PT103599B - PROCESS OF IDENTIFICATION OF ANIMAL SPECIES IN SAMPLES CONTAINING GENETIC MATERIAL, BASED ON DETERMINATION OF THE SIZE OF MITOCHONDRIAL DNA SEQUENCES - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO CONSISTE NUM PROCESSO DE IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES ANIMAIS BASEADO NAS DIFERENÇAS DE TAMANHO DAS SEQUÊNCIAS DE ADN DOS GENES MITOCONDRIAIS 12SRRNA E 16SRRNA PRESENTES EM AMOSTRAS BIOLÓGICAS COM MATERIAL GENÉTICO DE UMA OU MAIS ESPÉCIES ANIMAIS. COM ESTE PROPÓSITO DESENVOLVEU-SE UM PAINEL DE PRIMERS, MARCADOS COM FLUORESCÊNCIA, PARA AMPLIFICAÇÃO SIMULTÂNEA DE SETE FRAGMENTOS DE DIFERENTES TAMANHOS, NUMA REACÇÃO DE PCR EM MULTIPLEX, SENDO POSSÍVEL A SUA DETECÇÃO E ANÁLISE POR TÉCNICAS TAIS COMO ELECTROFORESE CAPILAR AUTOMATIZADA, ELECTROFORESE DE GEL DESNATURANTE, SEQUENCIAÇÃO, PIROSEQUENCIAÇÃO, DIGESTÃO ENZIMÁTICA, CIRCUITOS DE MOLÉCULAS DE ADN QUIMICAMENTE LIGADAS A SUPERFÍCIES SÓLIDAS (MICROARRAY), CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DESNATURANTE DE ELEVADA PERFORMANCE (DHLPC) OU OUTRA TÉCNICA AFIM. ESTA INVENÇÃO TEM A VANTAGEM DE SER APLICÁVEL INCLUSIVAMENTE A AMOSTRAS BIOLÓGICAS DEGRADADAS, DADO QUE SE BASEIA NA ANÁLISE SIMULTÂNEA DE SETE REGIÕES INFORMATIVAS DO ADN MITOCONDRIAL, DE GRANDE ABUNDÂNCIA RELATIVAMENTE AO ADN NUCLEAR. A MARCAÇÃO DOS PRIMERS COM FLUORESCÊNCIA PERMITE UMA UTILIZAÇÃO RÁPIDA, EFICAZ E ECONÓMICA DESTE MULTIPLEX EM SISTEMAS DE ELECTROFORESE CAPILAR AUTOMATIZADA. ESTAS CARACTERÍSTICAS DA INVENÇÃO POSSIBILITAM A SUA APLICAÇÃO NA IDENTIFICAÇÃO DE AMOSTRAS, EM LARGA ESCALA, EM ÁREAS TAIS COMO A FORENSE, A INDÚSTRIA ALIMENTAR, A ECOLOGIA E A ARQUEOLOGIA.The present invention is comprised of a method for identification of animal species based on the size differences of the DNA sequencing of the 12SRRNA and 16SRRNA mitochondrial genes present in biological samples with genetic material of one or more animal species. FOR THIS PURPOSE A FLAT-SCREEN PRIMERS PANEL DEVELOPED FOR SIMULTANEOUS AMPLIFICATION OF SEVEN FRAGMENTS OF DIFFERENT SIZES, IN A MULTIPLEX PCR REACTION, BEING POSSIBLE TO DETECT AND ANALYZE THEMSELVES AS AUTOMATIZED ELECTRONIC CAPILLARY ELECTROPHORESIS, GEL ELECTROPHORESIS DESNATURANT, SEQUENTIATION, PYROSEQUENTIATION, ENZYMATIC DIGESTION, CHEMICALLY SOLID SURFACE-LINKED (MICROARRAY) DNA MOLECULES, HIGH PERFORMANCE DENATURATING LIQUID CHROMATOGRAPHY (DHLPC), OR OTHER AFIM TECHNIQUE. THIS INVENTION HAS THE ADVANTAGE OF APPLYING ONLY TO DEGRADED BIOLOGICAL SAMPLES, BECAUSE IT IS BASED ON THE SIMULTANEOUS ANALYSIS OF SEVEN INFORMATION REGIONS OF MITOCHONDRIAL DNA, OF GREAT ABUNDANCE RELATIVE TO NUCLEAR DNA. PRIMERS BRANDING WITH FLUORESCENCE ALLOWS A QUICK, EFFECTIVE AND ECONOMIC USE OF THIS MULTIPLEX IN AUTOMATED CAPILLARY ELECTROPHORESIS SYSTEMS. THESE CHARACTERISTICS OF THE INVENTION POSSIBLE THEIR APPLICATION TO IDENTIFY SAMPLES ON A LARGE SCALE, IN SUCH AREAS AS FOR FORESTRY, THE FOOD INDUSTRY, ECOLOGY AND ARCHEOLOGY.

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO DE IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES ANIMAIS EM AMOSTRAS CONTENDO MATERIAL GENÉTICO, BASEADO NA DETERMINAÇÃO DO TAMANHO DE SEQUÊNCIAS DO ADN MITOCONDRIAL"DESCRIPTION OF THE INVENTION ANIMAL SPECIES IN SAMPLES CONTAINING GENETIC MATERIAL BASED ON DETERMINATION OF THE SIZE OF MITOCHONDRIAL DNA SEQUENCES "

Dominio técnico da invenção A presente invenção consiste num processo de identificação de espécies animais baseada nas diferenças de tamanho das sequências dos genes mitocondriais 12srRNA e 16srRNA presentes em amostras biológicas destas espécies.TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION The present invention is a process for the identification of animal species based on the sequence size differences of the 12srRNA and 16srRNA mitochondrial genes present in biological samples of these species.

De entre as várias aplicações do invento, distingue-se a possibilidade de analisar igualmente amostras biológicas degradadas, dado que se baseia na análise simultânea de sete regiões informativas do ADN mitocondrial, de grande abundância relativamente ao ADN nuclear. 0 processo objecto da presente invenção possibilita a sua aplicação à identificação de espécies animais, em larga escala, em áreas tais como a forense, a indústria alimentar, a ecologia e a arqueologia.Among the various applications of the invention, the possibility of analyzing degraded biological samples is also distinguished since it is based on the simultaneous analysis of seven mitochondrial DNA informative regions, of great abundance relative to nuclear DNA. The process object of the present invention enables its application to the identification of animal species, in large scale, in areas such as forensics, food industry, ecology and archeology.

Sumário da invenção A presente invenção consiste num processo de identificação molecular de espécies animais utilizando diferenças de tamanho na sequência de ADN de genes mitocondriais ubíquos. Para este efeito desenvolveu-se um painel de primers de PCR (Polymerase Chain Reaction - reacçâo em cadeia da polimerase), marcados com fluorescência, que permite a amplificação em multiplex (técnica de PCR que permite amplificar em simultâneo e numa única reacçâo várias 2 sequências de ADN com diferentes localizações no genoma) de sete regiões pertencentes aos dois genes mitocondriais que codificam as subunidades 12 e 16 do ARN ribossómico (12S e 16S do rARN). 0 tamanho dos fragmentos, amplificados por PCR em multiplex, pode ser então determinado por electroforese capilar automatizada ou através de métodos electroforéticos não-automatizados, sendo neste caso necessário analisar individualmente os padrões obtidos no gel de electroforese. A resolução da identificação do material biológico presente na amostra é obtida por comparação dos tamanhos determinados na análise com os tamanhos de referência previamente determinados para diferentes espécies.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is a process for the molecular identification of animal species using size differences in the DNA sequence of ubiquitous mitochondrial genes. For this purpose, a fluorescently labeled Polymerase Chain Reaction (PCR) primer was developed which allows for multiplex amplification (a PCR technique that allows simultaneous amplification and in a single reaction several sequences of DNA with different locations in the genome) from seven regions belonging to the two mitochondrial genes encoding ribosomal 12S and 16S rRNA subunits 12 and 16. The size of the fragments, amplified by multiplex PCR, can then be determined by automated capillary electrophoresis or by non-automated electrophoretic methods, in which case it is necessary to individually analyze the patterns obtained in the electrophoresis gel. The resolution of the identification of the biological material present in the sample is obtained by comparing the sizes determined in the analysis with the reference sizes previously determined for different species.

Antecedentes da invençãoBackground of the invention

Os métodos clássicos de caracterização molecular baseados na análise de proteínas (e.g. focagem isoeléctrica, precipitação de proteínas e reacções imunológicas; Hsieh et al. 1998; Skarpeid et al. 1998) apresentam limitações decorrentes da elevada rapidez de degradação das proteínas nas amostras, dos diferentes níveis de expressão proteicos nos diferentes tecidos, da escassez de anticorpos disponíveis para a aplicação de métodos imunológicos e da possibilidade de ocorrência de falsos resultados devido a reacções com proteínas semelhantes em diferentes espécies. 0 desenvolvimento de tecnologias moleculares baseadas em análise de ADN permitiu o surgimento de diversos métodos que ultrapassam alguns dos problemas das análises proteicas. As 3 principais vantagens da utilização desta molécula, na identificação de espécies, advêm da sua elevada estabilidade, da sua presença em praticamente todos os tecidos e do seu elevado conteúdo informativo.The classical molecular characterization methods based on the analysis of proteins (eg isoelectric focusing, protein precipitation and immunological reactions, Hsieh et al., 1998) have limitations due to the high degradation rate of the proteins in the samples, of the different levels of protein expression in different tissues, the scarcity of antibodies available for the application of immunological methods and the possibility of occurrence of false results due to reactions with similar proteins in different species. The development of molecular technologies based on DNA analysis allowed the emergence of several methods that overcome some of the problems of protein analysis. The 3 main advantages of the use of this molecule in the identification of species come from its high stability, its presence in almost all tissues and its high informative content.

Os primeiros métodos desenvolvidos baseavam-se na hibridação entre sondas de ADN (ADN genómico total ou sondas sintéticas) e as amostras a analisar. Estes métodos apresentam várias limitações nomeadamente: a) o facto de não poderem ser aplicados a amostras degradadas, visto requererem grandes quantidades de ADN na análise; b) nâo-padronização e possível discordância de resultados entre diferentes laboratórios, resultante da forte dependência das condições experimentais; c) os custos e dificuldades associados ao desenvolvimento de sondas específicas; d) a não-discriminação entre espécies diferentes, devido à possibilidade de hibridações não-específicas entre sequências de ADN.The first methods developed were based on the hybridization between DNA probes (total genomic DNA or synthetic probes) and the samples to be analyzed. These methods have several limitations, namely: (a) the fact that they can not be applied to degraded samples, since they require large amounts of DNA in the analysis; b) non-standardization and possible disagreement of results between different laboratories, resulting from the strong dependence of the experimental conditions; c) the costs and difficulties associated with the development of specific probes; d) non-discrimination between different species, due to the possibility of non-specific hybridizations between DNA sequences.

Avanços significativos nesta área só surgiram com o desenvolvimento de métodos baseados na técnica de reacção em cadeia da polimerase (PCR), através da qual é possível obter um grande número de cópias (amplificação) de uma região específica do genoma, delimitada por primers, para posterior detecção e análise.Significant advances in this area have only arisen with the development of methods based on polymerase chain reaction (PCR) technique, through which a large number of copies (amplification) of a specific region of the genome, delimited by primers, can be obtained for detection and analysis.

Os métodos baseados em PCR mais importantes, para a identificação de espécies são: RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - amplificação aleatória de ADN polimórfico), "Mammalian-wide Interspersed Repeat Fingerprints", PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - análise do polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição) e sequenciação (e.g. Lee and Chang 1994; Buntjer et al. 1999; Wolf et al. 1999; Parson et al. 2000). 4The most important PCR-based methods for identifying species are: Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), " Mammalian-wide Interspersed Repeat Fingerprints ", PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism restriction fragment size polymorphism) and sequencing (eg Lee and Chang 1994; Buntjer et al., 1999; Wolf et al., 1999; Parson et al., 2000). 4

Os dois primeiros métodos referidos produzem padrões complexos de fragmentos amplificados difíceis de interpretar sendo, por isso, impossível a sua aplicação na identificação de mais do que uma espécie em amostras com mistura de material biológico. Os resultados obtidos com estes métodos são muito dependentes das condições de reacção de PCR não sendo praticável uma padronização dos resultados entre laboratórios.The two foregoing methods produce complex patterns of amplified fragments which are difficult to interpret and thus impossible to apply to identifying more than one species in mixed samples of biological material. The results obtained with these methods are very dependent on the PCR reaction conditions and a standardization of results between laboratories is not practicable.

Adicionalmente, no caso da técnica RAPD são obtidos resultados discordantes devido à utilização de primers de PCR ligeiramente diferentes. A sua utilização em amostras degradadas origina padrões de identificação do tipo "fingerprint" incompletos (os fragmentos maiores não são amplificados) o que dificulta bastante a sua interpretação. 0 PCR-RFLP e a sequenciação de ADN são correntemente os métodos mais utilizados. No caso do PCR-RFLP, o ADN é cortado por enzimas de restrição, obtendo-se um conjunto de fragmentos de diversos tamanhos (e.g. Zehner et al. 1998; Wolf et al. 1999). A separação destes fragmentos é geralmente feita por electroforese. Uma importante limitação deste método é a possibilidade de ocorrência de polimorfismos nos locais de restrição que podem originar falsos negativos. 0 facto de se basearem em apenas algumas posições nucleotídicas (locais de restrição) limita o seu poder informativo e, em muitos casos, surgem também grandes dificuldades na análise de padrões de RFLP complexos. A sequenciação de ADN permite identificar e comparar diferenças entre regiões homólogas dos genomas de espécies distintas. Os loci normalmente mais utilizados são os genes ribossomais nucleares e os genes que codificam as proteínas 5 mitocondriais da subunidade I da citocromo c oxidase e do citocromo b (Zehner et al. 1998; Parson et al. 2000; Branicki et al. 2003). Apesar de bastante utilizada, a sequenciação apresenta diversas limitações quando aplicada à identificação de espécies. Uma delas é o facto de, na maior parte dos casos, o método se basear na análise de fragmentos com mais de 300 pares de bases (bp) que, sendo necessários para obter informação suficiente para a identificação, são difíceis de amplificar por PCR em amostras contendo pouco ADN e/ou ADN degradado (Bataille et al. 1999; Parson et al. 2000; Hsieh et al. 2000; Branicki et al. 2003). Mesmo na presença de uma amostra com ADN de boa qualidade, reduzir a análise a uma única região do ADN aumenta a probabilidade de falsos diagnósticos ou resultados nulos. Este aspecto é particularmente limitante devido à possibilidade de ocorrência de polimorfismos nos locais de ligação dos primers do PCR, impossibilitando o seu emparelhamento e a subsequente amplificação e análise do único locus utilizado. É também impossível a aplicação desta técnica a amostras com mistura de material biológico de diferentes espécies. Nestes casos, as sequências obtidas apresentam-se sobrepostas, impedindo a leitura e análise do resultado. Outra desvantagem importante é o elevado custo da aplicação desta tecnologia.In addition, in the case of the RAPD technique discordant results are obtained due to the use of slightly different PCR primers. Their use in degraded samples gives rise to identification patterns of the type " fingerprint " incomplete (the larger fragments are not amplified), which makes their interpretation very difficult. PCR-RFLP and DNA sequencing are currently the most commonly used methods. In the case of PCR-RFLP, the DNA is cleaved by restriction enzymes, obtaining a set of fragments of various sizes (e.g. Zehner et al., 1998; Wolf et al., 1999). Separation of these fragments is generally done by electrophoresis. An important limitation of this method is the possibility of occurrence of polymorphisms in the restriction sites that can lead to false negatives. The fact that they are based on only a few nucleotide positions (restriction sites) limits their informative power and, in many cases, there are also great difficulties in analyzing complex RFLP patterns. DNA sequencing allows to identify and compare differences between homologous regions of the genomes of different species. The most commonly used loci are the nuclear ribosomal genes and the genes encoding the mitochondrial proteins of the cytochrome c oxidase I subunit and cytochrome b (Zehner et al., 1998, Parson et al., 2000; Branicki et al., 2003). Although widely used, sequencing has several limitations when applied to species identification. One is that, in most cases, the method is based on the analysis of fragments with more than 300 base pairs (bp), which are necessary to obtain enough information for the identification, are difficult to amplify by PCR in samples containing low DNA and / or degraded DNA (Bataille et al., 1999, Parson et al., 2000, Hsieh et al., 2000, Branicki et al., 2003). Even in the presence of a sample with good DNA quality, reducing the analysis to a single region of the DNA increases the likelihood of false diagnoses or null results. This is particularly limiting because of the possibility of occurrence of polymorphisms at the binding sites of PCR primers, making it impossible to anneal them and subsequent amplification and analysis of the single locus used. It is also impossible to apply this technique to samples with a mixture of biological material from different species. In these cases, the sequences obtained are overlapping, preventing the reading and analysis of the result. Another important disadvantage is the high cost of applying this technology.

Estão também descritos diversos estudos que utilizam primers de PCR específicos para identificação de determinadas espécies. Por exemplo, o método descrito por Kusama et al. (2005) utiliza primers de PCR para o gene da subunidade 8 da ATP sintetase mitocondrial. A maior restrição ao uso deste tipo de abordagem é o facto de a detecção de uma espécie numa amostra depender totalmente da utilização do seu primer específico para obtenção de amplificado e posterior análise em electroforese. Este método requer que o analista disponha 6 de uma colecção de primers específicos e realize um número de reacções de PCR separadas, tantos primers e tantas reacções quantas as espécies cuja presença que pretende testar numa amostra. Em caso de amostras forenses com quantidades vestigiais de ADN eventualmente degradado, este método é de fraca aplicabilidade. A detecção das diferenças no tamanho de sequências resultantes de polimorfismos em regiões repetitivas do ADN nuclear (principalmente mini- e micro-satélites) é largamente utilizada tendo em vista, por exemplo, a identificação individual. No entanto, nunca foi descrita uma metodologia para detecção de diferenças de tamanho em sequências resultantes de polimorfismos de inserção/delecção de nucleótidos em genes mitocondriais com vista à identificação de espécies, tal como é apresentado na presente invenção.Several studies using specific PCR primers for identification of certain species are also described. For example, the method described by Kusama et al. (2005) uses PCR primers for the ATP subunit 8 gene of the mitochondrial synthetase. The greatest restriction to the use of this type of approach is that the detection of a species in a sample depends entirely on the use of its primer to obtain amplified and subsequent analysis in electrophoresis. This method requires the analyst to have 6 of a collection of specific primers and to perform a number of separate PCR reactions, as many primers and as many reactions as the species whose presence is intended to be tested in a sample. In the case of forensic samples with trace amounts of possibly degraded DNA, this method is of poor applicability. The detection of the differences in the size of sequences resulting from polymorphisms in repetitive regions of nuclear DNA (mainly mini- and microsatellites) is widely used for, for example, individual identification. However, a methodology for detecting size differences in sequences resulting from nucleotide insertion / deletion polymorphisms in mitochondrial genes for identification of species as disclosed in the present invention has never been described.

Num estudo, tendo em vista identificações biológicas (Marcos, 2005), são utilizadas diferenças de tamanho para identificar os fragmentos amplificados mas não a espécie, sendo referida a necessidade uma segunda aproximação baseada na sequenciação dos fragmentos identificados. Ao contrário da presente invenção, este estudo não contempla a utilização do PCR em multiplex para a identificação de espécies, não utiliza primers de PCR marcados por fluorescência, não é baseado no uso do ADN mitocondrial, está unicamente reivindicado para o gene da beta-actina citoplasmática e não é suportado por um estudo populacional de determinação de polimorfismos intra-específicos que possam condicionar o seu uso na identificação de espécies. Num outro trabalho, Bellis et al (2003) já tinham apresentado a mesma abordagem relativamente ao gene nuclear TP53, mantendo-se as diferenças acima enumeradas relativamente à nossa invenção. 7In a study, considering biological identifications (Marcos, 2005), size differences are used to identify the amplified fragments but not the species, and a second approach based on the sequencing of the identified fragments is required. In contrast to the present invention, this study does not contemplate the use of multiplex PCR for species identification, does not use fluorescence-labeled PCR primers, is not based on the use of mitochondrial DNA, is solely claimed for the beta-actin gene cytoplasmic and is not supported by a population study of determination of intra-specific polymorphisms that may condition its use in the identification of species. In another work, Bellis et al. (2003) had already presented the same approach regarding the TP53 nuclear gene, with the above differences remaining in relation to our invention. 7

Alguns documentos de patente, para além de utilizarem abordagens técnicas diferentes da descrita na presente invenção, visam apenas a identificação de espécies pertencentes a determinados grupos animais. Exemplos disto são os métodos desenvolvidos por Donne-Gousse et al. (2005 e 2006) que utilizando primers de PCR específicos para identificação de espécies piscícolas.Some patent documents, in addition to using technical approaches other than those described in the present invention, are only intended to identify species belonging to certain animal groups. Examples of these are the methods developed by Donne-Gousse et al. (2005 and 2006) than using specific PCR primers to identify fish species.

Em vários documentos de patente é também referida a utilização do ADN mitocondrial, mas sempre com propósitos não relacionados com a identificação de espécies. Por exemplo, em Tanaka (2003) o propósito da invenção é a identificação de variantes do gene citocromo b; em Morley e Grist (2005) pretende-se a detecção de populações de células aberrantes e sua utilização como marcadores de clonalidade, enquanto o trabalho de Hirai (2005) apenas visa detectar uma mutação pontual no ADN mitocondrial. De referir que em nenhum dos casos se utiliza a determinação e análise do tamanho de fragmentos amplificados do ADN mitocondrial.In several patent documents the use of mitochondrial DNA is also referred to, but always for purposes unrelated to species identification. For example, in Tanaka (2003) the purpose of the invention is the identification of variants of the cytochrome b gene; in Morley and Grist (2005) is intended the detection of aberrant cell populations and their use as clonality markers, while the work of Hirai (2005) is only aimed at detecting a point mutation in mitochondrial DNA. It should be noted that in none of the cases is the determination and analysis of the size of amplified fragments of mitochondrial DNA used.

No sentido da resolução de grande parte dos diferentes problemas inerentes às técnicas anteriormente referidas, é divulgado em seguida um processo de identificação de espécies animais em amostras contendo material genético, baseado na determinação do tamanho de sequências do ADN mitocondrial.In order to solve a large part of the different problems inherent in the above-mentioned techniques, a process of identification of animal species in samples containing genetic material based on the determination of mitochondrial DNA sequence size is disclosed below.

Para além das diferenças de sequência de nucleótidos entre as diferentes espécies animais, existem ainda os polimorfismos "indel" gerados pela inserção ou delecção polimórfica de um ou mais nucleótidos numa sequência de ADN. Este fenómeno ocorre independentemente, nas diferentes espécies, resultando em diferentes tamanhos para regiões homólogas de ADN. Estas 8 diferenças permitem a discriminação e identificação de várias espécies animais.In addition to the differences in the nucleotide sequence between the different animal species, there are also polymorphisms " indel " generated by the polymorphic insertion or deletion of one or more nucleotides in a DNA sequence. This phenomenon occurs independently in different species, resulting in different sizes for homologous regions of DNA. These 8 differences allow discrimination and identification of various animal species.

Está largamente demonstrado que certas regiões da molécula do ADN mitocondrial são caracterizadas por uma taxa de mutação superior à taxa de mutação observada ao longo do ADN nuclear, levando a uma rápida acumulação de diferenças nucleotidicas entre linhagens mitocondriais recentemente separadas (Saccone et al. 2000) . Como já referido, a acumulação de polimorfismos, tanto em regiões do genoma codificantes como em regiões não-codificantes, resulta principalmente de duas classes de alterações ao nivel da cadeia de ADN: substituições de um único nucleótido (SNPs - Single Nucleotide Polymorphism) , ou inclusão/remoção de nucleótidos (indel) .It is widely demonstrated that certain regions of the mitochondrial DNA molecule are characterized by a mutation rate higher than the mutation rate observed along nuclear DNA, leading to a rapid accumulation of nucleotide differences between recently separated mitochondrial lines (Saccone et al., 2000) . As noted above, the accumulation of polymorphisms, both in coding regions of the genome and in non-coding regions, results mainly from two classes of changes at the level of the DNA strand: single nucleotide substitutions (SNPs), or inclusion / removal of nucleotides (indel).

Enquanto que a análise de SNPs é correntemente utilizada numa variedade de estudos desde a genética evolutiva à forense, o uso de polimorfismos indel tem uma aplicação muito mais restrita devido, essencialmente, à sua baixa taxa de mutação.While SNP analysis is commonly used in a variety of studies from evolutionary to forensic genetics, the use of indel polymorphisms has a much narrower application due essentially to its low mutation rate.

Contudo, para o propósito de identificação de espécies, esta taxa de mutação mais lenta constitui uma vantagem, uma vez que diminui a probabilidade de eventos mutacionais recorrentes, bem como de polimorfismos intra-específicos.However, for the purpose of species identification, this slower mutation rate is an advantage, since it reduces the likelihood of recurrent mutational events as well as of intra-specific polymorphisms.

Descrição geral da invenção A presente invenção consiste num processo de genética molecular generalizadamente dirigido à identificação de materiais biológicos de origem animal. Mais especificamente, a presente invenção está direccionada para a identificação 9 das espécies domésticas (bovinos, caprinos, ovinos, porcinos, cães, gatos, ratos, cavalos e coelhos), bem como a detecção da presença de material biológico de origem humana. É mesmo possível a obtenção de resultados em espécies geneticamente afastadas, não pertencentes ao grupo dos mamíferos, como no caso dos galináceos.General description of the invention The present invention is a molecular genetic process generally directed to the identification of biological materials of animal origin. More specifically, the present invention is directed to the identification of domestic species (cattle, goats, sheep, pigs, dogs, cats, rats, horses and rabbits) as well as the detection of the presence of biological material of human origin. It is even possible to obtain results in genetically remote species, not belonging to the mammalian group, as in the case of chickens.

Está largamente demonstrado que certas regiões da molécula do ADN mitocondrial são caracterizadas por uma taxa de mutação superior à taxa de mutação observada ao longo do ADN nuclear, levando a uma rápida acumulação de diferenças nucleotídicas entre linhagens mítocondriais recentemente separadas (Saccone et al. 2000), Como já referido, a acumulação de polimorfismos, tanto em regiões do genoma codificantes como em regiões não-codificantes, resulta principalmente de duas classes de alterações ao nível da cadeia de ADN: substituições de um único nucleótido (SNPs - Single Nucleotide Polymorphisms), ou inclusão/remoção de nucleótidos (polimorfismos indel) . Enquanto que a análise de SNPs é correntemente utilizada numa variedade de estudos desde a genética evolutiva à forense, o uso de polimorfismos indel tem uma aplicação muito mais restrita devido, essencialmente, à sua baixa taxa de mutação. Contudo, para o propósito de identificação de espécies, esta taxa de mutação mais lenta constitui uma vantagem, uma vez que diminui a probabilidade de eventos mutacionais recorrentes, bem como de polimorfismos intra-específicos.It has long been shown that certain regions of the mitochondrial DNA molecule are characterized by a mutation rate higher than the mutation rate observed along nuclear DNA, leading to a rapid accumulation of nucleotide differences between recently separated mytochondrial lines (Saccone et al., 2000) As noted above, the accumulation of polymorphisms in both coding and non-coding regions of the genome results mainly from two classes of DNA-level changes: single nucleotide substitutions (SNPs), single nucleotide polymorphisms (SNPs) or inclusion / removal of nucleotides (indel polymorphisms). While SNP analysis is commonly used in a variety of studies from evolutionary to forensic genetics, the use of indel polymorphisms has a much narrower application due essentially to its low mutation rate. However, for the purpose of species identification, this slower mutation rate is an advantage, since it reduces the likelihood of recurrent mutational events as well as of intra-specific polymorphisms.

Após a determinação da diversidade nucleotídica ao longo de todos os genes mítocondriais, verificou-se a existência de várias regiões ricas em polimorfismos indel nos genes 12s and 16s do rARN, intercaladas com domínios altamente conservados. Foram então seleccionadas as regiões que apresentassem três 10 requisitos: a) o padrão de diversidade nucleotidica acima descrito; b) possibilidade de desenho de primers com idênticas temperaturas de emparelhamento nas regiões conservadas; e c) possibilidade de obtenção de fragmentos de diferentes tamanhos para optimização de amplificação por PCR em multiplex. Finalmente, foram seleccionadas sete regiões que preenchiam estes requisitos. A amplificação de cada um dos sete loci foi testada independentemente em reacções de PCR individuais, utilizando amostras de dez espécies de mamíferos. Todos os loci foram amplificados com sucesso utilizando a mesma temperatura de emparelhamento dos primers (60°C) na reacção de PCR.After determination of nucleotide diversity across all mytochondrial genes, there were several regions rich in indel polymorphisms in rRNA 12s and 16s genes, interspersed with highly conserved domains. Regions with three requirements were then selected: a) the nucleotide diversity pattern described above; b) possibility of designing primers with identical annealing temperatures in the conserved regions; and c) possibility of obtaining fragments of different sizes for multiplex PCR amplification optimization. Finally, seven regions were selected that fulfilled these requirements. Amplification of each of the seven loci was independently tested on individual PCR reactions using samples from ten mammalian species. All loci were successfully amplified using the same annealing temperature of the primers (60øC) in the PCR reaction.

No passo seguinte, e tendo em vista a construção e optimização do PCR em multiplex, todos os primers foram combinados e testados em PCRs com gradientes de temperaturas de emparelhamento de primers (48°C - 64°C). Em todos os casos foram obtidas amplificações positivas, posteriormente confirmadas por electroforese em gel de acrilamida e electroforese capilar automatizada. Estas reacções não apresentaram sinal de amplificação não-específica de outras regiões genómicas, mesmo às mais baixas temperaturas de emparelhamento.In the next step, and in view of the construction and optimization of PCR in multiplex, all primers were combined and tested in PCRs with primer annealing temperature gradients (48 ° C - 64 ° C). In all cases, positive amplifications were obtained, later confirmed by acrylamide gel electrophoresis and automated capillary electrophoresis. These reactions did not show nonspecific amplification signal from other genomic regions, even at the lowest annealing temperatures.

As reacções seguintes foram então efectuadas recorrendo a dois ciclos de amplificação com baixas temperaturas de emparelhamento dos primers de forma a obter amplificação eficiente mesmo nos casos de análise de amostras degradadas.The following reactions were then performed using two annealing cycles with low primer annealing temperatures in order to obtain efficient amplification even in the case of degraded sample analysis.

Tendo em conta que a ausência de polimorfismos indel intra-específicos é essencial para a aplicação deste multiplex à identificação de espécies, os sete loci foram testados em 11 vários indivíduos de cada espécie-alvo. Todos os loci apresentaram o mesmo tamanho dentro de cada espécie, revelando a ausência de polimorfismos indel intra- específicos. Estes resultados foram posteriormente confirmados com o uso de escalas alélicas. 0 desenho dos primers dentro de regiões altamente conservadas do genoma mitocondrial potência a possibilidade de obtenção de amplificações positivas em espécies filogeneticamente afastadas com este multiplex. Para testar preliminarmente a sua aplicabilidade a grupos animais não-mamíferos, foi analisada a galinha doméstica (Gallus gallus, n=3). Alguns fragmentos foram amplificados com sucesso, apresentando um padrão muito distinto dos padrões apresentados pelos mamíferos, permitindo discriminar esta espécie entre as restantes espécies analisadas.Taking into account that the absence of intra-specific indel polymorphisms is essential for the application of this multiplex to species identification, the seven loci were tested on 11 several individuals of each target species. All loci presented the same size within each species, revealing the absence of intra-specific indel polymorphisms. These results were later confirmed with the use of allelic scales. The design of the primers within highly conserved regions of the mitochondrial genome potentiates the possibility of obtaining positive amplifications in phylogenetically distanced species with this multiplex. To preliminarily test its applicability to non-mammalian animal groups, the domestic chicken (Gallus gallus, n = 3) was analyzed. Some fragments were successfully amplified, presenting a pattern very different from the patterns presented by the mammals, allowing to discriminate this species among the other species analyzed.

Desta forma, destacam-se as principais diferenças entre a presente invenção e os métodos descritos no estado da técnica para a identificação de espécies: A discriminação molecular entre espécies utilizando polimorfismos indel em genes mitocondriais; A análise simultânea de sete regiões mitocondriais informativas com polimorfismos indel; - A amplificação por PCR em multiplex para análise simultânea de sete regiões informativas com polimorfismos indel; - A determinação de polimorfismos indel por electroforese capilar automática, electroforese de gel desnaturante, sequenciação, pirosequenciação, digestão enzimática, análise 12 de circuitos de moléculas de ADN quimicamente ligadas a superfícies sólidas (microarray), cromatografia líquida desnaturante de elevada performance (dHLPC) ou outra técnica afim. - A não-necessidade de utilizar anticorpos, sondas de ADN, enzimas de restrição, primers de PCR com sequências aleatórias e/ou reacções de sequenciação do ADN. A presente invenção tem como principais aplicações: 1. Aplicações forenses A aplicabilidade deste multiplex na determinação da origem humana ou não-humana de um material biológico torna-o bastante útil em diversas situações forenses, nomeadamente na análise de vestígios de origem animal desconhecida, mesmo quando se encontram em elevado grau de decomposição. A rapidez, eficácia e baixo custo da utilização deste método fazem dele uma ferramenta eficaz na análise de amostras em larga escala, por exemplo em situações de desastres de massas, tais como acidentes naturais ou atentados terroristas. É igualmente aplicável na análise post-mortem de conteúdos estomacais de vítimas mortais ou na resolução de disputas legais ou questões criminais envolvendo animais. 2. Aplicações na indústria alimentarIn this way, the main differences between the present invention and the methods described in the state of the art for identifying species are highlighted: Molecular discrimination between species using indel polymorphisms in mitochondrial genes; Simultaneous analysis of seven informative mitochondrial regions with indel polymorphisms; - Multiplex PCR amplification for the simultaneous analysis of seven informative regions with indel polymorphisms; The determination of indel polymorphisms by automatic capillary electrophoresis, denaturing gel electrophoresis, sequencing, pyosequencing, enzymatic digestion, circuit analysis of chemically bound solid surface DNA (microarray), high performance denaturing liquid chromatography (dHLPC) or another related technique. The non-necessity of using antibodies, DNA probes, restriction enzymes, PCR primers with random sequences and / or DNA sequencing reactions. The present invention has as main applications: 1. Forensic applications The applicability of this multiplex in the determination of the human or non-human origin of a biological material makes it very useful in several forensic situations, namely in the analysis of traces of unknown animal origin, even when they are in a high degree of decomposition. The rapidity, effectiveness and low cost of using this method make it an effective tool in the analysis of large scale samples, for example in situations of mass disasters, such as natural accidents or terrorist attacks. It is equally applicable in the post-mortem analysis of stomach contents of victims or in the resolution of legal disputes or criminal matters involving animals. 2. Applications in the food industry

A indústria alimentar tem vindo a assumir cada vez mais a importância da opinião pública nas questões da segurança alimentar, dado o crescente interesse dos consumidores por produtos de qualidade devidamente certificados. A versatilidade deste método e sua potencial aplicação à escala 13 industrial poderá permitir a correcta identificação das espécies presentes numa grande variedade de alimentos processados como, por exemplo, enlatados, enchidos e produtos lácteos, detectando assim possíveis fraudes. As indústrias de produção de rações para animais, por exemplo, sujeitas a forte legislação proibindo a presença de derivados de certas espécies, poderão ter também grande interesse nesta tecnologia para garantir a conformidade dos seus produtos. 3. Estudos de ecologia e arqueologia A identificação da espécie de origem em materiais biológicos como ossadas, fezes ou pêlos em estudos de zoo-arqueologia ou ecologia pode ser efectuada com este novo método.The food industry has increasingly taken on the importance of public opinion on food safety issues, given the growing consumer interest in duly certified quality products. The versatility of this method and its potential application to the industrial scale may allow the correct identification of the species present in a wide variety of processed foods, such as canned goods, sausages and dairy products, thus detecting possible fraud. Animal feed industries, for example, subject to strong legislation banning the presence of derivatives of certain species, may also have a strong interest in this technology to ensure the conformity of their products. 3. Ecology and archeology studies The identification of the species of origin in biological materials such as bones, faeces or hair in zoo-archeology or ecology studies can be carried out with this new method.

As principais vantagens da presente invenção são: - A utilização do ADN mitocondrial, cuja abundância relativa ao ADN nuclear permite a obtenção de resultados mesmo em amostras degradadas, com pouco ADN total e/ou ADN fragmentado; - A análise de regiões pequenas do ADN mitocondrial (quatro regiões com menos de 300 pares de bases) que aumentam o sucesso da amplificação, aspecto especialmente importante na análise de amostras degradadas, com pouco ADN total e/ou ADN fragmentado; - A utilização de primers de PCR desenhados para regiões do ADN altamente conservadas nos mamíferos permite a aplicação deste método à identificação de várias espécies; 14 - Grande poder de resolução e baixa probabilidade de obtenção de resultados nulos pelo facto dado ser baseada na análise de sete marcadores informativos; - A optimização do PCR em multiplex permite efectuar a amplificação dos sete loci numa única reacção, permitindo rapidez e baixo custo por amostra; - A sua aplicabilidade na análise de amostras com mistura de materiais biológicos de diferentes espécies, dado que a separação por tamanho de fragmento permite a leitura e interpretação dos amplificados. Esta resolução é impossível recorrendo a métodos baseados em sequenciação de ADN; - A utilização de primers de PCR marcados com fluorescência permite a determinação do tamanho dos fragmentos por electroforese capilar automática; este aspecto possibilita grande rapidez, eficácia e baixo custo no processamento de amostras, principalmente em larga escala; - A possibilidade de uma análise quantitativa da mistura (para além da análise qualitativa) por comparação relativa entre as áreas dos picos correspondentes aos fragmentos das diferentes espécies presentes na mistura. Este aspecto permite, por exemplo, determinar os níveis de contaminação de uma amostra com materiais provenientes de outra espécie. 15The main advantages of the present invention are: The use of mitochondrial DNA, whose abundance relative to nuclear DNA allows results to be obtained even in degraded samples with little total DNA and / or fragmented DNA; - Analysis of small regions of mitochondrial DNA (four regions less than 300 base pairs) that increase the success of amplification, a particularly important aspect in the analysis of degraded samples with little total DNA and / or fragmented DNA; - The use of PCR primers designed for highly conserved DNA regions in mammals allows the application of this method to the identification of several species; 14 - Great power of resolution and low probability of obtaining zero results because it is based on the analysis of seven informational markers; - Optimization of multiplex PCR allows amplification of the seven loci in a single reaction, allowing quick and low cost per sample; - Its applicability in the analysis of samples with mixing of biological materials of different species, since the separation by size of fragment allows the reading and interpretation of the amplified ones. This resolution is impossible using methods based on DNA sequencing; - The use of fluorescently labeled PCR primers allows the determination of fragment size by automatic capillary electrophoresis; this aspect allows great speed, efficiency and low cost in the processing of samples, mainly in large scale; - The possibility of a quantitative analysis of the mixture (in addition to the qualitative analysis) by relative comparison between the areas of the peaks corresponding to the fragments of the different species present in the mixture. This allows, for example, to determine the levels of contamination of a sample with materials from another species. 15

Descrição detalhada da invenção 1. Análise das sequências de referência do ADN mitocondrial dos mamíferosDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION 1. Analysis of mammalian mitochondrial DNA reference sequences

Foi necessário identificar as regiões ricas em polimorfismos indel (responsáveis pelas diferenças de tamanho de sequências entre espécies) intercaladas com regiões altamente conservadas (idênticas entre as espécies e adequadas ao desenho de primers). Para este efeito, foram utilizadas diversas ferramentas informáticas na análise de todas as sequências de ADN de referência de mamíferos disponíveis em bases de dados públicas (123 espécies; Pereira et al 2003). As sequências foram alinhadas utilizando o programa Clustal W (Thompson et al. 1994) e distinguiram-se as regiões polimórficas das regiões conservadas com o programa DNAsp ver.4.10.2 (Rozas et al. 2003).It was necessary to identify regions rich in indel polymorphisms (responsible for differences in sequence sizes between species) interspersed with highly conserved regions (identical among species and suitable for primer design). For this purpose, several computer tools were used in the analysis of all mammalian reference DNA sequences available in public databases (123 species; Pereira et al 2003). The sequences were aligned using the Clustal W program (Thompson et al., 1994) and the polymorphic regions of the conserved regions were distinguished with the program DNAsp ver.4.10.2 (Rozas et al., 2003).

2. Desenho de primers de PCR2. Design of PCR primers

Os primers para PCR foram desenhados em regiões conservadas dos genes 12s e 16s do rARN do ADN mitocondrial, com base no alinhamento das sequências de referência das espécies-alvo. Foram desenhados primers com temperaturas de emparelhamento idênticas de forma a obter equilíbrio entre produtos amplificados na reacção de PCR em multiplex. Foi testada e excluída a possibilidade de formação de estruturas secundárias, bem como a formação de dímeros entre primers, por análise com o programa Oligo Calculator versão 3.07 (versão 3.07 URL: http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html).PCR primers were designed in conserved regions of the mitochondrial DNA rRNA 12s and 16s genes, based on the alignment of the reference sequences of the target species. Primers with identical annealing temperatures were designed in order to achieve equilibrium between amplified products in the multiplex PCR reaction. The possibility of formation of secondary structures, as well as the formation of dimers between primers, was tested and excluded by analysis with the program Oligo Calculator version 3.07 (version 3.07 URL: http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc .html).

As possíveis interacções entre todos os primers foram 16 testadas utilizando o programa AutoDimer versão 1.0 (Vallone e Butler 2004).The possible interactions between all the primers were 16 tested using the program AutoDimer version 1.0 (Vallone and Butler 2004).

Foram desenhados primers degenerados para alguns dos loci de forma a minimizar não-amplificações devidas a polimorfismos inter-especificos nos locais de emparelhamento. Para detecção dos produtos amplificados por fluorescência, alguns primers foram marcados na extremidade 5' com 6-Carboxifluoresceina (6-FAM), 6-Carboxi-2'-, 4-, 7-, 7'-tetraclorofluoresceina (TET) e 6-Carboxi-2' 4-, 4'-, 5'-, 7-, 7'- hexaclorofluoresceina (HEX). Todos os primers foram adquiridos à Thermo Electron Corp. (Waltham, MA, USA) com purificação por Reversed Phase HPLC.Degenerate primers were designed for some of the loci in order to minimize non-amplifications due to inter-specific polymorphisms at the annealing sites. For detection of the fluorescence amplified products, some primers were labeled at the 5 'end with 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 6-Carboxy-2', 4,7-, 7'-tetrachlorofluorescein (TET), and 6- Carboxy-2 ', 4', 5'-, 7 ', 7'-hexachlorofluorescein (HEX). All primers were purchased from Thermo Electron Corp. (Waltham, MA, USA) with purification by Reversed Phase HPLC.

3. Recolha de amostras e extracção do ADN3. Collection of samples and extraction of DNA

Com o objectivo de verificar a variabilidade intra-especifica presente nas dez espécies-alvo foram colhidas amostras num total de 84 indivíduos pertencentes às espécies: gato (Felis catus, n=10), vaca (Bos taurus, n=6), cão (Canis familiaris, n=10), cabra (Capra hircus, n=10), cavalo (Equus caballus, n=2), rato (Mus musculus, n=10), porco (Sus scrofa, n=6) , coelho (Oryctolagus cuniculus, n=10), ovelha (Ovis aríes, n=10), e humano (Homo sapíens, n=10) . Para além dos mamíferos, foi amostrada ainda uma espécie avícola (Gallus gallus, n=3/) . 0 ADN total foi extraído a partir de manchas de sangue recolhidas em cartões FTA® (Whatman, Clifton, NJ, USA), esfregaços bucais, tecidos musculares e fígado, utilizando protocolos de extracção para métodos Chelex (Biorad, Hercules, CA), fenol/clorofórmio e salino, respectivamente. 17 4. Condições de reacção do PCR em multiplexIn order to verify the intra-specific variability present in the ten target species, a total of 84 individuals belonging to the species: cat (Felis catus, n = 10), cow (Bos taurus, n = 6), dog (Musculus n = 10), pig (Sus scrofa, n = 6), rabbit (Capra hircus, n = 10), horse (Equus caballus, n = 2) Oryctolagus cuniculus, n = 10), sheep (Ovis aríes, n = 10), and human (Homo sapiens, n = 10). In addition to the mammals, a poultry species (Gallus gallus, n = 3 /) was also sampled. Total DNA was extracted from blood spots collected on FTA® cards (Whatman, Clifton, NJ, USA), buccal smears, muscle tissues and liver, using extraction protocols for Chelex methods (Biorad, Hercules, CA), phenol / chloroform and saline, respectively. 17 4. Multiplex PCR reaction conditions

Cada par de primers para cada locus foi inicialmente testado em reacções independentes de PCR (PCR em singleplex) de forma a avaliar a especificidade de amplificação. Foram utilizados 2 μΐ de ADN extraído em 12,5 μΐ de volume total de reacção contendo 1,25 μΐ de 10X tampão de PCR, 0,25 μΐ dos quatro dNTPs (0.2 mM cada), 1,0 μΐ de MgCl2 (25 mM), 1,25 μΐ de cada primer (2,5 μΜ) e 0,1 μΐ de Taq polymerase (BIORON GmbH). Após pré-incubação de 2 minutos a 95°C, as reacções de PCR foram realizadas num total de 35 ciclos nas seguintes condições: desnaturação a 95°C durante 30 segundos, emparelhamento a 60°C durante 30 segundos, e extensão a 72°C durante 1 minuto, com uma extensão final de 10 minutos a 72 °C.Each primer pair for each locus was initially tested on independent PCR reactions (singleplex PCR) in order to evaluate the amplification specificity. 2 μΐ of extracted DNA was used in 12.5 μl of total reaction volume containing 1.25 μl of 10X PCR buffer, 0.25 μ of the four dNTPs (0.2 mM each), 1.0 μg of MgCl 2 (25 mM ), 1.25 μ of each primer (2.5 μ) and 0.1 μ of Taq polymerase (BIORON GmbH). After 2 minutes preincubation at 95øC, PCR reactions were performed for a total of 35 cycles under the following conditions: denaturation at 95øC for 30 seconds, annealing at 60øC for 30 seconds, and extension at 72ø C for 1 minute, with a final extension of 10 minutes at 72 ° C.

As reacções de PCR em multiplex foram realizadas combinando 2 μΐ de ADN extraído, 1 μΐ de uma mistura de primers (2 μΜ de cada primer) e 5 μΐ de Multiplex PCR Master Mix (QIAGEN) para um volume total de 10 μΐ. As condições da reacção foram as seguintes: desnaturação inicial a 95°C durante 15 minutos, seguida de 10 ciclos de 30 segundos a 94°C, 1 minuto e 30 segundos a 50°C, e 1 minuto a 72°C e 20 ciclos de 30 segundos a 94°C, 1 minuto e 30 segundos a 48°C, e 1 minuto a 72°C, com uma extensão final de 50 minutos a 72°C. 5. Construção da escala alélicaMultiplex PCR reactions were performed by combining 2 μΐ of extracted DNA, 1 μΐ of a primer mix (2 μΜ of each primer) and 5 μΐ Multiplex PCR Master Mix (QIAGEN) for a total volume of 10 μΐ. The reaction conditions were as follows: initial denaturation at 95 ° C for 15 minutes, followed by 10 cycles of 30 seconds at 94 ° C, 1 minute and 30 seconds at 50 ° C, and 1 minute at 72 ° C and 20 cycles 30 seconds at 94 ° C, 1 minute and 30 seconds at 48 ° C, and 1 minute at 72 ° C, with a final extension of 50 minutes at 72 ° C. 5. Construction of the allele scale

Os produtos amplificados de cada um dos alelos detectados foram combinados e a sua concentração optimizada nas soluções finais, tendo sido assim obtidas escalas específicas para cada locus. 18The amplified products of each of the detected alleles were combined and their concentration optimized in the final solutions, thus obtaining scales specific for each locus. 18

6. Determinação do tamanho dos fragmentos de ADN amplificados por PCR6. Determination of the size of PCR-amplified DNA fragments

Os fragmentos amplificados foram preparados para determinação do seu tamanho por electroforese capilar automatizada por adição de 1 pL do produto de PCR a 15 pL de formamida desionizada com 0,75 pL de GeneScan™ 500 TAMRA size- Standard. A separação e detecção dos produtos foram realizadas com o ABI Prism™ 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando filtro C para marcações fluorescentes 6-FAM, TET e HEX. A determinação do tamanho dos fragmentos foi realizada com o GeneScan™ 350 TAMRA size-standard no software ABI Prism™ GeneScan™ v3.1.2 (Applied Biosystems). 7. Identificação das espécies: A identificação das espécies é feita comparando o resultado obtido na electroforese automática de capilar, electroforese de gel desnaturante, sequenciação, pirosequenciação, digestão enzimática, análise por circuitos de moléculas de ADN quimicamente ligadas a superfícies sólidas (microarray), cromatografia líquida desnaturante de elevada performance (dHLPC) ou outra técnica afim, ou seja o tamanho dos fragmentos amplificados, com o previamente determinado para cada espécie, também por electroforese capilar automatizada, conseguidos através de um estudo populacional com vários indivíduos de forma a obter os valores padrão para cada espécie. 19Amplified fragments were prepared for size determination by automated capillary electrophoresis by addition of 1 pL of the PCR product to 15 pL of deionized formamide with 0.75 pL of GeneScan ™ 500 TAMRA size-Standard. Separation and detection of the products were performed with the ABI Prismâ "¢ 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA) using C-filter for 6-FAM, TET and HEX fluorescent labels. Fragment size determination was performed with the GeneScan ™ 350 TAMRA size-standard in ABI Prism ™ GeneScan ™ v3.1.2 software (Applied Biosystems). 7. Identification of species: Identification of species is done by comparing the results obtained in automatic capillary electrophoresis, denaturing gel electrophoresis, sequencing, pyosequencing, enzymatic digestion, circuit analysis of DNA molecules chemically bound to solid surfaces (microarray), high performance denaturing liquid chromatography (dHLPC) or other related technique, ie the size of the amplified fragments, previously determined for each species, also by automated capillary electrophoresis, achieved through a population study with several individuals to obtain the values for each species. 19

DefiniçõesDefinitions

As seguintes definições servem para auxiliar um claro e consistente entendimento do âmbito e detalhe dos seguintes termos, usados para descrever e definir a presente invenção:The following definitions serve to assist a clear and consistent understanding of the scope and detail of the following terms used to describe and define the present invention:

Alelo: Uma de duas ou mais possíveis formas alternativas de um gene ou sequência específica de ADN que ocupa o mesmo locus. ADN mitocondrial: ADN extra-nuclear, presente nas mitocôndrias, organelos citoplasmáticos dos eucaríotas em número de cópias várias ordens de grandeza superior ao ADN nuclear.Allele: One of two or more possible alternative forms of a specific gene or sequence of DNA occupying the same locus. Mitochondrial DNA: extra-nuclear DNA, present in mitochondria, cytoplasmic organelles of eukaryotes in number of copies several orders of magnitude higher than nuclear DNA.

Electroforese e métodos electroforéticos: métodos de separação de macromoléculas (ADN ou proteínas) com base na diferença de tamanho, carga eléctrica e/ou outra propriedade física.Electrophoresis and electrophoretic methods: methods of separation of macromolecules (DNA or proteins) based on the difference in size, electric charge and / or other physical property.

Escala alélica: marcador molecular de tamanho padrão comportando diferentes alelos amplificados em cada locus.Allele Scale: Standard size molecular marker containing different amplified alleles at each locus.

Indel: Inserção ou delecçâo polimórfica de um ou mais nucleótidos numa sequência de ADN.Indel: Polymorphic insertion or deletion of one or more nucleotides in a DNA sequence.

Polimorfismo de ADN: A presença de duas ou mais sequências nucleotídicas de um gene ou outra região de ADN para o mesmo locus numa população.DNA polymorphism: The presence of two or more nucleotide sequences from one gene or another region of DNA for the same locus in a population.

Locus (plural loci): Localização específica de uma sequência de ADN num genoma. 20 PCR (Polimerase Chain Reactiorí) , reacção em cadeia da polimerase: técnica em que ciclos de desnaturação, emparelhamento de primers e extensão com a polimerase do ADN permitem amplificar exponencialmente o número de cópias de uma região-alvo de ADN.Locus (plural loci): Specific localization of a DNA sequence in a genome. PCR (Chain Reactiori Polymerase), polymerase chain reaction: technique where cycles of denaturation, primer annealing, and extension with the DNA polymerase allow exponentially amplifying the copy number of a DNA target region.

Primer: um oligonucleótido de ADN de cadeia simples que hibridiza com a cadeia de ADN de determinado locus de forma a actuar como lugar de inicialização da actividade da polimerase do ADN no PCR. A região a amplificar é delimitada por um par de primers.Primer: a single-stranded DNA oligonucleotide that hybridizes to the DNA strand of a given locus in order to act as the initiation site for DNA polymerase activity in the PCR. The region to be amplified is delimited by a pair of primers.

Multiplex PCR: técnica de PCR que permite amplificar em simultâneo numa única reacção várias sequências de ADN com diferentes localizações no genoma.Multiplex PCR: A PCR technique that allows simultaneous amplification in a single reaction of several DNA sequences with different locations in the genome.

Sequenciação de ADN: técnica molecular que consiste determinação da ordem exacta dos nucleótidos de uma região da cadeia de ADN.DNA Sequencing: A molecular technique that consists of determining the exact order of nucleotides in a region of the DNA strand.

Regiões (de ADN) homólogas: regiões de ADN comparáveis entre diferentes espécies por partilharem um ancestral comum. SNP (Single Nucleotide Polymorphism): polimorfismo devido à substituição ou inserção/delecção de uma base do ADN. 21Homologous (DNA) regions: DNA regions comparable between different species by sharing a common ancestor. SNP (Single Nucleotide Polymorphism): polymorphism due to substitution or insertion / deletion of a DNA base. 21

ReferênciasReferences

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Vallone, P.M. and Butler, J.M., 2004. AutoDimer: a screening tool for primer-dimer and hairpin structures. Biotechniques, 37 (2): 226-231.Vallone, P.M. and Butler, J.M., 2004. AutoDimer: the screening tool for primer-dimer and hairpin structures. Biotechniques, 37 (2): 226-231.

Wolf, C., Rentsch, J., and Hubner, P., 1999. PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: a reliable method for species Identification. J. Agric. Food Chem., 47(4): 1350-1355. 24Wolf, C., Rentsch, J., and Hubner, P., 1999. PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: a reliable method for species identification. J. Agric. Food Chem., 47 (4): 1350-1355. 24

Zehner,R., Zimmermann,S., and Mebs,D., 1998. RFLP and sequence analysis of the cytochrome b gene of selected animais and man: methodology and forensic application. Int. J. Legal Med., 111(6): 323-327.Zehner, R., Zimmermann, S., And Mebs, D., 1998. RFLP and sequence analysis of the cytochrome b gene of selected animals and man: methodology and forensic application. Int. J. Legal Med., 111 (6): 323-327.

Lisboa, 2 de Fevereiro de 2007Lisbon, February 2, 2007

Claims (1)

mwimicMpàm PP aapaèâPpaa detecçao -:· a&is, caraet«rí psslo £&cto de . c -:x ç ·- o CirG V.: p *'·.·' C a ;.e oa gia: :pC aeaapp: aa: Gaaa-ar eae: aaa a-a i.ara.ae hc· : ·. , a caa AV.ps ra.aa i a aat^aa: "ie ' a ^q-r·, ·; 's^À li. T; X',; /delecea de aã:aJ.ao3. acaaa aaT: α··ν;'ίΡ;?. Ç ,á 3^ ·.' .... áaaauce e C.v; vaaaaa G i 0 :Gi: \-.,L G a, * .- G.íG-: i.G -G-;G ·d.: ddie .· ; de: deter Gd.. :':Áí.Çgi\3 C;0 apaaaraa ,:e aai a eren ees 'aaaa.Gâaa a:a3 a: aarao aoadraa.: a ii:saARG a 1 a a a aa, e f p;a a a? a: t a a: aea - 3- e 'C: >.v í a:ea Pi :> PU :a Í- ,v-, G ÍG G 0 G .0 G V X ."á C C .,· 0. β :.:;satae jaaiavaaia .· e a-a aP i a a a a: a. a: a a; :a ρ a; a a aa a:; peio iiaaaa:a aaa aka a a:aga:i »·;;; P·· ί, ρ! 0Γ;;··:.C i 3;: Õt 1 :"tO λ :3pG >' .i^-vidc· C .oaa::· .eaic i.ad or ia G:i . ' :c:cac;g;g; :AA:'-\C-:;U."CA ·"· '3: ?' í .· ,-v . %; ,·- · .-·' ,'· N ' ·' ·.··. .. v ; ;·, -s .-.Ν·,.·. >· ·'. s. s-· v'v v· · .· G V;.· \VG>:,'-àá ··.... G Gi’..·' CG ,· XG..ÃÂGG b ATGCGGCA ai CCCGACGGGAGeCAGCAGaf ; / >. .•••'.’Ν’λ >'*. ·'· ,Λ,.^ « ,\ ,-·λ .·«,..... >· v. > ·>λ .·--· · ν ο a p'..aaa aaaaa.· a.aaaae.j·... ν ·..Λ;'·.Ρ·... .i. ·..':: ; a \a-a .l aae....; aa-a.íi;.:G.a..n.a.-.ay,; , ..P :.;;,ji.ííifcÃAft.: ;auí ifk.fP j ,· ,·' .·”· .··' .· ··' λ ,-"· -í. '··> :·;. \“>,···> ,··· ···· 'Λ .·'*· ·.·· e\ar; ·λ«' ·~\ ··; ,v s :q ,% ,···\··^''μ .,--% %' ,·'· .·'· .·" p> ,-v -'s ν\-: ----3:-:- - ,-- · .· v: νΛτΛ ν.Α/τν.·'·,· I .piG.dia á λ \.· λ \,·.· ν.ν-.,ν Λ \τ λ \·> Λ iv ν ΤΑΑ GT i>3: GCidi 'gÀG/V apa .GGT' aaa ::ρ··ν sl v· TTCG • GV.G .CG a· b-P· GG GCCC :;??> *:? ·"· G dP G GV .··' a, . • GGi' GTT G G· bi Ga ^ ,···. ,·λ : CGAT: :.G GGT' •' 33 V,· v '..gggVg \·'· ':p"aa ·' f d' GG"iGGGC.GTGCGGGGiiGGa G 31 ; 5f GGCCTAMAGCAGCCACCMX3'ν , ; < d' !.Λ·Í.;fc:,:i v1Ρ,,Λ.·\3..Ρ\3,νΛ.. a' , a v a1 aàP..de.:aaGapXe,yae3i'aGaaG.aP , £f G G A A T T T C C T G G 0 T C T G C 3 · ; o) analisii: a.:aaaauâT:aa ada dai:eeenaa;a ragicea iravorpativas aaa :: l':': .aa x a ο ο ο π a. a i s .a e x a a a a a x a a aa' va.a.:,aa a a a a::a: ,· o qaa paarPiata: arecauaaq aea aipaiaGrjao, aaaa dstecçào amwimicMpàm PP aapaèâPpaa detection -: · a & caraet «rí psslo £ & ampto de. c -: x ç · - o CirG V .: p * '·. ·' C a;. e o gia:: pC aeaapp: aa: Gaaa-ar eae: aaa a-a i.ara.ae hc ·: ·. , caa AV.ps ra.aa i a aat ^ aa: " ie 'a ^ q-r ·, ·; 's ^ There. T; X ',; delecea de aã: aJ.ao3. acaaa aaT: α ·· ν; 'ίΡ;?. Ç, á 3 ^ ·. ' .... áaaauce and C.v; vaaaaa G0: Gi: \ -., LGa, * .- G.iG-: i.G -G-; G · d .: ddie. from: hold Gd ..: ': Áí.Çgi \ 3 C; 0 apaaaraa,: eai a eren ees' aaaa.Gâaa a: a3 a: aarao aoadraa .: a ii: saARG a 1 aaa aa, efp; aaa ? a: t a a: aea - 3- e 'C: > .v ia: ea Pi: > PU: a-, v-, G IG G 0 G .0 G V X. &Quot; á C C., · 0. β:.:; Satae jaaiavaaia. · And a-a a p a a a a: a. a: a a; : a ρ a; aa aa aa :; by iiaaaa: a aaa aka a: aga: i »· ;; P ·· ί, ρ! 0Γ ;; ··: .C i 3 ;: Õt 1: " tO λ: 3pG > ' .i ^ -vidc · C .oaa :: · .eaic i.ad or ia G: i. ': c: cac; g; g; : AA: '- \ C - :; U. " CA · " ·' 3:? ' í. ·, -v. %; , · - · .- · ',' · N '·' ·. ··. .. v; ; ·, -S .-. Ν ·,. ·. > · · '. s. s- · v'v v · ·. · G V;. · \ VG >:, '- á ·· .... G Gi ’.. ·' CG, · XG..ÃÂGG b ATGCGGCA ai CCCGACGGGAGeCAGCAGaf; / >. . ••• '. ’Ν’λ >' *. · '·, Λ,. ^ «, \, - · λ. ·«, ..... > · v. > · ≫ λ. · - · · ν ο a p '.. aaa aaaaa. · A.aaaae.j · ... ν · ..Λ;' · .Ρ · ... .i. · .. '::; a \ a-a .l aae ....; aa-a.ii;.: G.a..n.a .-. ay ,; , ..P:. ;;, ji.ííifcÃAft .:; auí ifk.fP j, ·, · '. · ”·. ··'. · ·· 'λ, - " · -í. '·· > : · ;. \ "≫, ··· > , ··· ···· 'Λ. ·' * · ·. ·· e \ ar; · Λ «'· ~ \ ··; , v s: q,%, ··· \ ·· ^ '' μ., -%% ', ·' ·. · '·. · " p > , -v -'s ν \ -: ---- 3: -: - -, - ·. · v: νΛτΛ ν.Α / τν. · '·, · I .piG.day to λ \. · λ \, ·. · ν.ν -., ν Λ \ τ λ \ · > Λ iv ν ΤΑΑ GT i > 3: GCidi 'gÀG / V apa .GGT' aaa :: ρ ·· ν sl v · TTCG • GV.G .CG a · b-P · GG GCCC:; ?? > * :? · &Quot; · G dP G GV. ·· 'a,. • GGi 'GTT G G · bi Ga ^, ···. , · Λ: CGAT:: .G GGT '•' 33 V, · v '..gggVg \ ·' · ': p' aa · 'f d' GG 'iGGGC.GTGCGGGGiiGGa G 31; 5f GGCCTAMAGCAGCCACCMX3 '; < d '! .Λ · Í.; fc:,: i v1Ρ ,, Λ. · \ 3..Ρ \ 3, νΛ .. a', av a1 aàP..de: aaGapXe, yae3i'aGaaG.aP, GGAATTTCCTGG 0 TCTGC 3 ·; o) analyzeii: a.aaaauâT:aa ada dai: eeenaa; a ragicea iravorpativas aaa :: l ':': .aa x a ο ο ο π a. aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa, pa ra caraetexisado pelo facto de o deaer-co dos i rd ciado;'ea, dCR,· «dd rdd.j. .1 dd.dC· d:’S rddlddS COOSftrVdd:;.5S dod dddSO ;d áex cio r.?·RN αο ADN xa.lixocarxdr a-asa ,c«ra st: r.i..aarxxaaxa;xa o Paaeasao d·:: áetecçCio e i áex: iax f i.cx;ç:áo ticlecauar da eapécies a.a.Pasi:a, sUa acordo caax 3 reiaj.ndicaçdo i; eereeterarado por X:C ;:: X X:OX :XX: X Ο XXX .X XX: XX.:: X X::: X X: X X’’ X \:: X. XX X X O XXX: :/ . . X:. .X XXX: XXX: X ..XXX X: X’;.X >··;:; ·· ·: : .d · i r da aepéaras Γ.'· νθ ic t e 5... ta .s :P's/ : ./* :t':P :r •N,··., V ·-v a !v .o·. a iuoreeoeir?a toro ti acre a? casa ria ? .... ; ... :' >' ' .d & l Ç.-:: .-. ;ϊ • pi p. ara;ariaaeaa a: ca da.gaea.rai dos ··, aipi x. iates coar aba a i la iça.se •‘^díd -leasir de d. a:· .a aie saax-Pssi.aa? •ae asar a ri etea se a: d.o tape PC a ler aie ca? aa? sai ca? •a e arrear i ores $>a·: •dxx tatac PCP da Niooroeoêncáa-iCxacaaxaps de daáaaçda crrrctorirado por - V " ..-.: X -X1.. : ,:. .:. " ,· 4 ' . CC . : sp xaxr a x asaaea Pa ca? ataca? aio dadxaiccic o a a. ca; a ΐ a. i: à c c c a o ao i e c ia a atirai a, da acara c a ca c a t e i. o i. e ai .a a? a a d oaraotorirido por a ráacçáo da d CP. oa.iiisadá real típicas > ί'ΓΟ'' '^^ :Ç:'Ç ;‘C gp .· O .iV Cd O saiiasaUo da caraotoriradc s a o xx le o a ex.. . Processo de daa:ac:çso a id ::int .1 í i -. d:P Ç d 0 :pO ,:.ed'i.) Cãi d aie ta? sn icaai s, da a cor alo ess?? í;:. ί> Γ w .1 V 1. Π a'i j C -ei C 0 ã> aaxt: e r coroo t-er Is ado por a construção da asaxale oléx. .acs ser recai, is aci a. Ce totrua xeaoeclá laxe. cara estia iocvs, -atrairás ala oosibinaçâo dor orodutoç carcal a.í ioadox> iatraaéa da irá arar:: a a; de PCb; ' a par ara da C;iiC<:í UbX 'ΪΟΧ X 0$ v Gb G’C a- X: P\X G ç ‘1: G G-UG ccdeoéa t caçoa Opt. X ;b X X'i GXX G .O.i,:; 6 G G X X; Ç ;XG X!· Λ. X ; G X. G s •Ί turooaso da r ia ta ca; Pr a ioarc;dficeçao ruateaola r ae eapaoiea G.:X XXu.-it X. G.j. ΊΧβ acar do oca aa reialudicações anieria res, «au?*« t»ri s«4o por c oaaaraaaaaa oa eatprrctaa paases; ::X ; Kecoiaa a a as- b! uuauecçao ao . DDd a;; XUbGG;bG: XX XX XGXGGi tXXXX pGGG GXX:X i-λ G:G X c: Itiandâdicacap baa raaca a r r ca a em ;ao 1 iroa ri r saos .rrue I i π d e raiai o ci a s com ac aibaa aiiamerte consertadas b) Da a a rd; o ria ra '’ ’’ v '"' .rea de RCR; G- ; Ra a li. d aoâo ao a\.· Dl v ta :-Oi':c; t- CbbO Citi aaaai ,u 3 3 j 3 a; 3 Lu3o..cUò)b bb r 11. a a cca '·’:·* ·· c::J : : ;t· d· b be.d h;.ab x;^ ’ a. <b. :'Xiiri': d. ;G •d , }/ X G.G X: G X; X; GxG X jGbXG· C G ;X 0 -G ΓΧ'ΧΧη tb OXU.GXb d e a speci.es a 0..:.¾¾1 .a.. ora :X C C :X:b 0 cau a ;;e i tdndiouçbo :b: Π teri.or. caracterisado pwl 'X: XX d.;XX ori rao recolt abra, OaartaU: X;;' !u •ar; ar r.e t bi.oi.6o.tco, c;a par a.;. cu r. a r .cbb. la Fraca coo de t rareeçao e .identificação colecru ar ãGb ti' cpétrr es aclarar, a, ae acordo c .00 a a rara radicayõea n, t: 12, cara ateres: bdo por 0 ADR total, das a. aoacrao eer arar :X A.iX \,· <λ partir de tec idea bioiòr rico.a, ca talar ; raoradaa e p ;· : ;:XX.b\ i rore, b. Xd·: li.. si'.,· ,1, XtGG cailo oda libiidítiac;, ·: :; 0 :ro.achoa d’i,i aeirpica. ar; t rnoincoar iro caia, ibera V XX XXX; G 0 G. .XG. .X G': X; e .t i. a orlo, X , ^3:333333, ri XX 3 identifica alio coioaci.ar ce e s pé ci.ec 0 :X X ΧΧΧ.Χ. G s G;t acordo a ca a a reata i.ndicacoea ae t e rr o.raa, eer&ctstrisado por a reaoiueao da ideaii ficaçao de.a eepécrea,· d to áiateri.ai sa andCártra pre acate ca : ::;αρ;;·\ :·· ;> acr obtida or co;;;p;:a;apâo erocra oa iaaaahv ·. ,p b t >:·. :-· f, ·; r XX; dOG: Γ.Χ; a aí Li ae cou 0 rrasa a a.a.r; 0 cr; reteres? acra ; /.d ί'Χ'ν' j.çbbiiiidbb a ria rara ri aedo a por kmwtw^iwmiminMwo qa; irai auto pare diíu hl saca o as ; O '·' Λ·Λ * d ''a: d»- t; iotecç aa d Idddtificacác rsalocs: aspoatas a.o rsuas. a ..· da.;. coraa da a c r i a c a a s r e i a ir; d 1 c a ç ss rósea, caracteri mâl por $ ui. j,u! :Í: í;,:i Ú ;'i .X C -X' & Γi Ϊ. ui dl OS SuPOr . d ao a a das di.fls raaca c da tamanhos dos iragaieu a aaaa d.Lllsrsntes a a pácid s a, as d.rtereniea cru 0-c.c oca pai r cot 6i a;to; :· iraassças t; aetesçào d CB 0000 0 lia e a t a do sAFH do hdh sttoccatds v t .1SC dd O do PrOSPSiPS dd aataOÇS.d d ΙΡΡΟΡΙ. 1’ d OdCdO ISO 1. dCUi d d do aroscd.as ssnisusis, os sussado cosa d rs s s issoa. ca çdo ηορρορρο,;: carac te r::. sede por se .casas r .D. a a o. a .1 rusa oe sogroes pospsruisa. dia PJid arltocandrlai: e:a particular, do quatro regidas rsor 16, csrectarolaada por ser aplicada a detocção d is > s X! U: X> Θ Γ: ;u tiuxu. iii.;.&u;X.¾ isn.o.·. 11 cíix .. .1 .. ... ... .. ... 1..:::11 Uv 1).·. Ol., i-iilàl'.· d;:? ilu! f. íuOíXiu C> í·: Ί *: lanl.dticoaslc· r soiacular da a a pau::, as gruntiij, da acopoo cor- aa .perc;. susscsç-res dá a 1"U aaractariaada oca; ser aplicada a amo atras bistógicas, daç rs aa aa a aa ttoscaa, torus corta, uac e.sssists.tvsssssnoa, sanpno.· .sal.it<p ossos, peto.· :χ: e i r S 0 C, ;e ,1o cocção s idsntr. rica:· pio soiecd isii Γ 1U1 d..st r< <: : ui coroo co.a s.t reà sd Pd ·; r; .d ^ 1 y.· ·.· w...· W UI d.a por ::: •\ vs i 1 .-· - •i:.u ν·. ρ·· Λ ·,ν,:: οι:;; ;i:u: âs;' rsa X dl .;': - U í's .· L UI. :.:C0 ls; ria a arpau ídlogaa sala usado de datacç: r: C: lu 1 i ··;·!“ idS; st 1 11oa cao péc ·>· ,·::· ::· v *·' .* ar trlrs atuir: o ;aaiu: tis rhsa cr: i t o nas ·', ·.· \ d .· '.λ: \ ··' i •‘U >' . 1:- i:· ) : dasaote.; Xi0:0 >’···'\ .·' m* *'·' ·· d; raspistor: _ ;"Í <u r Ί P ·:: Isi dfr Pt.h de Cr. daonucl i v? 6'i;.; . Q 0 d r capas dd a 6, ímmmmmmnmmmmmmmmmmmmmmtmmmmmmrniKmKKmKemThis is explained by the fact that the design of the inventors; .1 dd.dC · d: 'S rddlddS COOSftrVdd:; .5S dod dddSO; dxex r.?·RN αο DNA xa.lixocarxdr a-ala, c' ra st: ri.aarxxaaxa; xa Paaeasao d · :: ei áexeción: iax fi.cx; ç: ticlecauar of the apApasi species: a, its agreement caax 3 reissued i; and determined by X: C; :: X X: OX: XX: X Ο XXX .X XX: XX. :: X X ::: X X: X X ’’ X \ :: X. XX X X O XXX:: /. . X: .X XXX: XXX: X ..XXX X: X ';. X >··;:; ·· ·:: .d · go from aepéaras Γ. '· Νθ ic te 5 ... ta .s: P's /: ./*: t': P: r • N, ··., V · -va !grandfather·. the yuoreeoeir? a toro ti acre a? house laugh? ....; ...: '>' '.d & l Ç.- :: .-. ; ϊ • pi p. ara; ariaaeaa a: ca da.gaea.rai dos ··, aipi x. yachts coar aba a la laça.se • ‘^ díd-leasir de d. a: · .a aie saax-Pssi.aa? • a e asar a ri etea if a: d.o tape PC reading aie ca? aa? get out ca? • a and arrear iores $ > a ·: • dxx tatac Niooroeoenca-iCxacaaxaps daaaçda PCP controlled by - V " ..- .: X-X1 ..:,:. .:. " , 4 '. CC : sp xaxr a x asaaea Pa ca? attack? aio dadxaiccic a a. here; a ΐ a. i: a c c a o i i cia a tirai, acara c a ca c a t e i. Hi. What's up? a d theorotorated by the ration of the CP. oa.iiisadá real typical > ί'ΓΟ '' '^^: Ç:' Ç; ‘C gp. · The .iV Cd The skirting of the face of the body. DAA PROCESS: ACTION: A: ID :: INT. d: P d d 0: pO,:. ed'i.) Cãi d aie ta? sn icaai s, color alo ess ?? í;:. ί > Γ w .1 V 1. Π a'i j C-e C 0 ã > aaxt: e r coroo t-er Supported by the construction of asaxale olé. .acs ser relai, is aci a. Ce totrua xeaoeclá laxe. cara estia iocvs, -atrairas ala ososibination pain oroduct carcal a.í ioadox > iatraaéa da will plow :: a a; of PCb; 'from C; iiC <: UbX' ΪΟΧ X 0 $ v Gb G'C a- X: P \ X G ç 1: G G-UG ccdeoéa t kids Opt. X; b X X'i GXX G .O.i,:; 6 G G X X; Ç; XG X! · Λ. X; G X. G s • uro turooaso da ria ta ca; For the sake of ruateaola r ae eapaoiea G.:X XXu.-it X. G.j. Acarβ sugar from oca aa re-hearings anieria res, «au? *« T »ri s« 4o by c oaaaraaaaaa or eatprrctaa paases; :: X; Kecoiaa a a asb! . DDd a ;; XUbGG; bG: XX XX XGXGGi tXXXX pGGG GXX: X i-λ G: GX c: Itiandâdicacap baa raaca arr ca em; ) Da aa rd; the ria ra '’’ v' " ' RCR area; G-; Ra read it. give to a \. · Dl v ta: -Oi ': c; t-CbbO Citi aaaai, 3 3 3; 3 Lu3o..cUò) b bb r 11. a cca '· ’: · * ·· c :: J::; t · d · b be.d h; .ab x; ^' a. < b. : 'Xiiri': d. ; G • d,} / X G.G X: G X; X; GxG X jGbXG · CG; X 0 -G ΓΧ'ΧΧη tb OXU.GXb from speci.es to 0 ..:. ¾¾1 .a .. now: XCC: X: b 0 ca a ;; ei tdndiouçbo: b: Π teri.or. characterized by pwl 'X: XX d.; XX ori rao recolt abra, OaartaU: X ;;' ! u • air; ar r.e t bi.oi.6o.tco, c; cu r. to rcbb. Weak Weaknesses and Identification Collecting will clarify, according to .00 a rare root: n: t, 12, as per: total ADR, a. in the field: X A.iX \, · < λ from tec idea bioiòr rico.a, caar; raoradaa and p; ·:;: XX.b \ i rore, b. Xd ·: li .. si '., ·, 1, XtGG cailo oda libiidítiac ;, ·::; 0: ro.achoa d'i, aeirpica. air; trnoincoar iro fall, ibera V XX XXX; G0 G.XG. .X G ': X; and i. orlo, X, 3: 333333, ri XX 3 identifies allo cioaci.ar ce and s ci.ec 0: X X ΧΧΧ.Χ. G s G; t according to the current reaction, and is being stressed by the reaction of the ideation of the epicreary, to the end of the previous period. ;; · \: ··; > acr obtained or co ;;; p;: a; after erocra oaaaaahv ·. , p b t >: ·. : - · f, ·; r XX; dOG: Γ.Χ; there Li ae and 0 rrasa a aaa; 0 cr; hold back? Accra; /.d ί'Χ'ν 'j.çbbiiiidbb a rare ria laughs a by kmwtw ^ iwmiminMwo qa; irai auto pare diíu hl saca o as; The '·' Λ · Λ * d '' a: d »- t; iotecç aa aa Idddtificacác rsalocs: aspoatas a.o rsuas. a .. · da.; coraa da a c r i a c a s r e i a ir; d 1 c açss rosea, bad character for $ ui. j, u! :::;::: Ú; Ϊi Ϊ. ui dl OS SUPPOr. giving the size of the different sizes of the iragaieu to the size of the leaves, the raw terrenia 0-c.ca the father's cot 6i; : · Rashes t; db 0000 0a and hdh sAFH t a sts toccatds v t .1SC dd O of PrOSPSiPS dd aataOÇS.d d ΙΡΡΟΡΙ. 1 's OdCdO ISO 1. dCUi d d from aroscd.as ssnisusis, the whispered cosa d rs s s that. ca çdo ηορρορρο,;: charac te r ::. thirst for your. a a o. a .1 rusa o and fathers-in-law postpsruisa. day PJid arltocandrlai: e: the particular of the four regs rsor 16, csrectarolaada because d is > s X! U: X > Θ Γ:; u tiuxu. iii.;. &u; X.¾ isn.o. ·. 11 cix .. .1 .. ... ... .. ... 1 .. ::: 11 Uv 1). ·. Ol., I-ilàl '. · D;:? ilu! f. 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