PT1537204E - Granzima b como um indutor da apoptose em células tumorais dependente de hsp70/péptidos hsp70 - Google Patents
Granzima b como um indutor da apoptose em células tumorais dependente de hsp70/péptidos hsp70 Download PDFInfo
- Publication number
- PT1537204E PT1537204E PT03792414T PT03792414T PT1537204E PT 1537204 E PT1537204 E PT 1537204E PT 03792414 T PT03792414 T PT 03792414T PT 03792414 T PT03792414 T PT 03792414T PT 1537204 E PT1537204 E PT 1537204E
- Authority
- PT
- Portugal
- Prior art keywords
- cells
- hsp70
- granzyme
- cell
- tumors
- Prior art date
Links
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 title claims abstract description 133
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 title claims abstract description 133
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 67
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 title abstract description 65
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 title description 27
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 title description 4
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 title 2
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 title 2
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 title 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 title 1
- 101100507655 Canis lupus familiaris HSPA1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 167
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 162
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims abstract description 91
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 16
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 5
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 4
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 3
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 9
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 abstract description 8
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 abstract description 8
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 abstract description 7
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 54
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 22
- KLWPJMFMVPTNCC-UHFFFAOYSA-N Camptothecin Natural products CCC1(O)C(=O)OCC2=C1C=C3C4Nc5ccccc5C=C4CN3C2=O KLWPJMFMVPTNCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- VSJKWCGYPAHWDS-FQEVSTJZSA-N camptothecin Chemical compound C1=CC=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 VSJKWCGYPAHWDS-FQEVSTJZSA-N 0.000 description 18
- 229940127093 camptothecin Drugs 0.000 description 18
- VSJKWCGYPAHWDS-UHFFFAOYSA-N dl-camptothecin Natural products C1=CC=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)C5(O)CC)C4=NC2=C1 VSJKWCGYPAHWDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 16
- 108010040476 FITC-annexin A5 Proteins 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 11
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 10
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 description 9
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 9
- 101000971513 Homo sapiens Natural killer cells antigen CD94 Proteins 0.000 description 8
- 102100021462 Natural killer cells antigen CD94 Human genes 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 7
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 7
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 7
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 6
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 101710176159 32 kDa protein Proteins 0.000 description 5
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 5
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 5
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 5
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 5
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 5
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 4
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 3
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 3
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000004503 Perforin Human genes 0.000 description 3
- 108010056995 Perforin Proteins 0.000 description 3
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000018932 HSP70 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010027992 HSP70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000831567 Homo sapiens Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 2
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100024333 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000025164 anoikis Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UBOKASXZHPZFRZ-UHFFFAOYSA-N 2-phenyl-1h-indole-4,6-diamine Chemical compound N1C2=CC(N)=CC(N)=C2C=C1C1=CC=CC=C1 UBOKASXZHPZFRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038222 60 kDa heat shock protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000203022 Acholeplasma laidlawii Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 1
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000003930 C-Type Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090000342 C-Type Lectins Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 231100000023 Cell-mediated cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 206010057250 Cell-mediated cytotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 108010058432 Chaperonin 60 Proteins 0.000 description 1
- 206010013082 Discomfort Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000004265 EU approved glazing agent Substances 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102100021260 Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100028970 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Human genes 0.000 description 1
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000012215 HSC70 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010036652 HSC70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710113864 Heat shock protein 90 Proteins 0.000 description 1
- 102100034051 Heat shock protein HSP 90-alpha Human genes 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000726355 Homo sapiens Cytochrome c Proteins 0.000 description 1
- 101000894906 Homo sapiens Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001009603 Homo sapiens Granzyme B Proteins 0.000 description 1
- 101000986085 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101001043564 Homo sapiens Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020843 Hyperthermia Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 241000204028 Mycoplasma arginini Species 0.000 description 1
- 241000202938 Mycoplasma hyorhinis Species 0.000 description 1
- 241000202894 Mycoplasma orale Species 0.000 description 1
- 108010077432 Myeloid Differentiation Factor 88 Proteins 0.000 description 1
- 102000010168 Myeloid Differentiation Factor 88 Human genes 0.000 description 1
- 101100275485 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cox-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102100021923 Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 239000008156 Ringer's lactate solution Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 1
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 208000034615 apoptosis-related disease Diseases 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- ZEWYCNBZMPELPF-UHFFFAOYSA-J calcium;potassium;sodium;2-hydroxypropanoic acid;sodium;tetrachloride Chemical compound [Na].[Na+].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].CC(O)C(O)=O ZEWYCNBZMPELPF-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000005890 cell-mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000012303 cytoplasmic staining Methods 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 208000021045 exocrine pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000036031 hyperthermia Effects 0.000 description 1
- 230000008004 immune attack Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000002555 ionophore Substances 0.000 description 1
- 230000000236 ionophoric effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000001698 laser desorption ionisation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000031942 natural killer cell mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 208000014500 neuronal tumor Diseases 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 108091006084 receptor activators Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000000822 sequential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 102000015340 serglycin Human genes 0.000 description 1
- 108010050065 serglycin Proteins 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Chemical compound OC(=O)C(C#N)=CC1=CC=C(O)C=C1 AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464476—Heat shock proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6467—Granzymes, e.g. granzyme A (3.4.21.78); granzyme B (3.4.21.79)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/50—Colon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/07—Heat shock proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Mycology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
DESCRIÇÃO "GRANZIMA B COMO UM INDUTOR DA APOPTOSE EM CÉLULAS TUMORAIS DEPENDENTE DE HSP70/PEPTIDOS HSP70" A presente invenção refere-se a um método ex vivo de indução ou intensificação da expressão da granzima B em células assassinas naturais (NK). Além disso, a presente invenção refere-se à granzima B para utilização no tratamento de tumores, em que as células tumorais expressam Hsp70 na sua superfície celular.
Foi verificado que niveis citoplasmáticos elevados da proteína de choque térmico 70 (Hsp70) protegem as células tumorais contra a morte celular programada (Nylandsted et ai. (2000) Ann. New York. Acad. Sei. 926, 122). A Hsp70 é a principal forma induzível pelo stress da família das proteínas de choque térmico (HSP) que está localizada, principalmente, no citossol. Provas acumuladas durante os últimos anos demonstraram que as HSP localizadas extracelularmente e ligadas à membrana plasmática são altamente imunogénicas e expõem as células ao ataque imunitário (Schild et al. (1999) Current Opinion in
Immunology 11, 109). Após incorporação mediada por um receptor (Amold-Schild et al. (1999) J. Immunol. 162, 3757) e re-apresentação por células apresentadoras de antigénio (APC), os péptidos acompanhados pela HSP promovem uma resposta de células CD8+ T citotóxicas (Suto et al. (1995) Science 269, 1585). Foram identificados vários receptores, incluindo CD91 e receptores semelhantes a toll 2 e 4 (TLR2/4) que medeiam a 1 interacção de complexos de péptidos HSP90 (gp96), HSP70 (Hsp70, Hsc70) e HSP60 com APC (Basu et al. (2001) Immunity 14, 303;
Binder et al. (2000) Nat. Immunol. 1, 151; Sondermann et al. (2000) Biol. Chem. 381, 1165.; Ohashi et al. (2000) J. Immunol. 164, 558). Foi descrito um "efeito chaperocina" independente do péptido para membros do grupo HSP70. A ligação de HSP70 exógena a monócitos através de TLR2/4, numa via dependente de CD14, induz o agrupamento dos receptores e a secreção de citocinas proinflamatórias através da transdução de sinal MyD88/IRAK/NFk-B (Pfeiffer et al. (2001) Eur. J. Immunol. 31, 3153; Asea et al. (2000) Nature Medicine, 6, 435; Asea et al. (2000) Cell Stress &
Chaperones, 5, 425; Asea et al. (2002) J Biol Chem. 277(17), 15028) .
Foi verificado que as células assassinas naturais (NK) interagem especificamente com um epitopo da Hsp70 localizado no terminal C (Botzler et al. (1998) Cell Stress & Chaperones, 3, 6), que é apresentado na membrana celular de células tumorais (Multhoff et al. (1995) Int. J. Câncer, 61, 272; Multhoff et al. (1997) J. Immunol. 158, 4341). A quantidade de Hsp70 ligada à membrana em células tumorais correlaciona-se positivamente com a sensibilidade à lise mediada por células NK: Foi verificado que o stress físico (calor), assim como o químico (fármacos citostáticos) , aumentam a expressão da Hsp70 na superfície celular em células tumorais e, deste modo, tornando-as melhores alvos de células NK (Multhoff (1997) Int. J. Hyperthermia 13, 39; Botzler et al. (1999) Exp. Hematol. 27, 470; Rabinovich et al. (2000) J. Immunol. 165, 2390; Feng et al. (2001) Blood 97, 3505). A incubação de células NK purificadas com a proteína Hsp70 recombinante aumenta a sua actividade citolítica contra células tumorais positivas para a Hsp70 membranar (Multhoff et al. (1999) Exp. Hematology 27, 1627). É obtido o mesmo efeito 2 com um péptido com 14 aminoácidos, denominado TKD (TKDNNLLGRFELSG, aa450-463), derivado do domínio do terminal C da Hsp70. Esta região corresponde ao domínio da Hsp70 exposto ao ambiente extracelular das células tumorais viáveis (Multhoff et al. (2001) Cell Stress & Chaperones 6, 337). Concomitante com uma actividade citolítica aumentada, após contacto com a proteína Hsp70 ou com o péptido TKD da Hsp70, a expressão na superfície celular da forma de activação do receptor CD94 das lectinas do tipo C foi intensificada em células NK. Ensaios de bloqueio utilizando um anticorpo inibidor específico para o CD94 revelaram um envolvimento do CD94 na interacção de células NK com células tumorais positivas para a Hsp70 membranar (Multhoff et al. (1999) Exp. Hematology 27, 1627). Estes dados indicam que, para além dos péptidos líder apresentadores de HLA-E de alelos HLA clássicos (Lanier et al. (1998) Immunity 8, 693;
Braud et al. (1998) Nature 391, 795), a sequência peptídica TKD da Hsp70 localizada no Terminal pode ser considerada como um ligando potencial de um complexo activador do receptor CD94 ainda indefinido. Embora a observação anterior indique que o péptido Hsp70 funciona como uma estrutura de reconhecimento de um alvo selectivo para um tumor para células NK positivas para CD94 (Multhoff et al. (1997) J. Immunol. 158, 4341), permanece por elucidar o mecanismo pelo qual as células NK lisam as células alvo tumorais positivas para a Hsp70. Para além disso, é desejável desencadear, especificamente, a actividade lítica das células NK direccionada para células tumorais, de uma forma mais específica do que foi até aqui possível. Todos estes objectivos científicos servem como um meio para obter abordagens mais eficazes e mais especificas ao tratamento de doenças e, em particular, ao tratamento de tumores. 3
Foi descrito que a expressão à superfície de proteínas de choque térmico incluindo a Hsp70 ocorre também, após a infecção virai ou em resposta ao stress. Em particular, a Hsp70 membranar foi encontrada em células linfóides infectadas com HIV (Di Cesare et al. (1992), Immunology 76, 341) e em linhas celulares de coelho infectadas com HTLV (Chouchane et al. (1994), J. Infect. Dis. 169, 253) . De um modo semelhante, é concebível que as células infectadas por bactérias ou afectadas por inflamação expressem Hsp70 na sua superfície celular.
Consequentemente, a actividade lítica das células NK ou da granzima B pode ser direccionada para células infectadas por vírus ou bactérias assim como, para células afectadas por inflamação. 0 estado da técnica inclui também as divulgações seguintes:
Documento WO 99/49881: efeitos anti-tumorais de células NK sobre células tumorais expressando Hsp70 na superfície celular (exemplos 2 e 3)
Documento WO 01/80880: referência feita nas páginas 7 e 8 à produção de granzima B por células NK activadas.
Assim, o problema técnico subjacente à presente invenção foi proporcionar meios e métodos para um tratamento específico de doenças e, em particular, de tumores, infecções virais e bacterianas e doenças inflamatórias. A solução para o referido problema técnico é obtida proporcionando as formas de realização caracterizadas nas reivindicações. 4
Consequentemente, a presente invenção refere-se a um método ex vivo de indução ou de intensificação da expressão da granzima B em células assassinas naturais (NK) compreendendo fazer contactar células NK com (a) proteína Hsp70; (b) um fragmento (do terminal C) compreendendo a sequência de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG; (c) um (poli)péptido compreendendo a sequência de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG; ou (d) uma combinação de (a), (b) e/ou (c). A granzima B é uma protease de serina bem conhecida na técnica e é descrita como estando envolvida no processo de apoptose/morte celular programada (Berke (1995) Cell, 81 (1), 9-12; Froelich et al. (1998) Immunology Today, 19(1), 30-26);
Metkar S et al. Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore Information, Immunity 16 (2002), 417-428
Esta enzima promove a fragmentação de ADN por quebra de procaspases na sua forma activada e, deste modo, induz a morte celular programada por uma via inibível por Bcl-2. A granzima B inicia a indução do processo de apoptose na presença de uma célula alvo no citossol. O termo "células NK" ("células assassinas naturais") compreende linfócitos granulares grandes expressando CD45 na 5 superfície e apresentando actividade assassina sem estímulo prévio. Estas são particularmente caracterizadas por não expressarem CD3 ou o receptor α/β ou γ/δ de células T e poderem ser estimuladas pela interleucina 2.
As células NK estimuladas pelo método da invenção são, também, caracterizadas pelas propriedades seguintes: são aderentes a plástico transientes após a adição de IL-2 em quantidades de 10 a 10000 Unidades, e. g. de 100 I U, em que a IL-2 pode ser adquirida à empresa Chiron; a aderência tem efeito 3-18 horas após a adição de IL-2 a PBL recentemente isolados (linfócitos do sangue periférico esgotados por monócitos); as células NK apresentam uma expressão CDlôdim (valor médio da fluorescência fraco); as células NK expressam CD56 e CD57 como marcador NK típico; as células NK expressam CD94 (receptor de lectinas do tipo C de células assassinas) as células NK segregam após activação com Hsp70 e citocinas IFNgama; as células NK podem ser estimuladas pela adição de Hsp70, de fragmento da Hsp70 ou de péptido Hsp70 (proteína purificada) (crescimento e actividade citotóxica); 6 não estão dependente do tipo de MHC do doente.
De acordo com a invenção, podem também ser utilizadas outras populações de células NK. São conhecidos, na técnica, métodos adicionais para obter a referida população e incluem o isolamento utilizando esferas magnéticas e separação celular. No entanto, neste caso é um pré-requisito que estas possam ser activadas pela Hsp70 ou pelos fragmentos ou (poli)péptidos acima referidos. De acordo com a invenção, podem ser utilizadas células NK isoladas. É, além disso, possível utilizar misturas de células, tal como células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC) contendo células NK.
Numa forma de realização particularmente preferida do método ex vivo da invenção, são utilizadas células mononucleares do sangue periférico (PBMC) ou uma sua fracção que contenha células NK como suspensões fisiológicas de células.
As células NK podem ser obtidas a partir dos doentes a serem tratados ou de um dador saudável por recolha de sangue, utilizando métodos adequados. De um modo preferido, devem ser utilizadas camadas leucocitárias ou concentrados de linfócitos obtidos por outros meios contendo células NK.
As camadas leucocitárias ou os concentrados de linfócitos são recolhidos de doentes através das veias e, e. g.f é adicionada heparina para prevenir a coagulação das células. As camadas leucocitárias, às quais foi adicionada heparina, são recolhidas num recipiente estéril (normalmente sacos de plástico estéreis) e depois são centrifugadas, utilizando centrifugação de densidade de Ficoll, resultando numa acumulação de células sanguíneas (= PBMC, células mononucleares do sangue periférico, 7 e. g., linfócitos, monócitos, granulócitos e semelhantes). 0 concentrado de linfócitos permanece estéril em sacos de cultura estéreis.
As camadas leucocitárias contendo células mononucleares do sangue periférico são utilizadas sob a forma de uma suspensão celular fisiológica, de um modo preferido, com adição de heparina. A heparina previne a agregação das células.
No documento WO 9949881 foram descritos métodos de estimulo de células NK por incubação com proteínas Hsp70 ou seus fragmentos do terminal C. Surpreendentemente, foi verificado que a expressão da granzima B é induzida ou intensificada em células NK fazendo contactar as referidas células com a proteína Hsp70, um seu fragmento compreendendo a sequência de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG, um (poli)péptido compreendendo a sequência de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG ou com uma combinação das referidas proteínas/(poli)péptidos, de um modo preferido, em combinação com IL-2. De um modo preferido, o fragmento referido acima e em relação com outras formas de realização (preferidas) da invenção é um fragmento do terminal carboxilo (terminal C) da Hsp70.
De acordo com a invenção, o termo "proteína Hsp70" refere-se a proteínas de choque térmico (HSP) eucariotas. A expressão das referidas HSP pode ser induzida por calor mas também por vários outros reagentes, tais como, e. g, .análogos de aminoácidos, metais pesados, ionóforos ou citotoxinas, em que o factor de aumento da expressão através de indução é, pelo menos, 5, em comparação com a expressão constitutiva. A sequência de aminoácidos completa foi publicada em Milner et al. (1990) Immunogenetics 32(4), 242-251.
De acordo com a invenção, o termo "fragmento" da proteína Hsp70 compreende, também, (poli)péptidos que apresentam uma sequência de aminoácidos da gama de aminoácidos 384-641 da Hsp70 humana. Todos os fragmentos do terminal C (terminal carboxilo) compreendem, pelo menos, a sequência de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG. São conhecidos na técnica métodos para o isolamento dos (poli)péptidos correspondentes e são particularmente descritos no exemplo 1 em anexo. Deste modo, o especialista na técnica é também capaz de produzir fragmentos a partir do fragmento 384-641 acima referido, por técnicas recombinantes sem complicações adicionais (em Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2. edição 1989, CSH Press, Cold Spring Harbor, N.I., são descritos métodos padrão para esta finalidade) e testá-los para as propriedades de activação pretendidas. 0 termo (poli)péptido refere-se a péptidos assim como a polipéptidos (proteínas). De acordo com o entendimento convencional, os péptidos compreendem até 30 aminoácidos enquanto os polipéptidos consistem em mais de 30 aminoácidos. Esta convenção é também utilizada de acordo com a invenção. Além disso, de acordo com a invenção, os aminoácidos ao longo da descrição são designados por um código de uma letra.
Numa alternativa os (poli)péptidos compreendendo a sequência de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG são (poli)péptidos consistindo na sequência de aminoácidos representada e opcionalmente, nas suas porções de aminoácidos adicionais derivados do terminal N e do terminal C da Hsp70, fundidos com sequências de aminoácidos adicionais seleccionadas aleatoriamente ou de ocorrência natural. Assim, o método ex vivo da presente invenção refere-se ao estímulo de células NK por 9 proteínas de fusão compreendendo a sequência do péptido Hsp70 14-mero.
Uma forma de realização preferida da invenção refere-se a um método ex vivo em que a proteína Hsp70, o seu fragmento (terminal C), o (poli)péptido compreendendo a sequência de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG ou a sua combinação estão num estado não complexado.
As HSP são conhecidas na técnica por ocorrerem em complexos com um grande número de diferentes péptidos substrato (Tamura et al. (1997) Science, 278, 117-223). No entanto, foi surpreendentemente verificado que as proteínas de choque térmico, os seus fragmentos (terminal C) ou derivados daí derivados (ver acima) induzem actividades imunológicas através da activação de células NK, mesmo se estas não formarem complexos com péptidos.
Deste modo, de acordo com os métodos descritos no documento WO 9949881, o especialista na técnica é capaz de estimular células NK utilizando a proteína ou o (poli)péptido Hsp70 compreendendo a sequência de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG num estado não complexado. É contemplada a injecção da Hsp70, de um fragmento da Hsp70 ou de um péptido da Hsp7 0 em doentes para o estímulo in vivo de células NK para produzir granzima B.
Nas formas de realização da invenção os métodos são realizados ex vivo ou in vitro. 10
Este método compreende o isolamento de células NK ou de uma população de células compreendendo células NK, como aqui descrito acima, em que uma suspensão celular fisiológica contendo células NK é misturada com a proteína Hsp70, com o seu fragmento do terminal C ou um seu derivado ou com uma proteína/(poli)péptido compreendendo a sequência de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG e é incubada para induzir ou intensificar a expressão da granzima B nas células NK. A incubação pode realizar-se, e. g., numa incubadora, à temperatura fisiológica (37 °C) num agitador (agitação suave), em CO2 a 5% + atmosfera humidificada a >80% mantendo também, de qualquer outra forma, as condições fisiológicas que permitem a sobrevivência das células NK. É contemplada a reinfusão das células NK, de um modo preferido, autólogas e/ou alogénicas com expressão de granzima B induzida ou intensificada num mamífero.
Logo que as células NK sofrem um tratamento in vitro ou ex vivo para induzir ou intensificar a expressão da granzima B, estas são reinfundidas num doente. A reinfusão pode ser realizada utilizando equipamento médico normal. Por exemplo, a reinfusão de células NK ou PBMC contendo células NK pode ser i.v., i. p., s. c. ou intratumoral. O mamífero pode ser um humano.
Numa outra forma de realização preferida do método ex vivo da invenção, o referido contacto das células NK com a proteína Hsp70, com o seu fragmento (terminal C) ou com um seu derivado ou uma proteína/(poli)péptido compreendendo a sequência de 11 aminoácidos TKDNNLLGRFELSG é realizado durante, pelo menos, 12 horas. De acordo com uma nova forma de realização preferida o referido contacto é realizado durante, pelo menos, 4 dias.
Numa outra forma de realização preferida a presente invenção refere-se a um método ex vivo em que as referidas células NK são obtidas, antes do referido contacto, a partir de células da medula óssea incubando as referidas células da medula óssea com interleucina 15 (IL-15) e factor de célula estaminal (SCF) em concentrações de 1 ng/mL - 1000 ng/mL por citocina durante, pelo menos, 7 dias até 4 meses.
Esta forma de realização preferida da invenção permite o isolamento de novo de células NK após o estímulo de células de medula óssea com as citocinas denominadas. As células NK obtidas desta forma apresentam os marcadores típicos de células NK, aqui referidos acima. A concentração preferida de citocinas está na gama de 100 ng/mL de cada citocina. Após estímulo com as citocinas e diferenciação em células NK que apresentam CD94 e CD56 na sua superfície, pode continuar o contacto destas células com a proteína Hsp70 ou com o fragmento do (poli) péptido acima referido ou com a combinação do acima como, aqui anteriormente referido.
De acordo com a invenção, quando aplicável, as preparações farmacêuticas são definidas como substâncias e preparações de substâncias que, quando utilizadas externamente ou internamente no corpo humano, se destinam a curar, aliviar, prevenir ou reconhecer doenças, insuficiências; defeitos físicos ou desconfortos patológicos. 12
Opcionalmente, as referidas composições farmacêuticas compreendem, além disso, um veiculo, diluente ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. São conhecidos do especialista na técnica exemplos de veículos adequados farmaceuticamente aceitáveis (toleráveis) e compreendem, por exemplo, soluções salinas tamponadas com fosfato, água, emulsões, tais como emulsões de óleo/água, soluções estéreis e semelhantes. As composições farmacêuticas (preparações farmacêuticas) contendo esses veículos podem ser preparadas de acordo com métodos comuns. As composições farmacêuticas podem ser administradas aos respectivos indivíduos numa dosagem adequada. As vias de administração são, por exemplo, intravenosa (i. v.), intraperitoneal (i. p.), intratumoral, subcutânea (s. c.), intramuscular (i. m.), tópica ou intradérmica. A dosagem depende de muitos factores, e. g., do tamanho, sexo, peso, idade do doente, assim como do tipo de composição especialmente administrada, do tipo administração e semelhantes. As composições podem ser administradas localmente ou sistemicamente. Geralmente, a administração é realizada parentericamente.
As preparações para administração parentérica incluem soluções aquosas ou não-aquosas, suspensões e emulsões estéreis. 0 propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, tais como azeite e ésteres orgânicos injectáveis, tais como oleato de etilo são exemplos de solventes não-aquosos. Os veículos aquosos incluem água, soluções, emulsões ou suspensões aquosas, incluindo salinas tais como NaCl a 0,9%, tamponada com fosfato, X-vivo 20, etc. e meios tamponados. Os veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose, dextrose e cloreto de sódio de Ringer ou com lactato de Ringer. Os veículos 13 intravenosos incluem regeneradores de fluidos e nutrientes, regeneradores eletrólitos (tais como os baseados na dextrose de Ringer) e semelhantes. Podem estar também presentes conservantes e outros aditivos, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes guelantes e gases inertes e semelhantes. Além disso, a composição farmacêutica da invenção pode compreender agentes adicionais, tais como interleucinas ou interferões dependendo da utilização pretendida da composição farmacêutica. A invenção refere-se também à granzima B para utilização no tratamento de tumores independente da perforinas in vivo. Os referidos tumores mais preferidos são seleccionados de um grupo consistindo em cancro do estômago, gástrico, colorectal, pâncreas, mamário, do pulmão, ginecológico, da cabeça e do pescoço, dermatológico (e. g., melanoma), tumores neuronais, leucemia e linfoma.
Os tumores a serem tratados expressam Hsp 70 na superfície celular. São conhecidos na técnica métodos para a detecção da expressão da Hsp70 à superfície e compreendem métodos histológicos, citometria de fluxo, etc.
Em contraste com a especulação da técnica anterior, pode ser demonstrado de acordo com a presente invenção que a granzima B é eficaz no tratamento de tumores independente da via das perforinas. Isto tem aplicações importantes na estratégia de tratamento de tumores uma vez que a incorporação do composto farmaceuticamente activo pode ser agora concebida de um modo independente da via das perforinas. A granzima B pode ser administrada intratumoralmente, iv, subcutaneamente. 14
Numa forma de realização preferida da presente invenção, a granzima B é utilizada como o único componente farmaceuticamente activo na referida composição farmacêutica.
Novamente, esta forma de realização preferida da invenção tem implicações importantes na concepção dos componentes necessários da composição farmacêutica a ser utilizada no tratamento de cancros. De um modo importante, não existe qualquer necessidade de incluir farmaceuticamente ingredientes activos adicionais na composição farmacêutica para tratar eficazmente tumores e/ou reduzir o tamanho dos tumores ou para tratar infecções virais ou bacterianas ou doenças inflamatórias. É contemplado um método para tratar tumores, infecções virais ou bacterianas ou doenças inflamatórias compreendendo os passos de: (a) fazer contactar as células NK com células tumorais contendo Hsp70 na sua superfície ou células afectadas pela referida infecção ou inflamação e contendo Hsp70 na sua superfície; (b) permitir a entrada da granzima B nas referidas células através de canais de iões formados pela referida Hsp70 na superfície celular do tumor; e (c) permitir às referidas células entrarem em apoptose em consequência da actividade enzimática da granzima B.
Como uma alternativa, a granzima por pode ser aplicada directamente, em vez de ser expressa por células NK estimuladas. Nesse o caso é contemplado um método para tratar tumores, 15 infecçoes virais ou bacterianas ou doenças inflamatórias compreendendo os passos de: (a) fazer contactar as células tumorais contendo Hsp70 na sua superfície ou células afectadas pela referida infecção ou inflamação e contendo Hsp70 na sua superfície com granzima B; (b) permitir a entrada da granzima B nas referidas células através de canais de iões formados pela referida Hsp70 na superfície celular; e (c) permitir às referidas células entrarem em apoptose em consequência da actividade enzimática da granzima B.
As gamas de células tumorais ou de células afectadas pela referida infecção ou inflamação e as concentrações de granzima B, assim como as gamas de tempo de contacto entre a granzima B e as células tumorais ou as células afectadas pela referida infecção ou inflamação podem ser obtidas pelo especialista na técnica estudando os ensinamentos da invenção referidos acima.
Numa forma de realização preferida deste método da invenção, a granzima B é administrada numa concentração final de 1 pg/mL a 500 pg/mL.
Numa outra forma de realização preferida deste método da invenção, a granzima B é administrada numa concentração final de 1 ng/mL a 10 ng/mL. É mais preferido que granzima B seja administrada numa concentração final de cerca de 6 ng/mL. Neste sentido é importante observar que são mais preferidos modos de administração que distribuam estas concentrações de granzima B 16 directamente às células tumorais ou às células afectadas pela referida infecção ou inflamação.
Numa outra forma de realização preferida da presente invenção a granzima B é distribuida/empacotada num lipossoma. A encapsulação de compostos farmaceuticamente activos em lipossomas está bem estabelecida na técnica.
As figuras mostram: A figura 1 mostra a identificação da granzima B como o parceiro interactivo para a proteína Hsp70 e para o péptido TKD da Hsp70.
Fig. IA: Foram incubadas colunas de proteína Hsp70 (Hsp70), albumina de soro bovino (BSA) e péptido (TKD) da Hsp70 com lisados celulares da linha YT de células NK ou com a linha K562 de células não NK. As proteínas ligadas foram eluídas das colunas em 5 fracções (F1 - F5), foram separadas numa SDS-PAGE. Após coloração de prata, os eluídos das células YT derivadas de colunas Hsp70 e TKD, revelaram uma banda de proteína com 32 kDa dominante nas fracções dois (F2) e três (F3). Não foi detectável qualquer banda de proteína com 32 kDa em eluídos YT derivados de colunas de BSA e em eluídos K562 derivados de colunas de TKD. A posição da banda com 32 kDa é indicada com uma seta.
Fig. 1B: Os péptidos triptícos da banda v 32 kDa colorada com azul de Coomassie da fracção 3 (F3), derivados da
coluna de TKD, correspondem à granzima B humana. A 17 probabilidade de identificação foi de 100% e a pontuação Z prevista foi de 1,89 correspondente a uma confiança >95%.
Fig. 1C: Análise de transferência de Western correspondente de eluídos de células YT e K562 (F3) após incubação com colunas de proteína Hsp70 (Hsp70) e de péptido (TKD) da Hsp70. A transferência foi autorradiografada e a localização da granzima B foi visualizada por imunocoloração com o mAb 2C5 específico para a granzima B. Os eluídos de células YT (esquerda), mas não de células K562 (direito) revelaram una banda de proteína granzima B com 32 kDa.
Fig. 1 D: Citometria de fluxo intracelular de células YT permeabilizadas (esquerda) e células K562 (direita) utilizando o anticorpo monoclonal HC2-PE específico para a granzima B conjugado com ficoeritrina (PE) (linha contínua), em comparação com um anticorpo correspondente ao isotipo de controlo negativo (linha tracejada). Apenas as células de YT, mas não as células de K562, contêm granzima B citoplasmática. A figura 2 mostra a ligação específica na superfície celular e a incorporação da granzima B (grB) por células tumorais positivas para a Hsp70 membranar
Fig. 2 A: Ligação comparativa da granzima B (2 pg/mL) à superfície celular de células tumorais CX+/Cx- e C0I0+/C0I0- a 4 °C e incorporação no citossol após uma variação de temperatura para 37 °C, durante 30 min, utilizando anticorpo monoclonal HC2-PE específico para 18
a granzima B conjugado com ficoeritrina (PE). Primeira linha, microscopia óptica, segunda linha, imunofluorescência das células sem granzima B (controlo); terceira linha, imunofluorescência das células após adição de granzima B, como especificado (grB) . É ilustrada uma microscopia de fluorescência representativa de três apresentando resultados idênticos; ampliação 40 x.
Fig. 2 B: Citometria de fluxo intracelular de células tumorais CX+/CX- (n = 2) e C0I0+/C0I0- (n = 4) permeabilizadas utilizando anticorpo monoclonal HC2-PE específico para a granzima B antes (linha tracejada) e após (linha contínua) incubação das células tumorais com granzima B 1 pg/mL, 2 pg/mL, 4 pg/mL a 3 7 °C durante 30 min Apenas as células CX+ e C0I0+, mas não as CX- e Colo- apresentaram um deslocamento dependente da dose do pico da granzima B para a direita, indicando a incorporação da granzima B proporcionada extracelularmente. A figura 3 mostra uma experiência em que a apoptose é induzida selectivamente pela granzima B (grB) isolada em células tumorais positivas para a Hsp70 membranar
Fig. 3 A: Percentagem de células CX+/C0I0+ (esquerda) e CX-/C0I0- (direita) positivas para a Anexina V-FITC e negativas para o iodeto de propídio (PI), não tratadas (barras pretas) ou após incubação com camptotecina (4 pg/mL; barras cinzentas claras) ou com granzima B (6 ng/mL; barras cinzentas escuras) durante 4 h, 12 h e 24 h. Os dados representam as médias de três a quatro 19 experiências independentes ± desvio padrão; * indica valores significativamente diferentes do controlo (p < 0,05) .
Fig. 3 B: Uma análise de citometria de fluxo representativa de células CX+ e CX- coradas positivamente com Anexina V-FITC e negativamente com iodeto de propídio (PI), não tratadas (controlo) ou após incubação com granzima B (grB) durante 24 h. A percentagem de células coradas positivamente com Anexina V-FITC é proporcionada em percentagem no canto inferior direito de cada gráfico.
Fig. 3 C: Análise de microscopia óptica de crescimento aderente de agrupamentos de células tumorais CX+/CX- e C0I0+/C0I0- não tratadas (controlo) ou após tratamento com camptotecina (cam, 4 pg/mL) ou granzima B (grB, 10 ng/mL), durante 24 h. A barra de escala indica 100 pm.
Fig. 3 D: Em paralelo, foram coradas com DAPI células CX+/CX- e C0I0+/C0I0- (24 h) quer não tratadas (controlo), quer tratadas com camptotecina (cam) ou granzima B (grB). Foi observada fragmentação considerável do ADN nuclear em todas as sublinhas de tumores após incubação com camptotecina (painel do meio). Após incubação apenas com granzima B as células CX+ e C0I0+ apresentaram fragmentação do ADN nuclear (painel inferior, esquerdo). Não foi observado qualquer sinal de apoptose em células CX- e Colo- após incubação com granzima B (painel inferior, direito). A barra de escala representa 10 pm. 20 A figura 4 mostra uma experiência em que é demonstrada a morte de células tumorais positivas para a Hsp70 membranar. A apoptose mediada por células NK positivas para granzima B é bloqueável por mAb especifico para a Hsp70.
Fig. 4 A: Microscopia óptica (ampliação 20 x) de colónias de células CX+ positivas para a Hsp70 membranar e CX-negativas para a Hsp70 membranar, não tratadas (controlo) ou após uma co-incubação de 12 h com células NK estimuladas com o péptido TKD da Hsp70 (+NK) . A proporção entre o efector e a célula alvo (E:T) foi de 20:1. A barra de escala representa 200 pm, a inserção no canto inferior direito de cada gráfico mostra uma colónia de células representativa, ampliação 2,5 x.
Fig. 4 B: Foi quantificada a morte celular de células alvo tumorais CX+/C0I0+ (painel esquerdo) e CX-/C0I0- (painel direito) por células NK ingénuas (NK dO) e estimuladas com o péptido TKD da Hsp70 (NK d3) em ensaios de libertação de 51Cr. Os niveis de granzima B intracelular em células NK ingénuas (NK dO) versus células NK estimuladas com TKD (NK d3) foram aumentados 1,4 vezes; concomitantemente, a lise das células CX+ foi elevada 1,5 vezes, a das células C0I0+ 2,0 vezes em diferentes proporções entre o efector e o alvo. A lise de células tumorais CX- e
Colo- permaneceu não afectada.
Além disso, a actividade citolitica aumentada das células NK estimuladas com TKD (NK d3 Hsp70 mAb) contra as células CX+ e C0I0+ foi completamente 21 inibida pelo anticorpo especifico para Hsp70 até ao nível da lise de células tumorais negativas para a Hsp70 membranar (inibição de 1,7 vezes, linha tracejada). A citotoxicidade foi determinada em proporções E:T variando entre 2:1 e 20:1; a libertação espontânea de cada célula alvo foi inferior a 10%. Os dados representam as médias de três experiências independentes ± desvio padrão.
Exemplos
Os exemplos seguintes ilustram a invenção. Estes exemplos não devem ser interpretados como limitantes: os exemplos são incluídos para finalidade de ilustração.
Exemplo 1 Materiais e Métodos Células A linha YT de células NK foi cultivada em densidades celulares variando entre 0,1 - 0,5 x 106 células/mL de meio RPMI-1640 (Life Technologies, Eggenstein, Alemanha) contendo soro de vitelo fetal a 10% (FCS, Life Technologies, Eggenstein, Alemanha) inactivado por calor suplementado com L-glutamina 6 mM e antibióticos (penicilina 100 IU/mL e estreptomicina 100 pg/mL; Life Technologies). As células NK aderentes ao plástico transientes foram derivadas de camadas leucocitárias de voluntários humanos saudáveis. Foram cultivadas células mononucleares do sangue periférico (PBMC) separadas com Ficoll em rIL-2 (100 IU/mL, Chiron, Frankfurt, Alemanha), durante 12 h. 22
Após selecção de aderência de linfócitos do sangue periférico esgotados em monócitos de acordo com um método modificado de
Vujanovic (Vujanovic et al. (1993) Cell. Immunol. 151, 133), as células foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com o péptido TKD da Hsp70 (2 pg/mL) durante 3 dias.
As sublinhas de tumor humano CX+/CX- e C0I0+/C0I0- foram derivadas por separação celular de linhas celulares de carcinoma CX-2 do cólon (positivas para a Hsp70: 60%) e Colo357 do pâncreas (positivas para a Hsp70: 70%) utilizando o anticorpo monoclonal C92F3B1 especifico para Hsp70, de acordo com um protocolo anteriormente descrito (Multhoff et al. (1997) J Immunol. 158, 4341). Consequentemente, as CX+ e CX- são autólogas, tal como são as C0I0+ e Colo-. As sublinhas CX+ de carcinoma com expressão elevada de forma estável de Hsp70 (positivas para a Hsp70: 80%) e C0I0+ (positivas para a Hsp70: 85%) diferem significativamente das células de carcinoma CX- (positivas para a Hsp70: 25%) e Colo- (positivas para a Hsp70: 35%) com expressão baixa de forma estável da Hsp70.
As sublinhas de carcinoma CX+/C0I0+ e CX-/C0I0-, que diferem no que respeita à sua expressão membranar da Hsp70, mas que apresentam expressão idêntica da classe MHC I e a linha celular leucémica K562 não-NK foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com FCS a 5%, L-glutamina 6 mM e antibióticos. Foram utilizadas células tumorais crescendo exponencialmente (dia 1 após a passagem das células) para tratamento com granzima B, camptotecina e como alvos em ensaios de citotoxicidade. 23
Todas as linhas celulares foram rastreadas regularmente para contaminações com micoplasmas por um imunoensaio com enzima detectando M. arginini, M. hyorhinis, A. laidlawii e M. orale (Roche, Mannheim, Alemanha). Foram utilizadas apenas linhas celulares isentas de micoplasmas.
Cromatografia de afinidade e imunoprecipitação
Foram incubados albumina de soro bovino (BSA, 1 mg/mL, Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha), proteína Hsp70 humana recombinante liofilizada 1 mg/mL, (Stressgen, Columbia Britânica, Canadá) ou péptido TKD da Hsp70 2 mg/mL (TKDNNLLGRFELSG, aa45o-463/· Bachem, Bubendorf, Suíça) com esferas de agarose AminoLink equilibradas (Furam, Rockford, EUA) em 2 mL durante 6 h, em conjunto com o redutor NaCNBH3. A capacidade de ligação da BSA, da proteína Hsp70 e do péptido TKD da Hsp70 foi superior a 95%. Após a remoção do material não ligado por lavagem abundante com tampão Tris e extinção dos grupos não-reactivos, os lisados celulares foram aplicados a colunas conjugadas com BSA, proteína Hsp70 e péptido TKD da Hsp70 durante 1 h.
Após lavagem com 10 volumes de coluna de tampão Tris 20 mM, as proteínas ligadas foram eluídas com cloreto de sódio 3 M em tampão Tris 20 mM, em 5 fracções. Cada fracção foi submetida a uma SDS-PAGE a 10% e foi transferida para membranas de PVDF. 24
Preparação da membrana A purificação da membrana foi realizada por homogeneização dounce de 50 x 106 células em tampão hipotónico, isento de EDTA contendo o inibidor de protease PMSF, seguida por centrifugação sequencial a 1000 g durante 5 min e a 100000 g, a 4 °C, durante 60 min. O sedimento contendo membranas foi ressuspenso em 2 mL de NaCl 0,3 M em tampão de Tris 50 mM, NP40 a 0,5%, pH 7,6.
Análise de transferência de Western
Após bloqueio em leite desnatado (0,1%) e incubação com o mAb 2C5 dirigido contra a granzima B (IgG2a, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha), a 4 °C, durante 5 h, as transferências de Western foram lavadas e foram incubadas com um Ab secundário de murganho anti-IgG HRP (Dianova, Hamburgo, Alemanha), durante 1 h. As proteínas foram detectadas utilizando o kit ECL (Amersham Bioscience) durante 5 segundos.
Identificação da proteína por impressão digital de massa de péptido
Foi cortada a proteína Hsp70 e a banda de proteína com 32 kDa do péptido TKD da Hsp70 precipitada a partir de géis colorados com azul de Coomassie, foi digerida com tripsina e foi dessalinizada utilizando pontas ZIP de fase reversa (Millipore, Eschbom, Alemanha). As amostras foram embebidas em ácido 4-hidroxi-a-ciano-cinâmico e as massas do péptido foram determinadas com um espectrómetro de massa Perseptive Voyager DePro MALDI-TOF (Ionização de Dessorção de Laser Assistida por 25
Matriz - Tempo de Voo) no modo reflectivo. Foi compilada uma lista de picos com o software m/z (Proteometrics) e foi utilizada para a selecção de picos; a impressão digital de massa do péptido resultante foi utilizada para pesquisar a base de dados não-redundante de proteínas NCBI utilizando o motor de busca Profound (Proteometrics). A granzima B foi identificada com uma probabilidade de 100% e confiança >95%.
Citometria de fluxo
Foram fixadas células (0,5 x 106) em paraformaldeído (PFA a 1% em PBS) durante 10 min e foram permeabilizadas em PBS contendo BSA (0,5%), NaN3 (0,1%) e saponina (0,1%). Depois, as células permeabilizadas foram incubadas com o anticorpo monoclonal HC2-PE conjugado com ficoeritrina para a granzima B (IgGl; Hõlzel Diagnostika, Colónia, Alemanha ou com um anticorpo IgGl de controlo, correspondente ao isotipo, a 4 °C durante 1 h, no escuro. Após lavagem as células foram analisadas num instrumento FACSCalibur (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha) .
Tratamento
Foram diluídas soluções de armazenamento de camptotecina (4 mg/mL, Sigma, Munique, Alemanha) em DMSO e foram armazenadas a 4 °C no escuro. Granzima B (6 ng/mL, Hõlzel Diagnostics, Colónia, Alemanha) as soluções foram preparadas de novo, directamente antes da utilização. Foram incubadas células em crescimento exponencial (0,5 - 1,5 x 106/mL) com camptotecina numa concentração final de 4 pg/mL ou com granzima B purificada, 26 enzimaticamente activa (10 ng/mL, 1 pg/mL, 2 pg/mL; 4 pg/mL) (Shi et ai. (2000) Methods in Enzymology 322, 125), durante 10 min e 30 min a 4 °C ou a 37 °C. A ligação e a incorporação foram determinadas em células tumorais não-permeabilizadas e permeabilizadas após lavagem em meio RPMI-1640 por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência num microscópio de rastreio Axioscop 25 (Zeiss, Jena, Alemanha) equipado com uma objectiva 40x filtros e padrão. As imagens foram tratadas por sombreamento de correcção multiplicativo utilizando o software Axiovison (Zeiss Vison, Jena, Alemanha). A Granzima B foi visualizada a vermelho utilizando o anticorpo HC2-PE. A morte celular apoptótica foi determinada após a incubação de células tumorais com 6 ng/mL de granzima B durante 4 h, 12 h e 24 h a 37 °C e lavando com meio RPMI-1640 através de diferentes ensaios de apoptose, como descrito abaixo. Ensaios de apoptose
Coloração com Anexina V-FITC: Resumidamente, as células foram lavadas duas vezes em tampão Hepes contendo CaCl2 5 mM e foram incubadas com Anexina V-FITC (Roche) durante 10 min à temperatura ambiente. As células coradas positivamente com
Anexina V-FITC foram medidas num citómetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha). Coloração DAPI: Foram incubadas células fixadas com metanol/acetona (0,1 x 106 células/100 pL) com 4,6-diamino-2-fenilindole (DAPI) 0,5 pg/pL em PBS/glicerol (3: 1), durante 15 min no escuro. Após lavagem em PBS as células foram montadas com Meio de Montagem Fluorescente (Dako, Glostrup, Dinamarca) e depois foram analisadas para fluorescência utilizando um microscópio de rastreio Zeiss modelo Axioscop 2 (Zeiss Jena, Alemanha) equipado com uma objectiva de 40 x e filtros padrão. A apoptose foi visualizada com coloração com DAPI em 50 células, cada. As imagens foram tratadas por sombreamento de correcção 27 multiplicativo utilizando o software Axiovision (Zeiss Vision Jena, Alemanha).
Libertação do citocromo c: Foi determinada a libertação de citocromo c utilizando um imunoensaio quantitativo (DCDCO, R&D Systems, Wiesbaden, Alemanha). Resumidamente, foram lavadas células CX+ e CX não tratadas ou tratadas com camptotecina (4 pg/mL) ou granzima B (6 ng/mL) (1,5 x 106/mL) em PBS e foram tratadas com tampão de lise durante 1 h à temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram removidos após centrifugação a 1000 g durante 15 min e foram utilizados 200 pL de uma diluição a 1:100, 1:250 e 1:500 para uma ELISA em sanduíche. A reacção foi inactivada após incubação com solução de substrato no escuro durante 3 0 min. A densidade óptica de cada poço foi determinada num leitor ELISA a 450 nm. A quantidade de citocromo c foi determinada de acordo com uma curva de calibração.
ELISPOT de Granzima B
Foi comparada a libertação de granzima B entre células NK não-estimuladas (NK dO) e células NK estimuladas com TKD (NK d3) após um período de 4 h de co-incubação com as linhas de células tumorais CX+/CX- e C0I0+/C0I0-, em diferente proporções entre efector e células alvo (E: T) variando entre 20:1 e 2:1. Foi utilizado um kit ELISPOT (N° 552572, BD, Heidelberg, Alemanha) na detecção da granzima B. Resumidamente, foram revestidas placas ELISPOT (MAIPN45, Millipore) de 96 poços, durante a noite, a 4 °C com o anticorpo de captura, foram bloqueadas com meio de cultura RPMI-1640 contendo FCS a 10% e foram incubadas com células tumorais e efectoras durante 4 h, a 37 °C, como especificado anteriormente. Após lavagem em água desionizada e 28 tampões de lavagem A e B, foi adicionado anticorpo anti-granzima B biotinilado (2 pg/mL) durante 2 h. Após outros dois passos de lavagem a granzima B foi visualizada por adição de avidina-peroxidase de rábano recentemente preparada (2 h) e solução de substrato (período de incubação de 25 min). As manchas foram contadas automaticamente utilizando o ImmunoSpot Series I Analyzer.
Ensaio de libertação de 51Cr e ensaio de inibição
Foi medida a citotoxicidade mediada por células utilizando um ensaio de 12 h com o isótopo radioactivo 51 Foram utilizadas as sublinhas de carcinoma do cólon CX+
CX- como células alvo. Foram utilizados o mAb C92F3B1 e um anticorpo de controlo correspondente ao isotipo (IgGl) numa concentração final de 5 pg/lx 106 células nos estudos de bloqueio. Após a incubação das células alvo CX+ e CX- com os anticorpos durante 30 min a 4 °C, as células foram marcadas com 51Cr e foi realizado o ensaio de citotoxicidade, como descrito por MacDonald (MacDonald et al. (1974) J. Exp. Med. 140, 718). A percentagem da lise específica foi calculada como: [(libertação experimental - libertação espontânea)/(libertação máxima libertação espontânea)] x 100.
Exemplo 2 A granzima B é vim parceiro interactuante da proteína de choque térmico 70 completa (Hsp70) e do péptido TKD da Hsp70
Foram identificadas proteínas parceiras por cromatografia de afinidade com proteína Hsp70 humana imobilizada (1 mg) ou um 29 péptido com 14 aminoácidos, designado TKD (TKDNNLLGRFELSG, aa450-463 f 2 mg) , contendo o epitopo extracelular da Hsp70 que revelou mediar a interacção com células NK. Este péptido foi anteriormente identificado como o epitopo (Reineke et al. (1996)
Immunobiol. 196, 96) de um anticorpo específico para a Hsp70 (Welch e Suhan (1986) J. Cell. Biol. 103, 2035) que detecta, especificamente, Hsp70 ligada à membrana em células tumorais viáveis (Multhoff et al. (1995) Int. J. Câncer 61, 272; Multhoff et al. (1995) Blood 86, 1374). Foi fraccionado um lisado celular da linha YT de células NK (Drexler et al. (2000) Leukemia 14, 777) em colunas de Hsp70 ou de péptido TKD imobilizados. O material ligado às colunas foi eluído com cloreto de sódio 3 M em cinco fracções. Foram administrados lisados celulares de YT a veículos ou a colunas conjugadas com BSA como controlos. Além disso, foi fraccionado o lisado de uma linha células não-NK (K562) numa coluna de afinidade conjugada com TKD. As fracções eluídas foram separadas por SDS-PAGE (10%) e foram visualizados por coloração com prata. Foi observada uma banda de proteína dominante com um peso molecular aparente de 32 kDa nas fracções dois (F2) e três (F3) de eluídos de células YT derivados da coluna de proteína Hsp70 (Hsp70) e de péptido (TKD) da Hsp70 (Figura IA, YT) . Esta banda não foi observada em eluídos de colunas de sepharose não conjugadas (dados não apresentados) ou colunas conjugadas com BSA nem no material eluído a partir das colunas de afinidade TKD carregadas com lisados de células K562 (Figura IA,). Foram obtidos resultados idênticos com colunas de proteína Hsp70 (dados não apresentados). Em paralelo, foram separados os eluídos do péptido TKD da Hsp70 e da proteína Hsp70 derivada da fracção 3 (F3) por SDS-PAGE e foram corados com azul de Coomassie. A banda da proteína de 32kDa derivada da F3 da coluna do péptido Hsp70 foi cortada e foi digerida com tripsina (Figura 1B) . Os péptidos resultantes foram analisados 30 por impressão digital de massa de péptido MALDI-TOF. A sequência dos péptidos trípticos apresentou uma homologia de 100% com a granzima B com um valor Z estimado de 1,89, indicando uma probabilidade superior a 95% para a granzima B (Figura 1B) . A identidade da banda de proteína com 32 kDa como granzima B foi confirmada adicionalmente por análise de transferência de Western, utilizando o anticorpo 2C5 (IgG2a) específico para a granzima B: os eluídos de células YT obtidos a partir de colunas de proteína Hsp70 (Hsp70) e de péptido (TKD) da Hsp70, revelaram ambos uma banda da proteína granzima B dominante com 32 kDa (Figura 1 C). Não foi detectada granzima B na fracção eluída das colunas de afinidade Hsp70 ou TKD carregadas com lisados de células K562 (Figura 1C) . A citometria de fluxo, utilizando um anticorpo (IgGl) contra a granzima B conjugado com ficoeritrina (PE) contra a granzima B, revelou uma coloração positiva para a granzima B citoplasmática em células YT, mas não em células K562 (Figura 1 D) . Estas observações corroboram os anteriores resultados da requerente. Em resumo, estes dados indicam que a granzima B é uma proteína parceira potencial da Hsp70. A granzima B irá, provavelmente, interagir com a região do terminal C da Hsp70 denominada TKD.
Exemplo 3 Ligação especifica e internalização da granzima B em células tumorais positivas para a Hsp70 membranar
As verificações anteriores colocaram a questão de saber se a Hsp70 ligada à membrana poderia permitir ligação específica e entrada da granzima B no citossol. Consequentemente, foi co-incubada granzima B purificada, isenta de perforinas, com sublinhas de células tumorais CX+/CX- e C0I0+/C0I0- que apresentam expressão membranar diferencial da Hsp70. Na fila 31 superior de cada painel, é mostrada uma análise por microscopia óptica de células CX + e C0I0+ (controlo) não tratadas, a 4 °C, versus a 37 °C (Figura 2A). A microscopia por imunofluorescência correspondente das células a 4 °C e 37 °C é ilustrada abaixo (controlo). Inicialmente, nenhuma das células mostrou qualquer coloração da granzima B, nem na superfície celular nem no citoplasma. No entanto, após um período de 15 min de incubação das células com granzima B (gr B) purificada a 4 °C, foi detectada uma fluorescência anular, nas sublinhas de tumor CX+ e C0I0+ positivas para a Hsp70 membranar (Figura 2A, painel esquerdo) indicando uma coloração típica da superfície celular. Uma variação da temperatura de 4 °C para 37 °C, durante um período de incubação de 30 min resultou na incorporação de granzima B, como determinado por um padrão de coloração citoplasmática nas sublinhas de tumores CX+ e C0I0+ (Figura 2A, painel direito). Pelo contrário os negativos para a Hsp70 membranar CX- e Colon- correspondentes não apresentaram qualquer ligação de granzima B da superfície celular a 4 °C nem incorporação, a 37 °C, (dados não apresentados). A análise por citometria de fluxo de células permeabilizadas revelou um deslocamento fraco do pico da granzima B para a direita selectivamente nas sublinhas de tumor CX+ e C0I0+ positivas para a Hsp70 membranar, mas não nas CX- e Colo-, quando as células foram co-incubadas com granzima B 1 pg/mL durante 30 min a 37 °C (Figura 2B, gráfico superior). Foi detectado um aumento dependente da dose na incorporação da granzima B, em células tumorais positivas para a Hsp70 membranar (CX+/C0I0+) após a co-incubação com granzima B 2 pg/mL e 4 pg/mL (Figura 2B, gráfico inferior). No entanto, mesmo na concentração mais elevada de 4 pg/mL, a granzima B foi incorporada muito mais pronunciadamente por células tumorais positivas para a Hsp70 membranar em comparação com as negativas para a Hsp70 32 (CX-/C0I0-). Os canais de ião potenciais formados pela Hsp70 podem desempenhar um papel no mecanismo selectivo de incorporação da granzima B em células tumorais positivas para a Hsp70 membranar. De facto, foi observada uma via particular condutância iónica após a incorporação de vesículas derivadas de fosfolípidos purificados a partir de sublinhas de tumor (CX+) positivas para a Hsp70 membranar. Isto não foi observado em vesículas obtidas a partir de células tumorais negativas para a Hsp70 membranar (CX-) (dados não apresentados). Com base nestes resultados, pode-se especular sobre uma actividade de canal iónico facilitando a incorporação da granzima B, selectivamente em células tumorais positivas para a Hsp70 membranar.
Exemplo 4 A granzima B proporcionada in vitro induz a apoptose selectivamente em células tumorais positivas para a Hsp70 membranar
As verificações anteriores colocaram a questão de se a granzima B purificada pode induzir a apoptose de células tumorais que apresentam Hsp70 na sua superfície celular. Foram incubadas células de carcinoma do cólon positivas (CX+/C0I0+) e negativas (CX-/C0I0-) para a Hsp70 membranar que apresentam uma expressão idêntica da classe I do MHC (Multhoff et ai. (1997) J. Immunol. 158, 4341), durante 4 h, 12 h e 24 h com granzima B isolada enzimaticamente activa (6 ng/mL) (Shi et al. (2000) Methods in Enzymology 322, 125). Todos os tipos celulares foram
incubados com o inibidor camptotecina da topoisomerase numa concentração de 4 pg/mL como controlo positivo da apoptose. A
apoptose foi determinada por coloração com Anexina V-FITC medida por FACS (FACSCalibur, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha) , coloração com DAPI e libertação de citocromo c mitocondrial. A 33 apoptose não foi detectada em células CX+ e CX- incubadas com camptotecina (cam) ou granzima B (grB) durante 4 h de incubação (Figura 3A). As células CX+ e C0I0+ assim como as CX- e Colo- incubadas com camptotecina sofreram apoptose após um período de incubação de 12 h e 24 h com camptotecina. Foi aparente que as sublinhas CX+/CX- de carcinoma do cólon estão melhor protegidas de uma morte celular mediada por camptotecina em comparação com as sublinhas C0I0+/C0I0- de carcinoma do pâncreas.
Como mostrado na Figura 3A, após 12 h a quantidade de células CX+ coradas positivamente com Anexina V-FITC aumentou de 16,6% para 28,0% (1,7 vezes) e após 24 h de 18% para 39% (2,1 vezes). Em células CX- a quantidade de células coradas positivamente com Anexina V-FITC aumentou, de um modo semelhante desde 12,1% para 19,8% (1,6 vezes) após 12 h e de 11,9% para 25,1% (2,1 vezes) após 24 h. Pelo contrário, foi observada apoptose selectivamente em células CX+ positivas para a Hsp70 membranar, incubadas com granzima B durante 12 h e 24 h, com um aumento, respectivamente 16,6% para 20,9% (1,3 vezes) e de 18% para 30,2% (1,8 vezes). De um modo semelhante, foi observado um aumento de 1,3 vezes e de 2,4 vezes na quantidade de células C0I0+ coradas positivamente com Anexina V-FITC, respectivamente após 12 h e 24 h. Em células CX- e Colo- nem no tratamento de 12 h nem no de 24 h com a granzima B induz a apoptose. Na Figura 3B é ilustrado um padrão comparativo de coloração com Anexina V-FITC de células CX+ e CX tratadas com granzima B durante 24 h. Em comparação com células de controlo não tratadas (18%), a quantidade de células CX+ coradas positivamente com Anexina V-FITC e negativamente com iodeto de propídio (PI) aumentou 1,7 vezes (30%) após tratamento com granzima B. No entanto, a quantidade de células CX- apoptóticas 34 permaneceu inalterada antes e após tratamento idêntico com granzima B. Para além das células CX+, a granzima B induz também a apoptose na linha de células leucémicas K562 positiva para a Hsp70 membranar (dados não apresentados). A quantidade de células coradas positivamente com Anexina V-FITC K562 aumentou desde 8,7% a 16% (1,8 vezes).
Para excluir a apoptose iniciada por anoikis foi realizada a análise por microscopia óptica das células tumorais CX+/CX- e C0I0+/C0I0- não tratadas (controlo), tratadas com camptotecina (cam) e granzima B (grB) . Como mostrado na Figura 3C, às 24 h após o tratamento com granzima B, nem as linhas celulares tumorais positivas para a Hsp70 membranar nem as negativas apresentavam qualquer sinal de perda na aderência ao plástico. No que respeita a estas verificações a requerente excluiu a possibilidade da anoikis poder ser um mecanismo possível para a indução da morte celular apoptótica em sublinhas de tumor positivas para a Hsp70 membranar. É importante observar que todos os ensaios de apoptose foram determinados dentro da população de células aderentes após uma tripsinaização curta (<1 min).
De um modo consistente, com os resultados do padrão de coloração com Anexina V-FITC, todos os tipos celulares, CX+/CX-, C0I0+/C0I0- apresentavam fragmentação nuclear, um sinal típico de apoptose numa etapa posterior, como detectado por coloração D AP I do ADN nuclear após tratamento com camptotecina (4 pg/mL) durante 24 h (Figura 3a, cam) . No entanto, foi apenas detectada fragmentação de ADN em células tumorais CX+ e C0I0+ positivas para a Hsp70 membranar após 24 h de tratamento com granzima B (6 ng/mL), enquanto não foi observada qualquer fragmentação de 35 ADN em células CX- e Colo- negativas para a Hsp70 membranar (Figura 3a, grB).
Foi medida a libertação de citocromo c após a incubação de células CX+ e CX- com granzima B, durante 24 h, como um teste adicional para a morte celular apoptótica. Como resumido na Tabela I, após a incubação com granzima B (6 ng/mL), durante 24 h, a concentração de citocromo c foi elevada de 0,382 mg/mL para 0,690 mg/mL (1,8 vezes) em células CX+. No entanto, não foi observado qualquer aumento do citocromo c em células CX- após tratamento com granzima B (0,452 mg/mL versus 0,425 mg/mL). Pelo contrário, uma incubação com camptotecina (4 pg/mL) durante 24 h, resulta num aumento comparável de 1,5 vezes das concentrações de citocromo c em ambos os tipos celulares. Estes resultados indicam que a granzima B isolada, induz a morte celular apoptótica selectivamente em células tumorais que apresentam Hsp70 na sua superfície celular. Foi proposto que o desencadeamento da apoptose pela granzima B seja mediado através do epitopo TKD da Hsp70 exposto extracelularmente. 36
Tabela I
Determinação quantitativa de citocromo humano c em células tumorais CX+ e CX- não tratadas (controlo) ou após incubação com camptotecina (4 pg/mL) ou granzima B (6 ng/mL) durante 24 h. Os dados representam as médias de 4 experiências independentes ± S.E.; *indica valores significativamente diferentes do controlo (p <0,05). células citocromo c (mg/mL) número de vezes de aumento controlo camptotecina granzima B CX+ 0,382 ± 0,02 0,555 ± 0,04* 0,690 ± 0, O co * 1/0 1/5 1,8 CX- 0,452 ± 0,02 0,672 ± 0,02* 0,425 ± 0, 075 1/0 1/5 0,9
Exemplo 5 Estímulo de células NK com o péptido TKD da Hsp70 induz a produção de granzima B e aumenta a morte das células alvo tumorais positivas para a Hsp70 membranar O papel fisiológico das verificações dos requerentes foi testado em ensaios funcionais utilizando células NK humanas ingénuas e estimuladas com Hsp70. Foi mostrado anteriormente que a incubação de células NK com a proteína Hsp70 em concentrações entre 10 e 50 pg/mL ou com concentrações equivalentes do péptido Hsp70 (0,2 - 2,0 pg/mL) resultou na actividade citolítica aumentada das células NK contra células alvo tumorais positivas para a Hsp70 membranar. Concomitantemente, a expressão de receptor CD94 de lectina do tipo C activante de células assassinas estava regulada positivamente (Multhoff et al. (1999) Exp. Hematology 27, 1627; Gross et al. (2002) apresentado) . 37
Embora a Hsp70 actue como uma estrutura de reconhecimento de células NK selectiva para tumores, como determinado por estudos de bloqueio de anticorpos (Multhoff et al. (1997) J. Immunol. 158,4341; Multhoff et al. (1995) Blood 86, 1374), o mecanismo da citotoxicidade NK permanece desconhecido. Para elucidar o possível mecanismo, foram incubadas células NK com o péptido TKD da Hsp70 (2 pg/mL), durante 3 dias. Foi observada uma expressão intracelular de granzima B significativamente elevada, como determinado em 3 experiências independentes. Pelo contrário a expressão granzima B não foi aumentada em células T positivas para CD3 tratadas com o péptido TKD da Hsp70. Na Figura 4A é ilustrada a análise por microscopia óptica de células NK activadas com o péptido Hsp70 co-incubadas com células CX+ positivas para a Hsp70 membranar e CX- negativas para a Hsp70 membranar. Foram cultivadas células tumorais CX+ positivas para a Hsp70 membranar e CX- negativas para a Hsp70 membranar (0,1 células x 106/mL) em duplicado em placas de 24 poços durante 2 dias. A taxa de proliferação de ambas as linhas celulares tumorais foi comparável, como determinado por contagens celulares idênticas (0,3 x 106 células/mL). As células tumorais CX+ e CX- no painel superior foram cultivadas na ausência de células NK; as células tumorais no painel inferior foram co-cultivadas durante 12 h com células NK que tinham sido estimuladas com o péptido TKD da Hsp70 (2 pg/mL, 3 dias) . Quase 100% das colónias de células CX+ foram encontradas em agrupamentos com células NK e a viabilidade das células tumorais CX+ parecem ser reduzida. Pelo contrário as células tumorais CX- e as células NK não se encontravam agrupadas; As células tumorais CX- negativas para a Hsp70 membranar não atraíram as células NK. A viabilidade celular das células tumorais CX- após o contacto com células NK parece ser menos afectada, em comparação com a de células tumorais CX+. As inserções no canto 38 inferior direito de cada gráfico ilustram uma ampliaçao de 2,5x de uma colónia de células representativa.
Foi quantificada a morte celular das células tumorais CX+/CX- e C0I0+/C0I0- após contacto com células NK recentemente isoladas, não estimuladas (NK dO) ou estimuladas com péptido TKD da Hsp70 (NKd3) num ensaio de libertação de 51Cr de 12 h (Figura 4B). De um modo consistente com o que foi observado por microscopia óptica (Figura 4A) , a actividade citolitica das células NK estimuladas com TKD (NK d3) contra células alvo CX+ (esquerda) foi significativamente intensificada em comparação com as células alvo CX- (direita) . Concomitantemente com os níveis aumentados de granzima B após o estímulo com o péptido TKD da Hsp70 durante 3 dias, a resposta citolitica foi significativamente elevada contra células CX+ e C0I0+ positivas para a Hsp70 membranar, mas não contra células CX- e
Colo- negativas para a Hsp70 membranar; 1,5 vezes (CX+) e 2,0 vezes (C0I0+) em proporções E:T de 2:1 a 20:1. Uma vez que as células tumorais CX+ e CX- diferem apenas no que respeita à sua expressão da Hsp70 membranar mas apresentam um padrão de expressão da MHC da classe I idêntico, pode ser excluído o efeito inibidor mediado por receptores inibidores de células assassinas (KIR). A actividade citolitica aumentada contra células tumorais CX+ positivas para a Hsp70 membranar (esquerda) , mas não contra células tumorais CX- negativas para a Hsp70 membranar (direita), pode ser completamente inibida pela pré-incubação das células alvo com o anticorpo monoclonal específico para a Hsp70 que é conhecido por detectar o péptido TKD da Hsp70 ligado à membrana em células tumorais viáveis (Multhoff et ai. (1995) Int. J. Câncer 61, 272). Pelo contrário a lise inferior das células tumorais negativas para a Hsp70 membranar permaneceu não afectada após a incubação com o 39 anticorpo Hsp70. Tecnicamente, não é possível quantificar a quantidade absoluta de granzima B que é transferida das células NK para as células tumorais por contacto intercelular. No entanto, podem ser determinados os valores relativos de libertação de granzima B por análise ELISPOT. Consequentemente, foi realizada, concomitantemente, uma comparação entre a resposta citolítica de células NK isoladas recentemente, não estimuladas (NK dO) e estimuladas com TKD (NK d3) contra células tumorais CX+/CX- e C0I0+/C0I0- com a definição da libertação da granzima B. Independentemente da linha celular tumoral e da proporção celular E:T, a co-incubaçao de células tumorais com células NK não estimuladas (NK dO) , resulta sempre numa libertação muito baixa de granzima B; 0 número de manchas foi sempre inferior a 20. Após um período de estímulo de 3 dias com TKD (NK d3) seguido por um tempo de co-incubação de 4 h com células tumorais, a libertação e granzima B estava significativamente regulada positivamente. Numa proporção E:T de 5:1, o número de manchas de granzima B, como determinado em três experiências independentes, foi como se segue: CX+ 260 ± 20, CX-165 ± 6; C0I0+ 137 ± 55; Colo- 66 ± 8. Concomitantemente, as células alvo tumorais positivas para a Hsp70 membranar (CX+/C0I0+), foram lisadas significativamente melhor em comparação com os seus correspondentes negativos (CX-/C0I0-). Estes dados sugerem fortemente que a lise de células tumorais positivas para a Hsp70 membranar por células NK activadas por TKD esteja associada com a libertação de granzima B. Foi proposta a hipótese de que a interacção da granzima B com o péptido TKD da Hsp70 ligado à membrana seja fundamental para a sua incorporação em células tumorais e para a indução da apoptose. Quando as células NK foram removidas por lavagem com PBS e as células tumorais foram coradas com DAPI. Após co-incubação com células NK as células CX+ positivas para a 40
Hsp70 membranar apresentavam fragmentação do ADN, enquanto as células CX- negativas para a Hsp70 membranar não. Foram obtidos resultados idênticos com coloração com Anexina V-FITC (dados não apresentados). Estas observações sugerem fortemente que as células NK activadas por TKD matem as células CX+ positivas para a Hsp70 membranar por indução da apoptose, as quais têm, também, niveis elevados de granzima B.
Lisboa, 28 de Abril de 2010 41
Claims (13)
- REIVINDICAÇÕES 1. Método ex vivo de indução ou de intensificação da expressão da granzima B em células assassinas naturais (NK) compreendendo fazer contactar as células NK com (a) proteína Hsp70; (b) um fragmento do (terminal C) compreendendo a sequência de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG; (c) um (poli)péptido compreendendo a sequência de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG; ou (d) uma combinação de (a), (b) e/ou (c) .
- 2. Método da reivindicação 1, em que a proteína Hsp70, o seu fragmento (do terminal C) , o (poli)péptido compreendendo a sequência de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG ou a sua combinação estão num estado não complexado.
- 3. Método da reivindicação 1 ou 2, compreendendo adicionalmente proporcionar células NK com expressão induzida ou intensificada de Granzima B, úteis para reinfusão num mamífero.
- 4. Método da reivindicação 3, em que as células NK são células NK autólogas e/ou alogénicas.
- 5. Método da reivindicação 3 ou 4, em que o referido mamífero é um humano. 1
- 6. Método de qualquer das reivindicações 1 a 5, em que o referido contacto é realizado durante, pelo menos, 12 horas.
- 7. Método da reivindicação 6, em que o referido contacto é realizado durante pelo menos 4 dias.
- 8. Método de qualquer das reivindicações 1 a 7, em que as referidas células NK são obtidas a partir da medula óssea por incubação das referidas células de medula óssea com a interleucina 15 (IL-15) e factor de célula estaminal (SCF) em concentrações de 1 nq/mL a 1000 nq/mL por citocina durante, pelo menos, 7 dias até 4 meses, antes do referido contacto.
- 9. Granzima B para utilização no tratamento in vivo de tumores independente das perforinas, em que os referidos tumores expressam Hsp70 na superfície celular.
- 10. Granzima B da reivindicação 9, a qual é utilizada como o único composto farmaceuticamente activo.
- 11. Granzima B da reivindicação 9 ou 10 que é concebida para ser administrada numa concentração final de 1 pg/mL a 500 pg/mL, de um modo preferido, de 1 pg/mL a 10 ng/mL e, de um modo mais preferido, numa concentração final de cerca de 6 ng/mL.
- 12. Granzima B de qualquer uma das reivindicações 9 a 11, a qual é empacotada em lipossomas. 2
- 13. Granzima B de qualquer das reivindicações 9 a 12, em que os referidos tumores são seleccionados de um grupo consistindo em tumores do estômago, gástricos, colorectais, do pulmão, e do tumores do pâncreas, mamários, ginecológicos, da cabeça pescoço, tumores dermatológicos (e. g., melanoma), neuronais, leucemia e linfoma. Lisboa, 28 de Abril de 2010 3
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP02018284 | 2002-08-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PT1537204E true PT1537204E (pt) | 2010-05-05 |
Family
ID=31896833
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PT03792414T PT1537204E (pt) | 2002-08-23 | 2003-08-22 | Granzima b como um indutor da apoptose em células tumorais dependente de hsp70/péptidos hsp70 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7722863B2 (pt) |
| EP (1) | EP1537204B1 (pt) |
| JP (1) | JP4699755B2 (pt) |
| AT (1) | ATE457349T1 (pt) |
| AU (1) | AU2003260452A1 (pt) |
| CA (1) | CA2535952A1 (pt) |
| CY (1) | CY1110005T1 (pt) |
| DE (1) | DE60331228D1 (pt) |
| DK (1) | DK1537204T3 (pt) |
| ES (1) | ES2340270T3 (pt) |
| PT (1) | PT1537204E (pt) |
| SI (1) | SI1537204T1 (pt) |
| WO (1) | WO2004018002A2 (pt) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100034772A1 (en) * | 2006-11-14 | 2010-02-11 | Ralf Dressel | Compositions and methods for immunotherapy |
| KR101192724B1 (ko) | 2010-02-04 | 2012-10-18 | 한국생명공학연구원 | 마이크로알엔에이의 발현을 조절하여 ｎｋ 세포를 활성화시키는 방법 |
| BR112013003989B1 (pt) | 2010-08-20 | 2020-11-24 | Immunovative Therapies, Ltd. | composição compreendendo células cd4+ th1/assassinas e método in vitro para destruir células cancerosas, células infectadas ou combinações das mesmas |
| WO2018005926A1 (en) | 2016-07-01 | 2018-01-04 | The General Hospital Corporation | Granzyme b directed imaging and therapy |
| WO2019043170A1 (en) | 2017-08-31 | 2019-03-07 | Multimmune Gmbh | POLY THERAPY BASED ON HSP70 |
| CN115477705B (zh) * | 2021-06-16 | 2024-02-23 | 四川大学华西医院 | 一种基于颗粒酶b构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用 |
| CN115305238B (zh) * | 2022-09-19 | 2023-11-17 | 杭州凤喆凰生物科技有限公司 | 一种提高自然杀伤细胞杀伤力的成分在自然杀伤细胞培养中的应用 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6130087A (en) * | 1996-10-07 | 2000-10-10 | Fordham University | Methods for generating cytotoxic T cells in vitro |
| EP1007723A4 (en) * | 1997-08-18 | 2001-11-28 | Blood Res Center | METHOD OF USING GRANZYMES AND FIXING MOLECULES THEREOF FOR TREATING DISEASES CHARACTERIZED BY ABNORMAL APOPTOSIS |
| IL137871A0 (en) * | 1998-02-27 | 2001-10-31 | Boehringer Ingelheim Pharma | Self-regulated apoptosis of inflammatory cells by gene therapy |
| DE19813759C1 (de) * | 1998-03-27 | 1999-07-15 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Verfahren zur Induktion einer durch NK-Zellen vermittelten Immunantwort |
| JP4832640B2 (ja) * | 1998-03-27 | 2011-12-07 | ガブリエル ミュルソフ | Ｈｓｐ７０タンパク質の新規使用 |
| FR2792205B1 (fr) * | 1999-04-19 | 2001-07-27 | Inst Nat Sante Rech Med | Composition pharmaceutique comprenant des cellules nkt activees par des pim, et son utilisation en therapie |
| ES2292587T3 (es) * | 2000-04-22 | 2008-03-16 | Pharmedartis Gmbh | Agentes apoptoticos. |
| US20040014652A1 (en) * | 2000-06-01 | 2004-01-22 | Andre Trouet | Tumor activated prodrug compounds and methods of making and using the same |
| WO2001091798A2 (en) * | 2000-06-01 | 2001-12-06 | Universite Catholique De Louvain | Tumor activated prodrug compounds |
| EP1319023B8 (en) * | 2000-09-13 | 2009-07-15 | multimmune GmbH | An hsp70 peptide stimulating natural killer (nk) cell activity and uses thereof |
| US7101977B2 (en) * | 2001-07-17 | 2006-09-05 | Research Development Foundation | Therapeutic agents comprising pro-apoptotic proteins |
-
2003
- 2003-08-22 PT PT03792414T patent/PT1537204E/pt unknown
- 2003-08-22 JP JP2004530248A patent/JP4699755B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2003-08-22 US US10/526,586 patent/US7722863B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-08-22 ES ES03792414T patent/ES2340270T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-22 WO PCT/EP2003/009341 patent/WO2004018002A2/en active Application Filing
- 2003-08-22 EP EP03792414A patent/EP1537204B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-22 SI SI200331798T patent/SI1537204T1/sl unknown
- 2003-08-22 AT AT03792414T patent/ATE457349T1/de active
- 2003-08-22 AU AU2003260452A patent/AU2003260452A1/en not_active Abandoned
- 2003-08-22 DE DE60331228T patent/DE60331228D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-22 CA CA002535952A patent/CA2535952A1/en not_active Abandoned
- 2003-08-22 DK DK03792414.9T patent/DK1537204T3/da active
-
2010
- 2010-05-10 CY CY20101100406T patent/CY1110005T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2004018002A2 (en) | 2004-03-04 |
| EP1537204A2 (en) | 2005-06-08 |
| CY1110005T1 (el) | 2015-01-14 |
| DE60331228D1 (de) | 2010-03-25 |
| EP1537204B1 (en) | 2010-02-10 |
| WO2004018002A3 (en) | 2004-06-17 |
| AU2003260452A1 (en) | 2004-03-11 |
| DK1537204T3 (da) | 2010-06-07 |
| ES2340270T3 (es) | 2010-06-01 |
| US7722863B2 (en) | 2010-05-25 |
| JP4699755B2 (ja) | 2011-06-15 |
| ATE457349T1 (de) | 2010-02-15 |
| CA2535952A1 (en) | 2004-03-04 |
| AU2003260452A8 (en) | 2004-03-11 |
| US20060111285A1 (en) | 2006-05-25 |
| JP2006507810A (ja) | 2006-03-09 |
| SI1537204T1 (sl) | 2010-06-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Grabowska et al. | CD169+ macrophages capture and dendritic cells instruct: the interplay of the gatekeeper and the general of the immune system | |
| Semino et al. | NK/iDC interaction results in IL-18 secretion by DCs at the synaptic cleft followed by NK cell activation and release of the DC maturation factor HMGB1 | |
| Gastpar et al. | Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells | |
| Chaput et al. | Dendritic cell derived-exosomes: biology and clinical implementations | |
| Multhoff | Heat shock protein 70 (Hsp70): membrane location, export and immunological relevance | |
| JP4819364B2 (ja) | 線維細胞形成阻害の検出方法、ならびに線維細胞形成を増強する方法および化合物 | |
| US20200254019A1 (en) | Pharmaceutical preparation | |
| Li et al. | Exosomes derived from atorvastatin-modified bone marrow dendritic cells ameliorate experimental autoimmune myasthenia gravis by up-regulated levels of IDO/Treg and partly dependent on FasL/Fas pathway | |
| ZA200206842B (en) | Casein derived peptides and uses thereof in therapy. | |
| WO2012174055A1 (en) | Wound healing using complement inhibitors | |
| US7396681B1 (en) | Application of Hsp70 proteins | |
| ES2340270T3 (es) | Granzima b dependiente de peptidos hsp70/hsp70 como inductora de apoptosis en celulas tumorales. | |
| Bochkova et al. | The role of glycodelin in the regulation of the immune system in the context of developing pregnancy | |
| Janssens et al. | Decoding immunogenic cell death from a dendritic cell perspective | |
| Hall et al. | Cooperative interaction of factor B and other complement components with mononuclear cells in the antibody-independent lysis of xenogeneic erythrocytes. | |
| AU2002215189B2 (en) | Use of the long pentraxin PTX3 for the preparation of medicament for the prevention and cure of autoimmune pathologies | |
| ZA200401574B (en) | Casein derived peptides and uses thereof in therapy | |
| Tosello et al. | Differential expression of constitutive and inducible proteasome subunits in human monocyte‐derived DC differentiated in the presence of IFN‐α or IL‐4 | |
| Ratajczak et al. | Further evidence that paroxysmal nocturnal haemoglobinuria is a disorder of defective cell membrane lipid rafts | |
| CZ20003238A3 (cs) | Pouľití CD137 pro podporu proliferace periferních monocytů | |
| US11351224B2 (en) | Pharmaceutical composition for preventing and treating transplant rejection | |
| Abdullah | Investigation into the immune prompting mechanisms of calreticulin for targeted cancer cell death and immunotherapy | |
| Chiusolo | Sam50 and Tim22: a novel mitochondrial gate for the import of Granzyme B | |
| Anft | The regulation of NK cell detachment from target cells as a key factor for serial killing and effector function | |
| US20210261638A1 (en) | Periostin compounds for the treatment of haematological complications |