD et al.r 1999; e Skerra, 2000. Numa outra forma preferida de execução as sequências de estrutura são sequências de estrutura de anticorpo de uma ou de diferentes espécies ou sequências de aminoácidos, que imitam a sequência de consenso das sequências de estrutura de murinos, anticorpos humanos e/ou anticorpos de mamíferos diferentes. Uma sequência de consenso é uma sequência idealizada em que o aminoácido que mais frequentemente ocorre é representativo em cada posição quando em comparação com um grande número de sequências existentes, por exemplo, de bases de dados de anticorpos. As moléculas de 17 reconhecimento preferidas aqui, são caracterizados pelo facto das sequências de estrutura para a primeira sequência 1 tripleto compreender a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 1 ou 2, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 3 ou 4, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 5 ou 6, ou as variantes acima descritas, serem sequências de estrutura de anticorpo da cadeia pesada variável, VH, na literatura também referida como sequências de estrutura, e as sequências de estrutura para a sequência 2 tripleto compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 7 ou 8, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 9 ou 10 e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 11 ou 12, ou as suas variantes acima descritas, serem sequências de estrutura de anticorpo da cadeia leve variável, VL.

Também preferidas são as sequências de estrutura de anticorpos de anticorpos de mamíferos, com as sequências de estrutura de anticorpos de origem humana e/ou murina a serem particularmente preferidas. As sequências de estrutura podem ser combinadas a partir de sequências de estrutura de anticorpos de várias espécies. Essas sequências de estrutura de anticorpos são bem conhecidas dos especialistas na técnica e podem ser obtidas a partir de várias bases de dados tais como a base de dados Kabat (immuno.bme.nwu.edu) ou a base de dados National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov). Da mesma forma, essas estruturas quadro de anticorpos podem ser estendidas por aminoácidos adicionais e/ou modificadas por uma ou mais mutações, por exemplo, supressões e/ou inserções, com ligação específico ao epítopo do tumor de MUC1 glicosilada a ser retido.

Quando se combinam as sequências tripleto com sequências de estrutura de anticorpo em uma variante preferida da invenção, a 18 molécula de reconhecimento representa uma cadeia variável de um anticorpo de uma estrutura dai derivada.

As sequências de estrutura de anticorpo particularmente preferidas como sequências quadro, no sentido da invenção, são as sequências de aminoácidos que correspondem ao FRH1, FRH2, FRH3 e FHR4 na Tabela 2 para a cadeia pesada variável e a sequência de aminoácidos correspondente ao FRL1, FRL2, FRL3 e FRL4 na Tabela 2 para a cadeia leve variável, correspondendo as sequências de aminoácidos das sequências 1 e 2 tripleto, com as SEQ ID Nos 1 a 12 correspondentes às regiões de CDR correspondentes dos anticorpos. As cadeias de anticorpos pesadas variáveis (VH) e leves (VL), respectivamente, são compostas como se segue: VH: FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4, e VL: FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4. A Tabela 2 ilustra as posições em detalhe. As posições dos aminoácidos individuais ou das sequências de aminoácidos correspondem à numeração dos aminoácidos em moléculas de anticorpos de acordo com Kabat.

Tabela 2:

Nome Intervalo de posição Posição Aminoácidos ou sequência de aminoácidos FRH1 1 a 30 1 E 2 V 3 K 4 L 5 V 6 E 7 S 8 G 9 G 10 G 11 L 12 V 19

13 Q 14 P 15 G 16 G 17 S 18 M 19 K 20 L 21 S 22 C 23 A ou V 24 A, V, S ou T 25 S 26 G 27 Y, F, S ou D 28 T 29 F, L ou I 30 S C DRH1 31 a 35 3EQ ID NO. 1 ou 2 e Variantes FRH2 36 a 49 36 W 37 V 38 R 39 Q 40 S 41 P 42 E 43 K 44 G 45 L 46 E 47 W 48 V 49 A CDRH2 50 a 65, caso em que a posição 52a, 52b e 52c são introduzidas 3EQ ID NO. 3 ou 4 e Variantes FRH3 66 a 94 66 R 67 F 20

68 T 69 1 70 S 71 R 72 D 73 D ou V 74 S 75 K 76 S 77 S 78 V 79 Y ou S 80 L 81 Q 82 M 82a N 82b N 82c L 83 R 84 A ou V 85 E 86 D 87 T 88 G 89 I 90 Y 91 Y 92 C 93 T 94 R, G, N ou S CDRH3 95 a 102, em que a posição 100 e a posição 99 não existem 3EQ ID NO. 5 ou 6 e variantes FRH4 103 a 113 103 W 104 G 105 Q 106 G 107 T 21

108 T 109 L 110 T 111 V 112 S 113 S OU A FRL1 1 a 23 1 D 2 I, V ou L 3 V 4 M ou L 5 T 6 Q 7 T ou A 8 P ou A 9 L ou F 10 S 11 L ou N 12 P 13 V 14 S ou T 15 L 16 G 17 D ou T 18 Q ou S 19 A 20 S 21 I 22 S 23 c CDRL1 24 a 34, caso em que as posições 27a, 27b, 27c, 27d e 27e são introduzidas 3EQ ID NO. 7 ou 8 e variantes FRL2 35 a 49 35 W 36 Y 37 L 38 Q 39 K 40 P 22

41 G 42 Q ou L 43 S 44 P 45 K ou Q 46 L 47 L 48 I ou V 49 Y CDRL2 50 a 56 3EQ ID NO. 9 ou 10 e variantes FRL3 57 a 88 57 G 58 V 59 P 60 D 61 R 62 F 63 S 64 G ou S 65 S 66 G 67 S 68 G 69 T 70 D 71 F 72 T 73 L 74 K ou R 75 I 76 S 77 R 78 V 79 E 80 A 81 E 82 D 83 L ou V 23

84 G 85 V 86 Y 87 Y 88 C CDRL3 9 a 97 3EQ ID NO.11 ou 12 e variantes FRL4 98 a 108 98 F 99 G 100 G ou D 101 G 102 T 103 K 104 L 105 E 106 I ou L 106a K 107 R 108 A

As sequências de aminoácidos SEQ ID Nos. 32 e 33 correspondem a sequências de aminoácidos com sequências de estrutura preferidas para a cadeia pesada variável. As sequências de aminoácidos SEQ ID Nos. 34 e 35 correspondem às sequências de aminoácidos com sequências de estrutura preferidas para a cadeia leve variável. Preferido é a combinação da SEQ ID NO. 32 e 34. Também preferida é a combinação SEQ ID NO. 33 e 35.

As técnicas e os métodos que serão utilizados na produção dessas sequências são bem conhecidas dos qualificados na técnica, e um perito na técnica será capaz de seleccionar sequências e/ou mutações de estrutura adequadas. No significado da invenção, as moléculas de reconhecimento especificas de MUC1 podem estar presentes em diferentes formatos. A estrutura básica da molécula de reconhecimento é uma ou mais cadeias de polipéptidos, que compreende a sequência 1 tripleto ou as sequências 1 e 2 tripleto 24 inventivas acima descritas e as sequências de estrutura. Por exemplo, a sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável está relacionada com as sequências de estrutura e as sequências 1 tripleto, e a sequência de aminoácidos de cadeia leve variável está relacionada com as sequências de estrutura e as sequências 2 tripleto, de uma maneira covalente ou não-covalente e podem estar situadas em uma ou mais cadeias de polipéptidos. Uma pluralidade de cadeias de polipéptidos podem estar presentes em uma forma covalentemente ligada, por exemplo através de pontes de dissulfureto, ou não-covalentemente ligadas como a molécula de reconhecimento.

Em particular, os diversos formatos inventivos de moléculas de reconhecimento incluem a ligação das referidas sequências tripleto com sequências de aminoácidos para além das sequências de estrutura acima descritas. Em uma variante preferida, as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção, por conseguinte, compreendem sequências acessórias adicionais além das sequências tripleto e das sequências de estrutura. Mais especificamente, as sequências acessórias são sequências de aminoácidos as quais primeiramente não estão envolvidas na configuração espacial das sequências tripleto, tal como na forma de sequências de estrutura, mas podem ter ai uma influência favorável como um resultado de interacções secundárias ou terciárias. Por exemplo, as sequências acessórias na forma de dominios constantes de um anticorpo, irão estabilizar o anticorpo, causando a dimerização, efectuando por isso uma ligação melhorada do anticorpo, ou, por exemplo, a fusão de uma scFv com um domínio de uma proteína de revestimento bacteriófaga provoca um aumento de actividade da ligação de scFv como divulgado, por exemplo, em Jensen KB et al. 2002. 25

Em uma forma de realização preferida as moléculas de reconhecimento compreendem sequências de aminoácidos com sequências de estrura em uma base de anticorpo e adicionalmente sequências acessórias em adição às sequências tripleto. Em particular, as sequências acessórias assumem pelo menos uma das seguintes funções: a) a ligação de uma sequência tripleto com as suas sequências de estrutura correspondentemente adequadas com pelo menos uma outra sequência tripleto com as suas sequências de estrutura correspondentemente adequadas, com a finalidade de criar ou melhorar a capacidade de ligação; b) estabilização dos dominios, por exemplo por meio de um ligante entre dois dominios de proteinas ou sequências de aminoácidos as quais sofrem a interacção com outras, na mesma ou em uma segunda cadeia; c) executar funções para finalidades imunológicas, por exemplo pela fusão com a porção Fc de anticorpos, quimioquinas, citoquinas, factores de crescimento ou as suas partes, ou anticorpos que têm uma especificidade diferente, ou os seus fragmentos, para o recrutamento de células do sistema imunológico, por exemplo, macrófagos ou os componentes do sistema complementar; d) a fusão com marcadores, por exemplo, sequências de multimerização, por exemplo, a sequência de retaguarda μ de IgM ou o dominio de associação de p53 ou MBL para multimerização das porções de ligação de MUC1 para a ligação multivalente ou para a purificação de moléculas de reconhecimento, por exemplo o marcador His, ou para a detecção, por exemplo o marcador myc, ou para a marcação ou quelação de moléculas de reconhecimento, por exemplo por sequências com elevada lisina. 26

As estruturas dequadas são bem conhecidas dos especialistas na técnica ou podem ser derivadas a partir da técnica anterior por dedução lógica.

Outras formas de realização preferidas são moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção que compreendem os seguintes formatos: fragmento de anticorpo de cadeia singular (scFv), fragmento de Fv, fragmento de (Fv)2, fragmento de Fab, fragmento de F(ab)2, multi-corpo (di-, tri-, tetra-corpo), imunoglobulina dos isotipos IgG, IgM, IgA, IgE, IGD ou as suas subclasses, por exemplo IgGl, ou as moléculas de reconhecimento derivadas da imunoglobulina que compreendem pelo menos um dominio constante.

De acordo com a invenção, "multi-corpo" é entendido como sendo um fragmento de anticorpo de cadeia singular, com a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável a serem ligadas directamente ou através de um lingente de uma tal forma que a associação de VH e VL tem lugar somente de uma maneira inter-molecular, em vez de intra-molecular, formando assim di-, tri- e/ou tetra-corpos.

De acordo com a invenção, um "ligante" é entendido como sendo um aminoácido ou uma sequência de aminoácidos com até 20 aminoácidos que liga a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável em um fragmento de anticorpo de cadeia singular.

Em uma forma de realização preferida as moléculas de reconhecimento da invenção são compostas de uma cadeia de polipéptido pesada e de uma leve, compreendendo cada uma das sequências de aminoácidos das cadeias leves e pesadas uma das estruturas tripleto acima descritas representando as regiões de CDR do anticorpo, representando as sequências de estrutura do anticorpo correspondente as sequências 27 de estrutura do anticorpo, e as sequências acessórias compreendendo pelo menos um dos dominios constantes do isotipo do anticorpo. As duas cadeias podem formar ligações covalentes uma com a outra. As regiões constantes e as regiões variáveis podem incluir sequências de anticorpos a partir de uma ou mais espécies. As porções de dominios constantes ou dominios constantes completos podem ser apagadas ou modificadas, a fim de, por exemplo se modificar a função executora das sequências acessórias, por exemplo, para prevenir ou melhorar a ligação aos receptores de Fc. Em uma forma de realização preferida a molécula de reconhecimento é um anticorpo ou fragmento de anticorpo de murino, quimerizado, humanizado ou humano. Por exemplo, a quimerização é efectuada através da ligação dos dominios de anticorpo variável com os dominios de anticorpo constante ou fragmentos de um domínio constante de anticorpos de diferentes espécies. Preferidas são as sequências de domínios constantes de anticorpos humanos. Os exemplos de anticorpos de murinos são mlgG-Pankol que consistem das sequências SEQ ID NO. 60 e 62, e mIgG-Panko2 que consistem das sequências SEQ ID NO. 61 e 63. Os exemplos de anticorpos quiméricos são as moléculas de reconhecimento clgG-Pankol que consistem das sequências SEQ ID NO. 64 e 68, e cIgG-Panko2 que consistem das sequências SEQ ID NO. 65 e 69.

As sequências de estrutura de anticorpo podem ser seleccionadas de tal forma que as sequências são largamente homólogas das sequências de anticorpos humanos. A selecção quanto à origem das espécies das sequências de estrutura também irá depender da utilização. Assim, para utilização terapêutica em campos particulares, os níveis mais elevados possível das sequências de estrutura humanas são preferidas, particularmente naqueles casos em que a respostade ao anticorpo de anti-rato humano (HAMA), deve ser evitada. Em outros campos terapêuticos, um xeno-componente é vantajoso porque efectua 28 estimulação adicional do sistema imunitário. Uma combinação dos dois é particularmente adequada em alguns casos, especialmente naqueles casos em que um xeno-componente é vantajoso na imunização inicial e uma espécie-compatível, isto é, um componente humano, é vantajoso em utilizações posteriores. A homologia com as sequências de consenso humanas é preferida, com o HuHIII a ser preferido para a cadeia pesada variável, e o HUKII a ser preferido para a cadeia leve variável. Particularmente preferida é a homologia com as sequências de linha germinais humanas as quais são conhecidas pelos especialistas na técnica e podem ser obtidas a partir da base de dados V BASE (www.mrc-cpe.cam.ac.uk) ou a partir da base de dados do Centro Nacional de Informação de Biotecnologia (www.ncbi.nlm.nih.gov).

As técnicas e os métodos que serão utilizados na produção dessas sequências são bem conhecidas pelos qualificados na técnica, e um especialista na técnica também será capaz de seleccionar sequências humanas adequadas e/ou realizar eventualmente mutações necessárias das referidas sequências.

Em uma outra forma de realização, as sequências tripleto que geralmente correspondem às ansas de ligação (regiões de CDR) e preferivelmente que têm elevadas homologias com as regiões de sequências correspondentes na sequência de linha germinal humana são adicionalmente adaptadas aí passo a passo, utilizando mutações simples, sem prejudicarem a ligação específica ao epítopo do tumor de MUC1 glicosilado. As moléculas de reconhecimento que têm estas sequências serão referidas aqui como anticorpos parcialmente humanos ou fragmentos de anticorpo. 29

Em uma outra forma de realização preferida, os aminoácidos específicos de sequências de estrutura de anticorpos de uma espécie são substituídos por outros, a fim de gerarem menos regiões imunogénicas em geral. Isto implica, tecnologias por si só conhecidas dos qualificados na técnica, por exemplo, tecnologias de humanização, por exemplo, enxertia de CDR, renovação, mistura da cadeia com mutações e desimunização por mutação ou apagamento de epítopos de MHC humanos.

Em uma forma de realização preferida, isto envolve uma molécula de reconhecimento derivada de IgM que tem os domínios constantes correspondentes de um IgM, preferencialmente as sequências humanas. No sentido da invenção, as imunoglobulinas são compostas de uma cadeia pesada e de uma cadeia leve de um anticorpo, e 2 cadeias leves e 2 cadeias pesadas preferivelmente representam uma unidade. As imunoglobulinas do tipo IgM consistem geralmente de 5 tais unidades adicionalmente ligadas através da cadeia J para formarem pontes de dissulfureto.

Em uma forma de realização particularmente preferida a cadeia J está ausente, com a multimerização das sub-unidades a ter lugar da mesma maneira, em cujo caso as estruturas hexa- e pentaméricas podem estar presentes. Os exemplos de anticorpos de IgM quiméricos são as moléculas de reconhecimento clgM-Pankol que consistem das sequências SEQ ID NO. 66 e 68, e cIgM-Panko2 que consistem das sequências SEQ ID NO. 67 e 69.

Em uma forma de realização preferida de tais moléculas de reconhecimento, os fragmentos de anticorpos de cadeia singular estão envolvidos, compreendendo uma estrutura 1 tripleto com as sequências de estrutura de anticorpo correspondentes acima descritas, as quais representam as regiões de CDR do anticorpo e as 30 sequências de estrutura do domínio variável da cadeia pesada de anticorpos, e uma estrutura 2 tripleto com as sequências de estrutura de anticorpo correspondentes descritas acima, as quais representam as regiões de CDR do anticorpo e as sequências de estrutura do domínio variável da cadeia leve de anticorpos, as quais são covalentemente ligadas, sob a forma de uma proteína de fusão. Aqui, as sequências estão ligadas directamente ou através de um ligante.

Preferido neste caso são os formatos scFv, sem nenhum ligante ou com um ligante de 1 a 9 aminoácidos em comprimento. Os anticorpos scFv formam estruturas multiméricas (por exemplo, di-, tri-, tetra-corpos) que, no sentido da invenção, também são referidos como multi-corpos e apresentam maior avidez ao epítopo do tumor de MUC1 glicosilado como um resultado da multivalência. Conforme estabelecido no Exemplo 8, o multi-corpo que tem a sequência SEQ ID NO. 45 liga-se muitas vezes melhor à linha de célula T47D do tumor mamário em um teste de ligação de célula radioactivo do que o anticorpo scFv que tem a sequência SEQ ID NO. 36. Estes constructos multivalentes em um formato de di-/tri-corpo são formas de realização particularmente preferidas da invenção, sendo vantajosos na terapia de tumor como um resultado de propriedades farmacocinéticas melhoradas. As sequências preferidas são as sequências SEQ ID NO. 36 a 47. Particularmente preferidas são as sequências SEQ ID NO. 48 a 59.

As formas de realização particularmente preferidas das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção são as moléculas de reconhecimento que compreendem as sequências SEQ ID NO. 48 a 59, SEQ ID NO. 61, 63, 65 ou 69, porque elas combinam todas as propriedades de ligação a) ah), como será descrito em maior pormenor nos exemplos. 31

Em uma outra forma de realização preferida as moléculas de reconhecimento são fundidas, quimicamente acopladas, covalentemente ou não-covalentemente associadas com (i) dominios de imunoglobulina de várias espécies, (i i) moléculas de enzima, (iii) dominiosde interacção, (iv) sequências de sinal, (v) corantes fluorescentes, (vi) toxinas, (vii) anticorpo scataliticos, (viii) um ou mais anticorpos ou fragmentos de anticorpos com diferentes especificidades, (ix) componentes citoliticos, (x) imunomoduladores, (xi) imunoefectores, (xii) antigénios de MHC de classe I ou de classe II, (xiii) agentes de quelação para marcadores radioactivos, (xiv) radioisótopos, (xv) lipossomas, (xvi) dominios transmembranares, (xvii) virus e/ou células. As células podem ser células de bactérias, de leveduras, de plantas, de insectos e/ou de mamiferos. As células de mamiferos são preferidas, por exemplo, células de murinos, humanas ou de hamsteres. As células efetoras são particularmente preferidas. "Células efectoras", no sentido da invenção são células, preferencialmente as células humanas, as quais medeiam as reacções imunes, tais como macrófagos, células dendriticas, linfócitos e células NK. Em particular, as moléculas de reconhecimento também podem ser combinadas com um marcador permitindo a detecção da molécula de reconhecimento e da sua purificação, tal como o marcador Myc ou o marcador His. No sentido da invenção, tais moléculas combinadas serão referidas como "constructos". As tecnologias para a produção de tais constructos são bem conhecidas dos qualificados na técnica, e um especialista na técnicaserá capaz de seleccionar as sequências e os componentes adequados e ligá-los com as moléculas de reconhecimento da invenção de uma maneira adequada.

Em uma outra forma de realização preferida as moléculas de reconhecimento acima descritas baseadas em anticorpos ou em 32 fragmentos de anticorpos são fundidas com péptidos ou proteínas não derivadas das imunoglobulinas. Por exemplo, o dominio de multimerização de uma molécula de não imunoglobulina é fundido com um scFv, especialmente a extremidade de terminal C da cadeia alfa de uma proteina de ligação C4, conforme descrito em Tonye Libyh M. et al., 1997, construindo assim uma molécula de reconhecimento multivalente.

Em uma outra forma de realização, um scFv é fundido com um dominio transmembranar de uma molécula de não imunoglobulina, por exemplo, com o domínio transmembranar de c-erb B2, h-PDGFR, o receptor de transferrina humano, ou o receptor de asialoglicoproteína humano (Liao et al., 2000), permitindo assim a expressão de moléculas de ligação sobre a superfície das células.

Uma outra forma de realização preferida da invenção compreende as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção, compreendendo adicionalmente sequências de aminoácidos que se ligam especificamente a macrófagos ou a outras células imunoefectoras. Por exemplo, as moléculas de reconhecimento da invenção compreendem ainda um local de ligação do anticorpo contra CD64, e, sob a forma de um anticorpo bi-específico ou de um fragmento de anticorpo (di-corpos), tem lugar a ligação de macrófagos a células tumorais positivas de MUC1, resultando no combate e/ou na destruição deste.

Uma forma de realização preferida da invenção diz respeito a moléculas de reconhecimento específicas de MUC1 radiomarcadas. Uma forma preferida envolve as moléculas de reconhecimento baseadas em anticorpos ou em fragmentos de anticorpos. Uma outra forma de realização preferida envolve as moléculas de reconhecimento radiomarcadas da invenção em formato de cadeia singular (incluindo a forma de di-, tri-, tetra-corpos). Outras formas preferidas são 33 os fragmentos de anticorpos de cadeia singular radiomarcados e as imunoglobulinas completas, por exemplo, os anticorpos inventivos de murinos, quiméricos ou humanizados de IgG ou de IgM ou os fragmentos de anticorpos humanizados. Escusado será dizer que a invenção não se limita a estes anticorpos, aos referidos marcadores radioactivos e aos referidos formatos de anticorpos.

Em uma forma de realização preferida, as moléculas de reconhecimento radiomarcadas ou toxina-marcadas estão envolvidas, as quais têm componentes xenogénicos, por exemplo, componentes de murinos, na porção Fc dos anticorpos, para que os anticorpos radioactivos tenham um menor periodo de permanência no sangue de um ser humano, sendo eliminados mais rapidamente. Os exemplos de tais moléculas de reconhecimento são mlgG-Pankol que consistem das sequências SEQ ID NO. 60 e 62, e mIgG-Panko2 que consistem das sequências SEQ ID NO. 61 e 63. Uma outra variante preferida são as moléculas de reconhecimento baseadas em anticorpos, em que os componentes de murinos são minimizados, mas que tem aqueles componentes de murinos incluídos que são responsáveis pela remoção do sangue (depuração). Formas de determinar os componentes apropriados são bem conhecidas dos especialistas na técnica.

Os fragmentos de anticorpos, tais como os fragmentos de scfv multivalentes preferidos, especialmente com nenhum ou muito curto ligante, oferecem uma vantagem na localização de tumores sólidos, em comparação com com os anticorpos monoclonais intactos. Com os anticorpos intactos apresentando uma acumulação específica dentro da área do tumor em estudos de biodistribuição, uma distribuição de anticorpo não homogénea com acumulação primária nas regiões periféricas é notada, quando se investiga precisamente o tumor. Devido a necroses do tumor, a distribuição de antigénios não homogénea e a pressão de tecido intersticial aumentada, não é possível alcançar as porções centrais do tumor com esses 34 constructos de anticorpos. Em contraste, os fragmentos de anticorpos pequenos mostram uma marcação rápida do tumor, penetram mais fundo dentro do tumor, e também, são removidos com relativa rapidez a partir da circulação sanguinea. No entanto, a constante dissociação de fragmentos de anticorpos monovalentes, tais como Fabs ou scFv é frequentemente excessivamente baixa, resultando em um curto periodo de permanência nas células tumorais. Por esta razão, os construtos de anticorpos multivalentes tais como multi-corpos (di-corpos, tri-corpos/tetra-corpos), F(ab')2 e outros mini-corpos (construtos de anticorpos multivalentes que consistem de domínio de ligação e sequência de multimerização, por exemplo, o domínio scfv e CH3 de um IgG) oferecem muitas vantagens na terapia do tumor. Os constructos multivalentes em um formato di-/tri-corpo (multi-corpos) são formas de realização preferidas da invenção, são vantajosos na terapia do tumor como um resultado de melhores propriedades farmacocinéticas e têm sido desenvolvidos para utilização na terapia do tumor. Eles podem ser utilizados como veículos para acumulação específica, por exemplo, de substâncias citotóxicas, tais como os agentes quimioterapeuticos ou radionuclídeos em um tumor. Ao seleccionar adequadamente os radionuclídeos, é possível destruir as células tumorais através de uma distância de vários diâmetros de células, de modo a que, mesmo as células tumorais negativas de antigénios em uma área do tumor podem ser cobertas e a pobre penetração de anticorpos dentro dos tumores sólidos pode ser compensada, pelo menos em parte.

Uma forma de realização particularmente preferida da invenção envolve multi-corpos radiomarcados os quais combinam propriedades farmacocinéticas particularmente vantajosas e, em combinação, têm uma melhorada retenção do tumor, penetração do tumor, meia-vida do soro e soro para a proporção da distribuição do tumor comparada com as imunoglobulinas completas e scFv. Outras vantagens são a elevada 35 avidez e a expressão de bactérias, permitindo uma produção de baixo custo de tais moléculas de reconhecimento. Vantajosamente, este formato especifico de moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção é, portanto, adequado para ser utilizado preferencialmente no tratamento de tumores primários pequenos, metástases e doenças residuais minimas.

Uma forma de realização preferida da invenção envolve moléculas de reconhecimento não radiomarcadas. Uma forma preferida envolve as moléculas de reconhecimento baseadas em anticorpos ou em fragmentos de anticorpos.

Outras formas de realização preferidas são as moléculas de reconhecimento baseadas em IgG e IgM humanizadas ou quimerizadas acopladas à toxina ou ao agente de citostático da invenção e, em particular, multi-corpos (di-, tri-, tetra-corpos), com propriedades farmacocinéticas particularmente vantajosas, tal como estabelecido acima.

Uma outra forma de realização preferida envolve lipossomas, os quais são carregados com, por exemplo toxinas ou agentes citostáticos e moléculas de reconhecimento sustentadas da invenção na sua superficie.

Um especialista na técnica será capaz de seleccionar radioisótopos adequados, toxinas e agentes citostáticos. As técnicas, métodos, dosagens e formulações dequadas são bem conhecidas dos especialistas na técnica.

Uma outra forma de realização preferida da invenção envolve células efectoras do sistema imunológico que têm moléculas de reconhecimento da invenção ligadas à sua superficie, as quais 36 directamente endereçam as células efectoras para as células tumorais que sustentam o MUC1, mediando assim o controlo e/ou a destruição destas. As células efectoras preferidas são macrófagos, células dendriticas e células NK obtidas do paciente e acopladas ex vivo com as moléculas de reconhecimento. Também preferidas são as linhas celulares desses tipos de células. A ligação é efectuada por exemplo, por meio de moléculas de reconhecimento bi-especificas as quais, em adição aos componentes específicos de MUC1, compreendem aminoácidos os quais medeiam a ligação das células efectoras. Por exemplo, estas são anticorpos bi-especificos, componentes complementares ou domínios constantes de anticorpos.

Uma outra forma de realização preferida envolve macrófagos de um paciente que, após a colecta, são acoplados com um anticorpo bi-específico, por exemplo, sob a forma de um anticorpo completo, preferivelmente quimicamente acoplado a fragmentos de Fab, ou mais preferencialmente, di-corpos os quais, por um lado, reconhecem o CD64 e, por outro lado, são específicos de MUC1 de acordo com a invenção. Esses macrófagos, que sustentam as moléculas de reconhecimento bi-especificas através da especificidade de CD64, são re-administrados ao paciente em uma formulação adequada, a fim de combaterem o tumor positivo de MUCl.As técnicas utilizadas para este fim, bem como os métodos, doses e formulações adequados, são bem conhecidas dos qualificados na técnica. Uma outra forma de realização preferida envolve macrófagos de um paciente que, após a colecta, são acoplados com um anticorpo específico de MUC1 ou um fragmento de anticorpo da invenção compreendendo a porção constante de um anticorpo o qual se liga aos macrófagos através dos receptores de Fc por si só conhecidos. As moléculas de reconhecimento podem ligar-se aos macrófagos quer como anticorpos completos, preferivelmente IgG ou IgM quiméricos ou humanizados, ou como um fragmento de anticorpo, por exemplo, scFv, Fab ou multi- 37 corpos sob a forma de uma proteína de fusão ou quimicamente acopladas com uma porção do domínio constante dos anticorpos, cuja porção é bem conhecida dos qualificados na técnica. Os macrófagos que sustentam as moléculas de reconhecimento são re-administrados ao paciente em uma formulação adequada, a fim de combaterem o tumor positivo de MUC1. As técnicas utilizadas para este fim, bem como os métodos, dosagens e formulações adequadas são bem conhecidas dos qualificados na técnica.

Uma outra forma de realização preferida envolve linhas celulares ou células do corpo, tais como as células efectoras acima descritas, as quais são transfectadas com moléculas que compreendem as moléculas de reconhecimento especificas de MUC1 da invenção e elementos adicionais que causam a expressão e a ancoragem na membrana, por exemplo, o domínio transmembranar e a activação mediada das células efectoras em contacto com uma célula tumoral que suporta o MUC1. Os elementos apropriados são bem conhecidos dos qualificados na técnica. Por exemplo, uma linha de célula dendrítica é transfectada com um vector que compreende uma molécula de reconhecimento a qual compreende um scFv ou multi-corpo inventivo e um domínio transmembranar e um domínio de activação. Em outro exemplo, os macrófagos são viralmente transfectados para este fim. As células efectoras que suportam as moléculas de reconhecimento são re-administradas ao paciente em uma formulação adequada, a fim de combaterem o tumor positivo de MUC1. As técnicas utilizadas para este fim, bem como os métodos, dosagens e formulações adequadas são bem conhecidas dos qualificados na técnica. A invenção também se refere a moléculas de ácido nucléico que compreendem uma ou mais sequências genéticas as quais codificam pelo menos uma das moléculas de reconhecimento acima descritas e/ou 38 os constructos, de acordo com a invenção. Devido ao código genético degenerativo, as referidas moléculas de ácido nucleico podem ter sequências altamente variáveis. A selecção do códão também depende das células utilizadas para produzirem as moléculas de reconhecimento, porque diferentes códões frequentemente são preferidos em células diferentes de organismos diferentes, e pode haver uma forte influência sobre a taxa de expressão, por exemplo, os codões de arginina AGA e AGG preferencialmente utilizados em genes eucarióticos são raramente vistos em bactérias onde os códões CGC e CGU são claramente mais frequentes. Em formas de realização preferidas a molécula do ácido nucleico da invenção é um ADN genómico, um ADNc e/ou um ARN. Os critérios para seleccionar codões adequados e a produção de uma molécula do ácido nucleico adequada são bem conhecidos dos qualificados na técnica.

Além disso, a invenção diz respeito a vectores para a expressão das moléculas de reconhecimento, especificamente nas células. No sentido da invenção, um vector é entendido como sendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção, a qual serve para expressar a molécula de reconhecimento e compreende uma sequência de ácido nucleico a qual inclui uma ou mais sequências genéticas que codificam, pelo menos, uma das moléculas de reconhecimento acima descritas e as quais, em particular, incluem pelo menos uma expressão efectora do promotor da molécula de reconhecimento. Evidentemente, os vectores podem compreender elementos adicionais bem conhecidos dos qualificados na técnica, os quais são utilizados, por exemplo, na propagação de vectores para a produção em células adequadas e em clonagem. As sequências de ácido nucleico podem estar presentes em um ou mais vectores, em uma forma de realização preferida, por exemplo, a cadeia pesada de uma imunoglobulina da invenção é codificada por um e a cadeia leve por outro vector. Em uma outra forma de realização preferida da 39 invenção o domínio variável da cadeia leve e o domínio variável da cadeia pesada são codificados como proteína de fusão sobre o mesmo vector em um promotor. Além disso, no sentido da invenção, as sequências de ácido nucleico que codificam porções de uma molécula de reconhecimento podem ser expressas por diferentes promotores bem conhecidos dos qualificados na técnica. isto facilita a

Em uma outra forma de realização, as referidas sequências de ácido nucleico diferentes podem estar presentes em um vector comum. Cada sequência pode ser expressa pelo seu próprio - o mesmo ou diferente - promotor, ou as sequências podem estar presentes em um vector bicistrónico me um promotor. Em uma forma preferida, as taxas de expressão diferentes dos componentes de moléculas de reconhecimento são alcançadaa pelos referidos diferentes promotores, melhorando a formação de todas as moléculas de reconhecimento quando comparado com a taxa de expressão igual de diferentes componentes. É também preferido utilizar promotores os quais podem ser induzidos por forma a melhorar a expressão da molécula de reconhecimento. De uma forma particularmente preferida os vectores também compreeendem os elementos regulamentares bem conhecidos dos qualificados na técnica, por exemplo, a expressão que aumenta os intensificadores da molécula de reconhecimento ou os seus componentes, por exemplo, o intensificador de CMV ou as sequências intensificadoras da imunoglobulina. As moléculas e os vectores de ácido nucleico compreendem preferivelmente sequências de ácido nucleico adicionais as quais são utilizadas como sequências de sinal para a secreção de moléculas de reconhecimento ou os seus componentes e são conhecidas por si só dos qualificados na técnica, por exemplo, PelB, OmpA ou MalE para sistemas de células procarióticas, ou o péptido de sinal do receptor de células T, de cadeias de imunoglobulina, de t-PA ou EPO para sistemas de células eucarióticas [Boel et al., 2000, Herrera et al., 2000]. De uma forma vantajosa, 40 purificação e/ou melhora o rendimento das moléculas de reconhecimento. Os métodos para a produção dos ácidos nucleicos e vectores acima descritos, promotores adequados, intensificadores e constructos de vector, bem como os critérios para a selecção destes são bem conhecidos dos qualificados na técnica e serão explicados em pormenor nos exemplos.

Em uma forma de realização especifica da invenção o vector de acordo com a invenção também compreende sequências de ácido nucleico que codificam as proteínas virais. O vírus em si será referido como uma forma particular de um vector, o material genético do qual compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a molécula de reconhecimento, de acordo com a invenção. Em uma forma preferida a molécula de reconhecimento é uma proteína de fusão com uma proteína capsidial do vírus ou os seus componentes, tornando possível que não apenas o material genético compreenda a sequência de ácido nucleico da molécula de reconhecimento, mas também que a própria molécula de reconhecimento esteja presente na superfície do vírus em um estado activo de ligação, por exemplo, uma molécula de reconhecimento de scFv da invenção como uma proteína de fusão com uma proteína capsidial de adenovírus, pox-vírus ou vírus da vacinia adequados para utilizações terapêuticas de genes. Esta mediadora endereça o vírus para uma célula tumoral que expressa o MUC1, de modo a que a expressão da molécula de reconhecimento na célula tumoral tenha lugar. Isto pode ser utilizado na expressão da molécula de reconhecimento in vivo no organismo ou in vitro em uma cultura celular. Em uma forma preferida, os sistemas bem conhecidos são empregues os quais utilizam um vírus ajudante para a replicação, de modo a garantir a segurança de um método terapêutico do gene que que comprende o referido vector. Os métodos para a produção de vectores virais 41 descritos acima, para a infecção e a expressão de moléculas de reconhecimento são bem conhecidos dos qualificados na técnica.

Em uma outra forma de realização especifica o vector da invenção compreende uma proteína de fusão de uma molécula de reconhecimento, de acordo com a invenção e uma proteína ou péptido que se liga especificamente a um vírus. Vantajosamente, as moléculas de reconhecimento obtidas podem ser utilizadas para endereçar o vírus para uma célula que expressa o MUC1. Assim, por exemplo, a transferência do material genético podem ser mediada por infecções, permitindo assim uma expressão de moléculas específicas, codificadas pelo material genético do vírus nas células in vivo no organismo sob a forma de uma terapia genética ou in vitro em uma cultura de células.

Além disso, a invenção diz respeito a um método de obtenção das referidas moléculas de reconhecimento, que compreende a incorporação de um ou mais vectores da invenção, os quais incluem uma ou mais moléculas de ácido nucleico da invenção, em uma célula hospedeira apropriada, a culturação da referida célula hospedeira em condições adequadas, e proporcionar uma ou mais moléculas de reconhecimento das células ou do meio de cultura. No sentido da invenção, o termo "incorporação de vectores" é entendido como representando tecnologias, por si só conhecias dos qualificados na técnica, por meio da qual o referido vector é introduzido em uma célula hospedeira, por exemplo, a eletroporação, a transfecção utilizando lípidos catiónicos, ou infecção, permanecendo aí de uma maneira transitória ou estável. No sentido da invenção, o termo "fornecer uma ou mais moléculas de reconhecimento" é entendido como representando tecnologias, por si só conhecidos dos qualificados na técnica, por meio das quais as moléculas de reconhecimento expressas durante o processo de culturação são obtidas a partir do 42 sobrenadante de cultura e/ou a partir das células, por exemplo, várias etapas de purificação quimica das proteinas, por exemplo, de fraccionamento, concentração, precipitação e/ou cromatografia. As técnicas e os procedimentos a serem utilizados neste método são bem conhecidos dos qualificados na técnica, e um especialista na técnica também será capaz de seleccionar células hospedeiras adequadas e condições de cultura, bem como métodos para o fornecimento de células e/ou de sobrenadantes de cultura. Por exemplo, conforme estabelecido acima, um especialista na técnica irá seleccionar sequências de ácido nucleico com códões adequados e seqoências promotoras adaptadas à célula hospedeira, de forma a obter-se a expressão mais elevada possivel de moléculas de reconhecimento activas. Em uma forma de realizaçãp preferida um especialista na técnica vai utilizar, por exemplo, passos cromatográficos de afinidade, por exemplo, a cromatografia na proteina A ou na proteína G ou na proteína L, ou por exemplo, a cromatografia de afinidade de iões de metal através de um marcador His adicionalmente introduzido. Isto será ilustrado com maior pormenor nos exemplos.

Para além dos passos explicitamente mencionados acima, o termo "obtenção" também compreende passos adicionais, tais como o tratamento prévio do material de partida ou tratamentos adicionais, do produto final. Os procedimentos de pré-tratamento são por si só conhecidos dos qualificados na técnica. Em adição aos procedimentos de provisão descritos acima, os procedimentos de tratamento posterior também compreendem, por exemplo, a composição final e/ou a formulação da molécula de reconhecimento obtida por meio do processo de produção em formas adequadas de utilização e/ou de administração. 0 tipo das referidas formas de utilização e/ou de administração, por exemplo, solução, liofilizado ou comprimido, vai depender da aplicação pretendida. É bem conhecido dos qualificados 43 na técnica qual a forma de administração que é adequado para o efeito. Dependendo da forma de administração, a molécula de reconhecimento produzida utilizando o método de acordo com a invenção pode estar presente juntamente com os agentes auxiliares, portadores ou outras substâncias activas. Os agentes auxiliares são preferencialmente adjuvantes, outras substâncias activas, preferivelmente moléculas imunoestimulatórias tais como as interleucinas. A molécula de reconhecimento produzida utilizando o método da invenção também pode ser quimicamente modificada em passos de tratamento posteriores. Preferencialmente, a molécula de reconhecimento está adequadamente ligada a uma ou mais moléculas adicionais, ou seja, pela interacção quimica ou fisica. Como moléculas adicionais no sentido da invenção, outras proteínas ou péptidos são preferencialmente utilizados, os quais são covalentemente ou não-covalentemente ligados com a molécula de reconhecimento produzida por meio do método de acordo com a invenção, por exemplo, a fim de produzir moléculas de reconhecimento bi-específicas, por se ligar uma molécula de reconhecimento da invenção a qual reconhece especificamente o antigénio de MUC1 com uma segunda molécula a qual, por exemplo liga especificamente uma célula imunoefectora (por exemplo, macrófagos, células NK, células dendríticas), ou por exemplo, uma ligação com interleucinas (por exemplo, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15), quimioquinas e factores de crescimento, e em virtude do efeito destas moléculas através da ligação da molécula de reconhecimento da invenção, os imunoefectores são direccionados para o núcleo das células 1 tumorais positivas, combatendo e/ou destruindo as mesmas, por exemplo. Como descrito acima, as referidas moléculas adicionais ou os seus componentes também podem fazer parte da própria molécula de reconhecimento, caso em que não seriam ligadas por meio dos métodos químicos ou físicos aqui descritos seguindo-se a expressão da molécula de reconhecimento. No sentido da invenção, 44 "imunoefectores", são entendidos como sendo aqueles componentes da invenção capazes de, directa ou indirectamente efectuarem o controlo e/ou a destruição das células tumorais positivas de MUC1, por exemplo, as células imunoefectoras, tais como macrófagos, células NK, células dendriticas, ou moléculas efectoras, tais como proteinas ou péptidos do sistema complementar. Adequadas como moléculas adicionais no âmbito do método de acordo com a invenção são, em particular, as substâncias que desenvolvem um efeito terapêutico ou de diagnóstico, por exemplo, os radioisótopos ou as toxinas. Estas substâncias estão ligadas com as moléculas de reconhecimento utilizando procedimentos por si conhecidos, por exemplo, os radioisótopos são quer directamente incorporados (por exemplo, iodo) ou ligados através de um agente de quelação covalentemente acoplado (por exemplo, itrio, indio, bismuto). As etapas do processo de tratamento adicional são bem conhecidas dos qualificados na técnica.

As células utilizadas de acordo com a invenção para expressarem as moléculas de reconhecimento podem ser células procarióticas ou eucarióticas, por exemplo, bactérias, leveduras (preferencialmente S. cerevisiae ou P. pastoris), insectos (D. melanogaster), plantas, células de mamíferos (preferencialmente, hamsteres, ratos ou linhas de células humanas) ou de organismos transgénicos, tais como animais e plantas. Preferencialmente, E. coli é utilizada para a expressão das moléculas de reconhecimento da invenção em um sistema procariótico, e as linhas celulares de mamíferos NSO, SP2/0, CHO-Kl, CHOdhfr-, COS-1, COS-7, HEK293, K562, Namalwa ou Percy 6 para a expressão em um sistema eucariótico. A invenção também diz respeito a composições para fins terapêuticos, profilácticos ou de diagnóstico, que compreendem, pelo menos uma molécula de reconhecimento da invenção em uma forma 45 ou composição adequada, especialmente farmaceuticamente adequada. Mais especificamente, a composição farmacêutica compreende materiais adicionais e substâncias, por exemplo, adjuvantes medicinais e/ou técnico-farmacêuticos. No sentido da invenção, as composições farmacêuticas utilizadas para fins terapêuticos e profiláticos, bem como as composições farmacêuticas utilizadas como agente de diagnóstico in vivo serão consideradas como fármacos. Em uma outra forma de realização preferida, as composições para diagnóstico ex vivo estão em causa, as quais podem conter materiais e substâncias adicionais. Esta forma de realização será ilustrada em maior detalhe na descrição de agentes de diagnóstico.

De acordo com a invenção, "fármacos ou composições farmacêuticas", usadas de uma forma sinónima aqui, são substâncias e formulações de substâncias destinadas a curar, aliviar ou evitar doenças, estados de doença, defeitos físicos ou afecções patológicas pela aplicação no ou dentro do corpo humano. De acordo com a invenção, os adjuvantes medicinais são substâncias utilizadas como ingredientes activos na produção de fármacos. Os adjuvantes farmacêutico-técnicos servem para formular adequadamente o fármaco ou a composição farmacêutica e, se necessário durante o processo de produção somente, podem mesmo ser removidos posteriormente, ou eles podem ser parte da composição farmacêutica como portadores farmaceuticamente toleráveis. Os exemplos de portadores farmaceuticamente toleráveis serão dados a seguir. A formulação de fármaco ou a formulação da composição farmacêutica é opcionalmente efectuada em combinação com um portador farmaceuticamente tolerável e/ou diluente. Os exemplos de portadores farmaceuticamente toleráveis são bem conhecidos dos qualificados na técnica e compreendem, por exemplo salina tamponada de fosfato, água, emulsões tais como emulsões de óleo/água, diversos tipos de detergentes, soluções estéreis, e assim por diante. Os fármacos ou 46 composições farmacêuticas compreendendo tais sportadores podem ser formulados por meio de métodos convencionais bem conhecidos. Estes fármacos ou composições farmacêuticas podem ser administrados a um indivíduo a uma dose adequada, por exemplo, em um intervalo de 1 μιη a 10 g de moléculas de reconhecimento por dia, e paciente. As doses de 1 mg a 1 g são preferidas. Preferida é a administração de doses em um número tão pequeno e tão baixo quanto possível, preferivelmente uma única dose, por exemplo de uma molécula de reconhecimento radiomarcada. A administração pode ser efectuada por várias vias, por exemplo, intravenosa, intraperitoneal, intrarectal, intragastrointestinal, intranodal, intramuscular, local, por exemplo, intratumoral, mas também por via subcutânea, intradérmica ou na pele ou através da mucosa. A administração de ácidos nucleicos pode também ser efectuada sob a forma de uma terapia genética, por exemplo, por meio de vectores virais descritos acima. O tipo de dosagem e via de administração pode ser determinada pelo médico assistente, de acordo com factores clínicos. Como é familiar para os qualificados na técnica, o tipo de dosagem vai depender de diversos factores, tais como o tamanho, a superfície corporal, a idade, o sexo ou a condição geral de saúde do paciente, mas também do agente particular a ser administrado, do período de tempo e do tipo de administração, bem como de outros medicamentos eventualmente administrados em paralelo.

Uma "composição de vacina" é uma composição farmacêutica para a imunização activa profilática ou terapêutica de pacientes, de modo a provocar uma resposta imune específica contra o epítopo do tumor de MUC1 glicosilado no paciente através da rede imunológica.

Mais especificamente, as composições farmacêuticas ou fármacos compreendem uma substância farmacológica a qual inclui uma ou mais moléculas de reconhecimento da invenção e/ou moléculas de ácido 47 nucleico codificando a mesma, em uma solução ou forma de administração adequada. A sua administração pode ser efectuada quer individualmente ou em conjunto com os adjuvantes apropriados descritos em conecção com os fármacos ou composições farmacêuticas, ou em combinação com um ou mais adjuvantes, por exemplo, QS-21, GPI-0100 ou outras saponinas, emulsões de água-óleo, tais como adjuvantes de montanida, polilisina, compostos de poliarginina, compostos de DNA, tais como CPG, Detox, vacinas bacterianas, tais como a vacina da febre tifoide ou vacinas de BCG, sais tais como fosfatos de cálcio, e/ou outros materiais apropriados que aumentam o efeito, preferivelmente moléculas imunoestimulatórias, tais como as interleucinas, por exemplo, IL-2, IL-12, IL-4 e/ou factores de crescimento, tais como o GM-CSF. Eles são misturados com as moléculas de reconhecimento da invenção de acordo com métodos bem conhecidos e administrados em formulações e dosagens adequadas. As formulações, as dosagens e os componentes adequados são bem conhecidos dos qualificados na técnica. A produção dos medicamentos ou das composições farmacêuticas, prossegue de acordo com os métodos conhecidos por si só.

Os fármacos ou composições farmacêuticas são utilizados na profilaxia ou no tratamento das doenças tumorais e/ou metástases, especialmente no tratamento de doenças tumorais positivas de MUC1 e metástases, tais como os carcinomas mamários, tumores gastrointestinais, incluindo os carcinomas do cólon, os carcinomas do estômago, o cancro do intestino grosso e o cancro do intestino delgado, carcinomas do pâncreas, carcinomas do ovário, carcinomas hepáticos, cancro do pulmão, carcinomas de células renais, mieloma múltiplo. Por exemplo, o tratamento é dirigido contra tumores primários, doenças tumorais residuais minimas, recidivas e/ou metástases. 0 tratamento dos tumores também pode ser efectuado como 48 um tratamento adjuvante. Os fármacos também podem ser usados na profilaxia de doenças tumorais positivas de MUC1. Por exemplo, a utilização profilática é dirigida para a profilaxia de tumores e metástases. Os agentes de tumores são administrados de uma forma adequada, de acordo com métodos bem conhecidos. Uma variante preferida é a injecção ou administração dos fármacos por via intravenosa, localmente, em cavidades corporais, por exemplo, por via intraperitoneal, intrarectal, intragastrointestinal, localmente, por exemplo, directamente em um tumor, em órgãos ou vasos linfáticos (intranodal), mas também por via subcutânea, intradérmica ou sobre a pele, e intramuscularmente. Em uma forma preferida, os tipos de administração também podem ser combinados, em cujo caso a administração pode ser feita em dias diferentes de tratamento ou em um dia de tratamento. De acordo com a invenção, também é possivel combinar dois ou mais fármacos da invenção ou composições farmacêuticas ou um ou mais fármacos da invenção com um ou mais fármacos ou tratamentos tumorais, tais como terapias de anticorpos, quimioterapias ou radioterapias, convenientemente administrados ou aplicados ao mesmo tempo ou separadamente no tempo. As formulações, dosagens e combinações adequadas de componentes são bem conhecidas dos qualificados na técnica ou podem ser determinadas de acordo com métodos bem conhecidos. A presente invenção também diz respeito a um método para a produção de um fármaco ou de uma composição farmacêutica, que compreende as etapas de produção de moléculas de reconhecimento e que compreende adicionalmente a etapa de formulação das moléculas de reconhecimento da invenção em uma forma farmaceuticamente tolerável. As moléculas de reconhecimento inventivas preferidas para este fim são descritas acima como formas de realização do tratamento de doenças tumorais e profilaxia, bem como em agentes de diagnóstico in vivo a seguir. 49

Por conseguinte, as moléculas de reconhecimento da invenção e as substâncias e composições produzidas utilizando o método de acordo com a invenção podem ser utilizadas preferencialmente na profilaxia, diagnóstico, acompanhamento e/ou tratamento de doenças tumorais. Além disso, é preferível utilizar as moléculas de reconhecimento, vectores e/ou o fármaco ou a composição farmacêutica na profilaxia e/ou no tratamento de doenças cancerígenas, incluindo tumores e metástases.

Em uma forma de realização preferida a doença ou tumor canceroso a ser tratado ou profilacticamente impedido, ou cujo reaparecimento é impedido, é seleccionada a partir do grupo de doenças cancerígenas ou doenças tumorais da região do ouvido-nariz-garganta, dos pulmões, mediastino, tracto gastrointestinal, sistema urogenital, sistema ginecológico, mama, sistema endócrino, pele, ossos e sarcomas de tecidos moles, mesoteliomas, melanomas, neoplasias do sistema nervoso central, doenças cancerosas ou doenças tumorais durante a infância, linfomas, leucemias, síndromas paraneoplásicas, metástases com tumor primário desconhecido (síndroma de CUP) , carcinomatoses peritoneais, doenças malignas relacionadas com a imunossupressão e/ou metástases tumorais.

Mais especificamente, os tumores podem compreender os seguintes tipos de câncro: adenocarcinoma da mama, próstata e cólon; todas as formas de câncro do pulmão a partir do tubo brônquico; câncro da medula óssea, melanoma, hepatoma, neuroblastoma; papiloma; apudoma, coristoma, branquioma; síndroma carcinóide maligna; doença cardíaca carcinóide, carcinoma (por exemplo, carcinoma de Walker, carcinoma celular basal, carcinoma squamobasal, carcinoma de Brown-Pearce carcinoma ductal, tumor de Ehrlich, carcinoma in situ, carcinoma cancro-2, carcinoma de células de Merkel, câncro das mucosas, carcinoma brônquico não parvicelular, carcinoma das células da 50 pituitária, carcinoma papilar, carcinoma fibroso, carcinoma brônquio-alveolar, carcinoma brônquico, carcinoma espinocelular e carcinoma de células de transição); perturbação funcional histiocitica; leucemia (por exemplo, em conexão com a leucemia de células B, leucemia de células mistas, leucemia de células nulas, leucemia de células T, leucemia crónica de células T, leucemia associada a HTLV-II, leucemia linfocitica aguda, leucemia linfocitica crónica, leucemia de mastócitos, e leucemia mielóide) ; histiocitose maligna, doença de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin, tumor de células plasmáticas solitárias; reticuloendoteliose, condroblastoma; condroma, condrossarcoma; fibroma; fibrossarcoma, tumores de células gigantes; histiocitoma; lipoma; lipossarcoma; leucosarcoma; mesotelioma; mixoma; mixossarcoma; osteoma; osteossarcoma; sarcoma de Ewing; sinovioma; adenofibroma; adenolinforna; carcinossarcoma, cordoma, craniofaringeoma, disgerminoma, hamartoma; mesenquimoma; mesonefroma, miossarcoma, ameloblastoma, cementoma; odontoma; teratoma; timoma, corioblastoma; adenocarcinoma, adenoma; colangioma; colesteatoma; cilindroma; cistadenocarcinoma, cistoadenoma; tumor da célula granulosa; ginadroblastoma; hidradenoma; tumor da célula iliota; tumor da célula de Leydig; papiloma; tumor da célula de Sertoli, tumor da célula de teca, leiomioma, leiomiossarcoma; mioblastoma; mioma; miossarcoma; rabdomioma; rabdomiossarcoma; ependimoma; ganglioneuroma, glioma; meduloblastoma, meningioma; neurilemoma; neuroblastoma; neuroepitelioma, neurofibroma, neuroma, paraganglioma, paraganglioma não cromafina, angioqueratoma, hiperplasia angiolinfóide com eosinofilia; angioma esclerosante; angiomatose; glomangioma; hemangioendotelioma; hemangioma; hemangiopericitoma, hemangiossarcoma; linfangioma, linfangiomioma, linfangiossarcoma; pinealoma; doença de Brodie; hemangiossarcoma; linfangiossarcoma; mixossarcoma, carcinoma do ovário; sarcoma (por exemplo, sarcoma de Ewing, experimentalmente, sarcoma de Kaposi e 51 sarcoma de mastócitos); neoplasias (por exemplo, neoplasias ósseas, neoplasias mamárias, neoplasias do sistema digestivo, neoplasias colorretais, neoplasias do figado, neoplasias do pâncreas, neoplasias da hipófise, neoplasias do testículo, neoplasias orbitais, neoplasias da cabeça e do pescoço, do sistema nervoso central, neoplasias do órgão da audição, pélvica, do tracto respiratório e do tracto urogenital); neurofibromatose e displasia de células escamosas cervicais.

Em uma outra forma de realização preferida, a doença ou tumor canceroso a ser tratado ou profilaticamente impedido, ou cujo reaparecimento é impedido, é seleccionado a partir do grupo de doenças cancerosas ou de doenças tumorais compreendendo células, incluindo o MUC1 na definição de acordo com a invenção, selecionadas a partir do grupo de: tumores da região do ouvido, nariz, garganta, compreendendo os tumores do interior do nariz, seios nasais, nasofaringe, lábios, cavidade oral, orofaringe, laringe, hipofaringe, ouvido, glândulas salivares, e paragangliomas, tumores dos pulmões, compreendendo carcinomas brônquicos não parvicelulares, carcinomas brônquicos parvicelulares, tumores do mediastino, tumores do tracto gastrointestinal, compreendendo os tumores do esófago, estômago, pâncreas, figado, vesicula e das vias biliares, intestino delgado, cólon e carcinomas rectais e carcinomas anais, tumores urogenitais compreendendo os tumores dos rins, uréter, bexiga, glândula da próstata, uretra, pénis e testículos, tumores ginecológicos compreendendo os tumores do colo do útero, vagina, vulva, cancro uterino, doença de trofoblasto maligna, carcinoma do ovário, tumores do tubo uterino (Tuba Faloppii), tumores da cavidade abdominal, carcinomas mamários, os tumores de órgãos endócrinos, compreendendo os tumores da tiróide, paratiróide, córtex adrenal, tumores do pâncreas endócrinos, tumores carcinóides e síndroma 52 carcinóide, neoplasias endócrinas múltiplas, sarcomas dos ossos e dos tecidos moles, mesoteliomas, tumores cutâneos, melanomas compreendendo melanomas cutâneos e intraoculares, tumores do sistema nervoso central, tumores durante a infância, compreendendo o retinoblastoma, tumor de Wilms, neurofibromatose, neuroblastoma, sarcoma de Ewing da familia dos tumores, rabdomiossarcoma, linfomas que compreendem linfomas de não Hodgkin, linfomas de células T cutâneos, linfomas primários do sistema nervoso central, doença de Hodgkin, leucemias incluindo as leucemias agudas, leucemias linfáticas e mielóide crónica, neoplasias de células plasmáticas, síndromas de mielodisplasia, síndromas paraneoplásicas, metástases com tumores primários desconhecidos (síndroma de CUP) , carcinomatose peritoneal, malignidade relacionada com a imunossupressão compreendendo neoplasias relacionadas com a SIDA tais como o sarcoma de Kaposi, linfomas associados com a SIDA, linfomas associados com a SIDA do sistema nervoso central, doença de Hodgkin associada com a SIDA, e tumores anogenitais associados com a SIDA, malignidades relacionadas com transplantes, tumores metastisados compreendendo metástases cerebrais, metástases pulmonares, metástases hepáticas, metástases ósseas, metástases pleurais e pericárdicas, e ascites malignas.

Em uma outra forma de realização preferida a doença ou tumor canceroso a ser tratado ou profilaticamente impedido, ou cujo reaparecimento é impedido, é seleccionado a partir do grupo que compreende doenças cancerosas ou doenças tumorais tais como carcinomas mamários, tumores gastrointestinais, incluindo carcinomas do cólon, carcinomas do estômago, cancro do intestino grosso e cancro do intestino delgado, carcinomas do pâncreas, carcinomas do ovário, carcinomas hepáticos, câncro do pulmão, carcinomas de células renais, mielomas múltiplos. 53

Em uma outra forma de realização preferida as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção são utilizadas na profilaxia de carcinomas mamários ou do ovário em mulheres que têm um risco aumentado de cancro da mama.

Em uma outra forma de realização preferida a doença ou tumor canceroso ou a metastização a serem tratados ou profilaticamente impedidos, ou cujo reaparecimento é impedido, é especificamente seleccionada a partir do grupo de tumores gastrointestinais e preferivelmente carcinomas do cólon, carcinomas do estômago e carcinomas do recto.

As moléculas de reconhecimento da invenção podem ser directamente empregues no tratamento ou na profilaxia de doenças tumorais ou juntamente com estruturas efectoras adicionais. De acordo com a invenção, "estruturas efectoras" são entendidas como sendo compostos químicos ou bioquímicos, moléculas ou átomos os quais, directamente ou indirectamente causam destruição ou danos, incluindo, por exemplo, a redução de crescimento ou a inibição do crescimento de células tumorais. Por exemplo, estes incluem radioisótopos, toxinas, agentes citostáticos e outras moléculas efectoras tais como citoquinas e quimioquinas ou outras estruturas que representam os próprios efectores ou sendo acoplados às referidas moléculas efectoras, por exemplo, lipossomas carregados com toxinas ou agentes citostáticos, os quais suportam as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção. Neste último exemplo de lipossomas, particularmente aquelas estruturas efectoras estão relacionadas, as quais, para além da molécula de reconhecimento para a especificidade de tumor, suportam moléculas responsáveis pela recepção de estruturas efectoras ou dos seus componentes em células, tais como os anticorpos contra os receptores que causam a endocitose mediada pelo receptor. Nesses casos, as moléculas de 54 reconhecimento compreendem preferivelmente um domínio transmembranar possibilitando a sua inserção na membrana lipossomal, ou, em outra forma de realização preferida as moléculas de reconhecimento são quimicamente acopladas sobre a superfície do lipossoma. As técnicas utilizadas para este fim são bem conhecidas dos qualificados na técnica, incluindo a produção dos lipossomas. A ligação das moléculas de reconhecimento com outras estruturas efectoras também prossegue de acordo com métodos conhecidos por si só. Como já definido acima, a ligação pode ser efectuada por exemplo, directamente por carga covalente ou não covalente, por acoplamento químico, o qual pode necessitar de uma molécula química ou biológica adicional, por exemplo, um agente de quelação ou ligante, ou sob a forma de proteínas ou péptidos de fusão, através da fusão. As moléculas de reconhecimento são empregues no tratamento de doenças tumorais com tumores que suportam o MUC1 ou na profilaxia, a qual, por exemplo, impede a formação de tumores primários ou metástases. Um objectivo preferido é o tratamento da doença residual mínima e de metástases. As moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção são administradas em uma formulação adequada, de uma só vez ou repetidamente, a intervalos apropriados e com doses adequadas.

Em uma forma de realização preferida as moléculas de reconhecimento radioactivas acima descritas, de acordo com a invenção são combinadas com uma aplicação de moléculas de reconhecimento específicas de MUC1 não marcadas, de acordo com a invenção. Isto contribui para uma melhoria dos antecedentes e uma ligação mais específica ao tumor por pequenas quantidades de saturação de moléculas que sustentam o MUC1 no sangue. Para este efeito, as moléculas de IgG e mais preferivelmente as moléculas de reconhecimento derivadas de IgM são preferencialmente utilizadas, por exemplo, um clgMG um ou uma sua forma humanizada, porque 55 primeiramente ligam-se ao antigénio de MUC1 no sangue, reduzindo, assim, a carga do antecedente e a radioactividade do soro e aumentando a focalização relativa do tumor, enguanto limita a penetração em tecidos e tumores em virtude do tamanho das moléculas. Os procedimentos e tecnologias utilizadas para este fim são bem conhecidas dos qualificados na técnica, e um especialista na tecnologia também será capaz de conceber uma dose, formulações, via de aplicação, e tempo de administração adequados das referidas moléculas de reconhecimento não marcadas. A presente invenção também diz respeito aos métodos para a produção de um agente de diagnóstico, compreendendo as etapas do método inventivo para a produção de moléculas de reconhecimento especificas de MUC1 de acordo com a invenção e, além disso, que compreende a etapa de formulação das moléculas de reconhecimento em uma forma diagnosticamente utilizável. A composição farmacêutica de acordo com a invenção, pode ser um seu "agente de diagnóstico". De acordo com a invenção, o termo "agente de diagnóstico" define substâncias e preparações de substâncias cujo objetivo é o de reconhecer doenças, estados de doenças, defeitos fisicos ou afecção patológica por aplicação em ou no corpo humano. Preferencialmente, as partes do corpo humano são entendidas como sendo fluidos corporais tais como sangue, soro sanguíneo, linfa, urina, fluido espinal, ou esperma, biópsias de tecidos ou amostras. A formulação do agente de diagnóstico preferivelmente compreeende a modificação das moléculas de reconhecimento produzidas com substâncias que permitem a detecção do antigénio de MUC1. As substâncias adequadas são bem conhecidas na técnica. Com base na selecção de uma substância, um especialista na técnica será capaz 56 de tomar as medidas adequadas a fim de formular um agente de diagnóstico.

De acordo com a invenção, também é possível para fins de diagnóstico, acoplar substâncias às moléculas de reconhecimento de acordo com métodos conhecidos por si só, o que facilita a detecçao de antigénios de MUCl e/ou as suas células portadoras, por exemplo, por biotinilação, marcação por fluorescência, marcação radioactiva ou ligação da enzima das moléculas de reconhecimento.

Um outro método de diagnóstico e prognóstico do tumor utiliza moléculas de reconhecimento da invenção, as quais reconhecem os antigénios de MUCl no soro de seres humanos. Também, contra os antecedentes das moléculas de reconhecimento, a propriedade de ligação muito menor de MUCl no soro, em comparação com os anticorpos bem conhecidos HMFG-1 e DF-3 (teste de CA15-3), isto é possível e vantajoso, porque as moléculas de reconhecimento de acordo com as invenção, são capazes de distinguir claramente entre o soro normal e o soro tumoral, mesmo naqueles casos em que a ligação no soro de pacientes com carcinoma do cólon, é baixa. A determinação é preferencialmente qualitativa, quantitativa e/ou em quantidades relativas dependentes do tempo, de acordo com métodos conhecidos por si só. De acordo com a invenção, os mesmos métodos também são utilizados no acompanhamento de doenças tumorais e para controlar o curso do tratamento, incluindo o acompanhamento das respostas imunológicas, e para o controlo e dosagem de tratamentos tumorais. As técnicas utilizadas em tais métodos são bem conhecidas, por si só, por exemplo, ELISA, manchemento de Western, FACS (triagem da célula activada por fluorescência), MACS (triagem da célula magneticamente activada), ADCC (citotoxicidade 57 celular dependente do anticorpo), CDC (citotoxidade dependente do complemento), imunocitoquímica e imuno-histoquímica.

Os métodos inventivos preferidos de diagnóstico e prognóstico do tumor utilizam as moléculas de reconhecimento específicas de MUC1 da invenção em métodos bem conhecidos por si só para detectar o antigénio do epítopo do tumor de MUC1 glicosilado no soro ou em preparações de tecido. Nestes métodos, o antigénio de MUCl, o MUC1 presente em complexos imunológicos e/ou o MUCl ligado em células é detectado, e a presença do antigénio de MUCl é determinada qualitativamente, quantitativamente e/ou em quantidades relativas, de acordo com métodos conhecidos por si só. De acordo com a invenção, os mesmos métodos são empregues no acompanhamento de doenças tumorais e para controlar o curso dos tratamentos. As técnicas utilizadas em tais métodos são bem conhecidas, por si só, por exemplo, ELISA, manchemento de Western, FACS (triagem da célula activada por fluorescência), MACS (triagem da célula magneticamente activada), ADCC (citotoxicidade celular dependente do anticorpo), CDC (citotoxidade dependente do complemento), imunocitoquímica e imuno-histoquímica.

Uma forma de realização preferida é um teste rápido de tecido em que as amostras de tecido são manchadas com moléculas de reconhecimento da invenção marcadas por fluorescência em um método imuno-histológico. Em um outro método preferido a molécula de reconhecimento, de acordo com a invenção, preferivelmente um anticorpo de isotipo de IgG, é combinado com um outro anticorpo que reconhece especificamente o antigénio de núcleo 1, preferencialmente o isotipo de IgM. A vantagem é que, por exemplo, no diagnóstico do carcinoma gastrointestinal (por exemplo, carcinomas colorectais e carcinomas gástricos), o reconhecimento, numa fase precoce e, ao mesmo tempo, o prognóstico em relação ao 58 curso da doença e/ou do risco de metastasização no fígado é possível, níveis mais elevados de núcleo 1 e do antigénio de MUC1 indicando um prognóstico mais desfavorável quanto ao curso, e níveis mais elevados de núcleo 1 indicando uma probabilidade de metastasização no fígado aumentada várias vezes. Em uma outra forma de realização preferida os anticorpos e as moléculas de reconhecimento são directamente marcadas com vários corantes fluorescentes, por exemplo, Cy3 e Cy5 ou Cy3 e FITC. Em uma forma de realização, em que a intensificação do sinal é vantajosa, os anticorpos e/ou as moléculas de reconhecimento são reforçados por anticorpos secundários marcados ou por biotina-estreptavidina. Vantajosamente, diversos isotipos e/ou sequências de espécies na região constante de anticorpos são utilizados. As técnicas e os métodos utilizados para este fim, por exemplo, de marcação e imuno-histologia, bem como a selecção dos formatos adequados de moléculas de reconhecimento são bem conhecidos dos qualificados na técnica. 0 método de diagnóstico descrito acima não é restricto a tumores gastrintestinais, mas pode ser utilizado em qualquer doença tumoral envolvendo o antigénio de MUC1.

Para um teste de tumor sorológico, uma outra forma de realização preferida da invenção combina a determinação de MUC1, como descrito acima, com a determinação de outros marcadores tumorais sorológicos, por exemplo, PSA, CEA ou AFP. Uma forma de realização preferida neste caso é a determinação de MUC1 e do antigénio do núcleo 1. Em uma forma de realização preferida, o MUC1 é imobilizado a partir do soro em uma fase sólida, utilizando um anticorpo específico de MUC1, e detectado com uma molécula de reconhecimento da invenção como o anticorpo de detecção, o qual liga especificamente o epítopo do tumor de MUC1 glicosilado, e o antigénio do núcleo 1 é detectado em MUC1, imobilizado por meio de um anticorpo necrófago anti-MUCl, tal como as moléculas de 59 reconhecimento especificas de MUC1 da invenção, utilizando um anticorpo de anti-núcleo lespecifico. Este teste de diagnóstico combina o reconhecimento precoce com uma declaração de prognóstico quanto ao curso da doença e/ou a probabilidade de metastasização no figado. As técnicas utilizadas para este fim, por exemplo, a marcação e a sorologia, incluindo os métodos de detecção, são bem conhecidas dos qualificados na técnica. Os métodos de diagnóstico acima descritos não estão limitados aos tumores gastrintestinais, mas podem ser utilizados em qualquer tumor que suporta o antigénio de MUC1. Os testes serológicos descritos acima são utilizados no diagnóstico, acompanhamento ao longo de uma doença tumoral, e no prognóstico dos tumores positivos de MUC1.

Para o diagnóstico in vivo, as moléculas de reconhecimento da invenção são marcadas usando , métodos conhecidos por si só adequados e, portanto, disponiveis para, métodos de imagem por si só conhecidos em seres humanos, por exemplo radioimunodiagnósticos, métodos de mapeamento PET ou endoscopia por imunofluorescência, por exemplo pelo acoplamento e/ou carga com as moléculas apropriadas, por exemplo os isótopos radioactivos, tais como indio, ou corantes fluorescentes, tais como Cy3, Cy2, Cy5 ou FITC. Em uma forma de realização preferida, os multicorpos de acordo com a invenção são covalentemente acoplados com um agente quelante adequado (por exemplo, DOTA ou DTPA) e, carregados com indio-111, utilizado em diagnósticos in vivo. Em uma forma de realização preferida, eles são administrados por via intravenosa em uma dose apropriada ao indivíduo, e a localização do antigénio de MUC1 e de um potencial tumor é medida de acordo com métodos conhecidos por si só. Os métodos e tecnologias utilizados para este fim, incluindo os métodos de imagem, são bem conhecidos dos qualificados na técnica, e um especialista na tecnologia também será capaz de conceber uma dose e formulações adequadas. 60

Em uma outra forma de realização preferida, as imunoglobulinas, preferivelmente o IgG, são radiomarcadas como acima descrito e ilustradas em maior detalhe nos exemplos, por exemplo, com indio-111, e administradas localmente no tumor ou nos vasos sanguíneos fornecendo ou evacuando o tumor. Em uma forma de realização, isto é utilizado para determinar o tamanho do tumor e, em uma outra forma de realização, para determinar gânglios linfáticos afectados. Os métodos e tecnologias utilizados para este fim são bem conhecidos dos qualificados na técnica, e um especialista na tecnologia também será capaz de conceber uma dose e formulações adequadas.

Em uma outra forma de realização, as moléculas de reconhecimento radioactivamente marcadas da invenção também são administradas por outras vias de aplicação. As vias preferidas são intraperitoneal, intranodal ou intrarectal e intragastrointestinal, respectivamente. A via intraperitoneal é particularmente vantajosa na determinação de tumores acessíveis através do peritoneu e/ou metastização nele, por exemplo, carcinomas do ovário e certos carcinomas gastrointestinais. A administração intrarectal ou intragastrointestinal é vantajosa em alguns tumores gastrointestinais e na localização e determinação das dimensões dos mesmos. Em alguns casos, pode ser utilizada a via intranodal para infiltração directa nos gânglios linfáticos singulares.

Em uma forma de realização preferida as moléculas de reconhecimento radioactivas acima descritas da invenção são combinadas com uma aplicação de moléculas de reconhecimento específicas de MUC1 não marcadas da invenção para agentes de diagnóstico in vivo. Isto é para melhorar o antecedente. Os métodos e tecnologias utilizados para este fim são bem conhecidos dos qualificados na técnica, e um especialista na tecnologia também será capaz de conceber uma dose, 61 formulações, via de aplicação, e tempo de administração adequados das referidas moléculas de reconhecimento não marcadas.

Em uma outra forma de realização preferida, as moléculas de reconhecimento da invenção, preferivelmente as imunoglobulinas, multicorpos ou fragmentos de anticorpos, mais preferivelmente IgG, Fab e multicorpos, são marcadas com um corante fluorescente e administrados in vivo. As vias de aplicação preferidas são intrarectal, intragastrointestinal, intraperitoneal, intravenosa e no fornecimento ou evacuação dos vasos sanguíneos. Uma forma de realização particularmente preferida é usada para localizar carcinomas gastrointestinais, através da endoscopia de fluorescência a seguir à aplicação das moléculas de reconhecimento marcadas por fluorescência. Em uma outra forma de realização preferida uma molécula de reconhecimento da invenção é combinada com pelo menos um anticorpo a um outro antigénio tumoral, preferivelmente um anticorpo anti-núcleo 1. Em uma forma preferida, diferentes corantes fluorescentes são utilizados, permitindo a diferenciação das moléculas de reconhecimento e dos anticorpos, combinando assim uma declaração de prognóstico com um reconhecimento precoce e um maior número de casos. Os corantes fluorescentes preferidos são aqueles que têm uma fluorescência menor de base, os quais são bem conhecidos dos qualificados na técnica. Os métodos e tecnologias utilizados para este fim, incluindo os métodos de imagem, por exemplo, a endoscopia por fluorescência, são bem conhecidos dos qualificados na técnica, e um especialista na tecnologia também será capaz de conceber uma dose, formulações, via de aplicação, e tempo de administração adequados das referidas moléculas de reconhecimento não marcadas. A invenção tem várias vantagens: As moléculas de reconhecimento específicas de MUC1 da invenção reconhecem os tipos de carcinomas 62

de uma maneira específica, razão pela qual elas podem ser utilizadas com vantagem no diagnóstico e/ou tratamento de um grande número de pacientes com tumores com diferentes indicações. Além disso, as moléculas de reconhecimento ligam-se vantajosamente a uma extensão muito baixa em áreas no tecido normal inacessível in vivo. Comparado com os marcadores tumorais bem conhecidos, isto é uma vantagem particular e uma notável propriedade das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção. Uma vantagem particular das moléculas de reconhecimento da invenção é a sua elevada especificidade para o tecido tumoral. Em particular, isto é devido à elevada especificidade para um epítopo de tumor de MUC1 glicosilado definido. 0 MUC1 de mucina epitelial polimórfica, na forma da molécula global, é um marcador tumoral bem estabelecido. Como consequência da complexidade da molécula, que é muito grande, altamente glicosilada, consiste essencialmente de um grande número de repetições paralelas polimórficas de resíduos de 20 aminoácidos no estado extracelular, e tem glicosilação heterogénea com relação às repetições paralelas, o MUC1 tem uma variedade de epitopos. As moléculas de reconhecimento da invenção que ligam o epítopo do tumor de MUC1 glicosilado especificamente no sentido da invenção, detectam um epítopo definidoo em MUC1, resultando em uma elevada especificidade das moléculas de reconhecimento para o tecido do tumor. Além disso, uma vantagem particular é que as moléculas de reconhecimento da invenção têm níveis baixos de reconhecimento de tais MUC1 libertados no soro por células tumorais (vazamento). Essa ligação reduzida a MUC1 presente no soro em um paciente com tumor é uma grande vantagem na terapia de doenças tumorais utilizando as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção. Além disso, as moléculas de reconhecimento da invenção apresentam elevada afinidade. Em particular, isto apresenta uma forma de construção de fragmentos de baixa valência, tais como scFv e multicorpos. A 63 possibilidade de ter esses diferentes formatos disponiveis é vantajosa para o desenvolvimento de agentes terapêuticos.

Sem que se pretenda ser uma limitação, a invenção será explicada em pormenor, com referência aos exemplos.

Exemplos 1. Preparação de scFv com diferentes comprimentos de ligação, os quais especificamente reconhecerem o epitopo do tumor de MUC1 glicosilado

Os scFv especifico de MUC1 com as sequências SEQ ID NO. 36 a 59 foram produzidos por amplificação de PCR e subsequente clonagem das cadeias variáveis em um vector de expressão bacteriana. Este vector inclui o promotor lacZ, um local de ligação de ribossoma (RBS), a origem M13, a sequência de sinal pelB para secreção no periplasma, um gene de resistência à ampicilina, e uma cassete de clonagem para acoplar um marcador da hexa-histidina para uma purificação eficiente e um marcador de c-myc para a extremidade de terminal C dos scFv (Fig. 1) . Para diferentes comprimentos de ligação, VH e VL foram amplificados com iniciadores específicos de tal forma que 22 nucleótidos na extremidade 3' do VH e na extremidade 5' de VL formaram uma região complementar (Fig. 2, PCR I e PCR II). Posteriormente, a seguir à purificação, os dois fragmentos de PCR foram ligados em um SOE-PCR (Fig. 2, PCR III), e o fragmento de PCR foi clonado no vector acima descrito através de NcoI/NotI. 2. Expressão e Purificação Bacteriana de scFv que Especificamente Reconhece o Epitopo do Tumor de MUC1 glicosilado 64

Os fragmentos de anticorpos do Exemplo 1 foram expressos em Escherichia coli e purificados. Para este efeito, o plasmídeo correspondente foi transformado em E. coli electrocompetente por meio de eletroporação e cultivado em meio de 2xTY (10 g de extracto de levedura, 16 g de triptona, 5 g de NaCl por litro) , com 100 pg/ml de ampicilina durante a noite. Esta cultura foi diluida 1:100 com meio 2xTY adicionado com 100 pg/ml de ampicilina e 0,5% de glicose e incubada a 37 °C até um ODeoonm de cerca de 0,6 ter sido atingido. Posteriormente, a cultura foi adicionada com 1 mM de IPTG para a indução e incubada a 25 °C durante mais 5 horas. As bactérias foram colhidas por centrifugação a 4000xg durante 20 minutos, o sedimento da célula foi ressuspenso em tampão TES (30 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 20% de sacarose, 1 mM de EDTA) e incubadas em gelo durante 20 minutos. Posteriormente, 5 mM de MgS04 foi adicionado, e a suspensão foi incubada em gelo durante mais 20 minutos. A fracção de periplasma foi obtida por centrifugação a 4000xg durante 60 minutos e dializada contra tampão de ligação (50 mM de tampão fosfato, pH 8,0, 300 mM de NaCl, 10 mM de imidazol) a 4 °C durante a noite. Os fragmentos de anticorpo contidos na fracção de periplasma foram purificados por cromatografia de afinidade de ião metálico (HiTrap Chelating HP, Amersham Pharmacia Biotech), utilizando o marcador His de terminal C. Para este efeito, a fracção dializada foi carregada em uma coluna previamente equilibrada com tampão de ligação, e as proteinas de não ligação foram lavadas a partir da coluna com tampão de lavagem (50 mM de tampão fosfato, pH 8,0, 300 mM de NaCl, 30 mM de imidazol) . Posteriormente, os fragmentos de anticorpos foram eluidos com tampão de eluição (50 mM de tampão fosfato, pH 8,0, 300 mM de NaCl, 300 mM de imidazol). 65 3. Clonagem de Vectores para Expressarem Anticorpos de IgG e IgM Quiméricos que Reconhecem Especificamente o Epitopo do Tumor de MUC1 Glicosilado 0 fragmento de ADN de Ncol/Xhol partir do vector scFv, o qual codifica VH (FIG. 1) , foi clonado no vector lider BS cultivado Ncol/Sall (FIG. 3). 0 vector lider BS inclui uma cassete de clonagem para introduzir a sequência do péptido de sinal do receptor da célula T na extremidade 5' e uma sequência dadora de união na extremidade 3' das sequências dos domínios variáveis (FIG. 3). A sequência de VL do anticorpo correspondente foi amplificada com iniciadores específicos para introduzir o local de restrição Ncol na extremidade 5' e o local de restrição Nhel na extremidade 3' no PCR utilizando a sequência de scFv como modelo e, depois da digestão de Ncol/Nhel, clonada no mesmo vector líder BS digerido. Posteriormente, cada fragmento HindIII/BamHI do vector líder BS foi clonado no correspondente vector de expressão eucariótico. Estes vectores (pEFpuroCYlVH, pEFpuroCpVH e pEFneoCKVL) incluem o promotor EF-Ια e o intensificador HCMV, a origem SV40, o sinal de poliadenilação BGH, o gene de resistência à puromicina no vector para a cadeia pesada e o gene de resistência à neomicina no vector para a cadeia leve, bem como as sequências do genoma da região γΐ constante humana ou da região μ para a cadeia pesada ou da região κ constante humana, para a cadeia leve (iniciadores para amplificação do ADN humano genómico e o mapa do vector, ver a FIG. 3) . 4. Expressão Eucariótica dos Anticorpos de IgG e IgM Quiméricos, os quais Reconhecem Especificamente o Epitopo do Tumor de MUC1 Glicosilado, em Células CHO e a sua Purificação 66

Para expressar os anticorpos quiméricos clgG-Pankol que consistem das sequências SEQ ID NO. 64 e 68 , cIgG-Panko2 que consistemdas sequências SEQ ID NO. 65 e 69, clgM-Pankol que consistem das sequências SEQ ID NO. 66 e 68, e cIgM-Panko2 que consistem das sequências SEQ ID NO. 67 e 69, as células CHOdhfr (ATCC No. CRL- 9096) foram co-transfectadas com uma mistura de vectores para as cadeias pesada e leve (1:3) por meio de eletroporação (106 células/ml, 500 V, 50 ps) e cultivadas em meio de selecção (meio CHO-S-SFM II (Life Technologies), suplemento de HT (Biochrom), 400 pg/ml de G418, 5 pg/ml de puromicina) durante 2 semanas. A seguir à clonagem da célula singular em uma placa de 96 cavidades, os sobrenadantes foram testados em um teste de ELISA (péptido de MUC1 glicosilado (30-mer, ver abaixo), como antigénio, FcyI-POD anti-humano acoplado ou FC5p-POD anti-humano acoplado (Dianova) como anticorpo secundário) , e o clone com a maior taxa de produção de anticorpo foi selecionado (cerca de 0.5 pg/106 células/24 h).

Para a produção de anticorpos, as células CHO estavelmente transfectadas que segregam o IgG e o IgM quiméricos, respectivamente, foram cultivadas em balões ou frascos de cultura em meio CHO-S-SFM II, suplementado com suplemento de HT, até ter sido alcançada uma densidade celular de cerca de 1 x 106 células/ml. Após a remoção das células do sobrenadante da cultura celular por centrifugação (400xg, 15 minutos), o anticorpo quimérico foi purificado usando uma coluna de proteína A (HiTrap r-proteína A FF, Amersham Pharmacia Biotech) para o IgG quimérico ou uma coluna de afinidade de anticorpo Fc54 anti-humano para o IgM quimérico. A fracção de anticorpo purificado eluído pela súbita mudança de pH foi re-tamponada em PBS e concentrada utilizando tubos de centrifugação Centriprep (corte de 50 kDa, Millipore). 67

5. Análise de scFv e Anticorpos, os quais Reconhecem Especificamente o Epitopo do Tumor de MUC1 glicosilado, em vim teste de ELISA

Diversos péptidos e glicopéptidos sintéticos foram usados como antigénios: um 30-mer não-glicosilado com a sequência APPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSA; um 30-mer glicosilado com a sequência APPAHGVTSAPDT[GalNAca]RPAPGSTAPPAHGVTSA, uma série de péptidos de MUC1 não glicosilados comprimentos variáveis, com a sequência [VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG] n em que n = 1, 3 e 5 (TR1, TR3 e TR5) , e uma série de péptidos de MUC1 glicosilados de comprimento variável, com a sequência A[HGVTSAPDT(GalNAca)RPAPGSTAPPA]n em que n = 1, 3 e 5 (TRlg, TR3g e TR5g). A partir das respectivas soluções de reserva (1 mg em 1 ml de H2O bi-destilado) , com as porções mantidas a -20 °C, foi produzida uma diluição por 1 yg/ml em PBS ou 10 yg/ml em bi-destilado. 50 μΐ/cavidade do acima foi pipetado em uma placa de microplacas, e a placa de teste foi incubada durante a noite (utilizando uma placa de imunoanálise NUNC Maxisorp F96 e a incubação a 4 °C para os péptidos em PBS; utilizando placas Nunclon TC e secagem leve dos péptidos a 37 °C para os péptidos em bi-destilação de H2O) . No dia seguinte, a placa de ensaio foi lavada 3 vezes com PBS/0,2% de Tween. Posteriormente, os locais de ligação não específicos foram bloqueados com 2% de BSA em PBS, e 50 μΐ do primeiro anticorpo foi aplicado (anticorpos de murino: 10-10000 ng/ml de PBS/1% de BSA; IgG quimérico: 1-100 ng/ml em PBS/1% de BSA; scFv: 50-500 ng/ml em PBS/1% de BSA) . Depois de três etapas de lavagem com PBS/0,2% de Tween, os correspondentes anticorpos secundários acoplados à peroxidase foram empregues para detectar os constructos de anticorpos especificamente ligados (um Fcyl anti-rato ou anti-humano para o anticorpo completo, um anticorpo marcador anti-His 68 para o scFv). Para detectar o anticorpo secundário ligado, uma reacção colorimétrica com TMB (3,3', 5,5'-tetrametilbenzidina) foi realizada. Depois de 15 minutos, a reacção foi extinta através da adição de 2,5 N de H2S04. A medição foi realizada utilizando um fotómetro de placa de microplacas com um filtro de 450 nm em forma dupla versus um filtro de 630 nm de referência. Os resultados representativos estão ilustrados nas Figs. 4 a 8. 5.1. Ligação da Região de PDTRP Glicosilado dentro de uma Sequência de Repetição Paralela de MUC1 A FIG. 4 mostra a ligação preferida das moléculas de reconhecimento da invenção ao péptido de MUC1 glicosilado. Duas moléculas de reconhecimento com diferentes sequências em anel em formato de IgG são comparadas. Os constructos de anticorpo de mlgG-Pankol (SEQ ID NO. 60 e SEQ ID NO. 62) e de mIgG-Panko2 (SEQ ID NO. 61 e SEQ ID NO. 63) ligam-se ao 30-mer de uma maneira altamente especifica, preferivelmente ao péptido glicosilado, e só levemente, ou de maneira nenhuma, à sequência de péptido não-glicosilado. Em comparação com o mlgG-Pankol e o mIgG-Panko2, a FIG. 5 ilustra a ligação dos anticorpos HMFG-1 específicos de MUC1, C595 e SM3 ao 30-mer não-glicosilado e glicosilado (exemplo representativo) . Os três anticorpos HMFG-1, C595 e SM3 mostraram nenhuma ou apenas uma ligeira dependência da glicosilação com um factor (proporção do péptido glicosilada/não glicosilado) de < 1,2 para os três anticorpos. Os anticorpos são utilizados para a diferenciação e não fazem parte das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção. Em contrapartida, um factor de > 4,5 (na FIG. 5: 5.1) resulta para mlgG-Pankol e um factor de > 20 (na FIG. 5: 22.1) para mIgG-Panko2 sob as mesmas condições. 69 A FIG. 6 ilustra diferentes formatos das moléculas de reconhecimento da invenção na sua ligação especifica preferida para o péptido de MUC1 glicosilado. 5.2. Ligação a Repetições Paralelas de MUC1 não glicosiladas múltiplas

Como um exemplo representativo, a FIG. 7 mostra a dependência da ligação das moléculas de reconhecimento da invenção, mlgG-Pankol e mIgG-Panko2, no número de repetições paralelas não-glicosiladas em comparação com os anticorpos C595 e SM3 específicos de MUC1. A relação do sinal com o péptido TR5 para que com o péptido TR1 represente um factor que reflecte o grau de dependência de ligação no número de repetições. Os factores de > 3 (na FIG. 7: 3.9) e > 8 (na FIG. 7: 12.7), resulta para mlgG-Pankol e mIgG-Panko2, respectivamente, enquanto os anticorpos C595 específicos de MUC1 (factor 1.1) e SM3 (factor 2.1) não mostram nenhuma ou apenas uma ligeira dependência sob as mesmas condições. 5.3. Ligação a Múltiplas Repetições Paralelas de MUC1 glicosilado

Como um exemplo representativo, a FIG. 8 mostra a dependência da ligação das moléculas de reconhecimento inventivas mIgG-Panko2 sobre o número de repetições paralelas (múltiplas regiões de PDTR glicosilado) em comparação com os anticorpos específicos C595 e SM3 de MUC1. 0 mIgG-Panko2 mostra uma dependência adicional sobre o número de repetições paralelas glicosiladas, enquanto a ligação dos anticorpos C595 e SM3 específicos de MUC1 é independente de qualquer aumento no número de repetições. 70 6. Mancheamento Imuno-histológico e Imunocitológico com Moléculas de Reconhecimento que Reconhecem Especificamente o Epitopo do Tumor de MUC1 glicosilado

Para o mancheamento imuno-histológico, secções congeladas de amostras de tecido apropriado foram secas ao ar e fixadas com 10% de formaldeido em PBS durante 15 minutos. Para reduzir a actividade da peroxidase endógena, os cortes foram tratados com 3% de peróxido de hidrogénio em PBS e, a seguir o bloqueio dos locais de ligação não especificos com soro de coelho, incubados com uma molécula de reconhecimento especifica de MUC1 na forma de um anticorpo primário. Posteriormente, as preparações foram incubadas com um anticorpo secundário apropriado (IgG anti-rato, POD-acoplado). A reacção de mancheamento foi realizada usando o substrato da peroxidase diaminobenzidina, e o contra-mancheamento com hematoxilina. A molécula de reconhecimento exemplar mIgM-Panko2 de acordo com a invenção sofre uma reacção com apenas um pequeno número de estruturas em tecido normal. Estas são principalmente encontradas em regiões privilegiadas imunes do corpo, por exemplo, na superfície apical de células de certos duetos glandulares e, portanto, estão localizadas em áreas inacessíveis ou dificilmente acessíveis a um anticorpo in vivo (Tabela 3) . Além disso, o mancheamento no tecido normal mamário é fraco em comparação com o tecido tumoral e é encontrado somente na membrana apical.

Tabela 3: Reacção de tecido normal humano com o anticorpo mlgG-Panko2 específico de MUC1.

Tipo de tecido Reactividade

Epiderme + /- estrato basal 71 Estômago

Intestino delgado Cólon

Peito

Baço

Próstata Fígado

Rins Gânglios Linfáticos

Vesícula Biliar estrato spinosum estrato granuloso estrato córneo células não epidérmicas epitélio foveolar glândulas de fundo glândulas corporais mucosa mucosa duetos glandulares ácinos células mioepiteliais trabéculas lienis células reticulares linfócitos macrófagos endotélio hepatócitos duetos biliares glomérulos epitélio capsular túbulo proximal túbulo distai túbulo colector linfócitos macrófagos células reticulares mucosa + + -/ + -/ + + 72 Cérebro 72 Glândula Adrenal

Timo

Bexiga

Coração Pâncreas

Tecido Muscular neurónios células gliais meninges células ependimais córtex adrenal medula adrenal células reticulares epiteliais góbulos de Hassall linfócitos macrófagos urotélio endocárdio miocárdio mesotélio duetos glandulares ácinos ilhéus de Langerhans tecido conectivo tecido sinovial músculo liso músculo esquelético -/ + + + +

As moléculas de reconhecimento como reivindicado dão uma reacção positiva com uma variedade de tumores. Os dados na Tabela 4 mostram que as moléculas de reconhecimento especificas de MUC1 reconhecem uma elevada percentagem de pacientes com tumores de uma única indicação, o que difere de uma indicação para a outra. Em adenomas do intestino grosso, o mancheamento correlaciona-se com o grau de displasia. Os adenomas do cólon não reagem com mIgG-Panko2 ou apenas muito ligeiramente, enquanto que os carcinomas do cólon são 73 positivos. 0 tecido normal do pâncreas é apenas ligeiramente positivo, enquanto que os carcinomas do pâncreas mostram uma reacção muito forte com a molécula de reconhecimento mIgG-Panko2 de acordo com a invenção.

Tabela 4: Reacção do tecido tumoral humano com m!gG-Panko2. Cólon

Tipo de tecido % de Casos Positivos

Arienoma tubular vilosidades tubulares vilosidades

Carcinoma da mucosa transitória adenocarcinoma adenocarcinoma papilar adenocarcinoma mucoso adenocarcinoma produtor de mucina carcinoma da célula em anel de sinete -netástases hepáticas Carcinomas do Estômago Carcinomas Hepáticos oem diferenciados •noderadamente diferenciados ligeiramente diferenciados Carcinomas do Pâncreas Carcinomas Mamários carcinomas primários metástases Carcinomas das Células Renais 25 25 33 30 90 67 67 100 100 81 90 14 42 50 100 87 91 100 74

Foi utilizada imunofluorescência para o mancheamento imunocitológico. Para este efeito, as células apropriadas foram ligeiramente secas em lâminas de microscópio e fixadas com 5% de formaldeido durante 10 minutos. A seguir ao bloqueio dos locais de ligação não específicos com BSA (1% em PBS) , as células foram incubadas com as moléculas de reconhecimento da invenção na forma de anticorpos primários. Isto foi seguido por lavagem, 3 vezes com PBS e incubação com o anticorpo secundário marcado por fluorescência apropriado (IgG-FITC anti-rato ou Fab-Cy2 anti-humano, Dianova). Depois de lavagens repetidas com PBS, as células foram embebidas em Mowiol. Várias linhagens celulares foram testadas com moléculas de reconhecimento específicas de MUC1 em imunofluorescência. Um certo número de linhagens de células tumorais deu uma reacção positiva (Tabela 5 e FIGS. 9 e 10).

Tabela 5: Reactividade de várias linhagens de células com o anticorpo m!gG-Panko2especifico de MUC1.

Linhas de células Reactividade ZR-75-1 Positiva T47D Positiva U266 (positiva) LN7 8 Positiva HT2 9 Negativa HCT15 (positiva) HepG2 Negativa K562 Positiva MCF-7 Positiva HEK293 (positiva) A FIG. 9 exemplifica a marcação por fluorescência das células T47D, uma linhagem celular do carcinoma mamário, com mIgG-Panko2. A FIG. 10 exemplifica a marcação por fluorescência das células K562 com clgG-Pankol. 75

Usando a marcação por imuno-histologia e imunofluorescência, a dependência da neuraminidase do epítopo do tumor de MUC1 glicosilado foi também investigada. Para este efeito, as secções ou células foram pré-incubadas com neuraminidase (0,02 U/ml de PBS + 0,01 M de Ca2+) durante uma hora à temperatura ambiente, posteriormente lavadas com PBS e, em seguida, marcadas como acima. Como ilustrado nas Tabelas 6 e 7, a ligação das moléculas de reconhecimento da invenção ao epitopo do tumor de MUC1 glicosilado é independente da neuraminidase no sentido da invenção ou é aumentado pelo tratamento com neuraminidase.

Tabela 6: Mancheamento Imuno-histológico de tecidos humanos com mIgG-Panko2 antes e depois do tratamento com neuraminidase.

Reactividade não tratada Reactividade depois do tratamento com Neuraminidase

Tecidos normais do cólon - - Adenoma do cólon + + Carcinoma do cólon ++ ++ Carcinoma da mama ++ +++

Tabela 7: Marcação por Imunofluorescência rotulagem de duas linhagens de células tumorais com mIgG-Panko2 antes e depois do tratamento com neuraminidase.

Reactividade não tratada Reactividade depois do tratamento com Neuraminidase K562 + ++ ZR-75-1 +++ ++++ 7. Quelação e Marcação Radioactiva de Anticorpos e de Fragmentos de Anticorpos que Reconhecem Especificamente o Epitopo do Tumor de MUC1 Glicosilado

Usando a conjugação, um agente de quelação que permite a ligação de um metal radioactivo foi covalentemente ligado aos anticorpos mlgG- 76

Panko2 e clgG-Pankol ou aos formatos scFv com as sequências SEQ ID NO. 36 e 45. Os produtos comerciais da firma Macrocyclics (Dallas, E.U.A.), ácido p-isotiocianatobenzil-di-etilenotriaminapenta-acético (p-SCN-Bz-DTPA) e ácido p-iso-tiocianatobenzil-1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético (p-SCN-Bz-DOTA) foram empregues como agentes de quelação. Ambos os agentes quelatantes são adequados para se ligarem a anticorpos para a sua radiomarcação [Brechbiel et al., 1986; Kozak et al., 1989; Stimmel et al., 1995]. A conjugação prossegue, através da reacção do grupo de isotiocianato no agente quelante com um grupo amino livre da lisina do aminoácido no anticorpo, formando assim uma ligação covalente N-C entre o agente quelante e o anticorpo.

Inicialmente, o anticorpo purificado ou o fragmento de anticorpo purificado deve ser re-tamponado em tampão de acoplamento, pH 8,7. Para este efeito, a ultrafiltração em uma unidade de filtração (Centriprep YM-50 ou YM-10; Millipore) foi realizada. Isto foi feito por repetidas diluições com um volume de 10 vezes e filtração através de uma membrana de poros definidos usando a centrifugação. Desta forma, o PBS foi substituído por tampão de acoplamento alcalino (0,05 M de carbonato de sódio, 0,15 M de cloreto de sódio, pH 8,7). A quelação foi realizada utilizando os agentes quelantes bifuncionais p-SCN-Bz-DTPA e p-SCN-BZ-DOTA, respectivamente. Para a reacção quelatante, a proteína (1 a 10 mg/ml) em tampão de acoplamento e uma solução do agente quelante de 1 mg/ml em 2% de DMSO/água foram misturados de tal ordem que um excesso molar de quelante fosse assegurado. Este foi seguido por incubação da mistura a 37 °C durante 1 hora. Posteriormente, o agente quelante não ligado foi retirado por ultrafiltração no mesmo vaso 77 (Centriprep YM50 ou YM-10; Millipore) e, como descrito acima, este foi re-tamponado para pH 4,2, em um tampão de carga (0,15 M de acetato de sódio, 0,15 M de cloreto de sódio, pH 4,2), necessários para a marcação radioactiva. A concentração protéica durante e depois desta etapa foi re-ajustada para 1-10 mg/ml utilizando uma medição de UV a 280 nm.

As condições para a reacção quelatante tinha de ser encontrada, a qual permitiria a radiomarcação do anticorpo sem reduzir substancialmente a sua bioactividade. 0 anticorpo quelado foi carregado com um metal radioactivo, produzindo assim o radioanticorpo. Os isótopos 111indio e 90itrio foram utilizados para o carregamento. Ambos têm propriedades quimicas e fisico-quimicas comparáveis, sendo ligados como iões trivalentes (ιηΙη3+, 90γ3+) pelo agente quelante. 0 anticorpo marcado com 111indio é um γ-emissor e é usado clinicamente para encontrar a dose individual para um paciente, enquanto que o 90ítrio é um β-emissor o qual é utilizado terapeuticamente. As meias-vidas são de 67 horas para o lxlIn e de 64 horas para o 90Y. O cloreto de 111indio da empresa NEN (Perkin Elmer, Bélgica) foi utilizado para o carregamento. 0 metal radioactivo é fornecido em uma solução de ácido clorídrico. Primeiro de tudo, a solução de inInCl3 foi levada para uma concentração de 1 M de HC1. Posteriormente, esta foi diluída com 0,05 M de HC1 para uma actividade específica de 80-320 mCi/ml, e uma sua alíquota foi utilizada para incorporação no anticorpo quelado, em cujo caso o volume adicionado da solução de 111InCl3 acídica de HC1 deve ser

igual ao volume da solução de anticorpo fornecida no tampão de acoplamento de pH 4,2, a fim de assegurar a estabilidade do pH. O 78 período de incubação foi de 1 hora a 37 °C, com mistura cuidadosa ocasional.

Posteriormente, o filtro inserido foi re-inserido na unidade de filtração e re-tamponado, como descrito acima, em tampão de fosfato, pH 7,2, incluindo um conteúdo fisiológico de cloreto de sódio. Assim, efectua-se a separação do anticorpo radiomarcado de elevado peso molecular e 111InCl3 não ligado. A quantificação da incorporação de luIn no anticorpo quelado foi feita utilizando-se a cromatografia em camada fina. A taxa de incorporação do metal radioactivo foi de 80-99% da radioactividade empregue. 8. Testes de Ligação Celular e Análise de Scatchard de Moléculas de Reconhecimento Radiomarcadas que Reconhecem Especificamente o Epítopo do Tumor de MUC1 Glicosilado Várias linhagens de células tumorais foram utilizadas para testar a capacidade de ligação das moléculas de reconhecimento radiomarcadas. Em cada determinação dupla, um número definido de células foram colocadas em um recipiente de 1,5 ml e incubadas com quantidades aumentadas de anticorpos. A seguir à lavagem, a quantidade de anticorpos ligados foi determinada com base na taxa de contagem. Este valor foi organizado em um diagrama como a proporção de quantidade ligada/não ligada versus ligada, o declive na região linear da curva foi determinado, e a intersecção da abcissa foi determinada (análise de Scatchard, ver abaixo). lxlO6 células por lote são necessárias. Depois da pré-incubação das células durante uma hora sobre gelo, a quantidade necessária de células foi colocada em recipientes de reacção, centrifugadas (5 minutos a lOOOxg, 25 °C) , e o sobrenadante foi removido. Posteriormente, este foi enchido com PBS/0,1% de Tween20/1% de BSA para fazer um volume de 200 μΐ, subtraindo a quantidade de 79 moléculas de reconhecimento a ser adicionada mais tarde. Posteriormente, a molécula de reconhecimento correspondente foi acrescentada para fazer um volume final de 200 μΐ (cerca de 40 a 500 ng, dependendo da molécula de reconhecimento), e os lotes foram incubados durante uma hora a 4-8 °C. Depois da centrifugação (4 minutos, lOOOxg, 25 °C) , o sobrenadante foi removido e o triturado das células cuidadosamente ressuspenso em 500 μΐ de PBST/1% de BSA. Depois de uma outra lavagem, o triturado celular foi medido no recipiente em uma contagem gama. As taxas de contagem especificas foram determinadas nas soluções iniciais da concentração definida, e o valor em cpm/ng foi usado como uma base de relativização dos valores medidos do anticorpo ligado. Os valores da abcissa são plotados como moléculas ligadas de anticorpos por célula (r) . O valor ordenado respectivo é o quociente de ligação (r) ligação livre, com a ligação livre arepresentar a diferença da quantidade total e a quantidade de anticorpo ligado (valores em M na FIG. 12). A intersecção da abcissa indica o número de locais de ligação/célula. 0 declive da linha recta fornece a associação constante de Kass em [M-1] . A FIG. 11 exemplifica a análise de Scatchard da ligação das moléculas de reconhecimento radiomarcadas em formato de scFv com a sequência SEQ ID NO. 36 (scFv monovalente, FIG. , 11a) e 45 (multicorpo, FIG. 11b) em células T47D, um Kass de 4,5xl06 M_1 e 5,3xl06 locais de ligação/célula para o scFv monovalente e um Kass de l,9xl07 M_1 e 2,6xl06 locais de ligação/célula para o multicorpo a ser obtido sob estas condições.

Na Tabela 8, a associação constante e o número de locais de ligação de células de vários anticorpos e formatos de anticorpos em células K562 são resumidos e comparados com o HMFG-1 utilizado e testados sob as mesmas condições. 80

Tabela 8: teste de ligação celular e análise de Scatchard com moléculas de reconhecimento radiomarcadas em células K562. 80 Anticorpo mIgG-Panko2 HMFG-1 clgG-Pankol cIgG-Panko2 SEQ ID NO. 36 SEQ ID NO. 46

Kass [Μ—1] Número de 9,5 x 10 8 2.7 x 10 8 1,2 x 10 8 6,1 x 10 8 1.8 x 10 7 4.9 x 10 7 locais de ligação/célula 1.0 x 10 5 6,3 x 10 4 1,9 x 10 9 1.1 x 10 5 5,5 x 10 9 4,8 x 10 5 9. Biodistribuição de Moléculas de Reconhecimento Radiomarcadas, que Reconhecem Especificamente o Epitopo do Tumor de MUC1 Glicosilado, em um modelo tumoral in vivo

Como modelo de tumor, o tecido do carcinoma do cólon humano (xenoenxerto No. 5841), foi transplantado por via subcutânea em ratos pelados (Ncr: nu/nu, feminino). 107 células cancerosas da mama ZR-75-1 positivas para MUC1, como um outro modelo tumoral, foram injectadas por via subcutânea em ratos pelados (Ncr: nu/nu, feminino) . Após cerca de 3-4 semanas, o tumor é palpável sob a pele. A cada rato que suporta o tumor (n=5 por ponto em tempo) 5 pg de luIn-marcado de mIgG-Panko2 em 200 μΐ foi administrado na veia caudal. Os ratos foram sacrificados após 5 minutos, 1 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h e 72 h, e a distribuição da radioactividade no tumor, no soro e nos órgãos foi determinada. A FIG. 12 ilustra a acumulação especifica de mIgG-Panko2 no tumor em % ID/g de tumor (em relação à dose injectada e ao peso do tumor) em um modelo de tecido transplantado. Em contrapartida, existe uma depleção de radioactividade nos órgãos e no soro ao longo do perfil do tempo, como indicado. A FIG. 13 resume os resultados com o modelo ZR-75-1. A absorção especifica de m!gG-Panko2 radiomarcado no tumor atinge 81 mais de 85% de ID/g de tumor depois de 72 horas, com a acumulação nos órgãos e no soro a ser muito baixa e comparável com ratos saudáveis. 10. Detecção de MUC1 Secretório Específico de Tumor em vim teste de Sanduíche ELISA de Usando as Moléculas de Reconhecimento que Reconhecem Especificamente o Epítopo do Tumor de MUC1 Glicosilado 0 MUC1 secretório especifico do tumor pode ser detectado em um teste de sanduíche de ELISA. Um anticorpo específico de MUC1 foi utilizado como anticorpo necrófago do MUC1, e uma molécula de reconhecimento da invenção foi utilizada para detectar o MUC1 específico do tumor. Para detectar o MUC1 secretório positivo do núcleo 1, uma molécula de reconhecimento, de acordo com a invenção é utilizada como necrófafo, por exemplo, e um anticorpo específico de núcleo 1 é utilizado para a detecção do antigénio do núcleo 1. Um terceiro anticorpo acoplado por enzima ou por fluorescência deve ser utilizado para detectar o anticorpo secundário.

Os sobrenadantes de três linhagens de células tumorais (K562, ZR-75-1 e T47D) foram analisados como exemplos. Os resultados estão ilustrados na Tabela 9. 105 células por ml de meio de cultura celular foram semeadas, cultivadas durante 4 dias, sem a substituição do meio, uma alíquota foi posteriormente extraída, e o sobrenadante da cultura de células foi separado do granulado celular por centrifugação. 50 μΐ de sobrenadantes não diluídos foram utilizados no teste de ELISA. O teste de sanduíche de ELISA foi realizado pelo revestimento da placa de microplacas com anticorpo necrófago (HMFG-1 ou mIgG-Panko2, 1 pg/ml) em PBS a 4 °C durante a noite. Três concentrações diferentes do anticorpo foram utilizadas para o revestimento (1 pg/ml, 2 pg/ml e 4 pg/ml) . O revestimento de 1 pg/ml foi verificado ser o mais sensível no teste de sanduíche de ELISA. Posteriormente, as placas revestidas foram 82 lavadas duas vezes com PBS e bloqueadas, em 5% de BSA, 0,05% de Tween 20 em PBS durante 1,5 horas à temperatura ambiente. O tampão de bloqueio foi removido, as placas foram lavadas mais uma vez com 0,1% de Tween 20 em PBS (tampão de lavaqem) , as amostras foram adicionadas e incubadas à temperatura ambiente durante 1,5 horas. O meio de cultura celular ou 2% de BSA em tampão de lavagem (tampão de diluição para o anticorpo secundário) foi utilizado como controlo negativo. O controlo positivo não esteve disponível. Para um teste de sanduíche de ELISA de núcleo 1 de MUC1, o tratamento com neuraminidase foi realizado, depois de se lavar três vezes, nas cavidades destinadas para esse fim. Para este fim, uma solução de neuraminidase (Dade Behring, Alemanha) foi diluída, 1:5, em tampão de imidazol (0,68 g de imidazol, 0,19 g de CaCl2 e 0,4 g de NaCl em 100 ml de H2O, pH 6,8) e incubada a 50 μΐ/cavidade durante 30 minutos a 37 °C. Como controlo, o tampão de imidazol sem nenhuma solução de neuraminidase foi incubado em um cavidade correspondente. Posteriormente, as csvidades foram lavadas três vezes e, o mIgG-Panko2 biotinilado (EZ-Link sulfo-NHS-LC-biotina, Pierce) ou um anticorpo de anti-núcleo 1 (mIgM-Karo4) para detectar o MUC1 ou o MUC1 que suporta o núcleo 1, foi adicionado em 2% de BSA em tampão de lavagem e incubado à temperatura ambiente durante mais uma hora. Novamente, isto foi lavado três vezes, seguido pela adição de estreptavidina acoplada à peroxidase ou anticorpo de IgM (μ) anti-rato acoplado à peroxidase (Dianova) diluído, 1:300 e 1:5000, respectivamente, em 2% de BSA em tampão de lavagem e incubação durante 1 hora à temperatura ambiente. Finalmente, as placas foram lavadas duas vezes em tampão de lavagem e uma vez em PBS. A reacção de mancheamento foi realizada em 25 mM de ácido cítrico, tampão de fosfato, pH 5,0, com 0,04% de H2O2 e 0,4 mg/ml de o-fenilenodiamina (Sigma), no escuro, à temperatura ambiente. A reacção de mancheamento foi extinta por se adicionarem 2,5 N de 83

ácido sulfúrico (concentração final de 0,07 N) e medida em um leitor de ELISA a 492 nm com um filtro de referência de 620 nm. Tabela 9: Análise do MUC1 secretório especifico do tumor em sobrenadantes de cultura de duas linhagens de células e detecção do núcleo 1, antes e depois do tratamento com neuraminidase em um teste de sanduiche de ELISA

Necrófago Ab HMFG-1 mIgG-Panko2 Detecção-Ab mIgG-Panko2 anti-Núcleo-1 (m!gM-Karo4) Linha de célula - Neuraminidase + Neuraminidase K562 + + ZR-75-1 +++ + T47D ++ - +++ 11. Detecção de MUC1 em Soro de Pacientes com Carcinoma do Cólon através das Moléculas de Reconhecimento que Reconhecem Especificamente o Epítopo do Tumor de MUC1 glicosilado

Um teste de sanduiche de ELISA, como descrito acima foi utilizado para detectar MUC1 solúvel em soros de pacientes. 0 anticorpo 115D8 anti-MUCl (necrófago no teste comercial CA 15-3) ou mIgG-Panko2 (1 pg/ml de PBS) foi utilizado como anticorpo necrófago. Após o bloqueio com 2% de BSA/PBS, os soros foram aplicados. 24 diferentes soros de carcinomas do cólon em diferentes diluições (de não diluido a 1:32 diluido) foram investigados. As diluições de um soro definido de um paciente com carcinoma mamário (152 U/ml, Teste CA 15-3 Enzymun, Boehringer Mannheim) foram usadas como padrão. Um limite de 23 U/ml (valor médio para os soros normais na literatura) foi estabelecido. Para detectar o MUC1 ligado, o mIgG-Panko2 foi comparado com dois outros anticorpos anti-MUCl, ou seja, DF3 (anticorpo de detecção no teste CA 15-3) e HMFG-1. Todos os três anticorpos foram biotinilados (EZ-Link sulfo-NHS-LC-biotina, Pierce) e, após a lavagem, três vezes com PBS + 0,1% de Tween 20, 84 acoplados com estreptaidina-POD (1:300 em 0,2% de BSA/PBS) e detectados com TMB como substrato de peroxidase (ver acima).

Os dados estão resumidos na Tabela 10. O MUC1 solúvel no soro de pacientes com carcinoma do cólon dá uma ligação significativamente menor com a molécula de reconhecimento mIgG-Panko2 da invenção em comparação com os anticorpos DF3 e HMFG-1 anti-MUCl bem conhecidos.

Tabela 10: Detecção de MUC1 no soro em um teste de ELISA utilizando vários anticorpos anti-MUCl.

Anticorpo Anticorpo de Amostras acima do limite/amostras % necrófago Detecção totais 115D8 DF3 20/24 83 115D8 HMFG-1 19/24 79 115D8 mIgG-Panko2 8/24 33 mIgG-Panko2 m!gG-Panko2 8/24 33 1/12 8 12. Terapia de Tumor para a Redução de Tumores Positivos a MUC1 em um Modelo Tumoral in vivo usando Moléculas de Reconhecimento Radiomarcadas que Reconhecem Especificamente o Epitopo do Tumor de MUC1 glicosilado O potencial terapêutico de mIgG-Panko2 foi investigado no modelo tumoral ZR-75-1 (ver o Exemplo 9) . Para este efeito, as moléculas de reconhecimento queladas (ver o Exemplo 7) foram carregadas (pH 4,5, 37 °C, 30 minutos; comparação com a incorporação de 111índio), com 90ítrio (um β-emissor para destruir as células tumorais) , bem como a estabilidade foi controlada usando cromatografia de camada fina.

Uma semana a oito semanas após a injecção subcutânea das células ZR-75-1 (dependendo do tamanho do tumor pretendido como modelo para o tratamento dos tumores sólidos de tamanho médio (cerca de 0,3 cm3) ou grandes (> 0,5 cm3) ou o tratamento de doença residual 85 mínima (< 0,05 cm3)), foram dados 200 μΐ aos ratos que suportam o tumor na veia da cauda. A solução injectável continha o mIgG-Panko2 marcado de 90Y (100 pCi por dose; actividade específica: 3 mCi/mg de anticorpo) em Ca/Mg-PBS com 4% de soro fetal de bovino para proteger da radiólise. Os grupos de controlo receberam a mesma injecção com nenhuma molécula de reconhecimento radioactivamente marcada ou com anticorpos de controlo radiomarcados (90Y-MOPC21). O peso corporal eo tamanho do tumor foram medidos duas vezes por semana e comparados. O crescimento relativo do tumor foi determinado considerando o respectivo tamanho do tumor, no início do tratamento. Uma segunda injecção (50 pCi por dose) foi dada cerca de três semanas após o primeiro tratamento. Este tipo de tratamento resultou em um forte efeito anti-tumoral em todos os animais testados. Ao tratar tumores pequenos (< 0,05 cm3) ou de tamanho médio (cerca de 0,3 cm3), foi possível inibir completamente o crescimento tumoral durante todo o período de observação (6 semanas; FIGS. 14a e 14b) . Em animais com tumores muito grandes (> 0,5 cm3) no início do tratamento, foi possível suprimir o crescimento tumoral durante cerca de três semanas (FIG. 14c). Devido ao tamanho do tumor, já não dentro dos limites do que é razoável, uma segunda injecção não foi possível no grupo controlo. O tratamento com um anticorpo (MOPC21) marcado por 90Y irrelevante na mesma dosagem, dá apenas uma pequena redução do crescimento tumoral em comparação com os animais não tratados (FIG. 14d), o que pode ser devido a irradiação não-específica como um resultado da deplecção relativamente lenta do anticorpo no soro.

Para além da menor mielotoxicidade, o tratamento com o mIgG-Panko2 marcado por 90Y não mostrou nenhuns efeitos colaterais. 86 13. Detecção de citotoxicidade celular dependente do anticorpo de Moléculas de Reconhecimento, que Reconhecem Especificamente o Epitopo do Tumor de MUC1 glicosilado, em um modelo in vitro A citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção foi investigada em um ensaio de libertação de európio. As células-alvo (ZR-75-1 ou MCF-7; 5xl06) foram incubadas durante 10 minutos a 4 °C em 800 μΐ de tampão de európio (50 mM de HEPES, pH 7,4, 93 mM de NaCl, 5 mM de KC1, 2 mM de MgCl2, 10 mM de ácido dietilenotriaminapenta-acético, 2 mM de acetato de európio (III)), electroporadas (710 V, 1 pulsação, 30 ps) em um Multiporador (Eppendorf), e posteriormente incubadas em gelo durante mais 10 minutos. Posteriormente, as células foram lavadas 5 vezes em RPMI 164 0/5% de FCS e depositadas em uma placa de fundo redondo de 96 cavidades (Nunc, 5xl03 em 100 μΐ por cavidade) . Após a adição de 20 μΐ de mIgG-Panko2, HMFG-1, clgG-Pankol ou cIgG-Panko2 em diferentes concentrações (0,2 a 25 pg/ml de concentração final em 200 μΐ de volume de incubação) ou os controlos correspondentes (meio, isotipo de controlo do hlgG), as células do sangue periférico humano (80 μΐ/cavidade, preparação, ver o Exemplo 14) foram adicionadas como células efectoras, utilizando uma célula efectora/proporção de célula alvo de 5 a 100 : 1 . 80 μΐ de RPMI/FCS sem nenhumas células efectoras não foi adicionado para determinar a liberação espontânea. A libertação máxima foi determinada após a lise completa das células-alvo com etanol. Após a incubação em uma incubadora a 37 °C durante 4 a 20 horas, a placa foi centrifugada a 500xg durante 5 minutos, e 20 μΐ da amostra de cada vez foi pipetada em 200 μΐ por cavidade da solução intensificadora (Perkin-Elmer Wallac). Após incubação durante 15 minutos à temperatura ambiente, a fluorescência foi determinada (Fluorómetro Victor2, Perkin-Elmer Wallac). A citotoxidade especifica é obtida a partir 87 da equação (lise experimental-lise espontânea)/(lise máxima-lise espontânea).

Os IgGs quiméricos de Pankol e Panko2 mostram elevada lise especifica das células-alvo positivas para MUC1 (FIG. 15a) . 0 IgG de murino de Panko2 mostra uma citotoxicidade mais baixa em comparação com as moléculas de reconhecimento quiméricas, mas um efeito claramente maior do que o anticorpo HMFG-1 de anti-MUCl de murino, com uma ligeira lise sendo observada apenas na mais elevada concentração testada para a última (FIG. 15b). 14. Análise de Ligação das Moléculas de Reconhecimento, que Reconhecem Especificamente o Epitopo do Tumor de MUC1 Glicosilado, às Células Sanguíneas Humanas A expressão de MUC1 sobre células hematopoiéticas pode ser detectada por meio de diversos anticorpos anti-MUCl. No entanto, resultados diferenciados com diferentes anticorpos de anti-MUCl permitem a conclusão de que o reconhecimento de MUC1 não epitelial é altamente dependente da especificidade fina do respectivo anticorpo, e que a variação dos padrões de glicosilação de MUC1 estão presentes nas células. A ligação das moléculas de reconhecimento da invenção a células sanguíneas humanas foi investigada utilizando citometria de fluxo.

As células sanguíneas periféricas humanas foram obtidas a partir do sangue de dadores saudáveis utilizando a centrifugação de densidade (Ficoll-Hypaque). A camada celular foi removida e lavada 3 vezes com RPMI 1640/5% de FCS. As células foram utilizadas, tanto no estado fresco ou criopreservadas e descongeladas em RPMI 1640/10% de FCS antes da sua utilização no mancheamento da célula ou como células efectoras no ensaio de ADCC (ver o Exemplo 13) . Para estimular as células T humanas, as células sanguíneas isoladas foram incubadas em RPMI/FCS + 1 pg/ml de PHA + 60 U/ml de LIS-2 em uma incubadora durante 3 a 8 dias. A estimulação foi monitorada em citometria de fluxo, através da detecção do marcador de activação CD25.

As células sanguíneas isoladas foram incubadas com mlgG-Pankol, mIgG-Panko2, HMFG-1 ou DF3 e com um controlo de isotipo de mlgGl como um controlo durante uma hora sobre o gelo. A seguir à lavagem com PBS, as células foram incubadas com Ig anti-rato de cabra conjugado com Cy3 (Dianova) e/ou com um marcador específico CD (CD3, CD14, CD19), anticorpo marcado de FITC (30 minutos, 4 °C, no escuro). A seguir à lavagem, as células foram analisadas utilizando a citometria de fluxo. Nenhum dos anticorpos testados se liga a células T não activadas. Depois da estimulação de PHA, a expressão MUC1 em células T humanas é regulada. Este MUC1 é fortemente detectado pelo HMFG-1 e DF3, mas apenas a uma extensão menor, por Panko2. O Pankol não apresenta qualquer ligação às células sanguíneas estimuladas por PHA (FIG. 16) . O Panko2 e DF3 não reconhecem MUC1 nem nos monócitos nem nas células B. Em contraste, o HMFG-1 e o Pankol dão uma fraca ligação aos monócitos e o HMFG-1 também se liga a células B (FIG. 16), sendo as densidades de superfície detectada significativamente menores do que aquelas em células T activadas.

Legendas das Figuras FIG. 1: Vcetor para a clonagem e a expressão bacteriana de fragmentos de anticorpo de cadeia singular. FIG. 2: Diagrama de clonagem para a preparação de fragmentos de anticorpo de cadeia singular que têm m diferentes comprimentos de ligante. 89 FIG. 3: Sistema de vector para a clonagem e a expressão eucariótica de anticorpos quiméricos em formato IgM ou IgGl. FIG. 4: Ligação das moléculas de reconhecimento da invenção, mlgG-Pankol e mIgG-Panko2, ao péptido de MUC1 glicosilado e não glicosilado em um teste de ELISA. 0 30-mer não-glicosilado com a sequência APPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS e o 30-mer glicosilado com a sequência APPAHGVTSAPDT[GalNAca]RPAPGSTAPPAHGVTSA foram utilizados como antigénios e ligados em PBS à placa. Os anticorpos mlgG-Pankol e mIgG-Panko2 foram empregues em uma concentração de 0,5 pg/ml no teste de ELISA. FIG. 5: Comparação da ligação especifica ificidade dos anticorpos anti-MUCl, HMFG-1, C595 e SM3 com o mlgG-Pankol e o mIgG-Panko2 ao péptido de MUC1 glicosilado e não glicosilado em um teste de ELISA. o 30-mer não glicosilado com a sequência APPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS e o 30-mer glicosilado com a sequência APPAHGVTSAPDT[GalNAca]RPAPGSTAPPAHGVTSA foram utilizados como antigénios e levemente secos na placa em H2O. Os anticorpos foram empregues em uma concentração de 10 pg/ml no teste de ELISA. FIG. 6: Ligação especifica de vários formatos preferidos de moléculas de reconhecimento a invenção em um teste de ELISA, exemplificada usando o péptido de MUC1 30-mer não glicosilado e glicosilado. O 30-mer não glicosilado com a sequência APPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS e o 30-mer glicosilado com a sequência APPAHGVTSAPDT[GalNAca]RPAPGSTAPPAHGVTSA foram utilizados como antigénios e ligados em PBS à placa. Os dois formatos scFv, SEQ ID NO. 36 e 45 foram utilizados com 0,5 pg/ml, o IgG de murino com 0,1 pg/ml e o IgG quimérico com 0,01 pg/ml. Como anticorpos 90 secundários diferentes são utilizados para estes diversos formatos, os dados de ELISA devem ser avaliados meramente qualitativamente. FIG. 7: Dependência da ligação das moléculas de reconhecimento mlgG-Pankol e mIgG-Panko2 da invenção no número de repetições paralelas em péptidos MUC1 não glicosilados em comparação com os anticorpos específicos de MUC1, SM3 e C595 em um teste de ELISA.

Uma série de péptidos de MUC1 não glicosilados de comprimentos variáveis, com a sequência [VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG]n em que n = 1, 3 e 5 (TR1, TR3 e TR5), foi utilizada como antigénios e seca levemente sobre a placa em H20. Os anticorpos foram empregues em uma concentração de 10 pg/ml. FIG. 8: Dependência da ligação das moléculas de reconhecimento mlgG-Pankol e mIgG-Panko2 da invenção, no número de repetições paralelas (regiões de PDTR glicosiladas múltiplas) em comparação com os anticorpos específicos de MUC1, SM3 e C595 em um teste de ELISA. Uma série de péptidos de MUC1 glicosilados de comprimento variável, com a sequência A[HGVTSAPDT(GalNAca)RPAPGSTAPPA]n, em que n = 1, 3 e 5 (TR1, TR3 e TR5), foi utilizada como antigénios e seca ligeiramente sobre a placa em H20. Os anticorpos foram empregues em uma concentração de 10 pg/ml. FIG. 9: Marcação por fluorescência de células da linha de célula T47D do tumor (carcinoma mamário) com a molécula de reconhecimento mIgG-Panko2 específica de MUC1. FIG. 10: Marcação por fluorescência de células da linha de célula K562 do tumor (leucemia eritróide) com a molécula de reconhecimento clgG-Pankol específica de MUC1. 91 FIG. 11: Diagrama de Scatchard para a análise da ligação celular de moléculas de reconhecimento especificas de MUC1 radiomarcadas. Os dados de ligação dos dois formatos scfv, a SEQ ID NO. 36 (a) e a SEQ ID NO. 45 (b) são exemplificados, r: moléculas ligadas por célula, A: concentração empregue da molécula de reconhecimento radiomarcada [M], x: percentagem ligada às células [M] . A diferença A-x representa a concentração de moléculas de reconhecimento livres no lote. A equação em linha recta correspondente é dada em cima, o declive da linha recta representa a associação constante. FIG. 12: Acumulação específica da molécula de reconhecimento radiomarcada, mIgG-Panko2, em um tumor em um modelo de xenotransplante de rato. Cada rato que suporta o tumor (n = 5 por ponto no tempo), foi administrado i.v. com 5 pg de mIgG-Panko2 marcado com inIn. Os ratos foram sacrificados após o período indicado, e a acumulação no tumor, em relação à dose injectada e ao peso do tumor (%ID/g), foi determinada. FIG. 13: Acumulação específica elevada da molécula de reconhecimento radiomarcada, mIgG-Panko2, em um tumor em vim modelo de célula tumoral ZR-75-1 no rato. Cada rato que suporta o tumor (n = 6 por ponto no tempo), foi administrado i.v. com 5 pg de mlgG-Panko2 marcado com 111In. Os ratos foram sacrificados após o período, conforme indicado, e a acumulação no tumor, no soro e nos órgãos, em relação à dose injectada e ao peso do tumor ou do órgão (%ID/g), foi determinada. FIG. 14: A inibição do crescimento tumoral em ratos que suportam tumores depois do tratamento com a molécula de reconhecimento radiomarcada, mlgG—Panko2. No 8o dia (14a; pequenos tumores: < 0,05 cm3), no 36° dia (14b; tumores pequenos e médios: cerca de 0,3 cm3) e no 57° dia (14c; tumores grandes: > 0,5 cm3) depois da injecção 92 subcutânea das células ZR-75-1, aos ratos que suportam o tumor foram dados 200 μΐ na veia caudal. A solução injectável continha o mIgG-Panko2 marcado por 90Y (100 pCi por dose; actividade específica: 3 mCi/mg de anticorpo) em Ca/Mg-PBS com 4% de soro fetal de bovino para proteger da radiólise. Os grupos de controlo não receberam a mesma injecção com nenhuma molécula de reconhecimento radioactivamente marcada. No caso dos tumores com tamanho pequeno e médio, uma segunda injecção (50 pCi) foi efectuada cerca de 3 semanas mais tarde. A FIG. 14d mostra o tratamento dos ratos que suportam tumores com 90Y-mIgG-Panko2 em comparação com um anticorpo de controlo irrelevante radiomarcado 90Y-MOPC21. FIG. 15: Mediação especifica de citotoxicidade celular dependente de anticorpos pelas moléculas de reconhecimento da invenção, Pankol e Panko2. Os anticorpos foram usados em uma concentração de 0,2 a 25 pg/ml. (a) Os formatos clgG de Pankol e Panko2 mostram uma lise específica elevada das células ZR-75-1 positivas para MUC1. (b) O Panko2 mlgG também medeia a lise celular do tumor específica e mostra um efeito significativamente maior do que o anticorpo HMFG-1, anti-MUCl de murino, com uma lise ligeira a ser observada somente na concentração testada mais elevada (25 pg/ml) para este último. FIG. 16: Análise de ligação de moléculas de reconhecimento da invenção a células sanguíneas humanas. As células sanguíneas periféricas humanas foram obtidas a partir do sangue de dadores saudáveis por meio de centrifugação de densidade. Para estimular as células T humanas, as células sanguíneas isoladas foram incubadas em RPMI/FCS + 1 pg/ml de PHA + 60 U/ml de hIL-2 em uma incubadora durante 3 a 8 dias. As células sanguíneas isoladas foram incubadas com mlgG-Pankol, m!gG-Panko2, HMFG-1, DF3 ou mlgGl (controlo) e 93 manchadas com Ig anti-rato de cabra conjugado com Cy3 (Dianova) e/ou com um marcador específico de CD (CD3, CD14, CD19), anticorpo marcado de FITC. Depois da lavagem, as células foram analisadas utilizando a citometria de fluxo.

As moléculas de reconhecimento, Pankol e Panko2, não mostram nenhuma ou somente uma baixa ligação às células sanguíneas humanas. Em contraste, os anticorpos específicos de MUC1, HMFG-1 e DF3 ligam-se fortemente às células T estimuladas por PHA, e HMFG-1 também se liga às células B e aos monócitos.

Referências

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Wu S. & Cygler M., J. Mol. Biol. 229, 597-601 (1993). Lista de Sequências Sequências CDR

SEQ ID NO. 1 DAWMD SEQ ID NO. 2 NYWMN SEQ ID NO. 3 EIRSKANNHATYYAESVKG SEQ ID NO. 4 EIRLKSNNYTTHYAESVKG SEQ ID NO. 5 GGYGFDY SEQ ID NO. 6 HYYFDY SEQ ID NO. 7 RSSQSIVHSNGNTYLE SEQ ID NO. 8 RSSKSLLHSNGITYFF SEQ ID NO. 9 KVSNRFS SEQ ID NO. 10 QMSNLAS SEQ ID NO. 11 FQGSHVPLT SEQ ID NO. 12 AQNLELPPT 95 cadeias pesadas variáveis SEQ ID NO. 32

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA

TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS SEQ ID NO. 33 EVKLVE S GGGLVQP GGSMKLS CVASGFTF SNYWMNWVRQSP EKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAE SVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSS cadeias leves variáveis SEQ ID NO. 34

DIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKRA SEQ ID NO. 35

DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQMSNL

ASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKRA

Associação de VH/VL

Pankol SEQ ID NO. 32 SEQ ID NO. 34

Panko2 SEQ ID NO. 33 SEQ ID NO. 35

Diferentes formatos de cadeia Fv singular SEQ NO. 36

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA

TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS 96

ASSGGGGSGGGGSGGSARDIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWY LQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVP LTF GD GTKLE LKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 37

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS ASSGSGSSADIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPK

LLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKL ELKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 39 EVKLVE S GGGLVQP GGSMKLS CAASGFTF SDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS AS S GS SADIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLL IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLEL KRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 40

EVKLVE S GGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAE SVKGRF TISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGlyYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS AS S S SADIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLI YKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELK RAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 41

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAE SVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS ASSSADIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKR AAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA 97 SEQ ID NO. 42

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS ASSADIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYK VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKRA AAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 43

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS ASADIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKRAA AHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 44

EVKLVE S GGGLVQP GGSMKLS CAASGFTF SDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS AADIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKRAAA HHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 45

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAE SVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS ADIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSN RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKRAAAH HHHHHGAAEQKLISEEVHQ SEQ ID NO. 46

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAE SVKGRFTISRnVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS DIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNR 98

FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKRAAAHH

HHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 47

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSD IVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKRAAAHHH HHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 48 EVKLVE S GGGLVQP GGSMKLS CVASGFTF SNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSA SSGGGGSGGGGSGGSARDIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYL QKPGLSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDF~LRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPP TFGGGTKLEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 49

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAE SVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSA SSGSGSSADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQL LIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLE IKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 50

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAE SVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSA SSGGSSADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLL IYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEI KRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 51

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT 99

THYAE SVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSA SSGSSADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLI YQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIK RAAAHIUIHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 52

EVKLVE S GGGLVQP GGSMKLS CVAS GF TF SNYWMNWVRQSP EKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAE SVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSA S S S SADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIY QMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKR AAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ 1DNO. 53

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSA SSSADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQ MSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKRA AAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 54

EVKLVE S GGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSA SSADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQM SNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKRAA AHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 55

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSA SADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQMS NLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKRAAA HHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA 100 SEQ ID NO. 56 EVKLVE S GGGLVQP GGSMKLS CVAS GF TF SNYWMNWVRQSP EKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAE SVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSA ADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQMSN LASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKRAAAH HHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA. SEQ 1D NO. 57

EVKLVE S GGGLVQP GGSMKLS CVAS GF TF SNYWMNWVRQSP EKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAE SVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSA DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQMSNL

ASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKRAAAHH HHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ 1D NO. 58

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSD IVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQMSNLA SGVPDRFSSSGSGTDFTLR1SRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKRAAAHHH HHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 59

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAE1RLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSDI VMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQMSNLAS GVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKRAAAHHHH HHGAAEQKLISEEDLNGAA

Anticorpos de Murino uma cadeia leve de IgGl de murinos (cadeia k) 101 SEQ ID NO. 60

DIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNR

FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKRADAAP

TVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDST

YSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC SEQ ID NO. 61

DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQMSNL

ASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKRADAAP

TVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDST

YSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC cadeia pesada do IgGl de murinos SEQ ID NO. 62

EVKLVE S GGGLVQP GGSMKLS CAASGFTF SDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAE SVKGRF TISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSA KTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMYTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESD LYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFI FPPKPKDVLTITLTPKVTCVWDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFR SVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAK DKVSLTCMITDFFPEOITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEA GNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK SEQ 10 NO. 63

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT

THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSAK

TTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDL

YTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIF

PPKPKDVLT1TLTPKVTCVWDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRS

VSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYT1PPPKEQMAKD

KVSLTCMITDFFPEOITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAG 102

NTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

Anticorpo de murino mlgG-Pankol SEQ 10 NO. 60 SEQ 10 NO. 62 mlgG-Panko2 SEQ 10 NO. 61 SEQ 10 NO. 63

Anticorpo quimérico (Rato/Humano) cadeia pesada de IgGl quimérico (cadeia gama) SEQ ID NO. 64

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAE SVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSG STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLS SWTVP S S SLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO. 65 EVKLVE S GGGLVQP GGSMKLS CVAS GF TF SNYWMNWVRQSP EKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSGS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK cadeia pesada de um IgM quimérico (cadeia mu) 103 SEQ ID NO. 66

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSG SASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVL RGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHWCKVQHPNGNKEKNVPLPV1AELPPKVSVFVPP RDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKV TSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLT KSTKLTCLVTDLTTYD SVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWN SGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTG FSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCV VAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY SEQ ID NO. 67 EVKLVE S GGGLVQP GGSMKLS CVAS GF TF SNYWMNWVRQSP EKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSGS ASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLR GGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHWCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPR DGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVT STLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTK STKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNS GERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGF SPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCW AHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY cadeia leve de um IgG 1 ou de IgM quimérico (cadeia kapa) SEQ ID NO. 68

DIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 104 SEQ ID NO. 69

DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQMSNL

ASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKRTVAAP

SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST

YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Anticorpo quimérico clgG-Pankol SEQ ID NO. 64 SEQ ID NO. 68 clgG-Panko2 SEQ ID NO. 65 SEQ ID NO. 69 clgM-Pankol SEQ ID NO. 66 SEQ ID NO. 68 clgM-Pankol SEQ ID NO. 67 SEQ 10 NO. 69

Lisboa,10 de Março de 2009 1

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de reconhecimento, caracterizada pelo facto de compreender uma sequência de aminoácidos a qual inclui (i) a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 ou 2 e (ii) a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3 ou 4, e (iii) a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5 ou 6 e que liga especif icamente o epítopo do tumor de MUC1 glicosilado de tal forma que a força da ligação é aumentada pelo menos por um factor de 20 em comparação com a ligação ao péptido não glicosilado de comprimento idêntico e a sequência de péptido idêntica.

2. Molécula de reconhecimento de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de compreender uma sequência de aminoácidos a qual inclui as sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5 e que se liga especificamente ao epítopo do tumor de MUC1 glicosilado.

3. Molécula de reconhecimento de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de compreender uma sequência de aminoácidos a qual inclui as sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6 e que se li ga especificamente ao epítopo do tumor de MUC1 glicosilado.

4. Molécula de reconhecimento de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de compreender adicionalmente uma sequência de aminoácidos a qual inclui (i) a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 7 ou 8 e 2 (ii) a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9 ou 10 e (iii) a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 11 ou 12 e que liga especificamente ao epítopo do tumor de MUC1 glicosilado.

5. Molécula de reconhecimento de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo facto de compreender adicionalmente uma sequência de aminoácidos a qual inclui as sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 e que liga especificamente o epítopo do tumor de MUC1 glicosilado.

6. Molécula de reconhecimento de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo facto de compreender adicionalmente uma sequência de aminoácidos a qual inclui as sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12 e liga especificamente o epítopo do tumor de MUC1 glicosilado.

7. Molécula de reconhecimento de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo facto de compreender adicionalmente as sequências de estrutura, as quais separam e/ou acompanham as sequências de aminoácidos, sendo as sequências de estrutura, sequências de estrutura de anticorpo.

8. Molécula de reconhecimento de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo facto das sequências de estrutura de anticorpo molécula para a molécula de reconhecimento de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3 serem sequências da cadeia pesada variável VH e as sequências de estrutura do anticorpo para as sequências adicionais da molécula de reconhecimento de acordo com a reivindicação 4, 5 ou 6 serem sequências de cadeia leve variável VL. 3

9. Molécula de reconhecimento de acordo com a reivindicação 7 ou a reivindicação 8, caracterizada pelo facto das sequências de estrutura de anticorpo serem de origem de murinos ou de seres humanos.

10. Molécula de reconhecimento de acordo com qualquer das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo das sequências de estrutura de anticorpo a) FRH1, FRH2, FRH3 e FRH4 para a cadeia pesada variável VH serem as seguintes sequências de aminoácidos, correspondendo a posição dos aminoácidos à numeração de acordo com Kabat: Para FRH1, na posição 1 E 2 V 3 K 4 L 5 V 6 E 7 S 8 G 9 G 10 G 11 L 12 V 13 Q 14 P 15 G 16 G 17 S 18 M 19 K 20 L 21 S 22 C 23 A ou V 4 Para FRH2, na posição Para FRH3, na posição 24 A, V, S 25 S 26 G 27 Y, F, S 28 T 29 F, L ou 30 S 36 W 37 V 38 R 39 Q 40 S 41 P 42 E 43 K 44 G 45 L 46 E 47 W 48 V 49 A 66 R 67 F 68 T 69 1 70 S 71 R 72 D 73 D OU V 74 S 75 K 76 S 77 S 78 V 79 Y ou S 80 L 81 Q 82 M 82a N ou T ou D I 5 5 82b N 82c L 83 R 84 A ou V 85 E 86 D 87 T 88 G 89 I 90 Y 91 Y 92 C 93 T 94 R, G, N ou S Para FRH4, na posição 103 a 113 103 W 104 G 105 Q 106 G 107 T 108 T 109 L 110 T 111 V 112 S 113 S ou A b) FRL1, FRL2, FRL3 e FRL 4 para a cadeia leve variável VL sao as seguintes sequências de aminoácidos, a posição dos aminoácidos correspondente à numeraçao, de acordo com Kabat: D I, V ou V M ou L T Q TorA P ou A L ou F Para FRL1, na posição 1 2 3 4 5 6 7 8 9 6 10 s 11 L ou N 12 P 13 V 14 S ou T 15 L 16 G 17 D ou T 18 Q ou S 19 A 20 S 21 I 22 S 23 C Para FRL2, na posição 35 W 36 Y 37 L 38 Q 39 K 40 P 41 G 42 Q ou L 43 S 44 P 45 K ou Q 46 L 47 L 48 I ou V 49 Y Para FRL3, na posição 57 G 58 V 59 P 60 D 61 R 62 F 63 S 64 G ou S 65 S 66 G 7 Para FRL4, na posição 67 S 68 G 69 T 70 D 71 F 72 T 73 L 74 K OU R 75 I 76 S 77 R 78 V 79 E 80 A 81 E 82 D 83 L ou V 84 G 85 V 86 Y 87 Y 88 C 98 F 99 G 100 G ou D 101 G 102 T 103 K 104 L 105 E 106 I ou L 106A K 107 R 108 A. qualquer das da molécula de

11. Molécula de reconhecimento, de acordo com reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo facto reconhecimento compreender uma combinação das sequências SEQ ID NO.: 32 e 34 ou as variantes humanizadas dessas sequências.

12. Molécula de reconhecimento, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo facto da molécula de reconhecimento compreender uma combinação das sequências SEQ ID NO.: 33 e 35 ou as variantes humanizadas dessas sequências.

13. Molécula de reconhecimento, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo facto de compreender um fragmento de anticorpos de cadeia singular, um multicorpo, um fragmento Fab, uma proteína de fusão de um fragmento de anticorpo com péptidos ou proteínas e/ou uma imunoglobulina dos isotipos IgG, IgM, IgA, IgE, IGD e/ou das suas subclasses.

14. Molécula de reconhecimento de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo facto de compreender um anticorpo ou fragmento de anticorpo de murino, quimerizado, humanizado, humano, parcialmente humano.

15. Molécula reconhecimento de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo facto de compreender pelo menos uma sequência de acordo com a SEQ ID NO.: 36 a 47, SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66 ou 68 ou as variantes humanizadas dessas sequências.

16. Molécula reconhecimento de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo facto de compreender pelo menos uma sequência de acordo com a SEQ ID NO.: 48 a 59, SEQ ID NO: 61, 63, 65, 67 ou 69 ou as variantes humanizadas dessas sequências.

17. Constructo, caracterizado pelo facto das moléculas de reconhecimento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 9 a 16 serem fundidas, quimicamente acopladas, covalentemente ou não covalentemente associadas com (i) domínios de imunoglobulina de diferentes espécies, (ii) moléculas de enzima, (iii) domínios de interacção, (iv) domínios para estabilização, (v) sequências de sinal, (vi) corantes fluorescentes, (vii) toxinas, (viii) anticorpos catalíticos, (ix) um ou mais anticorpos ou fragmentos de anticorpos, que têm uma especificidade diferente, (x) componentes citolíticos, (xi) imunomoduladores, (xii) imunoefectores, (xiii) antigénios MHC de classe I ou de classe II, (xiv) agentes de quelação para marcação radioactiva, (xv) radio-isótopos, (xvi) lipossomas, (xvii) domínios transmembranares, (xviii) vírus e/ou (XIX) células.

18. Molécula de ácido nucleico que compreende sequências de ácido nucleico as quais codificam para a sequência de aminoácidos de, pelo menos, uma molécula de reconhecimento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 ou um constructo um acordo com a reivindicação 17.

19. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 18 em que um primeiro vector codifica para a cadeia pesada e um segundo vector codifica para a cadeia leve de uma molécula de reconhecimento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 ou um constructo um acordo com a reivindicação 17.

20. Cassete de expressão ou um vector que compreende uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 18 ou a reivindicação 19 e um promotor o qual está operativamente ligado com a molécula do ácido nucleico.

21. Composição farmacêutica que compreende pelo menos uma 10 (i) molécula de reconhecimento, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 16, e/ou (ii) um constructo um acordo com a reivindicação 17, e/ou (iii) uma molécula do ácido nucleico que codifica para a molécula de reconhecimento, opcionalmente com um portador e/ou um adjuvante farmaceuticamente aceitável.

22. Método para a preparação de moléculas de reconhecimento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 ou de constructos de acordo com a reivindicação 17, que compreende (i) a introdução de uma ou mais moléculas de ácido nucleico as quais codificam para a sequência de aminoácidos de, pelo menos, uma molécula de reconhecimento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 em um vírus ou em uma célula hospedeira, e (ii) a cultura de células hospedeiras ou dos vírus em condições adequadas, e (iii) a recuperação da molécula de reconhecimento ou do constructo, carregando a célula efectora a molécula de reconhecimento ou a constructo, ou o vírus o qual especificamente detecta o epítopo do tumor de MUC1 glicosilado.

23. Utilização de uma molécula de reconhecimento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 ou do constructo de acordo com a reivindicação 17, para a produção de uma composição farmacêutica para a profilaxia, prevenção, diagnóstico, redução, terapia, controlo do progresso e/ou de pós-tratamento de doenças tumorais e/ou de metástases. 11

24. Utilização de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo facto das moléculas de reconhecimento compreenderem igG ou os seus fragmentos.

25. Utilização de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo facto das moléculas de reconhecimento compreenderem multicorpos.

26. Utilização de uma molécula de reconhecimento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 para o diagnóstico e prognóstico de tumores in vitro, através da detecção do epítopo do tumor de MUC1 glicosilado no soro ou em preparações de tecido. Lisboa, 10 de Março de 2009