PT1128731E - Composições de células restringidas capazes de crescimento rápido que produzem materiais supressores da proliferação e suas utilizações - Google Patents

Description

ΕΡ 1 128 731/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Composições de células restringidas capazes de crescimento rápido que produzem materiais supressores da proliferação e suas utilizações"

Campo do invento 0 presente invento refere-se à restrição da proliferação de células que se encontram em crescimento rápido em fase logarítmica ou que são capazes desse tipo de crescimento e que quando a sua proliferação é fisicamente restringida num material biocompatível e semipermeável, produzem normalmente quantidades não expressas ou aumentadas de um factor ou factores normalmente expressos capaz(es) de inibir o crescimento de outras células de proliferação rápida do mesmo tipo e/ou origens ou de tipo e/ou origens diferentes. Estas células restringidas são doravante aqui referidas como células de proliferação. Uma lista não restritiva de células de proliferação pertencentes a esta categoria inclui células neoplásicas, células de cancro e células não cancerosas incluindo, entre outras, células embrionárias, células estaminais e células numa fase pós-regeneração de lesão em tecido incluindo hepatócitos, fibroblastos e células epiteliais. As estruturas das quais uma é apresentada no invento podem ser utilizadas "tal e qual" ou para produzir material tal como concentrados com um peso molecular aproximado definido, que também têm um efeito anti-proliferação em células em proliferação rápida associadas com doenças ou condições tais como, e.g., cancro ou para controlar crescimento de células para evitar determinados problemas médicos que podem ser originados por crescimento celular descontrolado, tal como a formação de cicatrizes pós-cirurgia.

Antecedentes e arte anterior A encapsulação de diferentes materiais biológicos em materiais biologicamente compatíveis, que se encontra bem documentado na literatura, é uma técnica que tem sido utilizada há algum tempo embora com sucesso limitado. São exemplos na arte as patentes U.S. 5 227 298 (Weber, et al.); 5 053 332 (Cook, et al.); 4 997 443 (Walthall, et al.); 2 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ 4 971 833 (Larsson, et ai.); 4 902 295 (Walthall, et al.); 4 798 786 (Tice, et al.); 4 673 566 (Goosen, et al.); 4 647 536 (Mosbach, et al.); 4 409 331 (Lim); 4 392 909 (Lim); 4 352 883 (Lim); e 4 663 286 (Tsang, et al.). É também digna de nota a patente U.S. 5 643 569 de Jain, et al. Jain, et al. discutem com algum detalhe a encapsulação de ilhéus em diferentes materiais biocompativeis. Os ilhéus produzem insulina e a utilização dos materiais divulgados por Jain, et al. no tratamento da diabetes é ai explicado. A patente U.S. 5 888 497 de Jain et al. descreve pérolas de agarose implantáveis revestidas com agarose e contendo células de cancro nelas restringidas que produzem mais de um material que suprime o crescimento de células de cancro não restringidas do um número igual das mesmas células de cancro não restringidas.

As patentes Jain, et al. discutem em algum detalhe as abordagens anteriores efectuadas pela arte de terapia de transplante. Estas são igualmente aqui resumidas. São conhecidas cinco abordagens principais para proteger o tecido transplantado da resposta imunitária do hospedeiro. Todas envolvem tentativas para isolar o tecido transplantado do sistema imunitário do hospedeiro. As técnicas de isolamento imunitário utilizadas até ao presente incluem: câmaras de difusão extravascular, câmaras de difusão intravascular, câmaras de ultrafiltração intravascular, microencapsulação e macroencapsulação. Há muitos problemas associados com métodos da arte anterior incluindo uma resposta fibrótica do hospedeiro ao material implantado, instabilidade do material implantado, difusão limitada de nutrientes através de membranas semipermeáveis, secretagogos e permeabilidade do produto e tempo de espera de difusão através de barreiras de membranas semipermeáveis.

Por exemplo, foi desenvolvido um procedimento de microencapsulação para envolver células viáveis, tecidos e outras membranas lábeis no interior de membranas semipermeáveis por Lim em 1978. (Lim, relatório de investigação de Damon Corporation (1978)). Lim utilizou microcápsulas de alginato e poli L-lisina e para encapsular ilhéus de Langerhans (doravante aqui referidos como "ilhéus"). Em 1980, relatou-se a primeira aplicação in vivo bem sucedida 3 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ desta nova técnica em investigação da diabetes (Lim, et ai., Science 210: 908 (1980)). O implante destes ilhéus microencapsulados resultou na manutenção de um estado euglicémico em animais diabéticos. Outros investigadores, contudo, repetindo estas experiências, verificaram que o alginato causava uma reacção de tecido e não foram capazes de reproduzir os resultados de Lim, et al. (Lamberti, et al. Applied Biochemistry and Biotechnology 10: 101 (1984); Dupuy, et al., J. Biomed. Material and Res. 22: 1061 (1988); Weber, et ai., Transplantation 49: 396 (1990); e Doon-shiong, et al., Transplantation Proceedings 22: 754 (1990)). A solubilidade destes polímeros em água considera-se agora como sendo responsável pela estabilidade e biocompatibilidade limitadas destas microcápsulas in vivo (Dupuy, et al., supra, Weber et al., supra, Doon-shiong, et al., supra, e Smidsrod, Faraday Discussion of Chemical Society 57: 263 (1974)).

Iwata et al., (Iwata, et al. Jour. Biomedical Material and Res. 26: 967 (1992)) utilizaram agarose para microencapsulação de ilhéus pancreáticos alogénicos e verificaram que esta poderia ser utilizada como um meio para a preparação de micropérolas. No seu estudo, procedeu-se à microencapsulação individual de 1500-2000 ilhéus em agarose a 5% e implantou-se em ratinhos diabéticos induzidos com estreptozotocina. O enxerto sobreviveu durante um longo período de tempo e os recebedores mantiveram normoglicemia indefinidamente.

Contudo, o seu método sofre de várias desvantagens. É trabalhoso e inexacto. Por exemplo, muitas pérolas permanecem parcialmente revestidas e formam-se várias centenas de pérolas de agarose vazias. É assim necessário tempo adicional para separar ilhéus encapsulados de pérolas vazias. Além disso, a maioria das micropérolas implantadas juntam-se na cavidade pélvica e é necessário um grande número de ilhéus em pérolas individuais completamente revestidas para que se atinja normoglicemia. Além disso, as pérolas transplantadas são difíceis de recuperar, tendem a ser frágeis e libertam ilhéus facilmente quando se danificam ligeiramente.

Foi também ensaiado um procedimento de macroencapsulação. Produziram-se macrocápsulas de vários materiais diferentes, tal como poli-2-hidroxietilmetacrilato, poli(cloreto de 4 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ vinilo)-ácido c-acrílico e acetato de celulose para o isolamento imunitário de ilhéus. (Consultar Altman, et al., Diabetes 35: 625 (1986); Altman, et al., Transplantation: American Society of Artificial Internai Organs 30: 382 (1984); Ronel, et al., Jour. Biomedical Material Research 17: 855 (1983); Klomp, et al., Jour. Biomedical Material Research 17: 865-871 (1983)). Em todos estes estudos apenas se obteve uma normalização transitória da glicemia.

Archer, et al., Journal of Surgical Research 28: 77 (1980), utilizaram fibras ocas de copolimero acrilico para evitar temporariamente rejeição de xenoenxertos de ilhéus. Os autores relataram sobrevivência a longo prazo de enxertos pancreáticos murinos neonatais dispersos em fibras ocas que foram transplantados para hamsters diabéticos. Recentemente Lacy, et al., Science 254: 1782-1784 (1991) confirmaram os seus resultados mas verificaram que o estado euglicémico era uma fase transitória. Os autores verificaram que quando os ilhéus são injectados para o interior da fibra agregam no interior do tubo oco resultando em necrose da parte central das massas de ilhéus. A necrose central excluiu o prolongamento do enxerto. Para resolver este problema os autores utilizaram alginato para dispersar os ilhéus na fibra. Contudo, esta experiência não foi repetida de modo extensivo. Assim, a função da membrana como um meio de transplante de ilhéus é questionável. A patente de Jain, et al. anteriormente discutida relata que a encapsulação de células secretoras num material de gel permeável e hidrófilo resulta num material funcional e não imunogénico, que pode ser transplantado para animais, pode ser armazenado durante longos períodos de tempo e é terapeuticamente útil in vivo. A macroencapsulação das células secretoras proporcionou uma técnica mais eficaz e viável para transplante de células secretoras. A patente não discute de todo a incorporação de células capazes de proliferação rápida.

Uma revisão da literatura sobre encapsulação de células revela que, após encapsulação, as células quase sempre produzem menos materiais do que produzem quando não estão 5 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ encapsuladas. Consultar Lloyd-George, et al., Biomat. Art. Cells & Immob. Biotech. 21(3): 323-333 (1993); Schinstine, et al., Cell Transplant 4(1): 93-102 (1995); Chicheportiche, et al., Diabetologica 31:54-57 (1988); Jaeger, et al., Progress

In Brain Research 82:41-46 (1990); Zekorn, et al.,

Diabetologica 29:99-106 (1992); Zhou, et al., Am. j. Physiol. 274: C1356-1362 (1998); Darquy, et al., Diabetologica 28:776-780 (1985); Tse, et al., Biotech. & Bioeng. 51:271-280 (1996); Jaeger, et al., J. Neurol. 21:469-480 (1992); Hortelano, et al., Blood 87(12): 5095-5103 (1996); Gardiner, et al., Transp. Proc. 29:2019-2020 (1997). Nenhuma destas referências trata da incorporação de células capazes de proliferação rápida numa estrutura que as envolva e restrinja o seu crescimento mas contudo permita difusão de materiais para dentro e para fora da estrutura.

Uma teoria relativa ao crescimento de massas cancerosas aparenta tais massas, e.g., tumores, a órgãos normais. Os órgãos saudáveis, e.g. o figado, crescem até determinado tamanho e seguidamente não crescem mais; contudo, caso se remova uma parte do figado, este regenerar-se-á em determinada extensão. Este fenómeno é também observado com tumores. Resumidamente, notou-se que, quando se remove uma parte de um tumor as células na parte remanescente do tumor começarão a proliferar muito rapidamente até o tumor resultante atingir um tamanho especifico após o que a proliferação abranda ou cessa. Tal sugere que há alguma regulação interna em células cancerosas.

SUMÁRIO DO INVENTO O invento, que será observado na divulgação seguinte, mostra que quando células capazes de proliferação rápida são restringidas fisicamente, tal como quando são aprisionadas, a sua taxa de proliferação diminui acentuadamente e produzem quantidades inesperadamente elevadas de material que, quando aplicado a células de proliferação rápida não restringidas, inibe a proliferação dessas células não restringidas. A capacidade de atrasar proliferação de células de cancro tem sido um objectivo da oncologia desde o seu início. Portanto, a utilidade terapêutica deste invento relativamente ao tratamento de cancro e outros estados de doença e condições 6 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ causadas pela proliferação celular rápida será evidente e será aqui desenvolvida. 0 material produzido não parece estar limitado pelo tipo de célula de proliferação rápida utilizado nem pela espécie animal da qual as células de proliferação rápida provêm. Além disso, o efeito não parece ser especifico da espécie, dado que células restringidas de uma primeira espécie produzem material que inibe proliferação de células não restringidas de uma segunda espécie. Igualmente, relativamente a cancro, o efeito não parece ser especifico do tipo de cancro dado que células restringidas de um primeiro tipo de cancro produzem material que inibe a proliferação de células não restringidas de outro tipo de cancro. 0 efeito aparentemente não parece necessitar de uma resposta imunitária. 0 efeito antiproliferativo observa-se em sistemas in vítro nos quais não se utilizam células imunitárias. Portanto, o efeito antiproliferativo não pode ser atribuído a respostas imunológicas clássicas.

Assim, o invento refere-se a uma pérola sólida contendo agarose e revestida com agarose como uma estrutura biocompatível e restritiva de proliferação com permeabilidade selectiva, que contém células de proliferação rápida. A estrutura restringe as células de proliferação rápida ao estarem nela aprisionadas e que assim produzem um material que difunde através da referida pérola sólida contendo agarose e revestida com agarose em que o referido material tem um peso molecular de pelo menos 30 kd. O referido material suprime proliferação celular comparativamente a um número igual das mesmas células de proliferação rápida quando não restringidas, em que as referidas células de proliferação rápida são seleccionadas de células de cancro ou células estaminais não humanas e em que as células restringidas e células a ser suprimidas são originárias de espécies diferentes.

Além disso, o presente invento refere-se a um processo para preparar uma pérola contendo agarose e revestida com agarose como uma estrutura com permeação selectiva, restritiva de proliferação e biocompatível que contém células de proliferação rápida tal como definido anteriormente, incluindo (a) suspender as referidas células de proliferação rápida numa solução de agarose, 7 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ (b) formar uma pérola semi-sólida lisa a partir das referidas células de proliferação rápida suspensas da etapa (a), (c) incubar a referida pérola semi-sólida da etapa (b) enquanto se forma uma pérola sólida, (d) revestir a referida pérola sólida da etapa (c) com agarose para obter uma pérola contendo agarose e revestida com agarose que contém as referidas células de proliferação rápida, e cultivar as estruturas durante um período de tempo suficiente para restringir as células de proliferação rápida de modo a que estas produzam um material que suprime proliferação das células de proliferação rápida a serem suprimidas comparativamente com um número igual de células não restringidas de proliferação rápida do mesmo tipo, em que as células restringidas e as células a serem suprimidas são tal como definidas anteriormente.

Ainda adicionalmente, o presente invento refere-se a uma composição que é produzida ao restringir células de proliferação rápida em pérolas como uma estrutura de restrição de proliferação de permeabilidade selectiva e biocompatível e cultivar as referidas células restringidas em pérolas num meio de cultura adequado de modo a que estas produzam um material que suprime crescimento celular, recuperar o meio resultante e formar um concentrado do meio por separação da fracção que apresenta um peso molecular de pelo menos 30 kd, em que as referidas células de proliferação rápida e as referidas pérolas são tal como definidas anteriormente. Quando as estruturas a que nos referimos são colocadas em meio de cultura o material ao qual nos referimos deixa a estrutura e entra no meio de cultura.

Revelou-se também que se pode atingir um efeito antiproliferativo potente submetendo a filtração o meio condicionado obtido por cultura das estruturas do invento em meio de cultura. Os concentrados resultantes apresentam efeitos antiproliferativos extremamente fortes. O material, o meio condicionado e/ou os concentrados dele derivados podem também ser úteis para induzir a produção do 8 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ material antiproliferativo por outras células não restringidas de proliferação rápida.

Em concretizações preferidas, as células restringidas são células de cancro mas as vantagens de utilizar células não cancerosas para tratar cancro e outras condições proporcionam benefícios adicionais facilmente evidentes para os peritos na arte.

Estas e outras características do invento observar-se-ão pela divulgação seguinte. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS Exemplo 1

Este exemplo e os seguintes utilizam células RENCA. Estas são células de adenocarcinoma renal espontâneo de ratinhos BALB/C, que se encontram largamente disponíveis tendo sido mantidas tanto em culturas in vitro como in vivo. Consultar Franco, et al., Cytokine Induced Tumor Immunogenecity, 181-193 (1994) .

Descongelaram-se a 37°C amostras de células RENCA congeladas e seguidamente colocaram-se em frascos de cultura de tecidos contendo meio com modificação de Dulbecco (D-MEM) que foi suplementado com soro bovino a 10%, penicilina (100 u/ml) e estreptomicina (50 ug/ml) para proporcionar o que se referirá doravante como "meio completo".

Cresceram-se as células até à confluência e seguidamente trataram-se com tripsina, seguindo-se lavagem com solução salina equilibrada de Hank e seguidamente com o meio completo anteriormente referido. A fim de determinar se as células RENCA produziam tumores eficazmente, injectaram-se intraperitonealmente dois ratinhos BALB/C com 106 destas células. Observaram-se os ratinhos ao longo de um período de 3-4 semanas. Clinicamente, pareceram saudáveis durante as primeiras duas semanas e apresentaram actividade normal. Seguidamente, as manifestações clínicas de cancro tornaram-se evidentes. Um ratinho morreu após 23 dias e o segundo após 25 dias. Após a morte, examinaram-se os 9 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ ratinhos e observaram-se vários tumores de diferentes tamanhos. Alguns dos tumores apresentaram também hemorragia.

Fixou-se uma amostra de um tumor, retirada de um dos ratinhos, em formalina a 10% para análise histológica posterior.

Exemplo 2

Após se ter demonstrado que as células RENCA cresciam in vivo, efectuaram-se estudos para determinar se essas células cresciam quando restringidas na estrutura do invento.

Cresceram-se células RENCA até à confluência, tal como anteriormente descrito, trataram-se com tripsina e lavaram-se, também como anteriormente descrito. Prepararam-se então amostras com entre 60 000 e 90 000 células. Centrifugaram-se então as células, a 750 RPM e removeu-se o fluido.

Suspenderam-se então as células em soluções de atelocolagénio a 1% em solução salina tamponada de fosfato a um pH de 6,5.

Preparou-se uma solução de agarose de baixa viscosidade a 1% em meio mínimo essencial (MEM) manteve-se a 60°C e seguidamente adicionaram-se 100 ul desta solução a uma suspensão das células RENCA e atelocolagénio descrita anteriormente. Transferiram-se então os materiais, imediatamente, como uma única gota grande para óleo mineral estéril e à temperatura ambiente. A mistura formou uma pérola semi-sólida, única e lisa. Repetiu-se este procedimento para produzir várias pérolas.

Após um minuto, transferiram-se as pérolas para meio completo, como descrito anteriormente, a 37°C. Lavaram-se então as pérolas três vezes em meio mínimo essencial (MEM) contendo os antibióticos anteriormente listados. Incubaram-se então as pérolas durante a noite a 37°C numa atmosfera humidificada de ar e C02 a 5%. Após a incubação transferiram-se as pérolas, agora sólidas, para uma colher estéril que continha 1 ml de agarose a 5% em MEM. Rolaram-se as pérolas na solução 2-3 vezes para as revestir uniformemente com agarose. Transferiram-se as pérolas para óleo mineral antes da agarose solidificar para proporcionar uma superfície exterior lisa. Após 60 segundos, lavaram-se as pérolas cinco vezes com meio 10 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ completo a 37°C para remover o óleo. Seguiu-se incubação durante a noite (37°C, atmosfera humidificada de ar, CO2 a 5%) .

Utilizaram-se estas pérolas contendo RENCA nas experiências que se seguem.

Exemplo 3

Antes de efectuar investigações in vivo, foi necessário determinar se as células RENCA cresceriam em pérolas preparadas do modo anteriormente descrito.

Para tal, incubaram-se pérolas preparadas como discutido no exemplo 2 no meio descrito no exemplo 2 durante um período de três semanas, sob as condições descritas. Cortaram-se então três das pérolas em pequenos pedaços e cultivaram-se em frascos de cultura padrão, permitindo contacto directo entre o frasco e 0 meio de cultura. A observação destas culturas indicou que as células cresceram e formaram colónias RENCA padrão. Tal indicou que as células se tinham mantido viáveis nas pérolas.

Exemplo 4

Foram então efectuadas experiências in vivo. Nestas experiências incubaram-se as pérolas durante sete dias a 37°C. Transplantaram-se então pérolas para os ratinhos em causa. Para tal, efectuou-se uma incisão na linha média de cada um dos quatro ratinhos, efectuada intraperitonealmente. Transplantaram-se três pérolas, contendo cada uma das quais 60 000 células RENCA. Fecharam-se então as incisões (oclusão com duas camadas) utilizando uma sutura absorvível. Os quatro ratinhos (BALB/C) eram ratinhos machos normais, pesando entre 24-26 gramas e estavam aparentemente saudáveis. Estabeleceram-se dois conjuntos de controlos. No primeiro conjunto, dois ratinhos receberam três pérolas sem células RENCA e no segundo dois ratinhos não foram tratados com nada.

Três semanas após o implante, todos os ratinhos receberam injecções intraperitoneais de 106 células RENCA. Dezoito dias 11 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ mais tarde morreu um ratinho de controlo. Sacrificaram-se então todos os ratinhos remanescentes e avaliou-se a presença ou ausência de tumor.

Os ratinhos de controlo apresentavam vários tumores, enquanto os ratinhos que receberam os implantes de células encapsuladas em pérola apresentaram apenas pequenos nódulos isolados ao longo da cavidade.

Estes resultados encorajadores sugeriram a concepção das experiências estabelecidas no exemplo seguinte.

Exemplo 5

Nestas experiências, simularam-se cancros estabelecidos por injecção de células RENCA sob uma cápsula renal de cada um de seis ratinhos BALB/C. Quinze dias mais tarde, dividiram-se os ratinhos em dois grupos. Os três ratinhos no primeiro grupo receberam três pérolas cada um, tal como descrito no anterior exemplo 4. 0 segundo grupo (o grupo de controlo) recebeu pérolas que não continham células RENCA.

Durante os 4-5 dias iniciais, os ratinhos que tinham recebido implantes contendo células RENCA estavam com aparência letárgica e o seu pêlo tornou-se eriçado. Seguidamente voltaram ao normal. 0 grupo de controlo permaneceu energético sem alteração da condição do pêlo.

Dez dias após o implante (25 dias após injecção de células RENCA), contudo, os ratinhos de controlo tornaram-se lentos e apresentaram abdómenes dilatados. Um dos três ratinhos de controlo morreu ao catorze dias após transplante de pérolas. Seguiu-se sacrifício dos ratinhos.

As cavidades corporais dos ratinhos de controlo apresentaram hemorragia abundante com vários tumores ao longo de todo o canal alimentar, fígado, estômago e pulmões. Todos os órgãos da cavidade abdominal tinham-se tornado indistinguíveis devido ao crescimento tumoral exuberante. Contudo, os ratinhos que tinham recebido pérolas com células RENCA encapsulados não apresentaram hemorragia e apenas alguns nódulos no canal alimentar. Além disso, a comparação entre 12 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ grupos de ensaio e de controlo mostrou que no grupo de ensaio os nódulos não tinham progredido além do seu crescimento inicial sob a cápsula renal e antes do implante de macropérolas.

Exemplo 6 0 crescimento in vitro de células RENCA livremente inoculadas é inibido quando tais células são incubadas conjuntamente com células RENCA encapsuladas em macropérolas. Efectuou-se um conjunto de experiências adicionais para determinar se este efeito era observável com outras células.

Obteve-se uma linha celular de adenocarcinoma, i.e., MMT (tumor de mama de ratinho) de American Type Culture

Collection. Prepararam-se células MMT encapsuladas, tal como descrito anteriormente, com células MMT para produzir pérolas contendo 120 000 ou 240 000 células por pérola. Após preparação das pérolas utilizaram-se para determinar se estas inibiriam proliferação de células RENCA in vitro.

Especificamente, preparam-se duas placas de Petri de seis poços através de inoculação com lxlO4 células RENCA por poço em 4 ml de meio. Em cada placa, três poços serviram de controlo e três de ensaio. Um dos três poços de controlo em cada placa recebeu uma pérola vazia. Cada um dos outros poços recebeu dois ou três pérolas vazias. O segundo conjunto de poços foi tratado de igual modo, com poços recebendo uma, duas ou três pérolas contendo 120 000 ou 240 000 células MMT. Incubaram-se os poços a 37 °C durante uma semana, após o que as células RENCA foram tratadas com tripsina, lavadas e contadas utilizando um hemocitómetro. Apresentam-se os resultados na tabela 1: TABELA 1 PLACA N.° 1 N.° de células recuperadas após uma semana PLACA N.° 2 N.° de células recuperadas após uma semana N. 0 do Controlo 120 000 Controlo 240 000 poço (macropérola vazia) células MMT (macropérola vazia) células MMT 1 2,4xl05 1,4xl05 2, 8xl05 lxlO5 2 2,0xl0b 1,2xlOb 3,6xlOb 7xl04 3 4,4xl05 1,25xl05 2,5xlOb 9xl04 13 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ

Exemplo 7

Após os resultados do exemplo 6, efectuaram-se as mesmas experiências utilizando lxlO4 células MMT como inoculo (i.e., as células livres) em vez de células RENCA. A experiência foi efectuada precisamente como no exemplo 6. Apresentam-se os resultados na tabela 2 seguinte. TABELA 2 PLACA N.0 1 PLACA N.° 2 N.0 do poço Controlo (macropérola vazia) 120 000 células MMT em macropérolas Controlo (macropérola vazia) 240 000 células MMT em macropérolas 1 3, lxl0b 1,6xlOb 2, 8xl06 1,3xlOb 2 3,3xl06 1,0xl0b 2,6xlOb 1, lxlO6 3 3,0xl06 6,0xl05 2, 8xl06 5, 0xl05

Estes resultados encorajaram uma experiência in vivo, apresentada no exemplo 8.

Exemplo 8

Utilizou-se a linha celular de tumor de mama de ratinho (MMT) anteriormente descrita. Utilizando os protocolos anteriormente estabelecidos preparam-se implantes que continham 120 000 células por pérola e 240 000 células por pérola. O modelo experimental utilizado foi o modelo de ratinho descrito anteriormente. Dividiram-se vinte e dois ratinhos em grupos de 4 (controlo), 9 e 9. O primeiro grupo, i.e., os controlos, foram divididos adicionalmente em três grupos: dois receberam implantes de uma pérola vazia, um recebeu duas pérolas vazias e um recebeu três pérolas vazias.

No grupo experimental A (9 animais) as pérolas continham 120 000 células, enquanto no grupo experimental B as pérolas continham 240 000 células. Fizeram-se três subdivisões nos grupos A e B contendo cada uma três ratinhos. Os subgrupos receberam uma, duas ou três pérolas contendo células MMT. 14 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ

Durante os primeiros dias, os ratinhos nos grupos A e B apresentavam-se letárgicos e com pêlo eriçado. Tal persistiu durante cerca de cinco dias, após o que se observou comportamento normal. Vinte e um dias após o implante todos os animais receberam injecções de 40 000 células RENCA.

Após outros vinte dias, os ratinhos de controlo apresentaram abdómenes dilatados e pêlo extremamente eriçado. Um ratinho de controlo morreu vinte e cinco dias após injecção, enquanto os ratinhos de controlo remanescentes pareceram estar em estado terminal. Sacrificaram-se todos os ratinhos e observou-se desenvolvimento de tumor. Estas observações estão registadas na tabela 3 seguinte: TABELA 3 NÚMERO DE MACROPÉROLAS EM RATINHOS CONTROLO GRUPO EXPERIMENTAL A GRUPO EXPERIMENTAL B 1 ++++ - - 1 ++++ - - 1 + ++ 2 + + + + - - 2 - - 2 + + + + 3 + + + + - - 3 - - 3 - + + +

Estes resultados mostram que, dos dezoito ratinhos tratados, treze não apresentaram doença. Dos ratinhos do grupo A, um ratinho apresentou alguns nódulos pequenos (+) e outro ratinho apresentou alguns tumores (++).

No grupo B, um ratinho que tinha recebido uma pérola e um ratinho que tinha recebido duas pérolas apresentaram alguns tumores enredados no intestino. Um dos ratinhos que receberam três pérolas tinha desenvolvido um grande tumor sólido e estava aparentemente muito doente (+++). Todos os ratinhos de 15 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ controlo apresentavam numerosos tumores (++++). Os resultados mostraram que as células de tumor de mama de ratinho encapsuladas inibiram formação de tumor.

Exemplo 9

Tal como anteriormente sugerido, a prática do invento resulta na produção de material que inibe e/ou evita proliferação de células de tumor. Tal foi adicionalmente explorado na experiência que se segue.

Produziram-se pérolas adicionais, tal como anteriormente descrito no exemplo 2, excepto quanto à não inclusão de atelocolagénio. Assim, estas pérolas são pérolas agarose/agarose. Incorporaram-se células RENCA, tal como anteriormente descrito, nestas pérolas, mais uma vez como anteriormente descrito.

Usaram-se então como grupos de controlo e experimentais dois conjuntos de três placas de seis poços. No grupo de controlo, encheram-se poços com 4 ml de meio RPMI completo (soro fetal de vitelo a 10% e penicilina a 11 ml/1). Cada poço de grupo de controlo foi então inoculado com 10 000 células RENCA.

No grupo experimental, o meio RPMI completo foi condicionado por adição de material assegurado por incubação de dez pérolas contendo RENCA (120 000 células por pérola) numa placa de Petri de 35x100 mm contendo 50 ml do meio RPMI completo. Após cinco dias de incubação, recolheu-se meio destas placas e colocou-se 4 ml deste meio em cada poço de ensaio. Inocularam-se então estes poços com 10 000 células RENCA em cada.

Todas as placas (tanto de controlo como experimental) foram incubadas a 37 °C durante cinco dias. Após o periodo de incubação, as células foram tratadas com tripsina, lavadas, juntas e contadas utilizando um hemocitómetro. Apresentam-se os resultados na tabela 4: 16 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ TABELA 4 N.° DE POÇO CÉLULAS RENCA COM MEIO CÉLULAS RENCA COM MEIO DE ENSAIO DE CONTROLO CONDICIONADO 1 7 x 10b 3 x 10b 2 8 x 10b 2,5 x 10b 3 7 x 10b 3,4 x 10b

Estes resultados mostram que as células, quando restringidas, e.g., nas pérolas dos exemplos, produziram algum material que resultou em supressão de proliferação de células de tumor.

Exemplo 10 A experiência apresentada anteriormente mostrou que o crescimento de células RENCA, em meio condicionado, foi cerca de metade do crescimento das células no meio de controlo. As experiências aqui apresentadas analisam se a supressão da proliferação continuaria após o congelamento do meio condicionado.

Preparou-se meio condicionado de RENCA por incubação de dez pérolas contendo RENCA durante cinco dias. A incubação foi em placas de Petri 35x100 mm com 50 ml de meio RPMI completo a 37°C. Após a incubação recolheu-se o meio e armazenou-se a -20°C. Preparou-se meio condicionado por incubação de pérolas contendo células MMT (tumor de mama de ratinho). As pérolas continham 240 000 células por pérola; todas as outras condições foram as mesmas.

Descongelou-se a 37°C meio congelado e seguidamente foi utilizado nos testes seguintes. Utilizaram-se três placas de seis poços para cada tratamento, i.e., (i) meio RPMI de controlo, (2) meio condicionado congelado de RENCA e (3) meio condicionado congelado de MMT. Adicionou-se a cada poço um total de 4 ml de meio. Incubaram-se então todos os poços com 10 000 células RENCA e incubaram-se a 37°C durante cinco dias. Após incubação, retiraram-se duas placas de amostras de cada poço, trataram-se com tripsina, lavaram-se, juntaram-se e contaram-se num hemocitómetro. Em oito dias, as três placas remanescentes de cada poço foram ensaiadas do mesmo modo. 17 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ

Seguem-se os resultados: TABELA 5 PLACA COM 5 DIAS MEIO DE MEIO DE RENCA MEIO DE MMT DE IDADE CONTROLO CONGELADO CONGELADO CONDICIONADO CONDICIONADO 1 6xlOb 5xlOb 8xl04 2 6,8xlOb 4,2xl0b 8,5xl04 8 DIAS DE IDADE 3 2,8xl06 2xl06 8xl04

Quando estes resultados se comparam com os do exemplo 6 anterior, observar-se-á que apesar de meio condicionado RENCA congelado/descongelado não suprimir proliferação na mesma extensão que meio condicionado MMT congelado/descongelado (comparar exemplos 6 e 7), este último suprime contudo proliferação.

Exemplo 11

As experiências anteriormente apresentadas mostraram que meio condicionado congelado de macropérolas contendo RENCA ou MMT inibe a proliferação de células RENCA in vitro. As experiências aqui apresentadas analisaram se meio condicionado de macropérolas RENCA ou MMT, preparado como concentrados de 30 kd ou 50 kd por filtração, inibiriam a proliferação de células RENCA in vitro. Compararam-se os efeitos de meio condicionado de macropérolas com os efeitos de meio condicionado na presença de células RENCA e MMT não restringidas crescendo em culturas em monocamada, para determinar se células de tumor não restringidas cultivadas à confluência também produzem material regulador de proliferação.

Para estas experiências usaram-se 10 macropérolas, contendo cada uma 120 000 células RENCA ou MMT (i.e., I,2xl06 células totais) para condicionar o meio (RPMI completo) ao longo de um período de 5 dias. Paralelamente, plaquearam-se l,2xl06 células RENCA ou MMT, i.e., o mesmo número de células, numa placa de cultura e deixou-se 18 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ proliferar como uma monocamada ao longo de um período de 4 dias em meio RPMI completo. Mudou-se então o meio e este meio foi recolhido após vinte e quatro horas. A razão para o período de tempo diferente de exposição das pérolas e células não restringidas foi a diferença em número de células nas monocamadas relativamente às pérolas (3 a 5 vezes mais células nas monocamadas) no final do período de 5 dias. Noutras palavras, células não restringidas cresceram tão mais rapidamente do que células aprisionadas, que existiam 3- 5 vezes mais células.

Utilizaram-se filtros de 30 kd e 50 kd para preparar concentrados do meio condicionado que conteria provavelmente o material activo e eliminaria também materiais metabólicos tóxicos e/ou detritos como factores de confusão das experiências. Estes contaminantes, que são todos bem conhecidos, são demasiado pequenos para serem retidos num filtro de 30 kd. Ensaiaram-se também os filtrados, mas qualquer interpretação dos resultados com este material é complicada pela presença dos produtos de detritos celulares. Foi também utilizado um meio isento de soro (AIM V) nalgumas experiências para assegurar que quaisquer efeitos do soro em si estavam controlados.

Essencialmente, recolheu-se meio condicionado, quer três a cinco dias após a adição das macropérolas a este ou vinte e quatro horas após se ter adicionado meio fresco às células não restringidas. Colocou-se então o meio num filtro de tubo de ensaio com um filtro adequado (um filtro de 30 kd ou de 50 kd) e centrifugou-se durante 90 minutos. O material que permaneceu no filtro denomina-se como "concentrado", enquanto o material que passa através do filtro e se acumula no fundo do tubo é o filtrado.

Os resultados, resumidos nas tabelas 6, 7 e 8 seguintes, mostram que quando se utilizou o meio condicionado resultante das células RENCA restringidas nas macropérolas, este inibiu proliferação de células RENCA em cerca de 52% em duas experiências independentes. O concentrado de 50 kd inibiu proliferação em cerca de 99%, em ambos os casos, enquanto o concentrado de 30 kd inibiu proliferação em cerca de 97%. 19 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ

Tabela 6 - Inibição de crescimento de células RENCA em meio condicionado de macropérolas RENCA e concentrados reconstituídos Número de placa Meio RPMI não condicionado Meio condicionado de macropérolas RENCA Concentrado 30K deste meio Concentrado 50K deste meio N.° de células N.° de células Inibição N.° de células Inibição N.° de células Inibição 1 1,6 x 106 7,8 x 105 51,3% 4,2 x 104 97% 2,0 x 104 99% 2 1,65 x 106 8,0 x 105 51,5% 5,0 x 104 97% 2,0 x 104 99%

Tabela 7 - Inibição de crescimento de células RENCA em meio condicionado de cultura de células RENCA e concentrados reconstituídos Número de placa Meio não condicionado Meio condicionado de cultura de células RENCA Concentrado 30K deste meio Concentrado 50K deste meio N.° de células N.° de células Inibição N.° de células Inibição N.° de células Inibição 1 1,6 x 106 1,3 x 106 18,8% 1,1 x IO6 31,3% 9,0 x 105 43,8% 2 1,6 x 106 1,2 x 106 25,0% 1,0 x 106 37,5% 9,5 x 105 40,6% TABELA δ

Inibição de crescimento de células RENCA em meio condicionado de macropérolas RENCA e concentrado (meio AIM V) N. 0 DE PLACA MEIO DE CONTROLO AIM V MEIO CONDICIONADO CONCENTRADO 30K CONCENTRADO 50K N.° de células % de inibição N.° de células % de inibição N.° de células % de inibição 1 1,3 x 106 6,0 x 105 54% ~5,0 x 104 96% ~4, 0 x 104 97% 2 1,3 x 106 5,5 x 105 58% ~5,0 x 104 96% ~4, 0 x 104 97%

Um aspecto importante da experiência é que tanto as células MMT, como as células RENCA, quando aprisionadas e restringidas nas macropérolas, suprimem a proliferação de células RENCA, indicando que o efeito de restrição de proliferação não é especifico do tipo de tumor. Estas experiências confirmam as do exemplo 8, nas quais macropérolas contendo MMT suprimiram a proliferação de células RENCA in vivo. Além disso, estendem as divulgações indicando que o material libertado das macropérolas para o meio contém moléculas que têm pelo menos 30 kd de peso molecular que são em parte responsáveis pelo efeito de restrição de 20 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ proliferação. Finalmente, estas experiências demonstram que células RENCA e MMT restringidas pelas macropérolas produzem bastante mais material de supressão de proliferação do que as mesmas células cultivadas até confluência em culturas de monocamada.

Exemplo 12

As experiências apresentadas anteriormente demonstram que o meio condicionado de macropérolas tanto de MMT, como de RENCA contêm material libertado das células com proliferação restringida na macropérola que pode inibir a proliferação de células RENCA in vivo e in vitro. É importante salientar que as experiências demonstram que o efeito de inibição de proliferação não é especifico de tipo de tumor. As experiências aqui apresentadas analisam se o efeito também é independente da espécie na qual o tumor tem origem inicialmente. Aqui, analisam-se os efeitos de inibição de proliferação de células tumorais de uma linha celular derivada de cancro da mama humano em células RENCA (utilizando macropérolas ou meio condicionado de macropérolas) e também em células MMT (utilizando apenas meio condicionado de macropérolas) in vitro.

As metodologias para estes estudos in vitro foram semelhantes às descritas nos exemplos anteriores. Encapsularam-se 100 000 células MCF-7 (células de cancro de mama humano) em macropérolas e incubaram-se as macropérolas MCF-7 resultantes com células RENCA (10 000 por poço) durante 5 dias para avaliar os efeitos de inibição de proliferação das macropérolas. Além disso, preparou-se meio condicionado de macropérolas MCF-7 durante um período de incubação de 5 dias e ensaiou-se tanto em células RENCA, como MMT. A proliferação celular foi medida ao longo de um período de 5 dias.

Os resultados apresentam-se seguidamente: 21 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ TABELA 9

RESULTADOS DE MACROPÉROLAS MCF-7 EM CÉLULAS ALVO RENCA N.0 do poço CONTROLO (Macropérolas vazias) MACROPÉROLAS MCF-7 1 8,4 x 10b 4,4 x 10b 2 8,0 x 10b 4,4 x 10b 3 7,4 x 10b 3,8 x 10b TABELA 10

RESULTADOS DE MEIO CONDICIONADO MCF-7 EM CÉLULAS ALVO RENCA

Placa Meio de controlo RPMI Meio RPMI condicionado com MCF-7 1 9,0 x 10b 5,0 x 10b 2 8,8 x 10b 4,8 x 10b TABELA 11

RESULTADOS DE MEIO CONDICIONADO MCF-7 EM CÉLULAS ALVO MMT

Placa Meio de controlo RPMI Meio RPMI condicionado com MCF-7 1 5,0 x 10b 1,5 x 10b 2 6,0 x 10b 1,8 x 10b

Os resultados demonstram que MCF-7, uma linha celular de adenocarcinoma de mama humano, quando têm proliferação restringida em macropérolas, produz um material que inibe a proliferação de células de adenocarcinoma renal de ratinho e células tumorais de cancro de mama de ratinho a um nível significativo (30-70%), como demonstrado tanto pelas próprias macropérolas, como pelo seu meio condicionado derivado. Tal indica que o efeito de inibição de proliferação das células de cancro com crescimento restringido é independente tanto do tipo de tumor, como da espécie de origem do tumor, i.e., ratinho e humano.

Exemplo 13

As experiências apresentadas anteriormente demonstram que uma linha celular de adenocarcinoma de mama derivada de humanos (MCF-7), quando têm crescimento restringido em 22 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ macropérolas, produz inibição de proliferação de células de adenocarcinoma renal de ratinho e de mama de ratinho in vitro. As experiências aqui apresentadas analisam se existe um efeito paralelo de macropérolas contendo MCF-7 no crescimento de tumor de células RENCA in vivo.

Injectaram-se intraperitonealmente 20 000 células RENCA em dezoito ratinhos Balb/c. Após três dias, dividiram-se os ratinhos em dois grupos. O grupo 1 tinha seis ratinhos e o grupo 2 tinha os restantes doze ratinhos. Os ratinhos do grupo 1, os controlos, receberam transplantes de três macropérolas vazias cada. Cada ratinho do grupo 2 recebeu três macropérolas contendo MCF-7 (100 000 células por pérola). Após vinte e cinco dias, sacrificaram-se 2 ratinhos do grupo 1 e três ratinhos do grupo 2. Sacrificou-se o mesmo número no dia vinte e seis e os restantes ratinhos foram sacrificados no dia vinte e sete.

Na necroscopia, verificou-se que as cavidades peritoneais dos ratinhos de controlo estavam completamente cheias com tumor e era dificil identificar os órgãos normais. Classificamos isto como intensidade de tumor ++++ (100%). Nos ratinhos tratados, a intensidade de tumor foi classificada como + (10-20%).

Estes resultados demonstram que as macropérolas contendo células de adenocarcinoma de mama humano são capazes de inibir crescimento de tumor de adenocarcinoma de células renais em ratinhos, confirmando uma vez mais que o efeito de inibição de proliferação de células de cancro/crescimento de tumor não é especifico nem de tipo, nem de espécie.

Exemplo 14

As experiências apresentadas anteriormente demonstram que o efeito de inibição de proliferação celular/crescimento de tumor de tumores com crescimento restringido por macropérolas não é especifico nem de tipo de tumor, nem de espécie. As experiências aqui apresentadas seguidamente analisam se as células de adenocarcinoma de mama de ratinho com proliferação restringida (macropérolas) podem inibir o crescimento tanto de 23 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ tumores de mama espontâneos, como de tumores resultantes de injecção de células MMT.

Os ratinhos C3H têm uma incidência elevada de desenvolvimento de tumores ao longo da sua vida. Sete ratinhos em risco de desenvolvimento de tais tumores apresentavam tumores aos dezasseis meses de idade. Nessa altura, implantaram-se quatro macropérolas MMT contendo 100 000 células cada, em cinco dos sete ratinhos. Os restantes dois ratinhos de controlo receberam cada um, quatro macropérolas vazias. Os dois ratinhos de controlo desenvolveram tumores grandes e morreram no intervalo de três meses após os implantes das pérolas. Os ratinhos tratados foram sacrificados onze meses após os implantes de macropérolas MMT. Analisaram-se as macropérolas, órgãos e tumores recuperados grosseira e histologicamente. Coloração com hemotoxilina e eosina das macropérolas MMT apresentaram células viáveis. Os tumores preexistentes não tinham aumentado de tamanho e não havia evidências de desenvolvimento de qualquer tumor novo.

Também se efectuaram experiências em que se injectaram subcutaneamente células de tumor MMT na região torácica. Dividiram-se catorze ratinhos C3H em dois grupos. Os cinco ratinhos do grupo de controlo receberam implantes de três macropérolas vazias cada. Cada um dos nove ratinhos tratados receberam três macropérolas contendo MMT (240 000 células). Três semanas após implante, injectaram-se subcutaneamente todos os catorze ratinhos na área mamária com 20 000 células MMT cada.

No intervalo de vinte e cinco a trinta dias, os cincos ratinhos do grupo de controlo ficaram doentes com formação de tumor evidente e todos morreram até aos trinta cinco dias pós-injecção. Os nove ratinhos tratados, observados semanalmente, continuaram sem qualquer evidência de formação de tumor ou problemas de saúde durante este período. Dez a doze meses após injecção de tumor, quatro dos nove ratinhos tratados desenvolveram abcessos e perderam o pelo nas patas. Os restantes cinco ratinhos receberam novamente implantes de três macropérolas de MMT treze meses após a injecção de tumor inicial. Um ratinho morreu três dias após esta cirurgia, mas na necropsia estava completamente isento de tumor. Os quatro 24 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ ratinhos sobreviventes foram sacrificados oito meses após o segundo implante de macropérolas. A necropsia revelou proliferação de tumor minima ou ausente.

Adicionalmente, verificou-se nestas experiências que as pérolas recuperadas do primeiro implante continham células de tumor viáveis com base tanto na histologia, como na sua capacidade para voltar a padrões de crescimento de tumor agressivos em cultura de tecidos após remoção da pérola.

Os resultados destas experiências demonstraram que os efeitos de inibição de proliferação celular/crescimento de tumor de células de cancro restringidas em macropérolas, neste caso células de adenocarcinoma mamário de ratinho, podem influenciar o desenvolvimento e crescimento tanto de tumores de desenvolvimento espontâneo, como de tumores induzidos experimentalmente provocados por injecção de células de tumor na área mamária.

Exemplo 15

As experiências apresentadas anteriormente demonstram um efeito de inibição de proliferação de células de tumor/crescimento de tumor de células de cancro com proliferação restringida em macropérolas que é caracterizada pela sua eficácia em vários tipos de tumor e várias espécies, bem como em tumores tanto espontâneos, como induzidos artificialmente. As experiências aqui descritas estendem estas divulgações à análise dos efeitos de células derivadas de adenocarcinoma de próstata humano (ARCaplO), células de adenocarcinoma renal (células RENCA) de ratinho (Balb/c) e células de adenocarcinoma mamário (MMT) de ratinho (C3H) encapsuladas em macropérolas com proliferação restringida na proliferação de células de tumor ARCaPlO e crescimento de tumor ARCaPlO em ratinhos nus (Nu/Nu).

Na primeira série de experiências, injectaram-se quinze ratinhos Nu/Nu com 2,5xl06 células ARCaPlO subcutaneamente no flanco. No dia vinte após a injecção, altura em que o diâmetro de tumor máximo médio era de 0,5 cm, dividiram-se os ratinhos em dois grupos. Nove receberam implantes de quatro macropérolas de ARCaPlO (1,0 x 105 células por macropérola) 25 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ cada e seis ratinhos de controlo receberam quatro macropérolas vazias cada.

Dez semanas após o implante, cinco dos ratinhos de controlo apresentavam tumores vascularizados muito grandes (diâmetro médio de 2,5 cm) e um ratinho apresentava um tumor ligeiramente mais pequeno (inferior a 0,5 cm).

No grupo tratado, cinco ratinhos apresentaram regressão completa dos tumores iniciais e todos permaneceram isentos de tumor até serem sacrificados aos oito meses. Dois ratinhos não apresentaram crescimento de tumor, i.e., os seus tumores tinham o mesmo diâmetro máximo que tinham na altura do implante das macropérolas, e dois ratinhos apresentaram tumores que tinham aumentado desde o implante das macropérolas.

Apresentam-se seguidamente os resultados (volume de tumor e tamanho (c x 1 x a) de uma experiência em que foram implantadas macropérolas contendo RENCA (l,2xl05), dezoito dias após injecção subcutânea no flanco de 3,0xl06 células de tumor ARCaPlO por animal em 4 ratinhos Nu/Nu: TABELA 12 TAMANHO DE TUMORES OBSERVADOS EM RATINHOS TRATADOS (em mm) Número do ratinho tratado 3 dias antes do transplante ¢3/3/98) dia do transplante ¢6/3/98) 3 dias após transplante (9/3/98) 6 dias após transplante (12/3/98) 10 dias após transplante (16/3/98) 14 dias após transplante (20/3/98) 1 3,5 x 3 x chato 6,2 x 5,4 x chato 4 x 4 x chato en desaparecimento 0 0 2 3 x 3 x 1,5 5,1 x 2,2 x 2 4 x 2 x 0,5 3 x 3 x 0,4 2 x 2 x 0,3 2 x 2 x 0,3 3 3 x 2,5 x 1 3,1 x 3,3 x 1 3 x 2 x 0,5 3 x 2 x 0,2 3 x 2 x 0,2 3 x 2 x 0,2 4 2,5 x 2,5 x chato 3,2 x 3,4 x 0,5 nódulo por baixo da pele 0 0 0 TABELA 13

VOLUME DE TUMORES OBSERVADOS EM RATINHOS TRATADOS Número do 3 dias antes do dia do 3 dias após 6 dias após 10 dias após 14 dias após ratinho transplante transplante transplante transplante transplante transplante tratado (3/3/98) (6/3/98) (9/3/98) (12/3/98) (16/3/98) (20/3/98) 1 2,76 8,81 1,68 0 0 0 2 7, 10 11, 81 2,10 1, 89 0,63 0,63 3 3,95 5,38 1,58 0,63 0,63 0,63 4 1,64 2,86 0 0 0 0 26 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ

Noutra experiência, injectaram-se 10 ratinhos Nu/Nu com 2,5xl06 células APCaPlO, com seis ratinhos apresentando desenvolvimento de tumor sessenta e quatro dias após injecção. Administraram-se a três destes ratinhos quatro macropérolas MMT (2,4xl05 células) cada e três receberam macropérolas vazias. Os resultados apresentam-se seguidamente: TABELA 14 TAMANHO DE TUMORES OBSERVADOS EM RATINHOS TRATADOS (em mm) Número do 5 dias antes dia do 18 dias após 22 dias após 27 dias após 30 dias após ratinho do transplante transplante transplante transplante transplante transplante tratado (5/2/98) (10/2/98) (21/2/98) (4/3/98) (9/3/98) (12/3/98) 1 2x2x1 3x3x1,5 X! X! O C_n 0 0 0 2 3x2x1 3 x 2,5 x 1 2 x 2 x chato <1 mm <0, 8 rrrn <0,8 mm 3 4x4x1,5 6 x 6 x 1,5 6 x 2 x chato 4 x 1 x chato 3 x 1 x chato 3 x 1 x chato TABELA 15 TAMANHO DE TUMORES OBSERVADOS EM RATINHOS DE CONTROLO (em mm) Número do ratinho tratado 5 dias antes do transplante (5/2/98) dia do transplante (10/2/98) 18 dias após transplante (21/2/98) 22 dias após transplante (4/3/98) 27 dias após transplante (9/3/98) 30 dias após transplante (12/3/98) 1 4 x 4 x 1,5 5x5x2 6,5 x 6 x 3 6,5 x 6 x 3 6,5 x 6 x 3 7x7x3 2 3x2x1 4x6x3 4,5 x 7 x 3 5x8x3 11 x 12 x 5 13,3 x 13,3 x 6,5 2o tumor: 6x6x1 3 5x4x1 5x4x2 5 x 4,6 x 2,5 (rnultilóbulos) 5 x 5 x 2,5 6 x 6 x 2,5 2o tumor: 2x2x1 7 x 7 x 2,5 2o tumor: 3 x3 x 0,5

Os resultados destas experiências confirmam adicionalmente a natureza de espécies cruzadas e tumores cruzados do efeito de inibição de crescimento de tumor de restrição de proliferação em tumores de vários tipos. Além disso, estas experiências demonstram a capacidade das células de cancro com proliferação restringida não apenas suprimirem crescimento de tumor e evitarem formação de tumor, mas também de causarem uma real regressão de tumores in vivo.

Exemplo 16

As experiências apresentadas anteriormente demonstraram que células de cancro com proliferação restringida de vários tipos de tumores e espécies podem inibir a proliferação dos mesmos tipos de células de cancro, bem como de tipos diferentes in vitro e evitam a formação tanto de tumores espontâneos como induzidos, evitam o crescimento de tumores e 27 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ causam regressão de tumores in vivo num efeito que é independente da espécie e do tipo de cancro. A experiência aqui apresentada seguidamente descreve a extensão das divulgações a outra espécie (coelho) e a um tumor de coelho que se sabe ser induzido viricamente (VX2).

Nesta experiência, injectou-se intramuscularmente um coelho branco da Nova Zelândia (2,5 libras) numa coxa (dois locais) com 0,5 ml de pasta de tumor VX2 (caracterizada como sendo capaz de passar através de uma agulha de calibre n.° 26) em cada local. Às 3,5 semanas, apareceu um tumor de 5 cm x 2,5 cm (c x 1) na coxa dorsal e encontravam-se presentes dois tumores de 3 cm de diâmetro na coxa ventral. Nesta altura, implantaram-se intraperitonealmente 211 macropérolas (108 pérolas de células RENCA, 63 pérolas de células MMT e 40 pérolas contendo células de cancro de mama humano MCF-7). No intervalo de dois dias, o tumor na coxa dorsal tinha diminuído aproximadamente 50%; no entanto, os dois tumores ventrais não se alteraram. O animal foi sacrificado dez dias após o implante das macropérolas. Na necropsia, verificou-se uma diferença nitida entre os tumores dorsal e ventrais, já que o primeiro era muito mais pequeno do que era originalmente quando se implantaram as macropérolas, enquanto os dois tumores ventrais estavam ambos hemorrágicos e necróticos.

Esta experiência estende as divulgações sobre a eficácia da restrição de proliferação de vários tipos de células de cancro relativamente a prevenção, paragem e mesmo regressão de crescimento de tumor noutra espécie, coelho, adiciona um tumor de origem virica conhecida à lista de tipos de cancro e corrobora adicionalmente a natureza de tumor cruzado e espécies cruzadas do efeito de inibição de crescimento, dado que se utilizou uma combinação de macropérolas contendo células de cancro renal de ratinho, de mama de ratinho e de mama humano. Além disso, a experiência adiciona um modelo animal maior aos ensaios in vivo da eficácia de células de cancro com proliferação restringida para o tratamento de cancro.

Exemplo 17

As experiências descritas anteriormente demonstram que a restrição de proliferação de vários tipos de células de tumor 28 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ resulta na sua capacidade de inibir o crescimento de células do mesmo tipo ou de tipos diferentes in vitro e de evitar a formação, suprimir o crescimento ou causar regressão de vários tipos de tumores in vivo e que os efeitos verificados são independentes do tipo de tumor e da espécie. As experiências aqui apresentadas avaliam a viabilidade a longo prazo das células de cancro RENCA com proliferação restringida em macropérolas de agarose-agarose mantidas em cultura ao longo de períodos de 1 mês, 6 meses, 2 anos e 3 anos, utilizando técnicas histológicas, de cultura e in vivo. Mantiveram-se macropérolas contendo MMT em cultura até seis meses. Além disso, analisaram-se macropérolas contendo RENCA e MMT recolhidas de ratinhos Balb/c e C3H, respectivamente, após períodos de 2 a 8 meses após implante para células de tumor viáveis, tanto por técnicas histológicas, como de cultura.

Para estas experiências, prepararam-se as macropérolas de agarose-agarose com l,2xl05 células RENCA ou 2,4 x 105 células MMT. Analisaram-se histologicamente (coloração com hematoxilina e eosina) e por técnicas de cultura para viabilidade celular e características de tumor aos intervalos descritos anteriormente. Para as macropérolas RENCA, os números de células aumentaram aproximadamente 3 a 5 vezes durante o primeiro mês, com uma duplicação subsequente adicional em seis meses. Após um ano, ocorreu um aumento contínuo de massa celular, mas a taxa de proliferação celular tinha diminuído. Após dois anos, começou a aparecer material amorfo no centro da pérola e a massa celular/números não parecia aumentar, embora fossem ainda evidentes alguns eventos mitóticos. Após três anos, pareceu haver algum mais material amorfo no centro da pérola, mas a massa celular/número estavam estáveis. As macropérolas MMT foram seguidas apenas durante seis meses, mas o padrão inicial de proliferação celular e aspecto das pérolas é semelhante ao de RENCA.

Para a avaliação da viabilidade e comportamento biológico das células RENCA e MMT aos intervalos descritos anteriormente, esmagaram-se dez pérolas e plaquearam-se em dois ou mais frascos de cultura de tecidos de 25 cm2 em meio RPMI completo. Os frascos foram então observados para crescimento celular. Ao fim de um e seis meses, o número de células viáveis recuperáveis das pérolas aumentou. Ao fim de 29 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ um ano, ο número de células RENCA em crescimento nas pérolas esmagadas pareceu ser semelhante ao de seis meses. Ao fim de dois e três anos, a proporção de células viáveis parece ser ligeiramente menor, decaindo aproximadamente 20% do número máximo que tinham atingido na pérola (i.e., no seu estado restringido) após três anos em cultura.

Para a avaliação das macropérolas RENCA e MMT recuperadas após implante in vivo (períodos de 1-4 anos para macropérolas RENCA e até 8 meses para macropérolas MMT), utilizaram-se até à data técnicas histológicas. Os padrões de proliferação celular e massa são muito semelhantes aos das pérolas mantidas em cultura durante os períodos de tempo correspondentes, i.e., as células aumentam em número pelo menos até aos 4 meses para RENCA e 8 meses para MMT.

Para as outras linhas celulares de cancro utilizadas, tais como MCF-7 e ARCaPlO, os padrões de viabilidade nas macropérolas foram semelhantes aos verificados para RENCA e MMT.

Estas experiências demonstram que as células de cancro podem ser mantidas in vitro durante períodos até 3 anos e in vivo durante períodos de pelo menos 8 meses num ambiente de proliferação restringida e que elas mantêm a sua viabilidade durante esses períodos com uma demonstração nítida de números de células crescentes até pelo menos um ano. Tal é importante não só pela capacidade de criar e armazenar materiais para tratamento de cancro, mas também pela capacidade das células com proliferação restringida libertarem material de supressão de crescimento de tumor em animais de sangue quente ao longo dos períodos contínuos e prolongados que é provável que sejam necessários para o tratamento bem sucedido de cancros experimentais ou de ocorrência natural.

Exemplo 18

As experiências apresentadas anteriormente demonstram que células de cancro de vários tipos podem ser mantidas em condições de proliferação restringida durante longos períodos de tempo (até 3 anos) com retenção da sua capacidade para proliferar, para formar tumores e para libertar materiais que inibem proliferação celular e evitam, suprimem e provocam 30 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ mesmo regressão de crescimento de tumor. As experiências aqui apresentadas avaliam a possível toxicidade a longo prazo (um ano) de implantes de macropérolas de agarose-agarose contendo células de cancro em ratinhos Balb/c.

Implantaram-se 3 macropérolas RENCA (l,2xl05 células por pérola) em cada um de sete ratinhos Balb/c. Imediatamente após cirurgia os ratinhos pareceram doentes (pêlo eriçado e letargia) durante alguns dias, mas depois ficaram novamente saudáveis. Todos os ratinhos sobreviveram com boa saúde aparente durante um período de pelo menos um ano, com um ratinho que morreu de velhice e outro de causas não relacionadas. Todos os ratinhos foram sacrificados. Na necropsia, não se verificaram quaisquer anomalias, tais como fibrose, peritonite ou crescimento de tumor. Todos os órgãos observados pareciam normais, embora se tenha observado alguma aderência das pérolas às superfícies serosas dos intestinos, especialmente nos locais de dobras intestinais. Não se verificou qualquer interferência com a função ou estrutura normal dos intestinos.

Estes resultados demonstram que as macropérolas de agarose-agarose contendo células de cancro são bem toleradas em animais experimentais ao longo de um período de um ano. Estas divulgações demonstram que as pérolas de células de cancro com proliferação restringida podem ser utilizadas in vivo para a prevenção, supressão e regressão de proliferação celular, incluindo tumores in vivo de vários tipos.

Os exemplos anteriores descrevem o invento, que inclui, entre outros, composições de matéria que podem ser utilizadas para produzir material que suprime ou controla a proliferação de células de proliferação rápida, em particular supressão de células de cancro. Estas composições incluem células numa fase de crescimento logarítmica (fase de proliferação rápida) aprisionadas num material permeável selectivamente para formar uma estrutura que restringe a proliferação das células aprisionadas. Como resultado da restrição, as células produzem quantidades inesperadamente elevadas de material que suprime proliferação de células de proliferação rápida, tais como células de cancro. As células restringidas produzem mais 31 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ material do que quantidades comparáveis de células não restringidas. A matéria utilizada para preparar as estruturas do invento inclui qualquer matéria biocompativel contendo agarose, revestida por agarose, que restrinja o crescimento de células de proliferação rápida, induzindo-as assim a produzir maiores quantidades de material de supressão de proliferação/crescimento celular. A estrutura tem uma porosidade adequada para que o material supressor anterior possa difundir para o ambiente externo e evitar que os produtos ou células do sistema imunitário do hospedeiro entrem na estrutura e cause, rejeição das células de cancro ou impeçam de outra forma a sua capacidade de sobreviver e continuar a produzir o material pretendido. A matéria utilizada para formar a estrutura será também capaz de manter células viáveis (com proliferação restringida, mas vivas) tanto in vitro, como in vivo, de preferência durante periodos até vários anos, permitindo a entrada de nutrientes adequados, a eliminação de produtos de residuos celulares e um ambiente intra-estrutural fisico-quimico compatível. A matéria utilizada para preparar a estrutura é de preferência bem tolerada quando implantada in vivo, com maior preferência durante a duração total do implante no hospedeiro.

Uma lista não limitante de materiais e combinação de materiais que podem ser utilizados inclui alginato-poli-(L-lisina); alginato-poli-(L-lisina)-alginato; alginato-poli-(L-lisina)-polietilenoimina; quitosano-alginato; poli-hidroxiletilmetacrilato-metilmetacrilato; carbonilmetilcelulose; K-carragenano; quitosano; agarose-polietersulfona-brometo de hexadimetirina (polibreno); etilcelulose; géis de sílica; e suas combinações.

As estruturas que incluem as composições de matéria podem tomar várias formas, tais como uma pérola, uma esfera, um cilindro, uma cápsula, uma folha ou qualquer outra forma que seja adequada para implante num indivíduo e/ou cultura num meio in vitro. 0 tamanho da estrutura pode variar, dependendo da sua utilização eventual, tal como será evidente para o perito na arte. 32 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ

As estruturas do invento são permeáveis selectivamente, de modo que possam entrar nutrientes na estrutura e de modo que o material de inibição de proliferação, bem como os resíduos celulares possam sair da estrutura. Para utilização in vivo, é preferível que as estruturas impeçam a entrada de produtos ou células do sistema imunitário de um hospedeiro, que causariam a rejeição das células restringidas, ou de outra forma prejudicariam a capacidade das células produzirem material de supressão de proliferação.

Outro aspecto do invento inclui composições que são úteis para suprimir a proliferação de células de cancro. Estas composições são preparadas por cultura de células restringidas, tal como descrito anteriormente, num meio de cultura adequado, seguido por recuperação do meio condicionado resultante. Podem então formar-se concentrados a partir de meio condicionado, e.g., por separação de fracções com pesos moleculares superiores a 30 kd ou superiores a 50 kd, que têm efeitos antiproliferativos em células de cancro.

De acordo com o invento, seleccionam-se células proliferativas de células de cancro ou células estaminais não humanas. As células de cancro são um tipo e célula preferido e exemplos de tipos de células de cancro que podem ser utilizadas incluem células de cancro renal, células de cancro mamário, células de cancro da próstata, células de coriocarcinoma, etc. As células de cancro podem ser de origem epitelial, mesotelial, endotelial ou germinal e incluem células de cancro que geralmente não formam tumores sólidos, tais como células de leucemia. como

Como será evidente desta divulgação, um aspecto adicional do invento é a utilização de estruturas e composições de acordo com o invento para métodos terapêuticos para tratar indivíduos que sofrem de doenças hiperproliferativas, tais como cancro, inflamação, fibrose e trofoblastose. É também um aspecto do invento controlar o crescimento de células numa fase proliferativa, de modo a que se reproduzam de uma forma controlada. Tal é particularmente útil, por exemplo, no controlo da produção de quelóides e de tecidos cicatriciais, evitando adesões após cirurgia abdominal e possivelmente doenças dermatológicas hiperproliferativas, tais 33 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ psoríase. Quando utilizado em contexto terapêutico, tal como será detalhado seguidamente, o tipo de célula com restrição na estrutura não é o mesmo tipo de célula que causa (ou que pode causar) sofrimento ao doente. Um tal método envolve inserção de pelo menos uma das estruturas do invento num indivíduo, numa quantidade suficiente para causar supressão de proliferação celular no indivíduo. De preferência, as estruturas e composições do presente invento são utilizadas para o tratamento de cancro e o indivíduo é um ser humano, embora seja aplicável a outros animais, tais como animais domésticos, animais de quinta ou qualquer tipo de animal que sofra de cancro.

Uma composição do presente invento pode ser utilizada como terapia primária no tratamento de doenças hiperproliferativas e como um tratamento adjunto em combinação com outras terapias. Por exemplo, os doentes podem ser tratados com composições e métodos aqui descritos, conjuntamente com terapias conhecidas tais com radioterapia, quimioterapia, tratamento com outros materiais biologicamente activos, tais como citoquinas, moléculas anti-sentido, hormonas esteróides, terapia génica e semelhantes. As composições e métodos do invento podem também ser utilizados conjuntamente com procedimentos cirúrgicos para tratar cancro, e.g., por implante de macropérolas após ressecção de um tumor para evitar recrescimento e metástases. Os cancros que se encontram num estado não operável podem tornar-se operáveis por tratamento com as composições antiproliferativas do invento.

As composições do invento também podem ser utilizadas profilacticamente em indivíduos com risco de desenvolver cancro, e.g., presença de factores de risco individuais, história familiar de cancro em geral, história familiar de um tipo específico de cancro (e.g. cancro da mama) e exposição a carcinogéneos ocupacionais ou outros ou agentes que promovem cancro. Para profilaxia contra o cancro, uma quantidade eficaz profilacticamente das estruturas do invento é administrada ao indivíduo após identificação de um ou mais factores de risco.

Tal como indicado pelos exemplos anteriores, o efeito antiproliferativo não é limitado pelo tipo de célula proliferativa utilizada, nem pela espécie da qual a célula 34 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ proliferativa é originária. Assim, podem administrar-se estruturas que contêm, e.g., células de cancro de um primeiro tipo a um indivíduo com um segundo tipo diferente de cancro. Adicionalmente, podem ser utilizadas nas estruturas administradas células proliferativas de uma espécie diferente da espécie a ser tratada. Por exemplo, podem restringir-se células de cancro de ratinho nas estruturas do invento e seguidamente administrá-las a um humano.

Ainda outro aspecto do invento é a utilização de concentrados, tal como aqui descrito, como agentes terapêuticos. Estes concentrados podem ser preparados tal como aqui descritos e seguidamente administrados a um indivíduo com uma doença hiperproliferativa, tal como cancro ou a um doente com necessidade de controlar a taxa de crescimento celular, tal como um doente pós-operatório com um ferimento num local em que a formação de tecido cicatricial excessivo seria nociva ou simplesmente não seria desejável. Todas as concretizações descritas anteriormente podem ser utilizadas na preparação dos concentrados. Por exemplo, após cultura in vitro das estruturas contendo células de cancro de ratinho, podem preparar-se concentrados e seguidamente administrar-se a humanos. Igualmente, tal como discutido anteriormente, o tipo de célula de cancro utilizada para preparar o concentrado pode, mas não tem de ser do mesmo tipo de cancro de que o indivíduo sofre. Assim, podem ser utilizadas células de cancro mamário de ratinho, e.g., para preparar um concentrado a ser utilizado para tratar um humano com melanoma ou podem remover-se de um indivíduo com cancro da próstata algumas das suas células de cancro da próstata, aprisionarem-se numa estrutura do invento, cultivarem-se num meio adequado e seguidamente filtrar o meio condicionado para produzir um concentrado. Deve ter-se em consideração que o meio condicionado resultante das culturas das estruturas do invento in vitro é também uma parte do invento. São também uma parte do invento os processos para preparar as estruturas do invento, bem como os concentrados do invento. No caso dos concentrados, simplesmente cultivam-se as estruturas do invento durante um tempo suficiente para produzir uma quantidade suficiente de material antiproliferativo e seguidamente separam-se as partes 35 ΕΡ 1 128 731/ΡΤ pretendidas do meio condicionado resultante, e.g., por filtração com um filtro com uma porosidade adequada, tal como 30 quilodalton ou 50 quilodalton.

Lisboa, 2010-01-26

Claims (19)

1. ΕΡ 1 128 731/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Pérola sólida contendo agarose revestida com agarose que contém células de proliferação rápida que, quando restringidas por serem aprisionadas na referida pérola, produzem um material que suprime a proliferação celular, em que o referido material se difunde através da referida pérola sólida contendo agarose, revestida de agarose, em que o referido material tem um peso molecular de pelo menos 30 kd, em que as referidas células de proliferação rápida são seleccionadas entre células de cancro ou células estaminais não humanas e em que as células restringidas e as células a serem suprimidas são originárias de espécies diferentes.
2. 2. Pérola da reivindicação 1 incluindo alginato-poli-(L-lisina), alginato-poli-(L-lisina)-alginato, alginato-poli-(L-lisina)-polietilenoimina, quitosano-alginato, poli-hidroxiletilmetacrilato-metilmetacrilato, carboximetilcelulose, K-carragenano, quitosano, agarose-polietersulfona-brometo de hexadimetrina (polibreno), etilcelulose, géis de sílica e suas combinações.
3. 3. Pérola de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a referida célula de proliferação rápida é seleccionada do grupo que consiste em uma célula de cancro renal, uma célula de cancro da próstata, uma célula de cancro da mama, uma célula de coriocarcinoma, uma célula neoplásica ou uma célula estaminal não humana.
4. 4. Pérola de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 incluindo entre 120 000 a 240 000 células ou entre 60 000 a 90 000 células.
5. 5. Composição produzida por cultura de células restringidas em pérolas de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, num meio de cultura adequado, recuperação do meio resultante e formação de um concentrado a partir do meio por separação da fracção com um peso molecular de pelo menos 30 kd, em que as referidas células de proliferação rápida são tal como definidas em qualquer das reivindicações 1 ou 3. ΕΡ 1 128 731/ΡΤ 2/3
6. 6. Composição da reivindicação 5, em que cada uma das pérolas contém de 10 000 a 500 000 células de cancro, de preferência de 30 000 a 250 000 células de cancro.
7. 7. Composição das reivindicações 5 ou 6, em que as referidas células de cancro são células de cancro humano ou células de cancro de ratinho.
8. 8. Método de produção de uma pérola contendo agarose revestida com agarose, que contém células de proliferação rápida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, incluindo: (a) suspender células de proliferação rápida numa solução de agarose, (b) formar uma pérola semi-sólida lisa a partir das referidas células de proliferação rápida em suspensão, da etapa (a), (c) incubar as referidas pérolas semi-sólidas da etapa (b) enquanto formam uma pérola sólida, (d) revestir a referida pérola sólida da etapa (c) com agarose para obter uma pérola contendo agarose, revestida com agarose, que contém células de proliferação rápida, em que as referidas células de proliferação rápida são tal como definidas em qualquer das reivindicações 1 ou 3.
9. 9. Método da reivindicação 8, em que a etapa (a) inclui a adição de uma solução a 1% de agarose de baixa viscosidade às células de proliferação rápida e/ou a etapa (d) inclui fazer rolar a referida pérola sólida da etapa (c) em agarose a 5% e/ou pôr em contacto a referida pérola sólida rolada com óleo mineral e/ou lavar a referida pérola rolada para obter a referida pérola contendo agarose, revestida com agarose, que contém células de proliferação rápida, em que as referidas células de proliferação rápida são tal como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 ou 3.
10. 10. Método de qualquer das reivindicações 8 ou 9, em que a referida célula de proliferação rápida é seleccionada do grupo que consiste em uma célula de cancro renal, uma célula de cancro da próstata, uma célula de cancro da mama, uma célula de coriocarcinoma, uma célula neoplásica ou uma célula estaminal não humana. ΕΡ 1 128 731/ΡΤ 3/3
11. 11. Utilização de uma pérola contendo agarose, revestida com agarose contendo células de proliferação rápida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, para a preparação de um medicamento para o tratamento de doenças hiperproliferativas num indivíduo que o necessite, em que as referidas células de proliferação rápida são tal como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 ou 3.
12. 12. Utilização de uma quantidade suficiente da composição de qualquer das reivindicações 5 a 7 para a preparação de um medicamento para o tratamento de doenças hiperproliferativas num indivíduo.
13. 13. Utilização de acordo com as reivindicações 11 ou 12, em que o referido indivíduo é um ser humano.
14. 14. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 13, em que a referida doença hiperproliferativa é cancro.
15. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 11 e 14, em que as referidas células de proliferação rápida são células de cancro.
16. 16. Utilização de acordo com a reivindicação 15, em que as referidas células de cancro são células humanas, células de ratinho ou outras células não humanas.
17. 17. Utilização de acordo com as reivindicações 15 ou 16, em que as referidas células são do mesmo tipo que o cancro de que o referido indivíduo sofre.
18. 18. Utilização de acordo com as reivindicações 15 ou 16, em que as referidas células são de um tipo de cancro diferente daquele de que o referido indivíduo sofre.
19. 19. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 15 a 18, em que as referidas células são células retiradas do indivíduo ao qual a referida composição é administrada. Lisboa, 2010-01-26