PT1456093E - Beverage can lid with articulated neck - Google Patents

Description

Descriçãodescription

Complexos De Péptidas-Proteínas De Tensão Como Vacinas Contra Patogénios Intracelulares A presente invenção refere-se a uma vacina e método para produção dessa vacina. Mais especificamente, a invenção é referente a métodos para a produção de vacinas de complexos fragmentos de péptida antigénica / proteina de choque em células infectadas por patogénios intracelulares e composições obtidas deste modo.The present invention relates to a vaccine and method for the production of such a vaccine. More specifically, the invention relates to methods for the production of vaccines of complex antigenic peptide / shock protein fragments in cells infected by intracellular pathogens and compositions thus obtained.

Uma componente importante de qualquer resposta de imunidade humana é a presença em células T da apresentação células de antigénios (APCs) tais como macrófagos, células B ou células dendriticas. Os fragmentos de péptidas de antigénios alheios são apresentados na superfície do macrófago em combinação com moléculas de complexa histocompatibilidade (MHC), em associação com moléculas assistentes, tais como CD4 e CD8. Tais fragmentos de péptidas antigénicas que são apresentados neste modo são reconhecidos pelo receptor T de células T. A interacção de fragmentos de péptida antigénica com o receptor T resulta na proliferação de células T com antigénios específicos e linfoquinas secretadas pelas células T. A natureza dos fragmentos de péptinas antigénicas apresentadas pelos APCs é critica no estabelecimento da imunidade.An important component of any human immunity response is the presence in T cells of presenting antigen cells (APCs) such as macrophages, B cells or dendritic cells. Peptide fragments from foreign antigens are displayed on the surface of the macrophage in combination with complex histocompatibility (MHC) molecules, in association with helper molecules, such as CD4 and CD8. Such fragments of antigenic peptides that are presented in this mode are recognized by the T cell receptor. The interaction of antigenic peptide fragments with the T receptor results in the proliferation of T cells with specific antigens and T-cell secreted lymphokines. The nature of the fragments of antigenic peptides presented by APCs is critical in establishing immunity.

As proteínas de choque de calor (HSPs) formam uma família de proteínas altamente conservadas que são vastamente distribuídas pelas plantas e pelos reinos animais. Na base dos seus pesos moleculares, os HSP são agrupados em seis famílias distintas: pequenos (hsp 20-30kDa); hsp40; hsp60; 1/17 hsp70; hsp90; e hsplOO. Ainda que os HSP tenham sido originalmente identificados em células sujeitas à pressão do calor, foi descoberta a sua associação com outras formas de tensão, tais como infecções, e assim mais comummente conhecidas como proteínas de tensão (SPs). Por conveniências, as iniciais SP serão usadas aqui para denotar em geral todas as formas de proteínas de tensão produzidas, sendo as iniciais HSP usadas para denotar as proteínas que foram produzidas por tensão de calor.Heat shock proteins (HSPs) form a family of highly conserved proteins that are widely distributed throughout plants and animal kingdoms. On the basis of their molecular weights, the HSP are grouped into six distinct families: small (hsp 20-30kDa); hsp40; hsp60; 1/17 hsp70; hsp90; and hsplOO. Although HSPs were originally identified in cells subjected to heat pressure, their association with other forms of stress, such as infections, and thus more commonly known as stress proteins (SPs) was discovered. For convenience, the initials SP will be used herein to denote in general all forms of tensile proteins produced, the initial HSPs being used to denote the proteins that were produced by heat stress.

Membros da família de mamíferos hsp90 incluem hsp90 cistólico (hsp83) e retículo endoplásmático hsp90 (hsp83), hsp87, Grp94( Erp99) e gp97, ver por exemplo Gething e tal. (1992) Nature 355:33-45. Membros da família hsp70 incluem hsp70 cistólico (p73) e hsp70 (p72), o retículo endoplásmático parcial BiP (GRP78), o mitocondrial parcial hsp70 (Grp75) . Membros da família de mamíferos hsp60 foram somente identificados na mitocondria.Members of the hsp90 mammalian family include hysp90 (hsp83) and endoplasmic reticulum hsp90 (hsp83), hsp87, Grp94 (Erp99) and gp97, see for example Gething and such. (1992) Nature 355: 33-45. Members of the hsp70 family include hsp70, cystolic (p73) and hsp70 (p72), the partial endoplasmic reticulum BiP (GRP78), the partial mitochondrial hsp70 (Grp75). Members of the hsp60 mammalian family were only identified in the mitochondria.

Os SP têm presença frequente nas células. Um dos papéis dos SPs é supervisionar as péptidas de um compartimento celular para outro e apresentar as péptidas às moléculas MHC da apresentação da superfície celular para o sistema imunitário. No caso de células doentes, os SPs também supervisionam as péptidas virais ou com tumor na superfície celular, ver Li e Sirivastave(1994) Behring Inst. Mitt, 94:37-47 e Suzue et al. (1997) Proc.Natl.Acad.Sei. USA 94:13146-51. A função de supervisão é cumprida através da formação de complexos entre os SPs e os fragmentos de péptida antigénica e entre os SPs e os fragmentos de péptida associados a tumor ou vírus numa reacção dependente de ATP. Os SP cooperam com uma variedade de fragmentos de péptidas de largo espectro num modo dependente de ATP. As péptidas em tais complexos aparentam ser uma mistura 2/17 aleatórias de fragmentos de péptidas. As misturas das naturezas exactas dos fragmentos de péptidas ainda não foram determinados. A complexa formação de vários fragmentos de péptidas foi observada também em tecidos normais, não sendo um fenómeno especifico de tumores, ver Srivastava(1994) Experimentia 50:1054-60.SPs have a frequent presence in cells. One of the roles of SPs is to monitor the peptides from one cell compartment to another and present the peptides to the MHC molecules from the presentation of the cell surface to the immune system. In the case of diseased cells, SPs also supervise viral or tumor peptides on the cell surface, see Li and Sirivastave (1994) Behring Inst. Mitt, 94: 37-47 and Suzue et al. (1997) Proc.Natl.Acad.Sei. USA 94: 13146-51. The supervisory function is accomplished by forming complexes between the SPs and the antigenic peptide fragments and between the SPs and the tumor or virus-associated peptide fragments in an ATP-dependent reaction. SPs cooperate with a variety of broad spectrum peptide fragments in an ATP dependent manner. The peptides in such complexes appear to be a random mixture of peptide fragments. Mixtures of the exact natures of the peptide fragments have not yet been determined. The complex formation of various peptide fragments was also observed in normal tissues, not being a tumor-specific phenomenon, see Srivastava (1994) Experimentia 50: 1054-60.

Num contexto terapêutico, foi proposto o uso de mamíferos HSPs como vacinas. As Patentes Internacionais W097/10000 e W097/10001 descrevem que uma mistura de HSPs isolados de células cancerígenas ou infectadas por vírus é capaz de bloquear a imunidade de protecção ou conectar linfócitos T citotóxicos ao tumor ou vírus. No entanto, em contraste, os HSPs isolados de tais células normais são incapazes de bloquear tal imunidade. Não é o caso que os HSPs não sejam imunogénicos por si, mas estão aptos a bloquear a imunidade devido à sua associação com o tumor ou fragmentos de péptidas antigénicos específicos de vírus que são gerados durante o processamento de antigénios. Especificamente os fragmentos de péptidas associados com os HSPs são imunogénicos, e são apresentados às células T. Os HSP livres dos associados fragmentos de péptidas perdem a sua imunogenicidade, ver Udono, H. e Srivastava, P.K., Journal of Experimental Medicine, 178, página 1391 ff, 1993. Até ao presente momento, a natureza destes fragmentos de péptida ainda não foi determinada.In a therapeutic context, the use of mammalian HSPs as vaccines has been proposed. International Patents WO 97/10000 and WO 97/1001 disclose that a mixture of HSPs isolated from cancerous or virus infected cells is capable of blocking protective immunity or connecting cytotoxic T lymphocytes to the tumor or virus. However, in contrast, HSPs isolated from such normal cells are unable to block such immunity. It is not the case that HSPs are not immunogenic per se, but are capable of blocking immunity because of their association with the tumor or virus-specific antigenic peptide fragments that are generated during the processing of antigens. Specifically the peptide fragments associated with the HSPs are immunogenic, and are presented to the T cells. The free HSPs from the associated peptide fragments lose their immunogenicity, see Udono, H. and Srivastava, PK, Journal of Experimental Medicine, 178, page 1391, 1993. To date, the nature of these peptide fragments has not yet been determined.

Actualmente acredita-se que a imunogenicidade dos SPs resulta não dos SP por si, mas dos complexos fragmentos de péptidas associados aos SP. Esta conclusão é baseada num número de características dos complexos. Não existe nenhuma diferença na estrutura dos complexos SPs derivados a partir de células normais e células com tumores. Certos complexos de SPs com fragmentos de péptidas perdem a sua 3/17 imunogenicidade mediante o tratamento com ATP, Udone e tal. (1993) J. Exp. Med. 178:1391-96. Tal perda imunogenicidade é devida à dissociação do complexo nas componentes SP e de péptidas. A imunogenicidade das preparações SP depende da presença de células fagóciticas, tais como macrófagos e outros APCs. Pensa-se actualmente que os SPs são tomados por macrófagos, e que os fragmentos de péptidas associados com esses SPS são apresentados às moléculas de classe I através de MHC do macrófago. Deste modo , a resposta da célula T é iniciada. 0 uso de mamíferos HSP/antigénicos com complexos de fragmento de péptidas bem como vacinas contra patogénios intracelulares foi descrito na Patente Internacional WO 95/24923. Os HSP isolados das células infectadas com virus têm sido sugeridos como a fonte das péptidas antigénicas, que poderiam ser posteriormente apresentados às células T. Tal necessita da produção e purificação dos HSPs de tais células. A estimulação das células através de choques de calor produz um aumento generalizado no nivel das proteinas de de choque de calor. A Patente Internacional W098/34641 descreve o tratamento de doenças infecciosas de complexos de proteinas de choque de calor (s) não covalente limitada por moléculas antigénicas.It is currently believed that the immunogenicity of SPs results not from the SPs per se but from the complex peptide fragments associated with SP. This conclusion is based on a number of characteristics of the complexes. There is no difference in the structure of SPs complexes derived from normal cells and cells with tumors. Certain SP complexes with peptide fragments lose their immunogenicity by treatment with ATP, Udone and such. (1993) J. Exp. Med. 178: 1391-96. Such loss immunogenicity is due to dissociation of the complex in the SP and peptide components. The immunogenicity of SP preparations depends on the presence of phagocytic cells, such as macrophages and other APCs. It is now thought that SPs are taken up by macrophages, and that the peptide fragments associated with these SPS are presented to class I molecules through MHC of the macrophage. Thus, the T cell response is initiated. The use of HSP / antigen mammals with peptide fragment complexes as well as vaccines against intracellular pathogens has been described in WO 95/24923. HSPs isolated from virus infected cells have been suggested as the source of the antigenic peptides, which could then be presented to the T cells. This requires the production and purification of HSPs from such cells. Stimulation of cells through heat shock produces a generalized increase in the level of heat shock proteins. International Patent WO98 / 34641 describes the treatment of infectious diseases of non-covalent heat (s) protein complexes limited by antigenic molecules.

Em Heikema et al. (1997) as células são infectadas com o virus recombinante Semliki Forest expressando a nucleoproteina do viruz de influência. Os complexos das proteinas de choque dessas células foram usados para imunização. 4/17In Heikema et al. (1997) cells are infected with the recombinant Semliki Forest virus expressing the influence virul nucleoprotein. The shock protein complexes of these cells were used for immunization. 4/17

Nem na Patente Internacional W098/34641, nem em Heikema et al. (1997) os complexos são obtidos através de calor ou tratamento TNF.Neither in International Patent WO98 / 34641, nor in Heikema et al. (1997) the complexes are obtained by heat or TNF treatment.

No entanto, não tem sido sugerido que as células possam ser tratadas por choque de calor ou outras tensões, de modo a aumentar os níveis intracelulares dos HSPs. Tal deve-se provavelmente ao facto de ser desejável a estimulação da produção para apenas um pequeno subconjunto de HSPs, que são especialmente imunogénicos, portanto actualmente não existe modo de estimular as células para produzir qualquer subconjunto de HSPs com imunogenicidade melhorada.However, it has not been suggested that the cells can be treated by heat shock or other stresses, so as to increase the intracellular levels of the HSPs. This is probably due to the fact that it is desirable to stimulate production for only a small subset of HSPs, which are especially immunogenic, so there is currently no way to stimulate the cells to produce any subset of HSPs with improved immunogenicity.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOSUMMARY OF THE INVENTION

Portanto, num primeiro aspecto, a presente invenção providencia um método in vitro para produção de uma composição de vacina, compreendendo componente activo determinante imunogénico, caracterizado por compreender os passos de : a) sujeição das células infectadas com uma bactéria intracelular, protozoário, ou patogénio parasitico para gerar tensão com o calor ou factor de necrose em tumor; e b) extracção de SP/complexos de fragmentos de péptida antigénica a partir das células sujeitas a tensão; e c) uso de produtos extraídos tais como o imunogénico determinante na preparação da composição da vacina. É surpreendente que o tratamento de células infectadas com patogénio intracelular com factores de calor ou de necrose por tumor produza SPs que são mais imunogénicos que os SPs derivados a partir de células não induzidas ou células que foram sujeitas a tensão por outros estímulos. Um aspecto notável do bloqueio de imunidade destes SPs induzidos é a 5/17 memória de longo prazo quando comparados com outros subconjuntos de SPs imunizados. As melhores respostas em termos de memória para bactérias patogénicas são observados em proteínas com calor induzido e em protozoários e patogénios parasíticos com factor de necrose devido a tumor. 0 termo vacina é aqui usado para designar qualquer composição contendo um determinante imunogénico que estimule o sistema imunitário de modo que possa responder melhor a futuras infecções. Será considerado vantajoso que a vacina contenha um determinante imunogénico e um adjuvante, que melhor de modo não especifico a resposta a esse determinante.Therefore, in a first aspect, the present invention provides an in vitro method for producing a vaccine composition comprising immunogenic determining active component, comprising the steps of: a) subjecting the infected cells to an intracellular, protozoal, or pathogenic bacterium parasitic to generate tension with heat or tumor necrosis factor; and b) extracting SP / complexes from antigenic peptide fragments from the cells subjected to stress; and c) use of extracted products such as the immunogenic determinant in the preparation of the vaccine composition. It is surprising that treatment of cells infected with intracellular pathogen with heat factors or tumor necrosis produces SPs that are more immunogenic than SPs derived from uninduced cells or cells that have been stressed by other stimuli. A notable aspect of the immunity blockade of these induced SPs is the long term memory when compared to other subsets of immunized SPs. The best memory responses for pathogenic bacteria are observed in proteins with induced heat and in protozoa and parasitic pathogens with tumor necrosis factor. The term "vaccine" is used herein to mean any composition containing an immunogenic determinant that stimulates the immune system so that it can respond better to future infections. It will be considered advantageous if the vaccine contains an immunogenic determinant and an adjuvant, which better not specifically specific the response to that determinant.

Preferivelmente, o determinante imunogénico para a presente invenção é doseado em combinação com um adjuvante. Os adjuvantes adequados podem ser facilmente providenciados por um perito na técnica, tal como um adjuvante Freund completo, um adjuvante Freund incompleto, Quil A, Detox ISCOMs ou esqualeno. No entanto é considerado uma vantagem que a vacina da presente invenção seja eficiente sem um adjuvante. Tal vacina deve ser dada por meios adequados, oralmente ou por injecção.Preferably, the immunogenic determinant for the present invention is dosed in combination with an adjuvant. Suitable adjuvants may be readily provided by a person skilled in the art, such as a complete Freund's adjuvant, an incomplete Freund's adjuvant, Quil A, Detox ISCOMs or squalene. However, it is an advantage that the vaccine of the present invention is effective without an adjuvant. Such a vaccine should be given by appropriate means, either orally or by injection.

Os termos proteínas de choque o proteínas de choque de calor, conforme usados aqui, incluem as famílias de proteínas GroEL, GroES e DnaK e DnaJ bactérias HSPs e famílias relativas em outros patogénios extra celulares. Estas famílias são designadas na base da dimensão das péptidas a que dão o nome. As famílias são altamente conservadas entre espécies. Em adição muitas bactérias também expressam homólogos de proteínas eucarióticas. Preferivelmente a vacina contem uma variedade de complexos 6/17 de fragmentos de péptidas antigénicas / SP derivas do patogénio sujeito a tensão. Preferimos particularmente as famílias de proteínas GroEL, GroES, DnaK e DnaJ para serem usados como determinantes imunogénicos na presente invenção com DnaJ e GroEL sendo as preferidas. Preferivelmente os complexos de SP tem uma homologia superior a 25% e/ou 20% para identificar ao nível dos aminoácidos as famílias HSP de indução de calor. A presente invenção necessita que o tratamento de tensão que é usado esteja apto a estimular a presença de SPs dentro das células infectadas. Preferimos que nas células infectadas com protozoários e patogénios parasíticos a indução de tensão sejam por um factor de necrose por tumor e particularmente factor de necrose-α(TNF-a). Em células infectadas por patogénios bacterianos preferimos que a indução de tensão seja por tratamento de calor das células infectadas a uma temperatura de 5-10°C acima do crescimento natural da temperatura da célula não infectada. Sem estarmos restritos à teoria, pensa-se que o tratamento de células infectadas por patogénios intracelulares opera de modo a induzir especificamente aos HSPs mais aptos a interagir com as péptidas antigénicas a partir do patogénio, ou para induzir os HSPs que são mais facilmente fagocitozados por APCs, ou ambos.The terms "shock proteins" or "heat shock proteins" as used herein include the families of GroEL proteins, GroES and DnaK and DnaJ and HSPs and relative families in other extra cellular pathogens. These families are designated on the basis of the size of the peptides to which they give the name. Families are highly conserved between species. In addition many bacteria also express homologs of eukaryotic proteins. Preferably the vaccine contains a variety of 6/17 complexes of antigenic peptide / SP fragments of the stress pathogen. We particularly prefer the GroEL, GroES, DnaK and DnaJ protein families to be used as immunogenic determinants in the present invention with DnaJ and GroEL being preferred. Preferably the SP complexes have greater than 25% and / or 20% homology to identify at the amino acid level the HSP families of heat induction. The present invention necessitates that the stress treatment which is used is capable of stimulating the presence of SPs within the infected cells. We prefer that in the cells infected with protozoa and parasitic pathogens the induction of tension is by a tumor necrosis factor and particularly necrosis factor-α (TNF-a). In cells infected by bacterial pathogens we prefer that the induction of stress is by heat treatment of the infected cells at a temperature of 5-10 ° C above the natural growth of the temperature of the uninfected cell. Without being bound by theory, it is believed that the treatment of cells infected by intracellular pathogens operates in a way to specifically induce the HSPs most likely to interact with the antigenic peptides from the pathogen, or to induce the HSPs which are more easily phagocytosed by APCs, or both.

As condições óptimas para indução de SPs pode ser prontamente determinada por tentativa e erro e o efeito da mudança de estímulo avaliada através de técnicas convencionais, tais como o teste in vivo em animais ou outras técnicas, por exemplo as descritas em 'Current Protocols in Immunology', Wiley Interscience, 1997. 7/17Optimal conditions for SP induction can be readily determined by trial and error and the effect of the stimulus shift assessed by conventional techniques, such as in vivo testing in animals or other techniques, for example those described in Current Protocols in Immunology Wiley Interscience, 1997. 7/17

Caso as células sejam sujeitas a tensão por tratamento com TNF, o TNF é adequadamente usada a 0.5-1000 unidades internacionais (i.u)/ml de media, preferivelmente cerca de 1-500 i.u/ml. Especificamente para TNF-α preferimos que as células sejam tratadas com 10-500 i.u/ml e sejam depois cultivadas durante 10-16 horas. Alternativamente as células podem crescer em mono-camadas de alimentação e produção de citoquinos ou induzidas para produzir TNF endógeno. Além disso, o tempo de incubação das células varia também com a tensão do estimulo. Preferimos que seja usada uma exposição de 10-16 horas, podendo ser reduzida para 2-4 horas em alguns casos sendo ainda eficiente.If the cells are subjected to stress by TNF treatment, TNF is suitably used at 0.5-1000 international units (i.e.) / ml on average, preferably about 1-500 iu / ml. Specifically for TNF-α we prefer the cells to be treated with 10-500 IU / ml and then cultured for 10-16 hours. Alternatively the cells may grow in mono-layers of feeder and cytokine production or induced to produce endogenous TNF. In addition, the incubation time of the cells also varies with the stimulation voltage. We prefer to use a 10-16 hour exposure, which can be reduced to 2-4 hours in some cases and still be efficient.

Os meios para testar o calor óptimo ou niveis de TNF e período de incubação estão prontamente disponíveis para um perito na técnica. No entanto será considerada uma mais valia que o tratamento exacto não seja crucial para a invenção desde que o tratamento estimule a produção dos produtos imunogénicos desejados, notavelmente o complexos de fragmentos de péptidas antigénicas/SP, entre as células tratadas. De modo semelhante, as outras condições de tratamento, tais como a duração da exposição e o meio de incubação celular não são aspectos essenciais da presente invenção e pode ser variados mediante a natureza exacta da população de células em que é usada. Meios para variar e optimizar os parâmetros estão facilmente acessíveis a um perito na técnica.Means for testing optimal heat or TNF levels and incubation period are readily available to one skilled in the art. However, it will be appreciated that the exact treatment is not crucial to the invention as long as the treatment stimulates the production of the desired immunogenic products, notably the complexes of antigenic peptide / SP fragments, among the treated cells. Similarly, other treatment conditions such as the duration of exposure and the cell incubation medium are not essential aspects of the present invention and may be varied by the exact nature of the cell population in which it is used. Means for varying and optimizing the parameters are readily accessible to one skilled in the art.

Preferivelmente, o TNF deve ser isolado do organismo no qual a célula é tratada. O tratamento de células com TND provenientes do mesmo organismo providencia uma estimulação óptima da síntese dos complexos de SP. NO entanto, o use de TNF de outras espécies ou indivíduos pode ser útil na majoração da regulação dos níveis de SP nas células, de 8/17 modo a providenciar complexos SP adequados para o uso na presente invenção.Preferably, the TNF should be isolated from the organism in which the cell is treated. Treatment of TND cells from the same organism provides optimal stimulation of the synthesis of SP complexes. However, the use of TNF from other species or individuals may be useful in enhancing the regulation of SP levels in cells so as to provide SP complexes suitable for use in the present invention.

Qualquer célula patogénio infectada adequada ou linha de células pode ser usada na presente invenção, para providenciar uma origem de complexos SP. As células infectadas são obtidas por infecção de uma linha de células adequadas com o patogénio desejado in vitro ou através da isolação de células infectadas pelo patogénio in vivo. As células infectadas deste modo podem ser depois sujeitas a tensão adequada in vitro para produzir complexos de SP imunogénico adequados para a vacinação desse patogénio. Tal inclui células recombinantes que expressem antigénios heterologos a partir do patogénio intracelular desejado. Estes também incluem todos os tipos de células afectadas recombinantes usadas para produzir vacinas recombinantes, tais como linhas de células de mamíferos afectados com vectores recombinados através de métodos Standard na técnica tais como a electropuração, fusão e fosfato de cálcio. Além disso, a invenção também inclui a formação dos complexos de SP desejados a partir de células eucarioticas que expressam antigénios de patogénio intracelular heterologo que respondem ao tratamento por calor ou TNF. Ainda que os fragmentos anitigénicos são predominantemente proteínas e péptidas, estes ainda podem incluir carbohidratos, ácido nucleico e lípidos que inibem os SPs.Any suitable infected pathogen cell or cell line may be used in the present invention to provide an origin of SP complexes. Infected cells are obtained by infection of a suitable cell line with the desired pathogen in vitro or by isolation of cells infected by the pathogen in vivo. Cells infected in this way can then be subjected to adequate stress in vitro to produce immunogenic SP complexes suitable for vaccination of that pathogen. This includes recombinant cells expressing heterologous antigens from the desired intracellular pathogen. These also include all types of recombinant affected cells used to produce recombinant vaccines, such as affected mammalian cell lines with recombined vectors by standard methods in the art such as electropuration, fusion and calcium phosphate. In addition, the invention also includes the formation of the desired SP complexes from eukaryotic cells expressing heterologous intracellular pathogen antigens that respond to heat treatment or TNF. Although the anogenic fragments are predominantly proteins and peptides, they may still include carbohydrates, nucleic acid, and lipids that inhibit SPs.

Será apreciado que as células infectadas por patogénios intracelulares para o uso presente possam ter sido modificadas para lhes permitir uma síntese de SPs normalmente induzida pelos adequados estímulos de pressão extra celulares usando qualquer adequada técnica DNA recombinante, por exemplo as descritas em 'Current Protocols in Molecular Biology', Wiley Interscience, 1997. 9/17 A extracção e purificação dos materiais induzidos a partir do material celular através da aplicação de tensão, notavelmente complexos de fragmentos de péptidas antigénicas/SP, a partir do material celular remanescente podem ser obtidos usando qualquer técnica adequada. Por exemplo a tensão do matéria tratado pode ser por homogeneização ou fragmentação ultrasónica, seguida de uma centrifugação para obter a preparação SP de crude. As preparações endógenas de crude SP podem ser usadas directamente como a vacina da invenção. Opcionalmente, as preparações SP podem ser adicionalmente purificadas através de colunas ADP ou outros métodos adequados prontamente disponíveis para um perito na técnica, ver por exemplo as descrições das Patentes WO 97/1000 e WO 97/10001.It will be appreciated that cells infected by intracellular pathogens for the present use may have been modified to allow them to synthesize SPs normally induced by suitable extra cellular pressure stimuli using any suitable recombinant DNA technique, for example those described in Current Protocols in Molecular Biology ', Wiley Interscience, 1997. 9/17 Extraction and purification of the materials induced from the cellular material by applying stress, notably complexes of antigenic peptide / SP fragments, from the remaining cellular material can be obtained using any appropriate technique. For example the tension of the treated material may be by homogenization or ultrasonic fragmentation, followed by centrifugation to obtain the crude SP preparation. Endogenous crude SP preparations can be used directly as the vaccine of the invention. Optionally, the SP-preparations can be further purified by ADP columns or other suitable methods readily available to one skilled in the art, see for example the disclosures of WO 97/1000 and WO 97/10001.

Será considerado uma mais valia o facto de os complexos de fragmentos de péptidas antigénicas/SP imunogénicos específicos, poderem ser isolados a partir da mistura de complexos produzidos a partir da tensão do material celular de modo produzir uma vacina especifica para este patogénio. No entanto, tal não será usualmente necessário podendo ser uma mistura de complexos usada para induzir imunidade de amplo espectro. Caso seja desejado, os fragmentos específicos de péptida antigénica podem ser recuperados a partir do complexo, por exemplo através do tratamento com ATP usando técnicas convencionais.It will be appreciated that specific antigenic peptide / SP immunogenic fragments complexes may be isolated from the mixture of complexes produced from the strain of the cellular material so as to produce a vaccine specific for this pathogen. However, this will not usually be necessary and may be a mixture of complexes used to induce broad spectrum immunity. If desired, specific fragments of antigenic peptide can be recovered from the complex, for example by treatment with ATP using standard techniques.

Os complexos de fragmentos de péptidas anitgénicas/SP da vacina da presente invenção podem ser prescritos em combinação com um adjuvante e numa carreira aquosa. Os adjuvantes adequados são claros para um perito na técnica, tais como o adjuvante completo de Freund, o adjuvante incompleto de Freund, Quil A, Detox, ICOMs ou esqualeno. No 10/17 entanto, as composições de vacina da presente inveção podem ser eficientes sem recurso a um adjuvante. A invenção também providencia o uso de uma invenção de uma vacina em combinação opcional com um adjuvante, na preparação de um medicamento para bloqueio de imunidade de resposta no animal. 0 animal é tipicamente um humano. No entanto, a invenção também pode ser aplicada a outros mamíferos tais como cavalos, gado, caprinos, ovelhas ou suinos, e a pássaros, notavelmente domésticos tais como galinhas ou perus.The peptide / SP peptide fragments complexes of the present invention may be prescribed in combination with an adjuvant and in an aqueous carrier. Suitable adjuvants are clear to one skilled in the art, such as Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, Quil A, Detox, ICOMs or squalene. However, the vaccine compositions of the present invention can be efficient without the use of an adjuvant. The invention also provides the use of an invention of a vaccine in optional combination with an adjuvant in the preparation of a medicament for blocking response immunity in the animal. The animal is typically a human. However, the invention may also be applied to other mammals such as horses, cattle, goats, sheep or pigs, and to notably domestic birds such as chickens or turkeys.

As composições de vacinas da presente invenção podem ser administradas através de meios adequados, tais como oralmente, por inalação, transdermicamente ou através de injecção por qualquer meio de carreira médio. No entanto, é preferível administrar a vacina numa composição aquosa através da injecção usando qualquer agulha adequada ou com técnicas que não necessitem de agulhas.The vaccine compositions of the present invention may be administered by suitable means, such as orally, by inhalation, transdermally or through injection by any medium of career medium. However, it is preferred to administer the vaccine in an aqueous composition through injection using any suitable needle or techniques which do not require needles.

As vacinas da invenção podem conter qualquer concentração adequada de complexos de fragmentos de péptidas antigénicas/SP. Preferimos que os complexos de SP sejam administrados de 10-600 μqr preferivelmente 10-100 \x.q, ainda preferivelmente 25 μρ, por Kg de massa corporal do animal a ser tratado. Será preferido que a vacina da presente invenção possa ser aplicada como tratamento inicial seguida de um ou mais tratamentos subsequentes com as mesmas ou outras taxas de dosagem num intervalo de 2 6 semanas entre cada tratamento para providenciar imunização prolongada contra o patogénio.The vaccines of the invention may contain any suitable concentration of fragmented antigenic peptide / SP complexes. We prefer the SP complexes to be administered from 10-600 μgr preferably 10-100 μg, even more preferably 25 μg per kg body weight of the animal to be treated. It will be preferred that the vaccine of the present invention may be applied as initial treatment followed by one or more subsequent treatments with the same or other dosage rates within a period of 26 weeks between each treatment to provide sustained immunization against the pathogen.

Os exemplos seguintes são providenciados para ilustração, não sendo no entanto limitativos. As figuras 1 3 são perfis 11/17 de Capilares Zona Electroforecticas (CZE) de complexos de SP obtidos através de vários métodos de tensão. A Figura 1 é um perfil de CZE de péptidas/polipéptidas isoladas da conjunção de SPs isolados de M. Tuberculosis rato peritoneal infectado com macrofagos; A Figura 2 é um perfil CZE de péptidas/polipéptidas isoladas de SPs isolados do rato peritoneal infectado com macrofagos M. Tuberculosis; a Figura 3 é um perfil de CZE de péptidas/polipéptidas isoladas de SPs TNF-induzido isolados do rato peritoneal infectado com macrofagos M. Tuberculosis.The following examples are provided for illustration, but are not limiting. Figures 13 are profiles 11/17 of Electrophoretic Zone Capillaries (CZE) of SP complexes obtained by various stress methods. Figure 1 is a CZE profile of peptides / polypeptides isolated from the conjunction of SPs isolated from M. tuberculosis peritoneal mouse infected with macrophages; Figure 2 is a CZE profile of peptides / polypeptides isolated from SPs isolated from the peritoneal mouse infected with macrophages M. Tuberculosis; Figure 3 is a CZE profile of peptides / polypeptides isolated from TNF-induced SPs isolated from the peritoneal mouse infected with M. tuberculosis macrophages.

Exemplo 1: Preparação de SPs induzidos por calorExample 1: Preparation of heat-induced SPs

As células infectadas com M. Bovis foram lavadas num meio livre de cera, tal como RPMI(Sgima), sendo depois aquecidas a 45°C por hora ou 42°C por 5 horas e cultivados durante a noite. As células são então lavadas num meio livre de cera, sendo de seguida lavadas com salinas borrifadas com fosfato (PBS) . As células são então novamente suspensas por um tampão homogeneização. 0 tampão de homogeneização pode ser um tampão hipotónico, tal como 10 mM fosfato pH 7.4 com 2mM MgCI2, após o qual as células são separadas usando um dispositivo de homogeneização de células (ex. um dispositivo Dounce ou Potter, ou Ultraturrax ou Waring). Alternativamente, o tampão de homogeneização pode conter detergente, tal com PBS com 0.%Tween, sendo a concentração de detergente entre 0.1-1% e adequada para solubilizar a membrana da célula. 0 dano celular é então tratado por centrifugação, tipicamente 3-5000g durante 5 minutos, para remover os resíduos das células e dos núcleos, seguidos de uma alta velocidade de centrifugação, tipicamente 100,000g durante 15-30 minutos. O sobrenadante assim obtido é processado para originar complexos fragmentos de péptida antigénica/SP adequados para uso na vacina. Tal pode ser 12/17 simplesmente feito por precipitação de sulfato de amónio que usa um corte de 20-70% de sulfato de amónio. Especificamente 20% (w/w) é adicionado a 4°C, seguido de uma adição de mais sultato de amónio, tal como salina, para remover o sulfato de amónio antes do uso. Será apreciado que os complexos de SP isolados deste modo não sejam purificados por homogeneização, mas que sejam adequados para uso como componente de vacina.Cells infected with M. bovis were washed in a wax-free medium such as RPMI (Sgima), then heated at 45 ° C per hour or 42 ° C for 5 hours and cultured overnight. The cells are then washed in a wax-free medium, and then washed with phosphate-sprinkled saline (PBS). The cells are then resuspended by homogenization buffer. The homogenization buffer may be a hypotonic buffer, such as 10 mM phosphate pH 7.4 with 2 mM MgCl2, after which the cells are separated using a cell homogenization device (eg a Dounce or Potter device, or Ultraturrax or Waring). Alternatively, the homogenization buffer may contain detergent such as PBS with 0.% Tween, the detergent concentration being between 0.1-1% and suitable for solubilizing the cell membrane. Cell damage is then treated by centrifugation, typically 3-5,000g for 5 minutes, to remove residues from cells and nuclei, followed by a high centrifugation rate, typically 100,000g for 15-30 minutes. The supernatant thus obtained is processed to yield complex antigenic peptide / SP fragments suitable for use in the vaccine. This may simply be done by precipitation of ammonium sulfate using a 20-70% cut of ammonium sulfate. Specifically 20% (w / w) is added at 4 ° C, followed by an addition of more ammonium sulphate, such as saline, to remove the ammonium sulfate prior to use. It will be appreciated that the SP complexes isolated in this way are not homogenised but are suitable for use as a vaccine component.

Caso seja necessário um complexo de SP purificado, os complexos podem ser purificados a partir do sobrenadante, através de afinidade por cromatografia em matrizes com difosfato de adenosina, tal como ADP-agarose ou sefarose de ADP. Estes métodos são descritos nas Patente WO 97/10000, WO 97/10001 e WO 97/10002.If a purified SP complex is required, the complexes can be purified from the supernatant by affinity chromatography on matrices with adenosine diphosphate, such as ADP-agarose or ADP sepharose. These methods are described in WO 97/10000, WO 97/10001 and WO 97/10002.

Os complexos de SP podem ser usados a qualquer concentração para providenciar um determinante imunogénico na composição da vacina. Preferimos que a quantidade de complexo de SP induzida que é administrada esteja entre 10-600 μq, preferivelmente 10-100 μρ, ainda preferivelmente 25 μρ por kg da massa corporal do animal.SP complexes can be used at any concentration to provide an immunogenic determinant in the vaccine composition. We prefer that the amount of induced SP complex that is administered is between 10-600 μq, preferably 10-100 μρ, still preferably 25 μρ per kg of body weight of the animal.

De modo a determinar a imunogenicidade dos complexos de SP, as análises de proliferação de células T pode ser usada. As análises adequadas incluem reacções mistas de linfócitos(MLR), analisados por timidina tritiada, analises de toxicidade para determinar a libertação de 511CR a partir das células alvo, ver 'Current Protocols in Immunology' Wiley Interscience, 1997. Alternativamente, a produção de anticorpos pode ser examinada, usando análises convencionais ou avaliadas através de protecção intraneurina, ver 'Current Protocols in Immunology'. 13/17In order to determine the immunogenicity of the SP complexes, T cell proliferation assays can be used. Suitable analyzes include mixed lymphocyte reactions (MLR), analyzed by tritiated thymidine, toxicity analyzes to determine the release of 511CR from target cells, see Current Protocols in Immunology Wiley Interscience, 1997. Alternatively, the production of antibodies can be examined, using standard analyzes or evaluated through intraneurine protection, see Current Protocols in Immunology. 13/17

Exemplo 2: Preparação de SPs TNF-induzidos:Example 2: Preparation of TNF-Induced SPs:

As linhas de células induzidas pelo patogénio malarial plasmodio foram incudas num meio livre de cera, tal como RPMI(Sigma) , e incubadas com TNF-α durante a noite. Tipicamente o os figados de rato hepatócitos preparados por tratamente de colagenese de tecido de figado de rato, foram infectados por plasmodio Berghei através de um incubação das células do figado do rato com cerca de 3 vezes o número de células parasita, durante 5 horas a 35°C. As células permaneceram durante a noite a 37°C com e sem TNF-α. As células TNF-induzidas e as células de controlo foram então lavadas num meio livre de cera seguido de uma lavagem numa salina borrifada com fosfato(PBS).Cell lines induced by the plasmodial malarial pathogen were incubated in a wax-free medium such as RPMI (Sigma), and incubated with TNF-α overnight. Typically the mouse hepatocytes prepared by trapping collagenase from mouse liver tissue were infected with Berghei plasmodium by incubating mouse liver cells with about 3 times the number of parasite cells for 5 hours at 35 ° C. ° C. Cells remained overnight at 37 ° C with and without TNF-α. TNF-induced cells and control cells were then washed in a wax-free medium followed by a wash in a phosphate-sprinkled saline (PBS).

As células são então novamente suspensas com um tampão de homogeneização e deformadas usando um homogeneizador de células, por ciclos de congelamento ou através de detergente. 0 lisato celular é então tratado por centrifugação, tipicamente 3-5000g durante 5 minutos, para remover os resíduos das células e do núcleo, seguidos de alta velocidade de centrifugação, tipicamente 100,000g durante 15-30 minutos. O sobrenadante assim obtido é processado para originar um SP complexo adequado para uso numa vacina conforme descrito no Exemplo 1.The cells are then resuspended with homogenization buffer and deformed using a cell homogenizer, freeze-thaw cycles or through detergent. The cell lysate is then treated by centrifugation, typically 3-5,000g for 5 minutes, to remove cell and core residues, followed by high speed centrifugation, typically 100,000g for 15-30 minutes. The supernatant thus obtained is processed to give a complex SP suitable for use in a vaccine as described in Example 1.

Exemplo 3: Imunização com SPs induzidos; imunidade no recipiente da vacina:Example 3: Immunization with induced SPs; immunity in the vaccine container:

Os SPs foram preparados conforme descrito acima e os ratos e coelhos foram vacinados com 1-10 microgramas de proteína de tensão contendo extracto de salina borrifada de fosfato e distribuídos com doses de vacinas idênticas um mês após a injecção inicial. A indução de imunidade do patogénio foi 14/17 analisada por uma análise Western blot usando unicamente plasmódio ou proteinas M. bovís. Os niveis de anticorpos de 1:1-10,000 foram obtidos de modo rotineiro sendo a actividade citotóxica das células T direccionada para as células infectadas com o patogénio que também poderiam ser detectadas no rato imunizado. Os coelhos foram sujeitos a plasmodio M. bovis durante períodos de 6,12 e 18 meses após as imunizações iniciais reultaram na produção de boas respostas de anticorpos com 1:10 000 indicando boas respostas de memória nos animais imunizados.SPs were prepared as described above and rats and rabbits were vaccinated with 1-10 micrograms of strain protein containing phosphate saline extract and dispensed with doses of identical vaccines one month after the initial injection. Immunity induction of the pathogen was analyzed by Western blot analysis using either plasmid or M. bovine proteins. Antibody levels of 1: 1-10,000 were routinely obtained cytotoxic T cell activity directed to pathogen infected cells which could also be detected in the immunized mouse. Rabbits were subjected to M. bovis plasmodium for periods of 6.12 and 18 months after the initial immunizations resulted in the production of good antibody responses with 1:10 000 indicating good memory responses in the immunized animals.

Exemplo 4: Comparação das péptidas associadas em complexos de SP induzidos e constituídos e o seu uso em vacinasExample 4: Comparison of the associated peptides in induced and constituted SP complexes and their use in vaccines

Os ratos peritoneais isolados de macrofagos através de lavagem de cavidade peritoneal foram infectados com M. Tuberculosis (3Χ10Λ6 células incubadas com 10Λ7 células bacterianas durante 6hrs a 35°C). As culturas de células infectadas cresceram durante a noite na presença ou ausência de lug/ml TNF-α a 37°C, para a isolação da SPs TNF-induzidos ou constituídos, ou chocados a calor através de incubação a 42°C durante duas horas para a isolação dos SPs induzidos por calor (HSPs). As células tratadas foram comprimidas por centrifugação a 3000g durante 5 minutos e e novamente suspensas na solução de 1% em lOOmM Tris-HCI, pH8. O lisato celular foi centrifugado a 5000 durante 5 minutos para remover os detritos das células e dos núcleos, seguido de uma alta velocidade de centrifugação a 100,000 g durante 15-30 minutos. Os SPs e HSps foram preparados a partir dos lisatos limpos da precipitação de sulfato de amónio conforme descrito no Exemplo 1 acima.Peritoneal rats isolated from macrophages by lavage of the peritoneal cavity were infected with M. tuberculosis (3 x 10Λ células cells incubated with 10Λ7 bacterial cells for 6hrs at 35Â ° C). Infected cell cultures were grown overnight in the presence or absence of lug / ml TNF-α at 37 ° C for the isolation of TNF-induced or constituted SPs, or heat shocked by incubation at 42 ° C for two hours for the isolation of heat-induced SPs (HSPs). Treated cells were compressed by centrifugation at 3000g for 5 minutes and resuspended in 1% solution in 100 mM Tris-HCl pH8. Cell lysate was centrifuged at 5000 for 5 minutes to remove debris from cells and nuclei, followed by a high spin speed at 100,000 g for 15-30 minutes. SPs and HSps were prepared from the clean ammonium sulfate precipitation lyates as described in Example 1 above.

As péptidas associadas foram removidas dos HSPs e SPs purificados e novamente suspensas nos complexos 15/17 precipitados em 10% de ácido acético ficando em vapor durante 15 minutos para dissociar os complexos. O HSPs desnaturados e os SPs comprimidos numa Beckman durante 30 minutos num quarto frio contendo as péptidas sobrenadantes extraídas por secagem a frio e analisando a zona capilar por electroforese usando um sistema CZE Beckman. Os perfis das péptidas removidas dos SPs M. Tuberculosis TNF-induzidos ou constituídos foram significativamente diferentes entre si conforme mostrado nas Figuras 1-3, indicando que todos os tipos de SPs considerados nas diferentes famílias de péptidas associadas. A imunização dos coelhos evidenciou similar estrutura de anticorpos em animais imunizados com SPs TNF-induzidos ou constituídos relativamente a anticorpos com estrutura significativamente superior (10-50x) em animais imunizados com SPs bacterianos com calor induzido. A imunização com misturas de péptidas removidas e SPs ou HSPs desnaturados a partir dos quais são isolados originou uma fraca resposta de anticorpos indicando que a imunidade nativa necessária, permanece intacta em complexos de péptidas SP associados.The associated peptides were removed from the purified HSPs and SPs and resuspended in the precipitated complexes in 10% acetic acid and steamed for 15 minutes to dissociate the complexes. The denatured HSPs and the SPs were compressed in a Beckman for 30 minutes in a cold room containing the supernatants peptides extracted by cold drying and analyzing the capillary zone by electrophoresis using a Beckman CZE system. The profiles of the peptides removed from the TNF-induced M. tuberculosis SPs were significantly different from each other as shown in Figures 1-3, indicating that all types of SPs considered in the different families of associated peptides. Immunization of rabbits evidenced a similar structure of antibodies in animals immunized with TNF-induced or constituted SPs relative to antibodies with significantly higher (10-50x) structure in animals immunized with bacterial SPs with induced heat. Immunization with removed peptide mixtures and denatured SPs or HSPs from which they are isolated has resulted in poor antibody response indicating that the required native immunity remains intact in associated SP peptide complexes.

Exemplo 5: Comparação de vacinas com SPs induzidos e constituídosExample 5: Comparison of vaccines with induced and constituted SPs

Os hepatócitos de fígado de rato foram preparados através da digestão forçada de colagenese (PVG) em fígados de rato através de uma mistura fina e lavagem de células isoladas através da centrifugação por DMEM em meios de cultura de tecidos. As células lavadas foram novamente suspensas numa densidade de célula de 7χ10Λ6 células/ml e infectadas com Plasmodio Berghei através de co-cultura a 37°C durante 4 horas. As células infectadas foram usadas para preparar lisatos para análise de anticorpos, ou cultivadas durante a noite na presença ou ausência de lug/ml TNF-α a 37°C para 16/17 isolamento de SPs TNF-induzidos ou constituídos. AS células foram comprimidas através de centrifugação a 3000g durante 5 minutos e novamente suspensas em soluções de 1% de tween em lOOmM Tris-HCI, pH8. O lisato celular foi centrifufado a 5000g durante 5 minutos para remover os resíduos do celulares e do núcleo, seguidos de elevada velocidade de centrifugação a 100,000g durante 15-30 minutos. O lisato limpo foi então usado para análise de anticorpos ou para isolamento de SPs. Os SPs TNF-induzidos ou constituídos foram preparados a partir dos lisatos limpos através da precipitação de sulfato de amónio conforme descrito no Exemplo 1 acima.Rat liver hepatocytes were prepared by forced digestion of collagenase (PVG) in rat livers by fine mixing and washing isolated cells by centrifugation by DMEM in tissue culture media. The washed cells were resuspended at a cell density of 7 x 10 células6 cells / ml and infected with Plasmodio Berghei by co-culturing at 37 ° C for 4 hours. Infected cells were used to prepare lysates for antibody analysis, or cultured overnight in the presence or absence of lug / ml TNF-α at 37 ° C for 16/17 isolation of TNF-induced or constituted SPs. Cells were compressed by centrifugation at 3000g for 5 minutes and resuspended in 1% tween solutions in 100 mM Tris-HCl pH8. The cell lysate was centrifuged at 5000g for 5 minutes to remove cellular and core residues followed by high spin speed at 100,000g for 15-30 minutes. The cleaned lysate was then used for antibody analysis or for isolation of SPs. TNF-induced or constituted SPs were prepared from the cleaned lysates by precipitation of ammonium sulfate as described in Example 1 above.

Os coelhos foram imunizados com SPs isolados de TNF-induzido ou constituído e bactérias novamente suspensas a calor induzido em salina borrifada com fosfato sem a adição de qualquer adjuvante na primeira ou posteriores vacinas. As estruturas de anticorpos nos animais imunizados foram analisadas em 10 séries de diluições usando um ensaio em todas os lisatos celulares a partir de hepatocitos recentemente contamindos conforme descrito na análise acima. Os animais vacinados com SPs TNF-induzidos evidenciaram uma estrutura de anticorpos 10 a 100 vezes superior do que nos imunizados SPs constituídos.Rabbits were immunized with SPs isolated from TNF-induced or constituted and bacteria resuspended in induced heat in phosphate-sprinkled saline without the addition of any adjuvant in the first or subsequent vaccines. Antibody structures in the immunized animals were analyzed in 10 series of dilutions using an assay on all cell lysates from freshly contaminated hepatocytes as described in the above analysis. Animals vaccinated with TNF-induced SPs showed an antibody structure 10 to 100 fold higher than in the immunized SPs constituted.

Lisboa, 11 de Fevereiro de 2009 17/17Lisbon, 11th February 2009 17/17

Claims (11)

REIVINDICAÇÕES 1. Um método in vitro para produção de uma composição de vacina, compreendendo componente activo determinante imunogénico, caracterizado por compreender os passos de: a) sujeição das células infectadas com uma bactéria intracelular, protozoário, ou patogénio parasitico para gerar tensão com o calor ou factor de necrose em tumor; e b) extracção de SP/complexos de fragmentos de péptida antigénica a partir das células sujeitas a tensão; e c) uso de produtos extraídos tais como o imunogénico determinante na preparação da composição da vacina.An in vitro method for producing a vaccine composition comprising immunogenic determining active component, comprising the steps of: a) subjecting the infected cells to an intracellular bacterium, protozoa, or parasitic pathogen to generate tension with the heat or tumor necrosis factor; and b) extracting SP / complexes from antigenic peptide fragments from the cells subjected to stress; and c) use of extracted products such as the immunogenic determinant in the preparation of the vaccine composition. 2. Um método conforme reivindicado na reivindicação 1, em que o ingrediente activo do determinante imunogénico consiste predominantemente em ou mais complexos de fragmentos de péptidas antigénicas/proteinas de choque.A method as claimed in claim 1, wherein the active ingredient of the immunogenic determinant consists predominantly of more or complexes of antigenic peptide fragments / shock proteins. 3. Um método conforme reivindicado nas reivindicação 1 ou 2, caracterizado por as células serem infectadas por patogénios bacterianos e que a tensão aplicada seja o calor.A method as claimed in claim 1 or 2, wherein the cells are infected by bacterial pathogens and the applied voltage is heat. 4. Um método conforme reivindicado na reivindicação 3, em que a tensão de calor é obtida através do aquecimento de 5 a 8°C acima da temperatura normal da cultivação das células.A method as claimed in claim 3, wherein the heat stress is obtained by heating at 5 to 8 ° C above the normal cell culture temperature. 5. Um método conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado por as células serem infectadas através de patogénios parasiticos e que a tensão seja induzida por um factor de necrose por tumor. 1/2A method as claimed in claim 1, wherein the cells are infected through parasitic pathogens and the stress is induced by a tumor necrosis factor. 1/2 6. Um método conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por as células terem sido modificadas para induzir a síntese de proteínas de tensão.A method as claimed in any one of the preceding claims, characterized in that the cells have been modified to induce the synthesis of stress proteins. 7. Uma composição para vacina contendo um determinante imunogénico, caracterizada pelo determinante imunogénico ser produzido através de um método conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.A vaccine composition containing an immunogenic determinant, characterized in that the immunogenic determinant is produced by a method as claimed in any one of claims 1 to 6. 8. Uma composição para vacina conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizada por a composição também compreender um adjuvante para o determinante imunogénico.A vaccine composition as claimed in claim 7, characterized in that the composition also comprises an adjuvant for the immunogenic determinant. 9. Uma composição para vacina conforme reivindicado nas reivindicações 7 ou 8, caracterizada por a composição ser uma composição aquosa.A vaccine composition as claimed in claims 7 or 8, characterized in that the composition is an aqueous composition. 10. Uso de uma composição para vacina conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 7 a 9 para a preparação de um medicamento para bloqueamento de resposta de imunização do animal.Use of a vaccine composition as claimed in any one of claims 7 to 9 for the preparation of a medicament for blocking the immunization response of the animal. 11. O uso conforme reivindicado na reivindicação 10, caracterizado pela composição para vacina ser para administração para injecção. Lisboa, 11 de Fevereiro de 2009 2/2The use as claimed in claim 10, wherein the vaccine composition is for administration for injection. Lisbon, February 11, 2009 2/2