PT1549337E - Combinação de adnase i e glicosaminoglicanos para utilização em depuração de adn extracelular - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Combinação de ADNase I e glicosaminoglicanos para utilização em depuração de ADN extracelular"

Campo do invento 0 presente invento descreve-se nas reivindicações 1-21 e refere-se a ADNase I e em particular ao uso de ADNase I no tratamento de doenças caracterizadas pela presença de ADN extracelular endógeno.

Antecedentes do invento

As ADNases são um grupo de enzimas fosfodiesterase capazes de hidrolisar ADN. Actuam de uma forma não especifica, dado que não necessitam da presença de uma sequência específica na molécula alvo e são capazes de degradar extensamente moléculas de ADN clivando-as múltiplas vezes. Os dois tipos principais de ADNases são enzimas de ADNase de tipo I e ADNase de tipo II. Existem também enzimas ADNase de tipo III. A ADNase I requer catiões para ser activa e tem um pH óptimo cerca do neutro. Hidrolisa ADN produzindo nucleótidos 5' -fosfato. A ADNase II pode ser activada por catiões divalentes e tem um pH óptimo ácido. Hidrolisa ADN produzindo nucleótidos 3' - fosfato.

Clinicamente pensa-se que as ADNases, em particular a ADNase I, são úteis no tratamento de doenças respiratórias e são usadas actualmente para tratar fibrose cística. Foi sugerido que as ADNases também podem ser úteis no tratamento de várias outras doenças incluindo as que envolvem locais inflamatórios fechados e doenças auto-imunes, tais como lúpus eritematoso sistémico (LES) . As doenças respiratórias para as quais se pensa que a ADNase é útil no tratamento são caracterizadas por um aumento da viscosidade do muco devido à presença de ADN genómico humano e bacteriano. 0 muco é uma mistura complexa de sais, água, glicoproteínas, proteoglicanos e proteínas que limpa, lubrifica e protege muitas vias no corpo, incluindo as pulmonares. Contudo, a presença de ADN genómico, e em particular de cadeias longas de ADN genómico, aumenta a viscosidade do muco ao ponto de comprometer a 2 ΕΡ 1 549 337/ΡΤ depuração mucociliar. 0 muco viscoso não é depurado adequadamente pelos mecanismos normais e bloqueia ou obstrui as vias aéreas pulmonares, restringindo assim o fluxo aéreo. Pode também promover a ocorrência de infecções. Globalmente, o efeito pode ser fatal ou debilitante.

Pensa-se que o ADN genómico viscoso nestas doenças respiratórias é originário principalmente de infiltrado de células respiratórias tais como neutrófilos. Pensa-se que estas células sofrem necrose, em vez do processo mais controlado de apoptose, libertando elevadas quantidades de ADN genómico gelatinoso para o muco. A libertação de outros polímeros, tais como actina, das células em necrose pode aumentar adicionalmente a viscosidade do muco. A fibrose cística é uma das principais doenças respiratórias em que a produção aumentada anómala de muco e a presença de ADN no muco desempenham um papel importante. A fibrose cística é uma doença hereditária autossómica recessiva causada por mutação do gene regulador da condutância transmembranar de fibrose cística (CFTR). É a doença hereditária mais comum em indivíduos de descendência europeia e também ocorre noutras populações, mas normalmente com menor incidência. Os doentes com fibrose cística apresentam tipicamente dificuldade a respirar, perda de sal excessiva no suor e digestão e absorção de alimentos incompleta. A doença pode também afectar a fertilidade masculina. 0 CFTR é um canal de cloreto e encontra-se presente em células excretoras de muco. Os iões cloreto são libertados para o muco através do canal CFTR. Tal aumenta a osmolaridade do muco e resulta na passagem de água das células para o muco, tornando-o menos espesso e ajudando a assegurar que tem a viscosidade correcta. Nos doentes com fibrose cística, dado a deficiência em CFTR, os iões cloretos não são transportados com eficácia para o muco e assim o muco é mais viscoso. A absorção de sódio, normalmente restrita pela actividade CTFR, é aumentada e com esta a absorção de água, levando a excreções desidratadas condensadas que promovem infecções bacterianas e portanto inflamação. 0 número de leucócitos, em particular neutrófilos, no muco do pulmão de doentes de fibrose cística também é muito 3

ΕΡ 1 549 337/PT aumentado e a necrose destas células liberta ADN genómico que aumenta adicionalmente a viscosidade do muco. A fibrose cística é normalmente fatal, embora a esperança de vida dos indivíduos afectados esteja a aumentar devido a melhores tratamentos. Nos anos 60, os doentes de fibrose cística tinham em média uma esperança de vida inferior a dez anos e actualmente a esperança de vida média está a chegar aos trinta anos.

As ADNases, em particular a ADNase I humana recombinante vulgarmente usada no tratamento de fibrose cística, são caras. Além disso, embora se usem actualmente ADNases para tratar doentes com fibrose cística, cerca de 50 a 70% dos doentes com fibrose cística apresentam benefícios mínimos ou inexistentes após o tratamento.

Sumário do invento 0 presente invento baseia-se na constatação de que os glicosaminoglicanos com um peso molecular médio de 8 a 40 kd podem aumentar a actividade de ADNase I. O glicosaminoglicano só por si não cliva ADN, mas aumenta a capacidade de ADNase I para o fazer. Tal efeito sinérgico inesperado significa que é necessária menos ADNase I para atingir o mesmo efeito e também que se podem conseguir níveis mais elevados de actividade total num sistema que use a mesma quantidade de ADNase I. O maior nível de actividade atingível com a mesma quantidade de enzima pode significar que as doenças ou indivíduos que eram anteriormente refractários a tratamento com ADNases, ou que apresentavam benefícios mínimos do tratamento, podem agora ser tratáveis. Pode também significar que tem que se usar uma menor quantidade de ADNase I que é particularmente importante em aplicações em que se usam ADNases I recombinantes, dado que estas enzimas são caras.

Assim, o presente invento proporciona o uso de um glicosaminoglicano ou de um seu sal fisiologicamente aceitável no fabrico de um medicamento para tratar um indivíduo com uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno, em que o indivíduo também está a ser tratado com uma 4 ΕΡ 1 549 337/ΡΤ ADNase I, em que o glicosaminoglicano ou seu sal tem um peso molecular médio de 8 a 40 kd e o glicosaminoglicano ou seu sal aumenta a actividade da ADNase I, em que a doença é: (a) uma doença respiratória caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno no pulmão; (b) seleccionada de fibrose cística, limitação crónica do fluxo aéreo e pneumonia; (c) lúpus eritematoso sistémico (LES); ou (d) uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno num local inflamatório. 0 presente invento também proporciona o uso de uma ADNase I no fabrico de um medicamento para tratar um indivíduo com uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno, em que o indivíduo está a ser também tratado com um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável, em que o glicosaminoglicano ou seu sal tem um peso molecular médio de 8 a 40 kd e o glicosaminoglicano ou seu sal aumenta a actividade da ADNase I, em que a doença é: (a) uma doença respiratória caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno no pulmão; (b) seleccionada de fibrose cística, limitação crónica do fluxo aéreo e pneumonia; (c) lúpus eritematoso sistémico (LES); ou (d) uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno num local inflamatório. O presente invento proporciona adicionalmente uma composição farmacêutica compreendendo: um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável que tem um peso molecular médio de 8 a 40 kd; uma ADNase I; e um excipiente, transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável. O presente invento também proporciona: produtos compreendendo um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável, em que o glicosaminoglicano ou seu sal tem um peso molecular médio de 8 a 40 kd, e uma ADNase I para uso no tratamento de uma doença caracterizada pela presença 5 ΕΡ 1 549 337/ΡΤ de ADN extracelular endógeno no indivíduo a ser tratado, em que 0 glicosaminoglicano ou seu sal aumenta a actividade da ADNase 1 e em que os produtos são para ser administrados de uma forma simultânea, independente ou sequencial, em que a doença é: (a) uma doença respiratória caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno no pulmão; (b) seleccionada de fibrose cística, limitação crónica do fluxo aéreo e pneumonia; (c) lúpus eritematoso sistémico (LES); ou (d) uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno num local inflamatório; um agente para uso no tratamento de um indivíduo com uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno, em que o agente compreende um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável, em que o glicosaminoglicano ou seu sal tem um peso molecular médio de 8 a 40 kd, em que o referido indivíduo está a ser tratado com uma ADNase I e o glicosaminoglicano ou seu sal aumenta a actividade da ADNase I, em que a doença é: (a) uma doença respiratória caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno no pulmão; (b) seleccionada de fibrose cística, limitação crónica do fluxo aéreo e pneumonia; (c) lúpus eritematoso sistémico (LES); ou (d) uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno num local inflamatório; e um agente para uso no tratamento de um indivíduo com uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno, em que o agente compreende ADNase I, em que o referido indivíduo está a ser tratado com um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável, em que o glicosaminoglicano ou seu sal tem um peso molecular médio de 8 a 40 kd e o glicosaminoglicano ou seu sal aumenta a actividade da ADNase I, em que a doença é: (a) uma doença respiratória caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno no pulmão; (b) seleccionada de fibrose cística, limitação crónica do fluxo aéreo e pneumonia; (c) lúpus eritematoso sistémico (LES); ou (d) uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno num local inflamatório. 6

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Descreve-se aqui um kit compreendendo: um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável, em que o glicosaminoglicano ou seu sal tem um peso molecular médio de 8 a 40 kd; uma ADNase I; e material de embalagem. O invento também proporciona: um nebulizador ou outro dispositivo de aerossol liquido, inalador de pó seco ou inalador com doseador compreendendo uma composição de acordo com o invento; e uso de um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável, em que o glicosaminoglicano ou sal tem um peso molecular médio de 8 a 40 kd para aumentar a actividade de uma ADNase in vitro.

Descrição sucinta das figuras A figura 1 apresenta o efeito de uma heparina não fraccionada na degradação de ADN por ADNase. O eixo dos Y apresenta a concentração de ADN após incubação com ADNase durante 1 hora. O eixo dos X apresenta a concentração de ADNase utilizada. Apresentam-se os resultados para incubações efectuadas na presença de heparina ( ) e na aêBcia de heparina (♦) . A figura 2 apresenta o efeito de heparina não fraccionada na degradação de ADN por ADNase, tal como determinado por electroforese em gel de agarose. O painel superior apresenta os resultados de incubação de ADN genómico com ADNase na ausência de heparina, enquanto o painel inferior apresenta os resultados quando as mesmas digestões foram efectuadas na presença de heparina. As pistas 1 a 12 são como se segue: pistas 1 e 2 -apenas ADN; pistas 3 e 4 - ADN + ADNase (incubação de 5 minutos) ; pistas 5 e 6 - ADN + ADNase (incubação de 15 minutos); pistas 7 e 8 - ADN + ADNase (incubação de 30 minutos); pistas 9 e 10 7

ΕΡ 1 549 337/PT - ADN + ADNase (incubação de 45 minutos); pistas 11 e 12 - ADN + ADNase (incubação de 60 minutos). A figura 3 apresenta o efeito de heparina não fraccionada na degradação de ADN por ADNase tal como determinado por microscopia de força atómica (AFM). O painel A apresenta os resultados de ADN incubado sozinho. O painel B apresenta os resultados de ADN incubado com ADNase. O painel C apresenta os resultados de ADN incubado com ADNase e 1 micrograma por ml de heparina. O painel D apresenta os resultados de ADN incubado com ADNase e 10 microgramas por ml de heparina. A figura 4 apresenta o efeito de vários glicosaminoglicanos (GAG) na actividade de ADNase. O eixo dos Y apresenta a concentração de ADN remanescente após uma hora de incubação com ADNase e o GAG, enquanto o eixo dos X apresenta a concentração de GAG usada. Apresentam-se os resultados para (A) heparina; (B) uma mistura de sulfatos de condroitina A e C; (C) sulfato de heparano; (D) heparina de baixo peso molecular; e (E) sulfato de dextrano (que é um controlo não GAG). A figura 5 apresenta o efeito de uma mistura de sulfatos de condroitina A e C na eficácia de ADNase em expectoração de fibrose cística, tal como avaliado usando um ensaio de barreira envolvendo a medição do transporte de microesferas fluorescentes. Apresentam-se os resultados para várias concentrações de sulfato de condroitina. A figura 6 apresenta o efeito de uma mistura de sulfatos de condroitina A e C na degradação de ADN por ADNase tal como determinado por microscopia de força atómica (AFM). O painel A apresenta os resultados obtidos num controlo de ADN sem ADNase nem sulfato de condroitina. O painel B apresenta os resultados para ADN incubado apenas com ADNase. O painel C apresenta os resultados para ADN incubado com ADNase e sulfato de condroitina.

Descrição sucinta das sequências SEQ ID NO: 1 proporciona a sequência de nucleótidos e de aminoácidos para ADNase 1 humana. 8 ΕΡ 1 549 337/ΡΤ SEQ ID ΝΟ: 2 proporciona a sequência de aminoácidos para ADNase 1 humana.

Descrição detalhada do invento 0 presente invento refere-se à administração, a um indivíduo com uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno, de um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável, para potenciar a actividade de uma ADNase I que é administrada ao indivíduo para tratar a doença. A doença é: (a) uma doença respiratória caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno no pulmão; (b) seleccionada de fibrose cística, limitação crónica do fluxo aéreo e pneumonia; (c) lúpus eritematoso sistémico (LES); ou (d) uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno num local inflamatório. A actividade da ADNase I é assim aumentada. Pode verificar-se um efeito sinérgico. Numa concretização do invento especialmente preferida o glicosaminoglicano usado será uma heparina ou um seu sal fisiologicamente aceitável. A ADNase usada é uma ADNase I. Numa concretização especialmente preferida adicional o glicosaminoglicano será administrado intranasalmente e/ou através de inalação.

Sinergia de glicosaminoglicano com ADNase I

Inesperadamente, os glicosaminoglicanos com um peso molecular médio de 8 a 40 kd são capazes de aumentar a actividade de ADNase I. Ou seja, a mesma quantidade molar de enzima tem uma actividade aumentada na presença de glicosaminoglicano comparativamente à ausência de glicosaminoglicano. O glicosaminoglicano sozinho não tem actividade hidrolítica de ADN, ou tem actividade desprezável, pelo que o aumento da actividade é devido especificamente a um aumento da actividade da enzima na presença de glicosaminoglicano. A velocidade de digestão de ADN i.e. a quantidade de ADN digerida por unidade de tempo pode ser aumentada uma, duas, três, dez, vinte ou mais vezes pela adição do glicosaminoglicano. 0 aumento da actividade de ADNase I pode ser tipicamente de 5% a 5000%, preferentemente de 50 a 2500%, 9

ΕΡ 1 549 337/PT com maior preferência de 75 a 1000%, ainda com maior preferência de 100 a 1000%, ainda com maior preferência de 250 a 1000% e ainda com maior preferência de 500 a 1000%. Estes aumentos referem-se tipicamente à quantidade de ADN que a ADNase I pode degradar num determinado intervalo de tempo e preferentemente à actividade da enzima tal como expressa em unidades Kunitz ou alternativamente unidades Dornase.

Uma unidade Kunitz de ADNase I produzirá um delta A260 de 0,001 por minuto por ml a pH 5,0 a 25 °C, usando ADN como substrato, com [Mg2+] = 4,2 mM. Preferentemente, o ADN usado para avaliar a actividade de ADNase I será ADN genómico de timo de vitelo ou de esperma de salmão. Define-se uma unidade Dornase como a quantidade de enzima que causará uma diminuição de 1,0 unidades de viscosidade relativa numa solução de ADN altamente polimerizado relativamente à viscosidade original de 4,0 em 10 minutos a 37 °C. A presença de glicosaminoglicano pode aumentar efectivamente o número de unidades de actividade de enzima ADNase I presente mais de uma vez, duas vezes, três vezes, cinco vezes, dez vezes, vinte vezes ou mais. Tipicamente, a presença de glicosaminoglicano pode reduzir efectivamente a quantidade molar de ADNase I necessária para conseguir a mesma actividade a metade, um quarto, um quinto, um décimo ou mais. O glicosaminoglicano pode assegurar uma digestão mais completa de ADN num determinado intervalo de tempo pela mesma quantidade de ADNase I, assim o tamanho de fragmento médio ou principal pode ser tipicamente duas, três, cinco, dez, vinte cinquenta ou mais vezes mais comprido na ausência do que na presença de glicosaminoglicano após incubação durante um intervalo de tempo equivalente.

Descrevem-se aqui vários métodos para ensaiar a actividade de ADNase I. Pode usar-se qualquer um destes para avaliar a actividade de ADNase I. Nomeadamente pode usar-se um ensaio baseado em fluorescência usando, por exemplo, corante de Hoechst tal como o descrito em Labarce e Paiden, 1980, Anal. Biochem., 102:344-352 para ensaiar a hidrólise de ADN. Pode usar-se electroforese em gel para avaliar o tamanho de fragmento de ADN. 10 ΕΡ 1 549 337/ΡΤ Ο glicosaminoglicano ou seu sal é tipicamente proporcionado numa quantidade que produz um efeito sinérgico na actividade de ADNase I. Assim pode atingir-se um ou mais dos valores aqui apresentados para o aumento na actividade. A razão entre ADNase I e glicosaminoglicano ou sal em peso ou alternativamente em unidades pode ser, por exemplo, de 1:50000 a 1000:1, preferentemente de 1:10000 a 100:1, com maior preferência de 1:5000 a 50:1, ainda com maior preferência de 1:1000 a 25:1. A razão pode ser, por exemplo, de 1:500 a 1:20, preferentemente de 1:150 a 1:5, com maior preferência de 1:50 a 1:2 e ainda com maior preferência de 1:10 a 1:1. Os dois podem estar, por exemplo, em quantidades iguais ou a ADNase I pode estar num excesso de duas vezes, cinco vezes, dez vezes ou mais ou alternativamente o glicosaminoglicano pode estar presente num excesso semelhante. ADNAse 1

Pode usar-se qualquer ADNase I adequada no presente invento. A ADNase é assim uma ADNase I (EC 3.1.21.1). A ADNase I ocorre em várias espécies e pode usar-se no invento qualquer ADNase I capaz de clivar ADN. A ADNase I pode ser de uma fonte animal, tal como de origem bovina ou porcina. Pode ser de origem vegetal, fúngica ou microbiana. No entanto, tipicamente e com maior preferência a ADNase I é de origem humana e é preferentemente uma ADNase I humana recombinante. Podem usar-se preparações de ADNase I disponíveis comercialmente, tais como Dornase™ e Pulmozymele™ em concretizações do invento. A ADNase I terá uma actividade de hidrólise de ADN, por exemplo pode hidrolisar ADN originando nucleótidos 5' -fosfato Pode usar-se um ensaio baseado em fluorescência, por exemplo, pode usar-se corante Hoechst tal como o detectado em Labarce e Paiden, 1980, Anal. Biochem., 102:344-352 para ensaiar a hidrólise de ADN. A actividade hidrolítica pode ser avaliada de vários modos conhecidos na especialidade, incluindo electroforese analítica em gel de poliacrilamida e de agarose, ensaio de hipercromicidade (Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:363-377 (1950)) ou ensaio de verde de metilo (Kurnick, Arch. Biochem. 29:41-53 (1950); Sinicropi, et al., Anal. Biochem. 222:351-358 (1994)). A quebra de moléculas de ADN de formas de elevado peso molecular para 11

ΕΡ 1 549 337/PT menor peso molecular pode ser monitorizada preferentemente por técnicas tais como electrof orese em gel de agarose. Podem efectuar-se experiências de controlo na ausência da enzima e/ou na presença de uma proteína que se sabe que tem actividade de ADNase I. A ADNase I apresentará preferentemente actividade mucolítica para amostras de muco contendo ADN. A actividade mucolítica refere-se à redução de viscoelasticidade (viscosidade) do muco. A actividade mucolítica pode ser determinada por qualquer de vários métodos diferentes conhecidos na especialidade, incluindo ensaio de compactação de expectoração (consultar por exemplo WO 94/10567) ensaios usando um pêndulo de torção (Janmey, J. Biochem. Biophys. Methods 22:41-53 1991) ou outras metodologias reológicas adequadas.

Sabe-se que a ADNase I é propensa a desamidação. Os resíduos de asparagina e em particular a asparagina nas posições de aminoácido 7 e 74 da ADNase I humana madura são propensos a desamidação. Este processo converte os resíduos de asparagina em questão a resíduos de ácido aspártico ou iso-aspartato. A desamidação reduz a actividade da enzima e este é particularmente o caso de desamidação da asparagina na posição de aminoácido 74 de ADNase I humana madura.

Encontram-se disponíveis técnicas para remover formas desamidadas das enzimas deixando as formas amidadas e estas podem ser usadas para preparar ADNase I para uso no invento. Estas técnicas podem incluir permuta catiónica de tentáculo (TCX) ou purificação por afinidade usando ADN para purificar as formas amidadas da enzima que são ainda capazes de ligar ADN.

Uma preparação de ADNase I para uso no invento pode compreender tipicamente de 85 a 100%, preferentemente de 90 a 100%, com maior preferência de 95 a 100% e ainda com maior preferência de 99 a 100% de enzima amidada ou parcialmente amidada por peso. Nomeadamente estes valores referem-se à quantidade de enzima totalmente amidada i.e. em que todos os resíduos que naturalmente são amidados estão amidados. Tipicamente terão mais de 95%, preferentemente mais de 99% e ainda com maior preferência mais de 99,9% da ADNase I numa forma amidada. Nomeadamente, estes valores referem-se a valores na 12 ΕΡ 1 549 337/PT altura da produção ou aos seus valores um mês a um ano, preferentemente de dois a seis meses e com maior preferência de três a quatro meses após produção. Podem referir-se ao valor durante qualquer altura da validade do produto.

Sabe-se que determinadas superfícies promovem desamidação de ADNase I e por isso as composições e preparações farmacêuticas e os medicamentos do invento preferentemente não são armazenados em contacto com vidro. No entanto, podem ser armazenados em recipientes de vidro revestidos com uma camada que não seja de vidro, de modo a que não haja contacto directo do vidro com a ADNase I. Alternativamente podem proporcionar-se em recipientes de plástico ou outros recipientes adequados que não sejam de vidro.

As variantes de ocorrência natural ou conhecidas de ADNase I podem ser usadas no invento. Assim a expressão ADNase I abrange tais variantes. A expressão "variantes" refere-se a polipéptidos que têm essencialmente o mesmo carácter ou funcionalidade biológica básica de ADNase I. 0 carácter essencial de uma ADNase I é a actividade de fosfodiesterase e a capacidade de hidrolisar ADN. Os ensaios para medir a ruptura de ADN foram aqui descritos e estes podem ser usados para determinar se uma variante tem actividade hidrolítica. SEQ ID NO: 2 apresenta a sequência de aminoácidos para ADNase 1 humana e as variantes desta sequência são abrangidas pelo invento. Tipicamente, os polipéptidos com mais de 65% de identidade, preferentemente pelo menos 80% ou pelo menos 90% e particularmente de preferência pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, que mantêm actividade hidrolítica de ADN, são considerados variantes que podem ser utilizadas no invento. Tais variantes podem incluir variantes alélicas e a deleção, modificação ou adição de apenas um aminoácido ou grupos de aminoácidos à sequência da proteína, desde que o péptido mantenha actividade hidrolítica de ADN e mais de 65% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Podem fazer-se substituições de aminoácidos, por exemplo podem introduzir-se 1, 2 ou 3 a 10, 20 ou 30 substituições. O polipéptido modificado manterá actividade de ADNase I. As 13 ΕΡ 1 549 337/ΡΤ substituições conservativas podem ser feitas, por exemplo, de acordo com a seguinte tabela. Os aminoácidos no mesmo bloco na segunda coluna e preferentemente na mesma linha na terceira coluna podem ser substituídos entre si.

ALIFÁTICOS Não polares GAP I L V Polares não carregados C S T M N Q Polares carregados D E K R AROMÁTICOS H F W Y

As variantes mais curtas encontram-se no âmbito do invento. Por exemplo, um péptido de pelo menos 20 aminoácidos ou até 50, 60, 70, 80, 100, 150 ou 200 aminoácidos de comprimento é considerado abrangido pelo âmbito do invento desde que demonstre actividade hidrolítica de ADN e mais de 65% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Nomeadamente, mas não exclusivamente, este aspecto do invento abrange a situação em que a proteína é um fragmento da sequência de proteína completa de SEQ ID NO: 2 e pode representar uma região de ligação de ADN e hidrolítica, em particular incluindo o local activo.

Pode usar-se uma variedade de utilitários para calcular percentagem de homologia. O pacote UWGCG proporciona o utilitário BESTFIT que pode ser usado para calcular homologia (por exemplo usado com os seus parâmetros por omissão) (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p. 387-395). Os algoritmos PILEUP e BLAST podem ser usados para calcular homologia ou alinhar sequências (tipicamente com os seus parâmetros por omissão), por exemplo tal como descrito em Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10.

O utilitário para efectuar análise BLAST encontra-se disponível ao público através de National Centre for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.qov/). Este algoritmo envolve primeiramente identificação de pares de sequência de elevada pontuação (HSP) por identificação palavras curtas de comprimento W na sequência de interrogação que são iguais ou que obedecem um determinado limiar de pontuação T 14 ΕΡ 1 549 337/PT positiva quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento numa sequência da base de dados. T denomina-se limiar de pontuação de palavra de vizinhança (Altschul et ai, supra). Estes acertos de palavra de vizinhança iniciais funcionam como sementes para iniciar buscas para encontrar HSP que os contenham. Os acertos de palavra são estendidos em ambos os sentidos ao longo de cada sequência desde que a pontuação de alinhamento cumulativa possa ser aumentada. A extensão para acerto de palavra em cada sentido pára quando: a pontuação de alinhamento cumulativa diminui uma quantidade X relativamente ao valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa atinge um valor de zero ou inferior, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos com pontuação negativa; ou atinge-se o final de qualquer das sequências. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. 0 programa BLAST usa como parâmetros por omissão um comprimento de palavra (W) de 11, a matriz de pontuação BLOSUM62 (consultar Henikoff e Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915-10919) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4 e uma comparação de ambas as cadeias. O algoritmo BLAST efectua uma análise estatística da similaridade entre as duas sequências; consultar e.g., Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 5873-5787. Uma medida de similaridade proporcionada pelo algoritmo BLAST é a menor soma de probabilidades (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade de uma identidade entre duas sequências de nucléotidos ou de aminoácidos ocorrer por acaso. Por exemplo, considera-se que uma sequência é semelhante a outra sequência caso a menor soma de probabilidades em comparação da primeira sequência com a segunda sequência seja inferior a cerca de 1, preferentemente inferior a cerca de 0,1, com maior preferência inferior a cerca de 0,01 e com a maior preferência inferior a cerca de 0,001. A ADNase I utilizada pode ser de facto uma variante com afinidade reduzida para actina comparativamente à ADNase I da qual é derivada. Estas variantes podem, por exemplo, ser usadas quando está presente actina além do ADN e preferentemente quando a doença a ser tratada é uma doença respiratória em que se encontra presente actina no muco. 15

ΕΡ 1 549 337/PT A variante pode ter de 0 a 50%, preferentemente de 0 a 25%, com maior preferência de 0 a 15% e ainda com maior preferência de 0 a 5% da afinidade da ADNase I não modificada da qual é derivada para actina e preferentemente a de ADNase I humana. A afinidade da variante para actina pode ser reduzida de 1 a 1000 vezes, preferentemente de 5 a 500 vezes, com maior preferência de 10 a 100 vezes e ainda com maior preferência de 20 a 50 vezes. Estes dados podem referir-se à afinidade para actina polimérica ou monomérica ou ambas. A variante pode não ter qualquer capacidade de se liqar especificamente a actina. As variantes com actividade para actina reduzida manterão contudo alguma ou toda a sua capacidade hidrolítica e a sua capacidade para ligar e clivar ADN.

Podem efectuar-se alterações de aminoácidos numa ADNase I para introduzir um local de glicosilação no local de ligação a actina da ADNase I, ou perto dele, para reduzir a afinidade da variante para actina. As regiões ou resíduos responsáveis por ligação a actina podem ser deletadas ou substituídas por aminoácidos alternativos. Podem efectuar-se inserções ou modificações perto dos locais de ligação de actina para destruir a sua função. As variantes preferidas de ADNase I com afinidade para actina reduzida detalham-se em patente US 6 348343 e qualquer das variantes de ADNase I aí detalhadas com afinidade para actina reduzida, mas que mantêm actividade hidrolítica para ADN, podem ser usadas no presente invento. A redução da capacidade de ligar actina pode então ser determinada para verificar se afinidade para actina é reduzida, mantendo a actividade hidrolítica de ADN. A capacidade de uma variante ligar actina pode ser monitorizada por técnicas conhecidas na especialidade, tais como as detalhadas em Mannherz, et al.r Eur. J. Biochem. 104:367-379 (1980) . As afinidades de ligação relativas de diferentes ADNases I podem ser determinadas por medição da ligação da ADNase I a actina imobilizada num ensaio de ELISA ou por comparação da actividade hidrolítica de ADN da ADNase I na presença e na ausência de actina. A sequência da ADNase I pode ser modificada de modo a aumentar a sua semivida. Por exemplo a sequência da enzima pode ser alterada para remover sequências de reconhecimento para 16 ΕΡ 1 549 337/ΡΤ determinadas protéases e em particular as derivadas de células inflamatórias presentes no pulmão ou outros sistemas em que será usado o invento. A ADNase I pode também ser modificada quimicamente para alterar as suas propriedades tais como, por exemplo, a sua semivida biológica. Para conseguir estas modificações covalentes introduzir-se por reacção de resíduos de aminoácidos alvo da ADNase I nativa ou variante com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais de aminoácidos seleccionados ou com resíduos N-terminal ou C-terminal. Os agentes e métodos de derivatização adequados são bem conhecidos na especialidade.

Em particular, os resíduos que podem ser derivatizados incluem resíduos cisteinilo (mais usualmente por reacção com haloacetatos), resíduos histidilo (por reacção com dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0), resíduos lisinilo e amino-terminais (por reacção com anidrido succínico ou outros anidridos de ácido carboxílico), resíduos arginilo (por reacção com reagentes tais como fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclo-hexanodiona e ninidrina). Os grupos laterais carboxilo (aspartilo ou glutamilo) podem ser modificados selectivamente por reacção com carbodiimidas ou podem ser convertidos a resíduos asparaginilo e glutaminilo por reacção com iões amónio. A ligação covalente a agentes tais como polietilenoglicol (PEG) ou albumina de soro humana a ADNases I pode reduzir a sua imunogenicidade e/ou toxicidade da variante e/ou prolongar a sua semivida e portanto pode ser usada no invento. A ADNase I pode ser conjugada directamente ao glicosaminoglicano ou ligada através de uma molécula intermediária.

Glicosaminogli canos

Os medicamentos e usos do invento utilizam glicosaminoglicanos tal como descrito nas reivindicações 1-21. Os glicosaminoglicanos são heteropolissacáridos lineares possuindo sequências de repetição de dissacáridos características que são tipicamente altamente sulfatadas em N e em O nos resíduos D-glucosamina, galactosamina e ácido 17 ΕΡ 1 549 337/PT urónico. Estas partes de sulfato introduzem um elevado grau de carga negativa ao longo da cadeia de polímero glicosaminoglicano e aumentam a heterogeneidade destas macromoléculas.

Pode usar-se no invento qualquer glicosaminoglicano adequado, tal como reivindicado. De preferência, o glicosaminoglicano estará numa forma adequada para administração intranasal, através de inalação e/ou via instilação, tal como tipicamente serão administrados por essas vias os medicamentos do invento. Os glicosaminoglicanos e sais de glicosaminoglicano adequados para uso no presente invento terão um peso molecular médio de 8 a 40 kd, preferentemente de 10 a 30 kd, com maior preferência de 12 a 20 kd. Nomeadamente, o glicosaminoglicano ou sal pode ter um peso molecular médio de 14 a 18 kd, preferentemente de 15 a 17 kd e com maior preferência de 16 a 17 kd. Em alguns casos todas ou substancialmente todas as moléculas de glicosaminoglicano ou de sal de glicosaminoglicano terão um peso molecular dentro das gamas especificadas anteriormente. Assim de 50 a 100%, preferentemente de 75 a 100%, com maior preferência de 90 a 100%, ainda com maior preferência de 95 a 100% das moléculas podem ter tal peso molecular. Em alguns casos pelo menos 95%, preferentemente 97,5%, com maior preferência 99%, ainda com maior preferência 99,5% e ainda com maior preferência 99,9% podem ter um peso molecular dentro da gama. O glicosaminoglicano ou sal aqui descrito pode estar presente numa gama de tamanhos de peso molecular e tipicamente a maioria ocorre num tamanho de peso molecular dentro de uma das gamas de peso molecular especificadas anteriormente.

Preferentemente, o glicosaminoglicano usado no invento será qualquer sulfato de condroitinas A a E, heparina, sulfato de heparina, heparano, sulfato de heparano, ácido hialurónico, sulfato de queratano, ou uma mistura de quaisquer dois desses. O sulfato de condroitina B é por vezes denominado sulfato de dermatano. Numa concretização do invento mais preferida o glicosaminoglicano será qualquer de sulfato de condroitinas A, C, D ou E, heparina, sulfato de heparina, heparano, sulfato de heparano, ácido hialurónico, sulfato de queratano ou uma mistura de quaisquer dois desses. Numa concretização particularmente preferida o glicosaminoglicano será sulfato de condroitina A, sulfato de condroitina C, heparina, sulfato de heparina, 18 ΕΡ 1 549 337/ΡΤ heparano, sulfato de heparano ou uma mistura de quaisquer dois desses. Com maior preferência, o glicosaminoglicano será sulfato de condroitina A, sulfato de condroitina C, heparina ou uma mistura de quaisquer dois desses. Numa concretização ainda mais preferida do invento o glicoaminoglicano será heparina. Em algumas concretizações do invento o glicosaminoglicano usado será uma mistura de mais de dois glicosaminoglicanos de um dos grupos mencionados anteriormente, tal como uma mistura de três, quatro ou cinco dos glicosaminoglicanos.

Em concretizações do invento em que se usa uma mistura de dois glicosaminoglicanos, os dois podem estar presentes, por exemplo, na razão 1:1, 1:2, 1:4, 1:10 ou 1:100. A razão pode ser 90:10, 80:20, 70:30 ou 60:40. Pode usar-se qualquer razão adequada e qualquer dos glicosaminoglicanos pode estar à concentração mais elevada. A razão pode ser a mesma razão em que os dois são isolados quando são recuperados de um tecido comum usando técnicas padrão. Numa concretização preferida do invento será usada uma mistura de condroitinas A e C e em particular numa razão de 80:20, preferentemente 75:25 e ainda com maior preferência 70:30 com sulfato de condroitina A estando presente ao nivel mais elevado.

Tipicamente, o glicosaminoglicano não terá sido sujeito a fragmentação para reduzir o seu peso molecular. Usualmente, o glicosaminoglicano não terá sido sujeito a despolimerização, tal como por meios químicos ou enzimáticos, para reduzir o seu peso molecular. O número médio de unidades de sacarídeo nas cadeias de polissacárido do glicosaminoglicano podem ser tipicamente de 18 a 100, preferentemente de 30 a 80, com maior preferência de 40 a 60 e ainda com maior preferência de 5 a 60 unidades. O glicosaminoglicano pode ser qualquer glicosaminoglicano adequado disponível comercialmente e pode, por exemplo, ser um glicosaminoglicano não fraccionado. O glicosaminoglicano será tipicamente isolado de fontes naturais, tal como de um animal. Em alguns casos, o glicosaminoglicano pode ter sido sintetizado em vez de ser uma molécula de ocorrência natural.

Em alguns casos o glicosaminoglicano pode ter sido isolado de um animal e em particular de tecidos animais, tais como os 19 ΕΡ 1 549 337/PT de porcos ou gado. 0 glicosaminoglicano pode ter sido obtido de tecidos tais como pulmão, fígado ou intestino de um animal e em particular de pulmão bovino ou mucosa intestinal de porco. 0 glicosaminoglicano pode ter sido obtido da pele de tal organismo. 0 glicosaminoglicano pode ter sido isolado de um peixe cartilaginoso ou outro organismo marinho ou de água doce. Em alguns casos o glicosaminoglicano pode ter sido isolado de um tubarão ou lula e em particular da cartilagem de tal organismo. 0 glicosaminoglicano pode ter sido isolado de um esturjão e em particular de um notocórdio de esturjão.

Um dos glicosaminoglicanos específicos mencionado anteriormente pode ter sido modificado para gerar um derivado do glicosaminoglicano. Tais derivados podem ser usados no invento desde que mantenham a capacidade de aumentar a actividade de ADNase I. Assim na presença do derivado, uma determinada quantidade molar de ADNase I apresentará um maior nível de actividade do que na ausência do derivado. Assim no caso de heparina, a heparina pode ter sido sujeita a dessulfatação em 0, tal como pelo menos nas posições 2-0 e 3-0. Podem fazer-se modificações iguais ou equivalentes a outros glicosaminoglicanos para gerar derivados para uso no presente invento. 0 glicosaminoglicano pode ter sido sujeito a acetilação, desacetilação, oxidação e/ou descarboxilação tal como, por exemplo, oxidação com periodato para gerar um derivado. Podem usar-se heparinóides no invento.

Descreve-se aqui um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável compreendendo unidades dissacárido repetidas com a fórmula geral (1): -[A-B]- (1) em que: cada A é igual ou diferente e representa uma parte de fórmula (i) ou (ii) 20

ΕΡ 1 549 337/PT ψ ?1

em que : - um de Ri e R2 é hidrogénio e o outro é -CO2H, -SO3H ou -CH2OR em que R é hidrogénio ou -SO3H; - um de R3 e R4 é hidrogénio e o outro é -OR em que R é hidrogénio ou -SO3H; - um de R5 e Rè é hidrogénio e o outro é -OH; - * representa uma ligação directa a um átomo de hidrogénio ou parte B adjacente; e - ** representa uma ligação directa a uma parte B adjacente; cada B é igual ou diferente e representa uma parte de fórmula (iii) ou (iv); $7 &7

R12 Rio 1 Rio em que: - um de R7 e Rs é hidrogénio e o outro é -CH2OH ou -CH2OSO3H; - um de R9 e Rio é hidrogénio e o outro é -NHAc, -NH2 ou -NHSO3H; um de Rn e R12 é hidrogénio e o outro é -OH ou -OSO3H; 21

ΕΡ 1 549 337/PT - * representa uma ligação directa a um átomo de hidrogénio ou a uma parte A adjacente; e - ** representa uma ligação directa a uma parte A adjacente; e indica uma ligação em qualquer orientação estereoquímica ou um seu sal fisiologicamente aceitável.

As fórmulas aqui adoptam a prática padrão de representação de açúcares. De acordo com esta prática, as fórmulas incluem linhas verticais através de cada um dos átomos de carbono do ciclo. Tal não significa obviamente que se encontram ligados grupos metilo em cada uma das posições ou que se encontram presentes grupos metileno como parte da ligação entre partes cíclicas adjacentes.

De preferência, cada parte A no glicosaminoglicano de fórmula geral (1) é igual. Preferentemente, cada parte B no glicosaminoglicano de fórmula geral (1) é igual.

Preferentemente, cada parte A no glicosaminoglicano de fórmula geral (1) é uma parte de fórmula geral (i).

Tipicamente, um de Ri e R2 é hidrogénio e o outro representa -CO2H ou -CH2OR, em que R é hidrogénio ou -SO3H. Preferentemente, um de Ri e R2 é hidrogénio e o outro representa -CO2H.

Tipicamente, R3 é hidrogénio e R< é -0R, em que R representa hidrogénio ou -SO3H.

Tipicamente R5 é -OH e Rô é hidrogénio.

Tipicamente cada A é igual ou diferente e representa uma parte de fórmula (i).

Tipicamente R7 é -CH2OH ou -CH2OSO3H e Re é hidrogénio.

Tipicamente R9 é hidrogénio e Rio é -NHAc, -NH2 ou -NHSO3H.

Tipicamente Rn é -OSO3H ou -OH e R12 é hidrogénio. 22

ΕΡ 1 549 337/PT

Tipicamente cada B é igual ou diferente e representa R.7 R7

Rio R 12 Rio em que R7, Rs, R9, Rio, Rn, R12 * e ** são como descrito anteriormente.

Preferentemente Ri não é hidrogénio numa parte A que é adjacente a uma parte (iv) no qual R12 é hidrogénio.

Tipicamente o glicosaminoglicano de fórmula geral (1) é um glicosaminoglicano de fórmula geral (2)

em que: - um de Ri e R2 é hidrogénio e o outro é -CO2H; - R4 é -OH ou -OSO3H; - Rs é -OH; - R7 é -CH2OH ou -CH2OSO3H; - Rio é -NH2, -NHSO3H ou -NHAc; e

Rn é -OSO3H ou -OH. 23

ΕΡ 1 549 337/PT

Tipicamente o glicosaminoglicano de fórmula geral (1) é um glicosaminoglicano de fórmula geral (3)

em que: - Ri é -C02H; - R4 é -OH; - Rs é -OH; - R7 é -CH2OH ou -CH2OSO3H; - Rio é -NHAc; e - Rn é -OH ou -OSO3H.

Pode usar-se qualquer sal de glicosaminoglicano fisiologicamente aceitável e em particular um sal de metal, por exemplo um sal de sódio, um sal de metal alcalino ou um sal de metal alcalino-terroso. Outros sais incluem sais de cálcio, litio e zinco. Também se podem usar sais de amónio. 0 sal pode ser um glicosaminoglicanato de sódio ou sulfato de glicosaminoglicano. Podem também ser usados no invento sais de derivados de glicosaminoglicanos específicos aqui mencionados. No presente pedido quando se menciona glicosaminoglicano, também se incluem os seus sais fisiologicamente aceitáveis.

Tipicamente um sal fisiologicamente aceitável é um sal com um ácido ou base fisiologicamente aceitável. Os sais preferidos são sais com bases fisiologicamente aceitáveis. Tipicamente, tais sais são compostos em que o átomo de hidrogénio ácido de 24 ΕΡ 1 549 337/PT um grupo -CO2H e/ou -OSO3H é substituído por um catião, por exemplo um catião de metal alcalino (e.g. sódio ou potássio) ou metal alcalino-terroso (e.g. cálcio ou magnésio). Tais sais podem ser preparados, por exemplo, por reacção com um hidróxido adequado. 0 número de unidades de dissacárido presentes no glicosaminoglicano ou seu sal usado no invento será tal que o peso molecular do glicosaminoglicano ou sal é de 8 a 40 kd, preferentemente de 10 a 30 kd, com maior preferência de 12 a 20 kd. Nomeadamente, pode ser tal que o glicosaminoglicano tem um peso molecular de 14 a 18 kd, preferentemente de 15 a 17 kd e com maior preferência de 16 a 17 kd. O número de unidades de dissacárido presentes no glicosaminoglicano pode ser representado pelo número n, em que n é qualquer número inteiro de modo que o glicosaminoglicano tenha um peso molecular dentro de qualquer das gamas de peso molecular mencionadas anteriormente.

Assim o glicosaminoglicano ou sal usado pode ser representado pela fórmula geral:

H-[A-B]n-H em que -A-B é qualquer dos dissacáridos mencionados anteriormente e n é um número inteiro de modo a que o glicosaminoglicano ou seu sal tenha um peso molecular dentro das gamas de peso molecular mencionadas anteriormente. O valor de n pode ser, por exemplo, de 30 a 55 e com maior preferência de 35 a 50. O glicosaminoglicano usado no invento compreenderá tipicamente mais do que um comprimento de cadeia. Assim n para algumas das cadeias de glicosaminoglicano presentes pode ser um número inteiro menor ou maior do que um número inteiro que, por si só, daria uma cadeia com tamanho de peso molecular dentro de qualquer das gamas especificadas anteriormente. Assim o valor médio de n dos glicosaminoglicanos presentes nos medicamentos do invento pode ser qualquer dos valores aqui especificados para n e em particular um valor de n que origina glicosaminoglicano ou sal com um peso molecular dentro de uma das gamas de peso molecular aqui especificadas. 25

ΕΡ 1 549 337/PT

Os sais particularmente preferidos para uso no invento são sais de fórmula: Η-[A-B]nx-H Mx+ em que x<4n e M representa um catião fisiologicamente aceitável ou uma sua mistura. Com a maior preferência x<2n.

Numa concretização do invento particularmente preferida o glicosaminoglicano usado será uma heparina ou um seu sal fisiologicamente aceitável. A heparina é um mucopolissacárido de ocorrência natural presente numa variedade de órgãos e tecidos, particularmente fígado, pulmão e grandes artérias. A heparina é um polímero de resíduos alternados de -D-glucosamina e hexuronato ligados por ligações glicosídicas (1,4) . Quando os glicosaminoglicanos são sintetizados na natureza, tipicamente são conjugados a um núcleo central de proteína. No entanto, preferentemente os glicosaminoglicanos aqui descritos não têm tal núcleo central. Tipicamente, as preparações de glicosaminoglicano não terão um núcleo e podem ser usadas ou, caso estejam presentes, o núcleo pode ser removido. As preparações de glicosaminoglicanos comercialmente disponíveis não terão usualmente o núcleo e podem ser usadas. A heparina é usada clinicamente como um anticoagulante, em que se pensa que exerce os seus efeitos através de interacção com anti-trombina III (AT-III) e cofactor II de heparina e outros factores de coagulação. Tipicamente a heparina manterá alguma actividade anticoagulante i.e. será capaz de aumentar o tempo de coagulação num indivíduo. Assim preferentemente a heparina será capaz de ligar anti-trombina III (AT-III) e/ou cofactor II de heparina (HCII) e portanto inibir coagulação. Preferentemente será capaz de formar um complexo com AT-III, trombina e um factor de coagulação. Também se pode usar uma heparina isenta de actividade anticoagulante ou com actividade anticoagulante reduzida. Assim a heparina pode ter sido modificada para ter de 0 a 80%, preferentemente de 5 a 60%, com maior preferência de 10 a 40% e ainda com maior preferência de 10 a 30% da actividade da forma não modificada ou em comparação com heparina não modificada. Outros glicosaminoglicanos, em particular sulfato de dermatano, também têm actividade 26

ΕΡ 1 549 337/PT anticoagulante. Assim, preferentemente os glicosaminoglicanos e seus derivados usados manterão alguma actividade anticoagulante, tal como discutido anteriormente para heparina.

Indivíduos a ser tratados 0 indivíduo a ser tratado terá uma doença ou condição caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno tal como reivindicado. Ou seja, existirá ADN extracelular presente originário das células do corpo do indivíduo. Nomeadamente, a doença ou condição é: (a) uma doença respiratória caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno no pulmão; (b) seleccionada de fibrose cística, limitação crónica do fluxo aéreo e pneumonia; (c) lúpus eritematoso sistémico (LES); ou (d) uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno num local inflamatório.

Tipicamente o ADN estará presente numa das soluções ou excreções extracelulares do corpo. Assim, em concretizações preferidas o ADN pode estar presente no pulmão incluindo as suas vias aéreas. Tipicamente este ADN será originário do núcleo e portanto será ADN genómico. 0 ADN extracelular terá tipicamente elevado peso molecular. Assim pode ter, por exemplo, um tamanho de fragmento médio, gama de tamanhos de fragmentos ou tamanho de fragmento predominante na gama de 100 bases a 1 megabases, preferentemente de 1 kb a 500 kb, com maior preferência de 5 kb a 250 kb de comprimento, ainda com maior preferência de 25 kb a 100 kb e ainda com maior preferência de 25 kb a 50 kb de comprimento. Em concretizações do invento em que a doença a ser tratada é uma doença auto-imune tal como LES, o ADN pode ter um comprimento mais curto ou pode estar nas gamas especificadas anteriormente. O ADN será tipicamente total ou parcialmente isento de histonas ou compreenderá regiões isentas de histonas. Pode estar ligado a factores catiónicos ou factores com grupos catiónicos, tais como mediadores inflamatórios e/ou protéases. Assim, por exemplo, pode estar complexado ou associado a elastase, catepsinas e/ou IL-8. 27 ΕΡ 1 549 337/ΡΤ A presença do ADN tipicamente aumentará a viscosidade da solução ou liquido em que está presente. Em particular, tal será o caso em que o indivíduo sofre de uma doença respiratória em que tipicamente a presença do ADN aumentará a viscosidade do muco ou outras excreções pulmonares. Também pode ser o caso em que o objectivo é tratar ou auxiliar a resolver um local inflamatório e em particular um local inflamatório fechado em que se encontra presente ADN extracelular.

Tipicamente, a presença de ADN pode aumentar a viscosidade da solução em que está presente de 10 a 5000%, preferentemente de 50 a 2500%, com maior preferência de 100 a 1000%, ainda com maior preferência de 200 a 800% e ainda com maior preferência de 400 a 600%. A viscosidade da solução pode ser tipicamente duplicada, triplicada, quadruplicada ou aumentada cinco ou mais vezes comparativamente à viscosidade da solução na ausência do ADN. Tipicamente a viscosidade do ADN será tal que pode compreender tal função no indivíduo tal como, por exemplo, função pulmonar. Pode causar limitação do fluxo aéreo e/ou promover a ocorrência de infecções.

Numa concretização do invento o indivíduo pode sofrer de inflamação e em particular inflamação em que há ADN extracelular no local da inflamação. Em particular, o local de inflamação principal pode estar fechado parcial ou totalmente. O local pode conter ou produzir elevadas quantidades de pus ou outro material inflamatório. Os exemplos de condições incluem abcessos, meningite, peritonite, sinusite, otite, periodontite, pericardite, pancreatite, colelitíase, endocardite e artrite séptica. O indivíduo pode ter lesões inflamatórias e infectadas, tais como lesões infectadas da pele e/ou membranas mucosas, feridas cirúrgicas, lesões ulcerativas e queimaduras. A presença do ADN pode aumentar a viscosidade de soluções no local da inflamação e pode retardar ou prevenir a resolução da inflamação. Pode também causar dificuldades mecânicas, tal como por exemplo quando o local de inflamação fechado é uma articulação ou numa articulação, o seu funcionamento pode ficar prejudicado. Assim, pode ser mais difícil a flexão ou manipulação. O indivíduo pode ter uma doença auto-imune, tal como uma doença caracterizada pela produção de uma resposta imunitária contra ADN e em particular anticorpos contra ADN. 28

ΕΡ 1 549 337/PT

Numa concretização preferida o indivíduo pode ter ou pode estar em risco de desenvolver lúpus eritematoso sistémico (LES).

Numa concretização do invento particularmente preferida o indivíduo sofrerá de uma doença respiratória e em particular uma doença em que a viscosidade do muco ou de outras excreções pulmonares se encontre aumentada devido à presença de ADN. Um indivíduo aqui descrito pode ter, por exemplo, doença pulmonar dos brônquios aguda ou crónica, tal como pneumonia infecciosa, bronquite ou traqueobronquite, bronquiectasia, fibrose cística, asma, tuberculose e/ou infecções fúngicas. 0 indivíduo pode ter uma infecção do tracto respiratório. 0 indivíduo pode ter sinusite, congestão dos seios nasais ou infecções víricas que infectam o sistema respiratório, tal como constipação ou gripe. Numa concretização do invento particularmente preferida o indivíduo terá fibrose cística. 0 indivíduo pode ter pneumonia.

As doenças a serem tratadas são as descritas nas reivindicações 1-21 e envolverão tipicamente infiltração de células inflamatórias no local de inflamação e em particular no sistema respiratório. Estas células podem ser macrófagos, granulócitos, linfócitos ou outros leucócitos. Podem ser células T ou células B. Os granulócitos podem ser eosinófilos, basófilos ou neutrófilos e em particular serão neutrófilos. 0 número de células inflamatórias presentes no local, e em particular neutrófilos, pode tipicamente ser aumentado de 1 a 10000 vezes, preferentemente de 10 a 5000 vezes, com maior preferência de 20 a 1000 vezes, ainda com maior preferência de 50 a 500 vezes e ainda com maior preferência de 100 a 200 vezes. A proporção e número de determinado tipo de leucócitos pode ser determinado por técnicas de coloração padrão bem conhecidas na especialidade. Tipicamente, grande parte das células inflamatórias infiltradas sofre necrose ou lise, libertando ADN genómico para o muco do indivíduo. Assim o número e/ou proporção de células necróticas pode ser aumentado tipicamente de 10 a 5000 vezes, com maior preferência de 50 a 2000 vezes, ainda com maior preferência de 100 a 1000 vezes e com a maior preferência de 200 a 600 vezes. Nomeadamente as células de infiltração necróticas principalmente responsáveis pela libertação de ADN genómico para o muco serão granulócitos e especialmente neutrófilos. 29

ΕΡ 1 549 337/PT Ο ADN genómico das células inflamatórias pode estar predominantemente sob a forma de cadeias longas de ADN genómico viscoso. A necrose destas células pode também ser acompanhada pela libertação de outras proteínas das células inflamatórias, tais como mediadores de inflamação e proteínas antibacterianas, tais como protéases tal como elastase de neutrófilo e/ou catepsinas. Além do ADN genómico, podem também estar presentes outros polímeros no muco contribuindo adicionalmente para a sua viscosidade. Em muitos casos podem também estar presentes polímeros de actina contribuindo adicionalmente para a viscosidade.

Um factor contribuinte para a migração de células inflamatórias para os pulmões pode ser a presença de patogénios, irritantes, alergénios ou poluentes no pulmão. Por exemplo e particularmente em fibrose cística, o indivíduo pode ter infecções tais como infecções por Pseudomonas, Pneumococcus, Staphylococcus, Burkholderia, Haemophilus e/ou Aspergillus e em particular pode apresentar infecção por Haemophilus influenzae, Staphylcoccus aureus, Pseudomonas aeruginosa e/ou Burkholderia cepacia. Estas infecções podem ser a longo prazo, podem ocorrer periodicamente ou ser recentes. Podem ser agudas ou crónicas. Em certos casos o patogénio apresentará resistência a antibiótico devido a exposição prolongada a antibióticos durante o tratamento.

Os indivíduos podem adicional ou alternativamente ter uma história de exposição a poluentes, tal como fumo de tabaco, ou alergénios, tal como pólen, e estes podem contribuir para o influxo de células inflamatórias para o pulmão. A presença de patogénio, alergénios e/ou poluentes pode também promover a necrose de células inflamatórias em vez da sua eliminação através de processos tais como apoptose em que se pensa que o ADN genómico não é libertado para os pulmões em quantidades substanciais. 0 indivíduo pode ter uma história de exposição a poluentes e/ou produtos químicos e em particular os que têm uma forma inalável. Nomeadamente, o indivíduo pode ser fumador ou ex-fumador de tabaco. Tipicamente, o indivíduo pode ser ou ter sido um fumador compulsivo, fumando de 10 a 100, preferentemente 30 ΕΡ 1 549 337/ΡΤ de 20 a 60, com maior preferência de 25 a 50 e ainda com maior preferência de 30 a 40 cigarros por dia. O indivíduo pode tê-lo feito durante vários anos tais como de 5 a 50, preferentemente de 10 a 40, com maior preferência de 15 a 30 e ainda com maior preferência de 20 a 25 anos. O indivíduo pode ter sido ou ser um fumador de cachimbo ou charutos. O indivíduo pode ter mascado tabaco ou produtos contendo tabaco. Em alguns casos o indivíduo pode ter sido exposto passivamente a fumo de tabaco, sem ser ele próprio fumador de tabaco. Assim o indivíduo pode, por exemplo, ter sido exposto cumulativa e passivamente a fumo de tabaco por longos períodos no seu ambiente de trabalho, tempo livre e/ou em casa. O indivíduo pode usar narcóticos inalados tais como, por exemplo, marijuana ou outros narcóticos que são tipicamente misturados com tabaco antes de fumar. O indivíduo pode adicional ou alternativamente ter sido exposto a outros produtos químicos ou poluentes ambientais. Assim o indivíduo pode trabalhar ou ter trabalhado numa ambiente que o expõe a produtos químicos e/ou poluentes. Assim, por exemplo, o indivíduo pode ser um trabalhador fabril ou mineiro tal como mineiro de carvão. O indivíduo pode trabalhar na indústria de construção. O indivíduo pode ter sido exposto a elevados níveis de poluição, tais como emissões de escape de veículos ou outras máquinas. O indivíduo pode ter sido exposto a "smog" ou emissões contendo dióxido de enxofre. O indivíduo pode ter uma predisposição genética para desenvolver uma doença e em particular uma doença respiratória.

Numa das concretizações preferidas do invento o indivíduo terá uma limitação crónica do fluxo aéreo (CAL). Numa concretização do invento o indivíduo pode ter limitação crónica do fluxo aéreo (CAL). CAL é um condição clínica caracterizada por limitação do fluxo aéreo que não é completamente reversível. A limitação do fluxo aéreo é usualmente progressiva e associada a resposta inflamatória anómala dos pulmões a partículas ou gases nocivos. Nomeadamente CAL está associado a tabagismo, embora não exclusivamente. CAL pode ser definido como uma condição em que há um declínio progressivo da função pulmonar, em que o indivíduo afectado tem um FEVi inferior a 80% do previsto para um indivíduo 31 ΕΡ 1 549 337/ΡΤ da sua idade/raça e/ou altura e/ou apresenta uma razão FEVi/FVC inferior a 70%. Numa concretização especialmente preferida, o indivíduo a ser tratado com CAL terá um FEVi inferior a 75% do previsto. Tipicamente a redução de FEVi é apenas parcialmente reversível. Nomeadamente a redução de FEVi é apenas parcialmente reversível por tratamento com broncodilatadores tais como, por exemplo, agonistas adrenérgicos ê em particular salbutamol. O FEVi de um indivíduo com CAL pode ser de 10 a 80% do previsto. Tipicamente, o FEVi do indivíduo será de 10 a 75% do valor previsto. Preferentemente o indivíduo pode ter um FEVi de 60 a 75% do valor previsto, com maior preferência de 40 a 60% do previsto e ainda com maior preferência um valor inferior a 40% do previsto. O indivíduo com CAL pode ter um FEVi inferior a 70%, preferentemente inferior a 60%, com maior preferência inferior a 50% e ainda com maior preferência inferior a 40% do previsto. O valor de FEVi para o indivíduo será normalmente medido relativamente a valores previstos e ajustado para idade/sexo/raça e/ou altura. Os valores previstos podem ser os obtidos de Coates (seguidamente). O valor esperado, com o qual se pode comparar o valor obtido para o indivíduo com CAL, pode ser o valor esperado médio para fumadores ou não fumadores ou uma combinação de ambos os grupos, preferentemente o valor esperado será o de não fumadores que não sofrem de CAL (Coates, seguidamente). A diminuição de FEVi no indivíduo com CAL será apenas parcialmente reversível, em particular será apenas parcialmente reversível por administração de um broncodilatador. Assim, por exemplo, um aumento de FEVi relativamente ao valor basal do indivíduo (i.e. o valor antes da administração do broncodilatador) maior do que 15%, preferentemente maior do que 20% e ainda com maior preferência maior do que 25% será interpretado como reversibilidade. O aumento pode iniciar de 5 a 30, preferentemente de 10 a 25, com maior preferência ao longo de um período de 15 a 20 minutos após a administração do broncodilatador. Preferentemente o aumento iniciará 15 minutos após a administração do broncodilatador. Os aumentos tipicamente persistem de 3 a 6 horas, preferentemente de 4 a 5 horas e com maior preferência 4 horas. Tipicamente o broncodilatador usado para avaliar reversibilidade será um

agonista adrenérgico 2 tal como salbutamol ou ipratrópio. A 32

ΕΡ 1 549 337/PT redução de FEVi pode ser totalmente ou praticamente totalmente refractária ao tratamento com broncodilatadores. 0 indivíduo com CAL pode também apresentar aumentos mínimos semelhantes de FEVi com fármacos esteróides tais como Becotide™ ou Prednisolona™ embora tipicamente não se use a resposta a tais agentes para definir reversibilidade. Os aumentos também ocorrerão ao longo de um período de tempo maior, tal como após 2 a 3 dias e caso se administrem continuamente fármacos esteróides, persistem. Caso se parem os esteróides a melhoria pode persistir de 12 a 48 horas ou durante dias, semanas ou mesmo meses, tais como de seis horas a seis semanas, preferentemente de 1 dia a 3 semanas.

Os ensaios para avaliar a reversibilidade de redução de FEVi serão tipicamente efectuados quando o indivíduo estiver clinicamente estável e livre de infecção. 0 indivíduo não deve ter tomado ou não se lhe deve ter administrado broncodilatadores de inalação de acção rápida nas seis horas anteriores, agonistas de ção prolongada nas 12 horas anteriores ou teofilinas de libertação controlada nas 24 horas anteriores.

No diagnóstico de CAL os valores espirométricos devem ser tipicamente medidos antes e após a administração de uma dose adequada de broncodilatador de inalação ao indivíduo. A dose deve ser preferentemente seleccionada para estar elevada na curva dose/resposta e usualmente será administrada com um nebulizador de modo a garantir que foi inalada. Pode administrar-se uma dose semelhante em múltiplas inalações com um inalador com doseador e espaçador de volume grande, mas tal é menos preferido. Um protocolo de dosagem/medições típico para um indivíduo humano seria: - antes e 15 minutos depois de 2,5 a 5 mg de salbutamol ou 5 a 10 mg terbutalina nebulizados; - antes e 30 minutos depois de 500 pg de brometo de ipratrópio nebulizado; ou antes e 30 minutos depois de combinação de ambos. 33 ΕΡ 1 549 337/ΡΤ

Podem usar-se protocolos equivalentes para indivíduos não humanos. 0 FVC do indivíduo pode também ser medido no diagnóstico de CAL. Pode usar-se a razão entre FEVi e FVC no diagnóstico de CAL. Os indivíduos a serem tratados que têm CAL terão tipicamente um valor de FEVi/FVC inferior a 70%. A razão FEVi/FVC pode ser inferior a 65%, preferentemente inferior a 60%, com maior preferência inferior a 55% e ainda com maior preferência inferior a 55%. Um indivíduo aqui descrito pode ter um FEVi/FVC inferior a 70% e pode também ter um valor de FEVi de 80% ou menos do previsto. FVC (capacidade vital forçada) corresponde ao volume máximo de ar expirado com esforço do ponto de inalação máxima e pode ser medido por espirometria padrão. Nomeadamente, os valores especificados anteriormente para FEVi/FVC serão os valores após administração de um broncodilatador tal como resumido anteriormente. A diminuição de FEVi/FVC mostrará tipicamente a mesma falta de reversibilidade de FEVi em indivíduos com CAL. A avaliação espirométrica é o método mais preferido para diagnosticar CAL e portanto o método para identificação de indivíduos que podem ser tratados. Assim, numa concretização preferida do invento usar-se-á avaliação espirométrica no diagnóstico de um indivíduo com CAL e que portanto é tratável usando o invento. Adicionalmente, os sintomas apresentados pelo indivíduo podem também ser avaliados para auxiliar na confirmação de um diagnóstico de CAL. Tipicamente o diagnóstico envolverá avaliação espirométrica em combinação com avaliação dos sintomas de um indivíduo, bem como elucidação da existência de história de exposição do indivíduo a factores de risco. Em algumas situações pode não ser possível avaliação espirométrica, particularmente em situações de recursos limitados, e CAL será diagnosticado por meios alternativos, tal como por busca de sintomas CAL aqui listados e uma história de exposição a factores de risco para CAL. Embora a radiografia do tórax não seja tipicamente indicativa da existência ou não de CAL num indivíduo, pode ser usada para diagnosticar outras doenças respiratórias, tal como tuberculose, e portanto excluir CAL. 34

ΕΡ 1 549 337/PT Ο indivíduo com CAL apresentará ou apresentou anteriormente, uma velocidade acelerada de declínio da função pulmonar comparativamente com a média esperada para um indivíduo equivalente que não sofra de CAL e em particular para um indivíduo equivalente que não seja fumador. 0 indivíduo pode apresentar respiração ofegante em particular tanto após como durante exercício físico. Tipicamente tal não será induzido por exposição a um alergénio. 0 indivíduo pode também apresentar aumento de incidência de infecção bacteriana ou vírica e tal pode exacerbar a doença. 0 indivíduo com CAL pode apresentar uma taxa de diminuição de FEVi que é uma, duas, três, quatro ou mais vezes superior ao valor médio anual esperado para um indivíduo equivalente que não sofra de CAL. Por exemplo, um indivíduo em trinta pode apresentar uma redução anual entre 50 e 100, preferentemente entre 50 e 80 e com maior preferência entre 60 e 70 ml FEVi/ano comparativamente com uma redução desde entre 10 e 40 e tipicamente de 20 a 40 ml de FEVi/ano no não fumador equivalente. Estes valores podem também aplicar-se a doentes de CAL que não sejam fumadores tal como aqueles nos quais a doença é causada por poluentes.

Os indivíduos com CAL podem apresentar uma ou mais e algumas vezes todas as situações de tosse, aumento da produção de expectoração, dispneia e/ou uma história de exposição a factores de risco para a doença. No caso de tosse, aumento de expectoração e dispneia estes podem ter estado presentes durante períodos de tempo longos tal como pelo menos um mês, preferentemente seis meses, com maior preferência pelo menos um ano e ainda com maior preferência pelo menos dois anos. A tosse e produção de expectoração crónicas muitas vezes precedem o desenvolvimento de CAL e podem ser indicadores de indivíduos para os quais o invento pode ser utilizado profilacticamente para evitar o desenvolvimento de CAL.

Os indivíduos com CAL podem ter uma história de exposição a poluentes, incluindo qualquer um dos aqui mencionados e qualquer dos níveis aqui especificados. Nomeadamente, o indivíduo com CAL terá uma história de exposição a tabaco e/ou poluentes industriais. 35

ΕΡ 1 549 337/PT Ο indivíduo com CAL será tipicamente um adulto maduro. Por exemplo, o indivíduo pode ter entre 21 e 85, preferentemente entre 25 e 70, com maior preferência entre 30 e 60 e ainda com maior preferência entre 40 e 50 anos de idade. O início de qualquer dos sintomas ou de um sintoma específico aqui mencionado em associação com CAL, terá ocorrido tipicamente na idade adulta. Por exemplo, o indivíduo pode ter tido pelo menos 20, com maior preferência pelo menos 25, ainda com maior preferência pelo menos 30 e ainda com maior preferência pelo menos 35 anos de idade antes de ter experienciado um sintoma específico. Nomeadamente, os sintomas associados com estágios mais avançados de CAL, tal como qualquer dos aqui mencionados, pode ter o seu início nessas etapas tardias da vida. Os indivíduos com uma predisposição genética para desenvolver CAL, tal como aqueles com deficiência em ι-antitripsina, podem desenvolver CAL mais cedo. Por exemplo, podem apresentar um ou mais sintomas ou um sintoma específico entre 10 e 21, preferentemente entre 12 e 18 ou com maior preferência entre 14 e 16 anos de idade. Alternativamente, podem apresentar primeiramente o sintoma em qualquer das gamas de idades aqui mencionadas. O indivíduo pode ter sido diagnosticado em qualquer idade ou em qualquer das gamas de idades aqui especificadas. Estas gamas podem também aplicar-se a qualquer doença que o indivíduo possa ter e em particular às aqui mencionadas. O indivíduo pode ter uma predisposição genética para desenvolver CAL e pode apresentar uma história familiar da doença. Por exemplo, o indivíduo pode ter deficiência em i-antitripsina e portanto apresentar predisposição para desenvolver CAL. Os indivíduos em risco de desenvolver CAL podem ter tido baixos pesos à nascença e/ou uma história de exposição a poluentes no útero ou nos primeiros anos de vida. A mãe do indivíduo pode ser uma fumadora e pode ter continuado a fumar durante a gravidez. O indivíduo pode ter tido uma história de infecção respiratória grave na infância. A redução da função pulmonar máxima atingida, tal como medida por espirometria, pode identificar indivíduos que apresentam risco aumentado de desenvolver CAL. O indivíduo pode ter uma estágio precoce de CAL no qual os sintomas são geralmente moderados e pode apresentar períodos de normalidade ou pelo menos de redução de sintomas. 36

ΕΡ 1 549 337/PT

Alternativamente, o indivíduo pode estar num estágio mais avançado de CAL no qual os sintomas e em particular a redução de FEVi são mais pronunciados. Preferentemente, usam-se ou administram-se os métodos e medicamentos do invento num estágio precoce de CAL de modo a estes poderem fazer parar, abrandar ou regredir o aumento da taxa da diminuição de FEVi num estágio tão precoce quanto possível. A CAL é tipicamente uma doença progressiva com a gravidade da CAL e a extensão na qual tem um impacto no indivíduo afectado aumenta ao longo do tempo. Assim pode ocorrer uma manifestação progressiva dos sintomas da doença. A tosse crónica é habitualmente o primeiro sintoma que se desenvolve. Pode inicialmente ser intermitente, mas mais tarde pode estar presente todos os dias. A tosse estará tipicamente presente ao longo do dia e não apenas à noite e de manhã. Em alguns casos, pode desenvolver-se uma grave limitação do fluxo aéreo sem a presença de tosse. Após os ataques de tosse é frequente desenvolverem-se pequenas quantidades de expectoração firme. À medida que a CAL progride o indivíduo pode experienciar dispneia. 0 inicio da dispneia será frequentemente uma das razões pela qual um indivíduo humano irá à primeira consulta médica dado que pode ser debilitante e também induzir ansiedade. À medida que a função pulmonar do indivíduo se deteriora adicionalmente, a falta de ar torna-se mais incomodativa. 0 indivíduo pode apresentar respiração asmática e aperto no peito. A dispneia pode piorar durante ou após o exercício. As infecções respiratórias podem também exacerbar a situação e provocar aumento da dispneia. Os indivíduos humanos podem indicar que a dispneia prejudica progressivamente a sua capacidade de efectuar actividade física e de se esforçarem.

Os doentes de CAL são muitas vezes separados em categorias que reflectem o estágio e gravidade da doença. Tal pode ajudar a definir as necessidades de um indivíduo específico e qual o curso de tratamento que deve ser administrado. Numa classificação (sumário executivo GOLD, anteriormente) dividem-se os indivíduos nas seguintes categorias: 37

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Categoria 0 - Em risco A função pulmonar, tal como medida por espirometria, é normal.

Sintomas crónicos (tosse, expectoração, produção)

Tipicamente os indivíduos humanos não se apercebem da função pulmonar anómala.

Categoria I: CAL fraca

Limitação moderada do fluxo aéreo. FEVi/FVC < 70% FEVi superior ou igual a 80% do previsto.

Com ou sem sintomas crónicos (tosse, expectoração, produção).

Os indivíduos humanos podem não se aperceber que a sua função pulmonar é anómala.

Categoria II: CAL moderada

Pioria das limitações de fluxo aéreo. FEVi/FVC < 70% FEVi entre 30 e 80% do previsto (a categoria pode ser subdividida em: IIA - FEVi entre 50 a 80% do previsto; e IIB -FEVi entre 30 e 50% do previsto). Com ou sem sintomas crónicos (tosse, expectoração, produção). Os sintomas podem tipicamente tornar-se mais pronunciados durante o esforço. É provável que os indivíduos humanos estejam conscientes da doença e tenham procurado conselho médico. 38

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Categoria III: CAL grave

Limitação grave do fluxo aéreo. FEVi/FVC < 70% FEVi inferior a 30% do previsto ou alternativamente FEVi inferior a 50% do previsto em conjunção com falha respiratória ou sinais clínicos de insuficiência cardíaca direita (falha respiratória: pressão parcial de oxigénio arterial (PaCh) inferior a 8,0 kPa (60 mm Hg) com ou sem pressão parcial de CO2 arterial (PaCCt) maior que 6,7 kPa (50 mm Hg) quando se respira ar ao nível do mar). O indivíduo que tem CAL a ser tratado por utilização do invento pode incluir-se numa das categorias anteriores. Nomeadamente, o indivíduo pode incluir-se nas categorias I a III, preferentemente nas categorias II a III e mesmo com maior preferência na categoria III. O invento também abrange o tratamento de indivíduos em risco de CAL (categoria 0) e num estágio precoce da doença (categoria I).

Alguns dos sintomas de CAL são apresentados por indivíduos que sofrem de outras doenças. Por exemplo, várias doenças respiratórias diferentes de CAL comprometem a função pulmonar. Contudo, essas doenças podem distinguir-se de CAL através de uma avaliação completa do indivíduo e preferentemente por aplicação das orientações disponíveis relevantes para o diagnóstico de CAL. A Sociedade Torácica Britânica publicou um conjunto de orientações (Thorax 1997, 52 (Supl. 5) : Sl-28) e numa concretização preferida um indivíduo a tratar poderá incluir-se na definição da doença proporcionada por essas orientações. Além disso, a iniciativa global para a doença pulmonar obstrutiva crónica (GOLD) publicou um sumário executivo (2001) que define uma estratégia para o diagnóstico, gestão e prevenção da doença. Os indivíduos a tratar que têm CAL incluem-se na definição da doença proporcionada pelo sumário executivo. CAL não inclui fibrose cística (CF), apesar do invento poder ser usado para tratar tanto CAL como CF. Tipicamente um indivíduo com CAL terá pelo menos uma cópia funcional do gene 39 ΕΡ 1 549 337/ΡΤ CFTR (a menos que tenha tido a pouca sorte de desenvolver tanto CF como CAL). A CAL tem tipicamente um inicio muito mais tardio do que a fibrose cística, na qual o doente já nasce com essa deficiência. Na CAL o declínio da função pulmonar e o início de sintomas ocorrerá proqressivamente ao lonqo do tempo. Na CF o declínio da função pulmonar terá um início mais imediato e mais cedo na vida. Um indivíduo com CAL terá frequentemente cerca de 30, 40 ou mesmo 50 anos de idade antes de se aperceber que sofre da doença. A excepção mais importante ao início tardio de CAL é nos doentes que têm deficiência em i anti-tripsina. Tais indivíduos apresentarão um início precoce de CAL, tal como diagnóstico de CAL na adolescência ou no início da idade adulta, já que nasceram com uma condição genética que os predispõe para CAL. Os indivíduos que têm deficiência em i anti-tripsina e CF podem ser facilmente distinguidos entre si por ensaios bioquímicos e genéticos para identificar a natureza da doença. 0 indivíduo a tratar será um vertebrado animal e preferentemente será um mamífero. Tipicamente o indivíduo será um humano. Contudo, o invento também abrange o tratamento de animais com doenças que são a mesma ou equivalente a qualquer das doenças humanas aqui mencionadas. Assim, a doença do animal pode apresentar uma patologia subjacente que é semelhante ou igual à da doença humana. O animal pode ter um ou mais sintomas ou características semelhantes à doença humana e em particular uma ou mais das anteriormente enumeradas. Preferentemente, o animal sofrerá de uma doença abrangida pela definição de qualquer das doenças anteriormente enumeradas.

Nos casos em que o indivíduo não é humano, este poderá ser um animal doméstico ou um animal com importância agrícola. O animal pode ser, por exemplo, uma ovelha, porco, vaca, boi, ave de capoeira ou outro animal de quinta comercial. Nomeadamente, o animal pode ser uma vaca ou boi e preferentemente é uma vaca leiteira. O animal pode ser um animal de companhia tal como um cão, gato, pássaro ou roedor. O animal pode ser um gato ou outro animal felino. O animal pode ser um macaco tal como um primata não humano. Por exemplo, o primata pode ser um chimpanzé, gorila ou orangotango. O animal pode ser um cavalo e por exemplo, pode ser um cavalo de corrida. O animal pode ser um animal de desporto tal como, por exemplo, um galgo. 40

ΕΡ 1 549 337/PT

Avaliação do indivíduo O presente invento proporciona medicamentos e preparações para hidrólise de ADN para uso no tratamento de doenças causadas pela presença de ADN extracelular endógeno ou por ela caracterizadas, tal como definido nas reivindicações 1-21. Uma das formas preferidas de avaliar a eficácia das diferentes concretizações do invento é determinar a quantidade de ADN presente após o tratamento. Preferentemente, a alteração da quantidade de ADN e da gama de tamanhos do fragmento de ADN será tipicamente determinada após administração dos medicamentos do invento comparativamente com a situação antes da sua administração. Pode utilizar-se qualquer dos métodos aqui discutido para medir a quantidade e tamanho de fragmento de ADN. A gama de tamanhos do fragmento de ADN pode ser determinada por electroforese em gel ou outras técnicas de separação baseadas na separação de ADN por tamanho. A viscosidade da solução em que está presente ADN e em particular a viscosidade do muco pode ser determinada. Mais uma vez, preferentemente a situação de antes do tratamento é comparada com a situação após este. Qualquer das técnicas aqui discutidas para medir viscosidade pode ser usada tal como, por exemplo, técnicas como ensaios de compactação e ensaios que usam pêndulos de torção ou quaisquer outros métodos reológicos adequados.

Os medicamentos aqui descritos podem reduzir a viscosidade da solução contendo ADN de 0 a 100%, preferentemente de 20 a 100%, com maior preferência de 50 a 100% e ainda com maior preferência de 75 a 100% do valor anterior à administração do medicamento. Preferentemente, o comprimento médio do fragmento de ADN presente ou o tamanho do fragmento predominante será reduzido de 1 a 1000 vezes, com maior preferência de 5 a 500 vezes, com maior preferência de 10 a 100 vezes e ainda com maior preferência de 20 a 50 vezes. O tamanho médio do fragmento de ADN ou o tamanho do fragmento predominante, pode ser tipicamente de 50 pb a 10 kb, preferentemente de 100 pb a 2 500 pb, com maior preferência de 250 pb a 1 000 pb e ainda com maior preferência de 400 pb a 600 pb após o tratamento. O tratamento pode resultar num desvio visível para fragmentos de ADN de menor peso molecular tal como visualizado, por exemplo, por 41 ΕΡ 1 549 337/ΡΤ electroforese em gel e coloração com brometo de etídio e em particular pode reduzir a proporção de espécies de ADN no gel acima de 2 kb, preferentemente acima de 5 kb, com maior preferência acima de 10 kb e ainda com maior preferência aquelas maiores que 20kb no gel.

As alterações mencionadas acima e seguidamente podem ser observadas no intervalo de horas ou dias após administração, tal como desde uma hora a sete dias, preferentemente desde duas horas a dois dias e com maior preferência desde quatro horas a 24 horas após administração.

Os ensaios para avaliar viscosidade e ADN podem também ser efectuados em amostras retiradas do indivíduo para avaliar as concentrações óptimas de ADNase I e glicosaminoglicano e vários outros factores a utilizar. Assim, ao efectuar experiências in vitro em amostras tais como de expectoração para determinar como hidrolisar ADN de forma óptima, o medicamento a ser administrado ao indivíduo pode ser adaptado às suas necessidades. Poderá ser possível fazer esta adaptação de modo a que em alturas mais graves da doença ou em circunstâncias específicas, o regime de tratamento possa ser ajustado adequadamente. A administração dos medicamentos pode produzir tipicamente uma melhoria no estado do indivíduo. Por exemplo, no caso de doenças respiratórias, a administração pode resultar numa redução da obstrução das vias aéreas e entupimento, espuma ou borbulhamento causado por muco. O indivíduo pode apresentar um aumento de FEVi fazendo-o regressar a um valor mais perto do previsto para um indivíduo equivalente que não sofra da doença respiratória.

Nalguns casos, após o tratamento o indivíduo apresentará uma melhoria de FEVi de modo que FEVi aumenta de 25 a 100%, preferentemente de 40 a 100%, com maior preferência de 60 a 100% e ainda com maior preferência de 80 a 100% do valor previsto. A melhoria pode também ser menor, tal como de 5 a 10%, preferentemente de 15 a 25% ou com maior preferência de 20 a 25%. Tal pode ser acompanhado pelo indivíduo experienciar um aumento da facilidade em respirar, promoção da expiração de muco e redução da tosse. Os indivíduos podem apresentar aumento 42 ΕΡ 1 549 337/ΡΤ da capacidade de efectuar exercício e de se esforçarem fisicamente. 0 efeito mucolítico da ADNase I pode também diminuir a incidência de infecções respiratórias, em particular nos casos em que o indivíduo tem fibrose cística ou pneumonia. Assim, o indivíduo pode apresentar uma diminuição de infecções por patogénios tais como, por exemplo Pseudomonas, Pneumococcus, Staphylococcus, Burkholderia, Haemophilus e/ou Aspergillus. Nomeadamente, o doente pode apresentar incidência reduzida de infecção por Haemophilus influenza, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeuroginosa e/ou Burkholderia cepacia. Os indivíduos nos quais essas infecções eram crónicas podem já não estar infectados ou ter uma carga reduzida de patogénio após o tratamento. A carga de patogénio e a natureza dos patogénios podem ser avaliadas utilizando várias técnicas microbiológicas bem conhecidas na especialidade tal como coloração, cultura e plaqueamento.

Nos casos em que o indivíduo sofre de uma doença auto-imune caracterizada pela presença de anticorpos reactivos contra ADN, a eficácia do invento pode ser avaliada pela monitorização da diminuição da resposta imunitária contra ADN no indivíduo. Assim tipicamente o título de anticorpos contra ADN presentes no sangue será medido assim como pode ser medida a afinidade dos anticorpos presentes. 0 título de anticorpos ou a sua afinidade podem diminuir, por exemplo, por um factor de duas, quatro, cinco, dez, vinte, cinquenta ou mais vezes. Estes podem diminuir em mais de 20%, preferentemente mais de 40%, com maior preferência mais de 60% e ainda com maior preferência em mais de 90%. A avaliação do título e da afinidade do anticorpo pode ser avaliada utilizando técnicas padrão tal como ensaios ELISA. A gravidade da doença no doente pode ser monitorizada.

Os medicamentos do invento tratarão tipicamente a doença em questão. Estes podem melhorar a sua gravidade e/ou eliminar ou reduzir sintomas associados com a doença. Nomeadamente, reduzirão ou eliminarão características da doença associada à presença de ADN extracelular. Assim em doenças respiratórias tais como fibrose cística estes terão um efeito mucolítico reduzindo a viscosidade do muco. Tal ajudará na depuração da acumulação de muco e poderá ocorrer aumento na expectoração de 43

ΕΡ 1 549 337/PT muco. Poderá ocorrer uma melhoria na função pulmonar e uma incidência ou gravidade diminuídas da infecção. 0 indivíduo poderá ter uma sensação aumentada de bem estar. Em alguns casos de tratamento o indivíduo apresentará uma melhoria de FEVi de modo a que FEVi seja de 25 a 100%, preferentemente de 40 a 100%, com maior preferência de 60 a 100% e ainda com maior preferência de 80 a 100% do valor previsto.

Define-se FEVi como o volume forçado máximo que pode ser expirado em um segundo com início na inspiração máxima (European Resp. Journal, 1993; 6: Supl. 16 e Coates, Lung Function,:

Assessment and Applications In Medicine, 4a edição, Oxford, Blackwell, 1969). Pode medir-se por técnicas padrão bem conhecidas na especialidade i.e. por espirometria.

Os medicamentos podem aumentar a esperança de vida tal como em, por exemplo, 1 a 2 anos, preferentemente de 2 a 4 anos e ainda com maior preferência em mais de 4 anos.

Produtos O presente invento também proporciona produtos compreendendo um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável, tendo o glicosaminoglicano ou o seu sal um peso molecular médio de 8 a 40 kd e uma ADNase I para uso no tratamento de uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno no indivíduo a tratar, em que o glicosaminoglicano ou seu sal aumenta a actividade da ADNase I e em que os produtos devem ser administrados de forma simultânea, independente ou sequencial, em que a doença é: (a) uma doença respiratória caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno no pulmão; (b) seleccionada de fibrose cística, limitação crónica do fluxo aéreo e pneumonia; (c) lúpus eritematoso sistémico (LES); ou (d) uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno num local de inflamação. o como

Estes poderão estar tipicamente numa forma sólida ou líquida. Pode estar na forma de um pó. Pode estar liofilizado ou congelado. Pode também compreender outros componentes tais como água ou um tampão. O produto pode tomar a forma de uma solução aquosa compreendendo tanto ADNase I 44 ΕΡ 1 549 337/PT glicosaminoglicano ou sal. O produto pode também compreender agentes estabilizantes ou conservantes. Pode compreender agentes que permitem que o produto seja congelado sem perder actividade enzimática tal como glicerol. Os produtos podem ser enformados, por exemplo por mistura de pós de glicosaminoglicano e ADNase.

Administração e composições farmacêuticas 0 glicosaminoglicano ou sal fisiologicamente aceitável pode ser administrado simultânea, independente ou sequencialmente com a ADNase I. Assim os dois podem ser administrados no mesmo medicamento ou como dois medicamentos independentes e podem ser administrados ao mesmo tempo, um após o outro ou independentemente. Em concretizações nas quais os dois são administrados independentemente, preferentemente o glicosaminoglicano ou o sal serão administrados antes ou ao mesmo tempo da ADNase I. 0 glicosaminoglicano e ADNase I podem ser tipicamente administrados com um intervalo de uma semana a um minuto, preferentemente de dois dias a uma hora de intervalo, ainda com maior preferência de 24 horas a 2 horas de intervalo e ainda com maior preferência de 12 a 4 horas de intervalo. Os dois podem ser administrados com um intervalo de um minuto e uma hora, preferentemente de 10 minutos a 30 minutos de intervalo e ainda com maior preferência de 15 a 25 minutos de intervalo. Os dois podem ser administrados com um intervalo de um minuto a dez minutos, preferentemente de dois minutos a oito minutos de intervalo e com maior preferência de quatro a seis minutos de intervalo. Em alguns casos podem ser administrados sucessivamente, um imediatamente após o outro.

Os dois podem ser administrados pela mesma via ou através de vias diferentes, preferentemente os dois serão administrados pela mesma via quer como medicamentos independentes quer como o mesmo medicamento. O glicosaminoglicano ou sal e a ADNase I podem ser proporcionados em duas composições independentes, mas podem, por exemplo, ser misturados antes da adição a um dispositivo de entrega ou no dispositivo de entrega. O dispositivo de entrega pode ter um meio de regular a quantidade 45

ΕΡ 1 549 337/PT de cada entrega ao indivíduo. Pode ter um meio de misturar os dois ou entregar cada um separadamente.

Os medicamentos e composições aqui descritos podem ser preparados por formulação dos agentes activos, i.e o glicosaminoglicano ou sal e/ou a ADNase I, com um transportador e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável padrão tal como é de rotina na especialidade farmacêutica. A natureza exacta da formulação dependerá de vários factores incluindo o glicosaminoglicano, sal ou ADNase I particulares utilizados e a via de administração pretendida. Os tipos adequados de formulação são descritos detalhadamente em Remington' s

Pharmaceutical Sciences, 19a edição, Mack Publishing Company, Eastern Pennsylvania, EUA. A dose necessária a ser administrada será normalmente determinada por um médico, mas para o glicosaminoglicano ou sal será, por exemplo, de 0,01 mg a 5 g, preferentemente de 0,1 mg a 2,5 g, com maior preferência de 1 mg a lg, ainda com maior preferência de 10 mg a 500 mg, ainda com maior preferência de 50 mg a 250 mg e ainda com maior preferência de 100 mg a 200 mg. Estas doses serão tipicamente dadas uma, duas ou três vezes por dia e serão preferentemente dadas uma ou duas vezes por dia e com maior preferência serão dadas duas vezes por dia.

Se o glicosaminoglicano é heparina ou um seu sal fisiologicamente aceitável a dosagem administrada pode estar tipicamente na gama de 10 a 10 000 unidades por kg de peso corporal, preferentemente 100 a 10 000 unidades por kg de peso corporal, com maior preferência 200 a 5000 unidades por kg de peso corporal, ainda com maior preferência 500 a 2000 unidades por kg e ainda com maior preferência 1 000 a 1 500 unidades por kg.

Tipicamente a dose de ADNase será tal que a concentração de ADNase I atingida no local alvo é de 100 a 0,001 pg/ml, preferentemente de 50 a 0,1 pg/ml, ainda com maior preferência de 25 a 0,5 pg/ml, ainda com maior preferência de 10 a 1 pg/ml. A concentração atingida no local alvo pode ser de 8 a 2 pg/ml e preferentemente de 4 a 2 yg/ml. Estas doses serão tipicamente dadas uma, duas ou três vezes por dia e serão preferentemente dadas duas vezes por dia. 46 ΕΡ 1 549 337/ΡΤ A duração do tratamento será tipicamente de um dia, uma semana, duas semanas, um mês, seis meses, um ano ou mais. Em muitos casos o indivíduo tomará os medicamentos do invento permanentemente ou por períodos prolongados. Tal pode em particular ser o caso em que o indivíduo tem um defeito genético, tal como quando o indivíduo tem fibrose cística e assim tem permanentemente a doença. Tal pode também ser o caso em que um dos factores que causam a doença são algo ao qual o indivíduo está continuamente exposto e ao qual não pode evitar ou pretende evitar essa exposição. 0 indivíduo pode ser um fumador de tabaco mas não deixa de fumar tabaco.

Nos casos em que a doença é de duração mais curta ou que ocorre periodicamente, a duração da administração pode ser mais curta e pode estar ligada à duração da doença. Assim, por exemplo, quando a doença é um abscesso ou outra situação inflamatória tal como uma situação envolvendo um local de inflamação fechado, uma vez resolvida a inflamação, a administração do medicamento pode ser cessada ou reduzida. 0 horário de administração pode ser coordenado de modo a que os níveis mais elevados dos medicamentos sejam administrados quando a doença tiver maior gravidade ou que o início da administração seja também nesse ponto temporal. Assim em doenças respiratórias tais como, por exemplo, fibrose cística ou pneumonia tal pode ser quando o indivíduo tem um aumento da obstrução das vias aéreas, da infecção e/ou da inflamação. 0 medicamento pode também ser dado antes do exercício ou outro esforço físico.

Nos casos em que a doença envolve um local de inflamação específico o medicamento pode ser administrado directamente ao local da inflamação ou na região do local. Assim o medicamento pode, por exemplo, ser injectado no local, aplicado como creme ou no braço etc. 0 medicamento pode ser administrado através de um implante. Assim descreve-se aqui um implante compreendendo um medicamento do invento. Em doenças auto-imunes os medicamentos podem tipicamente ser administrados sistemicamente tal como por injecção intravenosa. Nomeadamente tal pode ser o caso para LES.

Preferentemente os medicamentos do invento podem ser administrados através de inalação e/ou intranasalmente. Assim 47

ΕΡ 1 549 337/PT podem ser entregues através do nariz e/ou boca. São bem conhecidos na especialidade métodos adequados para formular e preparar medicamentos para serem administrados através de inalação, instilação e intranasalmente. Os medicamentos podem também ser administrados por instilação. Numa concretização preferida, os medicamentos do invento são adequados para administração por inalação. Para terapia de inalação o medicamento pode estar em solução útil para administração por aerossol liquido, inaladores com doseador ou sob forma adequada para inalador de pó seco. 0 medicamento pode existir num pacote blister ou cápsula quebrável.

Em alguns casos os medicamentos podem ser administrados através de instilação. Em tais casos, tipicamente o medicamento estará na forma liquida e será administrado através de uma via área artificial tal como, por exemplo, um tubo endotraqueal. 0 liquido será tipicamente aspirado por uma seringa e seguidamente expelido através de via aérea artificial para o tracto respiratório do indivíduo. A instilação é frequentemente usada num contexto de emergência. Em muitos casos pode ser usada quando o indivíduo tiver uma forma relativamente avançada de CAL e tiver sido hospitalizado. Tipicamente serão instilados volumes tais como de 1 a 20 ml, preferentemente de 2 a 10 ml e ainda com maior preferência de 3 a 6 ml. Qualquer método para entrega ao tracto pulmonar poderá ser usado para entregar os medicamentos do invento.

Nos casos em que o medicamento deva ser administrado através do nariz este pode ser, por exemplo, sob a forma de aerossol nasal. O aerossol pode ser administrado, por exemplo, usando um atomizador ou nebulizador. Em alguns casos o medicamento pode estar sob forma de gotas nasais. Estas podem ser administradas usando um conta-gotas medicinal. Para discussão adicional sobre as formas de dosagem nasal consultar Remington' s Pharmaceutical Sciences (anteriormente). Os medicamentos administrados através do nariz podem incluir ajustadores de pH, emulsionantes ou agentes dispersantes, conservantes, tensioactivos, agentes de geleificação ou agentes de tamponamento tal como podem existir nos outros medicamentos do invento. Com a maior preferência a forma de dosagem nasal será isotónica com as excreções nasais. 48

ΕΡ 1 549 337/PT

Os medicamentos aqui descritos podem ser formulados como aerossóis. A formulação de aerossóis farmacêuticos é rotineira para os peritos na especialidade, consultar por exemplo, Sciarra, J. em Remington' s Pharmaceutical Sciences (anteriormente). Os agentes podem ser formulados como aerossóis em solução, aerossóis de pós secos em dispersão ou suspensão, emulsões ou preparações semi-sólidas. 0 aerossol pode ser entregue usando qualquer sistema propulsor conhecido dos peritos na especialidade. Os aerossóis podem ser aplicados ao tracto respiratório superior, por exemplo por inalação nasal ao tracto respiratório inferior ou a ambos. 0 glicosaminoglicano, sal ou ADNase podem ser entregues usando métodos de entrega de lipossomas e nanoparticulas. Podem usar-se lipossomas, nomeadamente lipossomas catiónicos, em formulações de transportador.

Os medicamentos para uso de acordo com o presente invento, podem incluir, além do ingrediente activo, um excipiente, transportador, tampão, estabilizante ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis e bem conhecidos pelo peritos na especialidade. Podem incluir, nomeadamente, um excipiente farmaceuticamente aceitável. Tais materiais não devem ser tóxicos e não devem interferir na eficácia do ingrediente activo. A natureza exacta do transportador ou outro material dependerá da via de administração. Descrevem-se transportadores farmacêuticos adequados em Remington' s Pharmaceutical Sciences (anteriormente).

Os medicamentos e composições do invento podem, por exemplo, ser tamponados de forma a que, caso incluam uma ADNase I, tenham um pH semelhante ou idêntico ao pH óptimo da ADNase I especifica em utilização. Por exemplo, o pH utilizado pode encontrar-se no intervalo de 2, preferentemente 1, com maior preferência 0,5, ainda com maior preferência 0,2 e ainda com maior preferência 0,1 unidades de pH relativamente ao pH óptimo da enzima em utilização. Em alguns casos, a ADNase I será activa ao longo de uma gama vasta de pH e o pH escolhido será o mais próximo do pH fisiológico ou pelo menos a enzima será activa pelo menos parcialmente ao pH fisiológico e portanto pode ser tamponada ao pH fisiológico ou pelo menos a um pH no intervalo de 2, preferentemente 1, com maior preferência 0,5, ainda com maior 49 ΕΡ 1 549 337/PT preferência 0,2 e ainda com maior preferência 0,1 unidades de pH do pH óptimo.

Os medicamentos podem incluir vários constituintes para optimizar a sua adequação para a via de entrega especifica escolhida. A viscosidade dos medicamentos pode ser mantida a um nível pretendido usando um agente de espessamento farmaceuticamente aceitável. Os agentes de espessamento que podem ser usados incluem metilcelulose, goma de xantano, carboximetilcelulose, hidroxipropilcelulose, carbómero, álcool polivinílico, alginatos, goma arábica, quitosanos e suas combinações. A concentração do agente de espessamento dependerá do agente seleccionado e da viscosidade pretendida.

Em algumas concretizações e nomeadamente quando se utiliza entrega intranasal, os medicamentos podem compreender um humidificante. Tal pode ajudar a reduzir ou evitar a secura da membrana mucosa e a evitar irritação das membranas. Os humidificante adequados incluem sorbitol, óleo mineral, óleo vegetal e glicerol; agentes calmantes; amaciadores da membrana; adoçantes; e suas combinações.

Os medicamentos podem compreender um tensioactivo. Os tensioactivos adequados incluem tensioactivos não iónicos, aniónicos e catiónicos. Exemplos de tensioactivos que podem ser usados incluem, por exemplo, derivados polioxietileno de ésteres parciais de ácidos gordos de anidridos de sorbitol, tais como por exemplo, Tween 80, estearato de polixoil 40, estearato de polioxiletileno 50, fusiatos, ácidos biliares e octoxinol.

Os medicamentos do presente invento podem ser entregues por qualquer dispositivo adaptado para introduzir uma ou mais composições terapêuticas no tracto respiratório superior e/ou inferior. Os dispositivos aqui descritos podem ser inaladores com doseador. Os dispositivos podem ser adaptados para entregar as composições terapêuticas do invento sob a forma de uma névoa finamente dispersa de líquido, espuma ou pó. O dispositivo pode usar um efeito piezoeléctrico ou vibração ultrassónica para desalojar o pó ligado a uma superfície tal como uma fita de modo a gerar uma névoa adequada para inalação. Os dispositivos podem usar qualquer sistema de propulsão conhecido dos peritos 50

ΕΡ 1 549 337/PT na especialidade incluindo, entre outros, bombas, gás liquefeito, gás comprimido e semelhantes.

Os dispositivos aqui descritos compreendem tipicamente um recipiente com uma ou mais válvulas através das quais o fluxo da composição terapêutica viaja e um actuador para controlar o fluxo. Os dispositivos adequados aqui descritos podem ser observados, por exemplo, em Remington' s Pharmaceut ical Sciences (anteriormente). Os dispositivos adequados para administrar os medicamentos do invento incluem inaladores e nebulizadores tais como os tipicamente usados para entregar esteróides a asmáticos. Em alguns casos, quando o indivíduo é por exemplo uma criança, pode usar-se um espaçador para facilitar administração eficaz com o inalador.

Estão disponíveis comercialmente várias concepções de inaladores e podem ser utilizadas para entregar os medicamentos do invento. Estas incluem os dispositivos Accuhaler, Aerohaler, Aerolizer, Airmax, Autohaler, Clickhaler, Diskhaler, inalador Easi-breathe, Fisonair, Integra, inalador Jet, Miat-haler, inalador Novolizer, inalador Pulvinal, Rotahaler, Spacehaler, Spinhaler, inalador Syncroner e Turbohaler.

Nos casos em que o glicosaminoglicano e/ou ADNase I são administrados sob a forma de partículas ou gotículas, o tamanho das partículas/gotículas e/ou outras propriedades das partículas/gotículas podem ser escolhidas para assegurar que as partículas são entregues a uma região específica do tracto respiratório. Por exemplo, podem ser concebidas para atingir apenas as partes superior ou inferior do tracto respiratório. Nos casos em que o glicosaminoglicano, sal ou agente terapêutico são entregues numa forma aquosa, preferentemente a solução será isotónica para ajudar a assegurar entrega eficaz ao indivíduo.

Caso se pretenda administrar os medicamentos ao tracto respiratório ou através deste, pode escolher-se o tamanho de partícula do medicamento com base na parte pretendida do tracto respiratório à qual se pretende administrar o medicamento. Nomeadamente, pensa-se que partículas com um diâmetro de 10 μΜ são eficazes a atingir as partes inferiores do tracto respiratório e portanto podem ser empregues quando tal local é o alvo pretendido para os medicamentos. Caso se pretenda 51 ΕΡ 1 549 337/PT entregar o medicamento às partes inferiores do tracto respiratório, tal como os alvéolos por exemplo, o diâmetro das partículas administradas pode ser inferior a 10 μΜ, preferentemente inferior a 8 μΜ, com maior preferência inferior a 6 μΜ e ainda com maior preferência inferior a 4 μΜ. Numa concretização preferida as partículas podem ter um diâmetro de 3 μΜ ou inferior e com maior preferência podem ter um diâmetro de 2 μΜ ou inferior. As partículas podem ter um diâmetro entre 3 e 5 μΜ. Em alguns casos as partículas administradas podem ter menos de 1000 nm, preferentemente menos de 500 nm, com maior preferência menos de 250 nm e ainda com maior preferência menos de 100 nm de diâmetro. Os tamanhos podem referir-se a partículas de matéria sólida ou gotículas de soluções e suspensões. O tamanho das partículas necessárias para penetrar numa parte específica do tracto respiratório será conhecido na especialidade e portanto pode escolher-se o tamanho da partícula adequado ao tamanho do alvo. Podem usar-se técnicas tais como moagem para produzir as partículas muito pequenas necessárias. Em alguns casos a parte pretendida do tracto respiratório pode ser o tracto respiratório superior e podem portanto utilizar-se partículas de maior tamanho. A densidade das partículas e a sua forma pode também ser escolhida para facilitar a sua entrega ao local pretendido.

Os medicamentos aqui descritos podem tomar uma variedade de formas. Nos casos em que estes são para administração através do tracto respiratório podem estar sob a forma de pós, microesferas em pó, soluções, suspensões, géis, suspensões de nanopartículas, lipossomas, emulsões ou micro-emulsões. Os líquidos presentes podem ser água ou outros solventes adequados tais como CFC ou HFA. No caso de soluções e suspensões estas podem ser aquosas ou envolver soluções diferentes de água.

As composições do invento podem também revestir implantes, dispositivos ou materiais para serem introduzidos no corpo. Em tais concretizações estas podem ser libertadas da superfície do objecto, preferentemente devagar. O presente invento também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo: 52

ΕΡ 1 549 337/PT - um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável gue tem um peso molecular médio de 8 e 40 kd; - uma ADNase I; e - um excipiente farmaceuticamente aceitável. O excipiente pode ser gualquer um dos aqui mencionados ou qualquer dos transportadores. A ADNase I e glicosaminoglicano ou sal são tal como definidos nas reivindicações 1-21.

Aplicações não clínicas

Apesar do principal uso do invento ser num contexto clinico, também se usa a ADNase I para várias aplicações não clinicas. Assim, demonstrar o efeito sinérgico do glicosaminoglicano sobre a actividade da ADNase I significa que a quantidade de ADNase I necessária em tais aplicações pode ser diminuída ou alternativamente que se pode atingir um nível mais elevado de actividade da ADNase I utilizando a mesma quantidade de ADNase I.

Assim o presente invento proporciona o uso de um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável que tem um peso molecular médio de 8 e 40 kd para aumentar a actividade de uma ADNase I in vitro.

As utilizações não clínicas do invento incluem, por exemplo, em experiências laboratoriais e/ou investigação. Por exemplo, utiliza-se por vezes ADNase I para remover ADN contaminante de preparações de ARN e nomeadamente de ARNm antes da síntese de ADNc. Também se utiliza para reduzir a viscosidade em câmaras de micro-injecção para micro-injecção de embriões e outros sistemas nos quais o aumento de viscosidade devida à presença de ADN possa causar problemas. O invento pode ser usado para aumentar a actividade de ADNase I em situações nas quais a enzima é usada para reduzir a viscosidade de uma solução por clivagem de ADN.

Podem usar-se os produtos e métodos do invento em qualquer aplicação não clínica envolvendo ADNase I. Podem introduzir-se etapas de purificação adicionais nos procedimentos para remover o glicosaminoglicano, caso se pretenda ou seja necessários, subsequentemente ou após o tratamento com ADNase I. Qualquer 53

ΕΡ 1 549 337/PT dos parâmetros aqui descritos relativamente a aplicações clinicas do invento podem ser igualmente aplicáveis a aplicações não clinicas e vice-versa.

Kits

Também se mencionam kits compreendendo: um glicosaminoglicano ou um seu sal, com peso molecular médio de 8 e 40 kd; uma ADNase I; e material de embalagem. O glicosaminoglicano ou sal e a ADNase I podem proporcionar-se nos kits em qualquer das formas aqui discutidas. O kit pode também compreender reagentes ou ensaios adicionais para efectuar os diferentes ensaios e técnicas que podem ser efectuados usando ADNase I e em particular técnicas laboratoriais usando a enzima. O kit também pode adicionalmente compreender instruções sobre como efectuar as técnicas.

Descreve-se aqui um kit compreendendo: - um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável, tendo o glicosaminoglicano ou o seu sal um peso molecular médio de 8 e 40 kd; - uma ADNase I; e - material de embalagem. O kit pode compreender instruções para a administração sequencial, simultânea ou independente da ADNase I e glicosaminoglicano a um indivíduo que sofra de uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno e está a ser tratado com um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável, com um peso molecular médio de 8 a 40 kd, de modo a que o glicosaminoglicano ou o seu sal aumente a actividade da ADNase I em que a doença é: (a) uma doença respiratória caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno no pulmão; (b) seleccionada de fibrose cística, limitação crónica do fluxo aéreo e pneumonia; (c) lúpus eritematoso sistémico (LES); ou (d) uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno num local de inflamação.

As instruções podem tomar a forma de uma etiqueta na embalagem. O kit pode compreender adicionalmente meios para 54 ΕΡ 1 549 337/PT administrar o glicosaminoglicano ou o seu sal e/ou a ADNase I tal como os agui discutidos.

Os seguintes exemplos ilustram o invento.

Exemplo 1: Demonstração de sinergia entre ADNase e heparina in vitro

Determinou-se o efeito da heparina sobre a actividade da ADNase in vitro. Incubou-se ADN de timo de vitela (5 pg/ml) com uma gama de concentrações de ADNase na presença ou ausência de heparina não fraccionada (160 unidades USP por mg de um sal de sódio de heparina de mucosa intestinal porcina - obtido de Calbiochem, número de catálogo 375095) que se usou a concentração de 1 mg/ml durante 1 hora a 37 °C. Todas as soluções foram preparadas em tampão de fosfato de sódio contendo sulfato de magnésio 1,2 mM. Após tratamento com ADNase estimou-se a quantidade de ADN intacto usando coloração Hoechst e quantificou-se a fluorescência associada (Labarca e Paider, 1980, Anal. Biochem., 102:344-352) . Usou-se ADNase I de bovino e tinha 2 500 unidades kunitz por mg (usou-se a mesma ADNase dos exemplos 2 e 3). Os resultados obtidos são apresentados na figura 1. A presença de heparina aumentou significativamente a actividade da ADNase, resultando numa quebra mais rápida do ADN. Contudo, as experiências utilizando heparina de baixo peso molecular de peso molecular médio 6kd na gama de concentrações de 0,01 pg/ml a 10 mg/ml não tiveram efeito na actividade ADNase (LMWH - utilizou-se um sal de sódio de heparina de mucosa intestinal porcina com PM 6000 - obtido de Sigma, número de catálogo D7037) . Assim, os resultados mostram que a concentrações de ADNase tipicamente atingidas nas vias aéreas de doentes de fibrose cística que recebem inalado 55

ΕΡ 1 549 337/PT LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110>

<120> TERAPIA DE COMBINAÇÃO DE GLICOSAMINOGLICANO

<130> P.85643 GCW <140> <141> <160> 2

<170> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 1055 <212> ADN <213> Homo Sapiens <22 0> <221> CDS <222> (2) . . (1054) <223> <4 0 0> 1 a gcc atg cac tac cca act gca ctc ctc ttc ctc ate ctg gee aat çgg 49

Ala Met His Tyr Pro Thr Ala Leu Leu Phe Leu Ile Leu Ala Asn Gly 15 10 15 acc eag acc ttt ege ate tgc gcc ttc aat gcc cag cgg ctg aca ctg 97 Thr Gin Thr Phe Arg Ile Cys Ala Phe Asn Ala Gin Arg Leu Thr Leu 20 25 30 ccc aag gtg gcc agg gag cag gtg atg gac acc tta gtt cgg ata ctg 145 Pro Lys Val Ala Arg Glu Gin Val Met Asp Thr Leu Val Arg Ile Leu 35 40 45 gct ege tgt gac ate atg gtg ctg cag gag gtg gtg gac tet tcc ggc 193 Ala Arg Cys Asp Ile Met Val Leu Gin Glu Val Val Asp Ser Ser Gly 50 55 60 age gcc ate ccg ctc ctg ctt cga gaa ctc aat cga ttt gat ggc tet 241 Ser Ala Ile Pro Leu Leu Leu Arg Glu Leu Asn Arg Phe Asp Gly Ser 55 70 75 80 ggg ccc tac age acc ctg age age ccc cag ctg ggg ege age acc tac 289 Gly Pro Tyr Ser Thr Leu Ser Ser Pro Gin Leu Gly Arg Ser Thr Tyr 85 90 95 atg gag acg tat gtg tac ttc tat cgg tea cac aaa aca cag gtc ctg 337 Met Glu Thr Tyr Val Tyr Phe Tyr Arg Ser His Lys Thr Gin Val Leu 100 105 110 agt tcc tac gtg tac aac gat gag gat gac gtc ttt gcc cgg gag cca 385 Ser Ser Tyr Val Tyr Asn Asp Glu Asp Asp Val Phe Ala Arg Glu Pro 115 120 125 ttt gtg gcc cag ttc tet ttg ccc age aat gtc ctt ccc age ctg gtg 433 Phe Val Ala Gin Phe Ser Leu Pro Ser Asn Val Leu Pro Ser Leu Val 130 135 140 ttg gtc ccg ctg cac acc act cct aag gcc gta gag aag gag ctg aac 481 Leu Val Pro Leu His Thr Thr Pro Lys Ala Val Glu Lys Glu Leu Asn 145 150 155 160 56

ΕΡ 1 549 337/PT gcc ctc tac gat gtg ttt ctg gag gtc tcc cag cac tgg cag age aag 529 Ala Leu Tyr Asp Val Phe Leu Glu Val Ser Gin His Trp Gin Ser Lys 165 170 175 gac gtg ate ctg ctt ggg gac ttc aat gct gac tgc gct tea Ctg acc 577 Asp Val Ile Leu Leu Gly Asp Phe Asn Ala Asp Cys Ala Ser Leu Thr ISO 1B5 190 aaa aag ege ctg gac aag ctg gag ctg cgg act gag cca ggc ttc cac 625 Lys Lys Arg Leu Asp Lys Leu Glu Leu Arg Thr Glu Pro Gly Phe His 195 200 205 tgg gtg att gcc gat ggg gag gac acc aca gtg cgg gcc age acc cac 673 Trp Val Ile Ala Asp Gly Glu Asp Thr Thr Val Arg Ala Ser Thr His 210 215 220 tgc acc tat gac ege gtc gtg ctg cac ggg gag ege tgc cgg agt ctg 721 Cys Thr Tyr Asp Arg Val Val Leu His Gly Glu Arg Cys Arg Ser Leu 225 230 235 240 ctg cac act gcg gct gcc ttt gac ttc ccc acg age ttc cag ctc acc 769 Leu His Thr Ala Ala Ala Phe Asp Phe Pro Thr Ser Phe Gin Leu Thr 245 250 255 gag gag gag gcc ctc aac ate agt gac cac tac ccc gtg gag gtg gag 817 Glu Glu Glu Ala Leu Asn Ile Ser Asp His Tyr Pro Val Glu Val Glu 260 265 270 ctg aag ctg age cag gcg cac age gtc cag cct ctc age ctc act gtt 865 Leu Lys Leu Ser Gin Ala His Ser Val Gin Pro Leu Ser Leu Thr Val 275 280 285 ctg ttg ctg cta tea ctc ctg tcc cct cag ctg tgc cct gct gcc tga 913 Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Ser Pro Gin Leu Cys Pro Ala Ala 290 295 300 gcg tcc ccc tac ccc ccc agg gcc tgc tgc ctt ttg gga ctt aaa ccc 961 cag cct ccc ccg tcc ate cag ccc tgg ggc tgg ggg gct tea act ata 1009 gtt gcc ctg tga ctg tag tcc acc cct gcc tgc ctt gtt tga ttt g 1055

<210> 2 <211> 351 <212> PRT <213> Homo sapiens 57

57 ΕΡ 1 549 337/PT <4 Ο 0> 2

Ala Met His Tyr Pro Thr Ala Leu Leu Phe Leu Ile Leu Ala Asn Gly 1 5 10 15 Thr Gin Thr Phe Arg Ile Cys Ala Phe Asn Ala Gin Arg Leu Thr Leu 20 25 30 Pro Lys Vai Ala Arg Glu Gin Vai Met Asp Thr Leu Vai Arg Ile Leu 35 40 45 AI a Arg Cys Asp Ile Met Vai Leu Gin Glu Vai Vai Asp Ser Ser Gly 50 55 60 Ser Ala Ile Pro Leu Leu Leu Arg Glu Leu Asn Arg Phe Asp Gly Ser 65 70 75 80 Gly Pro Tyr Ser Thr Leu Ser Ser Pro Gin Leu Gly Arg Ser Thr Tyr 85 90 95 Met Glu Thr Tyr Vai Tyr Phe Tyr Arg Ser His Lys Thr Gin Vai Leu 100 105 110 Ser Ser Tyr Vai Tyr Asn Asp Glu Asp Asp Vai Phe Ala Arg Glu Pro 115 120 125 Phe Vai Ala Gin Phe Ser Leu Pro Ser Asn Vai Leu Pro Ser Leu Vai 130 135 140 Leu Vai Pro Leu His Thr Thr Pro Lys Ala Vai Glu Lys Glu Leu Asn 145 150 155 160 Ala Leu Tyr Asp Vai Phe Leu Glu Vai Ser Gin His Trp Gin Ser Lys 165 170 175 Asp Vai Ile Leu Leu Gly Asp Phe Asn Ala Asp Cys Ala Ser Leu Thr 180 185 190 Lys Lys Arg Leu Asp Lys Leu Glu Leu Arg Thr Glu Pro Gly Phe His 195 200 205 Trp Tyr Ile Ala Asp Gly Glu Asp Thr Thr Vai Arg Ala Ser Thr His 210 215 220 Cys Thr Tyr Asp Arg Vai Vai Leu His Gly Glu Arg Cys Arg Ser Leu 225 230 235 240 Leu His Thr Ala Ala Ala Phe Asp Phe Pro Thr Ser Phe Gin Leu Thr 245 250 255 Glu Glu Glu Ala Leu Asn Ile 5er Asp His Tyr Pro Vai Glu Vai Glu 260 265 270 Leu Lys Leu Ser Gin Ala His Ser Vai Gin Pro Leu Ser Leu Thr Vai 275 280 285 Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Ser Pro Gin Leu Cys Pro Ala Ala 290 295 300

Lisboa, 2014-11-10

Claims (21)

1. ΕΡ 1 549 337/ΡΤ 1/10 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável no fabrico de um medicamento para tratar um indivíduo com uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno, em que o indivíduo está também a ser tratado com uma ADNase I, o glicosaminoglicano ou o seu sal tem um peso molecular médio de 8 a 40 kd e o glicosaminoglicano ou o seu sal aumenta a actividade da ADNase I, em que a doença é: (a) uma doença respiratória caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno no pulmão; (b) seleccionada de fibrose cística, limitação crónica do fluxo aéreo e pneumonia; (c) lúpus eritematoso sistémico (LES);ou (d) uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno num local de inflamação.
2. 2. Utilização de uma ADNase I no fabrico de um medicamento para tratar um indivíduo com uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno, em que o indivíduo está também a ser tratado com glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável, o glicosaminoglicano ou o seu sal tem um peso molecular médio de 8 a 40 kd e o glicosaminoglicano ou o seu sal aumenta a actividade da ADNase I, em que a doença é: (a) uma doença respiratória caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno no pulmão; (b) seleccionada de fibrose cística, limitação crónica do fluxo aéreo e pneumonia; (c) lúpus eritematoso sistémico (LES); ou (d) uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno num local de inflamação.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o glicosaminoglicano ou o sal fisiologicamente aceitável compreende unidades de dissacárido repetidas de fórmula geral (D -[A-B]- (1) em que: ΕΡ 1 549 337/PT 2/10 cada A é o mesmo ou diferente e representa uma parte com fórmula (i) ou (ii)

   em que: - um de Ri e R2 é hidrogénio e o outro é -CO2H, -SO3H ou -CH2OR - em que R é hidrogénio ou -SO3H; - um de R3 e R4 é hidrogénio e o outro é -OR em que R é hidrogénio ou -SO3H; - um de R5 e Rè é hidrogénio e o outro é -OH; - * representa uma ligação directa a um átomo de hidrogénio ou parte B adjacente; e - ** representa uma ligação directa a uma parte B adjacente; cada B é igual ou diferente e representa uma parte de fórmula (iii) ou (iv) ;

   - um de R7 e Rs é hidrogénio e o outro é -CH2OH ou -CH2OSO3H; ΕΡ 1 549 337/ΡΤ 3/10 - um de Rg e Rio é hidrogénio e o outro é -NHAc, -NH2 ou -NHSO3H; - um de Rn e R12 é hidrogénio e o outro é -OH ou -OSO3H; >jvwv indica uma ligação em qualquer orientação estereoquimica; - * representa uma ligação directa a um átomo de hidrogénio ou uma parte A adjacente; e - ** representa uma ligação directa a uma parte A adjacente ou um seu sal fisiologicamente aceitável.
4. 4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o glicosaminoglicano é: (a) uma heparina; ou (b) sulfato de condroitina A, sulfato de condroitina C, sulfato de condroitina D, sulfato de condroitina E, ácido hialurónico, sulfato de queratano ou sulfato de heparano.
5. 5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que se usa o sal de sódio de heparina ou sulfato de heparina.
6. 6. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a ADNase I: (a) tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 ou é uma ADNase I com mais de 65% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 e que retém actividade hidrolitica; (b) é uma ADNase humana de tipo I; e/ou (c) é uma ADNase I recombinante.
7. 7. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o glicosaminoglicano ou sal tem: (a) um peso molecular médio de 12 a 18 kd; (b) actividade anticoagulante; e/ou (c) não foi submetido a fragmentação e/ou despolimerização. ΕΡ 1 549 337/ΡΤ 4/10
8. 8. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a razão entre a quantidade de qlicosaminoglicano ou o seu sal e a quantidade de ADNase I administrada é de 5000:1 a 1:50 unidade por unidade.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que a razão é de 25:1 a 1:25.
10. 10. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que: (a) o glicosaminoglicano ou o seu sal e a ADNase I são administrados ao mesmo tempo; (b) o glicosaminoglicano ou o seu sal é administrado antes ou após a ADNase I; e/ou (c) o glicosaminoglicano ou o seu sal e a ADNase I são administrados como medicamentos independentes.
11. 11. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o indivíduo tem uma FEVi inferior a 75% do valor esperado para um indivíduo equivalente que não tenha a doença.
12. 12. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o glicosaminoglicano ou o sal e/ou a ADNase I são administrados por via de inalação, intranasalmente e/ou por via de instilação.
13. 13. Composição farmacêutica compreendendo: - um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável que tem um peso molecular médio de 8 a 40 kd; - uma ADNase I; e um excipiente, transportador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.
14. 14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13 que está sob a forma de um pó seco.
15. 15. Produtos compreendendo um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável, tendo o glicosaminoglicano ou o seu sal um peso molecular médio de 8 a 40 kd e uma ADNase I para uso no tratamento de uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno no indivíduo a tratar, em que o ΕΡ 1 549 337/ΡΤ 5/10 glicosaminoglicano ou ο seu sal aumenta a actividade de ADNase I e em que os produtos são para ser administrados de modo simultâneo, independente ou sequencial, em que a doença é: (a) uma doença respiratória caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno no pulmão; (b) seleccionada de fibrose cística, limitação crónica do fluxo aéreo e pneumonia; (c) lúpus eritematoso sistémico (LES); ou (d) uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno num local de inflamação.
16. 16. Produtos para uso de acordo com a reivindicação 15, em que: (A) o glicosaminoglicano ou o seu sal fisiologicamente aceitável compreende unidades dissacárido repetidas com a fórmula geral (1) : (1) -[A-B]- em que: cada A é igual ou diferente e representa uma parte de fórmula (i) ou (ii)

    em que: - um de Ri e R2 é hidrogénio e o outro é -CO2H, -SO3H ou -CH2OR- - em que R é hidrogénio ou -SO3H; - um de R3 e R4 é hidrogénio e o outro é -OR em que R é hidrogénio ou -SO3H; - um de R5 e R6 é hidrogénio e o outro é -OH; ΕΡ 1 549 337/PT 6/10 - * representa uma ligação directa a um átomo de hidrogénio ou parte B adjacente; e - ** representa uma ligação directa a uma parte B adjacente; cada B é igual ou diferente e representa uma parte de fórmula (iii) ou (iv) ; Ç-7 R7

    em que: - um de R7 e Rs é hidrogénio e o outro é -CH2OH ou -CH2OSO3H; - um de R9 e Rio é hidrogénio e o outro é -NHAc, -NH2 ou -NHSO3H; - um de R11 e R12 é hidrogénio e o outro é -OH ou -OSO3H; mw indica uma ligaçao em qualquer orientação estereoquimica; - * representa uma ligação directa a um átomo de hidrogénio ou uma parte A adjacente; e - ** representa uma ligação directa a uma parte A adjacente. ou um seu sal fisiologicamente aceitável; ou (B) o glicosaminoglicano ou o seu sal é uma heparina; ou (C) o glicosaminoglicano ou o seu sal é sulfato de condroitina A, sulfato de condroitina C, sulfato de condroitina D, sulfato de condroitina E, ácido hialurónico, sulfato de queratano ou sulfato de heparano; ou (D) usa-se o sal de sódio de heparina ou sulfato de heparina; ou ΕΡ 1 549 337/PT 7/10 (Ε) ο glicosaminoglicano ou seu sal tem um peso molecular médio de 12 a 18 kd; ou (F) o glicosaminoglicano ou seu sal tem actividade anticoagulante; ou (G) o glicosaminoglicano ou seu sal não foi submetido a fragmentação e/ou despolimerização; ou (H) a ADNase I tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou é uma ADNase I com mais de 65% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2; (I) a ADNase I é ADNase humana de tipo I; ou (J) a ADNase I é uma ADNase I recombinante; ou (K) a razão entre a quantidade de glicosaminoglicano ou do seu sal e a quantidade de ADNase I administrada é de 5000:1 a 1:50 unidade a unidade; ou (L) a razão entre a quantidade de glicosaminoglicano ou do seu sal e a quantidade de ADNase I administrada é de 25:1 a 1:25.
17. 17. Agente para uso no tratamento de um indivíduo com uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno, compreendendo o agente um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável, tendo o glicosaminoglicano ou o seu sal um peso molecular médio de 8 a 40 kd, em que o referido indivíduo está a ser tratado com uma ADNase I e o glicosaminoglicano ou o seu sal aumenta a actividade da ADNase I, em que a doença á: (a) uma doença respiratória caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno no pulmão; (b) seleccionada de fibrose cística, limitação crónica do fluxo aéreo e pneumonia; (c) lúpus eritematoso sistémico (LES); ou (d) uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno num local de inflamação.
18. 18. Agente para uso no tratamento de um indivíduo com uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno, compreendo o agente uma ADNase I, em que o referido indivíduo está a ser tratado com um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável, tendo o glicosaminoglicano ou o seu sal um peso molecular médio de 8 a 40 kd e o glicosaminoglicano ou o seu sal aumenta a actividade da ADNase I, em que a doença é: ΕΡ 1 549 337/ΡΤ 8/10 (a) uma doença respiratória caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno no pulmão; (b) seleccionada de fibrose cistica, limitação crónica do fluxo aéreo e pneumonia; (c) lúpus eritematoso sistémico (LES); ou (d) uma doença caracterizada pela presença de ADN extracelular endógeno num local de inflamação.
19. 19. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13 ou 14 ou um agente para uso de acordo com a reivindicação 17 ou 18, em que: (A) o glicosaminoglicano ou o seu sal fisiologicamente aceitável compreende unidades dissacárido repetidas com a fórmula geral (1) : -[A-B]- (1) em que: cada A é igual ou diferente e representa uma parte de fórmula (i) ou (ii)

    em que: - um de Ri e R2 é hidrogénio e o outro é -CO2H, -SO3H ou -CH2OR - em que R é hidrogénio ou -SO3H; - um de R3 e R4 é hidrogénio e o outro é -OR em que R é hidrogénio ou -SO3H; - um de R5 e R6 é hidrogénio e o outro é -OH; - * representa uma ligação directa a um átomo de hidrogénio ou parte B adjacente; e ΕΡ 1 549 337/ΡΤ 9/10 - ** representa uma ligação directa a uma parte B adjacente; cada B é igual ou diferente e representa uma parte de fórmula (iii) ou (iv) ; R7

    em que: - um de R.7 e Rs é hidrogénio e o outro é -CH2OH ou -CH2OSO3H; - um de R9 e Rio é hidrogénio e o outro é -NHAc, -NH2 ou -NHSO3H; - um de Rn e R12 é hidrogénio e o outro é -OH ou -OSO3H; indica uma ligação em qualquer orientação estereoquímica; - * representa uma ligação directa a um átomo de hidrogénio ou uma parte A adjacente; e - ** representa uma ligação directa a uma parte A adjacente. ou um seu sal fisiologicamente aceitável; ou (B) o glicosaminoglicano ou o seu sal é uma heparina; ou (C) o glicosaminoglicano ou o seu sal é sulfato de condroitina A, sulfato de condroitina C, sulfato de condroitina D, sulfato de condroitina E, ácido hialurónico, sulfato de queratano ou sulfato de heparano; ou (D) usa-se o sal de sódio de heparina ou sulfato de heparina; ou (E) o glicosaminoglicano ou seu sal tem um peso molecular médio de 12 a 18 kd; ou (F) o glicosaminoglicano ou seu sal tem actividade anticoagulante; ou ΕΡ 1 549 337/ΡΤ 10/10 (G) ο glicosaminoglicano ou seu sal não foi submetido a fragmentação e/ou despolimerização; ou (H) a ADNase I tem a seguência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 ou é uma ADNase I com mais de 65% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2; (I) a ADNase I é ADNase humana de tipo I; ou (J) a ADNase I é uma ADNase I recombinante; ou (K) a razão entre a quantidade de glicosaminoglicano ou do seu sal e a quantidade de ADNase I administrada é de 5000:1 a 1:50 unidade a unidade; ou (L) a razão entre a quantidade de glicosaminoglicano ou do seu sal e a quantidade de ADNase I administrada é de 25:1 a 1:25.
20. 20. Nebulizador ou outro dispositivo de aerossol liquido, inalador de pó seco ou inalador com doseador compreendo uma composição compreendo: - um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável que tem um peso molecular médio de 8 a 40 kd; - uma ADNase I; e um excipiente, transportador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.
21. 21. Utilização de um glicosaminoglicano ou um seu sal fisiologicamente aceitável, tendo o glicosaminoglicano ou o seu sal um peso molecular médio de 8 a 40 kd para aumentar a actividade de uma ADNase I in vitro. Lisboa, 2014-11-10