PT1107743E - Formulações proteicas estáveis secas por pulverização - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "FORMULAÇÕES PROTEICAS ESTÁVEIS SECAS POR PULVERIZAÇÃO "

Antecedentes da Invenção

Os aerossóis para a administração de agentes terapêuticos ao tracto respiratório foram descritos, por exemplo, em Adjei, A. e Garren, J. Pharm. Res., 7: 565-569 (1990); e Zanen, P. e Lamm, J. -W. J. Int. J. Pharm., 114: 111-115 (1995). O tracto respiratório abrange as vias aéreas superiores, incluindo a orofaringe e a laringe, seguidas pelas vias aéreas inferiores que incluem a traqueia seguida por bifurcações para os brônquios e bronquíolos. As vias aéreas superiores e inferiores são chamadas de vias aéreas condutoras. Os bronquíolos terminais, então, dividem-se em bronquíolos respiratórios que, em seguida, conduzem à zona respiratória final, os alvéolos ou pulmão profundo. Gonda, I. "Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents to the respiratory tract" em Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6: 273-313 (1990). O pulmão profundo ou alvéolos são o alvo principal dos aerossóis terapêuticos inalados para a administração sistémica de um fármaco.

Os aerossóis inalados têm sido utilizados para o tratamento de distúrbios locais do pulmão incluindo asma e fibrose quística (Anderson, Am. Rev. Respir. Dis., 140: 1317-1324 (1989)) e têm potenciais também para a administração 2 sistémica de péptidos e proteínas (Patton e Platz, Advanced Drug Delivery Reviews, 8: 179-196 (1992)). No entanto, as estratégias de administração de fármacos pulmonares apresentam muitas dificuldades para a administração de macromoléculas; estas incluem a desnaturação das proteínas durante a aerossolização, a excessiva perda de fármaco inalado na cavidade orofaringeana (muitas vezes excedendo os 80%) , pouco controlo sobre o local da deposição, a falta de reprodutibilidade dos resultados terapêuticos devido a variações nos padrões de respiração, a frequente absorção excessivamente rápida do fármaco resultando, potencialmente, em efeitos tóxicos locais e a fagocitose por macrófagos pulmonares.

Tem sido dedicada uma atenção considerável a concepção de inaladores pressurizados terapêuticos a fim de melhorar a eficácia das terapêuticas de inalação. Timsina et. al., Int. J. Pharm., 101: 1-13 (1995); e Tansey, I. P., Spray Technol. Market, 4: 26-29 (1994). Tem também sido dedicada atenção à concepção da textura da superfície do aerossol em pó, particularmente com referência à necessidade de evitar a agregação de partículas, um fenómeno que diminui, de forma considerável, a eficácia das terapêuticas de inalação. French, D. L., Edwards, D. A. e Niven, R. W., J. Aerosol Sei., 27: 769-783 (1996). As formulações de pó seco ("DPSs") com tamanhos de partícula grande têm características melhoradas de fluidez, tais como uma menor agregação (Visser, J., Powder Technology 58: 1-10 (1989)), aerossolização mais fácil e, potencialmente, menor fagocitose. Rudt, S. e R. H. Muller, J. Controlled Release, 22: 263-272 (1992); Tabata, Y. 3 e Y. Ikada, J. Biomed. Mater. Res., 22: 837-858 (1988). Os aerossóis de pó seco para a terapêutica de inalação são produzidos, de um modo geral, com diâmetros geométricos médios, principalmente na gama de menos de 5 pm, tipicamente variando entre 1 e 5 pm. Ganderton, D., J. Biopharmaceutical Sciences, 3: 101-105 (1992); e Gonda, I. "Physico-Chemical Principies in Aerosol Deliver" em Topics in Pharmaceutical Sciences 1991, Crommelin, D. J. e K. K. Midha, Eds., Medpharm Scientific Publishers, Estugarda, pp. 95-115, 1992. As partículas "transportadoras" de tamanho grande (não contendo fármaco) têm sido co-administradas com aerossóis terapêuticos para ajudar a conseguir uma aerossolização eficaz, entre outros possíveis benefícios. French, D. L., Edwards, D. A. e Niven, R. W., J. Aerosol Sei., 27: 769-793 (1996).

Os pulmões humanos podem remover ou degradar rapidamente, por exemplo por meio de hidrólise ou clivagem hidrolítica, os aerossóis depositados por períodos de tempo que variam de minutos a horas. Nas vias aéreas superiores, os epitélios ciliados contribuem para a "escada rolante mucociliar" por meio da qual as partícula são varridas das vias aéreas em direcção à boca. Pavia, D. "Lung Mucociliary Clearance" em Aerosols and the Lung: Clinicai and Experimental Aspects, Clarke, S. W. e Pavia, D., Eds., Butterworths, Londres, 1984. Anderson, Am. Rev. Respir. Dis., 140: 1317-1324 (1989). No pulmão profundo, os macrófagos alveolares são capazes de fagocitar partículas logo depois da sua deposição. Warheit, Μ. B. e Hartsky, Μ. A., Microscopy Res Tech.; 26: 412-422 (1993); Brain, J. D., "Physiology and Pathophysiology of Pulmonary Macrophages" em The 4

Reticuloendothelial System, S. M. Reichard e J. Filkins, Eds., Plenum, N. Y., pp. 315-327, 1985; Dorries, A. M. e Valberg, P. A., Am. Rev. Resp. Disease 146: 831-837 (1991); e Gehr, P., Microscopy Res. and Tech., 26: 423-436 (1993). À medida que o diâmetro das partículas excede 3 pm, há cada vez menos fagocitose por macrófagos. Kawaguchi, H., Biomateríals 7: 61-66 (1986); Krenis, L. J. e Strauss, B., Proc. Soc. Exp. Med. , 107: 748-750 (1961); e Rudt, S. e Muller, R. H., J. Contr. Rei., 22: 263-272 (1992). No entanto, verificou-se que o aumento do tamanho da partícula minimiza a probabilidade das partículas (que possuem densidade de massa padrão) de entrar nas vias aéreas e alvéolos devido à excessiva deposição nas regiões orofaringeana ou nasal. Heyder, J., J. Aerosol Sei., 17: 811-825 (1986).

As terapêuticas de inalação locais e sistémicas podem, muitas vezes, beneficiar de uma libertação controlada relativamente lenta do agente terapêutico. Gonda, I., "Physico-chemical principies in aerosol delivery" em: Topics in Pharmaceutical Sciences 1991, D. J. A. Crommelin e K. K. Midha, Eds., Estugarda: Medpharm Scientific Publishers, pp. 95-117 (1992). A libertação lenta de um aerossol terapêutico pode prolongar a permanência de um fármaco administrado nas vias aéreas ou alvéolos e diminuir a velocidade do aparecimento do fármaco na corrente sanguínea. Além disso, a aceitação do doente é aumentada, conseguindo-se a redução da frequência da dosagem. Langer, R., Science, 249: 1527-1533 (1990); e Gonda, I., "Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents to the respiratory tract" em Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 6: 273-313 5 (1990). A administração de fármaco com libertação controlada ao pulmão pode simplificar a maneira como muitos fármacos são tomados. Gonda, I. , Adv. Drug Del. Rev. , 5: 1-9 (1990); Zeng, X. , et al., Int. J. Pharm., 124: 149-164 (1995). administração de fármacos pulmonares é uma alternativa atraente em relação à administração oral, transdérmica e parentérica, porque a auto-administração é simples, os pulmões proporcionam uma grande superfície mucosal para a absorção do fármaco, não há efeito de primeira passagem no fígado de fármacos absorvidos e há uma actividade enzimática e uma degradação de fármaco mediada por pH reduzidas em comparação com a via oral. Pode-se conseguir uma biodisponibilidade relativamente alta de muitas moléculas, incluindo as macromoléculas, por meio de inalação. Wall, D. A., Drug Delivery, 2: 1-20 1995); Patton, J. e Platz, R.,

Adv. Drug Del. Rev., 8: 179-196 (1992); e Byron, P., Adv. Drug. Del. Rev., 5: 107-132 (1990). Como resultado, várias formulações de aerossol de fármacos terapêuticos estão em utilização ou estão a ser testadas para administração no pulmão. Patton, J. S., et al., J. Controlled Release, 28: 79-85 (1994); Damms, B. e Bains, W., Nature Biotechnology (1996); Niven, R. W., et al., Pharm. Res., 12 (9): 1343-1349 (1995) ; e Kobayashi, S., et al., Pharm. Res., 13(1): 80-83 (1996) .

Os fármacos actualmente administrados por inalação são apresentados principalmente como formulações pressurizadas líquidas. No entanto, muitos fármacos e excipientes, especialmente proteínas, péptidos (Liu, R., et al., Biotechnol. Bioeng., 37: 177-184 (1991)) e veículos biodegradáveis, tais como poliglicólidos co-polímeros (láctido-glicólido) (PLGA) são instáveis em ambientes aquosos durante períodos de tempo prolongados. Isto pode tornar problemático o armazenamento de uma formulação líquida. Além disso, com as formulações líquidas, pode ocorrer a desnaturação da proteína durante a aerossolização. Mumenthaler, M., et al., Pharm. Res., 11: 12-20 (1994). Tendo estas e outras limitações em consideração, as formulações em pó seco (DPFs) estão a ganhar um crescente interesse como formulações para administração pulmonar. Damms, B. e W. Bains, Nature Biotechnology (1996); Kobayashi, S., et al., Pharm. Res., 13(1): 80-83 (1996); e Timsina, M., et al., Int. J. Pharm., 101: 1-13 (1994). No entanto, entre as desvantagens das DPFs encontra-se a de que as partículas ultrafinas dos pós, de um modo geral, têm fracas propriedades de fluidez e aerossolização, levando a fracções respiráveis relativamente baixas de aerossol, que são as fracções do aerossol inalado que escapam à deposição na boca e garganta. Gonda, I., em Topics in Pharmaceutical Sciences 1991, D. Crommelin e K. Midha, Editors, Estugarda: Medpharm Scientific Publishers, 95-117 (1992) . Uma preocupação importante com muitos aerossóis é a agregação de partículas causada pela interacção de partícula-partícula, tais como interacções hidrófobas, electrostáticas e capilares. Uma terapêutica eficaz de inalação de pó seco, tanto para a libertação a curto prazo como a longo prazo dos componentes terapêuticos, seja para administração local ou sistémica, requer um pó que apresente uma agregação mínima, bem como meios de evitar ou 7 suspender os mecanismos naturais de desobstrução dos pulmões até que os fármacos tenham sido entregues eficazmente.

As partículas adequadas para administração ao sistema respiratório de um doente podem ser preparadas por secagem por pulverização a partir de soluções aquosas. Várias proteínas, no entanto, desnaturam sob condições aquosas de secagem por pulverização. Em alguns casos, as partículas de proteína que são preparadas por meio de pulverização a partir de soluções aquosas tendem a tornar-se higroscópicas e susceptíveis de perder a sua capacidade mesmo a níveis modestos de humidade. A secagem por pulverização na presença do agente tensioactivo polissorbato-20 demonstrou reduzir a agregação da hormona de crescimento recombinante durante a secagem por pulverização. Numa outra abordagem, foram utilizados solventes, incluindo água e metanol, ou água e etanol, para secar por pulverização microcápsulas ocas de albumina. Nenhuma destas técnicas, no entanto, resultou seja numa estabilidade melhorada da proteína, seja na higroscopicidade reduzida da proteína.

Deste modo, existe uma necessidade de métodos para produzir partículas secas por pulverização que superem ou minimizem os problemas acima mencionados. 0 documento EP 0 655 237-Al descreve a preparação de uma substância medicinal na forma de uma suspensão atomizada que compreende um produto seco por pulverização composto de 8 uma substância medicinal, de uma substância tensioactiva, fisiologicamente tolerada insolúvel no propulsor liquefeito, onde apropriado um aroma de mascaramento e/ou uma substância auxiliar usual, num fluorocarboneto liquidificável, hidrogenado ou parcialmente hidrogenado, como propulsor. Δ invenção refere-se, além disso, a um processo para a produção da preparação da substância medicinal que compreende substâncias adequadas para a inalação e que actuam localmente sobre o pulmão para o tratamento de distúrbios das vias aéreas ou asma. 0 documento W097/268663 descreve um processo para a produção de uma preparação tensioactiva pulmonar em pó contendo uma proteina hidrófoba que serve como um tensioactivo pulmonar caracterizado pelo facto de que uma solução ou suspensão orgânica contendo uma proteina hidrófoba que serve como um tensioactivo pulmonar e possivelmente outros componentes é submetida à secagem por pulverização. São obtidas preparações em pó que exibem boa estabilidade em armazenamento, são fáceis de reconstituir e são também adequadas para administração por inalação. 0 documento WO 97/44012 descreve micropartícuias, de até 50 pm em tamanho, compreendendo um agente terapêutico e um agente tensioactivo. Estes componentes podem ser formulados homogeneamente com um propulsor com HFC. O documento WO 91/16882 descreve um método para a secagem directa por pulverização de lipidos e fármacos solúveis em água para gerar um pó em volume como uma 9 alternativa à secagem de lipossomas pré-formados. No presente método, os lípidos são dissolvidos num solvente e o fármaco solúvel em água é dissolvido em solvente aquoso. As duas soluções são combinadas para formar uma solução de alimentação livre de precipitado que é, então, seca por pulverização para gerar o pó em volume. Depois da re-hidratação o pó forma lipossomas de modo espontâneo, tendo uma alta eficácia de encapsulação de fármaco, de aproximadamente 70%. O pó seco por pulverização directa é particularmente útil para administração do fármaco por inalação. O documento EP 0 317 120-A1 descreve uma nova composição e método para solubilizar fármacos anfifilicos numa pequena quantidade de solvente orgânico para utilização em lipossomas melhorados. Um fosfatidilglicerol é acidificado numa pequena quantidade de solvente orgânico. O fármaco anfifilico, tal com a Anfotericina B, suspenso em solvente orgânico é, então, adicionado ao fosfatidilglicerol acidificado e um complexo solúvel é formado entre o fosfatidilglicerol e o fármaco anfifilico. Quando a composição de lipossoma que incorpora o complexo solúvel é hidratada, o pH final do tampão aquoso hidratante é controlado cuidadosamente. Os lipossomas de Anfotericina B formados têm toxicidade distintamente reduzida. Y. -F. MAA et al., "Spray-drying of air-liquid interface sensitive recombinant human growth hormone" Journal of Pharmaceutical Sciences, vol 87, n° 2, Fevereiro de 1998 (02-1998), páginas 152-159, XP000729419 Washington (EUA) 10 descrevem um estudo que demonstrou que a degradação de rhGH (formação de agregado insolúvel e solúvel), como consequência da degradação da interface ar-líquido, poderia ser evitada utilizando a formulação apropriada. A adição do agente tensioactivo polissorbato-20 à alimentação de líquido (sem a presença de açúcar protector) reduz, de forma significativa, a formação de agregados de proteína insolúvel, enquanto que a adição de ião de zinco metálico divalente suprime, de forma eficaz, a formação de agregados de proteína solúvel. A combinação dos dois produziu um pó de rhGH seco por pulverização com uma degradação de proteína insignificante. Os dados dos autores sugerem que os dois componentes podem proteger a proteína por meio de mecanismos diferentes. As moléculas de polissorbato ocupam a interface ar-líquido das gotículas da pulverização, reduzindo, deste modo, a possibilidade da rhGH formar agregados insolúveis pela desnaturação da superfície. Dois iões de zinco associam-se com moléculas de rhGH para formar um complexo de dímero que pode reduzir a formação de agregados de proteína solúvel. A caracterização de pós secos por pulverização por microscopia electrónica de varrimento sugere que tanto a formulação como as condições de secagem têm uma forte influência na morfologia e no formato da partícula. Como um todo, os pós rhGH esféricos de superfície lisa e boa qualidade bioquímica podem ser preparados por secagem a seco utilizando esta formulação, sem a adição de açúcar protector. 11

Resumo da Invenção A invenção relaciona-se com métodos para produzir partículas secas por pulverização, também aqui referidas como partículas que têm uma estabilidade de proteína melhorada, de acordo com o reivindicado nas reivindicações 1 a 18.

Numa forma de realização da invenção, o método inclui combinar uma proteína, um fosfolípido e um co-solvente orgânico-aquoso para formar uma mistura que é seca por pulverização para produzir partículas secas por pulverização com uma estabilidade do agente bioactivo melhorada. Noutra forma de realização da invenção, o método inclui combinar uma proteína, um fosfolípido e um solvente orgânico 10 para formar uma mistura que é seca por pulverização para produzir partículas tendo uma estabilidade de proteína melhorada. Numa forma de realização preferida, a proteína é um agente terapêutico, profilático ou diagnóstico.

Noutra forma de realização, o fosfolípido é seleccionado do grupo que consiste em fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilgliceróis, fosfatidilserinas, fosfatidilinositóis e combinações dos mesmos. Em ainda outra forma de realização, as partículas secas por pulverização têm uma densidade tap inferior a 0,4 g/cm3. A invenção também se refere à utilização de uma quantidade eficaz das partículas secas por pulverização obtidas por meio dos métodos da invenção para a preparação de 12 um medicamento para utilização na administração do referido medicamento ao tracto respiratório de um doente em necessidade de tratamento, profilaxia ou diagnóstico.

As partículas secas por pulverização podem ser utilizadas para a preparação de um medicamento para a administração melhorada de um agente terapêutico, profilático ou diagnóstico nas vias aéreas ou na região alveolar do pulmão. As partículas podem ser eficazmente aerossolizadas para a preparação de um medicamento para administração no tracto respiratório de modo a permitir a administração sistémica ou local de uma ampla variedade de agentes terapêuticos. As mesmas também podem ser co-administradas, opcionalmente, com partículas de veículo maiores que não transportam um agente terapêutico, tendo, por exemplo, um diâmetro médio que varia entre cerca de 50 pm e 100 pm. As partículas podem ser utilizadas para formar uma composição que inclui as partículas e um veículo farmaceuticamente aceitável para administração a um doente, de preferência para administração por inalação.

De acordo com uma forma de realização, as partículas secas por pulverização podem, elas mesmas, ser utilizadas como veículos para a preparação de um medicamento para a administração de um agente terapêutico, profilático ou diagnóstico no sistema pulmonar. De acordo com esta forma de realização, um agente terapêutico, profilático ou diagnóstico pode ser adicionado às partículas de veículo secas por pulverização para a preparação de um medicamento para administração ao sistema pulmonar. Os agentes terapêuticos, 13 profiláticos ou diagnóstico mais pequenos, tais como, por exemplo, os agentes que têm um tamanho de partícula na gama nanométrica, podem ser transportados pelas partículas secas por pulverização e administrados no sistema pulmonar.

Ao proporcionar um método para produzir partículas que têm uma estabilidade de proteína aumentada, a invenção tem inúmeras vantagens. Além disso, a invenção proporciona um método para produzir partículas aerodinamicamente leves adequadas para a administração no sistema respiratório.

Descrição Pormenorizada da Invenção

De uma maneira genérica, a invenção relaciona-se com métodos para produzir partículas secas por pulverização que têm uma estabilidade de proteína melhorada. Os termos "bioactivo" e "biologicamente activo" são aqui utilizados de forma intercambiável. Conforme aqui utilizado, o termo agente bioactivo inclui péptidos e proteínas. As proteínas são aqui definidas como tendo cerca de 100 resíduos de aminoácidos ou mais, enquanto os péptidos são aqui definidas como tendo menos de cerca de 100 resíduos de aminoácidos. Conforme aqui utilizado, o termo agente bioactivo também inclui as macromoléculas bioactivas não sejam péptidos ou proteínas. Exemplos de tais macromoléculas bioactivas incluem, mas não se limitam a: polissacáridos e outros açúcares, lípidos, ADN, ARN, sequências de ácidos nucleicos, genes, moléculas anti-sentido, antigénios e outros. Numa forma de realização 14 preferida da invenção, a proteína pode ser um agente terapêutico, profilático ou diagnóstico.

Exemplos específicos de agentes biologicamente activos são, mas não se limitam a: insulina, eritroproteína, interferões, factores estimulantes de colónia, tais como factor estimulante de colónia de granulócitos, hormonas de crescimento, tais como, por exemplo, hormona do crescimento humano, análogos de LHRH, antagonistas de LHRH, activador de plasminogénio tecidual, análogo de somatostatina, r Factor VIII, r Factor IX, calcitonina, abciximab, dornase alfa, polissacáridos, AG337, proteína indutora de formação óssea, proteína morfogenética óssea, factor de crescimento derivado do cérebro, imunogénio gastrina-17, interleucinas, tais como, por exemplo, IL-2, superóxido PEF, infliximab, proteína-21 de aumento de permeabilidade, factor de crescimento derivado de plaquetas, factor de células estaminais, ThyrogenR e somatomedina C.

Conforme aqui utilizado, o termo estabilidade está relacionado, de um modo geral, com a manutenção da integridade ou a minimização da desnaturação, agregação ou desdobramento de um agente biologicamente activo, tal como uma proteína, péptido ou outra macromolécula bioactiva após ter sido exposto a condições conhecidas por afectarem de forma negativa a sua estabilidade. Conforme aqui utilizado, o termo estabilidade melhorada significa, de um modo geral, que, sob condições conhecidas por resultarem em degradação, desnaturação ou desdobramento, o agente bioactivo mantém uma maior estabilidade em comparação com partículas de controlo 15 submetidas às mesmas condições. As partículas de controlo podem ser, por exemplo, partículas ou pós disponíveis comercialmente que incluem o agente bioactivo. Por exemplo, as partículas de controlo podem incluir proteínas em volume liofilizadas ou açúcares liofilizados. As partículas de controlo também podem ser partículas obtidas por meio de métodos que não sejam os métodos da invenção. Por exemplo, as partículas de controlo podem incluir partículas que são secas por pulverização a partir de soluções aquosas ou partículas que não incluem um fosfolípido.

Muitas vezes, a degradação da proteína, por exemplo, é facilitada pela água. Uma estabilidade melhorada da proteína pode ser demonstrada em termos da retenção melhorada da integridade da proteína sob condições de armazenamento a níveis de humidade especificados. Por exemplo, as partículas secas por pulverização tendo uma estabilidade da proteína melhorada são partículas que são submetidas a menos degradação, desnaturação agregação e/ou desdobramento, em relação a formulações proteicas secas por pulverização a partir de soluções aquosas, ou secas por pulverização a partir de misturas que não incluem um fosfolípido, depois de armazenamento durante seis semanas a cerca de 25 °C (por exemplo, +/-2°C) e cerca de 60% (por exemplo, +/- 5%) de humidade relativa. Se forem utilizadas condições mais severas, as partículas secas por pulverização tendo uma estabilidade da proteína melhorada são partículas que, depois de armazenamento durante seis semanas a cerca de 40°C (por exemplo, +/-2°C) e cerca de 75% (por exemplo, +/- 5%) de humidade relativa, retêm uma maior estabilidade de proteína 16 (ou sofrem a menos degradação, desnaturação, agregação e/ou desdobramento) em comparação com as formulações de proteínas secas por pulverização a partir de soluções aquosas ou secas por pulverização a partir de misturas que não incluem um fosfolípido. Numa forma de realização da invenção as partículas secas por pulverização retêm, pelo menos, cerca de 70%, de preferência, pelo menos cerca de 80% da integridade da proteína, quando armazenadas em condições de cerca de 25°C e cerca de 60% de humidade relativa durante seis semanas. Noutra forma de realização da invenção, as partículas secas por pulverização retêm, pelo menos cerca de 50%, de preferência, cerca de 60% da integridade da proteína quando armazenadas em condições de cerca de 40°C e cerca de 75% de humidade relativa durante seis semanas. A estabilidade ou integridade do agente bioactivo pode ser medida por meio de métodos tais como aqueles conhecidos na técnica. Por exemplo, a estabilidade da proteína pode ser medida por cromatografia líquida de alta resolução de exclusão de tamanho (SEC HPLC). Outras técnicas adequadas para detectar a estabilidade, agregação ou degradação do agente bioactivo incluem, mas não se limitam a: cromatografia líquida de alta resolução de fase reversa (RP HPLC); electroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS PAGE); ensaio imunoadsorvente ligado a enzimas (ELISA) e radioimunoensaio (RIA).

Numa forma de realização, o método para produzir as partículas secas por pulverização tendo estabilidade melhorada do agente bioactivo inclui combinar um agente 17 bioactivo, tal como, por exemplo, os agentes descritos acima, com um fosfolipido e um co-solvente para formar uma mistura.

Os co-solventes incluem um solvente aquoso e um solvente orgânico. Os solventes orgânicos adequados que podem ser utilizados incluem, mas não se limitam a álcoois, tais como, por exemplo, etanol, metanol, propanol, isopropanol e butanóis. Outros solventes orgânicos incluem, mas não se limitam a perfluorocarbonetos, diclorometano, clorofórmio, éter, acetato de etilo, éter metilterbutilico e outros. Os solventes aquosos incluem água e soluções tampão. Numa forma de realização preferida, o solvente orgânico é etanol. De preferência, a quantidade de solvente orgânico pode estar presente no co-solvente numa quantidade que varia de cerca de 50 a cerca de 90% em volume. Numa forma de realização mais preferida, o solvente orgânico está presente no co-solvente numa quantidade que varia de cerca de 60 a cerca de 85% em volume.

Numa outra forma de realização, o método para produzir partículas secas por pulverização tendo uma estabilidade melhorada do agente bioactivo inclui combinar um agente bioactivo, tal como, por exemplo, os agentes descritos acima, com um fosfolipido e um solvente orgânico para formar uma mistura. 0 solvente orgânico inclui, mas não se limita aos solventes orgânicos descritos acima.

Numa forma de realização preferida da invenção, o fosfolipido, também aqui referido como fosfoglicérido, é um fosfolipido endógeno ao pulmão. Tal fosfolipido é 18 particularmente vantajoso na preparação de partículas secas por pulverização para administração ao sistema respiratório de um doente.

Noutra forma de realização preferida o fosfolípido é seleccionado do grupo que consiste em fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilgliceróis, fosfatidilserinas, fosfatidilinositóis e combinações destes. Exemplos específicos de fosfolípidos incluem, mas não se limitam às fosfatidilcolinas dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), dipalmitoil fosfatidiletanolamina (DPPE), distearoil fosfatidilcolina (DSPC), dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG) e quaisquer combinações destes. A mistura pode ter um pH neutro, a ácido ou alcalino. Opcionalmente, um tampão de pH pode ser adicionado ao solvente ou co-solvente ou à mistura formada. De preferência, o pH pode variar entre cerca de 3 a acerca de 10. A mistura obtida pela combinação do agente bioactivo com o fosfolípido e o co-solvente é seca por pulverização. Técnicas adequadas de secagem por pulverização são descritas, por exemplo, por K. Masters em "Spray Drying Handbook", John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1984. De um modo geral, durante a secagem por pulverização, é utilizado o calor de um gás quente, tal como ar ou azoto aquecido, para evaporar o solvente das gotículas formadas pela atomização de uma alimentação contínua de líquido. 19

Numa forma de realização preferida, é utilizado um atomizador rotativo. Exemplos de secadores de pulverização que utilizam atomização rotativa incluem o secador por pulverização Mobile Minor da Niro. De acordo com a invenção, o fosfolipido está presente nas partículas secas por pulverização numa quantidade de, pelo menos, cerca de 10% em peso. A quantidade de fosfolipido a ser incluída nas partículas pode ser determinada de forma experimental determinando a quantidade de fosfolipido que, quando incluído nas partículas secas por pulverização, resulta numa estabilidade melhorada, medida por meios tais como, mas não limitados, àqueles descritos acima.

Numa forma de realização, as partículas secas por pulverização incluem uma proteína, que está presente nas partículas numa quantidade que varia entre 30 e 90% em peso.

Sem estar restrito a qualquer mecanismo em particular, crê-se que a estabilidade melhorada é, pelo menos em parte, o resultado de uma tendência diminuída da proteína de ficar situada na interface ar-água ou na interface ar-co-solvente da gotícula. Crê-se que o fosfolipido compete com a proteína pela interface ar-gotículas protegendo , deste modo, a proteína. Além disso, crê-se que a presença do fosfolipido também torna as partículas secas por pulverização menos propensas à degradação devido à exposição a condições de humidade elevada durante o armazenamento. 20

De acordo com a invenção, as partículas secas por pulverização consistem num fosfolípido, tal como, por exemplo, os fosfolípidos descritos acima.

De acordo com uma outra forma de realização, as partículas consistem, essencialmente, em agente bioactivo e fosfolípido. Por exemplo, as partículas secas por pulverização podem ainda incluir pequenas quantidades ou traços de solvente ou co-solvente residuais, impurezas, substâncias que controlam o pH, ou outros materiais em pequenas quantidades ou quantidades residuais. As gamas para os níveis de impureza e para níveis residuais de solvente são geralmente bem estabelecidos na indústria e conhecidas dos especialistas na técnica. São também conhecidas na técnica as quantidades de tampões de pH que podem ser adicionados ao solvente, co-solvente ou mistura.

Numa forma de realização preferida, as partículas secas por pulverização têm uma densidade tap inferior a cerca de 0,4 g/cm3. Noutra forma de realização, as partículas secas por pulverização têm uma densidade tap inferior a cerca de 0,1 g/cm3. Ainda noutra forma de realização, as partículas secas por pulverização têm uma densidade tap inferior a cerca de 0,05 g/cm3.

Conforme aqui utilizada, a frase "partículas aerodinamicamente leves" refere-se a partículas que têm uma densidade tap inferior a cera de 0,4 g/cm3. A densidade tap das partículas de um pó seco pode ser obtida utilizando um instrumento GeoPyc™ (Micrometrics Instrument Corp. Norcross, 21 GA 30093). Pode também ser utilizado um Dual Plataform Microprocessor Controlled Tap Density Tester (Vankel, NC) . A densidade tap é uma medida padrão da densidade de massa de envelope. A densidade de massa de envelope de uma partícula isotrópica é definida como a massa da partícula a dividir pelo volume mínimo do envelope da esfera dentro do qual pode ser incluída. As características que podem contribuir para uma baixa densidade tap incluem a textura irregular da superfície e a estrutura porosa. O diâmetro médio preferido para as partículas aerodinamicamente leves para a terapêutica de inalação é, pelo menos, cerca de 5 micrómetros (pm) , por exemplo, entre cerca de 5 e cerca de 30 pm. Numa forma de realização preferida, as partículas secas por pulverização têm um diâmetro geométrico entre cerca de 5 pm e cerca de 30 pm. Termos tais como diâmetro médio, diâmetro médio de massa (MMD) diâmetro geométrico médio de massa (MMGD) e diâmetro de envelope médio de massa (MMED) são aqui utilizados de forma intercambiável. 0 termo diâmetro, em contraste com o termo "diâmetro aerodinâmico", refere-se aqui ao diâmetro de massa ou geométrico. Os termos "diâmetro aerodinâmico" e "diâmetro aerodinâmico médio de massa" (MMAD) são aqui utilizados de forma intercambiável. Numa forma de realização da invenção, o diâmetro aerodinâmico médio de massa é entre cerca de 1 pm e cerca de 5pm. Noutra forma de realização da invenção, o diâmetro aerodinâmico médio de massa é entre cerca de 1 pm e cerca de 3 pm. Noutra forma de realização o diâmetro aerodinâmico médio de massa é entre cerca de 3 pm e cerca de 5 pm. 22 0 diâmetro médio de massa das partículas secas por pulverização pode ser medido utilizando um instrumento de detecção de zona eléctrica tal como um Coulter Multisizer lie (Coulter, Miami, FL) ou um instrumento de difracção a laser (por exemplo, um instrumento Helos fabricado pela Sympatec, Princeton, NJ). 0 diâmetro das partículas numa amostra varia dependendo de factores tais como a composição da partícula e os métodos de síntese. A distribuição do tamanho de partículas numa amostra pode ser seleccionada de modo a permitir a deposição óptima em locais específicos no interior do tracto respiratório.

As partículas aerodinamicamente leves podem ser fabricadas ou separadas, por exemplo, por meio de filtração ou centrifugação, a fim de proporcionar uma amostra de partícula com uma distribuição de tamanho pré-seleccionada. Por exemplo, mais de 30%, 50%, 70% ou 80% das partículas numa amostra têm um diâmetro numa gama seleccionada de, pelo menos, cerca de 5 pm. A gama seleccionada numa certa percentagem das partículas têm de enquadrar-se, talvez, por exemplo, entre cerca de 5 e cerca de 30 pm, ou opcionalmente, entre cerca de 5 e cerca de 15 pm. Numa forma de realização preferida, pelo menos uma porção das partículas têm um diâmetro entre cerca de 9 e cerca de 11 pm. Opcionalmente, a amostra de partícula também pode ser fabricada, em que, pelo menos cerca de 90%, ou, opcionalmente, cerca de 95% ou cerca de 99% têm um diâmetro na gama seleccionada. A presença da proporção mais elevada das partículas aerodinamicamente leves, de diâmetro maior na amostra de partículas melhora a administração dos 23 agentes terapêuticos ou diagnósticos incorporados na mesma ao pulmão profundo. As partículas de grande diâmetro, de um modo geral, significam partículas com um diâmetro geométrico médio de, pelo menos, cerca de 5 μιη.

As partículas aerodinamicamente leves com uma densidade tap inferior a cerca de 0,4 g/cm3, diâmetros médios de, pelo menos cerca de 5 pm e um diâmetro aerodinâmico entre cerca de um e cerca de cinco micra , de preferência, entre cerca de um e cerca de três micra , são mais capazes de escapar a deposição inercial e gravitacional na região orofaringeana e são dirigidas às vias aéreas ou ao pulmão profundo. A utilização de partículas maiores, mais porosas é vantajosa, uma vez que as mesmas são capazes de aerossolizar de uma forma mais eficaz do que as partículas mais pequenas, mais densas, tais como aquelas utilizadas actualmente para terapêuticas de inalação.

Em comparação com as partículas mais pequenas, relativamente mais densas, as partículas maiores, aerodinamicamente leves, de preferência, com um diâmetro médio de, pelo menos cerca de 5 pm, também podem, potencialmente, evitar com mais sucesso o engolfamento fagocítico por macrófagos alveolares e a eliminação dos pulmões, devido à exclusão por tamanho das partículas do espaço citosólico dos fagócitos. A fagocitose das partículas por macrófagos alveolares diminui abruptamente à medida que o diâmetro da partícula aumenta para além de cerca de 3 pm. Kawaguchi, H., Biomaterials 7: 61-66 (1986); Krenis, L. J. e Strauss, B., Proc. Soc. Exp. Med., 107: 748-750 (1961); e 24

Rudt, S. e Muller, R. H., J. Contr. Rei., 22: 263-272 (1992). Para as partículas de tamanho estatisticamente isotrópico, tais como esferas com superfícies ásperas, o volume de envelope da partícula é aproximadamente equivalente ao volume do espaço citosólico necessário no interior de um macrófago para a completa fagocitose da partícula.

As partículas aerodinamicamente leves são, deste modo, capazes de uma libertação a longo prazo de um agente encapsulado nos pulmões. A seguir à inalação, as partículas biodegradáveis, aerodinamicamente leves podem depositar nos pulmões e, subsequentemente, sofrer a lenta degradação e libertação do fármaco, sem que a maior parte das partículas sejam fagocitadas por macrófagos alveolares. 0 fármaco pode ser administrado de uma forma relativamente lenta para dentro do fluido alveolar e a uma velocidade controlada para a corrente sanguínea, minimizando possíveis respostas tóxicas de células expostas a uma concentração excessivamente alta do fármaco. As partículas aerodinamicamente leves são, deste modo, altamente adequadas para as terapêuticas de inalação, particularmente em aplicações de libertação controlada.

As partículas podem ser preparadas com o material apropriado, aspereza de superfície, diâmetro e densidade tap para a administração localizada em regiões seleccionadas do tracto respiratório como o pulmão profundo ou as vias aéreas superiores. Por exemplo, uma densidade mais alta ou partículas maiores podem ser utilizadas para administração às vias aéreas superiores, ou uma mistura de partículas de vários tamanhos numa amostra, proporcionadas com o mesmo 25 agente terapêutico, ou diferente, pode ser administrada para atingir regiões diferentes do pulmão numa única administração. As partículas que têm um diâmetro aerodinâmico na gama de cerca de 3 a cerca de 5 pm são preferidas para a administração às vias aéreas centrais e superiores. As partículas que têm um diâmetro aerodinâmico na gama de cerca de 1 a cerca de 3 pm são preferidas para a administração ao pulmão profundo. 0 impacto inercial e a sedimentação gravitacional dos aerossóis são os mecanismos de deposição predominantes nas vias aéreas e alvéolos dos pulmões durante as condições normais de respiração. Edwards, D. A., J. Aerosol Sei., 26: 293-317 (1995) . A importância de ambos os mecanismos de deposição aumenta em proporção à massa do aerossol e não ao volume de partícula (ou envelope) . Uma vez que o local de deposição de aerossol nos pulmões é determinado pela massa do aerossol (pelo menos, para partículas de diâmetro aerodinâmico médio superior a aproximadamente 1 pm), a diminuição da densidade tap aumentando as irregularidades da superfície da partícula e a porosidade da partícula permite a administração de volumes de envelope de partículas maiores aos pulmões, sendo todos os outros parâmetros físicos iguais.

As partículas de baixa densidade tap têm um diâmetro aerodinâmico reduzido em comparação com o diâmetro real da esfera de envelope. 0 diâmetro aerodinâmico, daer, está relacionado ao diâmetro da esfera de envelope, d (Gonda, I., "Physico-chemical principies in aerosol delivery" em: Topics in Pharmaceutical Sciences 1991, D. J. A. Crommelin e K. K. 26

Midha, Eds., Estugarda: Medpharm Scientific Publishers, pp. 95-117 (1992)), pela fórmula: C^aer — cWp

em que a massa do envelope é em unidades de g/cm3. A deposição máxima de partículas de aerossol monodispersas na região alveolar do pulmão humano (~ 60 %) ocorre para um diâmetro aerodinâmico de aproximadamente daer=3 pm. Heyder, J. et al., J. Aerosol Sei., 17: 811-825 (1986). Devido à sua reduzida densidade de massa de envelope, o diâmetro d real das partículas aerodinamicamente leves compreendendo um pó monodisperso inalado que irá inibir a deposição máxima no pulmão profundo é: d = 3/Vp pm (em que p < 1 g/cm3) / onde d é sempre superior a 3 pm. Por exemplo, as partículas aerodinamicamente leves que apresentam uma densidade de massa de envelope p = 0,1 g/cm3, exibirão uma deposição máxima para as partículas que têm diâmetros de envelope até 9,5 pm. 0 tamanho de partícula aumentado diminui as forças de aderência entre as partículas. Visser, J., Powder Technology, 58: 1-10. Assim sendo, o tamanho grande de partícula aumenta a eficácia da aerossolização no pulmão profundo para as partículas de densidade baixa de massa de envelope, para além de contribuir para perdas fagocíticas menores.

Numa forma de realização da invenção, as partículas secas por pulverização têm uma densidade tap inferior a cerca 27 de 0,4 g/cm3 e um diâmetro médio entre cerca de 5 μιτι e cerca de 30 μιη, que em combinação produzem um diâmetro aerodinâmico entre cerca de 1 e cerca de 5 μιη, de preferência entre cerca de 1 e cerca de 3 pm. O diâmetro aerodinâmico é calculado para proporcionar a deposição máxima no interior dos pulmões, anteriormente conseguida pela utilização de partículas muito pequenas inferiores a cinco micra de diâmetro, de preferência entre um e três micra , que são então submetidas a fagocitose. A selecção de partículas que têm um diâmetro maior, mas que são suficientemente leves (em concordância a caracterização de "aerodinamicamente leves") resulta numa administração equivalente aos pulmões, mas as partículas de tamanho maior não são fagocitadas. Pode-se conseguir uma administração melhorada utilizando partículas com uma superfície áspera ou irregular em relação àquelas com uma superfície lisa.

De acordo com uma forma de realização da invenção, as partículas têm uma densidade de massa inferior a 0,4 g/cm3 e um diâmetro médio entre cerca de 5 pm e cerca de 30 pm. A densidade de massa e a relação entre a densidade de massa, o diâmetro médio e o diâmetro aerodinâmico estão discutidas no Pedido de Patente U.S. N° 08/655.570, depositado em 24 de Maio de 1996. Numa forma de realização preferida, o diâmetro aerodinâmico das partículas que têm uma densidade de massa inferior a cerca de 0,4 g/cm3 e um diâmetro médio entre cerca de 5 pm e cerca de 30 pm é entre cerca de 1 pm e cerca de 5 pm. 28

As partículas secas por pulverização podem ser utilizadas para a preparação de um medicamento para administração controlada, sistémica ou local, de agentes terapêuticos ou diagnósticos no tracto respiratório, por meio de aerossolização. A administração das partículas no pulmão por meio de aerossolização permite a administração no pulmão profundo de aerossóis terapêuticos de diâmetro relativamente grande, por exemplo, superiores a cerca de 5 pm de diâmetro médio. As partículas podem ser fabricadas com uma textura de superfície áspera para reduzir a aglomeração de partículas e melhorar a fluidez do pó. As partículas secas por pulverização têm propriedades de aerossolização melhoradas. As partículas secas por pulverização podem ser fabricadas com características que intensificam a aerossolização por meio de dispositivos de inalação de pó seco e conduzem a uma baixa deposição na boca, garganta e dispositivo de inalação.

As dosagens, formulações e sistema de administração de aerossol podem ser seleccionados para uma aplicação terapêutica, conforme descrito, por exemplo, em Gonda I. "Aerosols for delivery of therapautic and didagnostic agents to the respiratory tract", em Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6: 273-313, 1990; e em Moren, "Aerosol dosage forms and formulations", em Aerosols in Medicine. Principies, Dignosis and Therapy, Moren, et al., Eds, Esevier, Amesterdão, 1985. A maior aerossolização pelas partículas aqui descritas relativas a partículas que não incluem um tensioactivo ou um complexo carregado de um agente terapêutico permite que seja 29 administrado mais de um agente terapêutico. A utilização de polimeros biodegradáveis permite a libertação controlada nos pulmões e uma acção local por tempo prolongado ou biodisponibilidade sistémica. A desnaturação dos fármacos macromoleculares pode ser minimizada durante a aerossolização uma vez que as macromoléculas podem ser contidas e protegidas no interior de uma invólucro polimérico. A co-encapsulação de péptidos com inibidores de peptidase pode minimizar a degradação enzimática do péptido. De uma forma vantajosa, a administração pulmonar pode reduzir ou eliminar a necessidade de uma injecção. Por exemplo, a necessidade de injecções diárias de insulina pode ser evitada. A invenção também se relaciona com um método para a administração no sistema pulmonar. 0 método compreende administrar no tracto respiratório de um doente em necessidade de tratamento, profilaxia ou diagnóstico, uma quantidade eficaz das partículas secas por pulverização obtidas por meio dos métodos da invenção.

Partículas porosas ou aerodinamicamente leves, tendo um tamanho geométrico (ou diâmetro médio) na gama de cerca de 5 a cerca de 30 micrómetros, e uma densidade tap inferior a cerca de 0,4 g/cm3, de tal modo que possuem um diâmetro aerodinâmico de cerca de 1 a 3 pm, demonstraram que exibem as propriedades ideais para a administração ao pulmão profundo. No entanto, para administração às vias aéreas centrais e superiores, são preferidos os diâmetros aerodinâmicos maiores, de preferência que variam, por exemplo, de cerca de 3 a cerca de 5 pm. De acordo com uma forma de realização da 30 invenção as partículas têm uma densidade tap inferior a cerca de 0,4 g/cm3 e um diâmetro médio entre cerca de 5 e cerca de 30 pm. De acordo com outra forma de realização da invenção as partículas não poliméricas têm uma densidade de massa inferior a cerca de 0,4 g/cm3 e um diâmetro médio entre cerca de 5 pm e cerca de 30 pm. Numa forma de realização da invenção as partículas têm um diâmetro aerodinâmico entre cerca de um e cerca de cinco micra . Noutra forma de realização da invenção as partículas têm um diâmetro aerodinâmico entre cerca de um e cerca de três micra . Ainda noutra forma de realização da invenção as partículas têm um diâmetro aerodinâmico entre cerca de três e cerca de cinco mi era .

Para a utilização terapêutica, diagnóstica ou profilática as partículas podem ser administradas a partir de um dispositivo inalador, tal como, mas não limitado a um inalador de dose medida (MDI) , inalador de pó seco (DPI) nebulizador ou por instilação. Tais dispositivos são conhecidos na técnica. Por exemplo, um DPI está descrito na Patente U.S. N° 4.069.819 publicada por Valentini, et al., em 5 de Agosto de 1976.

Exemplos A presente invenção será melhor entendida por meio da referência aos exemplos não limitativos a seguir. 31

Alguns dos métodos e materiais utilizados nos exemplos a seguir estão descritos no Pedido de Patente U.S. N° 09/211.940, depositado em 15 de Dezembro de 1998, no Pedido de Patente U.S. N° 08/739.308, depositado em 29 de Outubro de 1996, agora Patente U.S. N° 5.874.064, no Pedido de Patente U.S. N° 08/655.570, depositado em 24 de Maio de 1996, no Pedido de Patente U.S. N° 09/194.068, depositado em 23 de Maio de 1997, no documento PCT/US97/08895, pedido depositado em 23 de Maio de 1997, no Pedido de Patente U.S. N° 08/971.791, depositado em 17 de Novembro de 1997, no Pedido de Patente U.S. N° 08/784.421, depositado em 16 de Janeiro de 1997, agora a Patente U.S. N° 5.855.913 e no Pedido de Patente U.S. N° 09/337.245, depositado em 22 de Junho de 1999.

Materiais A IgG foi obtida da Sigma, St. Louis, MO. A sequência de ADN de hGH está descrita na Patente U.S. N° 4.898.830 publicada em 6 de Fevereiro por Geoddel et al. O DPPC foi obtido da Avanti (Alabaster, ALA) ou Sigma.

Secagem por Pulverização

Foi utilizado um secador por pulverização Mobile Minor da Niro (Dinamarca) . O gás quente era ar ou azoto desumidificado. A temperatura do gás variou entre cerca de 80 a cerca de 150°C.

Análise da Distribuição do Tamanho das Partículas 32

As distribuições de tamanho foram determinadas utilizando um Coulter Multisizer II (Coulter Corp. Miami, FL) . Foram adicionadas, aproximadamente, 10 gotas de dispersante não iónico Coulter tipo Ia, seguido por uma solução de 2 mL de solução isoton II (Coulter), para microesferas de 5-10 mg e as partículas foram dispersas por mistura agitada em vórtice. Esta suspensão foi adicionada a 50 mL de solução isoton II até que a coincidência de partículas era entre 5 e 8%. Foram contadas partículas superiores a 500.000 para cada lote de esferas.

Morfologia das Partículas por Microscopia Electrónica de Varrimento (SEM) A morfologia da microesfera foi observada por meio de microscopia electrónica de varrimento (SEM) utilizando um microscópio Stereoscan 250 MK3 da Cambridge Instruments (Cambridge, MA) a 15 kV. As microesferas foram liofilizadas, montadas em braços de metal com fita adesiva de face dupla e revestidas com ouro antes da observação.

Análise da Densidade das Partículas A densidade aparente foi estimada por medições de densidade tap, conforme obtidas utilizando um Dual Platform Microprocessor Controlled Tap Density Tester (Vankel, NC) e confirmada por análise de intrusão de mercúrio em Porous Materials, Inc. (Ithaca, NY). 33

Medições de Integridade de Proteína

As medições da integridade da proteína foram obtidas por meio de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC-HPLC).

Exemplo 1

Foram preparadas partículas de IgG para demonstrar que partículas adequadas para inalação, com um diâmetro aerodinâmico teórico entre 1 e 3 micra , poderiam ser preparadas secando por pulverização uma proteína com DPPC numa mistura de co-solvente água/etanol. Foi utilizado um co-solvente etanol/água 70/30. A concentração solúvel (IgG e DPP combinados) era de 0,1% p/v. O pH da água variou de 3-5,7. Os parâmetros de secagem por pulverização foram a temperatura de entrada (110°C), taxa de rotação do atomizador (1-2 bar), taxa de alimentação de 40 mL/min, e temperatura de saída próxima a 50°C. Foram preparadas partículas de IgG/DPPC 40/60 e IgG/DPPC 50/50. As densidades tap variaram de 0,02 a 0,2 g/cm3 com diâmetros geométricos próximos aos 7 micra . Isto produziu diâmetros aerodinâmicos na gama de 1-3 micra , ideias para inalação. A análise SDS PAGE não demonstrou diferença entre o material IgG de partida e as partículas de IgG secas por pulverização indicando não haver agregados ou degradação. 34

Exemplo 2 A hormona de crescimento humano (hGH) é um exemplo de uma proteína susceptível à desnaturação durante a secagem por pulverização a partir de uma solução aquosa. A hGH foi seca por pulverização numa mistura de co-solvente aquoso/etanol com DPPC.

Foram utilizados um co-solvente aquoso/etanol 70/30 (vol/vol) e concentrações solúveis (hGH e DPPC combinados) de 0,1% p/v. O pH foi de 7,4 (tampão NaPCh) . Os parâmetros da secagem por pulverização foram conforme descrito acima. Foram preparadas partículas de hGH/DPPC 60/40 e hGH/DPPC 80/20.

As densidades tap variaram de 0,02 a 0,04 g/cm3 e os diâmetros geométricos de 7-8 micra . Isto produziu diâmetros aerodinâmicos na gama de 1-3 micra , ideais para inalação.

As partículas secas por pulverização de hGH a 60% e 80% foram analisadas por HPLC para detectar instabilidades (por exemplo, agregação, desamidação). As partículas secas por pulverização acima descritas foram comparadas a partículas de hGH que foram secas por pulverização sem a presença de DPPC e um co-solvente orgânico. A análise demonstrou uma redução de agregados de 23% para menos de 2% e nenhuma desaminação detectável. 35

Exemplo 3

Foi determinada a estabilidade da proteína gGH por um período de tempo prolongado (6 semanas) depois de exposição a diferentes temperaturas e humidades. Estas experiências foram levadas a cabo em frascos de vidro com a tampa frouxa proporcionado as amostras uma total exposição à temperatura e à humidade. As condições seleccionadas foram mais severas do que aquelas normalmente presentes durante a armazenagem do produto. A estabilidade da hGH foi medida por SEC-HPLC que demonstra a quantidade do monómero (a forma activa) e agregados de peso molecular mais elevado. A Tabela 1 apresenta os dados SEC-HPLC que demonstram a melhor estabilidade das partículas de hGH secas por pulverização (60% de hGH e 405 de DPPC) em comparação com o pó de hGH a granel.

Tabela 1

Condição de Estabilidade % das Partículas Monómero hGH/DPPC % Pó de monómero hGH a

25 ± 2°C & 60 ± 5% HR 40 + 2°C & 75 + 5% HR 88, 9 68, 4 granel 25,4 37,1

Lisboa, 14/09/2007

Claims (21)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para a produção de partículas de proteína secas por pulverização com uma estabilidade melhorada compreendendo: (a) combinar uma proteína tendo 100 aminoácidos ou mais, um fosfolípido e um solvente orgânico para formar uma mistura; e (b) a secagem por pulverização da referida mistura para produzir partículas de proteína secas por pulverização com uma estabilidade melhorada; em que as partículas secas por pulverização consistem na proteína numa quantidade de 30 a 90% em peso, um fosfolípido numa quantidade de pelo menos 10% em peso, um tampão opcional, e quantidades residuais de: um solvente ou co-solvente residuais, impurezas ou outros materiais em quantidades residuais.

2. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o fosfolípido é seleccionado do grupo que consiste em fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilgliceróis, fosfatidilserinas, fosfatidilinositóis e combinações destes.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a proteína é a hormona de crescimento humano. 2

4. Método de acordo com a reivindicação 1 em que as partículas secas por pulverização retêm, pelo menos, 70% da integridade da proteína quando armazenadas a 25 °C e em condições de 60% de humidade relativa durante seis semanas.

5. Método de acordo com a reivindicação 1 em que as partículas secas por pulverização retêm, pelo menos, 50% da integridade da proteína quando armazenadas a 40°C e em condições de 75% de humidade relativa durante seis semanas.

6. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a proteína é um agente terapêutico, profilático ou diagnóstico.

7. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a concentração da proteína e fosfolípido na referida mistura é de pelo menos 0,1% em peso/volume.

8. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o solvente orgânico inclui um álcool.

9. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o solvente orgânico é um co-solvente numa concentração de pelo menos 50% em volume.

10. Método de acordo com a reivindicação 1 em que as partículas secas por pulverização têm uma densidade tap inferior a 0,4 g/cm3. 3

11. Método de acordo com a reivindicação 10 em que as partículas secas por pulverização têm uma densidade tap inferior a 0,1 g/cm3.

12. Método de acordo com a reivindicação 11 em que as partículas secas por pulverização têm uma densidade tap inferior a 0,05 g/cm3.

13. Método de acordo com a reivindicação 10 em que as partículas secas por pulverização têm um diâmetro geométrico mediano entre 5 micra e 30 micra.

14. Método de acordo com a reivindicação 13 em que as partículas secas por pulverização têm um diâmetro aerodinâmico entre 1 micron e 5 micra.

15. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 14 em que o solvente orgânico é parte de um co-solvente, cujo co-solvente inclui também um solvente aquoso.

16. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 15 em que as partículas secas por pulverização são constituídas pela proteína, pelo fosfolípido e pelo tampão.

17. Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores em que o fosfolípido é endógeno ao pulmão.

18. Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores em que as partículas são na forma de um pó seco 4 para administração no tracto respiratório utilizando um inalador de pó seco.

19. Partículas que podem ser produzidas pelo método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18.

20. Partículas de acordo com a reivindicação 19 para utilização em terapêutica.

21. Utilização das partículas de acordo com a reivindicação 20 para a preparação de um medicamento destinado à utilização na administração do referido medicamento no tracto respiratório. Lisboa, 14/09/2007