PT1105485E - Dna e polipeptídeos de il-1 epsilon humana - Google Patents

Description

ΡΕ1105485 1

DESCRIÇÃO "DNA E POLIPEPTÍDEOS DE IL-1 EPSILON HUMANA"

FUNDAMENTO DO INVENTO

Campo do Invento O invento é dirigido a novos polipeptídeos de IL-1 epsilon humana purificados e isolados, ácidos nucleicos codificadores de tais polipeptídeos, processos para a produção de formas recombinantes de tais polipeptídeos, anticorpos gerados contra estes polipeptídeos, peptídeos fragmentados derivados destes polipeptídeos, utilização de tais polipeptídeis e fragmentos peptídicos em reacções celulares e imunes e como marcadores de peso molecular, utilização de tais polipeptídeos e fragmentos peptídicos como controlos para a fragmentação peptídica e estojos ("kits") compreendendo estes reagentes.

Descrição de Técnica Relacionada A interleucina-1 (IL-1) é um membro de um grande grupo de citocinas cuja principal função é mediar as respostas imunes e inflamatórias. Existem cinco membros conhecidos da família de IL-1, os quais incluem IL-1 alfa (IL-la), IL-1 beta (IL-ΐβ), antagonista do receptor de IL-1 2 ΡΕ1105485 (IL-lra), IL-1 delta (IL-Ιδ, conforme descrito em PCT US/99/00514) e IL-8 (anteriormente conhecida como IGIF e por vezes como IL-1 gama). IL-1, que é secretada por macrófagos, é de facto uma mistura essencialmente de IL-Ιβ e alguma IL-Ια (Abbas et al., 1994) . IL-Ια e IL-Ιβ, que são primeiro produzidas com precursores de 33 KD sem uma sequência sinal, foram ainda processados por clivagem proteolitica para produzir formas activas secretadas, cada uma com cerca de 17 KD. Ainda, o precursor de IL-Ια de 33 KD é também activo. Ambas as formas de IL-1 são os produtos de dois genes diferentes situados no cromossoma 2. Se bem que as duas formas sejam menos de 30% homólogas uma da outra, ambas se ligam aos mesmos receptores e possuem actividades semelhantes. IL-lra, uma forma biologicamente inactiva de IL-1, é estruturalmente homóloga de IL-1 e liga-se aos mesmos receptores. Ainda, IL-lra é produzida com uma sequência sinal que permite a secreção eficiente para a região extracelular onde compete de forma competitiva com IL-1 (Abbas et al., 1994).

Os ligandos da família de IL-1 ligam-se a dois receptores de IL-1 que são membros da superfamília de Ig. Os receptores de IL-1 incluem o receptor de 80 KDa tipo I (IL-1RI) e um receptor tipo II de 68 KDa (IL-RII). Os ligandos também se ligam a um fragmento proteolítico solúvel de IL-1RII (sIL-lRII) (Colotta et al., Science 261 (5120) :472-75, 1993) . 3 ΡΕ1105485 A principal fonte de IL-1 é o macrófago ou o fagócito mononuclear activado. Outras células que produzem IL-1 incluem células epiteliais e endoteliais (Abbas et al., 1994). A secreção de IL-1 pelos macrófagos ocorre após o macrófago encontrar e ingerir bactérias gram-negativas. Tais bactérias contêm moléculas de lipopolissacáridos (LPS), também conhecidas como endotoxina, na parede celular bacteriana. As moléculas LPS são os componentes activos que estimulam os macrófagos para produzirem factor de necrose tumoral (TNF) e IL-1. Neste caso, IL-1 é produzida como resposta a LPS e à produção de TNF. Em concentrações baixas, LPS estimula macrófagos e activa células B e outras respostas do hospedeiro necessárias para eliminar a infecção bacteriana; no entanto, em concentrações elevadas, LPS pode causar grave destruição dos tecidos, choque e mesmo morte. inflamatórios.

As funções biológicas de IL-1 incluem activação das células endoteliais vasculares e linfócitos, destruição de tecido localizada e febre (Janeway et al., 1996). Em niveis baixos, IL-1 estimula macrófagos e células do endotélio vascular para produzir IL-6, moléculas reguladas de forma positiva na superfície das células do endotélio vascular para aumentar a adesão de leucócitos e, indirectamente, activar leucócitos inflamatórios através da estimulação de fagócitos mononucleares e outras células para produzirem determinadas quimiocinas que activam leucócitos inflamatórios. Estas funções de IL-1 são 4 ΡΕ1105485 cruciais durante infecções microbianas de baixo nível. No entanto, se a infecção microbiana aumentar, IL-1 actua sistemicamente através da indução de febre, estimulação de fagócitos mononucleados para produzirem IL-1 e IL-6, aumentando a produção de proteínas séricas pelos hepatócitos e activação do sistema de coagulação. É também conhecido gue IL-1 não provoca necrose hemorrágica de tumores ou suprime a divisão de células estaminais da medula óssea. No entanto, IL-1 é letal para o homem em concentrações elevadas.

Atendendo à função importante de IL-1, existe a necessidade de outros membros da família de ligandos de IL-1. Ainda, face ao interesse continuado na pesquisa de proteínas e do sistema imune, a descoberta, identificação e papéis de novas proteínas, tais como IL-1 epsilon humana e seus receptores, estão na linha da frente da biologia molecular moderna e bioquímica. Apesar do crescente conhecimento, existe ainda a necessidade de identificar e determinar a função de proteínas envolvidas nas respostas celular e imune.

Ainda num outro aspecto, a identificação da estrutura primária ou sequência de uma proteína numa amostra desconhecida é o culminar de um processo árduo de experimentação. Com o objectivo de identificar uma amostra proteica desconhecida, o investigador pode basear-se numa comparação da amostra de proteína desconhecida com peptídeos conhecidos usando uma variedade de técnicas 5 ΡΕ1105485 conhecidas dos familiarizados com a matéria. Por exemplo, as proteínas são, de rotina, analisadas usando técnicas tais como electroforese, sedimentação, cromatografia e espectrometria de massa. A comparação de uma amostra de proteína desconhecida com polipeptídeos de peso molecular conhecido permite a determinação do peso molecular aparente da amostra de proteína desconhecida (T.D. Brock and M.T. Madigan, Biology of Microorganisms 76-77 (Prentice Hall, 6th ed. 1991)). Os padrões de pesos moleculares proteicos podem ser adquiridos comercialmente para ajudar no cálculo dos pesos moleculares de amostras de proteína desconhecidas (New England Biolabs Inc. Catalog:130-131, 1995; J.L. Hartley, Patente U.S. N° 5449758). No entanto, os padrões de peso molecular podem não corresponder muito bem ao tamanho da proteína da amostra desconhecida para permitir uma estimativa precisa do peso molecular aparente. A dificuldade da estimativa do peso molecular aparente é mais complexa no caso de proteínas que estão sujeitas a fragmentação por meios químicos ou enzimáticos (A.L. Lehninger, Biochemistry 106-108 (Worth Books, 2d ed. 1981)) . A natureza única da composição de uma proteína relativamente aos aminoácidos constituintes específicos resulta num posicionamento único de locais de clivagem dentro da proteína. A fragmentação específica de uma proteína por clivagem química ou enzimática resulta num 6 ΡΕ1105485 "impressão digital de peptídeos" única (D.W. Cleveland et al.r J. Biol. Chem. 252:1102-1106, 1977; M. Brown et al., J. Gen. Virol. 50:309-316, 1980). Consequentemente, a clivagem em locais específicos resulta na fragmentação reprodutível de uma determinada proteína em peptídeos de pesos moleculares precisos. Ainda, estes peptídeos possuem características de carga únicas que determinam o pH iso-eléctrico do peptídeo. Estas características únicas podem ser exploradas usando uma variedade de técnicas electro-foréticas e outras (T.D. Brock and M.T. Madigan, Biology of Microorganisms 76-77 (Prentice Hall, 6d ed. 1991)).

Quando é obtida uma impressão digital de peptídeos de uma proteína desconhecida, esta pode ser comparada com uma base de dados de proteínas conhecidas para ajudar na identificação da proteína desconhecida (W.J. Henzel et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5011-5015, 1993; B.

Thiede et al., Electrophoresis 1996, 17:588-599, 1996). Uma variedade de programas informáticos estão acessíveis através da Internet aos que trabalham na área para facilitar tais comparações, tais como Multildent (Local de Internet: www.expasy.ch/sprot/multiident.html), PeptidSearch (Local da Internet: www.mann.embl-heiedelberg.de...deSearch/ FR_PeptideSearchForm.html) e ProFound Local da Internet: www.chait-sgi.rockefeller.edu/egi-bin/prot-id-frga.html). Estes programas permitem ao utilizador especificar o agente de clivagem e os pesos moleculares dos peptídeos fragmentados dentro de uma determinada tolerância. Os programas comparam estes pesos moleculares com bases de dados de 7 ΡΕ1105485 proteínas para ajudar na elucidação da identidade da proteína na amostra. A informação precisa respeitante ao número de fragmentos peptídicos e o peso molecular preciso daqueles peptídeos é necessária para a identificação precisa. Assim, aumentando a precisão da determinação do número de fragmentos peptídicos e o peso molecular preciso daqueles peptídeos deverá resultar num maior sucesso na identificação de proteínas desconhecidas. A fragmentação de proteínas é ainda empregue para a produção de fragmentos para análise da composição em aminoácidos e sequenciação da proteína (P. Matsidiara, J. Biol. Chem. 262:10035-10038, 1987; C. Eckerskorn et al., Electrophoresis 1988, 9:830-838, 1988), particularmente a produção de fragmentos a partir de proteínas com um extremo N "bloqueado". Ainda, a fragmentação de proteínas pode ser usada na preparação de peptídeos para espectrometria de massa (W.J. Henzel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5011-5015, 1993; B. Thiede et al., Electrophoresis 1996, 17:588-599, 1996), para imunização, para selecção por afinidade (R.A. Brown, Patente U.S. N° 5151412) para determinação de locais de modificação (e.g. fosforilação), para a geração de compostos biológicos activos (T.D. Brock and M.T. Madigan, Biology of Microorganisms 300-301 (Prentice-Hall, 6th ed. 1991)) e para a diferenciação de proteínas homólogas (M. Brown et al., J. Gen. Virol. 50:309-316, 1980) .

Assim, existe também uma necessidade na área de ΡΕ1105485 polipept ídeos de IL-1 adequados para usar nos estudos de fragmentação de peptídeos, para usar em medições de pesos moleculares, e para usar na sequenciação de proteínas usando espectrometria de massa em tandem.

SUMÁRIO DO INVENTO 0 invento contribui para colmatar estas necessidades na área ao proporcionar ácidos nucleicos e poli-peptídeos isolados de IL-1 epsilon humana codificados por estes ácidos nucleicos. Especificamente, o invento engloba uma molécula de ácido nucleico de IL-1 epsilon humana isolada, compreendendo as sequências de DNA de SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:12 e uma molécula de ácido nucleico de IL-1 epsilon humana isolada codificadora da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 13, assim como moléculas de ácido nucleico complementares destas sequências. No invento estão incluídas moléculas de ácido nucleico de RNA e DNA, de cadeia simples e dupla, assim como moléculas de ácido nucleico que hibridam com um DNA de cadeia dupla desnaturada relacionado com SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 12. Estão também incluídas moléculas de ácido nucleico isoladas que derivam por mutagénese in vitro de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO:12, degeneradas relativamente a SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO: 12, são variantes alélicas de DNA humano do invento e são homólogos de espécie de DNA do invento. Está subjacente que todas estas moléculas de ácido nucleico codificam um polipeptídeo que activa IKBa e fosforilação 9 ΡΕ1105485 de MAP cinase como descrito no Exemplo III do presente pedido de patente. 0 invento também engloba vectores recombinantes que dirigem a expressão destas moléculas de ácido nucleico e células hospedeiras transformadas ou transfectadas com estes vectores. Ainda, o invento inclui método de utilização do ácido nucleico referido atrás nos ensaios para identificar cromossomas, mapear genes humanos e estudar o sistema imune. 0 invento também engloba polipeptideos isolados codificados por estas moléculas de ácido nucleico, poli-peptideos sintéticos codificados por estas moléculas de ácidos nucleicos e peptídeos e fragmentos destes poli-peptídeos. Anticorpos policlonais ou monoclonais que se ligam a estes polipeptídeos estão também incluídos no invento. O invento ainda abrange métodos para a produção de polipeptídeos IL-1 epsilon, incluindo cultura de uma célula hospedeira em condições que promovem a expressão e recuperação do polipeptídeo a partir do meio de cultura. Especialmente, a expressão de polipeptídeos IL-1 epsilon em células de bactérias, leveduras, plantas, insectos e animais está englobada no invento.

De um modo geral, os polipeptídeos do invento podem ser usados para estudar processos celulares, tais como regulação imune, proliferação celular, morte celular e respostas inflamatórias. Ainda, os polipeptídeos do ligando IL-1 epsilon, polipeptídeos relacionados com IL-1 epsilon e seus fragmentos, podem ser usados para identificar 10 ΡΕ1105485 proteínas associadas a ligandos do tipo IL-1 e receptores do tipo IL-1.

Ainda, estão abrangidos pelo invento os ensaios que utilizam polipeptídeos ligandos de IL-1 epsilon, polipeptideos relacionados com IL-1 epsilon e seus fragmentos para o rastreio de potenciais inibidores de actividade associados a moléculas contra-estrutura dos polipeptideos e métodos de utilização dos polipeptideos ligandos de IL-1 epsilon, polipeptideos relacionados com IL-1 epsilon e seus fragmentos como agentes terapêuticos para o tratamento de doenças mediadas pelas moléculas de contra-estrutura dos polipeptideos ligandos de IL-1 epsilon. Ainda, os métodos que utilizam polipeptideos ligandos de IL-1 epsilon, polipeptideos relacionados com IL-1 epsilon e seus fragmentos na projecção de inibidores são também um aspecto do invento. O invento ainda inclui um método para usar estes polipeptideos e seus fragmentos peptídicos como marcadores de pesos moleculares o qual permite a estimativa do peso molecular de uma proteína ou amostra de proteína fragmentada, assim como um método para a visualização dos marcadores de peso molecular do invento usando electrofo-rese. 0 invento ainda inclui métodos para usar polipeptídeos do invento e seus fragmentos peptídicos como marcadores para determinação do ponto isoeléctrico de uma amostra de proteína, assim como controlos para o estabelecimento do grau de fragmentação de uma amostra proteica. 11 ΡΕ1105485

Estão ainda englobados por este invento estojos ("kits") para ajudar nestas determinações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Este invento será mais facilmente descrito com referência aos desenhos em que:

Figura 1 é a sequência nucleotidica de DNA de IL-1 epsilon humana do invento, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:12 .

Figura 2 é a sequência de aminoácidos dos polipeptideos, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:13, codificada pelas sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:12, respectivamente.

Figura 3 descreve a homologia de aminoácidos entre o exão 3' de IL-1 humana epsilon e IL-1 epsilon murina (forma longa).

Figura 4 descreve a homologia de aminoácidos entre IL-1 epsilon humana (aminoácidos 51-159) e IL-1 epsilon murina (forma longa).

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Os receptores de interleucina-1 (IL-1) sao membros da grande superfamília de Ig dos receptores de 12 ΡΕ1105485 citocinas, muitos dos quais medeiam a resposta das células do sistema imune, em particular linfócitos. Nos últimos anos, membros da família de ligandos que se ligam a estes receptores foram descobertos num passo acelerado. O aumento do número de ligandos de IL-1 conhecidos tem sido largamente devido ao advento da clonagem de genes e técnicas de sequenciação. As sequências de aminoácidos deduzidas a partir das sequências de nucleótidos são consideradas como representando ligandos de IL-1 se partilharem homologia com outros ligandos de IL-1 conhecidos. IL-1 epsilon de ratinho é um homólogo de genes de IL-1 conhecidos, IL-la, IL-Ιβ, IL-Ιδ (descrito em PCT US/99/00514) e IL-lra e, mais recentemente, IL-18, ante-riormente também conhecida como IL-1 gama. IL-1 epsilon de ratinho foi inicialmente identificado através da pesquisa das bases de dados EST e descoberta de uma EST correspondendo a IL-1 epsilon de ratinho (número de acesso AA030324). A totalidade da grelha de leitura para a "forma longa" (ver abaixo) está contida nesta EST.

Sequência de DNA de IL-1 epsilon de ratinho (forma longa)

ATGTTCAOGA TCTTAOTAGT CSTGTGTGGA TCCTGCSMSAA C&AT&TCCTC ACTQCAGTCC CAAGGAAAGA GCAAACAGTT CC&GG&MSGG AACATAATGG AAATGTACm CCTGT&A&M3 «XTCTCTCTT CTATaCMG AAGAGTGGTA CA&CCTCTAC ATTTmGTCT GCAGCCrfCC CfGGTTOGTT CATCGCTGTC TGCTCT&AAG GGAGGXGCCC ACTCATTCTG ACCCAAGAAC TGGOGGAAAT CTTCATCACT GACTX CGAGA TSATTGTGGT ACATTAA (SEQIONOd) 13 ΡΕ1105485

Sequência de aminoácidos de IL-1 epsilon de ratinho (forma longa)

MFEI&WVCG SCHTISSLQS QGKSKQFQSG MXMEKSfSfKKE PfKASfcFYM KSGTTSTFRS AÃFPGP»FIÃV cskgscflxl tqbi^eifit dfemxwh* (SEQ1-0 NO:2)

Apesar de apresentar homologia com os genes de IL-1, IL-1 epsilon de ratinho é invulgar pelo facto da EST originalmente identificada aparentemente codificar os dois terços do extremo C de uma molécula do tipo IL-1. Ainda, durante os estudos de expressão de IL-1 epsilon, tornou-se aparente que existem duas formas, com "splicing" alternativo, de mRNA que codificam proteínas com extremos N idênticos mas divergentes nos extremos C. A mais longa destas duas proteínas era a codificada pelo EST original. A mais curta (por vezes designada "isoforma") tem aproxi-madamente um terço do comprimento de uma molécula típica da família IL-1.

Sequência de DNA de IL-1 epsilon de ratinho (forma curta) ATGTtCAGGA TCTTAGTAGt CGTGTGTGGÃ TCCTGCAGAft CÃ&T&TCCTC ACTGCAGTCC CAftGGAftAOA GCAAACAGTT CCAGXC&CT& TTACCTTQCT CCCATGGCftA TATCTGGAOA CTCTTGAGAC GAACAGQGGG G&TCCC&CGT ACATGGGAÍST GGAMGS3CCG ATOA (SEQIDNO:3)

Sequência de aminoácidos de IL-1 epsilon de ratinho (forma curta) MFHXLVWOG SCRTISSLQS QGXSHfflFQSI? &FC£HftNXWT I&RETGGlFR TWECRGR* (gEQÍO»4) 14 ΡΕ1105485

Estas duas proteínas (a forma longa e a forma curta), codificadas por versões com "splicing" alternativo do mesmo transcripto de RNA original, podem associar-se não covalentemente e assim formar uma molécula do tipo IL-1 "completa".

Em qualquer caso, usando como sonda os cDNAs mistos para as formas longa e curta de I-L-l epsilon de ratinho, identificou-se 11-1 epsilon humana através do rastreio de uma biblioteca genómica humana. A sequenciação de um clone obtido a partir da biblioteca genómica humana revela um segmento de DNA que contem uma grelha de leitura aberta, codificadora de uma porção de uma proteína com elevada homologia com IL-1 epsilon de ratinho na mesma região. A grelha de leitura aberta surge como um exão (o exão mais 3' da região codificadora). 0 local aceitador de "splicing" no extremo 5' deste exão está em posição idêntica ao local aceitador de "splicing" do exão correspondente em IL-1 epsilon de ratinho.

As sequências de DNA e de aminoácidos deste exão correspondendo a IL-1 epsilon humana estão descritas em SEQ ID N0:5 e SEQ ID N0:6, respectivamente.

Sequência de nucleótidos do DNA de IL-1 epsilon humana: GAAA&GGATA TAATGGMTT GTAímCCAA eCCGAGCCTG TGAAGTCCTT tCTCTTeme cacagccaga gtsgc&sqm ctcgacotg gastctgtôg C^TTCCCTGG CT03TTCATC GCTGTC&GCT CTSAAOG&GG CTGTCCTeTC ATCCTTACCC A&GA&CTGGG GAAAGCCAAC ACTACTGACT TTGGGTT&AC TATGCTGTTT TAA (S1QIDN0:S) 15 ΡΕ1105485

Um polipeptídeo preferido codificado pela sequência de ácido nucleico está descrito abaixo:

Sequência de aminoácidos de IL-1 epsilon humana:

Traduçao na grelha de leitura relevante (5'3') : EIBifffilUBJQ PESV&SFLFY HSQSGSSISTF E8V&FFGWFI AVSSBGSCFL ILTQELGKM? TTDFGLTMLF * A sequência de DNA de IL-1 epsilon humana de tamanho completo foi isolada como descrito no Exemplo I. A sequência de DNA e de aminoácidos da IL-1 epsilon humana de tamanho completo estão descritas em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO:8, respectivamente.

Sequência nucleotídica de tamanho completo do DNA de IL-1 epsilon humana:

AfGGAfcAàAG CÃTmftAA&T TÔAC&CACGT CAGCAGGGGA, TÃTCAATCAT CGGSTÍ3T<3<3G TTCTTCAGGA. CC&GACGCTC ATASCAGTCC CGAOGAAGGA CCOTATGTCT CCAGTCACTA TTGCCTTAAT CTCATGCCQ& CATaTGGACA CCCTTGA.GAA AGACAQAGGG AACCCCATCT ACCTGGGCCT GAATGGACTC AAlCTCTGCC TGATGTGTGC TAAASTCGGG GACGAGCCCA CACTGC&GCT GAAGGAAAAS GATAtÃATSG ATTTGTACAA CCAACCCO&G CCTGTGÁAGT CCTTTCTCTT CTACCACAGC CAGAGTGGCA QG&ACTCCAC CTTCGAGTCT GTGSCTTTCC CTGGCTGGTT CATCGCTGTC AGCTCTGAAG GAGGCTGTCC TCTCATCCTT AOCCAAGAAC TGGGG&AAGC CAA.CACTACT GACTTTGGGT TAACTATGCT (ΤΪ'ΤΤΤΑΆ (SEQIDNO:?) 16 ΡΕ1105485

Sequência de aminoácidos de tamanho completo de IL-1 epsilon humana:

Tradução na grelha de leitura relevante (5' para 3'):

MEK&LKXDTP OQGSIQDIHH KVWLQ-DQTL I&VPHKDHMS PVTIALISCR

HVETOBKOftG MFIYI*SUíGIs miCLMCAKVQ BQPTLQLKBK DIMSLYNQPE PVKSFLFYHS QSG&NSTFES mFFGWFIAV SSEGGCPL1L TQELGX&NTT DFGLimf* CSEOIDNO;8) "

Ainda, foi identificado um polimorfismo de um único nucleótido no gene de IL-1 epsilon humana. Especificamente, o polimorfismo compreende uma substituição de adenosina por guanosina no nucleótido 35. 0 polipeptídeo codificado por este gene de IL-1 epsilon polimórfico tem um resíduo de arginina na posição 12 em vez de um resíduo de glutamina. A sequência de DNA do gene de IL-1 epsilon humana contendo este polimorfismo de um único nucleótido está descrito em SEQ ID NO: 12 e a sequência de aminoácidos de tamanho completo correspondendo a este gene polimórfico está descrita em SEQ ID NO:13.

Sequência de nucleótidos de tamanho completo do DNA polimórfico de IL-1 epsilon humana: ATGGíyyyy^G c&ttquuuvt· tgacacacct cagcgggqga gcattcagga TATCAATCAT CGGGTGTGGG TTCTTCAGG& CCAGACGCTÇ AXAGG&&TCC CGAQS&AQGA CCGTATGTCT CCAGTCAGTA TTGCCTTAAT GTCKNSCCGA CATÇTGGAGA CCCTTiGAGAA AGACAGAGGG MCCCCATCT ACCTO-GGCCT G&ÃTGGaCTC AATCTCTGCC TGATSTGTGC TAAAGTCGOG GACCAGCCCÃ CACTGCAGCT GAAGGAAAAG C5ATATAATGG ATTTGTACAA CCAACCGGAÕ ÇCIQTG&ÃGT CCTXTCTCr? ÇTACÇACAGCI CAqAGT<3GÇA GGA&CTCCAC CTTOSAGTCT GTGGCTTTCC CTGQCTGKSTT CATOGCBSTC AGCTCTG&AíG OAGGCTGTCC TCTCATCCfT ACCCAAG&AC TOQGGAAAGC CÂACÃCTAÇT GÃ.CTTTGGGT TMCSATOCT GTTTTAÀ (SEQ ID NO; 12) 17 ΡΕ1105485

Sequência de aminoácidos de tamanho completo de IL-1 epsilon humano:

Tradução na grelha de leitura relevante (5' para 3'):

MEK&LKIDTP ORGSIQDIJSH HTO¥LQDQTL IAWR1GDRMS FVTIALISCR “HVETLBKD&Q MLCmCAKV-G DQPTLQUCEX DIMDLYKQFI

FVKSFLFYHS QSGRKSTFES VRFWStfFIAV SSBGGCPI*IL TQELGKftHTT DF0LTMLF* CSIQIDNOíB) A descoberta deste DNA codificador de IL-1 epsilon permite a construção de vectores de expressão compreendendo sequências de ácido nucleico codificadoras de polipeptideos IL-1 epsilon do invento; células hospedeiras transfectadas ou transformadas com os vectores de expressão; polipeptideos IL-1 epsilon humanos biologicamente activos e marcadores de peso molecular como proteínas isoladas e purificadas; e anticorpos imuno-reactivos com polipeptideos do invento.

Moléculas de Ácido Nucleico

Numa realização particular, o invento está relacionado com determinadas sequências nucleotídicas isoladas. Uma "sequência nucleotídica" refere-se a uma molécula polinucleotídica na forma de um fragmento separado ou como um componente de uma construção de ácido nucleico maior, que derivou de DNA ou RNA isolado pelo menos uma vez numa 18 ΡΕ1105485 forma substancialmente pura (i.e., livre de materiais endógenos contaminantes) e numa quantidade ou concentração que permite a identificação, manipulação e recuperação das suas sequências nucleotidicas componentes através de métodos bioquímicos convencionais (tais como os descritos em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Tais sequências são de preferência proporcionadas e/ou construídas na forma de uma grelha de leitura aberta, não interrompida por sequências internas não traduzidas, ou intrões, que estão tipicamente presentes em genes eucarióticos. As sequências de DNA não traduzidas podem estar presentes 5' ou 3' relativamente a uma grelha de leitura aberta, em que as mesmas não interferem com a manipulação ou expressão da região codificadora.

Sequências nucleotidicas particularmente preferidas do invento são SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:7 e SEQ ID N0:12, como descrito atrás. 0 invento ainda engloba fragmentos e oligonucleótidos isolados derivados das sequências nucleo-tídicas de SEQ ID N0:5, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID N0:12. As sequências de ácido nucleico dentro do âmbito do invento incluem sequências de DNA ou RNA isoladas que hibridam com as sequências nucleotidicas nativas aqui descritas em condições de restringência moderada ou elevada, e que codificam polipeptídeos ou seus fragmentos do invento. Estas sequências de DNA e RNA isoladas também incluem moléculas de DNA ou RNA de tamanho completo codificadores dos polipeptídeos de IL-1 epsilon. Sequências de ácido 19 ΡΕ1105485 nucleico ou nucleotídicas do invento devem ser entendidas como também codificando um polipeptídeo que activa a fosforilação de IKBa e MAP cinase como aqui descrito.

Tal como aqui usado, as condições de restrin-gência moderada, conforme é conhecido dos familiarizados com a matéria e como definido por Sambrook et al., Molecular Cloning: Ά Laboratory Manual,2nd ed. Vol. 1, ppl01-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), incluem a utilização de uma solução de pré-lavagem para os filtros de nitrocelulose de 5XSSC, 0,5% SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), condições de hibridação de 50% de formamida, 6X SSC a 42°C (ou outra solução de hibridação semelhante, como seja solução de Stark, em 50% de formamida a 42°C) e condições de lavagem de aproximadamente 60°C, 0,5X SSC, 0,1% SDS. As condições de elevada restringência são definidas como as condições de hibridação descritas e com lavagens a 68°C, 0,2X SSC, 0,1% SDS. Os familiarizados com a matéria reconhecerão que a temperatura e concentração salina da solução de lavagem podem ser ajustadas conforme necessário, de acordo com factores tais como o comprimento da sonda.

Devido à degenerescência conhecida do código genético, em que mais de um codão pode codificar o mesmo aminoácido, uma sequência de DNA pode diferir da apresentada em SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:12 e ainda codificar um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO:13, respec- 20 ΡΕ1105485 tivamente. Tais sequências de DNA variantes podem resultar de mutações silenciosas (e.g., ocorrendo durante a amplificação por PCR) ou pode ser o produto de mutagénese dirigida de uma sequência nativa.

O invento proporciona assim sequências de DNA isoladas equivalentes do invento, seleccionadas entre: (a) DNA derivado da região codificadora de um gene de mamífero nativo; (b) cDNA compreendendo a sequência de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 12; (c) DNA codificador dos polipeptídeos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 ou SQ ID NO: 13; (d) DNA capaz de hibridar com um DNA de (a) , (b) ou (c) em condições de restringência moderada e que codifica polipeptídeos do invento; e (e) DNA que é degenerado como resultado do código genético relativamente ao DNA definido em (a) , (b) , (c) ou (d) e que codifica polipeptídeos do invento. Certamente, polipeptídeos codificados por tais sequências de DNA equivalentes estão incluídos no invento. DNA que seja equivalente à sequência de DNA de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 12 hibridará em condições moderadamente restringentes com a sequência de DNA nativa de cadeia dupla que codifica polipeptídeos compreendendo sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO:13. Exemplos de polipeptídeos codificadas por tal DNA, incluem, mas não estão limitados aos fragmentos polipeptídicos e polipeptídeos compreendendo um ou mais locais de N-glicosilação inactivados, um ou mais 21 ΡΕ1105485 locais de processamento por protease inactivados ou uma ou mais substituições de aminoácidos conservadas, como descrito abaixo. Os polipeptideos codificados pelo DNA derivado de outras espécies de mamífero, em que o DNA hibridará com o complemento do DNA de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:12, estão igualmente incluídos.

Expressão A sequência de ácido nucleico codificadora dos polipeptideos do invento pode ser inserida em vectores de expressão recombinantes usando métodos bem conhecidos. Os vectores de expressão incluem uma sequência de DNA do invento operacionalmente ligada a sequências nucleotídicas reguladoras da transcrição ou tradução adequadas, tais como as derivadas de um gene de mamífero, microrganismo, vírus ou insecto. Exemplos de sequências reguladoras incluem promotores, operadores ou estimuladores da transcrição, um local de ligação do mRNA ao ribossoma e sequências adequadas que controlam a transcrição e iniciação e terminação da tradução. As sequências nucleotídicas estão "operacionalmente ligadas" quando a sequência reguladora está funcionalmente relacionada com a sequência de DNA do invento. Assim, uma sequência nucleotídica do promotor está operacionalmente ligada a uma sequência de DNA se a sequência nucleotídica do promotor controlar a transcrição da sequência de DNA do invento. A capacidade para replicar nas células hospedeiras pretendidas, geralmente conferida 22 ΡΕ1105485 por uma origem de replicação e um gene de selecção, através do qual os transformantes são identificados, podem ser ainda incorporados no vector de expressão.

Ainda, as sequências codificadoras dos peptídeos sinal adequados que não estejam naturalmente associados aos polipeptídeos do invento podem ser incorporados em vectores de expressão. Por exemplo, uma sequência de DNA para um peptideo sinal (líder de secreção) pode ser fundida em grelha com a sequência de nucleotídeos do invento de forma a que o polipeptídeo seja inicialmente traduzido como uma proteína de fusão compreendendo o peptideo sinal. Um peptí-deo sinal que é funcional nas células hospedeiras pretendidas aumenta a secreção extracelular do polipeptídeo. 0 peptideo sinal pode ser clivado do polipeptídeo quando da secreção do polipeptídeo pela célula. Células hospedeiras adequadas para a expressão de polipeptídeos do invento incluem procariotas, células de leveduras ou de eucariotas superiores. Os vectores de clonagem e expressão adequados para usar com células de bactérias, fungos, leveduras e mamíferos estão descritos, por exemplo, em Pouwels et al. Cloning Vectors: A laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985). Os sistemas de tradução acelulares podem ser igualmente empregues para produzir polipeptídeos do invento usando RNAs derivados das construções de DNA aqui descritas. ΡΕ1105485 23

Sistemas Procarióticos

Os procariotas incluem organismos gram negativos ou gram positivos. Células hospedeiras procarióticas adequadas para transformação incluem, por exemplo, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium e várias outras espécies dentro do género Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces e Staphylococcus. Numa célula hospedeira eucariótica, como seja Escherichia coli, um polipeptideo do invento pode incluir um resíduo de meti-onina N-terminal para facilitar a expressão do polipeptideo recombinante na célula hospedeira procariótica. A Met N-terminal pode ser clivada do polipeptídeos recombinante expresso.

Os vectores de expressão para usar em células hospedeiras eucarióticas também compreendem, de um modo geral, um ou mais genes de marcas fenotípicas seleccioná-veis. Um gene de uma marca seleccionável fenotípica é, por exemplo, um gene codificador de uma proteína que confere resistência a antibióticos ou que proporciona uma necessidade autotrófica. Exemplos de vectores de expressão úteis para as células hospedeiras procarióticas incluem os derivados de plasmídeos comercializados, tais como o vector de clonagem pBR322 (ATCC 37017). pBR322 contem genes para a resistência a ampicilina e tetraciclina e assim proporciona um meio simples para a identificação das células transformadas. Para construir um vector de expressão usando pBR322, um promotor adequado e uma sequência de DNA do invento - 24 - ΡΕ1105485 inserida no vector pBR322. Outros vectores comercializados incluem, por exemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) e pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA) . Outros vectores comercializados incluem os que são especificamente projectados para a expressão de proteínas; estes incluirão os vectores pMAL-p2 e pMAL-c2 que são usados para a expressão de proteínas fundidas com a proteína de ligação à maltose (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) .

As sequências do promotor normalmente usadas para os vectores de expressão de células hospedeiras procarióti-cas recombinantes incluem β-lactamase (penicilinase) , sistema do promotor da lactose (Chang et al., Nature 275:615, 1978; e Goeddel et al. , Nature 281:544, 1979), sistema promotor do triptofano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; e EP-A-36776) e o promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Um sistema de expressão de células hospedeiras procarióticas particularmente útil emprega um promotor do fago XPL e uma sequência de repressor termo-sensível cl857ts. Os vectores plasmídi-cos adequados derivados da American Type Culture Collec-tion, que inclui derivados do promotor ÀPL, incluem o plasmídeo pHUB2 (residente em E. coli estirpe JMB9 (ATCC 37092)) e pPLc28 (residente em E. coli RR1 (ATCC 53082)). O DNA do invento pode ser clonado em grelha no local de clonagem múltipla de um vector de expressão 25 ΡΕ1105485 bacteriano comum. Idealmente, o vector contem um promotor que pode ser introduzido a montante do local de clonagem, de forma que a adição de um indutor conduza à produção de um elevado nível da proteína recombinante quando o investigador o pretenda. Para algumas proteínas, os níveis de expressão podem ser reforçados através da incorporação de codões codificadores de uma parceiro de fusão (tais como hexa-histidina) entre o promotor e o gene com interesse.

Para a expressão da proteína recombinante, as células bacterianas são propagadas no meio de crescimento até atingir uma densidade óptica predeterminada. A expressão da proteína recombinante é então induzida, e.g., através da adição de IPTG (isopropil-b-D-tiogalacotipira-nósido), o qual activa a expressão de proteínas a partir de plasmídeos contendo um operador/promotor lac. Após indução (tipicamente durante 1-4 horas), as células são colhidas através da sedimentação numa centrífuga, e.g. a 5000 xg, durante 20 minutos a 4°C.

Para recuperação da proteína expressa, as células sedimentadas podem ser ressuspensas em dez volumes de Tris-HC1 50 mM (pH 8)/NaCl 1M e depois passadas duas a três vezes através de uma prensa Francesa. A maior parte das proteínas recombinantes expressas formam agregados insolúveis conhecidas como corpos de inclusão. Os corpos de inclusão podem ser purificados a partir de proteínas solúveis através da sedimentação numa centrífuga a 5000 xg, durante 20 minutos, 4°C. 0 sedimento de corpos de inclusão 26 ΡΕ1105485 é lavado com Tris-HCl 50 mM (pH 8)/l% Triton X-100 e depois dissolvido em Tris-HCl 50 mM (pH 8) ureia 8M/DTT 0,1M. Qualquer material que não possa ser dissolvido é removido por centrifugação (10000 xg durante 20 minutos, 20°C). A proteína com interesse será, na maior parte dos casos, a proteína mais abundante no sobrenadante resultante clarificado. Esta proteína pode ser "re-enrolada" na conformação activa através de diálise contra Tris-HCl 50 mM (pH 8)/ CaCl2 5 mM/ Zn(Oac) 5 mM/GSSG 1 mM/GSH 0,1 mM. Após re-enrolamento, a purificação pode ser realizada através de uma variedade de métodos cromatográficos tais como permuta iónica ou filtração em gel. Nalguns protocolos, a purificação inicial pode ser realizada antes do re-enrolamento. Como exemplo, as proteínas de fusão marcadas com hexa-histidina podem ser parcialmente purificadas em níquel imobilizado.

Se bem que o processo de purificação e re-enrolamento referido atrás assuma que a proteína será melhor recuperada a partir de corpos de inclusão, os familiarizados com a área da purificação de proteínas apreciarão que muitas proteínas recombinantes são melhor purificadas a partir da fracção solúvel dos lisados celulares. Nestes casos, o re-enrolamento muitas vezes não é necessário e a purificação por métodos cromatográficos convencionais pode ser realizada directamente.

Sistemas de Leveduras 27 ΡΕ1105485

Em alternativa, os polipeptídeos do invento podem ser expressos em células hospedeiras de leveduras, de preferência no género Saccharomyces (e.g., S. cerevisiae). Outros géneros de levedura, tais como Pichia, K. lactis ou Kluyveromyces, podem ser igualmente empregues. Os vectores de levedura muitas vezes possuirão uma sequência da origem de replicação derivada do plasmídeo 2μ de levedura, uma sequência de replicação autónoma (ARS), uma região de promotor, sequências para poliadenilação, sequências para terminação da transcrição e um gene de uma marca seleccionável. Sequências de promotor adequadas para vectores de levedura incluem, entre outros, promotores da metalotioneina, 3-fosfoglicerato cinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) ou outras enzimas glico-líticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; e Holland et al. , Blochem. 17: 4900, 1978) como seja enolase, gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase, hexocinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutocinas, glucose-6-fosfato isomera-se, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato cinase, triosefosfato isomerase, fosfoglucose isomerase e glucocinase. Outros vectores e promotores adequados para usar na expressão em levedura são ainda descritos em Hitzeman, EPA-73657 ou em Fleer et al., Gene 107:285-195 (1991); e van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135-139 (1990). Uma outra alternativa é o promotor ADH2 reprimível por glucose descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) e Beier et al. (Nature 300:724, 1982). Os vectores vai-vem replicáveis em levedura e em E. coli podem ser construídos através da inserção de sequências de DNA derivadas de pBR322 para 28 ΡΕ1105485 selecçao e replicaçao em E. coli (gene Ampr e origem de replicação) nos vectores de levedura atrás descritos. A sequência líder do factor α de levedura pode ser empregue para dirigir a secreção de um polipeptídeo do invento. A sequência líder do factor α é muitas vezes inserida entre a sequência do promotor e a sequência do gene estrutural. Ver e.g., Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:5330, 1984; Patente U.S. 4546082; e EP324274. Outras sequências líder adequadas para facilitar a secreção dos polipeptídeos recombinantes a partir de leveduras hospedeiras são conhecidos dos familiarizados com a matéria. Uma sequência líder pode ser modificada perto do seu extremo 3' de forma a conter um ou mais locais de restrição. Isto facilitará a fusão da sequência líder com o gene estrutural.

Os protocolos de transformação de leveduras são conhecidos dos familiarizados com a matéria. Um desses protocolos está descrito por Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1929, 1978. O protocolo de Hinnen et al., selecciona os transformantes Trp+ num meio selectivo, em que o meio selectivo consiste em 0,67% de base azotada de levedura, 0,5% de casaminoácidos, 2% de glucose, 10 μg/ml de adenina e 20 μg/ml de uracilo.

As células hospedeiras de levedura transformadas pelos vectores contendo a sequência do promotor de ADH2 podem ser crescidas para indução da expressão num meio 29 ΡΕ1105485 "rico". Um exemplo de um meio rico é aquele que consiste em 1% de extracto de levedura, 2% de peptona e 1% de glucose suplementado com 80 μρ/ιηΐ de adenina e 80 μρ/ιηΐ de uracilo. A desrepressão do promotor ADH2 ocorre quando a glucose é esgotada no meio.

Sistemas de Mamíferos e de Insectos

Como alternativa, podem ser empregues sistemas de culturas de células hospedeiras de mamífero ou de insectos para expressar polipeptídeos recombinantes do invento. Os sistemas de baculovírus para a produção de proteínas heterólogas em células de insecto estão revistos por Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Podem ser igualmente empregues linhas celulares estabelecidas com origem em mamíferos. Exemplos de linhas celulares hospedeiras de mamífero adequadas incluem a linha COS-7 de células de rim de macaco (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa e linhas celulares BHK (ATCC CRL 10) e a linha celular CV-l/EBNA-1 (ATCC CRL 10478) derivada da linha celular de rim de macaco verde africano CVI (ATCC CCL 70) como descrito por McMahan et al. (EMBO J. 10:2821, 1991).

Os métodos estabelecidos para a introdução de DNA em células de mamífero foram já descritos (Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69). 30 ΡΕ1105485

Protocolos adicionais usando reagentes comerciais, tais como Lipofectamina (Gibco/BRL) ou Lipofectamine-Plus, podem ser usados para transfectar células (Felgner et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 84: 7413-7417, 1987). Ainda, a electroporação pode ser usada para transfectar células de mamífero usando procedimentos convencionais, tais como os descritos em Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. A selecção de transformantes estáveis pode ser realizada usando métodos conhecidos, como sejam, por exemplo, resistência a fármacos citotóxicos. Kaufman et al., Meth. In Enzymollogy 185:487-511, 1990, descrevem vários esquemas de selecção, tais como resistência a di-hidrofolato reductase (DHFR). Uma estirpe hospedeira adequada para a selecção por DHFR pode ser CHO estirpe DX-B11, que é deficiente em DHFR (Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220, 1980). Um plasmídeo expressando o cDNA de DHFR pode ser introduzido na estirpe DX-B11 e apenas as células que contêm o plasmídeo podem crescer no meio selectivo adequado. Outros exemplos de marcas seleccionáveis que podem ser incorporadas num vector de expressão incluem cDNAs que conferem resistência a antibióticos, tais como G418 e higromicina B. As células portadoras do vector podem ser seleccionadas com base na resistência a estes compostos.

As sequências de controlo da transcrição e da tradução para os vectores de expressão de células hospedeiras de mamífero podem ser retiradas de genomas 31 ΡΕ1105485 virais. Sequências de promotores e de estimuladores normalmente usadas são derivadas do vírus polioma, adenovírus 2, vírus símio 40 (SV40) e citomegalovírus. As sequências de DNA derivadas do genoma virai de SV40, por exemplo, origem de SV40, promotor precoce e tardio, estimulador, locais de "splicing" e poliadenilação podem ser usados para proporcionar outros elementos genéticos para a expressão de uma sequência de um gene estrutural numa célula hospedeira de mamífero. Promotores virais precoces e tardios são particularmente úteis devido a serem facilmente obtidos a partir de um genoma virai como um fragmento, o qual pode também conter uma origem de replicação virai (Fiers et al., Nature 273:113, 1978;

Kaufman, Meth. In Enzymology, 1990). Fragmentos de SV40 menores ou maiores podem também ser usados, desde que

esteja incluída a sequência de aproximadamente 250 pb que se estende desde o local Hind III até ao local Bgl I situado na origem de replicação virai do SV40.

Sequências de controlo adicionais que demonstraram melhorar a expressão de genes heterólogos a partir de vectores de expressão de mamífero incluem elementos tais como o elemento da sequência que aumenta a expressão (EASE) derivado de células CHO (Morris et al., Animal Cell Technology, 1997, pp. 529-534) e o líder tripartido (TPL) e os RNAs do gene VA do Adenovírus 2 (Gingeras et al., J. Biol. Chem. 257:13475-13491, 1982). As sequências internas de entrada no ribossoma (IRES) de origem virai permite que mRNAs dicistrónicos sejam 32 ΡΕ1105485 traduzidos eficientemente (Oh and Sarnow, Current Opinion in Genetics and Development 3:295-300, 1993; Ramesh et al., Nucleic Acids Research 24:2697-2700, 1996). A expressão de um cDNA heterólogo como parte de um mRNA dicistrónico seguido do gene para uma marca seleccionável (e.g. DHFR) mostrou-se melhorar a transfectabilidade do hospedeiro e expressão do cDNA heterólogo (Kaufman, Meth. In Enzymology, 1990). Exemplos de vectores de expressão que empregam mRNAs bicistrónicos são pTR-DC/GFP descritos por Mosser et al., Biotechniques 22:150-161, 1997 e p2A5l descrito por Morris et al., Animal Cell Technology, 1997, pp. 529-534.

Um vector de expressão elevada útil, pCAVNOT, foi descrito por Mosley et al., Cell 59:335-348, 1989. Outros vectores de expressão para usar em células hospedeiras de mamífero podem ser construídos como descrito por Okayama and Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Um sistema útil para a expressão estável de elevado nível de cDNAs de mamífero em células epiteliais mamárias murinas C127 pode ser construído substancialmente como descrito por Cosman et al. {Mol. Immunol. 23:935, 1986). Um vector de expressão elevada útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman et al., Nature 312:768, 1984, foi depositado como ATCC 39890. Vectores de expressão de mamífero úteis estão descritos em EP-A-0367566 e no Pedido de Patente U.S. N° de Série 07/701415, entregue em 16 de Maio, 1991, aqui incluído como referência. Os vectores podem derivar de retrovírus. Em lugar da sequência sinal nativa, pode ser adicionada uma sequência sinal heteróloga, como seja a sequência sinal de 33 ΡΕ1105485 IL-7 descrita em Patente dos Estados Unidos 4965195; a sequência sinal para o receptor IL-2 descrito em Cosman et al., Nature 312:768 (1984); o peptídeo sinal de IL-4 descrito em EP 367566; o peptídeo sinal do receptor de IL-1 tipo I descrito em Patente US 4968607; e o peptídeo sinal do receptor de IL-1 tipo II descrito em EP 460846.

Um outro vector de expressão útil, pFLAG, pode ser usado. A tecnologia FLAG é centrada na fusão de uma marca peptídica FLAG de baixo peso molecular (1KD), hidrofílica com o extremo N de uma proteína recombinante expressa pelo vector de expressão pFLAG-Ι™ (adquirido a IBI Kodak).

Polipeptídeos do Invento

Conforme referido abaixo, o presente invento também inclui polipeptídeos isolados e purificados. Como aqui é usado, os "polipeptídeos" do invento referem-se a um género de polipeptídeos que ainda incluem proteínas tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO:13, assim como as proteínas tendo um elevado grau de semelhança (pelo menos 90% de homologia) com sequências de aminoácidos e proteínas essas que são biologicamente activas. Ainda, os polipeptídeos do invento referem-se aos produtos de genes dos nucleótidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:12. ΡΕ1105485 34

Isolamento e Purificação 0 termo "isolado e purificado" como aqui é usado, significa que os polipeptídeos ou fragmentos do invento estão esencialmente livres de associação com outras proteínas ou polipeptídeos, por exemplo, como um produto de purificação de cultura de células hospedeiras recombinantes ou como um produto purificado a partir de uma fonte não recombinante. 0 termo "substancialmente purificado" como aqui é usado, refere-se a uma mistura que contem polipeptídeos ou fragmentos do invento e está essencialmente livre de associação com outras proteínas ou polipeptídeos, exceptuando a presença de proteínas conhecidas que podem ser removidas usando um anticorpo específico e esses polipeptídeos ou seus fragmentos substancialmente purificados podem ser usados como marcadores de pesos moleculares. O termo "purificado" refere-se à forma "isolada e purificada" dos polipeptídeos do invento ou forma "substancialmente purificada" dos polipeptídeos do invento, uma vez que ambos são aqui descritos.

Um polipeptídeo isolado e purificado de acordo com o invento pode ser produzido através de sistemas de expressão recombinantes como descrito atrás ou purificado a partir de células naturais.

Numa realização preferida, a expressão de polipeptídeos recombinantes IL-1 epsilon pode ser conseguida utilizando fusões de sequências codificadoras de dos 35 ΡΕ1105485 polipeptídeos IL-1 epsilon com sequências codificadoras de um outro polipeptídeo para ajudar na purificação de polipeptídeos do invento. Um exemplo de tal fusão é uma fusão de sequências codificadoras de um polipeptídeo IL-1 epsilon com sequências codificadores do produto do qene malE do vector pMAL-c2 de New Enqland Biolabs, Inc. Tal fusão permite, a purificação por afinidade da proteína de fusão, assim como a separação da porção da proteína de ligação a maltose da proteína de fusão do polipeptídeo do invento após purificação. A inserção de DNA codificador do polipeptídeo IL-1 epsilon no vector pMAL-c2 pode ser conseguida numa variedade de formas usando técnicas de biologia molecular conhecidas. A construção preferida da inserção contem um codão de terminação adjacente ao codão do extremo carboxilo do polipeptídeo do invento. Ainda, a construção preferida da inserção resulta na fusão do extremo amina do polipeptídeo do invento directamente ao extremo carboxilo do local de clivagem do Factor Xa no vector pMAL-c2. Um fragmento de DNA pode ser gerado por PCR usando DNA do invento como DNA matriz e duas sequências oligonucleo-tídicas. A utilização das sequências iniciadoras oligonu-cleotídicas gera um fragmento de DNA de extremos cerses que pode ser isolado por meios convencionais. Este produto de PCR pode ser ligado a pMAL-p2 (digerido com a endonuclease de restrição XmnI) usando meios convencionais. Os clones positivos podem ser identificados por meios convencionais. A indução de expressão e purificação da proteína de fusão 36 ΡΕ1105485 pode ser realizada de acordo com as instruções do fabricante e como descrito atrás. Esta construção facilita uma separação precisa do polipeptídeo do invento da proteína de ligação a maltose fundida, utilizando um tratamento simples com protease de acordo com as instruções do fabricante. Desta forma, pode ser obtido o polipeptídeo IL-1 epsilon purificado. Ainda, tal vector construído pode ser facilmente modificado usando técnicas conhecidas de biologia molecular para gerar proteínas de fusão adicionais. Deve-se entender, certamente, que podem ser usados muitos vectores e técnicas diferentes, como referido atrás, para a expressão e purificação de polipeptídeos do invento e que esta realização de forma alguma limita o âmbito do invento. A proteína recombinante produzida em cultura bacteriana é geralmente isolada através de disrupção inicial das células hospedeiras por qualquer método conveniente (incluindo ciclos alternados de congelação e descongelação, sonicação, disrupção mecânica ou utilização de agentes de lise celular), centrifugação, extracção dos sedimentos celulares se for um polipeptídeo insolúvel ou a partir do fluido sobrenadante se o polipeptídeo for solúvel, seguido de um ou mais passos seleccionados entre concentração, remoção de sal, permuta iónica, purificação por afinidade ou cromatografia de exclusão por tamanho. Como é do conhecimento dos familiarizados com a matéria, os procedimentos para a purificação de uma proteína recombinante variará de acordo com factores tais como tipo de células hospedeiras empregues e se a proteína recombinante 37 ΡΕ1105485 é ou não secretada para o meio de cultura. Por exemplo, quando são empregues sistemas de expressão que secretam a proteína recombinante, o meio de cultura pode ser primeiro concentrado usando um filtro comercial para concentração de proteína, por exemplo uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Após o passo de concentração, o concentrado pode ser aplicado numa matriz de purificação, como seja um meio de filtração em gel. Como alternativa, pode ser empregue uma resina de permuta aniónica, por exemplo uma matriz ou substrato tendo grupos dietilami-noetilo (DEAE) pendentes. As matrizes podem ser acrilamida, agarose, dextrano, celulose ou outros tipos normalmente empregues na purificação de proteína. Como alternativa, pode ser empregue um passo de permuta catiónica. Permuta-dores de catiões adequados incluem várias matrizes insolúveis compreendendo grupos sulfopropilo ou carboximetilo. São preferidos os grupos sulfopropilo. Finalmente, um ou mais passos de cromatografia líquida de alta resolução em fase reversa (RP-HPLC) empregando meios de RP-HPLC hidrofóbicos, (e.g. gel de sílica tendo grupos metilo ou outros alifáticos pendentes) podem ser empregues para purificar os polipeptídeos. Alguns ou a totalidade dos passos de purificação referidos, em várias combinações, são bem conhecidos e podem ser empregues para proporcionar proteína recombinante isolada e purificada. É igualmente possível utilizar uma coluna de afinidade compreendendo uma proteína de ligação a polipeptídeos do invento, como seja um anticorpo monoclonal 38 ΡΕ1105485 gerado contra polipeptídeos do invento, para purificar por afinidade os polipeptideos expressos. Estes polipeptideos podem ser removidos de uma coluna de afinidade usando técnicas convencionais, e.g., num tampão de eluição de concentração salina elevada e depois dialisado contra um tampão de concentração salina mais baixa a usar ou através da alteração do pH ou outros componentes dependendo da matriz de afinidade usada.

Neste aspecto do invento, proteínas de ligação a peptídeos, tais como os anticorpos anti-polipeptídeos do invento ou outras proteínas que podem interagir com o polipeptídeo do invento, podem ser ligadas a um suporte de fase sólida como seja uma matriz de cromatografia em coluna ou um substrato semelhante para identificação, separação ou purificação de células que expressam polipeptídeos do invento na sua superfície. A aderência de proteínas de ligação a polipeptídeos do invento a uma superfície de fase sólida pode ser conseguida por vários meios, por exemplo microsferas podem ser revestidas com estas proteínas de ligação a polipeptídeos e mantidas no vaso de incubação através de um campo magnético. As suspensões de misturas celulares são colocadas em contacto com a fase sólida que tem na sua superfície tais proteínas de ligação a polipeptídeos. As células tendo polipeptídeos do invento na sua superfície ligam-se à proteína de ligação a polipeptídeos fixada e as células não ligadas são então removidas por lavagem. Este método de ligação por afinidade é útil para a purificação, rastreio ou separação de tais células 39 ΡΕ1105485 expressando o polipeptídeo a partir da solução. Os métodos de obtenção de células seleccionadas positivamente a partir da fase sólida são conhecidos na área e incluem, por exemplo, a utilização de enzimas. Tais enzimas são, de preferência, não tóxicas e não prejudiciais para as células e são de preferência dirigidas para a clivagem do elemento de ligação à superfície celular.

Como alternativa, as misturas de células suspeitas de conterem células que expressam polipeptídeos do invento podem ser primeiro incubadas com uma proteína biotinilada de ligação ao polipeptídeo do invento. Os períodos de incubação têm tipicamente pelo menos uma hora de duração para assegurar suficiente ligação aos poli-peptídeos do invento. A mistura resultante é então passada através de uma coluna de esferas revestidas com avidina, pelo que a elevada afinidade da biotina pela avidina proporciona a ligação às esferas das células que se ligam ao polipeptídeo. A utilização de esferas revestidas com avidina é conhecida na área. Ver Berenson, et al., J. Cell Biochem., 10D:239 (1986). A lavagem de material não ligado e a libertação das células ligadas são efectuadas usando métodos covencionais.

Nos métodos descritos abaixo, proteínas de ligação a polipeptídeos adequadas são anticorpos anti-polipeptídeos e outras proteínas que são capazes de ligação de elevada afinidade aos polipeptídeos do invento. Uma 40 ΡΕ1105485 proteína de ligaçao a polipeptídeos preferida é um anticorpo monoclonal anti-polipeptídeo.

Numa realização preferida, as células hospedeiras de levedura transformadas são empregues para expressar polipeptídeos do invento como um polipeptídeo secretado de forma a simplificar a purificação. O polipeptídeo recombinante secretado a partir da fermentação das células hospedeiras de levedura pode ser purificado por métodos análogos aos descritos por Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171, 1984) (relacionados com a utilização de dois passos sequenciados de HPLC de fase reversa para purificação).

Variantes 0 invento também inclui variantes dos poli-peptídeos do invento. Um polipeptídeo "variante" como aqui é referido significa um polipeptídeo substancialmente homólogo aos polipeptídeos nativos do invento, mas que tem uma sequência de aminoácidos diferente dos polipeptídeos nativos (humano, murino ou outra espécie de mamífero) do invento devido a uma ou mais deleções, inserções ou substituições. A sequência de aminoácidos variante é pelo menos 95% idêntica, pelo menos 98% idêntica, pelo menos 99% idêntica ou pelo menos 99,9% idêntica ao polipeptídeo preferido ou é codificada por uma das sequências de ácido nucleico do invento como anteriormente definido. A percentagem de identidade pode ser determinada, por 41 ΡΕ1105485 exemplo, através da comparação da informação de sequências usando o programa de computador GAP, versão 6.0 descrita por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) e disponível no University of Wisconsine Genetics Computer Group (UWGCG) . O programa GAP utiliza o método de alinhamento de Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), conforme revisto por Smith and Waterman (Adv. Appl. Math 2:482, 1981). Os parâmetros por defeito preferidos para o programa GAP incluem: (1) uma matriz de comparação binária (contendo um valor de 1 para as identidades e 0 para as não identidades) para nucleótidos e a matriz de comparação pesada de Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, como descrito por Schwartz and Dahoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.353-358, 1979; (2) uma penalização de 3,0 para cada intervalo e uma penalização adicional de 0,10 para cada símbolo em cada intervalo; e (3) sem penalização para os intervalos terminais.

As variantes podem compreender sequências substituídas de forma conservada, significando que um determinado resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo tendo características fisicoquímicas semelhantes. Exemplos de substituições conservadas incluem substituição de um resíduo alifático por um outro, como seja Ile, Vai, Leu ou Ala por um outro, ou substituições de um resíduo polar por um outro, como seja entre Lis e Arg; Glu e Asp; ou Gin e Asn. Outras dessas substituições conservadas, por exemplo substituições da totalidade das regiões tendo 42 ΡΕ1105485 características de hidrofobicidade semelhante, são bem conhecidas. As variantes naturais estão também incluídas no invento. São exemplos de tais variantes proteínas que resultam de casos de "splicing" alternativo, clivagem proteolítica dos polipeptídeos IL-1 epsilon ou transcrição/tradução de diferentes alelos. As variações atribuíveis a proteólise incluem, por exemplo, diferenças no extremo N ou C quando da expressão em diferentes tipos de células hospedeiras, devido a remoção proteolítica de um ou mais aminoácidos terminais dos polipeptídeos (de um modo geral entre 1 e 5 aminoácidos terminais) do invento.

Oligómeros

Os polipeptídeos do invento podem também existir como oligómeros, tais como dímeros ou trímeros ligados covalentemente ou não covalentemente. Os oligómeros podem ser ligados por ligações dissulfureto entre os resíduos de cisteína em diferentes polipeptídeos.

Numa realização do invento, um dímero de poli-peptídeo é criado através da fusão de polipeptídeos do invento da região Fc de um anticorpo (e.g., IgGl) de forma que não interfere com a actividade biológica destes polipeptídeos. A região Fc de preferência é fundida com o extremo C de um polipeptídeo solúvel do invento, para formar uma fusão Fc ou um polipeptídeo Fc. Os termos "proteína de fusão Fc" ou "polipeptídeos Fc" como aqui usado inclui formas nativas e muteínas, assim como 43 ΡΕ1105485 polipeptídeos Fc truncados contendo a região de charneira que promove a dimerização. Exemplos de métodos de preparação de polipeptídeos Fc descritos atrás estão descritos nas Patentes U.S. 5426048 e 5783672, ambas aqui incluídas como referência. A preparação geral de proteínas de fusão compreendendo polipeptídeos heterólogos fundidos com várias porções de polipeptídeos derivados de anticorpos (incluindo o domínio Fc) foi descrita, e.g., por Ashkenazi et al. (PNAS USA 88:10535, 1991) e Byrn et al. (Nature 344:677, 1990), aqui incluído como referência. Uma fusão de genes codificadora da proteína de fusão polipeptídeo:Fc do invento é inserida num vector de expressão adequado. As proteínas de fusão polipeptídeo:Fc são montadas à semelhança das moléculas de anticorpos, pelo que as ligações dissulfureto intercadeias formam-se entre os polipeptídeos Fc, dando polipeptídeos divalentes do invento. Se as proteínas de fusão forem preparadas como cadeias pesada e leve de um anticorpo, é possível formar um oligómero polipeptídico com quatro regiões polipeptídicas extracelulares. Como alternativa, pode-se ligar dois domínios polipeptídicos solúveis com um agente de ligação peptídico.

Alterações

Conforme referido atrás, o polipeptídeos isolados e purificados invento e seus proporciona fragmentos, 44 ΡΕ1105485 tanto recombinantes como não recombinantes. Variantes e derivados de polipeptideos nativos podem ser obtidos por mutações de sequências nucleotidicas codificadoras de polipeptideos nativos. As alterações da sequência de aminoácidos nativa podem ser conseguidas por qualquer um de uma série de métodos convencionais. As mutações podem ser introduzidas em loci particulares através da síntese de oligonucleótidos contendo uma sequência mutante, flanqueada por locais de restrição permitindo a ligação a fragmentos da sequência nativa. Após ligação, a sequência reconstruída resultante codifica um análogo tendo a inserção, substituição ou deleção de aminoácidos pretendida.

Como alternativa, os procedimentos de mutagénese dirigida com oligonucleótidos podem ser empregues para proporcionar um gene alterado em que codões predeterminados podem ser alterados por substituição, deleção ou inserção. Exemplos de métodos de preparação das alterações referidas atrás estão descritas por Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principies and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987); e Patentes U.S. Nos. 4518584 e 4737462, todas aqui incluídas como referência.

Os polipeptideos do invento podem também ser modificados para criar derivados de polipeptideos através 45 ΡΕ1105485 da formação de conjugados covalentes ou agregados com outras entidades químicas, tais como grupos glicosilo, grupos de polietilenoglicol (PEG), lípidos, fosfato, grupos acetilo e similares. Os derivados covalentes de polipeptídeos do invento podem ser preparados através da ligação das entidades químicas a grupos funcionais nas cadeias laterais dos aminoácidos dos polipeptídeos ou no extremo N ou extremo C de um polipeptídeo do invento ou seu domínio extracelular. Outros derivados dos polipeptídeos dentro do âmbito deste invento incluem conjugados covalentes ou de agregados destes polipeptídeos ou fragmentos peptídicos com outras proteínas ou polipeptídeos, como seja por síntese em cultura recombinante como fusões do extremo N ou C. Por exemplo, o conjugado pode compreender uma sequência de polipetídeo sinal ou líder (e.g. o líder do factor α de Saccharomyces) no extremo N de um polipeptídeo do invento. 0 peptídeo sinal ou líder por cotradução ou pós-tradução dirige a transferência do conjugado do seu local de síntese para um local dentro ou fora da membrana celular ou parede celular.

Os conjugados polipeptídicos podem também compreender peptídeos adicionados para facilitar a purificação e identificação de polipeptídeos do invento. Tais peptídeos incluem, por exemplo, poli-His ou os peptídeos de identificação antigénica descritos na Patente U.S. N° 5011912 e em Hopp et ai., Bio/Technology 6:1204, 1988. O invento ainda inclui polipeptídeos do invento 46 ΡΕ1105485 com ou sem o padrão de glicosilação nativo associado. Os polipeptideos expressos em sistemas de expressão de levedura ou de mamifero (e.g., células COS-1 ou C0S-7) podem ser semelhantes ou significativamente diferentes de um polipeptideos nativo relativamente ao peso molecular e ao padrão de glicosilação, dependendo da escolha do sistema de expressão. A expressão dos polipeptideos do invento em sistemas de expressão bacterianos, tais como E. coli, proporciona moléculas não glicosiladas. Os grupos glicosilo podem ser removidos através de métodos convencionais, em particular os que utilizam glicopeptidase. Em geral, os polipeptideos glicosilados do invento podem ser incubados com um excesso molar de glicopeptidase (Boehringer Mannheim).

Assim, construções de DNA equivalentes que codificam várias adições ou substituições de resíduos ou sequências de aminoácidos ou deleções de resíduos ou sequências terminais ou internas estão incluídos no invento. Por exemplo, os locais de N-glicosilação no domínio extracelular do polipeptídeos podem ser modificados para evitar a glicosilação, permitindo a expressão de um análogo com menos açúcares em sistemas de expressão de mamífero e de levedura. Os locais de N-glicosilação em polipeptídeos eucarióticos são caracterizados por um tripleto de aminoácidos Asn-X-Y, em que X é qualquer aminoácido excepto Pro e Y é Ser ou Tre. Substituições, adições ou deleções adequadas da sequência nucleotídica codificadora destes tripletos resultará no impedimento da ligação dos resíduos 47 ΡΕ1105485 de açúcar à cadeia lateral de Asn. A alteração de um único nucleótido, escolhido de forma a que Asn seja substituída por um aminoácido diferente, por exemplo, é suficiente para inactivar um local de N-glicosilação. Processos conhecidos para inactivação dos locais de N-glicosilação em proteínas incluem os descritos na Patente U.S. 5071972 e EP 276846, aqui incluído como referência.

Num outro exemplo, as sequências codificadoras dos resíduos Cis que não são essenciais para a actividade biológica podem ser alteradas para fazer com que os resíduos Cis sejam eliminados ou substituídos por outros aminoácidos, evitando a formação de pontes dissulfureto intramoleculares incorrectas quando da renaturação. Outros equivalentes são preparados através da modificação de resíduos de aminoácidos dibásicos adjacentes para aumentar a expressão em sistemas de levedura em que está presente a actividade de KEX2. EP 212914 descreve a utilização de mutagénese dirigida para inactivar os locais de processamento da protease KEX2. Os locais de processamento pela protease KEX2 são inactivados por deleção, adição ou substituição de resíduos para alterar os pares Arg-Arg, Arg-Lis e Lis-Arg de forma a eliminar a ocorrência destes resíduos básicos adjacentes. Os pares Lis-Lis são consideravelmente menos susceptíveis à clivagem por KEX2 e conversão de Arg-Lis ou Lis-Arg para Lis-Lis representa uma abordagem conservada e preferida para inactivação dos locais KEX2. ΡΕ1105485 48

Fragmentos e Suas Utilizações

Ainda num outro aspecto do invento, os poli-peptídeos do invento podem ser sujeitos a fragmentação em peptideos por meios químicos e enzimáticos. Os fragmentos assim produzidos podem ser usados numa variedade de fins, incluindo marcadores de pesos moleculares e marcadores de pontos isoeléctricos. Os polipeptídeos e fragmentos peptídicos podem também ser usados para análise do grau de fragmentação. Assim, o invento inclui também estes polipeptídeos e fragmentos peptídicos, assim como estojos ("kits") para ajudar na determinação do peso molecular aparente e ponto isoeléctrico de uma proteína numa amostra e estojos ("kits") para avaliar o grau de fragmentação de uma proteína numa amostra.

Se bem que todos os métodos de fragmentação estejam incluídos no invento, a fragmentação química é uma realização preferida e inclui a utilização de brometo de cianogénio para clivar em condições neutras ou ácidas, de forma que ocorra clivagem específica nos resíduos de metionina (E. Gross, Methods in Enz. 11:238-255, 1967). Isto pode ainda incluir passos adicionais, tais como um passo de carboximetilação para converter resíduos de cisteína numa espécie não reactiva. A fragmentação enzimática é uma outra realização preferida e inclui a utilização de uma protease como seja Asparaginilendo-peptidase, Arginilendo-peptidase, protease 49 ΡΕ1105485 de Achromobacter I, Tripsina, protease V8 de Staphylococcus aureus, Endoproteinase Asp-N ou Endoproteinase Lis-C em condições convencionais para resultar em clivagem em res-duos de aminoácidos específicos. A asparaginilendo-pepti-dase pode clivar especificamente no lado carboxilo dos resíduos de asparagina presente nos polipeptídeos do invento. A arginilendo-peptidase pode clivar especifi-camente no local carboxilo dos resíduos arginina presentes dentro destes polipeptídeos. A protease I de Achromobacter pode clivar especificamente no lado carboxilo dos resíduos lisina presentes dentro dos polipeptídeos (Sakiyama and Nakat, Patente U.S. No. 5248599; T. Masaki et al., Biochim. Biophys. Acta 660:44-50, 1981; T. Masaki et al., Biochim. Biophys. Acta 660:51-55, 1981). A tripsina pode clivar especificamente no local carboxilo dos resíduos de arginina e lisina dentro dos polipeptídeos do invento. A fragmentação enzimática pode também ocorrer com uma protease que cliva em múltiplos resíduos de aminoácidos. Por exemplo, a protease V8 de Staphylococcus aureus pode clivar especifi-camente no lado carboxilo dos resíduos de ácid aspártico e glutâmico presentes dentro de polipeptídeos (D.W. Cleve-land, J. Biol. Chem. 3:1102-1106, 1977). A endoproteinase Asp-N pode clivar especificamente no lado amina dos resíduos de asparagina presentes dentro dos polipeptídeos. A endoproteinase Lis-C pode clivar especificamente no lado carboxilo dos resíduos de lisina dentro dos polipeptídeos do invento. Outros tratamentos enzimáticos e químicos podem igualmente ser usados para fragmentar especificamente estes polipeptídeos numa única série de peptídeos específicos. 50 ΡΕ1105485

Certamente, os peptídeos e fragmentos dos poli-peptídeos do invento podem também ser produzidos por processos recombinantes convencionais e processos sintéticos bem conhecidos na área. Relativamente a processos recombinantes, os polipeptídeos e fragmentos peptídicos incluídos no invento podem ter pesos moleculares variáveis, dependendo da célula hospedeira em que são expressos. A glicosilação dos polipeptídeos e fragmentos peptídicos do invento em vários tipos celulares pode resultar em variações do peso molecular destas espécies, dependendo do grau de modificação. O tamanho destes fragmentos pode ser mais heterogéneo com fragmentos peptídicos derivados da porção extracelular do polipeptídeo. Polipeptídeos e fragmentos peptídicos consistentes podem ser obtidos usando polipeptídeos derivados totalmente do domínio transmem-branar e regiões citoplasmáticas, pré-tratamento com N-glicanase para remover glicosilação ou expressão dos polipeptídeos em hospedeiros bacterianos. O peso molecular destes polipeptídeos pode também variar através da fusão de sequências peptídicas adicionais aos extremos amina e carboxilo dos polipeptídeos do invento. As fusões de sequências peptídicas adicionais nos extremos amina e carboxilo dos polipeptídeos do invento podem ser usadas para aumentar a expressão destes polipeptídeos ou ajudar na purificação da proteína. Ainda, fusões de sequências peptídicas adicionais nos extremos amina e carboxilo dos polipeptídeos do invento alterarão 51 ΡΕ1105485 alguns, mas geralmente não todos, os fragmentos peptídicos dos polipeptídeos gerados por tratamento enzimático ou químico. Certamente, as mutações podem ser introduzidas em polipeptídeos do invento usando técnicas de biologia molecular de rotina e conhecidas. Por exemplo, uma mutação pode ser projectada de forma a eliminar um local de clivagem proteolítica por uma enzima especifica ou num local de clivagem por um procedimento de fragmentação específico induzido quimicamente. A eliminação do local alterará a impressão digital de peptídeos dos polipeptídeos do invento quando da fragmentação com o processo específico, enzimático ou químico.

Devido à sequência de aminoácidos única de cada fragmento especificar um peso molecular, estes fragmentos podem assim servir como marcadores de peso molecular ao serem usadas técnicas de análise que têm como objectivo determinar o peso molecular de uma proteína, polipeptídeos ou seus fragmentos numa amostra. Os marcadores de peso molecular do invento servem particularmente bem como marcadores de pesos moleculares para o cálculo do peso molecular aparente de proteínas numa amostra que possuem pesos moleculares aparentes semelhantes e, consequentemente, permitir uma maior precisão na determinação do peso molecular aparente de proteínas.

Quando o invento está relacionado com o uso de marcadores de pesos moleculares de fragmentos peptídicos, os marcadores têm, de preferência, pelo menos 10 resíduos 52 ΡΕ1105485 de aminoácidos de tamanho. Mais de preferência, estes marcadores de pesos moleculares consistindo em fragmentos peptidicos têm entre 10 e 100 aminoácidos de tamanho. Ainda mais preferidos são os marcadores de pesos moleculares entre 10 e 50 resíduos de aminoácidos e especialmente entre 10 e 35 aminoácidos de tamanho. Mais preferidos são os marcadores de peso molecular consistindo em fragmentos peptidicos entre 10 e 20 aminoácidos de tamanho.

Entre os métodos para a determinação de peso molecular encontram-se sedimentação, electroforese em gel, cromatografia e espectrometria de massa. Uma realização particularmente preferida é a electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (U.K. Laemmli, Nature 227:680-685, 1970). Convencionalmente, os métodos utilizam duas pistas separadas de um gel contendo dodecilsulfato de sódio e uma concentração de acrilamida entre 6-20%. A capacidade para resolver simultaneamente a marca e a amostra, em condições idênticas, permite um aumento da precisão. Deve-se entender, certamente, que muitas técnicas diferentes podem ser usadas para a determinação do peso molecular de uma proteína numa amostra usando os polipeptídeos do invento, e que esta realização não limita de forma alguma o âmbito do invento.

Ainda, os polipeptídeos e fragmentos peptidicos do invento possuem características de carga única e portanto podem servir como marcadores específicos para 53 ΡΕ1105485 ajudar na determinação do ponto isoeléctrico de uma proteína, de polipeptídeos ou de fragmentos peptídicos numa amostra usando técnicas tais como focagem isoeléctrica. Estes marcadores polipeptídicos ou de fragmentos peptídicos servem particularmente bem no cálculo de pontos isoeléctri-cos de proteínas em amostras que possuem pontos isoeléctri-cos aparentes perto dos marcadores polipetídicos ou fragmentos peptídicos do invento. A técnica de focagem isoeléctrica pode ainda ser combinada com outras técnicas tais como electroforese em gel para separar simultaneamente uma proteína na base de peso molecular e carga. A capacidade para resolver simultaneamente estes marcadores polipeptídicos e fragmentos peptídicos e a proteína da amostra em condições idênticas permite uma maior precisão na determinação do ponto isoeléctrico da proteína na amostra. Isto é particularmente interessante em técnicas, tais como electroforese bidimensional (T.D. Brock and M.T. Madigan, Biology of Microorganisms 76-77 (Prentice Hall, 6th ed. 1991)), em que a natureza do processo dita que quaisquer marcadores deverão ser resolvidos simultaneamente com a proteína da amostra. Ainda, com tais métodos, estes polipeptídeos e fragmentos peptídicos podem ajudar na determinação do ponto isoeléctrico e peso molecular de uma proteína ou fragmento peptídico numa amostra.

Os polipeptídeos e fragmentos peptídicos podem ser visualizados usando dois métodos diferentes que 54 ΡΕ1105485 permitem uma discriminação entre a proteína da amostra e os marcadores de peso molecular. Numa realização, os marcadores de peso molecular polipeptídicos e fragmentos peptídicos do invento podem ser visualizados usando anticorpos gerados contra estas marcas e técnicas de imunotransferência convencionais. Esta detecção é realizada em condições convencionais que não resultam na detecção de proteína da amostra. Deve-se entender que poderá não ser possível gerar anticorpos contra todos os fragmentos polipeptídicos do invento, uma vez que pequenos peptídeos podem não conter epitopos imunogénicos. É ainda compreendido que nem todos os anticorpos funcionarão neste ensaio; no entanto, os anticorpos que sejam capazes de se ligar a polipetídeos e fragmentos do invento podem ser facilmente determinados usando técnicas convencionais. A proteína da amostra é também visualizada usando um procedimento de coloração convencional. 0 excesso molar de proteína da amostra relativamente aos marcadores de peso molecular polipeptídicos ou de fragmentos peptídicos do invento é tal que o procedimento de coloração convencional predominantemente detecta a proteína na amostra. 0 nível destes marcadores de peso molecular polipeptídicos ou de fragmentos peptídicos é tal que permite pouca ou nenhuma detecção destas marcas pelo método de coloração convencional. 0 excesso molar preferido da proteína na amostra relativamente aos marcadores de peso molecular polipeptídicos do invento é entre 2 e 100000 vezes. Mais de preferência, o excesso molar preferido da proteína na amostra 55 ΡΕ1105485 relativamente a estes marcadores de peso molecular poli-peptídicos é entre 10 e 100000 vezes e especialmente entre 100 e 1000 vezes.

Deve-se entender certamente que muitas técnicas podem ser usadas para a determinação e detecção de peso molecular e ponto isoeléctrico de uma proteína, poli-peptídeos ou fragmentos peptídicos numa amostra usando estes marcadores de peso molecular polipeptídicos e seus fragmentos peptidicos e que estas realizações não limitam de forma alguma o âmbito do invento.

Numa outra realização, a análise da fragmentação progressiva dos polipeptídeos do invento em peptídeos específicos (D.W. Cleveland et al. , J. Biol. Chem. 252:1102-1106, 1977), como seja através da alteração do tempo ou temperatura da reacção de fragmentação, pode ser usada como controlo do grau de clivagem de uma proteína numa amostra. Por exemplo, a clivagem da mesma quantidade de polipeptídeo e amostra proteica em condições idênticas pode permitir uma comparação directa do grau de fragmentação. As condições que resultam na fragmentação completa do polipeptídeo podem também resultar em fragmentação completa da proteína na amostra.

Relativamente ao uso específico dos polipeptídeos e fragmentos peptídicos do invento como marcadores de peso molecular, a fragmentação de um polipeptídeo preferido do invento com brometo de cianogénio gera uma série única de 56 ΡΕ1105485 marcadores de peso molecular de fragmentos peptídicos com pesos moleculares de aproximadamente 6933, 625 3 238 Daltons na ausência de glicosilação. Um fragmento adicional de 149 Daltons resulta ainda se a metionina iniciadora estiver presente. Clivagem de SEQ ID NO: 8 por brometo de cianogénio gera fragmentos tendo pesos moleculares de 149,2, 260,3, 2017,4, 3954,6, 4442,1 e 6932,7. A clivagem de SEQ ID NO:13 por brometo de cianogénio gera fragmentos tendo pesos moleculares de 149,2, 260,3, 2017,4, 3954,6, 4470,1 e 6932,7. A distribuição dos residuos de metionina determina o número de aminoácidos em cada peptídeo e a composição de aminoácidos única de cada peptídeo determina o seu peso molecular.

Ainda, os polipeptídeos isolados e purificados preferidos do invento (SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO:13) possuem pesos moleculares calculados de aproximadamente 7810 (7941 Daltons após a adição de uma metionina na posição 1), 17684 e 17712 Daltons, respectivamente, na ausência de glicosilação. Os pesos moleculares observados de polipeptídeos IL-1 conhecidos incluem 17, 25, 31, 33 e 35 KDa e assim proporcionam uma gama de pesos moleculares para usar nestas determinações.

Sempre que se usa uma proteína intacta, a utilização destes marcadores de peso molecular polipeptídicos aumentarem a precisão da determinação do peso molecular aparente de proteínas que tenham pesos moleculares aparentes perto de 7810, 17684 ou 17712 Daltons. Sempre que os 57 ΡΕ1105485 fragmentos forem usados, existe uma maior precisão na determinação de pesos moleculares na gama dos pesos moleculares do fragmento.

Finalmente, relativamente aos estojos ("kits") que estão incluídos no invento, os constituintes de tais estojos ("kits") podem variar, mas tipicamente contêm os marcadores de peso molecular polipeptídicos e de fragmentos peptídicos. Também, tais estojos ("kits") podem conter os polipeptídeos em que um local necessário para a fragmentação foi removido. Ainda, os estojos ("kits") podem conter reagentes para a clivagem específica do polipeptídeo e da proteína na amostra por clivagem química ou enzimática. Os estojos ("kits") podem ainda conter anticorpos dirigidos contra polipeptídeos ou seus fragmentos do invento.

Oligonucleótidos da Cadeia Codificadora e Complementares da Cadeia Codificadora

Ainda, numa outra realização do invento, oligonucleótidos da cadeia codificadora e complementares da cadeia codificadora compreendendo uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples (RNA ou DNA) capaz de se ligar a uma sequência de mRNA alvo (formação de um duplex) ou à sequência na hélice de DNA de cadeia dupla (formando uma tripla hélice) pode ser preparado de acordo com o invento. Os oligonucleótidos da cadeia codificadora e complementares da cadeia codificadora, de acordo com o presente invento, 58 ΡΕ1105485 compreendem um fragmento da região codificadora de cDNA (SEQ ID N0:5, SEQ ID NO:7 ou SEQ ID N0:12). Tal fragmento, de um modo geral, compreendem pelo menos cerca de 14 nucleótidos, de preferência entre cerca de 14 e cerca de 30 nucleótidos. A capacidade para criar um oligonucleótido da cadeia codificadora ou complementar da cadeia codificadora, baseado numa sequência de cDNA para uma determinada proteina está descrita, por exemplo, Stein and Cohen, Câncer Res., 48:2659, 1988 and van der Krol et al., BioTechniques 6:958, 1988. A ligação de oligonucleótidos da cadeia codificadora e complementares das cadeias codificadoras às sequências de ácido nucleico alvo resulta na formação de complexos que bloqueiam a tradução (RNA) ou transcrição (DNA) por um de vários métodos, incluindo um aumento da degradação dos duplexes, terminação prematura da transcrição ou tradução, ou por outros meios. Os oligonucleó-tidos complementares da cadeia codificadora podem assim ser usados para bloquear a expressão de polipeptideos do invento. Oligonucleótidos complementares da cadeia codificadora e da cadeia codificadora ainda compreendem oligonucleótidos tendo esqueletos açúcar-fosfodiéster modificados (ou outras ligações de açúcar, tais como as descritas em WO 91/06629) e em que tais ligações de açúcar são resistentes a nucleases endógenas. Tais oligonu-cleótidos com ligações de açúcar resistentes são estáveis in vivo (i.e. capazes de resistir à degradação enzimática) mas que retêm a especificidade de sequência para serem 59 ΡΕ1105485 capazes de se ligar a sequências nucleotídicas alvo. Outros exemplos de oligonucleótidos da cadeia codificadora ou complementares da cadeia codificadora incluem os oligonucleótidos que são ligados covalentemente a grupos orgânicos, tais como os descritos em WO 90/10448 e outros grupos que aumentam a afinidade do oligonucleótido para uma sequência de ácido nucleico alvo, como seja poli-(L-lisina). Ainda, agentes intercalantes, tais como elipticina e agentes de alquilação ou complexos metálicos podem ser ligados a oligonucleótidos da cadeia codificadora ou complementares da cadeia codificadora para modificar especificidades do oligonucleótido da cadeia codificadora ou complementar da cadeia codificadora relativamente à sequência nucleotidica alvo.

Os oligonucleótidos complementares da cadeia codificadora ou da cadeia codificadora podem ser introduzidos numa célula contendo a sequência de ácido nucleico alvo através de qualquer método de transferência de genes, incluindo, por exemplo, transfecção de DNA mediada por CaP04, electroporação ou através da utilização de vectores de transferência de genes tais como vírus de Epstein-Barr. Os oligonucleótidos complementares da cadeia codificadora ou da cadeia codificadora são de preferência introduzidos numa célula contendo a sequência de ácido nucleico alvo através da inserção do oligonucleótido complementar da cadeia codificadora ou da cadeia codificadora num vector retroviral adequado, depois contacto da célula com o vector retroviral contendo a sequência inserida, in vivo ou ex 60 ΡΕ1105485 vivo. Os vectores retrovirais adequados incluem, mas não estão limitados a retrovirus murino M-MiLV, N2 (um retrovirus derivado de M-MuLV) ou os vectores de dupla cópia designados DCT5A, DCT5B e DCT5C (ver Pedido de Patente PCT US 90/02656).

Como alternativa, os oligonucleótidos da cadeia codificadora ou complementares da cadeia codificadora podem também ser introduzidos numa célula contendo a sequência nucleotidica alvo através da formação de um conjugado com uma molécula de ligação ao ligando, como descrito em WO 91/04753. Tais moléculas de ligação a ligandos incluem, mas não estão limitadas a receptores da superfície celular, factores de crescimento, outras citocinas ou outros ligandos que se ligam a receptores da superfície celular. De preferência, a conjugação da molécula de ligação ao ligando não interfere substancialmente com a capacidade da molécula de ligação ao ligando se ligar à sua molécula correspondente ou receptor, ou bloquear a entrada do oligonucleótido da cadeia codificadora ou complementar da cadeia codificadora ou a sua versão de conjugado na célula.

Ainda, numa outra realização, um oligonucleótido da cadeia codificadora ou complementar da cadeia codificadora pode ser introduzido numa célula contendo a sequência de ácido nucleico avo através da formação de um complexo oligonucleótido-lípido, como descrito em WO 90/10448. O complexo de oligonucleótido da cadeia codificadora ou complementar da cadeia codificadora-lípidos é de 61 ΡΕ1105485 preferência dissociado dentro da célula por uma lipase endógena.

Mapeamento Cromossómico

Ainda, numa outra realização, os oligonucleótidos representando a totalidade ou uma porção de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:12 podem ser usados pelos familiarizados com a matéria, usando técnicas bem conhecidas, para identificar o cromossoma 2 humano e o seu locus específico, que contem o DNA dos membros da família de IL-1, por exemplo, IL-1 epsilon. Como descrito atrás, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:12 foram mapeadas através de mapeamento por radiação de híbridos na região (2q) do braço longo do cromossoma 2. Aquela região está associada a doenças específicas que incluem mas não estão limitadas a glaucoma, displasia ectodérmica, diabete melitus dependente de insulina, síndrome da pele enrugada, leucemia das células T/linfoma, asma e distrofia muscular tibial. Assim, SEQ ID NO; 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12 ou um fragmento destas sequências pode ser usado pelos familiarizados com a matéria, usando técnicas bem conhecidas, para estudar as doenças atrás descritas e outras anormalidades relacionadas com o cromossoma 2. Isto permitirá distinguir condições em que esta marca está rearranjada ou eliminada. Ainda, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12 ou um seu fragmento pode ser usado como marca posicionai para mapear outros genes humanos de localização desconhecida. 62 ΡΕ1105485

Utilizações Terapêuticas e de Pesquisa

Uma outra realização do invento está relacionada com as utilizações terapêuticas de IL-1 epsilon. Os ligandos de IL-1 desempenham um papel central na protecção contra a infecção e na promoção de resposta imunes e inflamatórias, o que inclui a transdução de sinal celular, activação de células endoteliais vasculares e linfócitos, indução de citocinas inflamatórias, proteínas de fase aguda, hematopoiese, febre, reabsorção óssea, prostaglan-dinas, metaloproteinases e moléculas de adesão. Com o aumento continuado no número dos membros conhecidos da família IL-1, um esquema de classificação adequado é um que se baseia na comparação da estrutura polipeptídica assim como na função (activação e propriedades reguladoras). Assim, IL-1 epsilon, tal como IL-la, IL-β e 11-18, está provavelmente envolvido em muitas das funções referidas atrás. Ainda, IL-1 epsilon está provavelmente envolvido na promoção de respostas inflamatórias e, portanto, pode estar integralmente envolvido na indução e manutenção de doenças inflamatórias e/ou auto-imunes tais como artrite reumatóide, colite e psoríase. Como tal, as alterações na expressão e/ou activação de membros da família IL-1 tais como IL-1 epsilon pode ter efeitos profundos numa pletora de processos celulares, incluindo, mas não estando limitado a activação ou inibição de respostas celulares específicas, proliferação e reacções inflamatórias baseados em alterações na transdução do sinal. 63 ΡΕ1105485

Assim, IL-1 epsilon tem utilizações terapêuticas, tais como protecção contra a infecção e geração de respostas imunes e inflamatórias em indivíduos cujas respostas imunes e inflamatórias são inadequadas ou sem resposta. Por exemplo, IL-1 epsilon pode ser útil na estimulação do sistema imune de indivíduos cujo sistema imune está imuno-comprometido. De forma semelhante, devido a IL-1 epsilon provavelmente promover respostas inflamatórias e estar envolvido na indução e manutenção de doenças inflamatórias e/ou auto-imunes, antagonistas de IL-1 espilon são úteis na inibição ou tratamento de doença inflamatória e/ou auto-imune . A sinalização celular mediada por IL-1 muitas vezes envolve uma cascata de activação molecular, durante a qual o receptor propaga um sinal mediado por ligando-receptor através da activação específica de cinases intracelulares que fosforilam substratos alvo, resultando na activação da transcrição do factor NFk-B e das cinases de proteínas Jun, cinase N-terminal e cinase p38 map. Estes substratos podem eles próprios ser cinases que ficam activadas após fosforilação. Como alternativa, eles podem ser moléculas adaptadoras que facilitam a sinalização através da interacção proteína-proteína após fosforilação. IL-1 epsilon pode actuar como um antagonista e possui um efeito inibidor nas respostas imunes e inflamatórias. Por exemplo, IL-1 epsilon pode ter uma função semelhante à de ILlra, de forma que polipeptídeos de 64 ΡΕ1105485 IL-1 epsilon isolados e purificados ou seus fragmentos do invento podem ser úteis como agentes terapêuticos na inibição de sinalização e tratamento de doenças inflamatórias e/ou doenças auto-imunes. No entanto, dada a presença no Exemplo III, abaixo, é mais provável que IL-1 epsilon seja um agonista, como seja, por exemplo IL-Ια ou IL-18. Conforme estabelecido atrás, tais agonistas são úteis na promoção de respostas imunes e inflamatórias em indivíduos cujos próprios sistemas imunes dão respostas imunes inadequadas. Para fins de antagonização da acti-vidade de IL-1 epsilon, os inibidores de IL-1 epsilon podem ser manipulados ou projectados usando técnicas conhecidas na área. Os polipeptídeos do presente invento, incluindo inibidores de IL-1 epsilon, podem ser introduzidos no ambiente extracelular por meios bem conhecidos, como seja através da administração de proteína intravenosamente ou pela sua acoplagem a um anticorpo monoclonal dirigido contra um tipo celular específico, para assim afectar a sinalização.

Quando usado como agente terapêutico, os poli-peptídeos do invento podem ser formulados em composições farmacêuticas de acordo com métodos conhecidos. Os polipeptídeos podem ser combinados em misturas, como único material activo ou com outros materiais activos conhecidos, com diluentes farmaceuticamente adequados (e.g., Tris-HCl, acetato, fosfato), preservativos (e.g., Thimerosal, álcool benzílico, parabenos), emulsionantes, solubilizantes, adjuvantes e/ou veículos. Veículos adequados e suas formulações 65 ΡΕ1105485 estão descritas em Remington 's Pharmaceuticals Sciences, 16th ed. 1980, Mack Publishing Co. Ainda, tais composições podem conter os polipeptídeos complexados com polietileno-glicol (PEG), iões metálicos ou incorporados em compostos poliméricos tais como ácido poliacético, ácido poliglicó-lico, hidrogéis, etc., ou incorporados em lipossomas, microemulsões, micelas, vesículas unilamelares ou multi-lamelares, fantasmas de eritrócitos ou esferoblastos. Tais composições influenciarão o estado físico, solubilidade, estabilidade, velocidade de libertação in vivo e taxa de eliminação in vivo dos polipeptídeos do invento. A dosagem da composição pode ser facilmente determinada pelos familiarizados com a matéria. A quantidade a ser administrada e a frequência de administração podem ser determinadas empiricamente e terão em consideração a idade e tamanho do doente a ser tratado, assim como da doença a ser tratada. O tratamento compreende a administração da composição por qualquer método familiar dos relacionados com a área, incluindo injecção intravenosa, intraperitoneal, intracorporal, intra-articular, intraventricular, intrate-cal, intramuscular, subcutânea, tópica, tonsilar, intra-nasal, intravaginal e oral. A composição pode também ser dada localmente, como seja por injecção na área particular, intramuscularmente ou subcutaneamente.

Ainda, o DNA, polipeptídeos e anticorpos contra 66 ΡΕ1105485 polipeptídeos do invento podem ser usados como reagentes numa variedade de protocolos de pesquisa. Uma amostra de tais protocolos de pesquisa está apresentada em Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989). Por exemplo, estes reagentes podem servir como marcadores da expressão especifica de células ou especifica de tecidos de RN A ou proteínas. De forma semelhante, estes reagentes podem ser usados para estudar a expressão constitutiva e transitória de RNA ou polipeptídeos. Conforme referido atrás, o DNA pode ser usado para determinar a localização cromossómica do DNA e mapear genes relativamente a esta localização cromossómica. 0 DNA pode também ser usado para examinar a heterogeneidade genética e hereditariedade através da utilização de técnicas tais como impressão digital genética, assim como para identificar riscos associados a alterações genéticas. 0 DNA pode ainda ser usado para identificar genes adicionais relacionados com o DNA e estabelecer árvores evolutivas baseadas na comparação de sequências. 0 DNA e os polipeptídeos podem ser usados para seleccionar os genes ou proteínas que sejam homólogos do DNA ou polipeptídeos, através de procedimentos de rastreio positivo tais como transferências Southern e imunotransferência e através de procedimentos de rastreio negativo tais como subtracção.

Ainda, devido a IL-1 epsilon ser um ligando, toma parte em interacções proteína-proteína com pelo menos uma ou mais proteínas, i.e. um ou mais dos seus receptores. 67 ΡΕ1105485

Assim, os polipeptídeos e fragmentos do invento podem ser usados como reagentes para identificar (a) proteínas que o polipeptídeo regula e (b) proteínas com as quais pode interagir. Portanto, os ligandos de IL-1 epsilon ou polipeptídeos compreendendo porções de um ligando de IL-1 epsilon poderão ser usados através de acoplagem da proteína recombinante a uma matriz de afinidade ou através da sua utilização como "isco" no sistema de duplo híbrido de levedura, de acordo com técnicas de biologia molecular bem estabelecidas, para identificar proteínas que interajam directamente com o polipeptídeo do invento. Ainda, os polipeptídeos IL-1 epsilon e fragmentos do presente invento encontram utilização em estudos dirigidos no sentido de descobrir receptores de IL-1 e/ou receptores de IL-1 epsilon. Por exemplo, os polipeptídeos de IL-1 epsilon e os fragmentos dos polipeptídeos de IL-1 epsilon podem ser usados em estudos de ligação para identificar células que expressem receptores. Estudos de ligação adequados são conhecidos na área e estão dentro dos conhecimentos dos familiarizados com a matéria. De forma semelhante, os polipeptídeos de IL-1 epsilon e os fragmentos polipe-ptídicos do presente invento encontram utilizações adicionais na clonagem de receptores usando técnicas de clonagem de expressão.

Os polipeptídeos e seus fragmentos podem também ser usados como reagentes no estudo de vias de sinalização utilizadas por IL-1 e homólogos de IL-1R ou membros da família e/ou no bloqueio daquelas vias de sinalização. Tais 68 ΡΕ1105485 novos homólogos do receptor de IL-1 podem ser especifi-camente usados como reagentes para identificar novas moléculas envolvidas nas vias de transdução de sinal, carac-terizar expressão em células e tecidos, compreender os seus papéis no desenvolvimento, respostas imune e inflamatória e identificar moléculas reguladoras e seus substratos proteicos fisiologicamente relevantes.

Como alternativa, os polipeptídeos do invento poderão ser manipulados antes da expressão, de forma a serem dotados de uma cauda de poli-His ou FLAG, depois expressos e purificados usando cromatografia de quelato de níquel ou anticorpo anti-FLAG acoplado a uma resina, respectivamente. Uma vez ligado à resina, o polipeptídeo do invento poderá ser ligado covalentemente usando um agente de ligação cruzada bifuncional usando técnicas bem estabelecidas. 0 polipeptídeo ligado covalentemente à resina poderá ser então usado para purificar moléculas a partir dos lisados celulares ou sobrenadantes celulares (após tratamento com vários reagentes) através da sua afinidade para o polipeptídeo do invento.

Anticorpos

Dentro dos aspectos terapêuticos e de pesquisa do invento, os polipeptídeos do invento e peptídeos baseados na sua sequência de aminoácidos, podem ser utilizados para preparar anticorpos que se ligam especificamente aos polipeptídeos. 0 termo "anticorpos" pretende incluir anti- 69 ΡΕ1105485 corpos policlonais, anticorpos monoclonais, seus fragmentos tais como fragmentos F(ab')2 e Fab, assim como quaisquer parceiros de ligação produzidos por via recombinante. Os anticorpos são definidos para se ligarem especificamente aos polipeptideos do invento com um Ka superior ou igual a cerca de 107M_1. As afinidades dos parceiros de ligação ou anticorpos podem ser facilmente determinadas usando técnicas convencionais, por exemplo as descritas por Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci.r 51:660(1949).

Os anticorpos policlonais podem ser facilmente gerados a partir de uma variedade de fontes, por exemplo, cavalos, vacas, cabras, carneiros, cães, galinhas, coelhos, ratinhos ou ratos, usando procedimentos que são bem conhecidos na área. Em geral, os polipeptídeos purificados do invento ou um peptideo baseado na sequência de aminoácidos dos polipeptídeos do invento que está adequadamente conjugado, é administrado ao animal hospedeiro tipicamente através da injecção parenteral. A imunogenicidade destes polipeptídeos pode ser estimulada através da utilização de um adjuvante, por exemplo adjuvante completo ou incompleto de Freund. Após imunizações de reforço, pequenas amostras de soro são colhidas e testadas quanto à reactividade com os polipeptídeos. Exemplos de vários ensaios úteis para tal determinação incluem os descritos em: Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Larie (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; assim como procedimentos tais como imuno-electroforese contracorrente (CIEP), radio-imunoensaio, radio-imunoprecipitação, ensaios imunossor- 70 ΡΕ1105485 ventes ligados a enzimas (ELISA), ensaios de transferência de pontos e ensaios de sanduíche, ver Patente U.S. Nos. 4376110 e 4486530.

Os anticorpos monoclonais podem ser facilmente preparados usando procedimentos bem conhecidos, ver por exemplo, os procedimentos descritos nas Patentes U.S. Nos. RE 32011, 4902614, 4543439 e 4411993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn and Bechtol (eds.), 1980. Resumidamente, os animais hospedeiros, tais como ratinhos Balb/c são injectados intraperitonealmente pelo menos uma vez e, de preferência, pelo menos duas vezes com intervalos de cerca de 3 semanas com polipeptídeos isolados e purificados ou polipeptídeos conjugados do invento, facultativamente na presença de adjuvante. 10 μρ de polipeptídeo isolado e purificado do invento ou peptí-deos baseados na sequência de aminoácidos do polipeptídeo do invento na presença de adjuvante RIBI (RIBI Corp., Hamilton, Montana). Os soros de ratinho foram então testados pela técnicas de transferência de pontos convencional ou captura de anticorpos (ABC) para determinar qual o animal que produz o nível mais elevado de anticorpo e cujas células do baço são as melhores candidatas para a fusão. Aproximadamente duas a três semanas mais tarde, os ratinhos receberam um reforço intravenoso dos polipeptídeos ou polipeptídeos conjugados, como seja 3 μg suspenso em PBS estéril. Os ratinhos foram mais tarde sacrificados e as células do baço fundidas com células de mieloma comerciali- 71 ΡΕ1105485 zadas, como seja Ag8.653 (ATCC) , seguindo protocolos estabelecidos. Resumidamente, as células de mieloma foram lavadas várias vezes em meio e fundidas com células de baço de ratinho numa proporção de cerca de três células de baço para uma célula de mieloma. 0 agente de fusão pode ser qualquer agente adequado usado na área, por exemplo, poli-etilenoglicol (PEG) ou, mais de preferência, 50% PEG:10% DMSO (Sigma). A fusão é semeada por exemplo em vinte placas de 96 alvéolos de fundo plano (Corning) contendo um meio adequado, como seja DMEM suplementado com HAT e deixadas a crescer durante oito dias. Os sobrenadantes dos hibridomas resultantes foram colhidos e adicionados, por exemplo, a uma placa de 96 alvéolos durante 60 minutos que foi primeiro revestida com anticorpos de cabra anti-Ig de ratinho. Após lavagens, foram adicionados 125I-polipeptideo ou peptideos do invento a cada alvéolo, incubados durante 60 minutos à temperatura ambiente e lavados quatro vezes. Os alvéolos positivos podem ser subsequentemente detectados por métodos convencionais, tais como autorradiografia a -70°C usando filme Kodak X-Omat. Os clones positivos podem ser crescidos em cultura e os sobrenadantes subsequentemente purificados, como seja numa coluna de Proteína A (Pharmacia). Será certamente entendido que poderão ser usadas muitas técnicas para produzir anticorpos contra polipeptídeos e fragmentos peptídicos do invento e que esta realização de forma alguma limita o âmbito do invento.

Os anticorpos monoclonais do invento podem ser produzidos usando técnicas alternativas, como sejam as 72 ΡΕ1105485 descritas por Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibodiy Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990), que aqui é incluído como referência. De forma semelhante, os parceiros de ligação podem ser construídos usando técnicas de DNA recombinante para incorporar as regiões variáveis de um gene que codifica um anticorpo de ligação específica. Tal técnica está descrita em Larrick et al., Biotechnology, 7:394 (1989) .

Outros tipos de "anticorpos" podem ser produzidos usando a informação aqui proporcionada conjuntamente com as informações da literatura. Por exemplo, têm sido manipulados anticorpos de forma a conterem elementos de anticorpos humanos que são capazes de se ligar especificamente a polipeptídeos do invento que estão incluídos no invento.

Uma vez isolados e purificados, os anticorpos contra polipeptídeos do invento podem ser usados para detectar a presença dos polipeptídeos numa amostra usando protocolos de ensaios estabelecidos. Ainda, os anticorpos do invento podem ser usados terapeuticamente ou para fins de investigação para se ligarem a polipeptídeos e inibir a sua actividade in vivo ou in vitro.

Os anticorpos imuno-reactivos com polipeptídeos do invento e, em particular, anticorpos monoclonais contra estes polipeptídeos, estão agora disponíveis através do invento. Tais anticorpos podem ser úteis para a inibição da 73 ΡΕ1105485 actividade dos polipeptídeos in vivo e para a detecção da presença de polipeptídeos do invento numa amostra.

Numa outra realização, os anticorpos gerados contra um polipeptídeo e fragmentos peptídicos do invento podem ser usados em combinação com marcadores de pesos moleculares polipeptídicos ou fragmentos peptídicos do invento para aumentar a precisão quando da utilização destes marcadores de pesos moleculares na determinação do peso molecular aparente e o ponto isoeléctrico de uma proteína numa amostra. Os marcadores de peso molecular polipeptídicos ou fragmentos peptídicos do invento podem ser misturados com um excesso molar de uma proteína numa amostra e a mistura pode ser resolvida por electroforese bidimensional seguindo meios convencionais. Os polipeptí-deos podem ser transferidos para uma membrana de ligação adequada, como seja nitrocelulose, por meios convencionais e detectados pelos anticorpos do invento.

Descoberta de Fármacos

Os polipeptídeos purificados de acordo com o invento facilitarão a descoberta de inibidores de tais polipeptídeos. A utilização de um polipeptídeo purificado do invento no rastreio de potenciais inibidores do mesmo é importante e pode ser eliminar ou reduzir a possibilidade de reacções de interferência com contaminantes.

Ainda, os polipeptídeos do invento podem ser 74 ΡΕ1105485 usados para a projecção dos polipeptídeos baseados na estrutura. Tal projecção baseada na estrutura é também conhecido como "projecção racional de fármacos". Os polipeptideos podem ser analisados tridimensionalmente, por exemplo por cristalografia de raios X, ressonância magnética nuclear ou modelação por homologia, todos eles sendo métodos bem conhecidos. A utilização da informação estrutural do polipeptideo nos sistemas informáticos de modelação molecular para ajudar na projecção de inibidores e interacção inibidor-polipeptídeo está também incluída no invento. Tal modelação e projecção de fármacos auxiliada por computadores pode utilizar informação como seja análise conformacional química, potencial electrostático das moléculas, enrolamento proteico, etc. Por exemplo, a maior parte da projecção de inibidores específicos de classe de metaloproteases tem-se focado nas tentativas de quelatar ou ligar o átomo de zinco catalítico. Os inibidores sintéticos são geralmente projectados de forma a conterem um grupo carregado negativamente ao qual se liga uma série de outros grupos projectados de forma a especificar bolsas da protease particular. Um método particular do invento compreende a análise da estrutura tridimensional de polipeptideos do invento relativamente a locais de ligação prováveis dos substratos, síntese de uma nova molécula que incorpora um local reactivo previsível e ensaio da nova molécula como descrito abaixo.

Os exemplos que se seguem são apresentados para promover uma compreensão total deste invento. 75 ΡΕ1105485

Exemplo I

Isolamento e identificação de um novo ligando de IL-1 humana

Fizemos o rastreio de uma biblioteca genómica em fagos (Stratagene catalog# 946205) usando uma mistura de sondas de DNA de cadeia simples marcadas com 32P correspondendo à totalidade da sequência codificadora de IL-1 epsilon murina. Após lavagem de baixa restringência (lavagem de baixa restringência é definida como 0,2X SSC/0,1% SDS, à temperatura ambiente, Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, p.10.3,

John Wiley & Sons, Inc., (1996), foi identificado um clone positivo com um sinal de hibridação forte. O DNA preparado a partir deste clone e sujeito a análise de Southern permitiu identificar um fragmento de restrição Sall-Asp 718 de 5,5 Kb que foi subclonado em pBluescript e sequenciado. A análise de homologia do fragmento de 5,5 Kb usando o programa de computador UWGCG "bestfit" revelou que uma região de 212 pb dentro do clone era 74% semelhante, ao nível nucleot ídico, ao exão 3' de IL-1 epsilon murina. Conforme descrito na Figura 3, esta sequência de 212 pb contem uma grelha de leitura aberta de 70 aminoácidos com 66% de semelhança (64% de identidade) com o exão 3' de IL-1 epsilon murina. A sequência genómica à volta do locus de IL-1 76 ΡΕ1105485 epsilon humana foi prolongada mais 5 Kb na direcção 5 ' usando um estojo ("kit") de Genome walking (da Clontech) de acordo com as instruções do fabricante . A análise da sequênca desta região a montante revelou três exões tridimensionais putativos. Usou-se RT-PCR para confirmar a expressão destes exões e a sua associação num único cDNA de IL-1 epsilon, em RNA de quatro fontes diferentes de tecido humano (timo, amígdala e as linhas celulares HL-60 e THP-1). Ainda, um clone de cDNA foi obtido a partir da Stratagene Universal Human cDNA Library Array I que também demonstrou a ligação dos três exões mais 3' . 0 clone de cDNA derivado da Universal Human cDNA Library Array I era um clone parcial que não se prolongou para o extremo 5' da grelha de leitura aberta. As sequências de DNA de IL-1 epsilon humana de tamanho completo estão descritas em SQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 12. Os polipeptídeos codificados por SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:12 estão descritos em SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:13, respectivamente. Conforme descrito na Figura 4, os aminoácidos 51-159 de SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 13 partilham 53% de semelhança (49% de identidade) com a IL-1 epsilon murina (forma longa).

Exemplo II

Mapeamento de cromossoma de IL-I epsilon humana através do mapeamento de híbridos por radiação

Efectuou-se PCR usando o painel Whihead Insti-tute/MIT Center for Genome Research Genebridge4 de 93 hí- 77 ΡΕ1105485 bridos de radiação (http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distri-bution/human_STS_releases/july9 7/rhmap/genebridge4.html) . Foram usadas sequências iniciadoras situadas dentro do exão 3' putativo de IL-1 humana epsilon e que amplificam um produto de 195 pb de DNA genómico humano, mas que não amplificam DNA genómico de hamster. Os resultados dos PCRs foram convertidos num vector de dados que foi submetido ao local Whithead/MIT Radiation Mapping na internet (http://www-seq.wi.mit.edu). Os dados foram classificados e proporcionadas a localização cromossómica e colocação relativa aos marcadores conhecidos do Sequence Tag Site (STS) no mapa de híbridos por radiação. De acordo com os resultados, IL-1 epsilon humana situa-se no cromossoma 2, em 11.54cR de STS D2A»S121 e 4.3cR do marcador CHLC.GAAT11C03. 0 local da internet que se segue proporciona informação adicional sobre mapeamento de híbridos por radiação: http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/hu-man_STS_releases/july9 7/07-97.INTRO.html) .

Exemplo III

Activação de moléculas de sinalização em células humanas por IL-1 epsilon humana

Segue-se a descrição de testes e resultados que foram realizados para determinar se IL-1 epsilon é capaz de activar algumas das moléculas de sinalização envolvidas nas respostas de pressão uma vez que são activadas por IL-la, IL-Ιβ e outras citocinas inflamatórias. 78 ΡΕ1105485 IL-1 epsilon humana foi transfectada em células COS-1. Vários dias após transfecção, colheu-se meio condicionado (contendo IL-1 epsilon transitoriamente expressa. As células a testar foram incubadas neste meio condicionado ou, como alternativa, com meio condicionado derivado de células COS-1 transfectadas com o vector de expressão não recombinante. Aproximadamente 10 minutos após incubação, prepararam-se extractos celulares a partir de células a testar e a presença de moléculas de sinalização activadas foi testada usando anticorpos específicos para as formas fosforiladas de IKBa (fosforilação de Ser32), cinase MAP p38 (fosforilação em Trel80 e Tirl82) e cinase de proteínas activada por pressão (SAPK/JNK) (fosforilação de Trel83/Tirl85) (foram adquiridos anticorpos à New England Biolabs, Beverly, MA) . Sabe-se que estas moléculas de transdução de sinal estão envolvidas numa larga gama de respostas celulares a estímulos tais como irradiação UV, endotoxinas e citocinas inflamatórias incluindo IL-Ιβ. Comparando com o meio condicionado de controlo, o meio condicionado contendo 11-1 epsilon humana activou IKBa e fosforilação da cinase MAP p38 numa série de linhas celulares humanas incluindo Fibroblastos de Prepúcio Humano e Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana (ATCC CRL-1730). Na linha celular de linfoma não Hodgkins K299, IL-1 epsilon humana activou especificamente a fosforilação de JNK/SAPK. Estes resultados demonstram que IL-1 epsilon está envolvida nas vias de sinalização de resposta a pressão. 79 ΡΕ1105485

Exemplo IV

Distribuição tecidular de IL-1 epsilon humana A distribuição tecidular de mRNA de IL-1 epsilon humana foi estudada usando amplificação por PCR a partir de um painel de matrizes da primeira cadeia de cDNA. Especificamente, foi testado um Painel de cDNA de Múltiplos Tecidos Humanos da Clontech (Paio Alto, CA) usando uma sequência iniciadora directa no exão 2 e uma sequência iniciadora reversa no exão 4, que em conjunto amplificam um fraqmento de IL-1 epsilon de 450 pares de bases. A reacção de PCR correu durante 35 ciclos com uma temperatura de emparelhamento de 60°C. Os produtos de PCR foram detectados num gel de agarose usando brometo de etídio. mRNA de IL-1 epsilon humana foi detectado em tecidos do baço, nódulo linfático, timo, amígdala e leucócitos. 0 tecido com os níveis mais elevados de mRNA de IL-1 epsilon humana foi a amígdala.

Exemplo V

Activação de níveis de ICAM-1 em células humanas por IL-1 epsilon humana

Segue-se a descrição dos testes e resultados que foram realizados para determinar se IL-1 epsilon é capaz de activar algumas das moléculas na superfície celular envolvidas nas respostas a pressão tal como são activadas por IL-la, IL-Ιβ e outras citocinas inflamatórias. 80 ΡΕ1105485 IL-1 epsilon humana foi transfectada em células COS-1. Vários dias após a transfecção, colheu-se o meio condicionado (contendo IL-1 epsilon transitoriamente expressa). Células fibroblásticas de prepúcio humano (HFF) foram incubadas durante 18 horas a 37°C com este meio condicionado diluido a 1:1 com meio contendo 0,5% de soro, ou como alternativa meio condicionado derivado de células testemunha COS-1 transfectadas com o vector de expressão não recombinante, diluido com meio fresco com 0,5% de soro.

Após tratamento com o meio condicionado derivado de células COS-1, as células HFF foram lavadas duas vezes com PBS e removidas do frasco de cultura de tecidos com verseno (reagente não tripsina). Os niveis de ICAM-1 na superfície celular foram medidos através de coloração com anticorpo anti-CD54-PE (Pharmingen, San Diego, CA) em gelo durante, uma hora, seguido de lavagem e detecção baseada em FACS . Células HFF incubadas em meio condicionado derivado de células COS-1 apresentaram um ligeiro aumento nos niveis de ICAM-1, relativamente às células não tratadas. Por outro lado, as células HFF que foram tratadas com meio condicionado derivado de células COS-1 que tinham sido transfectadas com IL-1 epsilon apresentaram um aumento de duas vezes nos niveis de ICAM-1 na superfície celular. O nível de coloração de ICAM-1 observado nas células HFF tratadas com IL-1 epsilon foi comparável ao induzido nas mesmas células por IL-Ιβ purificada. ΡΕ1105485 81 <110> <120> <13 0> <140> <141> <150> <151> <150> <151> < 15 0 > <151> <16 0> < 17 0 > <210> <211> <212> <213>

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

Sims, John E.

Smith, Dirk E. DNA e polipeptídeos de IL-1 epsilon humana 03260.xxxx-00304 60/097413 1998-08-21 60/098595 1998-08-31 60/099974 1998-09-11 13

Patentln Ver. 2.0 1 297

DNA

Mus sp. 1 1 82 ΡΕ1105485 <400> atgttcagga tcttagtagt cgtgtgtgga tcctgcagas caatatcctc acigcagtec 66 caaggaaaga geaaaeagtt «caggsaaggg aacateatgg aaatgtaeas caaaaaggaa 120 eetgtaaaag ccfcctctctt ctateaeaag ãsgsgtgftâ caacctctae atttgagfcct 180 gcagçettcc ctggttggtt câtcgétgtc tgetetaaag ggagctgccc âctxâttctg MS acccaagaac tggggpast cttcstcact saettcgaga tpttgtggt aeattaa 25? <210> <211> <212> <213> <400> 2 98

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Lisboa, 22 de Setembro de 2006

Claims (15)

1. ΡΕ1105485 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma molécula de ácido nucleico seleccionada do grupo consistindo em: (a) uma sequência de DNA compreendendo a sequência nucleotidica de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO:12; (b) uma molécula de ácido nucleico codificadora de aminoácidos compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO:13 ou codificadora de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de homologia com tal sequência de aminoácidos; (c) um DNA capaz de hibridar com um DNA de (a) em condições de restringência moderada; (d) DNA que é degenerado, como resultado do código genético, para um DNA como definido em (a); e (e) fragmentos de (a) em que o ácido nucleico codifica um polipeptídeo que activa IKBa e fosforilação da cinase MAP p38 numa série de linhas celulares humanas incluindo fibroblastos do prepúcio humano e células endoteliais da veia umbilical humana. 2 ΡΕ1105485
2. 2. Uma molécula de ácido nucleico isolada, seleccionada do grupo consistindo em: (a) uma sequência de DNA compreendendo a sequência nucleotidica de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO:12; (b) uma molécula de ácido nucleico codificadora de amnoácidos compreendendo a sequência de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO:13.
3. 3. Um vector recombinante que dirige a expressão da molécula de ácido nucleico da reivindicação 1 ou 2.
4. 4. Um polipeptideo isolado codificado pela molécula de ácido nucleico da reivindicação 1 ou 2.
5. 5. Uma composição compreendendo um polipeptideo da reivindicação 4, e um diluente, excipiente ou veiculo fisiologicamente aceitável.
6. 6. Um polipeptideo isolado de acordo com a reivindicação 4 na forma não glicosilada.
7. 7. Um anticorpo que se liga a um polipeptideo da reivindicação 4.
8. 8. Um anticorpo de acordo com a reivindicação 7, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal. 3 ΡΕ1105485
9. 9. Um polipeptídeo isolado compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO:13.
10. 10. Um polipeptídeo IL-1 epsilon isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO:13.
11. 11. Uma célula hospedeira transfectada ou transduzida com o vector da reivindicação 3.
12. 12. Um método para a produção do polipeptídeo IL-1 epsilon compreendendo a cultura de uma célula hospedeira da reivindicação 11 em condições que promovem a expressão e recuperação do polipeptídeo a partir do meio de cultura.
13. 13. O método da reivindicação 12, em que a célula hospedeira é seleccionada do grupo consistindo em células bacterianas, células de levedura, células vegetais e células animais.
14. 14. Utilização de um polipeptídeo de acordo com a reivindicação 4 para a preparação de uma composição farmacêutica para a estimulação do sistema imune de um doente imunocomprometido. 4 ΡΕ1105485
15. 15. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 5 para a preparação de uma composição farmacêutica para a estimulação do sistema imune de um doente imunocomprometido. Lisboa, 22 de Setembro de 2006