PT1563055E - Método de dispositivo para rápido embebimento do blocos de células - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"MÉTODO DE DISPOSITIVO PARA RÁPIDO EMBEBIMENTO DO BLOCOS DE CÉLULAS"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção é destinada a dispositivos para preparação de células para exame microscópico, e para armazenar as células para testes moleculares e imunológicos. Mais particularmente, a invenção é destinada a um dispositivo para o embebimento de células e fragmentos de tecidos dentro de um substrato sólido, tal como parafina, de modo a permitir que possam ser cortados com um micrótomo para avaliação microscópica, e para serem armazenados num estado estável.

ANTECEDENTES

Muitos processos de doença só podem ser diagnosticados com base em exames histológicos ou citológicos utilizando um microscópio de luz. Por exemplo, enquanto a presença de um tumor pode ser detetado utilizando dispositivos radiológicos, a determinação de se um tumor é benigno ou maligno continua a requerer interpretação por um endoscópicas patologista da aparência das células utilizando um microscópio de luz. Antes de chegar a este estado, no entanto, a amostra de tecido deve primeiro ser recuperada, colhida e processada para exame microscópico. Está disponível um número de técnicas para recuperar e recolher biopsias ou amostras de células de um paciente. É benéfica para os pacientes a utilização de técnicas minimamente invasivas para a obtenção de biopsias ou amostras de células. Por exemplo, pequenos fragmentos de tecido podem ser obtidos a partir de biopsia de aspiração de agulha fina, ou através da escovagem das superfícies da cavidade corporal acessível através de técnicas 2 minimamente invasivas. Uma vez recuperadas, então as células necessitam de ser processadas para o microscópio. É conhecida uma variedade de técnicas de processamento, incluindo a técnica cytospin® e a técnica thin-prep® para depositar fragmentos de tecido diretamente sobre uma lâmina de microscópio. 0 documento JP-A-2000-146782 divulga formas de gerir a pressão de sucção durante a criação de espécimes citológicos num filtro, numa técnica tal como a técnica ThinPrep®.

Outra técnica, comummente referida como uma preparação do bloco de células, tem diversas vantagens sobre a deposição direta de fragmentos de tecido. 0 procedimento do bloco de células imobiliza células ou pequenos fragmentos de tecido num suporte sólido, tipicamente cera de parafina. Esse procedimento do bloco de células é descrito no documento US-A-5817032. São então cortadas secções finas dos blocos de células com um micrótomo e as secções são colocadas numa lâmina de microscópio para examine. As secções resultantes do bloco de células exibem informações de diagnóstico de uma maneira que complementa as técnicas de deposição direta. Por exemplo, as disposições arquitetónicas de células em relação umas às outras são melhor exibidas em secção a partir de um bloco de células do que em células depositadas diretamente sobre uma lâmina de microscópio. Os blocos de células também permitem a realização de importantes testes de diagnóstico molecular e imunológicos nas amostras de células que de outra forma seriam difíceis ou impraticáveis na preparação direta. Além disso, os blocos de células parecem preservar as células indefinidamente de um modo conveniente à temperatura ambiente, facilitando, desse modo, a pesquisa biomédica. 3 0 método de preparação do bloco de células exige que os fragmentos de células sejam "embebidos" em meio sólido, mais comummente em parafina. 0 "embebimento" requer as seguintes fases genéricas: (1) todas as moléculas de água devem ser removidas das células, geralmente através de álcool (a água é miscivel com o álcool); (2) todo o álcool deve ser então removido, bom como todas as substâncias gordurosas, e tipicamente substituídas por xileno (o xileno é miscivel com o álcool, mas não com a água); (3) o xileno deve ser removido e substituído por cera (a cera é miscivel com o xileno, mas não com a maioria dos álcoois ou com a água); e (4) as células em cera derretida devem então ser manualmente organizadas e endurecidas na parte inferior de uma cassete de tecido de forma que possa ser cortada uma secção do bloco de cera com o tecido embebido utilizando um micrótomo. As três primeiras destas fases são comummente efetuadas por um "processador de tecido", uma máquina que circula álcool, xileno, e cera derretida de forma sequencial numa câmara que contém a cassete de tecido. As cassetes de tecido normalmente servem o duplo objetivo de conter a amostra celular durante o processo de embebimento, e de fornecer um mecanismo de fixação para manter o bloco de cera na máquina do micrótomo de forma que a amostra celular posteriormente incluída na cera na superfície inferior da cassete seja capaz de ser cortada em finas lâminas.

Antes do "embebimento" poder ocorrer, a amostra celular deve ser manipulada de modo a concentrar as células e facilitar a sua transferência através do processo de embebimento. Um procedimento comummente utilizado para preparação de tais blocos de células é a técnica do coágulo, que é descrita por Yang et al. na Acta Cytologica, 42: 703 - 706 (1998). A técnica do coágulo envolve as 4 seguintes fases genéricas: (1) uma amostra celular é centrifugada durante 10 minutos; (2) o sobrenadante é decantado manualmente, deixando uma porção de células concentradas; (3) a fibrina e a trombina, obtidas a partir de fontes de bancos de sangue, são manualmente adicionadas à porção de células e incubadas durante 15 minutos com ocasional agitação manual de modo a reter a porção de células na fibrina de coagulação; (4) a amostra celular coagulada é manualmente removida com cuidado do tubo de centrifugação de modo a evitar perda de células devido ao arrastar do coágulo ao longo do lado do tubo ou ao quebrar do coágulo em pedaços pequenos impraticáveis; (5) a amostra celular coagulada é transferida manualmente para o papel da lente, que é então dobrado e colocado manualmente numa cassete de tecido; (6) a cassete de tecido é então colocada manualmente num processador de tecido automático, que então circula álcool, xilenol, e parafina quente na máquina (conforme descrito no parágrafo anterior) e é tipicamente preparado para funcionar durante a noite; (7) na manhã seguinte, a cassete é manualmente removida da parafina líquida do processador de tecido e aberta; (8) o papel da lente é aberto, e o coágulo celular é raspado do papel da lente e colocado manualmente num molde da secção do tecido; e (9) é suavemente adicionada parafina ao molde enquanto se tenta manualmente manter o coágulo celular contra a superfície inferior do molde que irá, eventualmente, ser cortada. (10) A cassete de tecido é então invertida sobre o molde de forma a servir como um suporte para a máquina do micrótomo, e endurecida na cera em conjunto com o coágulo celular. (11) A cassete de tecido, com fragmentos celulares embebidos em cera incluídos, é então separada do molde. Neste ponto, o bloco de cera está pronto para ser cortado com um micrótomo. Muitas destas onze fases são comuns a 5 outras técnicas de produção dos blocos de células existentes.

Outro procedimento popular para preparação dos blocos de células é a técnica do saco de colódio, que é descrita por Fahey e Bedrossian em Laboratory Medicine, 74 (2): 94-96 (1993). A técnica do saco de colódio envolve todas as onze fases anteriores, com a exceção de que as fases 1-4 são substituídas pelo seguinte: 0 colódio é manualmente colocado num tubo de centrifugação de modo a revestir o tubo. A amostra celular obtida a partir do paciente é, então, centrifugada no tubo revestido. 0 sobrenadante é decantado, e a fina camada de colódio é removida do tubo com a porção de células incluída concentrada e embebida conforme nas fases 5-11 acima. A técnica do colódio confere uma vantagem sobre a técnica de coágulo, ao evitar a diluição das células com fibrina e trombina. Com a técnica do colódio, não é necessário esperar que o coágulo da célula se forme tal como é exigido na técnica do coágulo, e as células não são suscetíveis de se perderem quando são retiradas para fora do tubo de centrifugação. No entanto, a técnica do colódio é substancialmente mais perigosa do que a técnica de coágulo, devido à natureza inflamável do colódio e do seu éter solvente.

No entanto, uma outra técnica para a preparação dos blocos de células é descrita por Diaz-Rosário e Kabawat em Câncer, 90: 265 - 272 (2000) . Nesta técnica, a amostra celular é inicialmente filtrada e a amostra filtrada é raspada do filtro e transferida para o papel de lente que é depois dobrado e colocado numa cassete de tecido e transferido para um processador de tecidos, seguido pelas fases 6-11 acima. 6

As técnicas de preparação do bloco de células atualmente disponíveis tais como aquelas anteriormente descritas sofrem de um número de problemas que as tornam incómodas, caras, suscetíveis à contaminação ou a erros de registo, e ineficientes para mostrar células de diagnóstico nas secções finais do micrótomo. Por exemplo, muitas das técnicas requerem que os fragmentos de células embebidos em cera sejam manualmente transferidos para uma cassete de tecido necessária para manter o bloco de cera no micrótomo para o seccionamento. Esta transferência manual para a cassete de tecido demora uma quantidade considerável de tempo, tal como a fase de transferência das células desde um tubo de amostra até um processador de tecido. Muitos dos fragmentos celulares perdem-se durante as fases de transferência e/ou de embebimento. No passado, as técnicas tentaram melhorar a concentração de células dentro do material seccionável e evitar a perda de células provada menos do que ideal, uma vez que as técnicas envolvem necessariamente a diluição da secção do micrótomo com substâncias transportadoras de tal modo que estão presentes relativamente poucas células, ou não diminuem a perda de células nas fases de pré embebimento.

As atuais técnicas do bloco de células geralmente demoram de 8 a 16 horas a serem concluídas devido ao facto de a extração de água, álcool, gorduras e xileno no processador de tecido consumir muito tempo. Embora existam métodos para acelerar a fase de processamento do tecido (fase 6 acima), tal como utilizando a radiação de micro-ondas, a pressão de vácuo, as temperaturas elevadas, e mais rapidamente os químicos de difusão, estes métodos sofrem dos seus próprios conjuntos de problemas. Estas técnicas apenas diminuem modestamente o tempo de processamento dos tecidos (fase 6 acima), mas são relativamente aborrecidas de realizar no 7 laboratório. Além disso, estas técnicas não realçam a eficiência das fases de processamento. A capacidade de produzir blocos de células no mesmo dia irá permitir a realização de diagnósticos mais rápidos, com redução de custos aumentados através da totalidade do sistema de saúde.

Outra desvantagem das técnicas do bloco de células descritas acima é que essas também são suscetíveis de registar incorretamente uma amostra uma vez que a amostra tem que ser manualmente movida entre o tubo de amostra, o papel da lente (ou colódio, e outras substâncias transportadoras), a cassete do tecido e o molde do tecido. Além de uma suscetibilidade para completar incorretamente o registo, com as técnicas existentes também é possível a contaminação cruzada entre a amostra do paciente e as células e biomoléculas (incluindo células cancerígenas) de outras fontes. Isto é, na técnica do coágulo de fibrina, as células do paciente são misturadas com um banho de plasma de outros pacientes, de modo a formar um coágulo. Durante a transferência de células de e para a cassete de tecido, a contaminação de células de um caso para outro pode ocorrer nas pinças utilizadas para manipular manualmente as porções de células. Uma vez que são imersas simultaneamente múltiplas cassetes de tecidos num banho comum de reagentes em processadores de tecido, a possibilidade de contaminação cruzada de células cancerígenas de um paciente para a porção de células de outra amostra (referido pelos patologistas como "flutuadores") é um problema sério bem reconhecido.

Uma outra desvantagem das fases do atual processador de tecido é que estas fases são difíceis de padronizar. Isto deve-se ao facto de uma máquina de processamento de tecidos 8 circular tipicamente os reagentes para embebimento para muitas amostras de laboratório ao mesmo tempo. Um bloco de células pronto para ser colocado num processador de tecido às 9:00 AM seria necessariamente exposto a diferentes condições que uma amostra colocada no mesmo processador às 9:30 AM. As técnicas moleculares emergentes requerem processamento padronizado para um ótimo desempenho. e o

Uma vez que a microscopia de luz é atualmente o "melhor padrão" para o diagnóstico de muitas doenças, os avanços na compreensão da biologia molecular de doenças e dos seus tratamentos geralmente requerem a capacidade de, simultaneamente, estudar as caracteristicas microscópicas das células enquanto se preservam as suas moléculas constituintes para pesquisa. A preservação simultânea dos componentes morfológicos e bioquímicos de uma célula representam atualmente um número de problemas para os investigadores e patologistas de diagnóstico (revisto em Srinivasan M, D Sedmak e Jewell S. "Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids". Am J Pathol. 2002; 161: 1961 - 71). Os tecidos de congelamento preservam os ácidos nucleicos e as proteínas (embora seja inevitável alguma autólise durante o descongelamento do tecido), mas o tecido congelado apresenta obstáculos à avaliação morfológica. Alguns dos impedimentos incluem "artefactos de congelamento" que distorcem a morfologia e dificultam o diagnóstico clássico de microscopia de luz, dificuldades técnicas de corte de secções finas de tecidos congelados, incapacidade de cortar um corte histológico a partir de determinados tipos de tecidos congelados (por exemplo, tecidos que contenham gorduras abundantes) armazenamento volumoso e caro de amostras de tecido congeladas, impraticabilidade de congelamento de amostras de tecido muito pequenas, 9 custo de micrótomos especiais necessários para cortar os tecidos congelados. Amostras de células embebidas em parafina conferem excelente morfologia e biomoléculas, tais como ácidos nucleicos e proteínas parecem muito estáveis para armazenamento de longo prazo, mesmo à temperatura ambiente, se as biomoléculas sobreviverem às fases de embebimento. Infelizmente, a fixação em formaldeído, amplamente utilizado como um fixador na produção de um bloco de tecido embebido em parafina, provoca extensos danos aos ácidos nucleicos e às proteínas. Embora existam técnicas de embebimento em parafina que não utilizam formol, estas técnicas ainda apresentam problemas. Os problemas incluem a lenta taxa de difusão dos reagentes de embebimento o que permite a degradação de biomoléculas, a variação diária nas condições de fixação quando é utilizado um reagente de embebimento em massa ao longo de muitos dias para embebimento das amostras, e o potencial de contaminação das células de uma amostra para outra quando as amostras são banhadas em conjunto em cubas de reagentes em existentes técnicas de embebimento em parafina. Há, por isso, a necessidade de uma técnica de preparação do bloco de células que seja capaz de colocar fragmentos de células dentro de uma área concentrada dentro do bloco de células, sem perder as células, de tal forma que uma única secção do bloco de células de cera mostra uma proporção substancial de todos os fragmentos de células, sem diluição, por fibrina ou outras moléculas transportadoras. É também desejável uma técnica que evite ou elimine o registo incorreto de um bloco de células, a contaminação de um bloco de células com outro bloco de células, e que requeira menos reagentes de embebimento e tempo do que as técnicas atualmente disponíveis, e que permita a 10 preservação padronizada de biomoléculas para estudos de diagnóstico e pesquisa.

SUMARIO DA INVENÇÃO A presente invenção é definida na reivindicação 1 abaixo, e as reivindicações dependentes são direcionadas para as caracteristicas opcionais. Abaixo é divulgado um dispositivo que utiliza um processamento através de fluxo e da técnica de embebimento para embeber as células rapidamente. Este processamento através de fluxo maximiza a eficiência da recuperação de células e das extrações durante o embebimento, diminuindo desse modo a quantidade de amostra celular necessária, minimizando a quantidade de tempo para o processamento, e minimizando a quantidade de reagentes necessários para o embebimento. O dispositivo também coloca automaticamente as células no plano do bloco de células, onde esses precisam de ser seccionados sem os diluir com substâncias transportadoras. Além disso, o dispositivo minimiza ou elimina o potencial para o registo incorreto de um bloco de células ou a contaminação cruzada entre duas amostras de células diferentes. Finalmente, utilizar o dispositivo permite a personalização e padronização da preservação de células ou de condições de embebimento das células de modo a facilitar a pesquisa de células. O dispositivo pode incluir uma cassete de tecido que tem uma dupla função de captar a amostra celular e também de fornecer uma via através da qual os reagentes de embebimento podem fluir. Uma via de fluxo das células pode ser fornecida para o fornecimento de fragmentos de células desde uma amostra celular recolhida, tipicamente tanto numa solução aquosa como num liquido conservante celular, através da cassete de tecido até um filtro que retém as 11 células e os fragmentos de tecido. 0 dispositivo também pode incluir uma via de fluxo do reagentes configurada de forma a passar sequencialmente os reagentes de embebimento, e depois, por último, a parafina, através da cassete de tecido e através da amostra celular depositada no filtro. Quando a parafina é arrefecida, as células embebidas em parafina podem ser removidas do filtro, e uma junta entre o filtro e a cassete de tecido pode ser removida da cassete de tecido. Esta técnica deixa um disco de cera que se projeta desde a cassete de tecido com as células embebidas colocadas no plano no qual uma secção de tecido pode ser cortada utilizando um micrótomo padrão. Ao colocar o filtro no plano da secção de tecido, o processo de embebimento manual é eliminado, e é reduzido o tempo requerido para um técnico encontrar o plano das células no bloco embutido. Uma vez que não é utilizado qualquer outro material matriz de suporte, os fragmentos de células não são "diluidos" com a matriz, e cada secção de tecido pode, por isso, mostrar uma maior concentração de células. 0 dispositivo pode ser operado manualmente ou ser totalmente automático. Abaixo é descrito um método de funcionamento e de automatização do dispositivo da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A invenção pode ser melhor compreendida a partir da seguinte descrição detalhada feita em conjunto com os desenhos anexos, em que: A FIG. 1 é uma vista detalhada de um dispositivo de embebimento do bloco de células; A FIG. 2 é uma vista detalhada de uma outra forma de realização de um dispositivo de embebimento do bloco de células; 12 A FIG. 3A é uma vista em perspetiva de uma cassete de tecido; A FIG. 3B é uma vista de cima para baixo da cassete de tecido da FIG . 3 A; A FIG. 3C é uma vista de baixo para cima da cassete de tecido da FIG. 3A; e A FIG. 4 é uma vista lateral da cassete de tecido da FIG. 3A ao longo das linhas A - A.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção fornece um dispositivo para a rápida preparação de um bloco de células para seccionamento com um micrótomo. 0 dispositivo 10 de embebimento do bloco de células da presente invenção é projetado como um sistema de fluxo. Conforme mostrado em detalhe na FIG. 1, uma forma de realização do dispositivo 10 inclui uma via de fluxo das células 16 definida por um tubo de entrada 20 que tem uma extremidade de entrada 22 configurada para colocação dentro de um recipiente 12 fixando uma amostra celular 14 nele próprio e uma extremidade de saida 24, que liga de modo removível a uma porta da amostra descartável 26. Uma braçadeira de tubo solenoide 28 pode ser colocada ao longo do tubo de entrada 20 de modo a regular o fluxo de fluido através do tubo 20. O recipiente 12 pode incluir qualquer feitio, forma ou tamanho adequado. Por exemplo, e conforme ilustrado, o recipiente 12 pode ser um tubo de centrifugação padrão descartável de 50 mL. A amostra celular 14 pode estar em suspensão numa solução fisiológica salina, tal como uma solução tampão salina Hanks, ou num liquido conservante tal como 50% de álcool aquoso. A suspensão de células pode ser centrifugada imediatamente antes de se iniciar o processamento de modo a ter as células em suspensão. Além disso, as amostras celulares 14 também podem ser mecanicamente agitadas durante as 13 subsequentes fases de forma a mantê-las numa suspensão, por exemplo, através da ligação do recipiente da amostra celular 12 a um agitador mecânico (não mostrado), ou por ter uma haste mecânica descartável de agitação imersa no recipiente da amostra celular 12 (não mostrado).

Em comunicação fluida com a porta da amostra 26 está uma porta do reagente descartável 110 que forma a extremidade terminal de uma via de fluxo do reagente 18 do dispositivo 10. A via de fluxo do reagente 18 é definida por uma pluralidade de tubos de fornecimento de reagente ou linhas que se estendem desde a fonte dos seus respetivos reagentes e que, depois, convergem para a porta do reagente 110. Os reagentes de embebimento 82, 92 e 102 fluem para a porta do reagente 110 através das linhas de fluxo 80, 90 e 100, respetivamente, as quais estão em comunicação fluida com a porta do reagente 110. Cada uma das linhas de fluxo 80, 90, 100 pode também incluir uma bomba 84, 94, 104 para controlar o fornecimento do reagente, e uma braçadeira de tubo solenoide 86, 96, 106 para assegurar uma via hermética ao ar. Um álcool contido num reservatório 82 pode passar através da linha de fluxo de álcool 80, o xileno contido num reservatório 92 pode passar através de uma linha de fluxo de xileno 90, e a parafina derretida pode passar desde um reservatório de cera aquecida 102 através de uma linha de fluxo da cera aquecida 100 até à porta do reagente 110. 0 tubo de fluxo da cera aquecida 100 pode ser formado a partir de latão ou de outros materiais condutores de calor, enquanto os tubos de fornecimento de álcool e de xileno 80, 90 podem ser formados a partir de um material adequado que não seja degradado pelos reagentes, tal como o nylon. 14

Apesar de serem mostradas e descritas três linhas de fluxo de reagentes diferentes, entende-se que a via do fluxo do reagente 18 pode incluir qualquer número ou combinação de tubos de fornecimento de reagentes. Além disso, um número de outros reagentes também pode ser utilizado na presente invenção. Por exemplo, também podem ser incluídos tubos para fornecimento de soluções de formol ou de ácido de descalcificação. Tubos para o fornecimento de reagentes de imuno-histoquimica também podem ser aplicados com o dispositivo 10 da presente invenção, permitindo, desse modo, a deteção da proteína. Estes tubos podem estar ligados à porta do reagente 110 da mesma forma como para o álcool e para o xileno. Além disso, também é possível ter uma pluralidade de tubos de fornecimento de reagentes para fornecimento do mesmo reagente, se assim desejado. A porta da amostra 26, o tubo de entrada celular 20 e a sua extremidade de saída removível 24 e o recipiente da amostra da célula 12 podem ser descartáveis, e utilizados para processar apenas uma amostra. Um defletor pode ser colocado na porta da amostra descartável 26 de modo a separar a extremidade de saída 24 do tubo de entrada 20 a partir da porta do reagente 110. Este defletor irá impedir que a amostra celular contamine a porta do reagente 110, permitindo que a porta do reagente 110 seja utilizada para o tratamento subsequente de muitas amostras celulares.

Conforme mostrado na FIG. 1, a porta da amostra 26 pode ser ligada a uma cassete de tecido removível 30. A cassete de tecido 30 ilustrada em maior detalhe nas FIGS. 3A - 3C, inclui uma porta cilíndrica 36 que se prolonga desde uma superfície superior 32 através de uma superfície inferior 34 da cassete 30. A porta cilíndrica 36 cria uma via de fluxo para as células e para os reagentes a serem 15 fornecidos. A porta cilíndrica 36 liga-se à porta da amostra 26 a partir da superfície superior 32 da cassete 30 para permitir, desse modo, a comunicação de fluido entre a via de fluxo do reagente 18 e a cassete de tecido 30. Dentro da porta cilíndrica 36 estão prateleiras finas 44 para fixar o tampão de cera que acabará por se formar na cassete 30 (dentro da porta cilíndrica 36 perto da superfície inferior 34) , apesar de se entender que outras estruturas tais como malha, saliências, sulcos, ranhuras, ou rugosidade da superfície também podem ser incluídas dentro da porta cilíndrica 36 de modo a aumentar a aderência da cera. A cassete de tecido 30 é projetada de forma a conferir suficiente rigidez estrutural a fim de eliminar a necessidade de cera para preencher a totalidade da cassete 30, conservando, desse modo, a parafina. É entendido que a cassete de tecido 30 deve ser construída a partir de um material que seja resistente à degradação a partir do álcool, xileno ou ácidos. Materiais exemplares para a formação da cassete de tecido 30 incluem polipropileno, polipropileno com talco, e nylon. Numa forma de realização, a cassete de tecido 30 tem um comprimento na escala de cerca de 40 - 50 mm e uma largura na escala de cerca de 20 - 30 mm. A profundidade total da cassete 30, incluindo a porta 36, está na escala de cerca de 5 - 15 mm. Conforme mostrado na FIG. 4, a porta cilíndrica 36 da cassete 30 é de aproximadamente 12,7 mm (0,5 polegadas) de diâmetro, medida a partir da superfície inferior 32. Estas dimensões permitem que a porta cilíndrica encaixe num molde de embebimento padrão, e permitem que a cassete seja posicionada no suporte de um micrótomo padrão para o seccionamento.

Fazendo novamente referência à FIG. 1, a porta cilíndrica 36 que se prolonga para fora da superfície inferior 34 da 16 cassete de tecido 30 é conectada de modo removível a uma junta plana, em forma de anel 42. A junta 42 pode ter aproximadamente 1,5 mm (1/16 de polegada) de espessura, e coincide aproximadamente com o diâmetro e com a espessura da parede da porta cilíndrica 36 da cassete de tecido 30. A junta 42 pode ser composta por um material flexível tal como a borracha Viton™ que permite que a junta 42 forme um selo à prova de água com a cassete de tecido 3 0 e que resista à degradação química quando exposta ao xileno e a outros reagentes de embebimento. A junta 42 também deve ser suficientemente flexível de modo a permitir que seja retirada para fora da cera endurecida no final do processo sem reformar a cera endurecida que se prolonga a partir da cassete do tecido. A junta 42 é ligada de modo removível a um filtro 40 que é maior em diâmetro do que o diâmetro interno da junta 42. O filtro 40 tem um poro de tamanho na escala de cerca de 6 -12 mícrones de diâmetro de forma a permitir que os detritos subcelulares fluam através do filtro 40 enquanto retém as células individuais de pequeno porte. O tamanho dos poros do filtro pode ser adaptado para diferentes tipos de amostras. Por exemplo, uma amostra que se sabe que contém um elevado número de glóbulos vermelhos e aglomerados de células poderia ser processada com um filtro com tamanho dos poros de 12 mícron de modo a permitir que os glóbulos vermelhos individuais passem através do filtro enquanto retém os fragmentos de tecido. 0 filtro 40 pode incluir um filtro de policarbonato (tal como, por exemplo, isopore™ fabricado pela Millipore Corporation, Billerica, MA), que é suave e previne que as células e a cera se colem aos filtros quando são removidas. Além disso, a junta 42, a cassete de tecido 30 e o filtro 40 podem ser levemente 17 unidos em conjunto de forma que estes três componentes possam ser rapidamente carregados no dispositivo 10.

Numa forma de realização, a espessura total da cassete de tecido 30 com a junta unida 42 está na escala de aproximadamente 5-20 mm, e de preferência de cerca de 10 mm. Esta configuração de baixo perfil posiciona o filtro 40 numa localização, onde a menor superfície de um molde de tecido padrão estaria localizado se a cassete de tecido 40 e a junta 42 fossem colocados dentro de um molde de tecido padrão. Esta configuração da cassete de tecido 30 e do filtro 40 permite que as células depositadas sejam automaticamente posicionadas aproximadamente no plano em que a lâmina do micrótomo irá cortar o bloco de células, sem a necessidade de um molde de tecido, uma vez que as células estão embebidas dentro do bloco de cera mais próximo do plano de frente para a lâmina de corte do micrótomo e mais afastado do local de união ao micrótomo. Uma vez que a junta 42 e a cassete de tecido 30 podem ser produzidos com dimensões precisas, é possível ter um micrótomo predefinido de forma a começar o seccionamento exatamente no plano onde as células estão localizadas. Isto pode diminuir o tempo e o esforço dos histologistas durante o seccionamento do micrótomo.

Conforme mostrado na FIG. 1, o filtro 40 está apoiado sobre um suporte de filtro 60. Uma superfície superior do suporte de filtro 60 de frente para o filtro 40 pode ser porosa na sua zona central, de modo que os líquidos podem fluir através do filtro 40 e do suporte de filtro 60. 0 suporte de filtro 60 pode incluir um anel não-poroso plano que envolve a zona porosa central. 0 filtro 40 pode ser colocado sobre o suporte de filtro 60 de forma a cobrir completamente a zona porosa do suporte de filtro 60 e 18 estender-se um pouco sobre a parte não-porosa do suporte de filtro 60. A junta 42 pode estar apoiada no topo da extremidade exterior do filtro 40 sobre o anel não-poroso do suporte de filtro 60. Com esta configuração, pode ser formado um selo à prova de água entre a porta cilíndrica 36 da cassete de tecido 30 e o suporte do filtro 60, com o próprio filtro 40 colocado entre esses. O suporte de filtro 60 pode ter uma extensão cilíndrica para se estender sobre a junta 42 e a extremidade inferior da porta cilíndrica 36 da cassete de tecido 30. Com esta configuração, pode ser assegurado um correto posicionamento da cassete de tecido 30 em relação ao suporte de filtro 60, à junta 42 e ao filtro 40. O suporte de filtro 60 inclui elemento de aquecimento e arrefecimento integrado. 0 suporte de filtro 60 também pode ser configurado de tal modo que o calor pode ser eficientemente conduzido em direção ou para fora do suporte 60, de modo a manter a parafina num estado fundido e para acelerar o processo de endurecimento da parafina. Por exemplo, um aquecedor associado com o suporte de filtro 60 pode ser utilizado de modo a aumentar o calor que envolve o suporte 60 durante o processo de embebimento, e diminuir o calor para o suporte 60, quando o embebimento estiver completo e a cera estiver a endurecer. Outras potenciais alternativas de aquecimento e de arrefecimento incluem a manutenção da totalidade do dispositivo 10 numa caixa aquecida, ou de luz infravermelha brilhante para o filtro 40. 0 suporte do filtro 6 0 é ligado de modo removível a um recipiente de resíduos 50 para a retenção de fluido de resíduos durante o processo de embebimento, que inclui fluido de meios que contém a amostra celular, e os 19 reagentes de embebimento em excesso. Os efluentes diferentes podem ser separados uns dos outros movendo mecanicamente os diferentes recipientes de resíduos 50 por baixo do suporte de filtro 60. Em alternativa, o recipiente de resíduos 50 pode incluir uma pluralidade de recetáculos independentes, cada um com a sua própria braçadeira solenoide. Tal configuração permite que o fluxo de um efluente particular seja seletivamente desviado para o seu respetivo recetáculo por meio das braçadeiras solenoides. Contempla-se que tal procedimento para separar os reagentes de embebimento no efluente iria facilitar a reciclagem dos reagentes de embebimento. 0 dispositivo também diminui os custos de eliminação uma vez que são utilizados menos reagentes (por exemplo, aproximadamente 5 mL por bloco de células) em comparação com outros métodos atualmente disponíveis para produção do bloco de células. O processo de realização de um bloco de células pode ser útil efetuado manualmente com esta invenção, com muitas das vantagens acima descritas, incluindo: velocidade de processamento mais rápida devido ao aumento da eficiência da extração num sistema de fluxo, utilização diminuída de reagentes de embebimento, menor risco de registos incorretos, eliminação de contaminação cruzada, eliminação da fase do molde de tecido, e padronização das condições de preservação de embebimento ou das células. Uma vez que o dispositivo 10 de embebimento do bloco de células utiliza um design de fluxo em vez de simplesmente imergir os fragmentos celulares dentro das soluções de embebimento, a eficiência das extrações é dramaticamente aumentada, resultando na diminuição da utilização de reagentes e num processamento extremamente rápido. Em amostras preparadas utilizando o dispositivo, para cada bloco de células produzidas, não foram necessários mais do que 5 mL de cada 20 de xileno, de álcool e de cera. O processo de embebimento, quando efetuado manualmente, pode ser realizado em cerca de 10 minutos. Para um processo manual, a amostra celular e os reagentes de embebimento poderiam ser diretamente fornecidos por pipetagem na cassete de tecido 30 ou para a porta da amostra 26 sob supervisão visual. É importante carregar apenas células suficientes de modo que os reagentes de embebimento possam fluir através das células no filtro 40. Isto pode ser feito manualmente através da adição gota a gota das células enquanto se monitoriza o quão rápido o menisco ou o nível de fluido dos fluidos diminui perante a aplicação de um conjunto de pressões negativas no lado dos resíduos do filtro 40. Durante a operação do dispositivo, quando a taxa do menisco, ou o nível do fluido, descendente primeiro diminui de modo percetível, há uma camada suficientemente espessa de células para pelo menos vinte secções de tecidos de 5 mícrones. Tem-se observado que a taxa de diminuição do nível do fluido é mais rápida em cada uma das fases de extração, presumivelmente devido ao facto de as células serem progressivamente mais porosas uma vez que a água e as gorduras foram removidas. É essencial evitar que o menisco do fluido nunca passe para o filtro 40 durante a execução manual das fases de embebimento; as células são distorcidas se isso acontecer. O dispositivo 10 também pode ser configurado para automatização. Podem ser utilizadas várias estratégias para automatizar parte ou a totalidade da produção do bloco de células. Por exemplo, prevê-se que o fluxo da amostra celular e dos reagentes possa ser controlado com uma combinação de pressão positiva aplicada a montante da cassete de tecido 30 de forma a empurrar a amostra celular e/ou os reagentes de embebimento através do filtro 40, ou 21 pressão negativa aplicada no lado dos resíduos da cassete de tecido 70 de modo a puxar a amostra e/ou os reagentes de embebimento através do filtro. A FIG.l ilustra um dispositivo 10 de embebimento do bloco de células automático no qual a pressão negativa é aplicada no recipiente de resíduos 50 por meio de um tubo de pressão negativa 70 que pode ser ligado a uma fonte de vácuo. A pressão negativa atua de modo a tirar as células da amostra celular 14 através do tubo de entrada 20 e para o filtro 40. A pressão negativa também remove os reagentes através do filtro 40 e sobre as células de modo a formar o bloco de células de cera. Conforme mostrado, um medidor de pressão 72 pode ser incluído com o tubo de saída de forma a medir a pressão negativa do sistema durante o funcionamento do dispositivo 10. Todo o sistema, desde o recipiente da amostra celular 12 e dos reservatórios de reagente de embebimento 82, 92 e 102, até ao recipiente de resíduos 50 pode ser feito à prova de água. Em tal sistema à prova de água, a aplicação de uma pressão negativa no final do recipiente de resíduos 70 permite que as braçadeiras do tubo solenoide 86, 96 e 106 controlem se é fornecida uma amostra celular 14, ou se são fornecidos os reagentes de embebimento 82, 92 e 102 à porta da amostra 26 e depois dessa ao filtro 40.

Num método de funcionamento do dispositivo 10 de embebimento do bloco de células, é extraída uma amostra de fragmentos de células numa solução aquosa de um recipiente 12 através do filtro 40 pela aplicação de vácuo, ou pressão negativa, a partir do recipiente de resíduos 50 para o tubo de entrada 20 até que os poros do filtro se tornem praticamente obstruídos por fragmentos de células. O álcool é então retirado através do filtro 40, seguido pelo xileno e pela parafina derretida. Depois de a parafina arrefecer, 22 as células embebidas são retiradas do filtro 40. A junta 42 entre o filtro 40 e a cassete de tecido 30 é retirada para fora da cassete de tecido 30 quando a cera endurece, deixando um anel de cera de cerca de 1 mm de espessura que se prolonga a partir da gaveta de tecido 30. A cassete de tecido 30 é desenhada de forma a acomodar o filtro 40 de tal modo que as células depositadas são recolhidas no plano em que a lâmina do micrótomo irá cortar o bloco de células para o seccionamento, ou muito perto desse plano. A porta da amostra descartável 26 elimina o risco de contaminação cruzada entre os blocos de células uma vez que os componentes que contactam com a amostra celular são descartáveis. A FIG. 2 ilustra o dispositivo 10 de embebimento do bloco de células da FIG. 1 com a aplicação de uma pressão positiva adicional. Nesta forma de realização, um tubo de pressão positiva 74 pode ser ligado ao recipiente 12 tendo uma tampa hermética ao ar 76, conforme mostrado. O tubo de pressão positiva 74 pode ser conectado a uma fonte de pressão positiva para o fornecimento de pressão ao recipiente 12, que irá então facilitar o movimento das células desde a suspensão de células no recipiente 12 através do tubo ' de entrada 20 e depois desse através da porta de amostra 24 e da cassete 30 para o filtro 40. Pode ser utilizada uma combinação de pressão positiva e pressões negativas para o fornecimento de amostra celular e de reagentes de embebimento para o filtro 40. Conforme mostrado, o tubo de entrada 20 inclui uma braçadeira de tubo solenoide 28 para assegurar uma via hermética ao ar. O solenoide 28 serve para evitar que os fluidos se dirijam para a amostra num sistema de pressão positiva, ou no caso de pressão negativa para evitar puxar a amostra em vez dos reagentes de embebimento num sistema de pressão negativa. 23

Para automatizar o sistema, o fluxo de entrada da amostra e os reagentes de embebimento para a porta cilíndrica 36 necessitam de coincidir com o fluxo de saída para o recipiente de resíduos 50 de tal forma que os meniscos dos líquidos que passam através da porta cilíndrica 36 não são puxados para o filtro 40, e não se pode permitir que os reagentes excedam a cassete de tecido 30. Num sistema à prova de água adequado, pode ser suficiente aplicar sequencialmente a pressão positiva para o recipiente 12 da amostra celular e para as bombas do reagente de embebimento 84, 104 e 104 para forçar a amostra celular e os reagentes de embebimento sequencialmente através da porta cilíndrica 36 e, posteriormente, através do filtro 40 para efetuar um processo de embebimento útil.

Alternativamente, a quantidade de amostra celular 14 e de reagentes de embebimento fornecidos à via de fluxo das células 36 pode ser monitorizada eletronicamente por uma variedade de técnicas e taxas de fluxo da amostra e os reagentes de embebimento podem, então, ser adequadamente modulados. 0 nível do menisco ou do líquido podem ser monitorizados através de tecnologias existentes, ou as tecnologias podem ser especificamente adaptadas para esta invenção particular. Por exemplo, um mecanismo para monitorizar o nível do menisco serve para refletir a luz num ângulo para o menisco a partir de um laser ou de um díodo emissor de luz. Os sensores de luz podem monitorizar a linha de refletividade que muda com a descida do menisco. Os sensores podem ser posicionados sobre a cassete de tecido, por exemplo, adjacentes à amostra da porta 26, ou os sensores podem ser integrados na amostra da porta 26.

Um outro mecanismo para monitorizar o nível do fluido é a utilização de um cabo de fibra ótica descartável, imersivel, conforme fornecido pela ALA Scientific Instruments Inc., Westbury, Nova Iorque, como parte do seu sistema de "bloqueio do nível". Neste sistema, a luz sai para fora do cabo quando esse está em contacto com um líquido, e a diminuição da intensidade da luz é proporcional ao grau de imersão. Um cabo de fibra ótica descartável poderia ser incorporado na via de fluxo da célula 16 da cassete de tecido 30 ou na porta da amostra 24.

Um outro mecanismo para monitorizar o nível de fluido seria a utilização de monitores do nível de fluido do tipo capacitância que detetam fluidos (incluindo fluidos não-condutores) devido às suas diferentes constantes dielétricas comparadas com o ar. Uma fonte elétrica e um sensor poderiam ser posicionados logo acima da junta 42.

Ainda um outro mecanismo para monitorizar o nível do fluido seria a posição de um feixe de luz horizontalmente através da parte inferior da via de fluxo das células imediatamente acima da junta 42 numa cassete de tecido translúcido 30. Um sensor de luz colocado no lado oposto da via de fluxo das células poderia detetar uma alteração na intensidade quando o menisco passasse através do feixe de luz. E ainda um outro mecanismo para monitorizar as taxas de fluxo seria pesar o efluente que passa através do filtro. O fornecimento da amostra e dos reagentes de embebimento poderia ser acoplado ao peso dos efluentes de tal modo que a quantidade de amostra ou de reagentes de embebimento dentro da via de fluxo das células da cassete de tecido fosse mantida entre dois níveis. 25 0 carregamento automático da quantidade adequada da amostra celular 14 no filtro 40 poderia ser obtido por uma variedade de mecanismos. Numa configuração adequada à prova de água com braçadeiras de tubo solenoide 86, 96, 106 fechadas, a aplicação de uma pressão negativa modesta na extremidade de resíduos da invenção pode fornecer a amostra celular 14 ao filtro 40. Um medidor de pressão 72 pode desencadear a libertação da pressão negativa quando a pressão negativa é aumentada até um certo ponto indicativo do bloqueio de alguns poros do filtro 40. Esse mecanismo seria semelhante aos descritos nas patentes dos EUA n°s. 6,225,125 e 6,010,909.

Em alternativa, a aplicação no recipiente da amostra celular 12 de um curto pulso de pressão positiva, conforme mostrado na FIG. 2 poderia forçar uma alíquota da amostra para a porta cilíndrica 36 da cassete de tecido 30. A quantidade de células fornecidas poderia então ser estimada pela taxa de fluxo através do filtro 40. De modo a facilitar este processo no qual apenas são fornecidas pequenas aliquotas da amostra celular ao filtro 40, seria viável bombear num volume maior de álcool ou de solução salina em cada pequena alíquota da amostra celular fornecida. A mudança de álcool para xileno para cera pode ser configurada para um determinado volume de reagentes a serem bombeados. Em estudos utilizando o dispositivo 10 da presente invenção, determinámos repetidamente que 5 mL de cada um destes reagentes é suficiente para o embebimento adequado. Também poderia ser viável para monitorizar o efluente para as alterações no índice de refletividade o que indicaria que as extrações foram concluídas. Ou seja, os refratómetros podem ser colocados a jusante da amostra celular no recipiente de resíduos 50 e a diferença no 26 índice de refletividade entre a água, o álcool e o xileno poderia ser utilizada para determinar se todos os reagentes (por exemplo, água, álcool, xileno, etc.) foram removidos. É entendido que, apesar de serem mostrados e descritos três tubos de fornecimento de reagentes diferentes, a via do fluxo do reagente 18 pode incluir qualquer número e combinação de tubos de fornecimento de reagentes. Por exemplo, pode ser vantajoso incluir um reservatório de solução salina com uma linha de fluxo para a porta do reagente 110 para lavar as proteínas das amostras celulares 14 contidas numa solução salina fisiológica. Também pode ser útil incluir um reservatório de ácido e uma linha de fluxo para a porta do reagente 110 ser capaz de efetuar uma descalcificação de uma amostra. Ao utilizar o presente dispositivo também pode ser alcançada excelente qualidade de precoloração. Por exemplo, os reservatórios poderiam incluir hematoxilina, eosina e água destilada de modo a permitir uma precoloração da amostra celular, poupando, desse modo, tempo, devido à eliminação da necessidade de coloração de uma eventual secção de parafina. Também é conveniente incluir a eosina durante as extrações de álcool uma vez que a eosina torna a amostra celular aparente para o histologista que corta a secção da parafina, permitindo que o histologista avalie a qualidade e a quantidade das células nas secções conforme essas forem cortadas com um micrótomo.

Ao colocar o filtro no plano da secção de tecido, o processo de embebimento manual é eliminado, e o tempo necessário para um técnico encontrar o plano das células no bloco embebido é reduzido. Uma vez que não é utilizado outro material matriz de suporte, os fragmentos de células não são "diluídos" com a matriz, e cada secção de tecido 27 pode, desse modo, mostrar uma maior concentração de células. No entanto, em algumas situações pode ser desejável colocar a amostra celular final embebida num molde de tecido para re-fundir e re-endurecer (fase 11 do procedimento genérico do bloco da célula descrito nos antecedentes). Isto poderia ser efetuado de uma forma automatizada. A função da fase de re-fusao e de re- endurecimento seria permitir que uma fina camada de cera cobrisse a parte inferior das células de modo a facilitar a fase de "enfrentar" o seccionamento pelo micrótomo, que, aumenta o número de secções utilizáveis que podem ser cortadas a partir de um bloco de células. É entendido que o dispositivo é configurado de tal forma que os componentes são facilmente removíveis uns dos outros. Isto é desejável de modo que um técnico possa rapidamente e facilmente substituir, de forma eficiente, os componentes utilizados ou danificados. Além disso, a amostra da porta 26, o tubo de entrada celular 20 e a sua extremidade de saída removível 24, e o recipiente da amostra celular 12 são todos descartáveis. Isto permite uma utilização de uma só vez de cada um desses componentes para o processamento de uma amostra única, evitando, desse modo, a contaminação enquanto se processam as amostras celulares subsequentes.

Um leitor de código de barras (não mostrado) poderia ser incluído, de forma a fazer corresponder a etiqueta da amostra celular com uma etiqueta na cassete de tecido, e, dessa forma, eliminar o registo incorreto.

Lisboa, 26 de Outubro de 2011

Claims (11)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um dispositivo (10) de embebimento do bloco de células através do fluxo, compreendendo: uma via de fluxo das células (16) definida por um tubo de entrada (20) para o fornecimento de fragmentos de células a partir de uma amostra celular (14) para uma porta da amostra (26), em que a porta da amostra (16) está em comunicação fluida com uma cassete de tecido (30) tendo anexado a ela um filtro (40), a via de fluxo das células (16) estando configurada de forma que, perante a aplicação de pressão, os fragmentos de células são removidos da amostra celular (14) através do tubo de entrada (20) para a porta da amostra (26) e depositados sobre o filtro (40); e uma via de fluxo do reagente (18) definida por uma pluralidade de tubos de fornecimento de reagente de fornecimento de reagentes a uma porta do reagente (110) em comunicação com a porta da amostra (26), o fluxo do reagente em comunicação com a porta da amostra (26), a via de fluxo do reagente (18) estando configurada de forma que, perante a aplicação de pressão, os reagentes são retirados através dos tubos de fornecimento de reagentes para a porta do reagente (110) e para os fragmentos de células depositadas no filtro (40) sendo o dispositivo caracterizado por: uma fonte (102) de parafina quente, em que a via de fluxo do reagente, inclui um tubo de fornecimento do reagente aquecido para fornecimento da parafina quente para a porta da amostra (26) 2 e também caracterizado por um suporte poroso termicamente condutivo (60) em que o filtro (40) se apoia, e um aquecedor, para fornecer calor para o suporte (60) durante o processo de embebimento.

2. O dispositivo de acordo com a reivindicação 1, em que o filtro (40) está colocado entre a cassete (30) e o suporte do filtro (60) e o filtro (40) removível a partir da cassete (30) de forma a deixar um disco de cera que se prolonga a partir da cassete (30) com células embebidas num plano no qual uma secção de tecido pode ser cortada, em que fragmentos de célula são automaticamente depositados perto de um plano capaz de ser seccionado por um micrótomo.

3. 0 dispositivo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a pressão aplicada à via de fluxo do reagente (18) é uma pressão negativa; ou em que a pressão aplicada à via de fluxo do reagente (18) é uma pressão positiva.

4. 0 dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a pressão aplicada à via de fluxo das células (16) é uma pressão negativa ou em que a pressão aplicada à via de fluxo das células (16) é uma pressão positiva.

5. 0 dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a via de fluxo do reagente (18) inclui um tubo de fornecimento de reagente para o fornecimento de um reagente selecionado a partir do grupo constituído por álcool, xileno, parafina quente, água destilada, solução 3 salina, ácido, hematoxilina, eosina, reagentes imunohistoquímicos.

6. 0 dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que cada tubo de fornecimento de reagente também inclui uma bomba (84, 94, 104) para regular o fluxo do reagente através do tubo.

7. O dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que cada tubo de fornecimento de reagente também inclui uma braçadeira de tubo solenoide (86, 96, 106) para formar uma via hermética ao ar.

8. 0 dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o filtro compreende policarbonato.

9. 0 dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a cassete de tecido (30) também inclui uma porta cilíndrica (36) configurada para fixação à porta da amostra (26) e que se estende através da cassete (30) configurada para fixação ao filtro (40).

10. O dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que também inclui um recipiente de resíduos (50) para a recolha de pelo menos um da pluralidade de reagentes.

11. O dispositivo, de acordo com a reivindicação 10, em que o recipiente de resíduos (50) inclui uma porta para ligação a uma fonte de pressão. 4 12. 0 dispositivo, de acordo com a reivindicação 11, em que a porta (50) também inclui um medidor de pressão {12) . Lisboa, 26 de Outubro de 2011