PT1470818E

PT1470818E - Utilização de derivados de fenotiazina piperazina no fabrico de um medicamento com efeitos neuroprotectores e/ou neurotróficos no cns e/ou pns

Info

Publication number: PT1470818E
Application number: PT03291024T
Authority: PT
Inventors: Aline Appert-Colin; Noelle Callizot
Original assignee: Neuro3D
Priority date: 2003-04-25
Filing date: 2003-04-25
Publication date: 2006-11-30
Also published as: WO2004096231A2; DE60307049T2; DE60307049D1; WO2004096231A3; EP1470818B1; HK1066741A1; ES2272911T3; DK1470818T3; ATE333881T1; US20060276460A1; EP1470818A1

Description

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DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE DERIVADOS DE FENOTIAZINA PIPERAZINA NO FABRICO DE UM MEDICAMENTO COM EFEITOS NEUROPROTECTORES E/OU NEUROTRÓFICOS NO CNS E/OU PNS"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção relaciona-se com uma nova utilização de derivados de fenotiazina piperazina e seus sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveis no fabrico de um medicamento com efeitos neuroprotectores e/ou neurotróficos no CNS e/ou PNS para o tratamento de esclerose lateral amiotrófica (ALS).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Estes compostos são conhecidos como principais fármacos tranquilizantes e neurolépticos devido aos seus efeitos como atenuantes da agitação esquizofrénica, e do comportamento maníaco. Mais particularmente a série de piperazina que inclui trifluoroperazina, proclorperazina, flufenazina são os compostos de fenotiazina anti-psicóticos mais potentes. A flufenazina é comercializada sob a marca registada Moditen® para os seus efeitos terapêuticos neurolépticos. A flufenazina e o seu sal cloridrato ou forma de éster enantato ou decanoato exerce actividade a vários níveis do CNS assim como em sistemas de órgãos periféricos, que conta para a sua acção anti-psicótica e efeitos secundários. Evidência indirecta indica que os efeitos anti-psicóticos das fenotiazinas estão ligados ao seu efeito no bloqueamento de dopamina e outros locais receptores de catecolamina. 2 A patente mundial WO 03/062232 revela derivados de tiazoles compreendendo um radical fenotiazina utilizado para o tratamento de doenças neurológicas tais como ALS. A patente dos Estados Unidos da América US6482822 revela derivados de N-iminometilamina compreendendo um radical fenotiazina possuindo uma actividade inibidora nas enzimas sintetase de NO produzindo NO e/ou uma actividade que armadilha a espécie de oxigénio reactiva e poderá produzir efeitos favoráveis no tratamento de patologias onde estão envolvidas espécies químicas. São citadas doenças ALS. A patente mundial WO 02/083656 revela derivados heterocíclicos de 5 membros compreendendo um radical fenotiazina possuindo uma actividade inibidora na monoamina oxidase ou na peroxidação de lípidos ou possuindo uma actividade de modulação em canais de sódio e que poderão ser utilizados para tratar ALS. A patente mundial WO 00/32175 revela derivados de fenotiazina úteis para tratamento de cancro e capazes de interactuar com a expressão de uma proteína mutante da p53. São também úteis para doenças associadas a proteína conformacionalmente instável ou mal enroladas tais como doenças ALS.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Surpreendentemente, o requerente descobriu que os derivados de fenotiazina piperazina e mais particularmente a flufenazina, são capazes de exercer efeitos neuroprotectivos e neurotróficos significativos. Estes novos efeitos que não poderão ser derivados a partir da 3 acção anti-psicótica da flufenazina actual foram sublinhados durante estudos específicos modelo in vitro e in vivo de degeneração neuronal de CNS e PNS. A invenção relaciona-se com

1. Utilização de um composto da fórmula I

A representa um alcileno de cadeia de linear ou ramificada desde 2 a 6 átomos de carbono separando os átomos de azoto ligados a ele por pelo menos dois átomos de carbono;

Rl representa hidrogénio, halogénio, alquilo inferior, alcoxi inferior, alcanoílo inferior, alquilo-mercapto inferior, trifluorometilmercapto, alquil-sulfonilo inferior (preferencialmente metilsulfonilo), perfluoroalquilo de 1 a 3 átomos de carbono; R2, R3, R4 e R5 cada um representam metilo, etilo ou hidrogénio, R6 representa hidrogénio, alquilo inferior, hidroxi-inferior-alquilo ou aciloxi-inferior-alquilo alifático possuindo 1 a 4 átomos de carbono na porção aciloxi e 1 a 6 4 átomos de carbono na porção alquilo, CH2-CH2-0-R7 onde R7 representa hidrogénio, C0R8 onde R8 é uma cadeia de radical alquilo linear ou ramificada de desde sete a catorze átomos de carbono; no fabrico de um medicamento com efeitos neuroprotectores e/ou neurotróf icos no CNS e/ou PNS para o tratamento de doenças de esclerose lateral amiotrófica (ALS). 2_. Utilização de acordo com o item 1 em que A representa etileno, propileno ou 2-metilpropileno; RI representa hidrogénio, cloro, COCH3, -CF3; R2, R3, R4 e R5 cada um representa hidrogénio; R6 representa CH3, CH2-CH2-0-R7 onde R7 representa hidrogénio, C0R8 onde R8 é um radical alquilo de cadeia de linear ou ramificada de desde sete a catorze átomos de carbono. _3. Utilização de acordo com qualquer um dos itens 1 a 2, em que os derivados de fenotiazina piperazina é flufenazina, ou um seu sal ou éster farmaceuticamente aceitável. _4. Utilização de acordo com qualquer um dos itens 1 a 3_, em que o medicamento é para uma via de administração oral, rectal, subcutânea, intramuscular ou intravascular. 5. Utilização de acordo com qualquer um dos itens 1 a 4, em que o medicamento compreende como componente activo desde 0,2 mg a 500 mg dos derivados de fenotiazina piperazina. 5 6. Utilização de acordo com qualquer um dos itens 1 a 5, em que o medicamento é para ser administrado em doses compreendidas entre 0,1 mg/kg e lOmg/kg. A invenção providencia medicamentos para o tratamento de doenças de esclerose lateral amiotrófica (ALS). Os medicamentos acima para a administração a seres humanos ou outros sujeitos animais compreendem uma quantidade efectiva de compostos derivados de fenotiazina piperazina de fórmula I possuindo efeitos neuroprotectores e/ou neurotróficos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Fig. 1: efeitos da flufenazina na sobrevivência dos neurónios da medula espinal

Fig. 2: efeitos protectores em neurónios corticais da flufenazina após intoxicação com ácido glutâmico e com maturação com BDNF.

Fig. 3: efeitos protectores da flufenazina em neurónios mesencefálicos após intoxicação com MPP+

Fig. 4: efeitos neurotróficos da flufenazina em neurónios corticais

Fig. 5: efeitos neurotróficos da flufenazina em neurónios da medula espinal

Fig. 6: taxa de sobrevivência de murganhos SOD após administração oral de flufenazina. 6

DESCRIÇÃO DETALHADA

Assim, de acordo com a presente invenção, é providenciada a utilização de derivados de fenotiazina piperazina e um seu sal e/ou éster farmaceuticamente aceitável, no fabrico de um medicamento com efeitos neuroprotectores e neurotróficos no CNS e PNS para o tratamento de doenças de esclerose lateral amiotrófica (ALS).

Os derivados de fenotiazina piperazina sao definidos como compostos da fórmula I

em que A representa um alcileno de cadeia linear ou ramificada de desde 2 a 6 átomos de carbono separando os átomos azoto a ele ligados por pelo menos dois átomos de carbono; RI representa hidrogénio, halogénio (preferencialmente cloro), alquilo inferior, alcoxi inferior, alcanoílo inferior (preferencialmente COCH3) , alquilo-mercapto inferior, trifluorometilmercapto, alquil-sulfonilo inferior (preferencialmente metilsulfonilo) , perfluoroalquilo del a 3 átomos de carbono, preferencialmente CF3 ; 7 R2, R3, R4 e R5 cada um representam metilo, etilo ou hidrogénio; R6 representa hidrogénio, alquilo inferior, hidroxi-inferior-alquilo ou aciloxi-inferior-alquilo alifático possuindo 1 a 4 átomos de carbono na porção aciloxi e 1 a 6 átomos de carbono na porção alquilo, CH2-CH2-0-R7 onde R7 representa hidrogénio, C0R8 onde R8 é um radical alquilo de cadeia linear ou ramificada de desde sete a catorze átomos de carbono.

Os termos "alquilo inferior", "alcoxi inferior", "alcanoilo inferior" como empregues aqui incluem ambos os radicais de cadeia linear e ramificada de desde 1 a 6 átomos de carbono.

Preferencialmente os derivados de fenotiazina piperazina utilizados nos medicamentos da invenção são seleccionados a partir de compostos de fórmula I em que A representa etileno, propileno ou 2-metilpropileno; RI representa hidrogénio, cloro, COCH3, CF3; R2, R3, R4 e R5 cada um representa hidrogénio; R6 representa CH2-CH2-0-R7 onde R7 representa hidrogénio, C0R8 onde R8 é um radical alquilo de cadeia linear de desde sete a catorze átomos de carbono.

Mais preferencialmente, os derivados de fenotiazina piperazina utilizados nos medicamentos da invenção é 4 — [3 — [2-(trifluorometil)- 10H- fenotiazin- 10- il] propiI]-l -piperazinaetanol (flufenazina) ou seus sais e /ou ésteres. Estes compostos e suas preparações químicas sob a forma de bases livres são reveladas nas patentes britânica GB 829246 e dos Estados Unidos da América, US 3.058.979.

Esta invenção inclui também sais das bases definidas acima formados com ácidos orgânicos e inorgânicos não tóxicos. Tais sais são facilmente preparados por métodos conhecidos na técnica e são revelados nas patentes britânica GB 829246 e dos Estados Unidos da América, US 3.058.979. A invenção também cobre derivados éster dos compostos acima e as suas preparações são descritas nas patentes britânica GB 833474 e dos Estados Unidos da América e US 3.194.733.

Os medicamentos da invenção são para tratar doenças de esclerose lateral amiotrófica (ALS).

Os efeitos neuroprotector e neurotrófico de flufenazina foram testados in vitro em culturas celulares neuronais primárias e in vivo, em estudos com modelos animais.

Os estudos in vitro foram primeiro conduzidos nos motoneurónios da medula espinal motoneurónios que estão envolvidos em doenças de neuropatia periférica como por exemplo esclerose lateral amiotrófica (ALS) de acordo com os protocolos descritos por Martinou J.C., Martinou I., Kato A.C. em Cholinergic differentiation factor (CDF/LIF) promotes survival of isolated rat embryonic motoneurons in vitro. Neuron 1992, 8(4) : 737-744) e por Ometani A., Nomoto H., Nitta A., Furukawa Y., Furukawa S. in 4-Metylcatechol stimulates phosphorylation of Trk family neurotrophin receptors and MAP kinases in cultured rat cortical neuron. J Neurosci Res 2002 Nov 1; 70 (3) :335-9.

Estudos adicionais foram conduzidos em neurónios corticais intoxicados com ácido glutâmico de acordo com o protocolo descrito por Nilsen J. e Brinton RD em Impact of progestins 9 9 synergy by antagonism by 143 : 205-212 on oestrogen-induced neuroprotection: progesterone and 19-norprogesterone and medoxyprogesterone acetate. Endocrinology 2002.

Os neurónios corticais estão envolvidos na doença de Alzheimer e também em neurónios do mesencéfalo ou neurónios dopaminérgicos que estão eles próprios envolvidos na doença de Parkinson. (ver também o protocolo descrito por Y. Mitsumotol, A. Watanabe, T. Miyauchi, F. Jimma, e T. Moriizumi em Stimulation of the regrowth of MPP+/damaged dopaminargic fibers by the treatment of mesencephalic cultures with basigin; J Neural Transm (2001) 108: 1127-1134) .

Os estudos in vivo foram conduzidos em animais transgénicos com ALS provocando mutações, um modelo para doenças neurodegenerativas de acordo com os protocolos descritos por Gurney Me, Pu H, Chiu Ay, Dal Canto Mc, Pochow Cy, Alexander Dd, Caliendo J, Hentati A, Kwon Yw, Deng Hx, et al. em Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science (1994) 264: 1772-1775; e por Mohajeri Mh, Figlewicz Da, Bohn Mc em Selective loss of alpha motoneurons innervating the medial gastrocnemius muscle in a model of amyotrophic lateral sclerosis. Exp. Neurol. (1998) 150: 329-336.

Todos estes testes demonstram que a sobrevivência neuronal aumenta na presença de várias concentrações de flufenazina comparada com o controlo sem flufenazina e que a flufenazina induz acção neuroprotectora após diferentes intoxicações. O efeito neurotrófico i.e. o desenvolvimento do neurite com flufenazina foi investigado em ambas as culturas neuronais cortical e da medula espinal de acordo com o protocolo descrito por Lucius R, Sievers J. em Postnatal retinal 10 ganglion cells in vitro: protection against reactive oxygen species (ROS)-induced axonal degeneration by cocultured astrocytes Brain Res 1996 Dec 16;743(1-2):56-62. Os resultados no comprimento do neurite assim como na percentagem de células com neurites quantificados por inspecção microscópica cuidadosa demonstram o efeito neurotrófico na presença de várias concentrações de flufenazina comparado com o controlo sem flufenazina.

Os resultados do teste in vivo demonstram a sobrevivência melhorada de animais com a administração de várias doses de flufenazina comparada com o controlo sem flufenazina.

Estes medicamentos podem ser administrados por vias de administração oral, rectal, subcutânea, intramuscular ou intravascular.

Os medicamentos de acordo com a invenção podem ser sólidos ou líquidos e ser apresentados nas formas farmacêuticas comummente utilizadas na medicina humana, tais como por exemplo, comprimidos simples ou revestidos por açúcar, cápsulas de gelatina, grânulos, supositórios, preparações injectáveis, unguentos, cremes, géis; são preparados de acordo com os métodos usuais. 0(s) componente(s) activo(s) pode(m) ser incorporado(s) com os excipientes usualmente utilizados nestas composições farmacêuticas, tais como talco, goma arábica, lactose, amido, estearato de magnésio, manteiga de cacau, veículos aquosos ou não aquosos, substâncias gordas de origem animal ou vegetal, derivados de parafina, glicóis, vários agentes molhantes, dispersantes ou emulsionantes, conservantes.

Estas composições podem em particular ser apresentadas na forma se um pó que se pretende ser dissolvido extemporaneamente num veículo adequado, por exemplo água 11 estéril apirogénica. 0 medicamento pode compreender como componente activo desde 0,2 mg a 500 mg dos derivados de fenotiazina piperazina. A dose administrada é variável de acordo com o estado tratado, o paciente em questão, a via de administração e o produto considerado. Pode estar, por exemplo, compreendida entre 0,01 mg e 50 mg por dia por via oral em adultos com flufenazina ou também compreendida entre 0,1 mg e 10 mg por dia por via intramuscular ou intravenosa.

Exemplos

Estudos in vitro:

Condições de culturas celulares: São isolados dois tipos de culturas celulares neuronais primárias i.e. neurónios corticais e da medula espinal de fetos de 15-17 dias de idade de ratos femininos Wistar e cultivadas em meio neurobasal/B27 até à diferenciação celular.

Ensaios de neuroprotecção;

Todos os testes são conduzidos com o seu controlo adequado. Exemplo 1 A manutenção de sobrevivência e proliferação neuronal é um processo crucial para a integridade dos neurónios. No presente estudo são utilizadas culturas celulares de motoneurónios da medula espinal para avaliar se a flufenazina promove ou nao a sobrevivência e a proliferação neuronal. 12

Sobrevivência e proliferação neuronal São incubadas culturas celulares com diferentes concentrações de dicloridrato de Flufenazina N-Mostarda: 50, 100, 250 nmol/1. A sobrevivência neuronal é em seguida monitorizada em diferentes pontos de tempo; 2, 24, 48, 72, 96, 120 horas por contagem do número de células sob microscópio. Os resultados são ilustrados na Fig. 1: a percentagem de sobrevivência neuronal obtida quando as culturas celulares são incubadas com flufenazina é comparada com a de culturas celulares incubadas sozinhas apenas com 50 microgramas de factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). As percentagens totais aumentam regularmente a partir de 48 h até 120 h e os melhores resultados de sobrevivência são obtidos com concentrações de flufenazina de 50 a 250 nmol/1.

Exemplo 2

Ensaio de intoxicação por ácido glutâmico:

A actividade neuroprotectora é avaliada pela perda de neurónios corticais induzida por ácido glutâmico. O processo de morte é iniciado por tratamento de 10 min culturas celulares de neurónios com concentração neurotóxica de ácido glutâmico de 100 micromol/1. A capacidade de flufenazina para reverter o processo de morte é obtida por exposição subsequente das células a

concentrações de flufenazina de 100 e 200 nmol/1. A 13 quantidade de LDH libertada é utilizada para estimar o grau de intoxicação e o decréscimo da quantidade libertada é proporcional à resistência celular à neurotoxicidade de Glu. Os resultados são ilustrados na Fig. 2 (parte direita) : a percentagem de sobrevivência neuronal obtida quando culturas de células intoxicadas são incubadas com flufenazina é comparada com a de culturas de células sem flufenazina.

Com 200 nmol/1 de flufenazina, é significativamente observado um aumento de 10 %.

Na parte esquerda da Fig. 2, pode ser observado que a flufenazina não tem efeito ou tem um efeito muito ligeiro, na sobrevivência de células na ausência de composto neurotóxico.

Exemplo 3

Ensaio de intoxicação por Μ PP+: A actividade neuroprotectora é avaliada pela perda de neurónio mesencefálico induzida por Μ PP+ com concentração de flufenazina de 250 nmol/1.

As células são intoxicadas por 2 micromol de MPP+ como neurotóxico durante 24 h. A cultura celular é seguidamente tratada com 250 nm/1 de flufenazina. São observados efeitos inversos após 48 horas.

Estes efeitos neuroprotectores são medidos pelo número aumentado de células positivas TH ou neurónios dopaminérgicos (i.e., neurónios mesencefálicos que contêm, tirosina hidroxilase (TH), uma enzima de síntese da 14 dopamina. Os resultados são ilustrados na Fig. 3 (parte direita) : A percentagem de sobrevivência neuronal mesencefálica obtida quando culturas celulares intoxicadas são incubadas com flufenazina é comparada com a de culturas celulares sem flufenazina.

Com 250 nmol/1 de flufenazina, é significativamente observado um aumento de 30 % de células positivas TH.

Estes resultados mostram que a flufenazina (250 nmol/1) reverte a perda neuronal induzida por MPP+ para a mesma extensão que o Riluzole (5 micromoles/1) um fármaco com actividade neuroprotectora estabelecida neste modelo (ver a referência de Storch A, Burkhardt K, Ludolph AC, Schwarz J. Protective effects of riluzole on dopamine neurons: involvement of oxidative stress and cellular energy metabolism. J Neurochem 2000 Dec;75(6):2259-69).

Na parte esquerda da Fig. 3, pode ser confirmado que a flufenazina de acordo com as suas reacções extrapiramidais conhecidas possui um efeito negativo (menos 50 %) na sobrevivência deste tipo de neurónios dopaminérgicos.

Em adição este ensaio também demonstra maior expansão de neurite do que nos neurónios do controlo a 250 nmol/1).

Exemplo 4

Ensaios neurotróficos: A capacidade da flufenazina para induzir o crescimento externo de neurite é investigada em ambas as culturas corticais e da medula espinal após 24 h de exposição à flufenazina. 15 0 comprimento da neurite assim como a percentagem de células com neurites são quantificados por inspecção microscópica cuidadosa. No tipo de neurónios do córtex, os resultados são ilustrados na Fig. 4; o efeito neurotrófico da flufenazina no córtex (200nmol/l) é expresso como um aumento de 30 % no comprimento dos neurites comparado com o comprimento das neurites nos neurónios do córtex de controlo.

Nos neurónios da medula espinal, os resultados são ilustrados na Fig 5: O efeito neurotrófico da flufenazina (50 nmol/1, 100 nmol/1) é expresso como um aumento de 40 a 50 % no comprimento dos neurites comparado com o comprimento das neurites nos neurónios da medula espinal de controlo.

Exemplo 5

Ensaios in vivo.

Tratamento de animais e flufenazina.

Sao utilizados murganhos de 4 meses de idade i.e. cerca de 2 semanas antes do aparecimento dos primeiros sintomas.

Sao genotipado para o gene SOD1 usando o método PCR . Os animais sao atribuídos em quarto grupos para receber uma administraçao oral diária de 1) solução salina como controlo, 2) 0,1 mg/kg, 3) 1 mg/kg, 4) lOmg/kg de flufenazina, até à morte por fraqueza e ocorre paralisia. A taxa de sobrevivência foi registada numa base diária.

Os resultados são ilustrados na Fig. 6: 16

As doses de 0,1 e 1 mg/kg de flufenazina intensificaram a sobrevivência de murganhos SOD como comparadas com o grupo tratado com a solução salina. Em contraste, a dose superior (lOmg/kg) pareceu possuir um efeito adverso e induziu um desvio a esquerda na curva de sobrevivência.

Lisboa, 28 de Setembro de 2006

Claims

1 Reivindicações 1. Utilização de um composto de fórmula geral I

em que A representa um alcileno de cadeia linear ou ramificada de desde 2 a 6 átomos de carbono separando os átomos de azoto ligados a ele por pelo menos dois átomos de carbono; RI representa hidrogénio, halogénio, alquilo inferior, alcoxi inferior, alcanoilo inferior, alquilo-mercapto inferior, trifluorometilmercapto, alquilo-sulfonilo inferior (preferencialmente metilsulfonilo), perfluoroalquilo de 1 a 3 átomos de carbono; R2, R3, R4 e R5 cada um representa metilo, etilo ou hidrogénio, R6 representa hidrogénio, alquilo inferior, hidroxi-inferior alquilo ou aciloxi-inferior-alquilo alifático possuindo 1 a 4 átomos de carbono na porção aciloxi e 1 a 6 átomos de carbono na porção alquilo, CH2-CH2-0-R7 onde R7 representa hidrogénio, C0R8 onde R8 é um radical alquilo de cadeia ramificada ou linear de desde 2 sete a catorze átomos de carbono; o " alquilo inferior," " alcoxi inferior ", " alcanoilo inferior " incluindo ambos os radicais de cadeia linear e ramificada de desde 1 a 6 átomos de carbono; ou dicloridrato de flufenazina N-mostarda; no fabrico de um medicamento com efeitos neuroprotectores e/ou neurotróficos no CNS e/ou PNS para o tratamento de doenças de esclerose lateral amiotrófica (ALS).

2. Utilização de acordo com a reivindicação 1 em que A representa etileno, propileno ou 2- metilpropileno; RI representa hidrogénio, cloro, COCH3, -CF3; R2, R3, R4 e R5 cada um representa hidrogénio; R6 representa CH3, CH2-CH2-0-R7 onde R7 representa hidrogénio, C0R8 onde R8 é um radical alquilo de cadeia linear de desde sete a catorze átomos de carbono.

3. Utilização de acordo com as reivindicações 1 a 2, em que o composto de fórmula geral I é flufenazina, ou um seu sal ou éster farmaceuticamente aceitável.

4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o medicamento é para via de administração oral, rectal, subcutânea, intramuscular ou intravascular.

5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o medicamento compreende 3 como componente activo desde 0,2 mg a composto de fórmula geral I.

6. Utilização de acordo com qualquer reivindicações 1 a 5, em que o medicamento administrado em doses compreendidas entre 10 mg/kg. Lisboa, 28 de Setembro de 2006 500 mg do uma das é para ser 0, 1 mg/kg a