PT1196433E - Derivados de peptidos ciclicos como inibidores da integrina clvbg - Google Patents
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Description
1
DESCRIÇÃO
"DERIVADOS DE PÉPTIDOS CÍCLICOS COMO INIBIDORES DA INTEGRINA ανβ6"
A invenção é relativa a novos derivados de péptidos com a fórmula I
Cyclo- (Arg-X1-Asp-X2-X3-X4-X5-X6-R1) I em que X1 significa Ser, Gly ou Thr, X2 significa Leu, Ile, Nle, Vai ou Phe, X3 significa Asp, Glu, Lys ou Phe, X4 significa Gly, Ala ou Ser, X5 significa Leu, Ile, Nle, Vai ou Phe, X6 significa Arg, Har ou Lys, R1 significa um ou mais radicais ácido ω-s de ácido pm, aminocarboxílico, tendo o radical ou os radicai ω-aminocarboxílico um comprimento de 500 a 2 500 estando incluídas as formas D e L dos radicais aminoácidos opticamente activos; assim como os respectivos sais e solvatos fisiologicamente inócuos. A invenção teve por objectivo descobrir novos compostos com propriedades valiosas, em particular aqueles que pudessem ser empregues no fabrico de medicamentos.
Descobriu-se que os compostos de acordo com a invenção seus sais possuem propriedades farmacológicas sais e os muito 2 valiosas em caso de boa compatibilidade. Os péptidos segundo a invenção podem ser empregues como inibidores eficazes do receptor da integrina ανβε e, com isso, no tratamento de diversas doenças e de diversos estados patológicos.
Outros inibidores da integrina ανβε estão descritos no DE 19858857 e por S. Kraft et al. in "J. Biol. Chem." 274, 1979-85 (1999) . Os compostos de acordo com a invenção devem ser considerados uma invenção opcional em relação ao pedido mencionado.
As integrinas pertencem à família da classe heterodimérica I - receptores transmembrana, que desempenham um papel importante em numerosas operações de adesão célula-matriz ou de adesão célula-célula (Tuckwell et al., 1996, "Symp.
Soc. Exp. Biol." 47) . As mesmas podem ser subdivididas genericamente em três classes: as integrinas βι, que representam receptores para a matriz extracelular, as integrinas β2, que podem ser activadas em leucócitos e que são "despoletadas" durante processos inflamatórios, assim como as integrinas av, que influenciam a resposta celular em processos de cicatrização de feridas e noutros processos patológicos (Marshall and Hart, 1996, "Semin. Câncer Biol." 7, 191) .
Todas as integrinas α5βι, αι^β3, α8βι, ανβι, ανβ3, ανβ5, ανβ8 e α,νβε ligam-se à sequência peptídica Arg-Gly-Asp (RGD) em ligandos naturais, como, por exemplo, a fibronectina ou a vitronectina. Os péptidos contendo RGD solúveis permitem inibir a interacção de cada uma destas integrinas com o respectivo ligando natural. A ανβε é uma integrina 3 relativamente rara (Busk et al., 1992, "J. Biol. Chem." 267(9), 5790), que se multiplica em operações de reparação no tecido epitelial e que, preferencialmente, liga as moléculas de matriz naturais fibronectina e tenascina (Wang et al., 1996, "Am. J. Respir. Cell Mol. Biol." 15(5), 664). As funções fisiológicas e patológicas da ανββ ainda não são bem conhecidas, mas presume-se, contudo, que esta integrina desempenha um papel importante em operações fisiológicas e em doenças (por exemplo, inflamações, cicatrização de feridas, tumores) em que tomam parte as células epiteliais. Assim, a ανβε exprime-se nos queratinócitos nas feridas (Haapasalmi et al., 1996, "J. Invest. Dermatol." 106(1), 42), do que se deve depreender que, a par de processos de cicatrização de feridas e de inflamações, os agonistas e os antagonistas da integrina mencionada também podem influenciar outras situações patológicas da pele, tais como, por exemplo, a psoríase. Além disso, a ανββ desempenha um papel no epitélio das vias respiratórias (Weinacker et al., 1995, "Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 12(5), 547), pelo que os respectivos agonistas/antagonistas desta integrina poderiam ser empregues com êxito em doenças das vias respiratórias, tais como bronquite, asma, fibroses pulmonares e tumores das vias respiratórias. Por fim, sabe-se que a ανβε também desempenha um papel no epitélio do intestino, pelo que os respectivos agonistas/antagonistas da integrina poderiam ser empregues no tratamento de inflamações, de tumores e de feridas do tracto gastrointestinal. A dependência da origem de angiogénese em relação à interacção entre as integrinas vasculares e as proteínas de matriz extracelulares encontra-se descrita por P. C. 4
Brooks, R. A. Clark e D. A. Cheresh in "Science" 264, 569-71 (1994) .
Surgiu assim o objectivo de encontrar - a par dos anticorpos e ligandos de elevado peso molecular naturais conhecidos até à data, que são difíceis de manusear em termos terapêuticos e de diagnóstico - ligandos de baixo peso molecular selectivos ou específicos potentes para a (Χνββ/· de preferência péptidos que pudessem ser empregues nas áreas terapêuticas mencionadas, mas também como meio de diagnóstico ou reagente.
Descobriu-se que os compostos peptídicos segundo a invenção e os seus sais exercem, como moléculas solúveis, um efeito sobres as células que têm o referido receptor, ou, se estiverem ligados a superfícies, representam ligandos sintéticos para a aderência celular conferida pela ανββ · Actuam sobretudo como inibidores da integrina ανβε, inibindo em particular as interacções do receptor com outros ligandos, como, por exemplo, a ligação da fibronectina. Esta acção pode ser comprovada, por exemplo, pelo método descrito por J. W. Smith et al. in "J. Biol. Chem." 265, 12267 - 12271 (1990).
Descobriu-se ainda que as novas substâncias têm, no caso de boa compatibilidade, propriedades farmacológicas muito valiosas, e que podem ser empregues como medicamentos. Isto é descrito com maior detalhe mais em baixo.
Os compostos peptídicos, em conformidade com a invenção, podem ainda ser empregues como meios de diagnóstico na detecção e na localização de estados patológicos no sistema 5 epitelial in vivo e in vitro, se forem munidos dos respectivos marcadores (por exemplo, o radical de biotinilo) de acordo com o estado da técnica. A invenção também abarca as combinações com pelo menos outra substância activa e/ou conjugados com outras substâncias activas, como as substâncias activas citotóxicas, e conjugados com marcadores de rádio para a terapia com raios X ou diagnóstico PET, mas também proteínas de fusão com proteínas de marcação como GFP ou anticorpos, ou proteínas terapêuticas como a IL-2.
Os compostos especialmente eficazes são os da fórmula I, em que uma sequência octapeptídica - Cyclo-(Arg-X1-Asp-X2-X3-X4-X5-X6, em que os radicais X1, X2, X3, X4, X5 e X6 têm os significados dados - é ampliada por R1. 0 efeito da ampliação de anel é mostrado no exemplo do Cyclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg) [EMD 271588]. Como composto comparativo usou-se o Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2 [EMD 271293] . Na tabela que se segue, estão indicados alguns péptidos Cyclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-R1), a distância de R1 (calculada) e o valor Q (IC50 [substância] / IC50 [EMD 271293] ou -log Q. R1 Distância [pm] Q -log Q 0 0 47 -1,672 Gly 370 2,1 -0,322 Abu 617 0,028 1,553 Gly-Gly 740 0,05 1,301 Aha 870 0,036 1,444 Aee 1078 0,038 1,420 Gly—Gly—Gly 1110 0,03 1,523 Abu-Abu 1235 0,03 1,523 Gly-Gly-Gly-Glv 1480 0,033 1,481 Aha-Aha 1740 0,036 1,444 Gly-Gly-Gly-Glv-Gly 1850 0,046 1,337 Gly-(Gly)4-Gly 2220 0,05 1,301 6
Os compostos especialmente eficazes são logo obtidos se o comprimento de espaçamento R1 tiver atingido os 500 pm aproximadamente. Especialmente preferidos são os compostos com a fórmula I, em que R1 tem um ou mais radicais de ácido ω-aminocarboxílico (e) , tendo o radical ou os radicais de ácido ω-aminocarboxílico um comprimento de 600 a 2 500 pm, com total preferência um comprimento de espaçamento de 600 a 2 000 pm. Os radicais de ácido ω-aminocarboxílico podem ser qualquer ácido ω-aminocarboxílico, dando-se particular preferência aos aminoácidos seguintes escolhidos do grupo:
Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gin, Glu, Hcy, His, Hse, Ile, Leu, Lys, Met, Pen, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Vai e H2N-(CH2CH20) m- (CH2) n_COOH, em que m e n significam, por sua vez independentemente um do outro, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, na condição de que m + n > 0.
Assim sendo, a invenção tem preferencialmente por objecto os derivados de péptidos de acordo com a reivindicação 1 com a fórmula I
Cyclo- (Arg-X1-Asp-X2-X3-X4-X5-X6-R1) em que X1 significa Ser, Gly ou Thr, X2 significa Leu, Ile, Nle, Vai ou X3 significa Asp, Glu, Lys ou Phe, X4 significa Gly, Ala ou Ser, 7 X5 significa Leu, Ile, Nle, Vai ou Phe, X6 significa Arg, Har ou Lys, R1 significa 1 a 10 aminoácidos, escolhido(s) do grupo Ala,
Asn, Asp, Arg, Cys, Gin, Glu, Hcy, His, Hse, Ile, Leu, Lys, Met, Pen, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Vai e H2N- (CH2CH2O) m- (CH2 ) n-COOH, m e n significam, por sua vez independentemente um do outro, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11 ou 12, na condição de que m + n > 0, estando incluídas as formas D e L dos radicais aminoácidos opticamente activos, assim como os respectivos sais fisiologicamente inócuos.
Alguns grupos preferidos de compostos podem ser expressos pelas seguintes fórmulas parciais Ia a Ih, as quais correspondem à fórmula I e em que os radicais não mencionados em detalhe têm o significado dado na fórmula I, tendo porém em conta que: em a) X1 significa Gly ou Thr; em b) X1 significa Gly ou Thr, X2 significa Leu; em c) significa Gly ou Thr, X1 X2 significa Leu, X3 significa Asp ou D- -Asp; em d) X1 significa Gly ou Thr, X2 significa Leu, X3 significa Asp ou D- -Asp X4 significa Gly ou Ala; em e) X1 significa Gly ou Thr, X2 significa Leu, X3 significa Asp ou D- -Asp, X4 significa Gly ou Ala, X5 significa Leu; em f) X1 significa Gly ou Thr, X2 significa Leu, X3 significa Asp ou D- -Asp, X4 significa Gly, Ala ou Ser X5 significa Leu, X6 significa Arg; em g) X1 significa Gly ou Thr, X2 significa Leu, X3 significa Asp ou D- -Asp, X4 significa Gly, Ala ou Ser 9 X5 significa Leu, X6 significa Arg, R1 significa 1 a 10 aminoác: Asn , Asp, Arg, Cys , Gin, Glu, Met , Pen, Phe, Pro, Ser, (CH 2CH20)m-(CH2 )n-COOH, m < e n signif icam , por sua out ro, 0, 1, 2 , 3, 4, 5, 6, 7 na condição de que m + n > 0; dos, escolhidos do grupo Ala, Hcy, His, Hse, Ile, Leu, Lys, Thr, Trp, Tyr, Vai e H2N- vez independentemente um do , 8, 9, 10, 11 ou 12, em h) X1 significa Gly ou Thr, X2 significa Leu, X3 significa Asp ou D-Asp X4 significa Gly, Ala ou X5 significa Leu, X6 significa Arg, R1 significa 1 a 6 amino β-Ala, Abu ou Ah a; escolhidos do grupo Gly, e os respectivos sais. A invenção tem sobretudo por objecto os compostos peptídicos escolhidos do grupo: 10
Cydo-íArg-ôly-Asp-Leu-Asp-Ala-Leu-Arg-Gfy-Gly-Gly),
Cydo^Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Gly-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly), C yci o-( A rg ~G ly-As p-Le u - D-Ala-AI a - Leu -Arg~G I y-G I y-G íy) ,
Gyclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly),
Cydo-(Arg~G!y-Asp-Leu-DnAsp-Alâ-Leu-Arg-Abu-Abu)(
CyckKArg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aha-Aha),
Cydo^Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aha),
Cyclo-ÍArg-Giy-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aee),
CycIcKArg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu),
CycÍo-(Ãrg»Thr“Asp»Leu-D-Asp-Aia-Leu-Arg-p-A!a),
CycÍG-(Arg-Gly-A5p~Leu-D-Asp~AÍa«Leu~Ârg-p~Âía)f e os respectivos sais fisiologicamente inócuos.
As abreviaturas, anterior e posteriormente apresentadas, de radicais aminoácidos representam os radicais dos seguintes aminoácidos:
Abu
Aee
Acido 4-aminobutirico H2N-(CH2CH20)2-CH2-COOH
Ah a
Aib
Ala
Asn
Asp
Arg Bgl Cys
Dab
Dap Ácido 6-amino-hexânico, ácido 6-aminocapróico Ácido α-amino-isobutirico Alanina Asparagina Ácido aspárgico Arginina C-alfa-terc.-butilglicina Cisteina Ácido 2,4-diaminobutirico Acido 2,3-diaminopropiónico
Gin
Glutamina
Glp Acido piroglutâmico Glu Ácido glutâmico Gly Glicina Har Homoarginina Hcy Homocisteína His Histidina homo-Phe homofenilalanina Hse homoserina Ile Isoleucina Leu Leucina Lys Lisina Met Metionina Nal Naft-2-il-alanina Nle Norleucina Orn Ornitina Pen Penicilamina Phe Fenilalanina Phg Fenilglicina 4-Hal-Phe 4-halogenofenilalanina Pro Prolina Ser Serina Thr Treonina TIS triisopropilsilano Trp Triptofano Tyr Tirosina Vai Valina. Há ainda os seguintes significados Ac Acetilo
BOC
Terc.-butoxicarbonilo 12 BSA Albumina de soro bovino CBZ ou Z Benziloxicarbonilo DCC1 Diciclo-hexilcarbodiimida DCM diclorometano DIEA Dietilamina DMF Dimetilformamida EDC1 N-etil-N,N'-(dimetilaminopropil)-carbodiimida Et Et ilo FCA Ácido fluoresceinocarboxílico FITC Fluoresceinoisotiocianato Fmoc 9-fluorenilmetoxicarbonilo FTH Fluoresceinotioureia HOBt 1-hidroxibenzotriazol Me Metilo MB HA 4-metilbenzidrilamina Mtr 4-metoxi-2,3,6-trimetilfenilsulfonilo HONSu N-hidroxissuccinimida OBut Éster de terc.-butilo Oct Octanoilo OMe Éster de metilo OEt Éster de etilo Pbf 2,2,4,6,7-pentametil-di-hidrobenzofurano-5- sulfonilo
Pmc 2,2,5,7, 8-pentametilcromano-6-sulfonilo POA Fenoxiacetilo Sal Saliciloilo TBS + + Soro fisiológico tamponado com Tris com catiões bivalentes TBSA TBS + BSA TBTU Tetrafluoroborato de 2-(lH-benzotriazol-l-il)- 1,1,3-tetrametilurónio TF A Acido trifluoroacético 13
Trt Tritilo (trifenilmetilo).
Desde que os aminoácidos acima referidos possam assumir várias formas enantioméricas, todas essas formas, e também as suas misturas (por exemplo, as formas DL), encontram-se anterior e posteriormente incluídas. Além disso, os aminoácidos podem estar providos dos respectivos grupos de protecção de si conhecidos. A invenção também tem por objecto os hidratos e solvatos, como, por exemplo, os alcoolatos, destes compostos.
Nos compostos de acordo com a invenção também se encontram incluídos os designados por derivados prodrugs, ou seja, os compostos transformados com, por exemplo, grupos alquilo ou grupos acilo, açúcares ou oligopéptidos, os quais são dissociados rapidamente no organismo nos compostos activos de acordo com a invenção. A estes também pertencem os derivados poliméricos biodegradáveis dos compostos de acordo com a invenção, como descrito, por exemplo, in "Int. J. Pharm." 115, 61 - 67 (1995).
Nos compostos de acordo com a invenção encontram-se também - além dos compostos com a fórmula I que estejam ligados uns aos outros de forma peptídica pelos grupos α-amina e α-carboxi (ligação cabeça-cauda) - aqueles compostos cíclicos, que - caso exista, por exemplo, uma cadeia lateral funcional, como, por exemplo, um grupo SH - estejam ligados do seguinte modo:
Lado-lado, por exemplo, S-S (dissulfureto) ,
Cabeça-lado Lado-cauda. 14
Além disso, os compostos segundo a invenção também incluem os derivados que consistam nos péptidos conforme a invenção propriamente ditos e em compostos marcadores conhecidos, que permitam detectar facilmente os péptidos. Os exemplos destes derivados são os péptidos de marcação fluorescente ou biotinilados, marcados com radioactividade. "Radical corante fluorescente" significa, preferencialmente, 7-acetoxicumarin-3-ilo, fluorescein-5-(e/ou 6)-ilo, 2',7'-diclorofluorescein-5-(e 6)-ilo, di-hidrotetrametilrosamin-4-ilo, tetrametilrodamin-5-(e/ou 6)-ilo, 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-etilo ou 4,4-difluoro-5,7-difenil-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indecen-3-etilo.
Os radicais corantes fluorescentes funcionalizados apropriados, que podem servir de reagentes no fabrico dos compostos segundo a invenção com a fórmula I, encontram-se por exemplo descritos em "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals", 5.a edição, 1992 - 1994, por R. P. Haughland, Molecular Probes, Inc.. A invenção não abrange apenas os péptidos referidos, mas também as misturas e as preparações que também contenham, além destes compostos segundo a invenção, outras substâncias activas farmacológicas ou adjuvantes, que possam influenciar da forma pretendida a acção farmacológica primária dos péptidos segundo a invenção.
Os compostos em conformidade com a invenção e também as substâncias de partida para o seu fabrico são de resto fabricados por métodos de si conhecidos e com frequência empregues, como descritos na literatura (por exemplo, nas 15 obras padrão, como Houben-Weyl, "Methoden der organischen Chemie", Georg-Thieme-Verlag, Estugarda), e isto sob as condições de reacção conhecidas e adequadas às transformações mencionadas. Neste caso, também é possível recorrer a variantes de si conhecidas.
Em termos preferenciais, os péptidos em conformidade com a invenção podem ser fabricados por síntese de fase sólida e posteriores dissociação e purificação, como descrito, por exemplo, por Jonczyk und Meienhofer (Peptides, Proc. 8th Am. Pept. Symp., Eds. V. Hruby und D. H. Rich, Pierce Comp. III, pág. 73 - 77, 1983, ou "Angew. Chem." 104, 1992, 375) ou de acordo com Merrifield ("J. Am. Chem. Soc." 9_4, 1972, 3102). Os péptidos em conformidade com a invenção podem ser produzidos em fase sólida (manualmente ou numa máquina de síntese), numa estratégia de Fmoc com grupos de protecção laterais de labilidade ácida, e purificados por meio de RP-HPLC. A homogeneidade de cristã pode ser medida por RP-HPLC e a identidade das substâncias por meio de FAB-MS.
De resto, os péptidos podem ser produzidos por métodos usuais da síntese de aminoácidos e de péptidos, como conhecido a partir, por exemplo, de "Novabiochem - 1999 Catalog & Peptide Synthesis Handbook der Calbiochem-Novabiochem GmbH", D-65796 Bad Soden, de inúmeras obras padrão e de pedidos de patente publicados. É possível utilizar ligações por etapas e condensações de fragmentos. Diferentes grupos de terminação N, de terminação C e de protecção lateral podem ser utilizados, sendo preferencialmente escolhidos os passíveis de dissociação ortogonal. As etapas de ligação podem ser realizadas com diferentes reagentes de condensação, tais como carbodiimidas, carbodiimidazol, os do tipo urónio como 16 TBTU, métodos de anidrido mistos, e métodos de halóides de ácido ou de ésteres activos. Convém que os ésteres activados sejam produzidos in situ, através, por exemplo, da adição de HOBt ou de N-hidroxissuccinimida. A ciclização de uma molécula percursora linear com grupos de protecção lateral também pode ser realizada com estas reacções de condensação, como descrito, por exemplo, no DE 43 10 643 ou in Houben-Weyl, I. c., volume 15/11, páginas 1 a 806 (1974). É possivel empregar diferentes resinas e funções âncora na sintese peptídica de fase sólida. As resinas podem ter por base, por exemplo, o poliestireno ou a poliacrilamida; as funções âncora como Wang, o-clorotritilo, podem ser empregues no fabrico de ácidos peptidicos, âncoras de aminoxantenoxi, na produção, por exemplo, de amidas peptídicas.
Os péptidos/as proteínas biotinilados/as ou marcados/as com fluorescência também podem ser fabricados/as por métodos padrão (por exemplo, E. A. Bayer and M. Wilchek in "Methods of Biochemical Analysis" vol. 26 The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology; e "Hanbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals", 6.a edição, 1996, por R. P. Haugland, Molecular Probes, Inc.; ou também no WO 97/14716).
Obviamente, os péptidos segundo a invenção também podem ser libertados por solvólise, em particular hidrólise, ou por hidrogenólise, dos respectivos derivados funcionais. As substâncias de partida preferidas para a solvólise ou para a hidrogenólise são aquelas que contenham, em vez de um ou mais grupos amina e/ou hidroxi livres, os respectivos 17 grupos amina e/ou hidroxi protegidos; de preferência aquelas que tenham um grupo de protecção amina em vez de um átomo de H que esteja ligado a um átomo de N, ou um grupo de protecção hidroxi em vez do átomo de H de um grupo hidroxi. 0 mesmo é válido para os ácidos carboxilicos, que possam ser protegidos por substituição da sua função hidroxi -CO-OH, por um grupo de protecção, por exemplo, como éster. A expressão "grupo de protecção amina" é geralmente conhecida e diz respeito a grupos apropriados para proteger (bloquear) um grupo amina de transformações químicas, sendo porém de fácil remoção depois de a reacção química pretendida ter sido realizada noutros pontos da molécula. A expressão "grupo de protecção hidroxi" é também de modo geral conhecida, e diz respeito a grupos adequados a proteger um grupo hidroxi de transformações químicas, sendo porém de fácil remoção depois de a reacção química pretendida ter sido realizada noutros pontos da molécula. A libertação dos compostos dos seus derivados funcionais dá-se - consoante o grupo de protecção utilizado - com, por exemplo, ácidos fortes, favoravelmente com TFA ou ácido perclórico, mas também com outros ácidos inorgânicos fortes como o ácido clorídrico ou o ácido sulfúrico, com ácidos carboxilicos orgânicos fortes como o ácido tricloroacético, ou ácidos sulfónicos como o ácido benzenossulfónico ou o ácido p-toluenossulfónico. Os grupos de protecção de remoção hidrogenolítica (por exemplo, CBZ ou benzilo) podem ser dissociados através, por exemplo, do tratamento com hidrogénio na presença de um catalisador (por exemplo, de um catalisador de metal nobre como o paládio, favoravelmente num suporte como o carbono). 18
Os grupos de protecção típicos para terminações N e para grupos amina laterais são Z, BOC, Fmoc; os para as terminações C ou para as cadeias laterais de Asp ou Glu são O-prim.-alquilo (por exemplo, OMe ou OEt), O-terc.-alquilo (por exemplo, OBut) ou Obenzilo. À função guanidina da Arg, adequa-se, por exemplo, Z, BOC, NO2, Mtr, Pmc ou Pbf. As funções alcoólicas podem ser protegidas por radicais benzilo, radicais terc.-alquilo ou por grupos tritilo.
Os grupos BOC, OBut e Mtr podem ser dissociados com, preferencialmente e por exemplo, TFA em diclorometano , ou com cerca de 3 a 5 n de HC1 em dioxano, a 15 - 30°; e 0 grupo FMOC com uma solução a cerca de 5 - 50% de dimetilamina, dietilamina ou piperidina em DMF, a 15 - 30°. O grupo tritilo é empregue, por exemplo, na protecção dos aminoácidos histidina, asparagina, glutamina e cisteína. A dissociação decorre, consoante o produto final pretendido, com TFA/10% de tiofenol, em que o grupo tritilo é dissociado de todos os aminoácidos mencionados. No caso do emprego de TFA/anisol ou de TFA/tioanisol, o grupo tritilo é apenas dissociado de His, Asn e Gin, permanecendo na cadeia lateral de Cys.
Os grupos de protecção de remoção hidrogenolítica (por exemplo, CBZ ou benzilo) podem ser dissociados através, por exemplo, do tratamento com hidrogénio, na presença de um catalisador (por exemplo, de um catalisador de metal nobre como o paládio, favoravelmente num suporte como o carbono). Como solventes, adequam-se neste caso os acima referidos, em especial, por exemplo, álcoois como metanol ou etanol, ou amidas como a DMF. A hidrogenólise é normalmente realizada a temperaturas entre cerca de 0 e 100°, e a 19 pressões entre cerca de 1 e 200 bar, de preferência a 20 -30° e a 1 - 10 bar. Uma hidrogenólise do grupo CBZ é por exemplo bem realizada em Pd/C a 5 - 10 % em metanol, ou com formiato de amónio (em vez de hidrogénio) em Pd/C em metanol/DMF, a 20 - 30°.
Como já mencionado, os péptidos segundo a invenção abrangem os respectivos sais fisiologicamente inócuos, que também podem ser produzidos por métodos padrão. Assim, uma base de um composto de acordo com a invenção pode passar com um ácido ao respectivo sal de ácido de adição ácida, através, por exemplo, da transformação de quantidades equivalentes da base e do ácido num solvente inerte, como o etanol, e posterior concentração por evaporização. Considera-se nesta transformação sobretudo os ácidos que dão origem a sais fisiologicamente inócuos. Assim sendo, é possível utilizar ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácido sulfúrico, ácido nítrico, halogenetos de hidrogénio como ácido clorídrico ou ácido hidrobrómico, ácidos fosfóricos como ácido ortofosfórico, ácido sulfâmico, e ainda ácidos orgânicos, em particular ácidos carboxílicos, sulfónicos ou sulfúricos monobásicos ou polibásicos, alifáticos, alicíclicos, aralifáticos, aromáticos ou heterocíclicos, tais como, por exemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido piválico, ácido dietilacético, ácido malónico, ácido succínico, ácido pimélico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido málico, ácido cítrico, ácido glucónico, ácido ascórbico, ácido nicotínico, ácido isonicotínico, ácido metanossulfónico ou etanossulfónico, ácido etanodissulfónico, ácido 2-hidroxietanossulfónico, ácido benzenossulfónico, ácido p-toluenossulfónico, ácidos naftalinomonossulfónicos e naftalinodissulfónicos, e ácido 20 laurilsulfúrico. É possível empregar os sais com ácidos fisiologicamente não inócuos como, por exemplo, os picratos, no isolamento e/ou na purificação dos compostos em conformidade com a invenção. Por outro lado, é possível passar um ácido dos compostos de acordo com a invenção, pela transformação com uma base, a um dos seus sais metálicos ou de amónio fisiologicamente inócuos. Tem-se aqui em consideração como sais, sobretudo os sais de sódio, de potássio, de magnésio, de cálcio e de amónio, e ainda os sais de amónio substituídos como, por exemplo, os sais de dimetilamónio, de dietilamónio ou de diisopropilamónio, os sais de monoetanolamónio, de dietanolamónio ou de diisopropanolamónio, os sais de ciclo-hexilamónio e de diciclo-hexilamónio, os sais de dibenziletilenodiamónio, e ainda os sais com, por exemplo, arginina ou lisina.
Os compostos peptídicos segundo a invenção podem ser empregues, como já mencionado, como substancias activas medicamentosas na medicina humana e veterinária, em particular na profilaxia e/ou na terapia de doenças em que estejam implicadas células epiteliais. É de salientar em particular, neste caso, as doenças ou as inflamações ou os processos de cicatrização da pele, dos órgãos das vias respiratórias e da área do estômago e dos intestinos, como, por exemplo, no caso de apoplexia, angina de peito, doenças tumorais, doenças osteolíticas como osteoporose, doenças de patologia angiogénica, tais como, por exemplo, inflamações, fibroses, em particular fibrose pulmonar, doenças oftalmológicas, retinopatia diabética, degeneração macular, miopia, histoplasmose ocular, artrite reumática, osteoartrite, glaucoma rubeótico, colite ulcerativa, doença de Crohn, arteriosclerose, psoríase, restenose após 21 angioplastia, no caso de falha renal aguda, nefrite, infecções microbianas e esclerose múltipla.
Em conformidade com isso, a invenção tem por objecto os compostos peptidicos anteriores e posteriores e nas fórmulas definidas nas reivindicações, incluindo os respectivos sais fisiologicamente inócuos, como medicamentos, meios de diagnóstico ou reagentes. A invenção tem sobretudo por objecto os respectivos medicamentos, como inibidores destinados ao combate a doenças que tenham directa ou indirectamente a ver com uma expressão do receptor da integrina ανβε, em particular, portanto, no caso de doenças de patologia angiogénica, tromboses, enfarte cardíaco, doenças coronárias, arteriosclerose, tumores, osteoporose, inflamações, infecções, e para influenciar os processos de cicatrização de feridas.
Também constitui objecto as respectivas preparações farmacêuticas, que contenham pelo menos um medicamento com a fórmula I e, eventualmente, substâncias de suporte e/ou substâncias auxiliares. A invenção tem ainda por objecto a utilização dos compostos peptidicos e/ou dos respectivos sais fisiologicamente inócuos, de acordo com as reivindicações e com a descrição, no fabrico de um medicamento destinado ao combate a doenças que tenham directa ou indirectamente a ver com uma expressão do receptor da integrina αγβε^ em particular, portanto, no caso de doenças de patologia angiogénica, tromboses, enfarte cardíaco, doenças coronárias, arteriosclerose, tumores, osteoporose, inflamações, infecções, e para influenciar os processos de cicatrização de feridas. Os 22 medicamentos segundo a invenção ou as preparações farmacêuticas contendo os mesmos podem ser empregues na Medicina ou na Veterinária. Consideram-se aqui como substâncias de suporte, as substâncias orgânicas ou inorgânicas que se adeqúem à aplicação enteral (por exemplo oral), à aplicação parenteral, à aplicação tópica ou à aplicação na forma de um pulverizador de inalação, e que não reajam como os novos compostos, como, por exemplo, água, óleos vegetais, álcoois benzilicos, alquilenoglicóis, polietilenoglicóis, triacetato de glicerina, gelatina, hidratos de carbono como lactose ou amido, estearato de magnésio, talco e vaselina. Na aplicação oral recorre-se sobretudo a comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, pós, granulados, xaropes, sucos ou gotas; na aplicação rectal aos supositórios; na aplicação parenteral a soluções, de preferência soluções oleicas ou aquosas, e ainda a suspensões, emulsões ou implantes; na aplicação tópica a pomadas, cremes ou pós. Os novos compostos podem ser igualmente liofilizados e os produtos de liofilização obtidos podem ser empregues, por exemplo, na produção de preparados injectáveis. As preparações indicadas podem ser esterilizadas e/ou conter substâncias auxiliares como lubrificantes internos, conservantes, estabilizadores e/ou reticulantes, emulsionantes, sais para influenciar a pressão osmótica, substâncias tampão, corantes, aromatizantes e/ou diversas outras substâncias activas, como, por exemplo, uma ou mais vitaminas. No caso da aplicação como pulverização de inalação, é possível empregar pulverizadores contendo a substância activa sob a forma dissolvida ou suspensa, num gás propulsor ou numa mistura de gases propulsores (por exemplo, CO2 ou hidroclorofluorocarbonos). De forma conveniente, emprega-se neste caso a substância activa na forma pulverizada, 23 podendo adicionar-se um ou mais solventes adicionais, compatíveis a nível fisiológico, como, por exemplo, o etanol. As soluções de inalação podem ser ministradas por intermédio de inaladores habituais.
As substâncias conforme a invenção podem ser normalmente ministradas em analogia com outros péptidos conhecidos disponíveis no mercado (por exemplo, os descritos no US A 4 472 305, de preferência em dosagens entre cerca de 0,05 e 500 mg, em especial entre 0,5 e 100 mg, por unidade de dosagem. A dosagem diária encontra-se, preferencialmente, compreendida entre cerca de 0,01 e 20 mg/kg de peso corporal. A dose especial para cada paciente depende contudo de diversos factores, como, por exemplo, da eficácia do composto especial empregue, da idade, do peso corporal, do estado geral de saúde, do sexo, do custo, do momento e da via de administração, da velocidade de eliminação, da combinação medicamentosa e da gravidade da respectiva doença a que diz respeito a terapia. Prefere-se a aplicação parenteral.
Além disso, os novos compostos com a fórmula I podem ser utilizados na biologia analítica e na biologia molecular.
Os novos compostos da fórmula I, em que X significa um radical corante fluorescente, acoplado por uma ligação —CONH—, -COO-, -NH-C(=S)-NH-, -NH-C(=0)-NH-, -S02NH- ou —NHCO—, podem ser empregues como marcadores de diagnóstico na análise FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) e na microscopia fluorescente. O emprego de compostos marcados na microscopia fluorescente é descrito, por exemplo, por Y.-L Wang e D. L. Taylor in "Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture", Part A + B, Academic Press, Inc., 1989.
Os novos compostos de acordo com a invenção também podem ser empregues como ligandos da integrina no fabrico de colunas para a cromatografia de afinidade, com vista à preparação de integrinas na forma pura. 0 complexo de um material de suporte derivado da avidina, por exemplo, Sepharose, e dos novos compostos, é produzido por métodos de si conhecidos (por exemplo, E. A. Bayer and M. Wilchek in "Methods of Biochemical Analysis" vol. 26 The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology) . Os materiais de suporte poliméricos adequados neste caso são as fases sólidas poliméricas, conhecidas da química de péptidos, com preferencialmente propriedades hidrófilas, por exemplo poliaçúcares de reticulação transversal, tais como celulose, Sepharose ou SephadexR, acrilamidas, polímeros à base de polietilenoglicol ou TentakelpolymereR.
Por fim, a invenção abrange igualmente as sequências de ADN recombinantes, as quais contêm secções que codificam as áreas peptídicas que apresentam os motivos estruturais peptídicos segundo a invenção.
Este ADN pode ser transferido por partículas para as células, como descrito in Ch. Andree et al. "Proc. Natl. Acad. Sei." 91, 12188 - 12192 (1994), ou a transferência para as células pode ser aumentada por outras substâncias auxiliares, tais como lipossomas (A. I. Aronsohn and J. A. Hughes J. "Drug Targeting", 5, 163 - 169 (1997)).
Por conseguinte, a transferência deste ADN pôde ser utilizada em leveduras, por meio de vírus bacculo, ou em 25 células de mamíferos para a produção das substâncias peptídicas desta invenção.
Se um organismo animal ou humano for infectado deste modo com um ADN recombinante, os péptidos segundo a invenção por último autoformados pelas células infectadas podem ligar-se directamente ao receptor da integrina α,νβε, por exemplo de células tumorais, bloqueando-as. 0 ADN recombinante correspondente, que pode ser preparado por técnicas usuais e conhecidas, também pode, contudo e por exemplo, encontrar-se na forma de ADN virai, o qual contém secções que codificam a proteína do invólucro do vírus. Através da infecção de um organismo hospedeiro com os vírus recombinantes deste tipo, preferencialmente não patogénicos, é com preferência possível atacar as células hospedeiras que exprimem a integrina ανββ (targeting).
Os vírus adequados são, por exemplo, as estirpes de adenovírus que são já várias vezes utilizadas como vectores para genes estranhos em células de mamíferos. Um número de propriedades tornam-nos bons candidatos à terapia genética, como se pode ver in S. J. Watkins et al. "Gene Therapy" 4, 1004 - 1012 ( 1997) (ver também J. Engelhardt et al. "Hum. Gene Ther." 4, 759 - 769 (1993)). Como se pode encontrar in A. Fasbender et al. "J. Clin. Invest." 102, 184 - 193 (1998), o problema comum na terapia genética por vectores virais e não virais é a eficiência limitada da transferência genética. Com a sequência de ligandos adicional acima descrita para a integrina ανβε na proteína do invólucro dos adenovírus, é possível conseguir uma melhoria da transferência, por exemplo, de cADN de Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR). 26 À semelhança do que se verifica no trabalho de T. Tanaka et ai. "Câncer Research" 58, 3362 - 3369 (1998), também é possível utilizar, em vez do ADN para a angiostatina, o ADN para as sequências desta invenção para transfecções celulares por meio de vectores retrovirais ou adenovirais. "Nature
Os péptidos segundo a invenção também podem ser empregues dentro de um complexo lipossómico de lípido/péptido/ADN para uma transfecção de culturas de células, juntamente com um complexo lipossómico composto por lípido/ADN (sem péptido), com vista à utilização na terapia genética nos humanos. 0 fabrico de um complexo lipossómico de lípido/ADN/péptido encontra-se descrito, por exemplo, por Hart S. L., et al. 1998: Lipid-Mediated Enhancement of Tranfection by a Non-viral Integrin-Targeting Vector, "Human Gene Therapy" 9, 575 - 585. Um complexo lipossómico de lípido/péptido/ADN pode ser produzido a partir, por exemplo, das seguintes soluções-mães: 1 μg/μl de lipofectina (mistura equimolar de DOTMA (= cloreto de N-[l-(2,3-dioleiloxi)-propil)-N,N,N-trimetilamónio) e DOPE (dioleil-fosfatidiletanolamina) ) , 10 μρ/ιηΐ de ADN plasmídeo e 100 μg/ml de péptido. Tanto o ADN com o péptido são neste intuito dissolvidos em meio de cultura celular. O complexo lipossómico é produzido por mistura dos três componentes numa determinada relação de peso (lípido : ADN : péptido, por exemplo de 0,75 : 1 : 4). Os complexos de ADN lipossómicos para uma terapia genética nos humanos encontram-se já descritos (Caplen N. J., et al. 1995: Liposome-mediated CFTR gene transfer to the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis,
Medicine" 1, 39 - 46). 27
Assim sendo, o objecto da invenção trata-se também da utilização de ADN recombinante modificado de forma correspondente, de sistemas de libertação de genes, em particular de ADN virai, no combate a doenças que tenham directa ou indirectamente a ver com uma expressão do receptor da integrina ανββ, em particular, portanto, no caso de doenças de patologia angiogénica, tromboses, enfarte cardíaco, doenças coronárias, arteriosclerose, tumores, osteoporose, inflamações, infecções, e para influenciar os processos de cicatrização de feridas.
Todas as temperaturas encontram-se anterior e posteriormente indicadas em °C.
As análises por HPLC (tempo de retenção Rt) ocorreram nos seguintes sistemas:
Coluna de 5 μιη de LicroSpher 60 RP-Select B (250-4), com um gradiente de 50 min de 0 a 80% de 2-propanol em água/0,3% de ácido trifluoroacético, com 1 ml/min de fluxo e detecção nos 215 nm.
Espectrometria de massa (MS): EI (ionização por impacto de electrões) M+ FAB (Fast-Atom Bombardment) (M+H)+
Exemplo 1
Fabrico e purificação dos péptidos de acordo com a invenção: 28
Em princípio, o fabrico e a purificação foram realizados por estratégia de Fmoc, sob protecção de cadeias laterais de labilidade ácida em resinas de labilidade ácida, mediante utilização de um sintetizador peptídico de fluxo contínuo disponível no mercado, em conformidade com as indicações de Haubner et al. ("J. Am. Chem. Soc.", 118, 1996, 17703) .
Cyclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu) [EMD 272914] 2,7 g de Fmoc-Abu-OH (Bachem B-1910) foram suspensos em 150 ml de cloreto de metileno e dissolvidos de forma clara em 10 ml de DMF. Adicionou-se 5,6 ml de diisopropiletilamina, a solução foi embebida em 12,0 g de resina de poliestireno-cloreto de o-clorotritilo (1,14 mmol/g, Bachem D-196512) e a preparação foi agitada à temperatura ambiente. Passadas 5 horas, a resina foi aspirada e foi lavada de cada vez com 300 ml de DCM/MeOH/DIEA = 17/2/1, DCM, DMF, DCM e MeOH. Depois da remoção dos solventes, obteve-se 14,55 g de resina de Fmoc-aminoácido. Três determinações de Fmoc deram origem em média a uma carga de 541 μιηοΐ/g de resina de Fmoc-Abu-O-oCITrt.
Sujeitou-se 0,7 g de resina de Fmoc-Abu-O-oClTrt-poliestireno consecutivamente numa técnica de ligação dupla, 2 x com, de cada vez, 0,30 g de TBTU, 0,315 ml de etildiisopropilamina e Fmoc-aminoácido em 4,1 ml de DMF, num equipamento de síntese comercial e num procedimento típico (equipamento e manual Milligen 9050 Pepsynthesizer™, 1987), durante 30 minutos, respectivamente, numa etapa de ligação. As etapas de lavagem foram realizadas em DMF durante 10 minutos, as 29 etapas de dissociação foram realizadas em piperidina/DMF (1 : 4 vol.) durante 5 minutos; as acetilações de terminação N (capping/encapsulamento) foram realizadas com anidrido do ácido acético/piridina/DMF (2 : 3 : 15 vol.) durante 15 minutos. Empregou-se os aminoácidos Fmoc-Arg(Pmc), depois Fmoc-Leu, depois Fmoc-Ala, depois Fmoc-D-Asp(OBut), depois Fmoc-leu, depois Fmoc-Asp(OBut), depois Fmoc-Thr(But), depois Fmoc-Arg(Pmc) e, por fim, Fmoc-Abu. Depois da dissociação do grupo de protecção Fmoc da resina de Fmoc-Abu-Arg(Pmc)-Thr(But)-Asp(OBut)-Leu-D-Asp(OBut)-Ala-Leu-Arg(Pmc)-Abu-O-oCITrt-poliestireno, procedeu-se a lavagem com DMF e isopropanol e, depois da secagem no vácuo à temperatura ambiente, obteve-se 0,9 g de resina de Abu-Arg(Pmc)-Thr(But)-Asp(OBut)-Leu-D-Asp(OBut)-Ala-Leu-Arg(Pmc)-Abu-O-oCITrt-poliestireno. Por intermédio do tratamento desta peptidil-resina com 20 ml de trifluoroetanol/diclorometano/ácido acético (2:6:2 vol.) durante 2 horas à temperatura ambiente, filtração, concentração no vácuo e trituração com éter dietílico, obteve-se 0,19 g do péptido protegido com cadeias laterais Abu-Arg(Pmc)-Thr(But)-Asp(OBut)-Leu-D-Asp(OBut)-Ala-Leu-Arg(Pmc)-Abu-OH.
Através da adição por gotas de uma solução deste produto em DMF (100 mg de péptido/15 ml de DMF) numa solução agitada de TBTU/HOBt/DIPEA (10 : 10 : 11 equivalentes), em 50 ml de DMF/100 mg de péptido no período de 30 minutos, e de mais agitação durante 1 hora, conseguiu-se a ciclização. Depois da concentração e da precipitação com água, obteve-se 0,15 g de Cyclo-(Arg(Pmc)-Thr(But)-Asp(OBut)-Leu-D-Asp(OBut)-Ala-Leu-Arg(Pmc)-Abu-Abu) bruto. Após o tratamento com ácido trifluoroacético/água/TIS (94 : 3 : 3 vol.) durante 2 horas à temperatura ambiente, concentração no vácuo e 30 trituração com éter dietílico, originou-se um precipitado de 85 mg de Cyclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu) .
Ocorreu uma purificação do produto por RP-HPLC em Lichrosorb RP 18 (250 - 25, 7 μιη, Merck KGaA) em 0,3% de TFA, com um gradiente de 4% em 24% de 2-propanol numa hora com 10 ml/min, e avaliação do eluido por meio de fotómetro de fluxo de UV nos 215 e 254 nm. Obteve-se 51 mg do produto, FAB 1067; Rt = 19,0.
De modo análogo, produziu-se os seguintes produtos:
| cycto-f RGDLdALRG} ! 954..1 954 16,79 271587 271588 I cycio-(RGDLdALR) 271589 j cyçjo-(RGDLdGLR) 271590 | cyclo-(RG Dld-jl-Aia-LR) £71591 11011.1 1011 117,83 11068,.2 1068 j 17,79 11239,.3 1239 117,30 271592 | cycÍQ-(RGDLdALRGG) 271593 cycMRGPLdAlRGGG) j 271594 cyclo-(RGDldALRGGGGGG) cycloíRTDlxtALRGGG)
1272914 272966 cyclo-(RGSLdALR-Abu-Ab« 272967 cydcM RTDLdG L.RGGG) 1:1098,2 1099 119,00 | 272968 cvcio-ÍRTDLDALRGGG) 11112,2 1113 [ 17,39 272969 cvcio-(RTDLDGLRGGG) 11098,2 1099 j 16,88 272970 cycio-(RGDLDALRG) 1954,1 955 í 17,32 | 272971 cvclo-(RaOLdALRGGG) 11082,2 1083 ! 18,26 272:972 cyclo-(RGDLaALRGGG) .......íl'0827 1083 118,23 l 32 !272958 cycío-(RGDLdALR-Aha-Aha) 11123,3 1123 19,38 I272959 cyclo-(RGDLdALR-Aha) 11010,2 1010 1042 20,83 18,92 272960 | cydo-(RGDLdALR-Aee) 11042,2 |cycMRGDLdALRGGGG) 11125,2 Η125 j 17.56 272982 117,52
I 272965 j cycío-ÇRGPLPGLRGGG) j 1054,1 1273028 cyclO"(RTDLdALR~Aha).................Mo 72,2 1273033 1 cycio-(RTDLdALR-Abu) j 1044,2 273035 cyclo-(RGOLcfALR-Abu) 1000,1 l n.d. i 16,98 j 273038 Dyclo-(RTDLdALR-Aha-Aha) 11185,4 i n.d. 120,46 273040 cycÍQ“(RTDLdALR-Abu-Abu) M111,3 x 2 TFA j n.d. 118,75 1012,1 11012 304219 \ cycfo-(RTDLdALR>(3Ala) 19,4 304218 cydo-(RGDLdALR-3Ala) 988,1 968 18,7 329400 cycío-(RGDLdALR) 811,9 812 21,15 32941:2 cyclo-(RTDLdAlR-Abu-Abu) 1111,3 1112 20,31 329402 cyclo-(RGDLdALAGGG) 983,1 984 20,48 329399 cycfo-(NMeArg- GDLaALRGGG) 1038,2 1039 19,68 329398 cycioAR-NMeGly- DLaALRGGG) 1038,2 1039 19,76 328397 cyclO"(RGD-NMeLeu- aALRGGG) 1038,2 1039 20,22 323396 cyclo-(RGDL-[D-NMeAla]- ALRGGG) 1038,2 1039 20,55 ; 323335 cydõ-(RGD:La-NMeAía- LRGGG) 1038,2 1039 21,35 329394 cyclo-(RGDLaA-NMeLeu* RGGG) 11038,2 1039 18,87 329393 cydo-{RGDLaAL-NMeArg- GGG) cyciQ-ÍRGDLdAAR) 1038,2 1039 20,64 I cydo-(RGDldAARGGG) 33 A nomenclatura para os aminoácidos é de acordo com "Eur. J. Biochem." 138, 9-37 (1984), letra pequena = D-aminoácido, n. d. = não determinado/medido.
Os compostos 271312, 271578, 271579, 271586 - 271591, 272970, 272971, 329393 - 329400 não são compostos de acordo com a invenção, mas sim compostos comparativos.
Exemplo 2 ανββ / teste de ligação do receptor da fibronectina
Os péptidos de acordo com a invenção produzidos foram ligados em solução, juntamente com a fibronectina de acção competitiva, ao receptor da ανβδ imobilizada e determinou-se o valor Q como medida para a selectividade da ligação do péptido a ser testado à ανβε · Neste caso, o valor Q é calculado a partir do quociente dos valores IC50 do péptido de teste e de um padrão. O padrão trata-se de um Ac-RTDLDSLR-NH2 linear (código EMD 271293) (lit./patente ver Pytela et al. "Science" 231, 1559, (1986)). O teste de ligação foi em detalhe realizado como se segue: A imobilização do receptor da ανββ solúvel em placas de microtítulo foi realizada por diluição da solução proteica em TBS++ e posterior incubação durante a noite nos 4°C (100 μΐ/cavidade). Os pontos de ligação inespecíficos foram bloqueados por incubação (2 h, 37°C) com 3% (w/v) BSA em TBS++ (200 μΐ/cavidade). O BSA em excesso foi removido por lavagem por três vezes com TBSA++. Os péptidos foram diluídos em série (1 : 10) em TBSA++ e incubados em conjunto com fibronectina biotinilada (2 μρ/πιΐ) com a 34 integrina imobilizada (50 μΐ de péptido + 50 μΐ de ligando por cavidade; 2 h; 37°C) . A fibronectina não ligada e os péptidos foram removidos por lavagem por três vezes com TBSA++. A detecção da fibronectina ligada ocorreu por incubação (1 h, 37°C) com um anticorpo de antibiotina (Biorad) ligado por fosfatase alcalina (1 : 20 000 em TBSA++; 100 μΐ/cavidade) . Depois da lavagem por três vezes com TBSA++, ocorreu a detecção colorimétrica por incubação (10 - 15 min; 25°C, no escuro) com solução de substrato (5 mg de fosfato de nitrofenilo, 1 ml de etanolamina, 4 ml de H2O; 100 (μΐ/cavidade)). A reacção enzimática foi parada pela adição de 0,4 M NaOH (100 μΐ/cavidade) . A intensidade de cor foi determinada nos 405 nm no aparelho de medição ELISA e foi nivelada contra o valor nulo. Como valor nulo, utilizou-se as cavidades que não tinham sido revestidas com o receptor. Como padrão, empregou-se Ac-RTDLDSLR-NH2. Os valores IC50 para os péptidos testados foram lidos de um gráfico e determinou-se, a partir dai juntamente com o valor IC50 do péptido padrão, o valor Q do péptido em conformidade com a invenção.
Valor Q = IC50 do péptido de teste/ICso do padrão
Determinou-se as médias dos valores Q das repetições da experiência.
Os resultados do teste descrito encontram-se reunidos na seguinte tabela 1: 35
Tabela 1
Resultados do teste de ligaçao do receptor da fibronectina/ανβε Código (EMD) Sequência Valor Q = IC50 péptido de teste / [Qso EMD j 271293 | 271293 Ac-RTDLDSLR ~NH2 1,00 {=75 nM) | 271586 271587 cyclo-(RGDLDSLR) cydo-(RGDLdSLR) 26 I 88 | 271588 cycla-(RGDLdALR) 47 | 271589 cydo-(RGDLdGLR) 19 | 272970 cycio-(RG DLDALRG) 6,7 I !272964 çyçlo-(RGDLDALRGGG) 0,037 | 272965 cycio-{RGDLDGLRGGG) 0,16 | l272972 cyc!o-{RGDLaALRGGG) 0,05 l 1271593 cydQ-CRGDLdALRGGG) 0,03 272963 cydo-(RGDLdGLRGGG) 0,084 271590 cyclo-(RGDLd-pAla-LR) 233 ! 36 271591 ! cyeb-ÍRGDLdALRG} 2,1 271592 I cydo-(RGDLdALRGG) 0,05 271594 | cyclo- 0,05 (RGDLdALRGGGGGG) cycio-(RGDLdALR-Abu-Abu) j 0,03
cycto-fRTDLDALR-GGG) cycio-(RTDLDGLR-GGG) 273028 273033 273038 272966 li cyclo-fRTDLdALR-GGG) j0,05 cydo-( RTDLdGLR-GGG) \ 0 r 15 0.14 0.18 cydo-( RTD LdALR-Aha) 0,015 cycÍoARTPLdALR-Abu) 10,043 l cycio-(RTOldALR-Aha-Aha) ! 0,015 273040 j cycio-(RTDLdALR-Abu-Abu) 0,014 272971 çyc lo- (R a P Ld A L R-G G G)
Os exemplos que se seguem sao relativos a preparações farmacêuticas:
Exemplo A: Ampolas injectáveis
Uma solução de 100 g de Cyclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu) e de 5 g de hidrogenofosfato de dissódio é ajustada, em 3 1 de água destilada duas vezes, com 2 n de ácido clorídrico para um pH de 6,5, é filtrada de forma 272914 272958 2.72959 272960 cy cl o-{ R G P Ld AL R-A h a-.A ha) 10,036 1 cycio-{R.GDLdALR-Aha) ~ 10t036 ] cycicH RG D LdALR-Aee) 10,038 272961 272962 273035 271312 271578 271579 cycfo-(RGDLdALRGGGG) 10,033 cyclo-(RGDLdALRGGGGG) i 0,046 I cydo-(RGPLdALR-Abu) 10,028 j cycíodRTDLDSLR) | cycÍ0"( RTD LdALR) 104 12 37 estéril, deitada para ampolas injectáveis, liofilizada mediante condições estéreis e encerrada de forma estéril. Cada ampola injectável contém 5 mg de substância activa.
Exemplo B: Supositórios
Funde-se uma mistura de 20 g de Cyclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu) com 100 g de lecitina de soja e 1 400 g de manteiga de cacau, deita-se a mesma para moldes e deixa-se arrefecer. Cada supositório contém 20 mg da substância activa.
Exemplo C: Solução
Prepara-se uma solução de 1 g de Cyclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-
Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu), 9,38 g de NaH2P04 . 2 H20, 28,48 g de Na2HP04 · 12 H20, e 0,1 g de cloreto de benzalcónio em 940 ml de água destilada duas vezes. Ajusta-se o pH para 6,8, enche-se até 1 1 e esteriliza-se por irradiação. É possível empregar esta solução na forma de gotas para os olhos.
Exemplo D: Pomada
Mistura-se 500 mg de Cyclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-
Arg-Abu-Abu) com 99,5 g de vaselina, sob condições de assepsia.
Exemplo E: Comprimidos
Uma mistura de 1 kg de Cyclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu) , 4 kg de lactose, 1,2 kg de amido de batata, 0,2 kg de talco e 0,1 kg de estearato de magnésio, 38 é comprimida pelo procedimento habitual em comprimidos, passando cada comprimido a conter 10 mg da substância activa.
Exemplo F: Drageias
Comprime-se comprimidos como indicado no exemplo E, e reveste-se os mesmos, de seguida e de forma habitual, com uma cobertura de sacarose, amido de batata, talco, adraganta e corante.
Exemplo G: Cápsulas
Enche-se, pelo procedimento habitual, cápsulas de gelatina dura com 2 kg de Cyclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu), passando cada cápsula a conter 20 mg da substância activa.
Exemplo H: Ampolas
Uma solução de 1 kg de Cyclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu) em 60 1 de água destilada por duas vezes, é filtrada de forma estéril, deitada em ampolas, liofilizada mediante condições de esterilidade e encerrada de forma estéril. Cada ampola contém 10 mg da substância activa.
Exemplo I: Pulverizador de inalação
Dissolve-se 14 g de Cyclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu) em 10 1 de solução de NaCl isotónica, e deita-se a solução em recipientes de pulverização correntes com mecanismo de bomba. A solução pode ser pulverizada na boca 39 ou no nariz. Cada jacto de pulverização (cerca de 0,1 ml) corresponde a uma dose de cerca de 0,14 mg.
Lisboa, 21 de Dezembro de 2006
Claims (5)
1 REIVINDICAÇÕES 1. Os derivados de péptidos com a fórmula I Cyclo- (Arg-X1-Asp-X1-X2-X3-X4-X5-R1) em que X1 significa Ser, Gly ou Thr, X1 significa Leu, lie, Nle, Vai ou Phe, X2 significa Asp, Glu, Lys ou Phe, X3 significa Gly, Ala ou Ser, X4 significa Leu, lie, Nle, Vai ou Phe, X5 significa Arg, Har ou Lys, R1 significa um ou mais radicais de ácido ω-aminocarboxílico, tendo o radical ou os radicais de ácido ω-aminocarboxílico um comprimento de 500 a 2 500 pm, estando incluídas as formas D e L dos radicais aminoácidos opticamente activos, assim como os respectivos sais e solvatos fisiologicamente inócuos. 1 Os derivados de péptidos de acordo com a reivindicação 1 com a fórmula I 2 Cyclo- (Arg-X1-Asp-X1-X2-X3-X4-X5-R1) I 3 em que 4 X1 significa Ser, Gly ou Thr, 5 X1 significa Leu, lie, Nle, Vai ou Phe, 2 X1 significa Asp, Glu, L^ 'S ou Phe, X2 significa Gly, Ala ou Ser, X3 significa Leu, Ile, Nle, Vai ou Phe, X4 significa Arg, Har ou Lys, R1 significa 1 a 10 aminoác' CO o Ό escolhidos do grupo 1-1 <c a, Asn, Asp, Arg, Cys, Gin, Glu, Hcy, His, Hse, Ile, Leu, Lys, Met, Pen, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Vai e H2N- (CH2CH20)m- (CH2) n-COOH, m e n significam, por sua vez independentemente um do outro, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, na condição de que m + n > 0, estando incluídas as formas D e L dos radicais aminoácidos opticamente activos, assim como os respectivos sais e solvatos fisiologicamente inócuos. 1 Os compostos peptídicos de acordo com a reivindicação 1 ou 2, escolhidos do grupo: 2 Cyclo-ÍArg-Gly-Asp-Leu-Asp-Ala-Lpu-Arg-Giy-Gly-Gly), GycMArg-Gly-Asp-l^u-Asp-Gly-Leu-Arg-Gíy-Gly-Giy), Cycio(Arg-Gíy-Asp~Leu~D*Aia*Ate"LeU“Arg-Gly-Giy-Giy), 3 Cyclo-Í Arg-Th r-Asp-Leu-D-Asp-Aia-Leu-Arg-Gly-Gly-G ly), Cyolo-ÍArg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu), 4 Cy ci o-(Arg-G ly- As p -Le u- D-Asp-AI a-Leu -Arg-A ha- Ah a) f Cydo-(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-AÍa-leu*Arg-Aha}, Cy do {Arg-Gíy-As p-Le u-D-As p-AJa- Leu-A rg-Aee), Cy d o-(Arg-Th r-Asp- Le u-D -As p> AI â-Le u - Arg - Abu-A b u), Cyclo--(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-p-Ala)( Cyclo^Arg-Giy-Asp-Leu-D-Asp-Âla-Leu^Arg-p-Ala), 3 e os respectivos sais e solvatos fisiologicamente inócuos.
4. Os compostos peptídicos com a fórmula I, de acordo com as reivindicações 1 e 2, e os compostos de acordo com a reivindicação 3, assim como os respectivos sais e solvatos inócuos em termos fisiológicos, como medicamentos. 5. 0 medicamento de acordo com a reivindicação 4 como inibidor destinado ao combate a doenças, que tenham a ver com uma expressão e função patológica dos receptores da integrina ανβε · 6. 0 medicamento de acordo com a reivindicação 5, destinado ao combate a tromboses, enfarte cardíaco, doenças coronárias, arteriosclerose, tumores, osteoporose, fibroses, inflamações, infecções, psoríase, e destinado a influenciar os processos de cicatrização de feridas.
7. A preparação farmacêutica que contém pelo menos um medicamento de acordo com uma das reivindicações 5 e 6 e, eventualmente, substâncias de suporte e/ou substâncias auxiliares e, eventualmente, outras substâncias activas.
8. A utilização de compostos peptídicos de acordo com as reivindicações 1 a 3, e/ou dos respectivos sais fisiologicamente inócuos, no fabrico de um medicamento destinado ao combate a doenças que tenham a ver com uma expressão e função patológica dos receptores da integrina ανβε · 4
9. A utilização de acordo com a reivindicação 8 no fabrico de um medicamento destinado ao combate a tromboses, enfarte cardíaco, doenças coronárias, arteriosclerose, tumores, osteoporose, fibroses, inflamações, infecções, psoríase, e destinado a influenciar os processos de cicatrização de feridas. Lisboa, 21 de Dezembro de 2006
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