PT1032424E - Combinacao de um inibidor da aldose-redutase com um inibidor da glicogenio-fosforilase - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO ' COMBINAÇÃO DE UM INIBIDOR DA ALDOSE-REDUTASE COM UM INIBIDOR DA GLICOGÉNIO-FOSFORILASE"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Esta invenção relata a combinação farmacêutica de um inibidor da aldose-redutase e de um inibidor da glicogénio-fosforilasc, conjuntos ("kíts") contendo tais combinações e o uso de tais combinações para tratar diabetes, hipcrglicemia, hipercolesteremia, hipertensão, hiperinsulinemia, hiperlipidemia, aterosclerose e isquemia dos tecidos em mamíferos.

Apesar de cedo descoberta a insulina e seu uso alargado subsequente no tratamento de diabetes, a descoberta posterior e uso de sulfonilureias (e.g. Clorpropamida™ (Pfizer), Tolbutamida™ (Upjohn), Aceto-hexamida™ (E.I. Lilly), Tolazamida™ (Upjohn), biguanidas (e.g.Fcnformin™ (Ciba Geigy), Metformin™ (G.D.Searle)), os inibidores da alfa-glicosidase (e.g., rpv r 'ΐ'ΐ #

Precose (Bayer)) e sensibilizadores da insulina (e.g., Rezulin (Parke Davis)) como agentes hipoglicémicos orais, há uma necessidade continuada de tratamentos para diabetes. O uso da insulina, necessário em cerca de 10% dos pacientes diabéticos nos quais os agentes hipoglicémicos não são eficazes (diabetes Tipo I, diabetes mellitus dependente de insulina), requer doses múltiplas diárias, habitualmente por auto-injecção. A determinação da dosagem própria da insulina requer estimativas frequentes do açúcar na urina e no sangue. A administração de um excesso de dose de insulina pode causar hipogliccmia, cujos efeitos oscilam entre anormalidades suaves no açúcar do sangue até ao coma, e eventualmente a morte. O tratamento da diabetes mellitus não dependente de insulina (diabetes Tipo II, DMNDI) consiste geralmente na combinação de dieta, exercício, agentes orais, e.g. sulfonilureias, e em casos mais severos, insulina. Contudo, os hipoglicémicos clinicamente disponíveis podem ter outros efeitos laterais que limitam o seu uso. Em qualquer situação, onde um destes agentes pode falhar num caso individual, outro pode ser bem sucedido. A necessidade contínua de agentes hipoglicémicos, que possam apresentar efeitos laterais menores ou ser bem sucedidos onde os outros falham, é claramente evidente.

Os inibidores da aldose-redutase constituem uma classe de compostos que se tomaram largamente conhecidos pela sua utilidade nas condições de tratamento e prevenção resultantes de complicações da diabetes tais como neuropatia e nefropatia diabética. Tais compostos são bem conhecidos pelos peritos na técnica e são prontamente identificados pelos testes biológicos de referência.

Por exemplo, é conhecido o composto zopolrestat, ácido 1-ftalazina-acético, 3,4-di-hidro-4-oxo-3-[[5-trifluorometil)-2-benzotiazolil]metil]-, por exemplo da patente U.S. 4,939,140 comummente atribuída a Larson et al., juntamente com um número de compostos por isso relacionados, por possuírem utilidade como inibidores da aldose-redutase. O Zopolrestat tem a estrutura

e, como um inibidor da aldose-redutase, é útil no tratamento das complicações acima mencionadas resultantes de diabetes mcllitus.

Ensinou-se o uso de certos inibidores da aldose-redutase no abaixamento dos níveis de lipidos em mamíferos. Veja-se, por exemplo, a patente U.S. 4,492,706 (cuja revelação é aqui incorporada pela referência) de Kallai-sanfacon e a patente EP 0 310 931 A2 (Ethyl Corporation). A patente U.S. 5,064,830 (cuja revelação é aqui incorporada pela referência) comummente atribuída a Going revela o uso de certos ácidos oxoftalizinilacéticos, incluindo o zopolrestat, para o abaixamento dos níveis de ácido úrico no sangue. O pedido de patente dos EUA No. 08/059,688 revela o uso de certos inibidores da aldose-redutase, incluindo o zopolrestat, para o abaixamento do nível de lipidos no sangue de seres humanos. A revelação nota que as utilidades terapêuticas derivam do tratamento de doenças causadas por um nível acrescido de trigliceridos no sangue, incluindo tais doenças desordens cardiovasculares tais como a trombose, aterosclerose, infccção do miocárdio, e angina de peito. A aterosclerose, uma doença das artérias, é reconhecida como uma causa dominante de morte nos Estados Unidos e no Oeste da Europa. E bem conhecida a sequência patológica que conduz à aterosclerose e doença oclusiva do coração. O Estágio inicial nesta sequência é a formação de "estrias de gordura" nas artérias carótida, coronária e cerebral e na aorta. Estas lesões apresentam cor amarela devido à presença dos depósitos de lipido encontrados principalmente dentro de células de músculo liso e em macrófagos da camada intima das artérias c da aorta. Posteriormente, é postulado que a maioria do colesterol encontrado dentro das estrias de gordura, por seu lado, origina o desenvolvimento da "placa fibrosa", que consiste em células íntimas do músculo liso carregadas com lipidos e rodeadas por lipido extra-celular, colagénio, elastina e proteoglicanos. As células mais a matriz formam uma capa fibrosa que cobre um depósito mais profundo de detritos celulares e mais lipido extracelular. O lipido é principalmente colesterol livre e esterificado. A placa fibrosa forma-se lentamente, e pode com o tempo ficar calcificada e necrótica, avançando para a "lesão complicada" que é responsável pela oclusão arterial e com tendência para a trombose mural e espasmo do músculo arterial que caracterizam a aterosclerose avançada. A evidência epidemiológica estabeleceu firmemente a hiperlipi-demia como factor de risco primário na causa da doença cardiovascular (DCV) devida a aterosclerose. Nos anos recentes, os peritos da profissão médica colocaram ênfase renovado no abaixamento dos níveis de colesterol no plasma e nas lipoproteinas de colesterol de baixa densidade em particular, como um passo essencial na prevenção de DCV. Os limites superiores do "normal" são agora conhecidos como sendo significativamente inferiores aos antigamente apreciados. Como resultado, compreendeu-se que grandes segmentos das populações do Oeste estão particularmente em elevado risco. Tais factores de risco independentes incluem tolerância à glucose, hipertrofia ventricular esquerda, hipertensão, e pertencerem ao sexo masculino. A doença cardiovascular é especialmente predominante entre indivíduos diabéticos, pelo menos em parte devido à existência de factores de risco independentes múltiplos nesta população. 0 sucesso do tratamento da hiperlipidemia na população em geral, e nos indivíduos diabéticos em particular, é por isso de importância médica excepcional. A hipertensão (ou elevada pressão sanguínea) é uma condição que ocorre na população humana como sintoma secundário de várias desordens tais como a estenose arterial renal, feocromocitoma ou desordens endócrinas. Contudo, a hipertensão é também evidenciada em muitos pacientes nos quais o agente causativo ou a desordem são desconhecidos. Enquanto tal hipertensão "essencial" está frequentemente associada a desordens tais como obesidade, diabetes c hipertrigliceridemia, a relação entre estas desordens não foi ainda elucidada. Adicionalmente, muitos pacientes apresentam os sintomas de pressão sanguínea elevada na ausência completa de outros sinais de doença ou desordem. É sabido que a hipertensão pode conduzir directamente a falha cardíaca, falha renal e ataque apoplético (hemorragia cerebral). Estas condições são capazes de causar doença a curto prazo num paciente. A hipertensão pode também contribuir para o desenvolvimento de aterosesclerose e doença das coronárias. Estas condições enfraquecem gradualmente um paciente e podem conduzir à morte a longo termo. A causa exacta da hipertensão essencial é desconhecida, embora se acredite que um número de factores determinados contribuam para o estabelecimento da doença. Entre tais factores estão os estados de ansiedade e tensão nervosa, emoções descontroladas, desregulação da libertação de hormonas (a renina, angiotensina, sistema aldosterona), sal e água em excesso devido a disfunção renal, espessamento das paredes e hipertrofia vascular resultante da constrição de vasos sanguíneos e factores genéticos. O tratamento da hipertensão essencial tem sido realizado tendo em mente os factores anteriores. Assim, uma gama larga de beta-bloqucadores, vasoconstritores, inibidores da enzima responsável pela conversão da angiotensina e muitos outros têm sido desenvolvidos e comercializados como anti-hipertensores. O tratamento da hipertensão utilizando estes compostos -6- mostrou ser benéfico 11a prevenção de mortes a curto intervalo Lais como por falha cardíaca, falha renal e por hemorragia cerebral. Contudo, permanece um problema o desenvolvimento da aterosclerose ou doença do coração devida a hipertensão durante um longo período de tempo. Isto implica que embora a pressão sanguínea elevada seja reduzida, a causa subjacente ou intrínseca na base da hipertensão essencial não está a responder ao tratamento. A hipertensão tem sido associada a elevados níveis de insulina no sangue, uma condição conhecida como hiperinsulinemia. A insulina, uma hormona peptídica cujas acções primárias são promover a utilização da glucose, a síntese de proteínas e a formação e armazenamento dos lipidos neutros, actua também para promover o crescimento das células vasculares e aumenta a retenção renal de sódio, entre outras coisas. Estas últimas funções podem ser conseguidas sem afectar os níveis de glucose e são causas conhecidas de hipertensão. O crescimento vascular periférico, por exemplo, pode causar constrição dos capilares periféricos; enquanto a retenção de sódio aumenta o volume do sangue. Assim, baixando os níveis de insulina em hiperinsulinémicos pode-se prevenir o crescimento vascular anormal e a retenção renal de sódio causada pelos níveis altos de insulina e consequentemente aliviar a hipertensão. A hipertrofia cardíaca é um factor significativo de risco no desenvolvimento de morte súbita, enfarte do miocárdio e falha cardíaca congestiva. Estes acontecimentos cardíacos são devidos, pelo menos em parte, à susceptibilidadc aumentada para a doença do miocárdio após isquemia e reperfusão que pode ocorrer em convalescença bem como nas fixações perioperativas. Há uma necessidade médica ainda não atingida de prevenir ou minimizar resultados perioperativos adversos do miocárdio, particularmente o enfarte do miocárdio perioperativo. Ambas a cirurgia cardíaca e não cardíaca estão associadas a riscos substanciais de enfarte do miocárdio ou morte. Alguns 7 milhões de pacientes submetidos a cirurgia não cardíaca são considerados em risco, com incidentes de morte perioperativa e complicações cardíacas sérias atingindo 20-25% em algumas séries. Além disso, dos 400,000 pacientes submetidos anualmente a cirurgia de "by-pass" coronário, a ocorrência do enfarte do miocárdio perioperativo é estimada cm 5% e a morte em 1-2%. Não existe terapia medicamentosa correntemente comercializada nesta área que reduza os danos no tecido cardíaco resultantes de isquemia perioperativa do miocárdio e aumente a resistência cardíaca a episódios isquémicos. Tal terapia será antecipadamente salvadora de vidas e reduz as hospitalizações, aumenta a qualidade de vida e reduz os custos globais de cuidados de saúde dos pacientes de alto risco. A produção de glucose hepática é um alvo importante na terapia da DMNDI. O fígado é o maior regulador dos níveis de glucose no plasma no estádio pós-absortivo (jejuado), c a velocidade de produção hepática de glucose em pacientes DMNDI é significativamente elevada em relação aos indivíduos normais. Do mesmo modo, no estado pós-prandial (alimentado), onde o fígado desempenha um papel proporcionalmente mais pequeno no aporte total de glucose ao plasma, a produção hepática de glucose é anormalmente elevada em pacientes DMNDI. A glicogenólise é um alvo importante para interrupção da produção de glucose hepática. O fígado produz glucose por glicogenólise (degradação do polímero de glucose glicogénio) e gluconeogénese (síntese de glucose a partir de precursores com 2 e 3-carbonos). Diversas linhas de evidência indicam que a glicogenólise pode ser responsável por uma contribuição importante para o aporte de glucose hepática em DMNDI. Primeiro, em seres humanos pós-absortivos normais, é estimada uma produção de glucose hepática até 75% como resultado da glicogenólise. Em segundo lugar, os pacientes com doenças de armazenamento do glicogénio no fígado, incluindo a doença de Heis (deficiência na glicogénio-fosforilase), mostram hipoglicemia episódica. Estas observações sugerem que a glicogenólise pode ser um processo significativo pra a produção hepática de glucose. A glicogenólise é catalisada no fígado, músculo, e cérebro por isoformas da glicogénio-fosforilase específicas de tecido. Esta enzima faz a clivagem da macromolécula de glicogénio para libertar a glucose-1-fosfato e uma molécula nova de glicogénio mais curta. Dois tipos de inibidores da glicogénio-fosforilase foram descritos até à data: glucose e análogos de glucose [Martin, J. L. et al. Biochemistry 1991, 30, 10101] e cafeina e outras purinas análogas [Kasvinsky, P.J. et al. J. Biol. Chem. 1978, 253, 3343-3351 e 9102-9106], Postulou-se que estes compostos, e os inibidores da glicogénio-fosforilase em geral, são de uso potencial para o tratamento da DMNDI por decrescerem a produção de glucose hepática e baixarem a glicemia. [Blundell, T. B. et al. Diabetologia 1992, 35, Suppl. 2, 569-576 e Martin et al. Biochemistry 1991, 30, 10101]. O(s) mecanismo(s) responsável pela doença do miocárdio observada após isquemia e reperfusão não está completamente entendido. Foi descrito (M.F. Allard, et al. Am. J. Physiol. 267, H66-H74, 1994) que "a redução pré-isquémica de glicogénio... está associada ao aumento da recuperação funcional ventricular esquerda pós-isquémica em corações de ratos hipertrofiados".

Assim, embora haja uma variedade de terapias para hiperglicemia, hipercolesteremia, hipertensão, hiperinsulinemia, hiperlipidemia, aterosclerose e isquémicas há uma necessidade contínua e uma pesquisa contínua neste campo do conhecimento para terapias alternativas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção é dirigida para composições farmacêuticas compreendendo inibidores da aldose-redutase e inibidorcs da glicogénio-fosforilase e para o uso de tais composições na preparação de um medicamento para o tratamento de condições de resistência à insulina, incluindo biabetes em mamíferos (e.g., seres humanos quer machos quer fêmeas) ou para o uso de tais composições na preparação de um medicamento para a redução de danos nos tecidos (e.g., prevenindo substancialmente a danificação de tecidos, induzindo protecção dos tecidos) resultantes de isquemia.

As combinações compreendem quantidades terapeuticamente eficazes de um inibidor da aldose-redutase e de um inibidor da glicogénio--fosforilase.

Uma quantidade preferida do inibidor da aldose-redutase é cerca de 0,1 mg/Kg a cerca de 20 mg/Kg e uma quantidade preferida de inibidor da glicogénio-fosforilase é cerca de 0,1 mg/Kg a cerca de 15 mg/Kg.

Um inibidor da aldose-redutase especialmente preferido é o ácido 3,4-di-hidro-4-oxo-3-[[5-trifluorometil)-2-benzotiazolil]metil]-l-ftalazina-acético.

Os inibidores da glicogénio-fosforilase preferidos incluem compostos contendo a fórmula I.

e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-fármacos derivados em que a linha a tracejado (—) é uma ligação opcional; A é -C(H)=, -C((Ci-C4)alquilo)= ou -C(halo)= quando a linha a tracejado (—) é uma ligação, ou A é metileno ou -CH((CrC4)alquilo)- quando a linha a tracejado (—) não é uma ligação;

Ri, Rio ou Rn são cada um independentemente H, halo, 4-, 6- ou 7-nitro, ciano, (CrC4)alquilo, (Ci-C4)alcoxilo, fluorometilo, difluorometilo ou trifluoro-metilo; R2éH; R3 é H ou (Ci-C5)alquilo; R4 é H, metilo, etilo, n-propilo, hidroxi(Ci-C3)alquilo, (Ci-C3)alcoxi(Ci-C3)alquilo, fenil(C]-C4)alquilo, fenil-hidroxi(Ci-C4)alquilo, fenil(Ci-C4)alcoxi-(Ci-C4)alquilo, tien-2- ou -3-il(CrC4)alquilo ou fur-2- ou -3-il(CrC4)alquilo em que os referidos anéis R4 são mono-, di- ou tri-substituídos independentemente no carbono com H, halo, (Ci-C4)alquilo, (Ci-C4)alcoxilo, trifluorometilo, hidroxi-lo, amino ou ciano, ou R4 c pirid-2-, -3- ou -4-il(C 1 -C4)alquilo, tiazol-2-, -4- ou -5-il(C|-C4)al-quilo, imidazol-1, -2-, -4-, ou -5-il(Ci-C4)alquilo, pirrol-2- ou -3-il(Ci-C4)alquilo, oxazol-2-, -4- ou -5-il-(Ci-C4)alquilo, pirazol-3-, -4- ou -5-il(Ci-C4)alquilo, isoxazol-3-,-4- ou -5-il(CrC4)alquilo, isotiazol-3-, -4- ou -5-il(Ci-C4)alquilo, piradazin-3- ou -4-il-(Ci-C4)alquilo, pirimidin-2-, -4-, -5- ou -6-il(Ci-C4)alquilo, pirazin-2- ou -3-il(Ci-C4)alquilo ou l,3,5-triazin-2-il(Ci-C4)alquilo, em que os referidos heterociclos precedentes R4 são opcionalmente mono- ou di-substituí-dos independentemente com halo, trifluorometilo, (Ci-C4)alquilo, (Ci-C4)al-coxilo, amino ou hidroxilo e os referidos mono- ou di-substituintes estão ligados a carbono; R5 é H, hidroxilo, fluoro, (Ci-C5)alquilo, (Ci-C5)alcoxilo, (Ci-C6)alca-noílo, amino(Ci-C4)alcoxilo, mono-N- ou di-N,N-(Ci-C4)alquilamino(Cr C^alcoxilo, carboxi(Ci-C4)alcoxilo, (Ci-C5)alcoxicarbonil(C|-C4)alcoxilo, benziloxicarbonil(Ci-C4)alcoxilo, ou carboniloxilo em que o referido carboniloxilo está ligado carbono-carbono com fenilo, tiazolilo, imidazolilo, 1H-indolilo, furilo, pirrolilo, oxazolilo, pirazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo ou 1,3,5-triazinilo e onde os referidos anéis R5 precedentes são opcionalmente mono-substituídos com halo, (CrC4)alquilo, (Ci-C4)alcoxilo, hidroxilo, amino ou trifluorometilo e os referidos mono-substituintes estão ligados a carbono; R7 é H, fluoro ou (Ci-C5)alquilo; ou R5 e R7 podem ser considerados em conjunto como oxo; R6 é carboxilo, (CpCgjalcoxicarbonilo, C(0)NR8R9 ou C(0)Ri2, em que Rg é H, (Ci-Cgjalquilo, hidroxilo ou (CrC3)alcoxilo; e Rg é H, (Ci-Cg)alquilo, hidroxilo, (Ci-Cg)alcoxilo, metileno-perfluora-do(CrCg)alquilo, fenilo, piridilo, tienilo, furilo, pirrolilo, pirrodinilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, isoxazolilo, isotiazolilo, piranilo, piperidinilo, morfolinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, piperazinilo ou 1,3,5-triazinilo em que os referidos anéis R5 precedentes são ligados por carbono-azoto; ou

Rg é (Ci-C5)alquilo mono-, di- ou tri-substituído, em que os referidos subs-tituintes são independentemente H, hidroxilo, amino, mono-N- ou di-N,N-(Cr C5)alquilamino; ou

Rg é (CpCsjalquilo mono- ou di-substituído, em que os referidos substi-tuintes são independentemente fenilo, piridilo, furilo, pirrolilo, pirrolidinilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, isoxazolilo, isotiazolilo, piranilo, piridinilo, piperidinilo, morfolinilo, piradizinilo, pirimi-dinilo, pirazinilo, piperazinilo ou 1,3,5-triazinilo, onde os anéis Rg não-aromáticos contendo azoto são opcionalmente mono-substituídos no azoto com (CrC6)alquilo, benzilo, benzoilo ou (CrC6)alcoxi-carbonilo e em que os anéis R9 são opcionalmente mono-substituídos no carbono com halo, (Ci-C4)alquilo, (Ci-C4)aleoxilo, hidroxilo, aniino, ou mono-N c di-N,N(CrC5)alquilamino com a condição de não estar incluído nenhum azoto quaternário e que não haja ligações azoto-oxigénio, azoto-azoto ou azoto-halogénio;

Ri2 é piperazin-l-ilo, 4-(CrC4)alquilpiperazin-l-ilo, 4-formilpiperazin-l-ilo, morfolino, tiomorfolino, 1-oxotiomorfolino, 1,1-dioxo-tiomorfolino, tiazo-lidin-3-ilo, l-oxo-tiazolidin-3-ilo, l,l-dioxo-tiazolidin-3-ilo, 2-(Ci-C6)alcoxicar-bonilpirrolidin-l-ilo, oxazolidin-3-ilo ou 2(R)-hidroximetilpirrolidin-l-ilo; R12 é oxazetidin-2-ilo 3- e/ou 4-mono ou di-substituído, oxazolidin-3-ilo 2-, 4-, e/ou 5-mono- ou di-substituído, tiazolidin-3-ilo 2-, 4-, e/ou 5-mono- ou di-substituído, l-oxotiazolidin-3-ilo 2-, 4-, e/ou 5-mono- ou di-substituído, 1,1-dioxotiazolidin-3-ilo 2-, 4-, e/ou 5-mono- ou di-substituído, pirrolidin-l-ilo 3-, 4-, e/ou 5-mono- ou di-substituído, piperidin-l-ilo 3-, 4-, e/ou 5-mono-, di- ou tri-substituído, piperazin-l-ilo 3-, 4-, e/ou 5-mono-, di ou tri-substituído, azetidin-1-ilo 3-substituído, 1,2-oxazinan-2-ilo 4, e/ou 5-mono- ou di-substituído, pirazolidin-l-ilo 3-, e/ou 4-mono- ou di-substituído, isoxazolidin-2-ilo 4-, e/ou 5-mono- ou di-substituído, isotiazolidin-2-ilo 4-, e/ou 5-mono- ou di-substituído, em que os referidos substituintes RI2 são independentemente H, halo, (C1-C5)-alquilo, hidroxilo, amino, mono-N- ou di-N,N-(Ci-C5)aIquilamino, formilo, oxo, hidroximino, (Ci-C5)alcoxilo, carboxilo, carbamoilo, mono-N- ou di-N,N-(Cr C4)alquilcarbamoilo, (Ci-C4)alcoxi-imino, (CrC4)alcoximetoxilo, (Ci-Cg)alcoxi-carbonilo, carboxi(CrC5)alquilo ou hidrox^Q-Csjalquilo; desde que se R4 é H, metilo, etilo ou n-propilo R5 é OH; desde que se R5 e R7 são H, então R4 não é H, metilo, etilo, n-propilo, hidroxi(C|-C3)alquilo ou (Ci-C3)alcoxi(CrC3)alquilo e R6 é C(0)NR8R9, C'(0)R12 ou (Ci-C4)alcoxicarbonilo.

Um primeiro grupo de compostos preferidos de fórmula I consiste naqueles compostos em que -13-

Ri é 5-H, 5-halo, 5-metilo ou 5-ciano; RI0 e Rn são cada um independentemente H ou halo; A é -C(H)=; R2 e R3 são H; R4 c fenil(Ci-C2)alquilo em que os referidos grupos fenilo são mono-, di-, ou tri-substituídos independentemente com H, halo, (Ci-C4)alquilo, (Ci-C4)al-coxilo, trifluorometilo, hidroxilo, amino ou ciano; ou R4 é tien-2- ou -3-il(Ci-C2)alquilo, pirid-2-, -3- ou -4-il(CrC2)alquilo, tiazol-2-, -4- ou -5-il(CrC2)alquilo, imidazol-1-, -2-, -4- ou -5-il(CrC2)alquilo, fur-2- ou -3-il(Ci-C2)alquilo, pirrol-2- ou -3-il(Ci-C2)alquilo, oxazol-2-, -4- ou -5-il(CrC2)alquilo, pirazol-3-, -4- ou -5-il(CrC2)alquilo, isoxazol-3-, -4- ou -5-il(C|-C2)alquilo em que os referidos heterociclos R4 precedentes são opcionalmente mono- ou di-substituídos independentemente com halo, trifluorometilo, (CrC4)alquilo, (CrC4)alcoxilo, amino ou hidroxilo e os referidos mono- ou disubstituintes estão ligados ao carbono; R5 é hidroxilo; R6 é C(0)NRgR9 ou C(0)R,2; e R? é H.

Entre o primeiro grupo de compostos preferidos acima referidos de fórmula I está um primeiro grupo de compostos especialmentc preferidos em que o átomo de carbono a tem uma estereoquímica (S); 0 átomo de carbono b tem uma estereoquímica (R); R4 é fenil(CpC2)alquilo, tien-2-il-(Ci-C2)alquilo, tien-3-il~(Ci-C2)alquilo, fur-2-il-(CrC2)alquilo ou fur-3-il-(Cj-C2)alquilo em que os referidos anéis são mono- ou di-substituídos independentemente com H ou fluoro; Rô é C(0)NR8R9; R8 é (Ci-C3)alquilo, hidroxilo ou (Ci-C3)alcoxilo; e R9 é H, (Ci-Cg)alquilo, hidroxilo, hidroxi(Ci-C6)alquiIo, (Ci-C8)alcoxilo, piridilo, morfolinilo, piperazinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, ímídazolilo ou tiazo-lilo ou (Ci-C4)alquilo mono-substituído com piridilo, morfolinilo, piperazinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, imidazolilo ou tiazolilo.

Entre os primeiros grupos acima descritos dos compostos especialmente preferidos estão os compostos especialmente preferidos [(lS)-((R)-hidroxi-dimetilcarbamoil-metil)2-fenil-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico [(lS)-[(R)-hidroxi-(metoxi-metil-carbamoil)-metil]2-fenil-etil]-amida do ácido 5,6-dicloro-lH-indole-2-carboxílico [(1 S)-[(R)-hidroxi-(metoxi-metil-carbamoil)-metil]2-fenil-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico ((lS)-[(R)-hidroxi-[(2-hidroxi-etil)-metil-carbamoil)-metil]2-fenil-etil)-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico [(lS)-[(R)-hidroxi-(metil-piridin-2-il-carbamoil)-metil]2-fenil-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico ((lS)-[(R)-hidroxi-[metil-(2-piridin-2-il-etil)-carbamoil]-metil]2-fenil-etil)-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico.

Dentro do primeiro grupo acima descrito de compostos especialmente preferidos estão os compostos em que a. Ri é 5-cloro;

Rio e Rn são H, R4 é benzilo; R8 é metilo; e R9 é metilo; b. Ri é 5-cloro;

Rn é H; R10 é 6-cloro; - 15 - c. d. e. f. R4 é benzilo; Rg é metilo; e Rg é metoxilo; Ri é 5-cloro; R10 e Ru são H; R4 é benzilo, Rg é metilo; e R9 é metoxilo. Ri é 5-cloro; Rio e Rn são H; R4 é benzilo, R8 é metilo; e R9 é 2-(hidroxi)etilo; R! é 5-cloro; Rio e Rn são H; R4 é benzilo; R8 é metilo; e R9 é piridin-2-ilo, e Ri é 5-cloro; Rio e Rn são H; R4 é benzilo; Rg é metilo, e R9 é 2-(piridin-2-il)etilo.

Dentro do acima referido primeiro grupo de compostos preferidos de Fórmula I está um segundo grupo de compostos especialmente preferidos em que o átomo de carbono a tem uma estereoquímica (S); 0 átomo de carbono b tem estereoquímica (R); R4 é fenil(Ci-C2)alquilo, tien-2-il-(Ci-C2)alquilo, lien-3-il-(C|-C2)alquilo, fur-2-il-(Ci-C2)alquilo ou fur-3-il-(Ci-C2)alquilo em que os referidos anéis são mono- ou di-substituídos independentemente com H ou fluoro;

Rg é C(0)R12; e R)2 é morfolino, 4-(Ci-C4)alquilpiperazin-l-ilo, azetidin-l-ilo 3-substituído, pirrolidin-l-ilo 3- ou 4, -mono- ou di-substituído, isozaxolidin-2-ilo 4- e/ou 5- mono- ou di-substituído, 1,2-oxazinan-2-ilo 4- e/ou 5- mono- ou di-substituído, em que os referidos substituintes são cada um independentemente H, halo, hidroxi, amino, mono-N- ou di-N,N-(C1-C6)alquilamino, oxo, hidroximino ou alcoxilo.

Dentro do segundo grupo de compostos especialmente preferidos estão os compostos particularmente preferidos

Cloreto da [(1 S)-benzil-(2R)-hidroxi-3-(4-metil-piperazin-1 -il)-metil]-3-oxo-propil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(lS)-benzil-(2R)-hidroxi-3-(3-hidroxi-azetidm-l-il)-metil]-3-oxo-propil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, ((1 S)-benzil-(2R)-hidroxi-3-isoxazolidin-2-il-3-oxo-propil)-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico, ((lS)-benzil-(2R)-hidroxi-3-[l,2]oxazinan-2-il-3-oxo-propil)-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(lS)-benzil-(2R)-hidroxi-3-((3S)-hidroxi-pirrolidin-l-il)-3-oxo-propil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(lS)-benzil-3-((3S,4S)-di-hidroxi-pirrolidin-l-il)-(2R)-hidroxi-3-oxo-propil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, ou [(lS)-benzil-3-((3R,4S)-di-hidroxi-pirrolidin-l-il)-(2R)-hidroxi-3-oxo-propil]-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico, ou ((lS)-benzil-(2R)-hidroxi-3-morfolin-4-il-3-oxo-propil)-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico. - 17- /1.,/ / -av- (_____

Dentro do acima descrito segundo grupo de compostos cspecial- mente preferidos estão os compostos em que a. R] é 5-cloro; Ri0e Rn são H, R4 é benzilo; R12 é 4-metilpiperazin-1-ilo; b. Ri é 5-cloro;

d. e. f. g· R10 e Rn são H; R4 é benzilo;e R12 é 3-hidroxi-azetidin-l-ilo; R! é 5-cloro; R10 e Rn são H; R4 é benzilo; e R12 é isoxazolidin-2-ilo; R, é 5-cloro; Rio e Rn são H; R4 é benzilo; e R12 é (l,2)-oxazinan-2-ilo; é 5-cloro; R10 e Rn são H; R4 é benzilo; e Rué 3(S)-hidroxipirrolidin-l-ilo; Ri é 5-cloro; R10 e Rn são H; R4 é benzilo; e R12 é (3S,4S)-di-hidroxipirrolidin-l-ilo; Ri é 5-cloro; R10 e Rn são H; R4 é benzilo; e R,2 é (3R,4S)-di-hidroxipirrolidin-l-ilo;e h. R] é 5-cloro; R10 e Rn são H; R4 é benzilo; e R12 é morfolino.

Um segundo grupo de compostos preferidos de Fórmula I consiste naqueles compostos em que

Ri é H, halo, metilo ou ciano; R10 e Rn são cada um independentemente H ou halo; A é -C(H)=; R2 e R3 são H; R4 é fenil(Ci-C2)alquilo,em que os referidos grupos fenilo são mono-, di-ou tri-substituídos independentemente com H ou halo ou mono- ou di-substituídos independentemente com H, halo, (Ci-C^alquilo, (Ci-C4)alcoxilo, trifluorometilo, hidroxilo, amino ou ciano, ou R4 é tien-2 ou 3-il-(Ci-C2)alquilo, pirid-2-, -3 ou -4-il-(C1-C2)alquilo, tiazol-2-, -4- ou -5-il-(Ci-C2)alquilo, imidazol-1-, -2-, -4- ou -5-il-(C]-C2)alquilo, fur-2- ou 3-il-(Ci-C2)alquilo, pirrol-2-, ou -3-il-(Ci-C2)alquilo, oxazol-2-, -4- ou -5-il-(Ci-C2)alquilO, pirazol-3-, -4- ou -5-il-(Ci-C2)alquil, isoxazol-3-, -4- ou -5-il-(Ci-C2)alquilo em que os referidos heterociclos R4 precedentes são opcionalmente mono- ou di-substituídos independentemente com halo, (Cp C4)alquilo, (CrC4)alcoxilo, trifluorometilo, amino ou hidroxilo e os referidos mono- ou di-substituintes estão ligados a carbono; R5 é hidroxilo;

Re é carboxilo ou (CrC8)alcoxicarbonilo; e R7 é H, fluoro ou (CrC6)alquilo.

Dentro do segundo grupo de compostos preferidos de Fórmula I está um grupo de compostos especialmentc preferidos em que -19- o átomo dc carbono a tem cstereoquímica (S); o átomo de carbono b tem cstereoquímica (R); R4 é fenil(Ci-C2)alquilo, tien-2-il-(C1-C2)alquilo, tien-3-il-(Ci-C2)alquilo, fur-2-il-(CrC2)alquilo ou fur-3“il-(Ci-C2)alquil em que os referidos anéis são mono- ou di-substituídos independentemente com H ou fluoro;

Rio e Ru são H; R$ é carboxilo; e R7 é H,

Preferido entre os grupos imediatamente precedentes está um composto em que Ri é 5-cloro;

Rio e Rn são H; e R4 é benzilo.

Um terceiro grupo de compostos preferidos de Fórmula I consiste naqueles compostos em que

Ri é H, halo, metilo ou ciano;

Rio e Rn são cada um independentemente H ou halo; A é -C(H)=: R2 e R3 são H; R4 é fenil(Ci-C2)alquilo, em que os referidos grupos fenilo são mono-, di-ou tri-substituídos independentemente com H ou halo ou mono- ou di-substituídos independentemente com H ou halo, (Q-C^alquilo, (Ci-C4)alcoxilo, trifluorometilo, hidroxilo, amino ou ciano; ou R4 é tien-2 ou 3-il-(CrC2)alquilo, pirid-2-, -3 ou -4-il-(Ci-C2)alquilo, tiazol-2-, -4- ou -5-il-(C|-C2)alquilo, imidazol-1-, -2-, -4- ou -5-il-(CrC2)alquilo, fur-2- ou 3-il-(CrC2)alquilo, pirrol-2-, ou -3-il-(CrC2)alquilo, oxazol-2-, -4- ou -5-il-(CpC2)alquilo, pirazol-3-, -4- ou -5-il-(Ci-C2)alquilo, isoxazol-3-, -4- ou -5- il-(CrC2)alquilo em que os referidos heterociclos R4 precedentes sao opcionalmente mono- ou di-substituídos independentemente com halo, trifluorometilo, (Cj-C4)alquilo, (CrC4)alcoxilo, amino ou hidroxilo e os referidos mono- ou di-substituintes estão ligados a carbono; R5 é fluoro, (Ci-C4)alquilo, (Ci-C5)alcoxilo, amino(Ci-C4)alcoxilo, mono-N- ou di-N,N-(C1-C4)alquilamino(Ci-C4)alcoxilo, carboxi(CrC4)alcoxi,(Ci-C5)alcoxi-carbonil(CrC4)alcoxilo, benzil- oxicarbonil(Ci-C4)alcoxilo; R6 é carboxilo ou (CpCg^lcoxicarbonilo; e R7 é H, fluoro, (Ci-C6)aIquilo.

Um quarto grupo de compostos preferidos de Fórmula I consiste naqueles compostos em que

Ri é H, halo, metilo ou ciano;

Ri0e Rn são cada um independentemente H ou halo; A é -C(H)=: R2 e R3 são H; R4 é fenil(CpC2)alquilo, em que os referidos grupos fenilo são mono-, di-ou tri-substituídos independentemente com H ou halo ou mono- ou di-substituídos independentemente com H ou halo, (CrC4)alquilo, (CrC4)alcoxilo, trifluorometilo, hidroxilo, amino ou ciano; ou R4 é tien-2 ou 3-il-(C|-C2)alquilo, pirid-2-, -3 ou -4-il-(C]-C2)alquilo, tiazol-2-, -4- ou -5-il-(CrC2)alquilo, imidazol-1-, -2-, -4- ou -5-il-(Ci-C2)alquilo, fur-2- ou 3-il-(Ci-C2)alquilo, pirrol-2-, ou -3-il-(Ci-C2)alquilo, oxazol-2-, -4- ou -5-il-(Ci-C2)alquilo, pirazol-3-, -4- ou -5-il-(CrC2)alquilo, isoxazol-3-, -4- ou -5-il-(CrC2)alquilo em que os referidos heterociclos R4 precedentes são opcionalmente mono- ou di-substituídos independentemente com halo, trifluorometilo, (Ci-C4)alquilo, (C1-C4)alcoxilo, amino ou hidroxilo e os referidos mono- ou di-substituintes estão ligados a carbono; R5 é fluoro, (Ci-C4)alquilo, (C|-C5)alcoxilo, amino(Ci-C4)alcoxilo, mono- -21 -

7 '*' * » ι N- ou di-N,N-(Ci-C4)alquilamino(Ci-C4)alcoxilo, carboxi(Ct-C4)alcoxilo, (C|-C5)alcoxicarbonil(Ci-C4)alcoxilo, benzil-oxicarbonil(Ci-C4)alcoxi; R0 é C(0)NRgR9 ou C(0)R12; e R7 é H, fluoro ou (Ci-C6)alquilo.

Os inibidores da glicogénio-fosforilase preferidos incluem compostos tendo a Fórmula IA

Fórmula IA e os sais farmaceuticamente aceitáveis pró-fármacos derivados em que a linha a tracejado (—) é uma ligação opcional; A é -C(H)=, -C((Ci-C4)alquilo)= ou -C(halo)= ou -N=, quando a linha a tracejado (—) é uma ligação, ou A é metileno ou -CH((CrC4)alquilo)- quando a linha a tracejado (—) não é uma ligação;

Ri, R10 ou R| | são cada um independentemente H, halo, ciano, 4-, 6- ou 7-nitro, (Ci-C4)alquilo, (CrC4)alcoxilo, fluorometilo, difluorometilo ou trifluorometilo; R2éH; R3 é H ou (Ci-C5)alquilo; R4 é H, metilo, etilo, n-propilo, hidroxi(CrC3)alquilo, (Ci-C3)alcoxi(Cr C3)alquilo, feníl(Ci-C4)alquilo, feniI-hidroxi(Ci-C4)alquilo, (fenilo)((Ci-C4)alco-xilo)(CpC4)alquilo, tien-2- ou -3-il(Ci-C4)alquilo ou fur-2- ou -3-il(C|-C4)alquilo em que os referidos anéis R4 são mono-, di- ou tri-substituídos independen-temente no carbono com H, halo, (Ci-C4)alquilo, (Ci-C4)alcoxilo, trifluorometilo, hidroxilo, amino ou ciano, ou 4,5-di-hidro-lH-imidazol-2-ilo; ou R4 é pirid-2-, -3- ou -4-il(Ci-C4)alquilo, tiazol-2-, -4- ou -5-il(Cr C4)alquilo, imidazol-1, -2-, -4-, ou -5-il(CpC4)alquilo, pirrol-2- ou -3-il(Ci-C4)alquilo, oxazol-2-, -4- ou -5-il-(CpC4)alquilo, pirazol-3-, -4- ou -5-il(Cr C4)alquilo, isoxazol-3-,-4- ou -5-il(Ci-C4)alquilo, isotiazol-3-, -4- ou -5-il(Cr C4)alquilo, piridazin-3- ou -4-il-(Ci-C4)alquilo, pirimidin-2-,-4-, -5- ou -6-il(Cr C4)alquilo, pirazin-2- ou -3-il(Ci-C4)alquilo, l,3,5-triazin-2-il(Ci-C4)alquilo, ou indol-2-(Ci-C4)alquilo, em que os referidos heterociclos precedentes R4 são opcionalmente mono- ou di-substituídos independentemente com halo, trifluorometilo, (Ci-C4)alquilo, (Ci-C4)alcoxilo, amino, hidroxilo ou ciano e os referidos mono- ou di-substituintes estão ligados a carbono; R4 é Rp-carboniloximetilo, em que o referido R|5 é fenilo, tiazolilo, imidazolilo, ΙΗ-indolilo, furilo, pirrolilo, oxazolilo, pirazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, piridilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo ou 1,3,5-triazinilo e em que os referidos anéis Ris precedentes são opcionalmcnte mono- ou di-substituídos independentemente com halo, amino, hidroxilo, (Ci-C4)alquilo, (Cr C4)alcoxilo ou trifluorometilo e os referidos mono- ou di-substituintes estão ligados a carbono; R5éH; R6 é carboxilo, (CrC8)alcoxicarbonilo, benziloxicarbonilo, C(0)NR8R9 ou C(0)R12, em que R8 é H, (Ci-Ce)alquilo, ciclo(C3-C6)alquilo, ciclo(C3-C6)alquil(Cr C5)alquilo, hidroxilo ou (C]-C8)alcoxilo; e R9 é H, ciclo(C3-C8)alquilo, ciclo(C3-C8)alquil(CrC5)alquilo,ciclo(C4-C7)alcenilo, ciclo(C3-C7)alquil(Ci-C5)alcoxilo, ciclo(C3-C7)alquiloxilo, hidroxilo, metileno-perfluorado(CrC8)alquilo, fenilo, ou um heterociclo cm que o referido heterociclo é piridilo, furilo, pirrolilo, pirrodinilo, oxazolilo, tiazolilo, imida-zolilo, pirazolilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, isoxazolilo, isotiazolilo, piranilo, piridinilo, piperidinilo, morfolinilo, piridazinilo, pirímidinilo, pirazinilo, pipera-zinilo ou 1,3,5-triazinilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, benzimidazolilo, tiocro-manilo ou tetra-hidrobenzotiazolilo em que os referidos anéis heterociclos são ligados por carbono-azoto; ou R9 é (CrC6)alquilo ou (CrC8)alcoxilo em que os referidos (CrC6)alquilo ou (CrC6)alcoxilo são opcionalmente monosubstituídos com ciclo (C4-C7)alcen-1-ilo fenilo, tienilo, piridilo, furilo, pirrolilo, pirrolidinilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, isoxazolilo, isotiazolilo, piranilo, piridinilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, 1-oxotiomorfolinilo, 1,1-dioxotiomorfolinilo, piradizinilo, pirímidinilo, pirazinilo, piperazinilo ou 1,3,5-triazinilo, ou indolilo e onde os referidos (Ci-C6)alquilo ou (C|-C8)alcoxilo são opcionalmente adicionalmente e independentemente mono- ou di-substituídos com balo, hidroxilo, (C1-C5)alcoxilo, amino, mono-N- ou di-N,N-(C|-Cs)alquilamino, ciano, carboxilo, ou (CrC4)alcoxicarbonilo; e em que os anéis R9 são opcionalmente mono- ou di-substituídos independentemente no carbono com (Ct-C4)al quilo, (Ci-C4)alcoxilo, hidroxilo, hidroxi-(C|-C4)alquilo, amino(Ci-C4)alquilo, mono-N- ou di-N,N-(Ci-C4)alquilamino(Ci-C4)alquilo,(Ci-C4)alcoxi(Ci-C4)aIquilo, amino, mono-N e di-N,N(Ci-C4)alquil-amino, ciano, carboxilo, (CrC5)alcoxicarbonilo, carbamoilo, formilo ou trifluorometilo e os referidos anéis R9 podem opcionalmente ser mono-, ou di-substituídos independentemente com (Ci-C5)alquilo ou halo; com a condição de não estar incluído qualquer azoto quaternário ou algum heterociclo R9; R12 é morfolino, tiomorfolino, 1-oxotiomorfolino, 1,1-dioxotiomorfolino, tiazolidin-3-ilo, l-oxotiazolidin-3-ilo, l,l-dioxotiazolidin-3-ilo, pirrolidin-l-ilo, piperidin-l-ilo, piperazin-l-ilo, piperazin-4-ilo, azetidin-l-ilo, l,2-oxazinan-2-ilo, pirazolidin-l-ilo, isoxazolidin-2-ilo, l,2-oxazetidin-2-ilo, oxazolidin-3-ilo, 3,4-di- hidroisoquinolil-2-ilo, l,3-di-hidiOÍso-indol-2-ilo, 3,4-di-hidro-2II-quinol-l-ilo, 2,3-di-hidro-benzo[ 1,4]oxazin-4-ilo, 2,3-di-hidro-benzo[ 1,4]-tiazin-4-ilo, 3,4-di-hidro-2H-quinoxalin-1 -ilo, 3,4-di-hidro-benzo[c] [1,2] oxazin-1 -ilo, 1,4-di-hidro-benzo[d][l,2]oxazin-3-ilo, 3,4-di-hidrobenzo[e][l,2]oxazin-2-ilo, 3H-benzo[d]-isoxazol-2-ilo, 3H-benzo[c]isoxazol-l-ilo, ou azepan-l-ilo, em que os referidos substituirdes R12 são opcionalmente mono-, di- ou tri-substituídos independentemente halo, (Ci-C5)-alquilo, (Ci-C5)alcoxilo, hidroxilo, amino, mono-N- ou di-N,N-(Ci-C5)alquilamino, formilo, carboxilo, carbamoilo, mono-N- ou di-N,N-(Ci-C5)alquilcarbamoilo, (Ci-C6)alcoxi(CrC3)alcoxilo, (Cr C5)alcoxicarbonilo, benziloxicarbonilo, (Ci-C5)alcoxicarbonil(CrC5)alquilo, (Cr C4)alcoxicarbonilamino, carboxi(C!-C5)alquilo, carbamoil(CrC5)alquilo, mono-N- ou di-N,N-(Ci-C5)alquil-carbamoil(Ci-C5)alquilo, hidroxi(Ci-C5)alquilo, (Cr C4)alcoxi(Ci-C4)alquilo, amino(CrC4)alquilo, mono-N- ou di-N,N-(Cr C4)alquilamino(Ci-C4)alquilo, oxo, hidroxi-imino ou (Q-Cg^lcoxi-imino e em que não mais de dois substituintes são seleccionados de oxo, hidroxi-imino ou (Ci-C6)alcoxi-imino e oxo, hidroxi-imino ou (C,-C6)alcoxi-imino estão em carbonos não aromáticos; e em que os referidos anéis R12 são opcionalmente adicionalmente mono- ou di-substituídos independentemente com (Ci-C5)alquilo ou halo; com a condição de quando é (C|-C5)alcoxicarbonilo ou benziloxicarbonilo então R] é 5-halo, 5-(Ci-C4)alquilo ou 5-ciano e R4 é (fenilo)(hi-droxilo)(Ci-C4)alquilo, (fenilo)((Ci-C4)alcoxilo)(C1-C4)alquilo, hidroximetilo ou Ar(CrC2)alquilo, em que Ar é tien-2- ou -3-ilo, fur-2- ou -3-ilo ou fenilo em que os referidos Ar são opcionalmente mono- ou di-substituídos independentemente com halo; com as condições de quando R4 é benzilo e R5 é metilo, R|2 não é 4-hidroxi-piperidin-l-ilo ou quando R4 é benzilo e R5 é metilo R^ não é C(0)N(CH3)2; com a condição de quando R\ e Rio e Rn são H, R4 não é imidazol-4-ilmetilo, 2-feniletilo ou 2-hidroxi-2-feniletilo; -25- com a condição de quando ambos R8 e R9 são n-pentilo, Ri é 5-cloro, 5-bromo, 5-ciano, 5-(C!-C5)alquilo, 5(Ci-C5)alcoxilo ou trifluorometilo; com a condição de quando ambos R)2 é 3,4-di-hidro-isoquinolol-2-ilo, o referido 3,4-di-hidro-isoquinolol-2-ilo não está substituído com carboxi(Cr C4)alquilo; com a condição de quando R8 é H e R9 é (Ci-C6) alquilo, R9 não está substituído com carboxilo ou (C1-C4) alcoxicarbonilo no carbono que está ligado ao átomo de azoto N de NHR9; e com a condição de quando R^ é carboxilo e Rj, R|0, Rn e R5 são todos H, então R4 não é benzilo, H, (fenilo)(hidroxilo)metilo, metilo, etilo ou n-propilo.

Um primeiro de compostos preferidos de fórmula IA consiste naqueles compostos em que R, é 5-H, 5-halo, 5-metilo, 5-ciano ou 5-trifluorometilo; R,o e Rt [ são cada um independentemente H ou halo; A é -(CH)=; R2 e R3 são H; R4 é H, metilo, fenil(CrC2)alquilo, em que os referidos grupos fenilo são mono- ou di-substituídos independentemente com H, halo, (CrC4)alquilo, (Ci-C4)alcoxilo, trifluorometilo, hidroxilo, amino ou ciano e em que os referidos grupos R4 são opcionalmente adicionalmente mono-substituídos com halo; ou R4 é tien-2- ou -3-il(CrC2)alquilo, pirid-2-, -3- ou -4-il(Ci-C2)alquilo, tiazol-2-, -4- ou -5-il(CrC2)alquilo, imidazol--2-, -4-, ou -5-il(C]-C2)alquilo, fur-2- ou -3-il(Ci-C2)alquilo, pirrol-2- ou -3-il(Ci-C2)alquilo, oxazol-2-, -4- ou -5-il-(CrC2)alquilo, pirazol-3-, -4- ou -5-il(C]-C2)alquilo, isoxazol-3-,-4- ou -5-il(Cr C2)alquilo, isotiazol-3-, -4- ou -5-il(CrC2)alquilo, piridazin-3- ou -4-il-(Cr C2)alquilo, pirimidin-2-,-4-, -5- ou -6-il(Ci-C2)alquilo, pirazin-2- ou -3-il(Cr C2)alquilo ou l,3,5-triazin-2-il(Ci-C7)alquilo, em que os referidos heterociclos precedentes R4 são opcionalmente mono- ou di-substituídos independentemente -26- com halo, trifluorometilo, (Ci-C4)alquilo, (Ci-C4)alcoxilo, arniiio ou hidioxilo e os referidos mono- ou di-substituintes estão ligados a carbono; R5 é H; e R6 é C(0)NR8R9 ou C(0)R12.

Dentro do primeiro grupo de compostos acima preferidos de Fórmula IA está um primeiro grupo de compostos especialmente preferidos em que R4 é H, fenil(Ci-C2)alquilo, tien-2- ou -3-il(CrC2)alquilo, fu.r-2- ou -3-il(C!-C2)alquilo, em que os referidos anéis R4 são mono- ou di-substituídos independentemente com H ou fluoro; Ró é C(0)R12; e R12 é morfolino, tiomorfolino, 1-oxotiomorfolino, 1,1-dioxotiomorfolino, tiazolidin-3-ilo, l-oxotiazolidin-3-ilo, l,l-dioxotiazolidin-3-ilo, pirrolidin-l-ilo, piperidin-l-ilo, piperazin-l-ilo, piperazin-4-ilo, azetidin-l-ilo, 1,2-oxazinan-2-ilo, isoxazolidin-2-ilo, isotiazolidin-2-ilo, l,2-oxazetidin-2-ilo, oxazolidin-3-ilo, 1,3-di-hidroiso-indol-2-ilo, ou azepan-l-ilo, que os referidos anéis R12 são opcionalmente mono- ou di-substituídos independentemente com halo, (C|-C5)-alquilo, (C]-C5)alcoxilo, hidroxilo, amino, mono-N- ou di-N,N-(Ci-C5)alquilamino, formilo, carboxilo, carbamoilo, mono-N- ou di-N,N-(Ci-C5)alquilcarbamoilo, (CpCslalcoxicarbonilo, hidroxi(Cr C5)alquilo, amino(Ci-C4)alquilo, mono-N- ou di-N,N-(C|-C4)alquilamino(Ci-C4)alquilo, oxo, hidroxi-imino ou (CrC6)alcoxi-imino com a condição de apenas os heterociclos R12 tiazolidin-3-ilo, pirrolidin-l-ilo, piperidin-l-ilo, piperazin-l-ilo, piperazin-4-ilo, azetidin-l-ilo, l,2-oxazinan-2-ilo, isoxazolidin-2-ilo, ou oxazolidin-3-ilo, serem opcionalmente mono- ou di-substituídos com oxo, hidroxi-imino ou (CrC6)alcoxi-imino; e em que os referidos anéis R12 são opcionalmente adicionalmente mono- ou di-substituídos independentemente com (Ci-Cs)alquilo.

Dentro do grupo acima referido de compostos especialmente preferidos estão os compostos [(lS)-benzil-2-(3-hidroxi-imino-pirrolidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [2-(cis-3,4-di-hidroxi-pirrolidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico, [2-((3S,4S)-di-hidroxi-pirrolidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico, [(lS)-benzil-3-((cis)-3,4-di-hidroxi-pirrolidin-l-il)-(2R)-hidroxi-3-oxo-propil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(1 S)-benzil-2-(cis-3,4-di-hi droxi-pirrolidin-1 -il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico, [2-(l,l-dioxo-tiazolidin-3-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indo-le-2-carboxílico, [2-oxo-2-tiazolidin-3-il-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxí- lico, [(lS)-(4-fluoro-benzil)-2-(4-hidroxi-piperidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico, [(1 S)-benzil-2-((3RS)-hidroxi-piperidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [2-oxo-2-((lRS)-oxo-l-tiazolidin-3-il)-etil]-amida do ácido 5-cloro- 1H-indole-2-carboxílico, [(1 S)-(2-fluoro-benzil)-2-(4-hidroxi-piperidin-1 -il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(lS)-benzil-2-((3S,4S)-di-hidroxi-pirrolidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, r(lS)-benzil-2-(3-hidroxi-azetidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro- 1 H-indole-2-carboxí lico, -28- / L>' /<v [(lS)-benzil-2-(3-hidroxi-imino-axel.idin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(lS)-benzil-2-(4-hidroxi-imino-piperidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico.

Dentro do grupo acima descrito de compostos especialmente preferidos está um primeiro grupo de compostos especialmente preferidos em que R4 é H; e

Ri2 é tiazolidin-3-ilo, 1-oxo-tiazolidin-3-ilo, l,l-dioxo-tiazolidin-3-ilo ou oxazolidin-3-ilo ou os referidos substituintes Ri2 são opcionalmente mono- ou di-substituídos independentemente com carboxilo, (C|-C5)alcoxicarbonilo, hidroxi-(Ci-C5)alquilo, ammo(C]-C3)alquilo, mono-N- ou di-N,N-(C]-C3)alquilamino(Ci-C3)-alquilo ou R12 é pirrolidin-l-ilo mono- ou di-substituído em que os referidos substituintes são independentemente carboxilo, (Ci-C5)alcoxicarbonilo, (Cj-C5)alcoxilo, hidroxilo, hidroxi(CrC3)alquilo, amino, amino(Ci-C3)alquilo, mono-N- ou di-N,N-(C1-C3)alquilamino(Ci-C3)alquilo, ou mono-N- ou di-N,N-(Cr C4)alquilamino; e os anéis R12 são opcionalmente adicionalmente di-substituídos independentemente com (Ci-C5)alquilo.

Compostos preferidos dentro do grupo imediatamente precedente de compostos particularmente preferidos são os compostos em que a. R] é 5-cloro;

Rio e Rn são H; e

Ri2 é cis-3,4-di-hidroxi-pirrolidin-l~ilo; b. Ri é 5-cloro; R10 e Rn são H;e R4 é benzilo; R,2 é (3S,4S)-di-hidroxi-pirrolidin-1 -ilo; c. Ri é 5-cloro;

Rio e Rn são H; e

Ri 2 é 1,1 -dioxo-tiazolidin-3-ilo; d. R! é 5-cloro;

Rio e Rn são H; e R12 é tiazolidin-3-ilo; e e. Ri é 5-cloro;

Rio e Rn são H; e

Ri2 é l-oxo-tiazolidin-3-ilo.

Dentro do grupo acima descrito de compostos especialmente preferidos está um segundo grupo de compostos particularmente preferidos em que R4 é fenilmetilo, tien-2- ou -3-ilmetilo em que os referidos anéis R4 são opcionalmente mono- ou di-substituídos com fluoro; e R12 é tiazolidin-3-ilo, l-oxo-tiazolidin-3-ilo, l,l-dioxo-tiazolidin-3-ilo ou oxazolidin-3-il ou os referidos substituintes R12 são opcionalmente mono- ou di-substituídos independentemente com carboxilo ou (Ci-C5)alcoxicarbonilo, hidroxi(Ci-C3)alquilo, amino(Ci-C3)alquilo ou mono-N- ou di-N,N-(Ci-C3)al-quilamino(C 1 -C3)-alquilo ou R12 é azetidin-l-ilo mono- ou di-substituído ou pirrolidin-l-ilo mono-ou di-substituído ou piperidin-l-ilo mono- ou di-substituído em que os referidos substituintes são independentemente carboxilo, (CrC5)alcoxicarbonilo, hidroxi-(Ci-C3)alquilo, amino(Ci-C3)alquilo, mono-N- ou di-N,N-(Ci-C3)alquilamino(Ci-C3)alquilo, hidroxilo, (CrC5)alcoxilo, amino, mono-N- ou di-N,N-(CrC5)al-quilamino, oxo, hidroxi-imino ou (Ci-C5)alcoxi-imino; e os anéis R12 são opcionalmente adicionalmente mono- ou di-substituídos independentemente com (C[-C5)alquilo. -30-

Compostos preferidos dentro do grupo imediatamente precedente de compostos particularmente preferidos são os compostos em que a. Ri é 5-cloro; R10e Rn são H; R4 é 4-fluoro-benzilo; RI2 é 4-hidroxi-pirrolidin-l-ilo; e a estereoquimica do carbono (a) é (S). b. R] é 5-cloro; R10 c Rn são H;e R4 é benzilo; R12 é 3-hidroxi-piperidin-l-ilo; e a estereoquimica do carbono (a) é (S). c. Ri é 5-cloro; R10 e Ru são H; R4 é benzilo;

Rn é cis-3,4-di-hidroxi-pirrolidin-l-ilo; e a estereoquimica do carbono (a) é (S). d. Ri é 5-cloro;

Rio e Rn são H; R4 é benzilo; R12 é 3-hidroxi-imino-pirrolidin-l-ilo; e a estereoquimica do carbono (a) é (S). e. Ri é 5-cloro;

Rio e Rn são H; R4 é 2-fluoro-benzilo; R12 c 4-hidroxipiperidin-l-ilo; e a estereoquimica do carbono (a) é (S). f. Ri é 5-cloro; R,o e Rn são H; -31 - R4 é benzilo; R12 é (3S,4S)-di-hidroxi-pirrolidin-l-ilo; e a estereoquimica do carbono (a) é (S). g· h.

Ri é 5-cloro; R10 e Rn são H; R4 é benzilo; R12 é 3-hidroxi-azetidin-l-ilo; e a estereoquimica do carbono (a) é (S). R] é 5-cloro;

Rio e Rn são H; R4 é benzilo; R12é 3-hidroxi-imino-azetidin-l-ilo; e a estereoquimica do carbono (a) é (S).

Ri é 5-cloro;

Rio e Rn são H; R4 é benzilo; R12 é 4-hidroxi-imino-piperidin-l-ilo; e a estereoquimica do carbono (a) é (S).

Um segundo grupo de compostos especialmente preferidos dentro do primeiro grupo de compostos preferidos são os compostos em que R4 é H, fenil(Ci-C2)alquilo, tien-2- ou -3-il(Ci-C2)alquilo, fur-2- ou -3-il(CrC2)alquilo em que os referidos anéis R4 são mono- ou di-substituídos independentemente com H ou fluoro; R6 é C(0)NR8R9; e

Rg é H, (Ci-C5)alquilo, hidroxilo ou (Ci-C^alcoxilo; e R9 é H, ciclo(C4-C6)alquilo, ciclo(C3-C6)alquil(Ci-C5)alquilo, metileno-perfluorado(Ci-Cg)alquilo, piridilo, pirrolidinilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, benzotiazolilo, ou tiocromanilo; ou -32-

Rq c (Ci-C5)alquilo em que os referidos (C|-C5)alquilo opcionalmente substituídos com ciclo(C4-C6)alcen-l-ilo, fenilo, tienilo, piridilo, pirrolidinilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, 1-oxotiomorfolinilo, ou 1,1-dioxotiomorfolinilo e onde o referido (Cj-C5)alquilo ou (C]-C4)alcoxilo é opcionalmente adicionalmente e independentemente mono- ou di-substituído com halo, hidroxilo, (Ci-Cs)alcoxilo, amino, mono-N- ou di-N,N-(Ci-C5)alquilamino, ciano, carboxilo, ou (Ci-C4)alcoxi-carbonilo; e em que os anéis R9 são opcionalmente mono- ou di-substituídos independentemente no carbono com halo, (CrC4)alquilo, (CrC4)alcoxilo, hidroxilo, amino, mono-N e di-N,N(Ci-C4)alquilamino, carbamoilo, (Ci-C5)alcoxicarbonilo ou carbamoilo.

Dentro do segundo grupo imediatamente precedente de compostos especialmente preferidos estão os compostos em que a. Rj é 5-cloro;

Rio e Rn são H; R4 é benzilo;

Rs é metilo; e R9 é 3-(dimetilamino)propilo; e b. a estereoquimica do carbono (a) é (S).

Ri é 5-cloro;

Rio e Rn são H; R4 é benzilo; R8 é metilo; e R9 é 3-piridilo; c. a estereoquimica do carbono (a) é (S).

Ri é 5-cloro;

Rioe Rn são H; -33- Á /rvv / s i.'\n i \„ R4 é benzilo;

R8 é metilo; e R9 é 2-hidroxietilo; e a estereoquimica do carbono (a) é (S). R] é 5-fluoro;

Rio e Rn são H; R4 é 4-fluorofenilmetilo; R8 é metilo; e

Ry é 2-morfolinoetilo.

Um terceiro grupo e compostos especialmente preferidos dentro do primeiro grupo de compostos preferidos são os compostos em que R4 é H, fenil(Ci-C2)alquilo, tien-2- ou -3-il(Ci-C2)alquilo, fur-2- ou -3-il(CrC2)alquilo em que os referidos anéis R4 são mono- ou di-substituídos independentemente com H ou fluoro; Rô é C(0)NR8R9; e

Rg é H, (Ci-Csjalquilo, hidroxilo ou (CrC4)alcoxilo; e R9 é (Ci-C4)alcoxilo em que 0 referido (Ci*C4)alcoxilo é opcionalmente substituído com ciclo(C4-C6)alcen-l-ilo, fenilo, tienilo, piridilo, pirrolidinilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfo-linilo, 1-oxotiomorfolinilo, ou 1,1-dioxotiomorfolinilo e onde o referido (C|-C5)alquilo ou (CpC^alcoxilo é opcionalmente adicionalmente e independen-temente mono- ou di-substituído com halo, hidroxilo, (Ci-C5)alcoxilo, amino, mono-N- ou di-N,N-(Ci-C5)alquilamino, ciano, carboxilo, ou (C]-C4)alcoxi-carbonilo; e em que os anéis R9 são opcionalmente mono- ou di-substituídos independentemente no carbono com halo, (CrC4)alquilo, (CrC4)alcoxilo, hidroxilo, amino, mono-N e di-N,N(Ci-C4)alquilamino, carbamoilo, (Ci-C5)alcoxicarbonilo ou carbamoilo.

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Dentro do terceiro grupo imediatamente precedente de compostos especialmente preferidos estão os compostos em que a. Ri é 5-cloro;

Rio e Rn são H; R4 é 4-benzilo;

Rs é metilo; e R9 é 2-hidroxietoxilo; e a estereoquimica do carbono (a) é (S). R! é 5-cloro;

Rio e Ru são H; R4 é 4-fluorofenilmetilo;

Rg é metilo; e R9 é metoxilo; a estereoquimica do carbono (a) é (S). Ri é 5-cloro;

Rio e Rn são H; R4 é benzilo;

Rs é metilo; e R9 é metoxilo;

Um segundo grupo de compostos preferidos de fórmula IA são aqueles compostos em que

Ri é 5-halo, 5-metilo, 5-ciano ou trifluorometilo;

Rio e Ru são cada um independentemente H ou halo; A é -(CH)=; R2 e R3 são H; R4 é H, fenil(Ci-C2)alquilo, tien-2- ou -3-il(Ci-C2)alquilo, fur-2- ou -3-il(Ci-C2)alquilo, em que os referidos anéis são mono- ou di-substituídos indepen- dentemente com H ou fluoro; R5 é H; e R6 é (C1-C5)alcoxicarbonilo.

Um terceiro grupo de compostos preferidos de fórmula IA são aqueles compostos em que

Ri é 5-halo, 5-metilo, 5-ciano ou trifluoromctilo; R10e R| | são cada um independentemente H ou halo; A é -(CH)=; R2 e R3 são H; R4 é H, metilo, fenil(Ci-C2)alquilo, em que os referidos grupos fenilo são mono- ou di-substituídos independentemente com H, halo, (CrC4)alquilo, (Ci-C4)alcoxilo, trifluorometilo, hidroxilo, amino ou ciano e em que os referidos grupos fenilo são adicionalmente mono-substituídos independentemente com halo; ou R4 é tien-2- ou -3-il(Ci-C2)aIquilo, pirid-2-, -3- ou -4-il(Ci-C2)aIquilo, tiazol-2-, -4- ou -541((1^-C2)alquilo, imidazol—2-, -4-, ou -5-il(Ci-C2)alquilo, fur-2- ou -3-il(Ci-C2)alquilo, pirrol-2- ou -3-il(Ci-C2)alquilo, oxazol-2-, -4- ou -5-il-(Ci-C2)alquilo, pirazol-3-, -4- ou -5-il(Ci-C2)aIquilo, isoxazol-3-,-4- ou -5-iI(C[-C2)alquilo, isotiazol-3-, -4- ou -5-il(Ci-C2)alquilo, piridazin-3- ou -4-il-(Ci-C2)alquilo, pirimidin-2-,-4, -5- ou -6-il(Ci-C2)alquilo, pirazin-2- ou -3-il(Cr C2)alquilo ou l,3,5-triazin-2-il(Ci-C2)aIquilo, em que os referidos heterociclos precedentes R4 são opcionalmente mono- ou di-substituídos independentemente com halo, trifluorometilo, (C’i-C4)alquilo, (CrC4)alcoxilo, amino ou hidroxilo e os referidos mono- ou di-substituintes estão ligados a carbono; R5 e H ; e Rô é carboxilo.

Dentro do terceiro grupo de compostos preferidos está um primeiro grupo de compostos especialmentc preferidos em que R10 e Rn são H; e R4 é H.

Particularmente preferidos dentro do grupo imediatamente precedente de compostos especialmente preferidos em que Ri é 5-cloro.

Outro aspecto desta invenção é a utilização dc a. um primeiro composto, consistindo o referido primeiro composto num inibidor de redutase; e b. um segundo composto, consistindo o referido segundo composto num inibidor da glicogénio-fosforilase, na preparação de um medicamento para tratar mamíferos que se apresentam com condições de resistência à insulina. A condições de resistência à insulina preferidas consideradas individualmente ou em grupo incluem diabetes, hiperinsulinemia, tolerância alterada à glucose, hiperglicemia e/ou hiperlipidemia a seguir às refeições, composição do corpo alterada, redução da massa corporal, obesidade (especialmente a obesidade visceral abdominal), hipertensão, dislipidemia (e.g., níveis aumentados de ácidos gordos livres, de tricegliceridos, de colesterol VLDL, e de colesterol LDL, e nível reduzido de colesterol HDL), aterosclerose, isquemia de tecidos e doenças cardiovasculares, síndroma X (também referido como "síndroma Metabólico"), gravidez, condições de infecção, uremia, hiperandrogenismo, hipercortisolemia ou outras condições de excesso de hormonas adrenocorticais, acromegalia, excesso de hormona de crescimento ou doença ovariana policística. -37-

Condiçõcs de resistência à insulina especial mente preferidas consideradas individualmente ou como um grupo incluem a dislipidemia, isquemia de tecidos, obesidade, doença ovariana policística, síndroma X e hipertensão.

Em particular diabetes é especialmente preferida.

Um inibidor de aldose-redutase preferido é o ácido 1-ftalazina-acético, 3,4-di-hidro-4-oxo-3-[[5-trifluorometil)-2-benzotiazol]metil]- ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Um inibidor preferido da glicogénio-fosforilase é [(lS)-benzil-(2R)-((3S,4S)-hidroxi-3-((3S)-hidroxi-pirrolidin-l-il)-2-oxopropil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(lS)-benzil-3-((3S,4S)-di-hidroxi-pirrolidin-l-il)-(2R)-hidroxi-3-oxopropil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(lS)-((R)-hidroxi-dimetilcarbamoil-metil)-2-fenil-etil]-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico, [(lS)-((R)-hidroxi-metoxi-metil-carbamoil)-metil)-2-fenil-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(lS)-((R)-hidroxi-[(2-hidroxi-etil)-metil-carbamoil]-metil)-2-fenil-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(lS)-benzil-2-(3-hidroxi-imino-pirrolidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico, [2-(cis-3,4-di-hidroxi-pirrolidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(lS)-benzil-3-((cis)-di-hidroxi-pirrolidin-l-il)-(2R)-hidroxi-3-oxopropil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, f2-((3S,4S)-di-hidroxi-pirrolidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(lS)-benzil-3-((cis)-3,4-di-hidroxi-pirrolidin-1-il)-(2R)-hidroxi-3-oxo-propil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(lS)-benzil-2-(cis-3,4-di-hidroxi-pirrolidin-l-il)-2-oxoetil]-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico, [2-(l,l-dioxotiazolidin-3-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(lS)-(4-fluoro-benzil)-2-(4-hidroxi-piperidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(lS)-benzil-2-((3RS)-hidroxi-piperidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(2-oxo-2-((lRS)-oxo-tiazolidin-3-il)-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indolc-2-carboxílico, [(1 S)-benzil-2-(3-hidroxi-azetidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico.

Um mamífero preferido é um ser humano macho ou a fêmea.

Outro aspecto preferido deste método é aquele em que o primeiro composto e o segundo composto são administrados substancialmente simultaneamente.

Outro aspecto desta invenção é uma composição farmacêutica sinergística para conseguir um efeito sensibilizador de insulina num mamífero compreendendo a. uma quantidade de um primeiro composto, consistindo o referido primeiro composto num inibidor da aldose redutase; e b. uma quantidade de um segundo composto, sendo o referido segundo composto um inibidor da glicogénio-fosforilase em que a quantidade do primeiro composto sozinha e a quantidade do segundo composto sozinha é insuficiente para conseguir o efeito sensibilizador de insulina se administrada sozinha e em que o efeito combinado das quantidades do primeiro e segundo compostos é maior que a soma dos efeitos sensibilizadores de insulina atingíveis com as quantidades individuais do primeiro e segundo composto, e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

Outro aspecto desta invenção é um conjunto ("kit") compreendendo: a. uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor da aldose-redutase e um veículo farmaceuticamente aceitável numa primeira forma de dosagem; b. uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor da glicogcnio-fosforilase e um veículo farmaceuticamente aceitável numa segunda forma de dosagem; c. veículos para conter as referidas primeira e segunda formas de dosagem.

Ainda outro aspecto desta invenção é a utilização de a. uma quantidade de um primeiro composto, consistindo o referido primeiro composto num inibidor da aldose-redutase; e b. uma quantidade de um segundo composto, sendo o referido segundo composto um inibidor da glicogénio-fosforilase, na preparação de um medicamento para conseguir um efeito sensibilizador de insulina num mamífero que apresente condições de resistência à insulina, em que a quantidade do primeiro composto sozinha e a quantidade do segundo composto sozinha é insuficiente para conseguir o referido efeito sensibilizador da insulina e em que o efeito combinado das duas quantidades do primeiro e do segundo compostos é maior que a soma dos efeitos sensibilizadores da insulina atingível com as quantidades individuais do primeiro e do segundo composto.

Outro aspecto desta invenção é dirigido para é a utilização de a. um inibidor da aldose-redutase; e b. um inibidor da glicogénio-fosforilase, na preparação de um medicamento para a redução da danificação de tecidos resultante ou que podia resultar de isquemia compreendendo a administração a um mamífero necessitado de tal tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz de

As isquemias de tecidos preferidas consideradas individualmente em grupo são aquelas em que o tecido isquémico é cardíaco, no cerebral, no fígado, rim, pulmão, intestino, músculo esquelético, baço, pâncreas, nervo, medula espinal, tecido da retina, vasculatura, ou tecido intestinal.

Um tecido isquémico especialmente preferido é o tecido cardíaco.

Preferencialmente, a combinação deta invenção é para ser administrada prolilacticamente. A lesão isquémica tratável de acordo com esta invenção pode ocorrer durante a transplantação de órgãos.

Preferencialmente, a combinação deta invenção é para ser administrada antes da cirurgia cardíaca. O termo condições de resistência à insulina refere-se a condições (um estado ou sindroma insulinoresistente) em que a sensibilidade e/ou a capacidade de resposta à insulina em órgãos, tecidos, ou células no corpo de um mamífero é reduzida em comparação com o estado normal (ou insulinosensível). Esta resistência resulta em múltiplas anormalidades dos níveis de glucose, proteínas, e do metabolismo de lípidos, balanços de electrolitos e iões, e do crescimento, por exemplo, por órgãos, tecidos, e células, que pode manifestar-se de um ou mais dos seguintes modos (mas não limitados a):hiperinsulinemia, tolerância à glucose "alterada" (IGT), hiperglicemia e/ou hiperlipidemia a seguir às refeições, diabetes tipo II, composição alterada do corpo, redução da massa corporal, obesidade (especialmente obesidade visceral abdominal), hipertensão, dislipidemia (e.g. aumento de ácidos gordos livres, dos níveis de trigliceridos, de colesterol VLDL, de colesterol LDL, e redução do nível de colesterol HDL), aterosclerose, isquemia de tecido, e doenças cardiovasculares (Kopelman e Albon, 1997; DeFronzo e Ferrannini, 1991; Reaven, 1991; Malmstrom, et al., 1997). Como resultado do estado de resistência à insulina, é requerida uma maior quantidade de insulina para se atingir ou aproximar a mesma acção biológica da insulina nos órgãos, tecidos e células comparada com o estado normal (ou sensível a insulina), que conduz a uma maior procura no pâncreas para que segregue mais insulina (liipeiinsulinemia piorada), e na circunstância nrais extrema, falha pancreática e insuficiência de insulina conduzindo à condição diabética tipo I. Os estados insulinoresistentes podem, por exemplo, incluir obesidade, síndroma X (também referido como "síndroma Metabólico"), gravidez, condições de infecção, uremia, hiperandrogenismo, hipercortisolemia ou outras condições de excesso de hormonas adrenocorticais, acromegalia, excesso de hormona de crescimento, ovários policísticos, ou pode ser associada com idade avançada ou grupos étnicos específicos (Kopelman e Albon, 1997). O termo efeito sensibilizador de insulina refere-se ao estado em que os tecidos do paciente estão desenvolvidos para dar uma resposta normal ou melhor que a resposta biológica normal a uma determinada quantidade de insulina. O termo "redução" é entendido como incluindo prevenção parcial ou prevenção que, embora maior que aquela que resultaria da utilização do fármaco ou de um placebo, é inferior a 100% em adição a uma prevenção substancial total. O termo "danos resultantes de [...Jisquemia" tal como é aqui empregue refere-se a condições directamente associadas com a redução do fluxo sanguíneo nos tecidos, por exemplo devido a um coágulo ou obstrução dos vasos samguíneos que fornecem sangue ao tecido em causa e que resulta, inter alia, na diminuição do transporte de oxigénio a tal tecido, comprometimento da eficácia do tecido, disfunções do tecido e necrose. Altemativamente, onde o fluxo de sangue ou a perfusão do órgão podem ser quantitativamente adequadas, a capacidade de transporte de oxigénio ou meio de perfusão do órgão pode estar reduzida, e.g., em ambiente hipóxico, de tal modo que está diminuído o aporte de oxigénio ao tecido, e sucede a eficácia do tecido alterada, a disfunção do tecido e a necrose do tecido. O termo inibidor de aldose-redutase refere-se a compostos que inibem a bioconversão da glucose em sorbitol catalisada pela enzima aldose-redutase. 0 termo inibidor da glicogénio-fosforilase refere-se a qualquer substância ou agente ou a alguma combinação de substâncias e/ou agentes que reduzem, retardam, ou eliminam a acção enzimática da glicogénio-fosforilase. A acção enzimática correntemente atribuída à glicogénio-fosforilase é a degradação de glicogénio por catálise da reacção reversível de uma macromolécula de glicogénio e fosfato inorgânico a glucose-1-fosfato e uma macromolécula de glicogénio que é mais curta por saída de um resíduo glicosilo em relação à molécula original (direcção do processo da glicogenólise). O termo "tratando", "tratar" ou "tratamento" tal como usado aqui inclui tratamento preventivo (e.g., profiláctico) e paliativo.

Por "farmaceuticamente aceitável" entende-se que o veículo, diluente, excipientes, e/ou sal devem ser compatíveis com os outros ingredientes da formulação, e por isso não prejudiciais ao seu recebedor. A expressão pró-fármaco refere-se a compostos que são precursores de fármacos que a seguir à administração, libertam o fármaco in vivo via algum processo químico ou fisiológico (e.g., um pró-fármaco ao ser levado ao pH fisiológico ou através da acção de uma enzima é convertido na forma de fármaco desejada). Os pró-fármacos exemplares libertam o correspondente ácido livre após clivagem. -44-

Por alquileno cntendc-sc um hidrocarboncto saturado (cadeia linear ou ramificada) em que um átomo de hidrogénio é removido de cada um dos carbonos terminais. Exemplos de tais grupos (assumindo que o comprimento designado abrange o exemplo particular) são metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno).

Por halo entende-se cloro, bromo, iodo, ou fluoro.

Por alquilo entende-se um hidrocarboneto de cadeia saturada linear ou hidrocarboneto saturado ramificado. Exemplos de tais grupos alquilo (assumindo que o comprimento designado abrange o exemplo particular) são metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec-butilo, butilo terciário, pentilo, isopentilo, neopentilo, pentilo terciário, 1-metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, hexilo, iso-hexilo, heptilo e octilo.

Por alcoxi entende-se um alquilo saturado de cadeia linear ou alquilo saturado ramificado ligado através de uma função oxi. Exemplos de tais grupos alcoxilo (assumindo que o comprimento designado abrange o exemplo particular) são metoxilo, etoxilo, propoxilo, isopropoxilo, butoxilo, isobutoxilo, butoxilo terciário, pentoxilo, isopentoxilo, neopentoxilo, pentoxilo terciário, hexoxilo, iso-hexoxilo, heptoxilo e octoxilo.

Tal como usado aqui o termo mono-N- ou di-N,N-(C]-Cx)alquil... refere-se à metade (Ci-Cx)alquilo considerada independentemente quando é di-N,N-(Ci-Cx)alquil...(x refere-se a números inteiros). E para ser compreendido que uma metade carbocíclica ou heterocíclica pode estar ligada ou de outro modo unida a um substrato designado, através de diferentes átomos do anel sem salientar um ponto específico de -45- ligação, sendo então de considerar todos os pontos possíveis, quer através de um átomo de carbono ou, por exemplo, um átomo de azoto trivalente. Por exemplo, o termo "piridir significa, por exemplo, 2-, 3-, ou 4-piridilo, o termo "tienil" significa, por exemplo, 2-, ou 3-tienilo, e por aí adiante. A expressão "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a sais aniónicos não-tóxicos tais como (mas não limitados a) cloreto, brometo, iodeto, sulfato, bissulfato, fosfato, acetato, maleato, fumarato, oxalato, lactato, tartarato, citrato, gluconato, metanossulfonato e 4-tolueno-sulfonato. A expressão refere-se também a sais catiónicos não-tóxicos tais como (mas não limitados a) sódio, potássio, cálcio, magnésio, amónio ou benzatina (N,N'-dibenziletilenediamina) protonada, colina, etanolamina, dietanolamina, etilenediamina, meglamina (N-metil-glucamina), benetamina (N-benzilfcnetilamina), piperazina ou trometamina (2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol).

Tal como usadas aqui, as expressões "solvente inerte a reacções" e "solvente inerte" referem-se a um solvente ou mistura de solventes que não interage com materiais de partida, reagentes, intermediários ou produtos de maneira a afectar adversamente o rendimento do produto desejado. O sinal de parentesco negativo ou positivo aqui usado na nomenclatura denota a direcção da rotação do plano da luz polarizada por um estereoisómero particular.

Um químico com experiência comum reconhecerá que certos compostos desta invenção conterão um ou mais átomos que podem existir num estereoisómero particular ou configuração geométrica, dando origem a isómeros estereoisómeros e configuracionais. Todos esses isómeros e misturas resultantes -46- são incluídos nesta invenção. Hidratos e solventes dos compostos desta invenção são também incluídos. DTT significa ditiotreitol, DMSO significa sulfóxido de dimetilo, EDTA significa ácido etilenodiaminotetra-acético.

Outras características e vantagens serão aparentes nas memória descritiva e reivindicações que descrevem a invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Em geral os compostos desta invenção podem ser preparados por processos que incluem processos conhecidos nas artes químicas, particularmente à luz da descrição aqui contida. Certos processos para o fabrico dos compostos desta invenção são fornecidos como características posteriores da invenção e são ilustrados pelos esquemas reaccionais seguintes. Outros processos podem ser descritos na secção experimental.

Qualquer inibidor da aldose-redutase pode ser usado como composto (agente activo) desta invenção. O termo inibidor da aldose-redutase refere-se a compostos que inibem a bioconversão da glucose a sorbitol catalisada pela enzima aldose-redutase. Talinibição é prontamente determinada por aqueles experientes na técnica de acordo com procedimentos de referência (J. Malone, Diabetes. 29:861-864, 1980. "Red Cell Sorbitol, an Indicator of Diabetic Control"). Uma variedade de inibidores da aldose-redutase são descritos e referenciados abaixo, contudo, outros inibidores da aldose-redutase serão do conhecimento dos peritos na técnica. Os nomes químicos comuns da nomenclatura dos EUA (USAN) ou outras designações estão entre parêntesis quando aplicável, juntamente com a referência à literatura de patentes apropriada revelando o composto. A actividade de um inibidor da aldose-redutase num tecido pode ser determinada pelo teste da quantidade de inibidor da aldose-redutase que é requerida para baixar a quantidade de sorbitol no tecido (i.e., inibindo a produção posterior de sorbitol consequente do bloqueamento da aldose-redutase) ou baixar a frutose do tecido (inibindo a produção de sorbitol consequente do bloqueamento da aldose-redutase e consequentemente a produção de frutose). Enquanto não se desejar estar ligado a alguma teoria particular ou mecanismo, acredita-se que um inibidor da aldose-redutase, ao inibir a aldose-redutase, previne ou reduz a lesão isquémica como descrito aqui a seguir.

Em concordância, os exemplos de inibidores da aldose-redutase úteis nas composições e métodos desta invenção incluem: 1. ácido 3-(4-bromo-2-fluorobenzil)-3,4-di-hidro-4-oxo- 1-ftalazina-acético (ponalrestat, US 4,251,528); 2. N[[(5-trifluorometil)-6-metoxi-l-naftalenil]tioxometil]-N-metilgli-cina (tolrestat, US 4,600,724); 3. ácido 5-[(Z,E)-b-metilcinamilidene]-4-oxo-2-tioxo-3-tiazolideno-acético (epalrestat, US 4,464,382, US 4,791,126, US 4,831,045); 4. ácido 3-(4-bromo-2-fluorobenzil)-7-cloro-3,4-di-hidro-2,4-di-hidro-2,4-dioxo-l(2H)-quinazolina-acético (zenarestat, US 4,734,419, e 4,883,800); 5. ácido 2R,4R-6,7-dicloro-4-hidroxi-2-metilcroman-4-acético (US 4,883,410); 6. ácido 2R,4R-6,7-dicloro-6-fluoro-4-hidroxi-2-mctilcroman-4- acético (US 4,883,410); 7. ácido 3,4-di-hidro-2,8-di-isopropil-3-oxo-2H-l ,4-benzoxazina-4- acético (US 4,771,050); 8. ácido 3,4-di-hidro-3-oxo-4-[(4,5,7-trifluoro-2-benzotiazolil)metilj-2H-l,4-benzotiazina-2-acético (SPR-210, U.S. 5,252,572); 9. N-[3,5-dimetil-4-[(nitrometil)sulfonil]fenil]-2-metil-bcnzenoacetamida (ZD5522, U.S. 5,270,342 e U.S. 5,430,060) 10. (S)-6-fIuoroespiro[croman-4,4'-imidazolidina]-2,5'-diona (sorbinil, US 4,130,714); 11. d-2-metil-6-fluoro-espiro(croman-4,,4'-imidazolidina)-2',5'-diona (US 4,540,704); 12. 2-fluoro-espiro(9H-fluoreno-9,4'-imidazolidina)-2',5'-diona (US 4,438,272); 13. 2,7-di-flaoro-espiro(9H-fluorcno-9,4'-imidazolidina)-2',5'-diona (US 4,436,745, US 4,438,272); 14. 2,7-di-fluoro-5-metoxi-espiro(9H-fluoreno-9,4’-imidazo-lidina)-2',5'-diona (US 4,436,745, US 4,438,272); 15. 7-fluoro-espiro(5H-indenol[l,2-b]piridina-5,3,-pirroli-dina)-2,5'-diona (US 4,436,745, US 4,438,272); 16. d-cis-6'-cloro-2',3'-di-hidro-2,-metil-espiro(imidazo-lina-4,4'-4'-H-pirano(2,3-b)piridina)-2,5-diona (US 4,980,357); 17. espiro[imidazolidina-4,5'(6H)-quinolina]2,5-diona-3'-cloro-7',8'-di~ hidro-7'-metil-(5'-cis)(US 5,066,659); 18. (2S,4S)-6-fluoro-2',5'-dioxo-espiro(croman-4,4'-imida-zolidina)-2-carboxamida (US 5,447,947) e 19. 2-[(4-bromo-2-fluorofenil)metil]-6-fluoro-espiro[iso-quinolina-4(lH),3,-pirrolidina]-l,2,,3,5'(2H)-tetrona (ARI-509, US 5,037,831).

Outros inibidores da aldose-redutase incluem compostos tendo a

fórmula II

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que Z é O ou S; R1 é hidroxilo ou um grupo capaz de ser removido in vivo para produzir um composto de fórmula II em que R1 é OH; e X e Y são o mesmo ou diferentes e são seleccionados de hidrogénio, trifluorometilo, fluoro, e cloro.

Um subgrupo preferido dentro do grupo acima descrito de inibidores da aldose redutase inclui os compostos numerados 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10, e 17, e os compostos seguintes de Formula II: 20. ácido 3,4-di-hidro-3-(5-fluorobenzotiazol-2-ilmetil)-4-oxoftalazin-1-ilacético [R1= hidroxilo; X=F; Y=H]; 21. ácido 3-(5,7-difluorobenzotiazol-2-ilmetil)-3,4-di-hidro-4-oxoftala-zin-l-ilacético [R1= hidroxilo; X=Y=F]; 22. ácido 3-(5-clorobenzotiazol-2-ilmetil)-3,4-di-hidro-4-oxoftalazin-l-ilacético [R1= hidroxilo; X=C1; Y=H]; 23. ácido 3-(5,7-diclorobenzotiazol-2-ilmetil)-3,4-di-hidro-4-oxoftala-zin-l-ilacético [R1= hidroxilo; X=Y=C1]; 24. ácido 3,4-di-hidro-4-oxo-3-(5-trifluorometilbenzoxazol-2-ilmetil)-ftalazin-l-ilaeétieo [R1- hidroxilo; X=CF3; Y=II]; 25. ácido 3,4-di-hidro-3-(5-fluorobenzoxazol-2-ilmetil)-4-oxoftalazin-1-ilacético [R1= hidroxilo; X=F; Y=H]; 26. ácido 3-(5,7-difluorobenzoxazol-2-ilmetil)-3,4-di-hidro-4-oxofta-lazin-l-ilacético [Rl= hidroxilo; X=Y=F]; 27. ácido 3-(5-clorobenzoxazol-2-ilmetil)-3,4-di-hidro-uxoftalazin-l-il-acético [R1= hidroxilo; X=F; Y=H]; 28. ácido 3-(5,7-diclorobenzoxazol-2-ilmetil)-4-di-hidro-4-oxoftalazin-1-ilacético [Rl= hidroxilo; X=Y=C1]; e 29. zopolrestat; ácido 1-ftalazina-acético, 3,4-di-hidro-4-oxo-3-[[5-(tri-fluorometil)-2-benzotiazolil]metil]-4- [Rl= hidroxilo; X=trifluorometilo; Y=H].

Nos compostos 20-23, e 29 Z é S. Nos compostos 24-28, Z é O.

Do subgrupo acima, os compostos 20-29 são mais preferidos com 29 especialmente preferido.

Os compostos inibidores da aldose-redutase desta invenção são prontamente disponíveis ou podem ser facilmente sintetizados por aqueles peritos na técnica usando métodos convencionais de síntese orgânica, particularmente tendo em vista as descrições pertinentes das especificações da patente.

Qualquer inibidor da glicogénio-fosforilase pode ser usado como o segundo composto desta invenção. O termo inibidor da glicogénio-fosforilase refere-se a qualquer substância ou agente ou qualquer combinação de substâncias e/ou agentes que reduz, retarda ou elimina a acção enzimática da glicogénio-fosforilase. A acção enzimática correntemente conhecida da glicogénio-fosforilase é a degradação do glicogénio por catálise da reacção reversível de uma macromolécula de glicogénio e fosfato inorgânico a glucose-1-fosfato e uma macromolécula de glicogénio que é mais curta por diferença de um resíduo em relação à macromolécula de glicogénio original (direcção da glicogenólise). Tais acções são prontamente determinadas por aqueles experientes na técnica de acordo com as determinações de referência (e.g., tal como descrito aqui a seguir). Uma variedade destes compostos são incluídos nos seguintes pedidos de patentes PCI publicados: publicação W096/39384 e W096/39385 de pedido de patente PCT. Contudo, outros inibidores da glicogénio-fosforilase serão conhecidos para os peritos na técnica.

Em geral os compostos de Fórmula I e IA podem ser feitos por processos que incluem processos conhecidos nas artes químicas, particularmente à luz da descrição aqui contida. Certos processos para o fabrico de compostos de Fórmula I e IA são fornecidos como características posteriores da invenção e são ilustrados pelos esquemas de reacção seguintes.

ESQUEMA I -52-

III -53-ESQUEMA ΤΙ

COOEt N

I

H

*11 VI

' V RÍn

Me

NO,

R

Ri-, IX

VIIIA

-54-ESQUEMA III

Agentes redutores VII

XVII

XVI

-55-ESQUEMA IV

R4 R4 ^>^\^K^COOAIquilo R4 ^JP\h/COOAIqui

OH

XXII

ΌΟΟΗ R12H

R8R9NH

Ra

OH XXIII r4

OH XXIV

Pt. N r3 ^>^\h^O00NR8Rg;C(0)8Ri2

OH XXV

XXVI

ESQUEMA V

XXXII XXXIII t -57- r4 ΖΙ

COOH

XL r4

COOH

XLII

ESQUEMA VI

Base, R3-X 1. PhCHO, reduz

2. NaCNBH3/R3CHO 3. H2 Exaustivo, Pd/C

OH XLIV κ R« R , R5 H2N R7

MIA

r4

Pt

COOH r3 R4

XLI

r5 r6

III

-58- ESQUEMA VII

-59- ESQUEMA VIII

R3 Oalquilo LXII R4

Ή

R7 0-(CH2)néster

LXIII

Pr

Re 0(CH2)nCH2NHPT1 LXVI R4

PT

r3 LXX

ESQUEMA IX

ESQUEMA X 'CHO

De acordo com o Esquema Reaccional 1 os compostos de Fórmula I, em que Ri, Rto, Ru, A, R2, R3, R4, R5, Ró e R7 são como definidos acima podem ser preparados por qualquer de dois processos gerais. No primeiro processo 0 composto desejado de Fórmula I pode ser preparado por acoplamento -61 - do ácido indole-2-carboxílico ou ácido indolina-2-carboxílico de Fórmula I apropriada com o composto amina de Fórmula III apropriada (i.e., acilando a amina). No segundo processo o composto de Fórmula I desejado pode ser preparado por acoplamento do composto de Fórmula IV apropriada (i.e., um composto de Fórmula I em que R6 é carboxilo) com o álcool apropriado ou amina de fórmula R8R9NH ou R12H em que R8, R9 e R12 são como definidos acima (i.e., acilando a amina ou álcool).

Tipicamente, o composto de Fórmula II é combinado com a amina apropriada (ou o composto de Fórmula IV é combinado com a amina apropriada (e.g., R12H ou R8R9NH)) ou álcool na presença de uma agente de acoplamento adequado. Um agente de acoplamento adequado é aquele que transforma um ácido carboxílico numa espécie reactiva que forma uma ligação amida ou éster por reacção com uma amina ou álcool, respectivamente. O agente de acoplamento pode ser um reagente que efectua esta condensação num só passo reaccional quando misturado com o ácido carboxílico e a amina ou álcool. Se o ácido é para ser condensado com um álcool é preferível empregar um grande excesso do álcool como solvente da reacção, com ou sem 1,0 a 1,5 equivalentes adicionados de dimetilaminopiridina. Reagentes de acoplamento exemplares são cloridrato de l-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbo-diimida-hidroxibenzotriazole (DEC/HBT), carbonildiimidazole, diciclo-hexilcar-bodiimida/hidroxibenzotriazole (HBT), 2-etoxi-l-etoxicarbonil-l,2-di-hidroqui-nolina (EEDQ), carbonildiimidazole/HBT, e dietilfosforileianeto. O acoplamento é realizado num solvente inerte, preferencialmente um solvente aprótico a uma temperatura de cerca de -20°C a cerca de 50°C durante 1 até cerca de 48 horas. Solventes exemplares incluem acetonitrilo, diclorometano, dimetilformamida e clorofórmio. O agente de acoplamento pode também ser aquele agente que converte o ácido carboxílico num intermediário activado que é isolado e/ou formado num primeiro passo e deixado a reagir com uma amina ou álcool num segundo passo. Exemplos de tais agentes de acoplamento e intermediários activados são o cloreto de tionilo ou cloreto de oxalilo para formar o cloreto de ácido, fluoreto cianúrico para formar um fluoreto de ácido ou um cloroformato de alquilo tal como cloroformato de isobutilo ou isopropenilo (com uma base amina terciária) para formar um anidrido misto do ácido carboxílico. Se o agente de acoplamento é o cloreto de oxalilo é vantajoso empregar uma pequena quantidade de dimetilformamida como co-solvente com outro solvente (tal como diclorometano) para catalisar a formação do cloreto de ácido. A utilização destes agentes de acoplamento e a selecção apropriada de solventes e temperaturas são conhecidas dos peritos na técnica ou podem ser prontamente determinadas por consulta da literatura. Estas e outras condições exemplares úteis para acoplamento de ácidos carboxílicos estão descritas em Houben-Weyl, Vol XV, parte II, Wunsch, Ed., G. Theime Verlag, 1974, Stuttgart, e M. Bodansky, "Principies of Peptide Synthesis," Springer-Verlag Berlin 1984, e "The Peptides. Analysis, Synthesis and Biology" (ed. E. Gross e J. Meienhofer), vols 1-5 (Academic Press NY 1979-1983).

Os compostos de Fórmula IV em que Rl5 R(0, Rn, A, R2, R3, R4, R5, e R7 são como definidos acima podem ser preparados a partir dos ésteres correspondentes de Fórmula V (i.e., compostos de Fórmula I em que R^ é (Cp C5)alcoxicarbonilo ou benziloxicarbonilo) por hidrólise com um álcali aquoso a uma temperatura de cerca de -20°C a cerca de 100°C, tipicamente a cerca de 20°C, durante cerca de 30 minutos a cerca de 24 horas.

Altemativamente, compostos de Fórmula IV são preparados por activação de um ácido indolecarboxílico de Fórmula II com um agente de -63 - acoplamento (como descrito acima) que dá um intermediário aclivado (Lai como um cloreto de ácido, fluoreto de ácido, ou anidrido misto) que então se deixa reagir com um composto de Fórmula II em que R3, R4, e R5, e R7 são como descritos acima e R6 é carboxi, num solvente adequado na presença de uma base adequada. Solventes adequados incluem água ou metanol ou uma mistura resultante, juntamente com um co-solvente tal como diclorometano, tetra-hidrofurano, ou dioxano. Bases adequadas incluem hidróxidos de sódio, potássio ou lítio, bicarbonato de sódio ou potássio, carbonato de sódio ou potássio, ou carbonato de potássio juntamente com brometo de tetrabutilamónio (1 equivalente) em quantidade suficiente para consumir o ácido libertado na reacção (geralmente aquela quantidade suficiente para manter o pH da reacção superior a 8). A base pode ser adicionada incrementalmente juntamente com o intermediário activado para efcctuar o controlo próprio de pH da reacção. A reacção é conduzida geralmente entre -20°C e 50°C. Procedimentos de isolamento são acrescentados por um entendido na técnica para remover impurezas, mas consistem tipicamente na remoção de co-solventes miscíveis com água por evaporação, extraeção de impurezas a pH elevado com um solvente orgânico, acidificação até pH baixo (1-2) e filtração ou extraeção do produto desejado com um solvente adequado tal como acetato de etilo ou diclorometano. 0 composto de Fórmula V pode ser preparado por acoplamento do composto apropriado de Fórmula III em que R6 é alcoxicarbonilo e o composto apropriado de Fórmula II num processo análogo ao descrito acima (e.g., Procedimento A).

Altemativamente, os compostos de fórmula I que contêm átomos de enxofre no estado de oxidação sulfóxido ou sulfona podem ser preparados a partir dos compostos de Fórmula I correspondentes tendo o átomo de enxofre na forma não oxidada, por tratamento com um agente oxidante adequado, tal como ácido -64- m-cloroperbenzóico em dicloromelano a urna lempeiatuia de cerca de 0°C a cerca de 25°C durante cerca de 1 a cerca de 48 horas usando cerca de 1 a cerca de 1,3 equivalentes para conversão ao estado de oxidação sulfóxido e superior a cerca de 2 equivalentes para conversão ao estado de oxidação sulfona.

Altemativamente, os compostos de Fórmula I que são mono- ou di-alquilados no aminoalcoxilo R5 podem ser preparados a partir do composto correspondente de Fórmula I em que R5 é aminoalcoxilo por monoalquilação ou dialquilação na amina R5 para preparar o composto desejado de Fórmula I. Tal mono- ou di-alquilação pode ser conduzida por tratamento do composto de Rs aminoalcoxilo com um equivalente do composto carbonílico apropriado (para monoalquilação) ou mais de 2 equivalentes do composto carbonílico apropriado (para dialquilação) e um agente redutor adequado num solvente adequado. Condições de redução adequadas incluem cianoboro-hidreto de sódio ou boro-hidreto de sódio em metanol ou etanol, ou hidrogénio/catalisador de hidrogenação (tal como paládio sobre carvão) num solvente polar tal como água, metanol, ou etanol a cerca de 0°C a 60°C durante 1 a 48 horas.

Altemativamente, os compostos de Fórmula I, em que R5 é alcanoiloxilo (RCOO-), são preparados por O-acilação do composto apropriado de Fórmula I com um cloreto de ácido apropriado ou outro derivado de ácido activado na presença, se necessário, de uma base adequada, (e.g., base amina terciária tal como trialquilamina ou piridina), preferencialmente num solvente aprótico tal como tetra-hidrofurano ou diclorometano, a uma temperatura de cerca de 0°C a cerca de 50°C, durante cerca de 0,5 a cerca de 48 horas.

Altemativamente, os compostos de Fórmula I em que R5 e R7 são considerados juntos como oxo são preparados por oxidação de um composto correspondente de Fórmula I, por exemplo, em que R5 é hidroxilo e R7 é H, com um agente oxidante adequado. Agentes oxidantes exemplares incluem o reagente Dess-Martin em diclorometano, uma carbodiimida e dimetilsulfóxido e um catalisador ácido (condições Pfitzner-Moffatt ou modificações resultantes, tais como empregar uma carbodiimida hidrossolúvel) ou reacções do tipo Swem (e.g., cloreto de oxalilo/DMSO/trietilamina). Os compostos de Fórmula I tendo outras funções sensíveis a oxidação podem beneficiar de protecção apropriada e desprotecção de tais funções.

Por exemplo, no Esquema Reaccional I certos compostos de Fórmula I contêm funções amina primária, amina secundária ou ácido carboxílico na parte da molécula definida por R5 ou R6 que podem interferir com a reacção de acoplamento desejada do Esquema Reaccional I se o intermediário de Fórmula III, ou R12H ou a amina R6R9NH for deixada desprotegida. Consequentemente, a funcionalidade amina secundária ou primária pode ser protegida se está presente nas metades R5 ou Rg do intermediário de Fórmula III ou amina (R6R9NH ou R12H) por um grupo protector apropriado durante a reacção de acoplamento do Esquema Reaccional I. O produto de tal reacção de acoplamento é um composto de Fórmula I contendo o grupo protector. Este grupo protector é removido num passo subsequente para produzir o composto de Fórmula I. Grupos protectores adequados para protecção de amina e ácido carboxílico incluem aqueles grupos protectores comummente usados em síntese de peptidos (tais como N-t-butoxicarbonilo, N-carbobenziloxilo, e 9-fluorenilmetilenoxi-carbonilo para aminas e alquilos baixos ou ésteres benzílicos para ácidos carboxílicos) que não são quimicamente reactivos nas condições de acoplamento descritas acima (e precedendo imediatamente os exemplos presentes como Procedimento A) e podem ser removidos sem alterar quimicamente outra funcionalidade no composto de Fórmula I. Os ácidos indole-2-carboxílicos e indolina-2-carboxílicos usados no Esquema Reaccional I, quando não disponíveis comercialmente ou conhecidos na técnica prévia (tal técnica está extensivamente publicada), estão disponíveis por métodos sintéticos convencionais. Por exemplo, de acordo com o Esquema Reaccional II o éster indole de Fórmula VII pode ser preparado a partir do composto de Fórmula VI (em que Q é seleccionado de modo a conseguir o A desejado como definido acima) via síntese de Fischer de indole (ver The Fischer índole Svnthesis, Robinson, B. (Wiley, New York, 1982)) seguida de saponifícação do éster indólico resultante de Fórmula VII para produzir o ácido correspondente de Fórmula VIII. A aril-hidrazona de partida pode ser preparada por condensação de uma hidrazina prontamente disponível com o derivado de carbonilo apropriado ou via reacção de Japp-Kjlingeman (ver Organic Reactions. Phillips, R. R., 1959, 10, 143).

Altemativamente, o ácido indole-2-carboxílico de fórmula VIIIA pode ser preparado por condensação de um composto orto-metil-nitro de Fórmula IX com um éster oxalato para produzir o éster indólico de Fórmula X seguido por redução do grupo nitro e subsequente hidrólise.

Este processo de três passos é conhecido como síntese de indole de Reissert (Reissert, Chemische Berichte 1897, 30, 1030). Condições para concretizar esta sequência, e referências relacionadas, são descritas na literatura (Kermack, et al., J. Chem. Soe. 1921, 119, 1602; Cannon et ah, J. Med. Chem., 1981, 24, 238; Julian, et al in Heterocyclic Compounds, vol 3 (Wiley, New York, NY, 1962, R.C. Elderfield, ed.) p 18). Um exemplo da implementação específica desta sequência é a dos Exemplos 10A-10C aqui contidos. Ácidos 3-Halo-5-cloro-lH-indole-2-carboxílicos podem também ser preparados por halogenação de ácidos 5-cloro-lH-indole-2-carboxílicos.

Altemativamente, (ao Esquema Reaccional II) as indolinas substituídas de Fórmula XIV podem ser preparadas por redução dos indoles . **> -67- ν._ correspondentes de Fórmula XV com agente redutor tal como magnésio em metanol a uma temperatura dc cerca de 25°C a cerca dc 65°C para cerca de 1 a cerca de 48 horas Esquema Reaccional III). Ácidos indolinacarboxílicos de Fórmula XVI são preparados por saponificaçao do éster de Fórmula XVII correspondente (Esquema Reaccional III). O composto de Fórmula XVII é preparado por redução do éster indólico correspondente de Fórmula VII com um agente redutor tal como magnésio em metanol tal como descrito para a conversão do composto de Fórmula XV no composto de Fórmula XIV acima.

Os parágrafos seguintes descrevem como preparar as várias aminas que são usadas nos Esquemas Reaccionais acima.

De acordo com o Esquema Reaccional IV os compostos de Fórmula XXII (as aminas de Fórmula III do Esquema Reaccional I em que R5 é OH, R7 é H e Ré é um éster) ou compostos de Fórmula XXVI (Ró é C(0)NR8R9 ou C(0)Ri2) são preparados a partir de um aldeído N-protegido (designado por PT) de Fórmula XX. O aldeído de Fórmula XX ou o aducto de bissulfito de sódio de um aldeído de Fórmula XX é tratado com cianeto de potássio ou de sódio em solução aquosa com um co-solvente tal como dioxano ou acetato de etilo a uma temperatura de cerca de 0°C a cerca de 50°C para produzir uma ciano-hidrina de Fórmula XXL A ciano-hidrina de Fórmula XXI é tratada com um álcool (e.g., (CrC6)alcanol tal como metanol) e um catalisador ácido forte tal como ácido clorídrico a uma temperatura de cerca de 0°C a cerca de 50°C, seguida da adição de água, se necessário. O grupo protector (PT) é então removido, se ainda presente, por um método de desprotecção apropriado resultando um composto de Fórmula XXII. Por exemplo, se o grupo N-protector PT da Fórmula XX é terc-butoxicarbonilo (t-Boc), o composto de Fórmula XXIII é directamente formado a partir do composto de Fórmula XXI, e a adição de água não é necessária. O composto de Fórmula XXII pode ser protegido no azoto com um grupo protector adequado para formar um composto de Fórmula XXIII seguido de hidrólise do éster com álcali aquoso a uma temperatura de cerca de 0°C a cerca de 50°C num solvente inerte à reacção resultando no hidroxiácido correspondente de Fórmula XXIV. O composto de Fórmula XXIV é acoplado (num procedimento análogo ao processo de acoplamento descrito no Esquema Reaccional I) com uma amina apropriada R8R9NH ou HR)2 para formar um composto de Fórmula XXV, que é então desprotegido resultando um composto de Fórmula XXVI (i.e., composto de Fórmula III em que R5 é OH, R7 é H e R^ é C(0)R12 ou C(0)NR8R9. Um exemplo da conversão de uma ciano-hidrina de Fórmula XXI no éster metílico correspondente de Fórmula XXII com remoção do grupo protector t-boc é o fornecido na publicação PCT WO/9325574, Exemplo la. Outros exemplos em que uma ciano-hidrina é convertida em ésteres alquílicos baixos de Fórmula XXIII pode ser encontrado na patente U.S. no. 4,814,342, e publicação EPO 0438233.

Certos compostos de Fórmula I são estereoisoméricos em virtude da sua configuração estereoquímica nos carbonos marcados a ou b. Um perito na técnica pode preparar intermediários de Fórmula XXII e XXVI com a esteroquímica desejada de acordo com o Esquema Reaccional IV. Por exemplo, o aldeído de Fórmula XX está disponível em qualquer das formas enantioméricas (estereoquímica em a) por processos da literatura esquematizados abaixo (ver Esquema Reaccional V). A ciano-hidrina de Fórmula XXI pode ser preparada a partir do composto de Fórmula XX por tratamento com cianeto de sódio ou potássio como descrito acima com manutenção da estereoquímica no carbono a resultando uma mistura de estereoisómeros no carbono b. O químico especializado pode empregar a cristalização nesta etapa para separar isómeros ou purificar urn isómero.

Por exemplo, a preparação do composto de Fórmula XXI em que PT é Boc, R3 é H, R4 é benzilo e a estereoquímica dos carbonos a e b é (S) e (R) respectivamente, empregando esta via juntamente com a purificação por recristalização é descrita em Biochemistry, 1992, 31, 8125-8141.

Altemativamente, a separação de isómeros pode ser efectuada por técnicas de cromatografía ou recristalização após conversão de um composto de Fórmula XXI (mistura de isómeros) num composto de Fórmula XXII, XXIII, XXIV, XXV, V, IV, ou I pelos processos e ou sequências aqui descritas. Os intermediários de Fórmula XXI de uma estereoquímica específica nos carbonos a e b são convertidos em intermediários de Fórmula XXII com retenção desta estereoquímica por tratamento com um álcool e um catalisador ácido forte, seguido de adição de água, se necessário, como acima descrito.

Alternativamente, o desejado isómero do composto de Fórmula XXI pode também ser obtido por derivatização do intermediário de Fórmula XXI e separação cromatográfica dos derivados diastereoisoméricos (por exemplo com cloreto de trimetilsililo (TMS) ou cloreto de t-butildimetil-sililo (TBDMS) para dar derivados O-TMS ou O-TBDMS). Um derivado sililo de um intermediário de Fórmula XXI tendo uma única forma estereoisomérica nos carbonos a e b é convertido com retenção de estereoquímica num intermediário de Fórmula XXII (se o grupo sililo não é removido neste passo é removido subsequentemente por um método apropriado, tal como tratamento com fluoreto de tetrabutilamónio em tetra-hidrofurano), pelo método descrito acima para a conversão do composto de Fórmula XXI no composto de Fórmula XXII.

De acordo com o esquema raccional V os aldeídos de Fórmula XX -70- (materiais de partida para o Esquema Reaccional IY) são preparados a partir dos aminoácidos correspondentes de Fórmula XXX. O aminoácido de Fórmula XXX é protegido no azoto com um grupo protector (PT) (tal como Boc). O composto protegido é esterifícado com um álcool e convertido num éster, preferencialmente o éster metílico ou etílico do composto de Fórmula XXXI. Isto pode ser conseguido por tratamento do composto de Fórmula XXX com iodeto e metilo ou etilo na presença de uma base adequada (e.g. K2C03) num solvente polar tal como dimetilformamida. O composto de Fórmula XXXI é reduzido, por exemplo, com hidreto de diisobutilalumínio em hexano ou tolueno, ou uma mistura resultante, a uma temperatura de cerca de -78°C a cerca de -50°C seguida de paragem com metanol a -78°C como descrito em J. Med. Chem., 1985, 28, 1779-1790 para formar o aldeído de Fórmula XX. Altemativamente (não ilustrado no Esquema Reaccional V), N-metoximetilamidas análogas correspondentes ao composto de Fórmula XXXI, em que o substituinte álcool do éster é substituído por N(OMe)Me, são formadas a partir de um composto de Fórmula XXX, N,0-dimetil-hidroxilamina e um agente de acoplamento adequado (e.g., cloreto de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (DEC). O composto resultante é reduzido, por exemplo, com hidreto de alumínio e lítio num solvente inerte à reacção tal como éter ou tetra-hidrofurano a uma temperatura de cerca de 0°C a cerca de 25°C para formar o aldeído de Fórmula XX. Este método de dois passos é geral para a conversão de α-aminoácidos N-protegidos em aldeídos de Fórmula XX (Fehrentz e Castro, Synthesis 1983, 676-678).

Altemativamente os aldeídos de Fórmula XX podem ser preparados por oxidação de aminoálcoois protegidos, por exemplo, com piridina-S03 a uma temperatura de cerca de -10°C a cerca de 40°C num solvente inerte à reacção, preferencialmente dimetilsulfóxido. Os aminoálcoois protegidos de Fórmula XXXITT, se não comercialmente disponíveis, podem ser preparados por protecção dos aminoálcoois de Fórmula XXXII. Os aminoálcoois de Fórmula XXXII são preparados por reduçãu dos aininoáeidos de Fórmula XXX. Esta redução é conseguida por tratamento dos compostos de Fórmula XXX com hidreto de alumínio e lítio de acordo com o processo descrito por Dickman et al., Organic Syntheses; Wiley: New York, 1990; Collect. Vol. VII, p 530, ou com ácido sulfurico-hidreto de boro e sódio pelo procedimento de Abiko e Masamune, Tetrahedron Lett. 1992 333, 5517-5518, ou com hidreto de boro e sódio-iodo de acordo com o procedimento de McKennon e Meyers, J. Org. Chem. 1993, 58, 3568-3571, que também reviu outros processos adequados para converter aminoácidos de Fórmula XXX em aminoálcoois de Fórmula XXXII.

De acordo com o Esquema Reaccional VI os compostos de Fórmula XXX utilizados no Esquema Reaccional V podem ser preparados como segue. Os aminoácidos de Fórmula XLI podem ser preparados por N-alquilação dos aminoácidos de Fórmula XL protegidos (PT) por tratamento com uma base apropriada e um agente alquilante. Procedimentos específicos para esta alquilação são descritos por Benoiton, Can. J. Chem 1977, 55, 906-910, e Hansen, J. Org. Chem. 1985, 50 945-950. Por exemplo, são utilizados quando R3 é metilo, hidreto de sódio e iodeto de metilo em tetra-hidrofurano. Desprotecção do composto de Fórmula XLI produz o composto desejado de Fórmula XXX.

Altemativamente, um aminoácido de Fórmula XLII pode ser N-alquilado por uma sequência de três passos envolvendo benzilação redutiva (tal como com benzaldeído, hidrogenação Pd/C-catalisada) para dar o derivado mono-N-benzilo e aminação redutiva com o composto acilo apropriado (por exemplo com formaldeído e cianoboro-hidreto de sódio para introduzir R3 como metilo) para dar o aminoácido N-benzilo, N-R3-substituído. O grupo protector N-benzilo é convenientemente removido (por exemplo por hidrogenação com um catalisador apropriado) para produzir o composto de Fórmula XXX. Condições específicas para este procedimento de alquilação de três passos são descritas por

Reinhold ct al., J. Mcd. Chem., 1968, 11,258-260. A preparação imediatamente precedente pode também ser usada para introduzir uma metade R3 no intermediário de Fórmula XLIV para formar 0 intermediário de Fórmula XLV (que é um intermediário de Fórmula III em que R3 é Η). A preparação imediatamente precedente pode também ser usada para introduzir uma metade R3 num intermediário de Fórmula Illa (que é um intermediário de Fórmula III em que R3 é H).

Os aminoácidos usados nos esquemas presentes (e.g., XL, XLII), se não comercialmente disponíveis, ou referidos na literatura, podem ser preparados por uma variedade de métodos conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, a síntese de Strecker ou variações resultantes podem ser usadas. Consequentemente, um aldeído (R4CHO), cianeto de sódio ou potássio e cloreto de amónio reagem para formar o aminonitrilo correspondente. O aminonitrilo é hidrolisado com ácido mineral para formar o aminoácido desejado de Fórmula XLII R4C(NH2)COOH. Altemativamente, pode ser usado o método de Bucherer-Berg em que se forma uma hidantoína por aquecimento de um aldeído (R4CHO) com carbonato de amónio e cianeto de potássio seguido de hidrólise (por exemplo, com hidróxido de bário em dioxano ao refluxo) com ácido ou base para formar o aminoácido desejado de Fórmula XLII R4C(NH2)COOH.

Outros métodos para a síntese de α-aminoácidos são também referidos na literatura que permitiria a um perito na técnica preparar o intermediário desejado de Fórmula XLII R4C(NH2)COOH necessário para a síntese dos compostos de Fórmula I. Métodos adequados para a síntese ou resolução de compostos de Fórmula XLII são encontrados em revisões de conjunto de Duthaler (Tetrahedron 1994, 50, 1539-1650), υυ ρυι Williams (R. Μ. Williams, Synthesis of optically active aminoacids. Pergamon: Oxford, U. K., 1989).

Um método específico para a síntese de um intermediário de Fórmula XLII em qualquer forma enantiomérica a partir do intermediário correspondente R4X (X = Cl, Br, ou I) e' o procedimento de Pirrung e Krishnamurthy (J. Org. Chem. 1993, 58, 957-958), ou pelo procedimento de 0'Donnell, et al. (J. Am. Chem. Soe. 1989, 111, 2353-2355). Os intermediários R4X requeridos são prontamente preparados por muitos métodos familiares ao químico perito na técnica. Por exemplo, aqueles compostos em que R4X é ArCH2X podem ser preparados por hidrogenação radicalar do composto ArCH3 ou por formolação do areno Ar-H e conversão do álcool ao brometo.

Outro método específico para a síntese de intermediários de Fórmula XLII em qualquer forma enantiomérica é 0 de Corey e Link (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 1906-1908). Assim, um intermediário de Fórmula R4COCCI3 é reduzido enantioespecificamente ao intermediário R4CH(0H)CC13, que é convertido por tratamento com azida e base a um intermediário R4CH(N3)COOH, que é reduzido por hidrogenação catalítica ao composto desejado de Fórmula XLII. A triclorometilcetona R4C0CC13 requerida é obtida por reacção do aldeído R4CHO com anião triclorometilato seguido de oxidação (Gallina e Giordano, Synthesis 199, 466-468).

As aminas intermediárias de Fórmula III (usadas no Esquema Reaccional I), em que R5 e R7 são H podem ser preparados de acordo com o Esquema Reaccional VII. Um aminoácido de Fórmula L (adequadamente protegido (Ρχ)) é activado por conversão a cloreto de ácido, fluoreto ou anidrido misto (e.g., com cloroformato de isobutilo e trietilamina num solvente inerte tal como tetra-hidrofurano ou dioxano a cerca de -0°C até cerca de -40°C) e o intermediário activado tratado com diazometano para dar a diazocetona de Fórmula LI. A diazocetona de Fórmula LI é tratada com um álcool (ROH) (e.g., (CrC6)alcanol tal como metanol), e um catalisador adequado tal como aquecimento, óxido de prata ou benzoato de prata para preparar o éster de Fórmula L1I. O éster de Fórmula LII é desprotegido para formar o composto de Fórmula IIIA (via rearranjo de Wolff). Altemativamente o éster de Fórmula LII é hidrolisado, com por exemplo um álcali, e acoplado com o R12H ou amina HNR8R9 apropriada para preparar o composto de Fórmula IITB como descrito previamente.

De acordo com o Esquema Reaccional VIII as aminas intermediárias de Fórmula III em que R5 é um substituinte oxigénio ligado (e.g., alcoxilo) (usado no Esquema Reaccional I) podem ser preparados como segue. O composto de Fórmula LXI é alquilado no oxigénio por tratamento com uma agente alquilante apropriado (e.g., alquiliodeto, alquilbrometo, alquilcloreto ou alquiltosilato) e base suficiente para formar o alcóxido (hidreto de sódio ou potássio) num solvente aprótico polar adequado (e.g., dimetilformamida ou tetra-hidrofurano) a uma temperatura de cerca de 0°C a cerca de 150°C resultando num composto de Fórmula LXII. O composto de Fórmula LXII é desprotegido para conduzir ao intermediário amina desejado.

As aminas intermediárias de Fórmula III em que R5 é (Cr C6)alcoxicarbonilalcoxilo (usado no Esquema Reaccional I) podem ser preparadas como segue. O composto de Fórmula LXI é alquilado com um éster halo-alcanoato para formar um composto de Fórmula LXIII que é então desprotegido para formar a amina desejada. O ácido correspondente pode ser preparado por hidrólise do éster usando álcali aquoso num solvente apropriado. Aquelas aminas de Fórmula III em que R6 contém um éster e R5 contem um carboxilo podem ser preparadas a partir da amina de Fórmula LXIII (tal como preparadas acima neste parágrafo), em que R5 contem a função ácido carboxílico protegida como éster t-butílico por tratamento com ácido anidro para originar o ácido correspondente em R5 sem hidrolisar o éster na posição R6. Os compostos de Fórmula LXVI (aminas intermediárias de Fórmula III em que R5 é aminoalcoxilo protegido) podem ser preparados a partir do composto de Fórmula LXI. O composto de Fórmula LXI é alquilado com um halo-alquilo-nitrilo para formar o composto de Fórmula LXIV. 0 composto de Fórmula LXIV é reduzido à amina primária por tratamento com hidrogénio e um catalisador apropriado (e.g., ródio sobre carbono) na presença de amoníaco, de preferência num solvente polar, prótico como água, metanol ou etanol para dar a amina primária dc Fórmula LXV. O composto de Fórmula LXV é protegido no azoto com um grupo protector (PTi), que é ortogonal ao outro grupo protector (PT), seguido de desprotecção do grupo protector Pt para produzir o composto de Fórmula III desejado. O composto de Fórmula III protegido é acoplado com o composto apropriado de Fórmula II e o composto protegido resultante de Fórmula I é desprotegido.

Os compostos de Fórmula LXIII e LXIV em que n é dois são preferencialmente preparados por tratamento do composto de Fórmula LXI com um excesso de éster acrilato ou acrilonitrilo, respectivamente, na presença de uma base adequada, tal como hidróxido de sódio ou potássio, num solvente adequado, preferencialmente um solvente polar prótico.

De acordo com o Esquema Reaccional IX os compostos de Fórmula LXVII e de Fórmula LXIX (compostos de Fórmula III em que R5 é F ou R5 e R7 são ambos F) podem ser preprados a partir do compostod e Fórmula LXI. O composto de Fórmula LXI é tratado com um agente de fluoração adequado tal como trifluoreto de dietilaminoenxofre num solvente inerte à reacção tal como um solvente aprótico, preferencialmente diclorometano, para formar o composto de Fórmula LXVII. O composto de Fórmula LXVII é convenientemente -76- desprotegido. O composto de Fórmula LXI é oxidado ao composto de Fórmula LXVIII utilizando as condições descritas acima para a preparação dos compostos de Fórmula I em que R5 e R7 em conjunto formam oxo. O composto de Fórmula LXVIII é difluorado em condições adequadas (e.g., dietilaminoenxofre em diclorometano).

De acordo com o Esquema Reaccional X o composto de Fórmula LXXIII ou o composto de Fórmula LXIV em que R7 é alquilo (i. e., o composto de Fórmula III em que R7 é alquilo) são preparados a partir de um composto de Fórmula LXX (ver também o Esquema Reaccional V para preparação de aminas análogas). O composto de Fórmula LXX é tratado com um reagente organometálico R7M e o álcool secundário resultante oxidado como no parágrafo directamente precedente para formar o composto de Fórmula LXXI. O composto de Fórmula LXXI é convertido via a cianidrina de Fórmula LXXII no composto de Fórmula LXXIII usando as mesmas condições que são usadas para converter o composto de Fórmula XXI no composto de Fórmula XXII no Esquema Reaccional IV.

Altemativamente, o composto de Fórmula LXXII ó convertido no composto de Fórmula LXIV como descrito para a conversão do intermediário ciano na amida no Esquema Reaccional V.

Um composto de Fórmula R8NH2 ou R9NH2 é monoalquilado com um composto carbonílico correspondendo a R8 ou R9, respectivamente, sob condições de aminação redutiva apropriada, para dar uma amina de fórmula R8R9NH. Para evitar dialquilação, pode ser preferível proteger as aminas (R8NH2 ou R9NH2) com um grupo protector adequado PT para dar R8(PT)NH ou -77- R.9(Pt)NH, por exemplo por reacçao com benzaldeido e um agente redutor. As aminas protegidas são monoalquiladas com um composto carbonílico correspondendo a R9 ou Rg respectivamente, sob condições de aminação redutiva adequada, para dar R8R9N(PT). O grupo protector (PT) é removido (e.g. por hidrogenação catalítica exaustiva quando PT é benzilo) para dar um composto de Fórmula RgR9NH. Condições de aminação redutiva apropriada estão disponíveis na literatura para os peritos na técnica. Estas condições incluem aquelas referidas por Borch et al. (J. Am. Chem. Soc. 1971, 2897-2904) e aquelas revistas por Emerson (Organic Reactions, Wiley: New York, 1948 (149, 174), Hutchins et al. (Org. Prep. Proced. Int 1979 (11), 20, e Lane et al. (Synthesis 1975, 135). Condições de aminação redutiva favorecendo a N-monoalquilação incluem aquelas referidas por Morales, et al. (Synthetic Communications 1984, 1213-1220) e Verardo et al. (Synthesis 1992 121-125). As aminas R8NH2 ou R9NH2 podem também ser monoalquiladas com R9X ou RgX, respectivamente, em que X é cloreto, brometo, tosilato ou mesilato. Altemativamente, um intermediário de fórmula RS(PT)NH ou R9(PT)NFI pode ser alquilado com R9X ou R8X, e o grupo protector removido para dar um composto de fórmula R8R9NH. Métodos adicionais podem ser usados para preparar aminas de fórmula R8R9NH em que R8-NH ou R9-NH são ligados por oxigénio-azoto. Assim um composto prontamente disponível de fórmula (Q-C^alcoxicarbonil-NHOH ou NH2CONHOH é dialquilado no azoto e oxigénio por tratamento com base e excesso adequado de agente alquilado adequado (R-X) para dar o correspondente (Ci-C4)alcoxicarbonil-N(R)OR que é então hidrolisado para dar um composto de fórmula R8R9NH (em que R8-R9-R). Condições adequadas, base e agente alquilante incluem as descritas por Goel e Krolls (Org. Prep. Proced. Int. 1987, 19, 75-78) e Major e Fleck (J. Am. Chem. Soc. 1928, 50, 1479). Altemativamente, uma amina de fórmula NH2CONH(OH) pode ser sequencialmente alquilada, primeiro no oxigénio para dar NH2CONH(OR’), depois no azoto para dar NH2CON(R") (OR'), por tratamento sucessivo com os agentes alquilantes R'X e R"X, respectivamente, na presença de uma base adequada. Uma base e agentes alquilantes adequados incluem os descritos por Kreutzcamp e Messinger (Chem. Ber. 100, 3463-3465 (1967) e Danen et al. (J. Am. Chem. Soc. 1973, 95, 5716-5724). Hidrólise destes derivados de hidroxi-ureia alquilados produz as aminas R'ONH2 e RONHR", que correspondem a certas aminas de fórmula RgRgNH. O químico perito na técnica pode adaptar os procedimentos descritos neste parágrafo a outros agentes alquilantes R, R', e R"-X para preparar outras aminas de fórmula RgR9NH em que R8-N ou R9-N são ligados oxigénio-azoto. Uno et al. (SynLett 1991, 559-560) descrevem a adição catalisada por BF3 de um reagente organometálico R-Li a uma óxima O-alquilo de fórmula R'CH=N-OR", para dar compostos de fórmula R'RCH-NH(OR"). Esta via pode também ser usada para dar compostos de fórmula R8R9NH em que um dos R8-NH ou R9-NH estão ligados oxigénio-azoto.

Pró-fármacos desta invenção em que o grupo carboxilo num ácido carboxílico de Fórmula I é substituído por um éster podem ser preparados por combinação do ácido carboxílico com o haleto de alquilo apropriado na presença de uma base tal como carbonato de potássio num solvente inerte tal como dimetilformamida a uma temperatura de cerca de 0°C a 100°C durante cerca de 1 a cerca de 24 horas. Altemativamente o ácido é combinado com um álcool apropriado como solvente na presença de uma quantidade catalítica de ácido tal como ácido sulfúrico concentrado a uma temperatura de cerca de 20°C a 120°C, preferencialmente ao refluxo, durante cerca de 1 hora a cerca de 24 horas. Outro método é a reacção do ácido com uma quantidade estequiométrica do álcool na presença de uma quantidade catalítica de ácido num solvente inerte tal como tetra-hídrofurano, com remoção concomitante da água que é produzida por meios físicos (e.g. trapa de Dean-Stark) ou químicos (e.g. "molecular sieves").

Os pró-fármacos desta invenção em que uma função álcool foi derivatizada como éter podem ser preparados combinando o álcool com o brometo ou iodeto de alquilo apropriado na presença de uma base tal como o carbonato de potássio num solvente inerte tal como a dimetilformamida a uma temperatura de cerca de 0°C a 100°C durante cerca de 1 a cerca de 4 horas. Éteres alcanoilaminometílicos podem ser obtidos por reacção do álcool com um bis-(alcanoilamino)metano na presença de uma quantidade catalítica de ácido num solvente inerte tal como tetra-hidrofurano, de acordo com um método descrito na patente US 4,997,984. Altemativamente, estes compostos podem ser preparados por métodos descritos por Hoffman et al. no J. Org. chem. 1994, 59, 3530.

Os ésteres dialquilfosfato podem ser preparados por reacção do álcool com um dialquilclorofosfato na presença de uma base num solvente inerte tal como tetra-hidrofurano. Os di-hidrogenofosfatos podem ser preparados por reacção do álcool com um clorofosfato de diarilo ou dibenzilo como descrito acima, seguida de hidrólise ou hidrogenação na presença de um catalisador metálico nobre, respectivamente.

Os glicosidos são preparados por reacção do álcool e um hidrato de carbono num solvente inerte tal como tolueno na presença de ácido. Tipicamente a água formada é removida à medida que sc forma como acima descrito. Um procedimento alternativo é a reacção do álcool com um haleto de glicosilo adequadamente protegido na presença de base seguida de desprotecção. Ν-( 1 -hidroxialquil)amidas, Ν-( 1 -hidroxi-1 -(alcoxicarbonil) inclinam idas ou compostos em que R2 foi substituído por C(0H)C(0)0Y podem ser preparados por reacção da amida ou Índole progenitor com o aldeído apropriado em condições neutras ou básicas (e.g. etóxido de sódio em etanol) a temperaturas entre 25 e 70°C. N-alcoximetilindoles ou N-l-(alcoxi)alquilindoles podem ser obtidos por reacção do índole N-insubstituído com o haleto de alquilo necessário na presença de uma base num solvente inerte. l-(N,N-dialquilaminometil)indole, l-(l-(N,N-dialquilamino)etil)indole e Ν,Ν-dialquilaminometilamidas (e.g. R3=CH2N(CH3)2) podem ser preparadas por reacção do composto N-H progenitor com o aldeído e amina apropriada num solvente alcoólico a 25 a 70°C.

Pró-fármacos cíclicos (e.g., os pró-fármacos desta invenção em que R2 e R3 são um carbono comum) podem ser preparados por reacção do composto progenitor (fármaco) com um aldeído ou cetona ou o seu dimetilacetal num solvente inerte na presença de uma quantidade catalítica de ácido com remoção concomitante de água ou metanol. Altemativamente, estes compostos podem ser preparados por reacção do aminoálcool ou hidroxiamida com um gem-dibromoalcano na presença de base (e.g. carbonato de potássio) num solvente inerte (e.g. dimetilformamida).

Os compostos de Fórmula IA podem ser preparados como descrito acima.

Os números dos esquemas e os números das fórmulas mencionados após este ponto no texto referem-se a números de esquema e a números de fórmula que aparecem após este ponto no texto (i.e., não devem ser confundidos com a discussão precedente).

ESQUEMA XI -81 -Rn R4V< >r;

Rfi

Nn R5 A^\ R3 nr9

IA

RVOJRio R11

Procedimento A (Cí-CbIOHN R8R9NH\

Procedimento A O A—

OH NR,

R jtV‘ώΑ

II

R4 .COOHwy Ar=\ P-3 NR2 IV

R

Rio Rn álcali aquoso R4 RXR H-^ Ks Rr

III

R R\ ^.COOCn-Cs; benzi lo\ Xr R R5

NR, A^< R3

Rio

V

- 82 - ESQUEMA XII

vi

Me A\VoJ •io 1. (ROCO)?, base

VII IA

- 83 - ESQUEMA XIII

VII XVI

XVII - 84- R„ Η·

COOH R,

XVIII

ESQUEMA XIV

r4 pt . U-COOH

R12H R8R9NH

Rc R,

XVIII R„ R»

CONR8R9 ; C(O)R Rc 12 ^1^'CONRgRg ; C (O) R12 R, R,

XXV

Illb

ESQUEMA XV

XXXII

R3

Px

XXX

RXR= COOR I r3 XXXI

XXXIII

ESQUEMA XVI

p Kq1\/ 5 "N-^^COOH H XL

Base, R3-X

R4X .Ks HNÍ ^COOH

XLI R. h2n- 5 1. PhCHO, reduz COOH 2. NaCNBH3/ composto de XLI1 carbonilo adequado R R R4\/ tkí'' Xr·

HN- 1 R

5 COOH

XXX 3. H2, Pd/C exaustivo

Illa 111

De acordo com o Esquema Reaccional XI os compostos de Fórmula IA, em que Ri, R)0, Rn, A, R2, R3, R4, R5 e Rô são como definidos acima podem ser preparados por qualquer de dois processos gerais. No primeiro processo o composto desejado de Fórmula IA pode ser preparado por acoplamento do ácido indolc-2-carboxílico de Fórmula II, ácido indolina-2-carboxílico ou ácido benzimidazole-2-carboxílico com a amina apropriada de Fórmula III (i.e,, acilando a amina). No segundo processo o composto desejado de Fórmula IA pode ser preparado por acoplamento do composto apropriado de Fórmula IV (i.e., um composto de Fórmula IA em que R6 é carboxilo) com o álcool apropriado ou -86- a amina de Fórmula R8R9NH ou R12H, em que R8R9 e R12 são como definidos acima (i.e., acilando a amina ou álcool). O primeiro processo (acoplamento de compostos de Fórmula II com compostos de Fórmula III é tipicamente preferido quando R4 não é H e R5 é H).

Tipicamente, o composto de Fórmula II é combinado com 0 composto de Fórmula III (ou o composto de Fórmula IV é combinado com a amina apropriada (e.g., R12H ou R8R9NH)) ou álcool na presença de um agente de acoplamento adequado. Um agente de acoplamento adequado é aquele que transforma um ácido carboxílico numa espécie reactiva que forma uma ligação amida ou éster por reacção com uma amina ou álcool, respectivamente. O agente de acoplamento pode ser um reagente que efectua esta condensação num processo único quando misturado conjuntamente com o ácido carboxílico e a amina ou álcool. Se 0 ácido é para ser condensado com um álcool é preferível empregar um grande excesso do álcool como solvente da reacção, com ou sem 1,0 a 1,5 equivalentes adicionados de dimetilaminopiridina. Reagentes de acoplamento exemplares são cloreto de l-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida-hidroxibenzotriazole (DEC/HBT), carbonildiimidazole, diciclo-hexilcarbodiimida/ hidroxibenzotriazole (HBT), 2-etoxi-l-etoxicarbonil-l,2-di-hidroquinolina (EEDQ), carbonildiimidazole/HBT, anidrido propanofosfónico (anidrido ácido propanofosfónico, PP A) e dietilfosforileianeto. O acoplamento é realizado num solvente inerte, preferencialmente num solvente aprótico a uma temperatura de cerca de -20°C a cerca de 50°C durante cerca de 1 a cerca de 48 horas, na presença opcional de uma base amina terciária tal como a trietilamina. Solventes exemplares incluem acetonitrilo, diclorometano, acetato de etilo, dimetilformamida e clorofórmio ou misturas resultantes. O agente de acoplamento pode também ser aquele agente que converte o ácido carboxílico num intermediário activado que é formado e/ou isolado num primeiro passo e deixado a reagir com uma amina ou álcool num segundo passo. Exemplos de tais agentes de acoplamento e intermediários activados são cloreto de tionilo ou cloreto de oxalilo para formar o cloreto de ácido, fluoreto cianúrico para formar um fluoreto de ácido ou um cloroformato de alquilo tal como o cloroformato de isobutilo ou isopropenilo (com uma base amina terciária) para formar um anidrido misto do ácido carboxílico. Se o agente de acoplamento é cloreto de oxalilo é vantajoso empregar uma pequena quantidade de dimetilformamida como co-solvente com outro solvente (tal como diclorometano) para catalisar a formação do cloreto de ácido. O cloreto de ácido pode ser acoplado misturando uma base apropriada com o intermediário de Fórmula III num solvente apropriado. Combinações apropriadas solvente/base são por exemplo, diclorometano, dimetilformamida ou acetonitrilo ou misturas resultantes na presença de uma base amina terciária e.g., trietilamina. Outras combinações solvente/base apropriadas incluem água ou um (C|-C5)álcool ou uma mistura resultante em conjunto com um co-solvente tal como diclorometano, tetra-hidrofurano ou dioxano e uma base tal como carbonato de sódio ou potássio, hidróxido de sódio, potássio ou lítio ou bicarbonato de sódio em quantidade suficiente para consumir o ácido libertado na reacção.O uso de um catalisador de transferência de fase (tipicamente 1 a 10 mole %) tal como um haleto de amónio quaternário (e.g. brometo de tetrabutilamónio ou cloreto de metiltrioctilamónio) é vantajoso quando é empregada uma mistura de co-solventes apenas parcialmente miscíveis (e.g. diclorometano-água ou diclorometano-metanol). O uso destes agentes de acoplamento e a selecção apropriada de solventes e temperaturas são conhecidos dos peritos na técnica ou podem ser prontamente determinados a partir da literatura. Estas e outras condições exemplares úteis para acoplamento de ácidos carboxílicos estão descritas em Houben-Weyl, Vol XV, part II, E. Wunsch, Ed., G. Theime Verlag, 1974, Stuttgart, and M. Bodanski, Principies og Peptide Synthesis, Springer-Verlag Berlin 1984, and The Peptides. Analysis,

Synthesis and Biology (ed. E. Gross and J. Meienhufei), vols 1-5 (Acadcmic Press NY 1979-1983).

Os compostos de Fórmula IV em que Ri, Ri0, Rn, A, R2, R3, R4 e R5 são como definidos acima podem ser preparados a partir dos ésteres correspondentes de Fórmula V (i.e., compostos de Fórmula I em que Rg é (Cr C5)alcoxicarbonilo ou benziloxicarbonilo) por hidrólise com um álcali aquoso a uma temperatura de cerca de -20°C a cerca de 100°C, tipicamnete a cerca de 20°C, durante cerca de 30 minutos a cerca de 24 horas.

Altemativamente, compostos de Fórmula IV são preparados por activação de um ácido indolecarboxílico de Fórmula II com um agente de acoplamento (como descrito acima) que dá um intermediário activado (tal como um cloreto de ácido, fluoreto de ácido, ou anidrido misto) que então se deixa reagir com um composto de Fórmula II em que R3,R4 e R5 são como descrito acima, e R6 é carboxilo, num solvente adequado na presença de uma base adequada. Solventes adequados incluem água, ou metanol ou uma mistura resultante, juntamente com um co-solvente tal como diclorormetano, tetra-hidrofurano, ou dioxano. Bases adequadas incluem hidróxidos de sódio, potássio ou lítio, bicarbonato de sódio ou potássio, ou carbonato de potássio em conjunto com brometo de tetrabutilamónio (1 equivalente) em quantidade suficiente para consumir o ácido libertado na reacção (geralmente aquela quantidade suficiente para manter o pH da reacção superior a 8). A base pode ser adicionada incrementalmente juntamente com o intermediário activado para efectuar o controlo de pH próprio da reacção. A reacção é conduzida geralmente entre -20°C e 50°C. Os procedimentos de isolamento são adaptados pelos peritos na técnica de modo a remover impurezas, mas tipicamente consistem na remoção de co-solventes miscíveis com água por evaporação, extracção de impurezas a pH elevado com um solvente orgânico, acidificação a pH baixo (1-2) e filtração, ou - 89 - extracçao do produto desejado com urri solvente adequado tal como acetato de etilo ou diclorometano. O composto de Fórmula V pode ser preparado por acoplamento do composto de Fórmula III apropriado em que R6 é alcoxicarbonilo e o composto apropriado de Fórmula II por um procedimento análogo ao descrito acima.

Altemativamente, os compostos de Fórmula IA que contém átomos de enxofre no estado de oxidação sulfóxido ou sulfona podem ser preparados a partir dos compostos correspondentes de Fórmula IA contendo o átomo de enxofre na forma não oxidada, por tratamento com um agente oxidante apropriado, tal como ácido m-cloroperbenzóico em diclorometano a uma temperatura de cerca de 0°C a cerca de 25°C durante cerca de 1 a cerca de 48 horas usando cerca de 1 a cerca de 1,3 equivalentes para conversão do estado de oxidação sulfóxido e mais de 2 equivalentes para conversão ao estado de oxidação sulfona.

Por exemplo, no esquema reaccional XI certos compostos de Fórmula IA contém funções amina primária, amina secundária ou ácido carboxílico na parte da molécula definida por R6 que podem interferir com a reacção de acoplamento desejada do Esquema Reaccional XI, se o intermediário de Fórmula III ou a amina R12H ou RgR9NH é deixada desprotegida. Consequentemente, a função amina primária, amina secundária ou ácido carboxílico pode ser protegida, sempre que esteja presente nas metades R6 da amina R12H ou R6RyNH intermediária de Fórmula III por um grupo protector adequado durante a reacção de acoplamento do Esquema Reaccional XI. O produto de tal reacção de acoplamento em tal caso é um composto de Fórmula IA contendo o grupo protector. Este grupo protector é removido num passo subsequente para fornecer o composto de Fórmula IA. Grupos protectores -90- adequados para protecção de amina e de ácido carboxílico incluem aqueles grupos protectores usados comurnmente na síntese de peptidos (tal como N-t-butoxicarbonilo, N-carbobenziloxilo, e 9-fluorenil-metilenoxicarbonilo para aminas e ésteres benzílicos e alquílicos mais baixos para ácidos carboxílicos) que não são reactivos quimicamente nas condições de acoplamento descritas acima e podem ser removidos sem alterar quimicamente outra funcionalidade no composto de Fórmula IA.

Os ácidos indole-2-carboxílicos de partida usados no Esquema Reaccional XI, quando não comercialmente disponíveis ou conhecidos no estado da técnica (tal técnica está publicada extensivamente), estão disponíveis por métodos sintéticos convencionais. Por exemplo, de acordo com o Esquema Reaccional XII o éster indólico de Fórmula VII (em que A não é azoto) pode ser preparado a partir do composto de Fórmula VI (em que Q é selcccionado para conseguir o A desejado como definido acima, excepto para N) via síntese de Fischer de indole (ver The Fischer índole Svnthesis Robinson, B. (Wiley, New York, 1982)) seguida por saponifícação do éster indólico de Fórmula VII resultante para dar o ácido correspondente de Fórmula VIII. A aril-hidrazona de partida pode ser preparada por condensação de uma hidrazina prontamente disponível com o derivado de carbonilo apropriado ou via reacção de Japp-Klingeman (ver Organic Reactions, Phillips, R. R., 1959, 10, 143).

Altemativamente, o ácido indole-2-carboxílico de Fórmula VIIIA pode ser preparado por condensação de um composto orto-metil-nitro de Fórmula IX com um éster oxalato para dar o éster indólico de Fórmula X seguida de redução do grupo nitro e subsequente pirrólise.

Este processo de três passos é conhecido como síntese de indole de Reissert (Reissert Chemische Berichte 1897, 30, 1030). Condições para conseguir -91 - esta sequência, e referências com ela realcionadas, estão descritas na literatura (Kcrmack, et al., J. Chem. Soc. 1921, 119, 1602; Cannon et al., J. Med. Chem. 1981, 24, 238; Julian, et al in Heterocyclic Compounds, vol 3 (Wiley, New York, NY, 1962, R.C. Elderfíeld, ed.) p 18). Ácidos 3-halo-5-cloro-lH-indole-2-carboxílicos pode ser também preparados por halogenação de ácidos 5-cloro-lH-indole-carboxíbcos.

De acordo com o Esquema Reaccional XIII os intermediários ácidos benzi midazoles-2-carboxílicos de Fórmula XI podem ser preparados por condensação de um composto orto-diamina de Fórmula XIII com ácido glicólico, seguida de oxidação do benzimidazole-2-metanol de Fórmula XII resultante (Bistrzycki, A. e Przeworski, G. Ber. 1912, 45, 3483). Altemativamente, (ao Esquema Reaccional XII) as indolinas substituídas de Fórmula XIV podem ser preparadas por redução das indolinas correspondentes de Fórmula XV com um agente redutor tal como magnésio em metanol a uma temperatura de cerca de 25°C a cerca de 65°C durante cerca de 1 a cerca de 48 horas (Esquema Reaccional III).

Os ácidos indolinacarboxílicos de Fórmula XVI podem ser preparados por saponificação do éster correspondente de Fórmula XVII (Esquema Reaccional XIII). O éster de Fórmula XVII é preparado por redução do éster indólico correspondente de Fórmula VII com um agente redutor tal como magnésio em metanol como descrito para a conversão do composto de Fórmula XV acima.

Os parágrafos seguintes descrevem modos de preparar as várias aminas que são usadas nos Esquemas Reaccionais acima. -92-

De acordo com o Esquema Reaccional XIV um alfa-aminoácido dc Fórmula XXIII pode ser protegido no azoto com um grupo protector adequado (Pt) (e.g., t-Boc) para formar um composto de Fórmula XXIV. Um perito na técnica pode seleccionar prontamente um grupo protector adequado e um método para a sua introdução. Por exemplo, dois grupos protectores comuns são t-Boc (introduzido por tratamento do aminoácido com di-t-butildicarbonato num solvente adequado preferencialmente prótico ou uma mistura de solventes a pH elevado) e CBZ (introduzido por tratamento do aminoácido com benzilcloroformato num solvente adequado, preferencialmente prótico ou uma mistura de solventes e base). O composto de Fórmula XXIV é acoplado (por um processo análogo ao processo de acoplamento descrito no Esquema Reaccional XI) com uma amina apropriada R6R9Nf f ou R12H para formar um composto de Fórmula XXV, que é então desprotegido resultando o composto de Fórmula Illb (i.e., composto de Fórmula III em que Rg é C(0)R|2 ou C(O)NRgRi)). Se o grupo protector é t-Boc por tratamento do composto de Fórmula XXV com um ácido num solvente adequadopreferencialmente aprótico. Ácidos para esta desprotecção incluem HC1, MeS03H ou ácido trifluoroacético.

De acordo com o Esquema Reaccional XV um composto de Fórmula XXXI (amina de Fórmula III N-protegida em que R^ é (Cr Cg)alcoxicarbonilo ou benziloxicarbonilo) pode ser preparado a partir do aminoácido desprotegido de Fórmula XXX correspondente através de N-protecção (produzindo o aminoácido protegido de Fórmula XXXIII) seguida de esterifícação. Por exemplo, o composto de Fórmula XXXIII pode ser esterificado com o álcool apropriado e um catalisador ácido tal como cloreto de hidrogénio ou cloreto de tionilo, ou no caso do tert-butanol por tratamento do aminoácido com isobutileno e um catalisador ácido tal como ácido sulfurico concentrado ou por tratamento com um haleto de alquilo (e.g., iodeto de metilo) e uma base (e.g., carbonato de potássio). Altemativamente, a esterifícação pode preceder 0 passo de protecção.

De acordo com o Esquema Reaccional XVI os compostos de Fórmula XXX em que R3 não e H utilizados no Esquema Reaccional V podem ser preparados como segue. Os aminoácidos de Fórmula XLI podem ser preparados por N-alquilação dos aminoácidos protegidos (PT) de Fórmula XL por tratamento com uma base apropriada e agente alquilante. Procedimentos específicos para esta alquilação estão descritos por Benoiton, Can. J. Chem 1977, 55, 906-910, and Hansen, J. Org. Chem. 1985, 50 945-950. Por exemplo, quando R3 é metilo, e PT é Boc, são utilizados hidreto de sódio e iodeto de metilo em tetra-hidrofurano. Desprotecção do composto de Fórmula XLI origina o composto desejado de Fórmula XXX.

Altemativamente, o aminoácido de Fórmula XLII pode ser N-alquilado por um processo com uma sequência de três passos envolvendo benzilação redutiva (tal como com benzaldeído, hidrogenação catalisada por Pd/C) para dar o derivado mono-N-benzilo e aminação redutiva com um composto carbonílico apropriado (por exemplo com formaldeído e cianoboro-hidreto de sódio para introduzir R3 como metilo) para dar aminoácido N-benzilo, N-R3-substituído. O grupo protector N-benzilo é convenientemente removido (por exemplo por hidrogenação com um catalisador apropriado) para produzir o composto de Fórmula XXX. Condições específicas para este procedimento de três passos estão descritas por Reinhold et al., J. Med. Chem., 1968, 1_1_, 258-260. A preparação imediatamente precedente pode também ser usada para introduzir uma metade R3 num intermediário de Fórmula Illa (que é um intermediário de Fórmula III em que R3 é H).

Os aminoácidos usados nos esquemas aqui incluídos (e.g., XL, XLII), se não forem comercialmente disponíveis, ou descritos na literatura, -94-

podem ser preparados por uma variedade de métodos conhecidos dos peritos ua técnica. Por exemplo, pode ser usada a síntese de Strecker ou variações relacionadas. Consequentemente, um aldeído (R4CHO), cianeto de sódio ou potássio e cloreto de amónio reagem para formar o aminonitrilo correspondente. O aminonitrilo é hidrolisado com ácido mineral para formar 0 aminoácido desejado de Fórmula XLII R4C(NH2)COOH. Altemativamente, 0 método de Bucherer-Berg pode ser usado em que se forma uma hidantoína por aquecimento de um aldeído (R4CHO) com carbonato de amónio e cianeto de potássio seguido de hidrólise (por exemplo, com hidróxido de bário em dioxano ao refluxo) com ácido ou base para formar 0 aminoácido desejado de Fórmula XLII R4C(NH2)COOH.

Outros métodos de síntese de α-aminoácidos estão também descritos na literatura que permitiriam a um perito na técnica preparar o intermediário de Fórmula R4C(NH2)COOH desejado necessário para a síntese dos compostos de Fórmula IA. Métodos adequados para a síntese e/ou resolução dos compostos de Fórmula XLII são encontrados em revisões de conjunto de Duthaler (Tetrahedron 1994, 50, 1539-1650), ou de Williams (R.M. Williams, Synthesis of optically active aminoacids. Pergamon: Oxford, U. K., 1989).

Um método específico para a síntese de um intermediário de Fórmula XLII em qualquer das formas enantioméricas a partir do intermediário correspondente R4X (X=C1, Br, ou I) é pelo procedimento de Pirrung e Krishnamurthy (J. Org. Chem. 1993, 58, 957-958), ou pelo procedimento de 0'Donnell, et al. (J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 2353-2355). Os intermediários R4X requeridos são prontamente preparados por muitos métodos familiares ao químico perito na técnica. Por exemplo, aqueles compostos em que R4X é

ArCH2X podem ser preparados por halogenação radicalar do composto ArCH3 ou por formolação do areno Ar-H e conversão do álcool ao brometo.

Outro método específico para a síntese de intermediários de Fórmula XLII em qualquer forma enantiomérica é o de Corey e Link (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 1906-1908). Assim, um intermediário de R4COCCI3 é reduzido enantioespecifícamente ao intermediário R4CH(OH)CCl3 que é convertido por tratamento com azida e base a um intermediário R4CH(OH)COOH, que é reduzido por hidrogenação catalítica ao composto desejado de Fórmula XLII. A triclorometilcetona R4COCCI3 requerida é obtida por reacção do aldeído R4CHO com anião tríclorometilato seguida de oxidação (Gallina e Giordano, Synthesis 1989, 466-468).

Um composto de fórmula RgNH2 ou R9NH2 é monoalquilado com um composto carbonílico correspondendo a Rg ou Ry, respectivamente, em condições de aminação redutiva apropriadas, para dar um amina de fórmula RgRyNH. Para evitar dialquilação, pode ser preferível proteger as aminas (R8NH2 ou R9NH2) com um grupo protector adequado PT para dar R8(PT)NH ou R9(Pt)NH, por exemplo por reacção com benzaldeído e um agente redutor. As aminas protegidas são monoalquiladas com um composto carbonílico correspondendo a R9 ou Rg respectivamente, em condições adequadas de aminação redutiva, para dar RgR9N(Pr)· O grupo protector (PT) é removido (e.g. por hidrogenação catalítica exaustiva quando PT é benzilo) para dar um composto de fórmula RgR9NH. Condições de aminação redutiva apropriadas estão disponíveis na literatura especializada para os peritos na técnica. Estas condições incluem aquelas referidas por Borch et al. (J. Am. Chcm. Soc. 1971, 2897-2904) e aquelas revistas por Emerson (Organic Reactions, Wiley: : New York, 1948 (14), 174), Hutchins et al. (Org. Prep. Proced. Int 1979 (11), 20, e Lane et al. (Synthesis 1975, 135). Condições de aminação redutiva favorecendo a N-monoalquilação incluem aquelas referidas por Morales, et al. (Synthetic Communicalioiis 1984, 1213-1220) e Verardo et al. (Synthesis 1992 121-125). As aminas R8NH2 e R9NH2 podem também ser monoalquiladas com R9X ou RSX, respectivamente, em que X é cloreto, brometo, tosilato ou mesilato. Altemativamente, um intermediário de fórmula Rg(PT)NH ou R9(Pt)NH pode ser alquilado com R9X ou R8X, e o grupo protector removido para dar um composto de fórmula com RjjRgNH. Métodos adicionais podem ser usados para preparar aminas de fórmula R8R9NH em que R8-NH ou R9-NH são oxigénio-azoto ligados. Assim um composto prontamente disponível de fórmula (Ci-C^alcoxicarbonil-NHOH ou NH2CONHOH é dialquilado no azoto e oxigénio por tratamento com base e excesso adequado de agente alquilante (R-X) para dar o (C|-C4)alcoxicarbonil-N(R)OR correspondente que é então hidrolisado para dar um composto de fórmula R8R9NH (em que R8=R9=R). Condições adequadas, base, e agente alquilante incluem as descritas por Goel e Krolls (Org. Prep. Proced. Int. 1987, 19, 75-78) e Major e Fleck (J. Am. Chem. Soc. 1928, 50, 1479). Altemativamente, N-hidroxiureia(NH2CONH(OH)) pode ser sequencialmente alquilada, primeiro no oxigénio para dar NH2CONH(OR’), depois no azoto para dar NH2CON(R")(OR'), por tratamento sucessivo com os agentes alquilantes R'X e R"X, respectivamente na presença de uma base adequada. Uma base e agentes alquilantes adequados incluem aqueles descritos por Kreutzcamp e Messinger (Chem. Ber. 100, 3463-3465 (1967) e Danen et al. (J. Am. Chem. Soc. 1973, 95, 5716-5724). Hidrólise destes derivados de hidroxiureia alquilada produz as aminas RO'NH2 e RO'NHR", que correspondem a certas aminas de fórmula RgRgNH. O químico perito na técnica pode adaptar os procedimentos descritos neste parágrafo a outros agentes alquilantes R, R'e R"-X para preparar outras aminas de fórmula R8R9NH em que Rs-N ou R9-N são ligados por oxigénio-azoto. Uno et al. (SynLett 1991, 559-560) descrevem a adição catalisada por BF3 -97- de um reagente organometálico R-Li a uma alquil-óxima de fórmula R'CH=N-OR", para dar compostos de fórmula R'RCH-NH(OR"). Esta via pode também ser usada para dar compostos de fórmula R8R9NH em que um de R8-NH ou R9-NH são ligados por oxigénio-azoto.

Pró-fármacos desta invenção em que um grupocarboxilo num ácido carboxílico de Fórmula IA está substituído por um éster podem ser preparados combinando o ácido carboxílico com o haleto de alquilo apropriado na presença de uma base tal como carbonato de potássio num solvente inerte tal como dimetilformamida a uma temperatura de cerca de 100°C a cerca de 1 durante cerca de 24 horas. Altemativamente o ácido é combinado com o álcool apropriado como solvente na presença de uma quantidade catalítica de ácido tal como ácido sulfurico concentrado a uma temperatura de cerca de 20 a 120°C, preferencialmente ao refluxo, durante cerca de 1 hora a cerca de 24 horas. Outro método é a reacção do ácido com uma quantidade estequiométrica do álcool na presença de uma quantidade catalítica de ácido num solvente inerte tal como tetra-hidrofurano, com remoção concomitante de água sendo realizada por meios físicos (e.g. trapa de Dean-Stark) ou químicos (e.g. "molecular sieves").

Pró-fármacos desta invenção onde a função álcool foi derivatizada como éter podem ser preparados combinando o álcool com o brometo ou iodeto de alquilo apropriado na presença de uma base tal como carbonato e potássio num solvente inerte talcomo dimetilformamida a uma temperatura de cerca de 0 a 100°C durante cerca de 1 a cerca de 24 horas. Éteres alcanoilaminometílicos podem ser obtidos por reacção do álcool com um bis-(alcanoilamino)metano na presença de uma quantidade catalítica de ácido num solvente inerte tal como tetra-hidrofurano, de acordo com um método descrito na patente US 4,997,984. Altemativamente, estes compostos podem ser preparados pelos métodos descritos por Hoffman et al. em J. Org. Chem. 1994, 59, 3530.

Os ésteres dialquilfosfato podem ser preparados por reacção do álcool com um clorofosfato dialquílico na presença de uma base num solvente inerte tal como tetra-hidrofurano. Os di-hidrogenofosfatos podem ser preparados por reacção do álcool com um clorofosfato diarílico ou dibenzílico como descrito acima, seguida de hidrólise ou hidrogenação na presença de um catalisador metal nobre, respectivamente.

Glicosidos são preparados por reacção do álcool com um hidrato de carbono num solvente inerte tal como tolueno na presença de um ácido. Tipicamente a água formada na reacção é removida à medida que é formada como acima descrito. Um procedimento alternativo é a reacção do álcool com um haleto de glicosilo adequadamente protegido na presença de uma base seguida de desprotecção. N-(l-hidroxialquil)amidas, N-(l-hidroxi-l-(alcoxicarbonil) metil)-amidas ou compostos cm que R2 foi substituído por C(OH)C(0)OY podem ser preparadas por reacção da amida ou do indole parente com o aldeído apropriado em condições neutras ou básicas (e.g. etóxido de sódio em etanol) a temperaturas entre 25 a 70°C. N-alcoximetil-indoles ou N-l-(alcoxi)alquil-indoles podem ser obtidos por reacção do indole N-insubstituído como haleto de alquilo necessário na presença de uma base num solvente inerte. l-(N,N-dialquilaminometil)indole, l-(l-(N,N-dialquilamino)etil)indole e Ν,Ν-dialquilaminometil-amidas (e.g. R3=CH2N(CH3)2) podem ser preparadas pela reacção do composto parente N-H com o aldeído apropriado e amina num solvente alcoólico a 25 a 70°C.

Os pró-fármacos desta invenção em que R2 e R3 são um carbono comum podem ser preparados por reacção do composto parente (fármaco) com benzaldeído ou uma cetona ou o seu dimetilacetal num solvente inerte na presença de uma quantidade catalítica de ácido com remoção concomitante de -99- água ou metanol.

Os materiais de partida e reagentes para os esquemas reaccionais acima descritos (e.g., aminas, ácidos indolecarboxílicos substituídos, ácidos indolinacarboxílicos substituídos, aminoácidos), embora a preparação da maior parte esteja acima descrita, são também facilmente disponíveis ou podem ser facilmente sintetizados pelos peritos na técnica usando métodos convencionais de síntese orgânica. Por exemplo, muitos dos intermediários aqui usados para preparar compostos de Fórmula I e Ia são, relacionados com ou são derivados de aminoácidos encontrados na natureza, nos quais há um interesse científico e necessidades comerciais grandes, e consequentemente muitos destes intermediários são comercialmente disponíveis ou são referidos na literatura ou são facilmente preparados a partir de outras substâncias comercialmente disponíveis por métodos que são referidos na literatura.

Alguns dos métodos de preparação úteis para a preparação dos compostos aqui descritos (e.g. compostos de Fórmula I, compostos de fórmula IA) podem requerer protecção ou funcionalidade remota. A necessidade de tal protecção variará dependendo da natureza da funcionalidade remota e das condições dos métodos de preparação. A necessidade de tal protecção é prontamente determinada por um perito na técnica. O uso de tais métodos de protecção/desprotecção está também abrangido pelo conhecimento da técnica. Para uma descrição geral de grupos protectores e seu uso, ver T. W. Greene, Protective Groups in Organic Svnthesis. John Wiley & Sons, New York, 1991.

Alguns dos compostos desta invenção têm carbonos assimétricos e por isso são enantiómeros ou diastereoisómeros. Misturas diastereoisoméricas podem ser separadas nos seus diastereoisómeros individuais com base nas suas diferenças físico-químicas por métodos conhecidos per se., por exemplo cromatografía e/ou cristalização fraccionada. Enantiómeros podem ser separados convertendo a mistura enantiomérica numa mistura diastereosisomérica por reacção com um composto opticamente activo apropriado (e.g., álcool), separando os diastereoisómeros e convertendo (e.g., hidrolisando) os diastereoisómeros individuais nos enantiómeros correspondentes puros. Todos tais isómeros, incluindo diastereoisómeros, enantiómeros e misturas resultantes são considerados como parte desta invenção.

Muitos dos compostos desta invenção são acídicos e formam um sal com um catião farmaceuticamente aceitável. Alguns dos compostos desta invenção são básicos e formam um sal com um anião farmaceuticamente aceitável. Todos esses sais estão dentro do âmbito desta invenção e podem ser preparados por métodos convencionais. Por exemplo, podem ser preparados simplesmente por contacto das entidades ácidas e básicas, usualmente numa razão estequiométrica, quer em meio aquoso, não-aquoso ou parcialmente aquoso, como apropriado. Os sais são recuperados por filtração, por precipitação com um não-solvente seguida de filtração, por evaporação do solvente, ou, no caso de soluções aquosas, por liofilização, como apropriado.

Em adição, quando os compostos desta invenção formam hidratos ou solvatos eles estão também inseridos no âmbito da invenção. A utilidade das combinações da presente invenção como agentes médicos no tratamento de doenças tais como as que são detalhadas aqui nos mamíferos (e.g. seres humanos) é demonstrada pela actividade dos compostos desta invenção nos ensaios convencionais e nos ensaios in vitro e in vivo abaixo descritos. Tais ensaios também fornecem um meio pelo qual as actividades dos compostos desta invenção podem ser comparadas com as actividades de outros compostos conhecidos. Os resultados destas comparações são úteis para a - 101 -

determinação dos níveis de dosagem em mamíferos, incluindo seres humanos, para o tratamento de tais doenças.

ENSAIOS DE INIBIDOR DE ALDOSE-REDUTASE A actividade de um inibidor da aldose-redutase pode ser determinada pela quantidade de inibidor de aldose-redutase que é requerida para baixar o nível de sorbitol tecidular e assim baixar a frutose tecidular de acordo com o ensaio seguinte.

Ratos macho Sprague-Dawley são tomados diabéticos por injecção de streptozocina a 55 mg/Kg, i.v., em tampão citrato dc pH 4,5. São alimentados ad libitum em condições controladas de alojamento, temperatura e iluminação. Após cinco semanas de diabetes, os ratos são anestesiados com uma sobredosagem de pentobarbital, e os tecidos são rapidamente removidos e analisados os conteúdos de sorbitol e frutose.

Os níveis de sorbitol são analisados de acordo com o método de Donald M. Eades et al., "Rapid Analysis of Sorbitol, Galactitol, mannitol and Myioinositol mixtures From Biological Sources", Journal of Chromatography. 490. 1-8,(1989). A frutose nos tecidos de rato é medida enzimaticamente usando uma modificação do método de Ameyama (Methods in Enzvmology. 89:20-29, 1982), em que o ferricianeto foi substituído por resazurina, um corante que é reduzido à resorufina altamente fluorescente. A quantidade de fluorescência da resorufma é estequiométrica com a quantidade de frutose oxidada pela frutosedesidrogenase. O ensaio contém extracto de nervo em 0,1 ml de ácido perclórico a 6% neutralizado num volume final de 1,5 ml. A seguir a uma -102-

íncubação durante 60 minutos à temperatura ambiente numa gaveta fechada, é determinada a fluorescência da amostra ao comprimento de onda de excitação = 560 nm, emissão =580 nm com fendas de 5 mm cada num espectrofotómetro de fluorescência Perkin-Elmer modelo 650-40. As concentrações de ffutose são calculadas por comparação com uma série de padrões de frutose de concentrações conhecidas.

ENSAIOS DO INIBIDOR DA GLICOGENIO-FOSFORILASE

As três isoenzimas diferentes de glicogénio-fosforilase (GP) purificadas, em que a glicogénio-fosforilase está no estado activado "a" (referido como glicogénio-fosforilase a, ou a abreviação GPa), e referidas aqui como glicogénio-fosforilase a do fígado humano (HLGPa), glicogénio-fosforilase a do músculo humano (HMGPa), e glicogénio-fosforilase a do cérebro humano (HBGPa), podem ser obtidas pelos procedimentos seguintes:

Expressão e fermentação

Os cDNAs da HLGP e HMGP são expressos a partir do plasmídeo pKK233-2 (Pharmacia Biotech. Inc., Piscataway, New Jersey) em estirpes E. coli XL-1 Blue (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA). A estirpe é inoculada num meio LB (consistindo de 10 g de triptona, 5 g de extracto de levedura, 5 g de NaCl, e 1 ml de NaOH IN por litro) mais 100 mg/L de ampicilina, 100 mg/1 de piridoxina e 600 mg/L de MnCl2 e crescida a 37°C até uma densidade de células de OD55o=1,0. Neste ponto, as células são induzidas com 1 mM de isopropil-1-tio-p-D-galactosido (IPTG). Três horas após indução as células são recolhidas por centrifugação e os peletes de células são congelados a -70°C até serem necessários para purificação. - 103 - O cDNA dc HBGP pode ser expresso por diversas metodologias, por exemplo, pelo método descrito por Crerar, et al. (J. Biol. Chem., 270:13748-13756). O método descrito por Crerar, et al. (J. Biol. Chem. 270:1378-13756) para a expresão de HBGP é como se segue: o cDNA de HBGP pode ser expresso a partir do plasmídeo pTACTAC numa estirpe E. coli 25A6. A estirpe é inoculada num meio LB (consistindo de 10 g de triptona, 5 g de extracto de levedura, 5 g de NaCl, e 1 ml de NaOH IN por litro) mais 100 mg/L de ampicilina e crescida durante a noite, depois ressuspendida em meio LB fresco mais 50 mg/L de ampicilina, e reinoculada num volume 40X de meio LB/amp contendo 250 μΜ de isopropil-l-tio-p-D-galactosido (IPTG), 0,5 mM de piridoxina e 3 mM de MgCl2 e crescida a 22°C durante 48-50 horas. As células podem então ser recolhidas por centrifugação e os peletes de células são congelados a -70°C até serem necessários para purificação. O cDNA HLGP é expresso a partir do plasmídeo pBlueBac III (Invitrogen Corp., San Diego, CA) que é co-transfectado com BaculoGold Linear Virai DNA (Pharmigen, San Diego, CA) em células Sf9. O vírus recombinante é subsequentemente purificado em placas (plaque-purified). Para produção de proteína, as células Sf9 crescidas em meio livre de soro são infectadas a uma multiplicidade de infecção (moi) de 0,5 e a uma densidade de células de 2 x 106 células/ml. Após crescimento durante 72 horas a 27°C, as células são centrifugadas, e os peletes de células congelados a -70°C até serem necessários para purificação.

Purificação da glicogenio-fosforilase expressa em E. coli

As células E. coli em peletes descritas acima são ressuspendidas em 25 mM de β-glicerofosfato (pH 7.0) com 0,2 mM de DTT, 1 mM de MgCl2, mais os inibidores de protease seguintes.

0,7 μg/mL 0,5 pg/mL 0,2 mM 0,5 mM

Pepstatina A Leupeptina fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), e EDTA, lisadas por pré-tratamento com 200 mg/mL de lisozima e 3 mg/mL de DNAase seguido de sonicação em contínuo em quantidades de 250 mL durante 5 x 1,5 minutos em gelo usando um aparelho de rebentamento celular ultra-sónico Branson Modelo 450 (Branson Sonic Power Co., Danbury CT). Os lisados de células de E. coli são então tratados por centrifugação a 35,000 X g durante uma hora seguida de filtração através de filtros de 0,45 micrometros. A GP na fracção solúvel dos lisados (estimada em menos de 1 % da proteína total) é purificada por monitorização da actividade enzimática (como descrito no Ensaio da Actividade deGPa, abaixo) numa série de passos cromatográficos detalhados abaixo.

Cromatografia de Afinidade de Metal Imobilizado (IMAC1

Este passo é baseado no método de Luong et al. (Luong et al. Journal of Chromatography (1992) 584, 77-84.). 500 mL da fracção solúvel de células lisadas filtrada (preparada de aproximadamente 160-250 g de "pellet" de células original) são colocados numa coluna de 130 mL de Sepharose Quelante IMAC (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, New Jersey) que foi carregada com 50 mM de CuCl2 e 25 mM de β-glicerofosfato, 250 mM de NaCl e 1 mM de imidazole ao pH 7 do tampão de equilibração. A coluna é lavada com o tampão de equilibração até que a A2so retome à linha de base. A amostra è então eluída da coluna com o mesmo tampão contendo 100 mM de imidazole para remover a GP ligada e outras proteínas ligadas. Fracções contendo a actividade de GP são reunidas (aproximadamente 600 mL), são adicionados ácido - 105 -

etilenediaminatetra-acético (EDTA), DL-ditiotreitol (DTT), fluoreio de fenilmetilsulfonilo (PMSF), leupeptina e pepstatina A para obter concentrações de 0,3 mM, 0,2 mM, 0,2 mM, 0,5 pg/mL e 0,7 pg/mL respectivamente. A GP reunida é libertada de sais através de um acoluna Sephadex G-25 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) equilibrada com tampão Tris-HCl 25 mM (pH 7,3), 3 mM de tampão DTT (Tampão A) para remover imidazole e é armazenada em gelo até ao segundo passo cromatográfico.

Cromatografia de 5'-AMP-Sepharose

As fracções de GP reunidas libertas de sais (aproximadamente 600 mL) são de seguida misturadas com 70 mL de 5-AMP-Scpharose (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, New Jersey) que foi equilibrado com Tampão A (ver acima). A mistura é suavemente agitada durante uma hora a 22°C e então empacotada na coluna e lavada com Tampão A até que a A2so retome à linha de base. A GP e outras proteínas são eluidas da coluna com tampão Tris-HCl 25 mM, DTT 0,2 mM e adenosina-5'-monofosfato 10 mM a pH 7,3 (Tampão B). As fracções contendo GP são reunidas seguindo a identificação por determinação da actividade enzimática (descrita abaixo) e visualizando Mr aproximadamente pela banda de 97 Kdal da proteína GP através da electroforese em gel de dodecil-sulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE) seguida de fixação com prata (2D-silver Stain II"Daiichi Kit," Daiichi Pure Chemicals Co., LTD, Tokyo, Japão) e então reunidas. A GP reunida é dializada em β-glicerofosfato 25 mM, DTT 0,2 mM, EDTA 0,3 mM, NaCl 200 mM, tampão de pH 7,0 (Tampão C) e conservada no gelo até ser usada.

Antes de se utilizar a enzima GP, a enzima é convertida da forma inactiva tal como é expressa na estirpe E. coli XL-1 Blue (designada GPb) (Stragene Cloning Systems, La Jolla, Califórnia), na forma activa (designada -106-

GPa) pelo procedimento descrito na Secção (A) Activacão de GP abaixo.

Purificação da Glicogeniofosforilase expressa em células Sf9

Os pelctes de células Sf9 descritos acima são ressuspendidos em β-glicerofosfato 25 mM (pH 7,0) com DTT 0,2 m.M, 1 mM de MgCl2, mais os inibidores de protease seguintes:

0,7 pg/mL Pepstatina A 0,5 pg/mL Leupeptina 0,2 mM fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), e 0,5 mM EDTA, lisados por pré-tratamento com 3 pg/mL de DNAase seguido de sonicação em porções durante 3 x 1 minutos sobre gelo usando um aparelho sonicador Branson Modelo 450 (Branson Sonic Power Co., Danbury CT). Os lisados de células Sf9 são então purificados por centrifugação a 35,000 X g durante uma hora seguida de filtração através de filtros de 0,45 micrometros. A GP na fracção solúvel dos lisados (estimada em 1,5% da proteína total) é purificada por monitorização da actividade da enzima (como descrito na secção do Ensaio de Actividade da GP, abaixo) a partir de uma série de passos cromatográficos pormenorizados abaixo.

Cromatografia de Afinidade de Metal Imobilizado (IMAC) A Cromatografia de Afinidade de Metal Imobilizado é realizada como descrita na secção acima. As ffacções reunidas de GP libertas de sais são depois conservadas em gelo até serem posteriormente processadas.

Activacão da GP

Antes de posterior cromatografía, a fracção de enzima inaetiva tal como expressa em células Sf9 (designada GPb) é convertida na forma activa (designada GPa) pelo procedimento seguinte descrito na Secção (A) Activação de GP abaixo.

Cromatografía de Permuta Aniónica A seguir à activação da GPb purificada por IMAC na GPa por reacção com a fosforilasequinase imobilizada, as fracções de GPa reunidas são dializadas contra tampão Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, contendo DTT 0,5 mM, EDTA 0,2 mM, 1,0 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 1,0 pg/mL de leupeptina e 1,0 pg/mL de pepstatina A. A amostra é então colocada numa coluna de Cromatografía de Permuta Aniónica MonoQ Pharmacia Biotech. Inc., Piscataway, New Jersey). A coluna é lavada com tampão de equilibração até que A28o retome à linha de base. A amostra é de seguida eluida da coluna com um gradiente linear de 0-0,25 M de NaCl para remover a GP ligada e outras proteínas ligadas. As fracções contendo GP eluem no intervalo entre 0,1-0,2 M de NaCl, tal como detectado por monitorização do eluato para o pico da absorvância da proteína a A2so· A proteína GP é então identificada por visualização do Mr através da banda de aproximadamente 97 Kdal da proteína GP por electroforese em gel de dodecilsulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE) seguida de fixação com prata (2D-silver Stain II "Daiichi Kit", Daiichi Pure Chemicals Co., LTD., Tokyo, Japão) e depois reunidas. A GP reunida é dializada em ácido N.N-bis[2-Hidroxietil]-2-aminoetano-sulfónico 25 mM, DTT 1,0 mM, EDTA 0,5 mM, NaCl 5 mM, tampão de pH 6,8 e conservada no gelo até ser usada.

Determinação da Actividade Enzimática de GP A) Activação de GP: Conversão de GPb em GPa -108 -

Antes da determinação da actividade enzimálica da GP, a enzima é convertida da forma inactiva tal como resulta da expressão em E. coli estirpe XL-Blue (designada GPb) (Stragene Cloning Systems, La Jolla, Califórnia), na forma activa (designada GPa) por fosforilação de GP usando fosforílasequinase como se segue. A fracção de enzima inactiva tal como é expressa em células Sf9 (designada GPb) é também convertida na forma activa (designada GPa) pelo procedimento seguinte.

Reaccão de GP com Fosforílasequinase Imobilizada A fosforílasequinase (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) é imobilizada em Affí-Gel 10 (BioRad Corp., Melvile, NY) de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, a enzima fosforílasequinase (10 mg) é incubada com suporte Affi-Gel lavado (1 mL) em 2,5 mL de HEPES 100 mM e CaCl2 80 mM a pH 7,4 durante 4 horas a 4°C. O suporte Affí-Gel é então lavado uma vez com o mesmo tampão antes de tratamento com HEPES e éster metílico de glicina a pH 8,0 durante uma hora à temperatura ambiente. O tampão de tratamento (blocking) é removido e substituído por HEPES 50 mM (pH 7,4), β-mercaptoetanol 1 mM c NaN3 0,2% para armazenamento. Antes de ser utilizada para converter a GPb em GPa, a fosforílasequinase imobilizada em suporte de Affi-Gel é equilibrada por lavagem no tampão usado para produzir a reacção da quinase, consistindo de β-glicerofosfato 25 mM, DTT 0,3 mM, e EDTA 0,3 mM a pH 7,8 (tampão de ensaio da quinase). A GPb inactiva parcialmente purificada, obtida através da Cromatografia de 5'-AMP-Sepharose acima (da E. coli) ou a mistura de GPa e GPb obtida da IMAC acima (de células Sf9) é diluida 1:10 com o tampão de ensaio da quinase e então misturada com a enzima fosforílasequinase supramencionada imobilizada no suporte de Affi-Gel. NaATP é adicionado até 5 mM e MgCl2 até 6 mM. A mistura resultante é misturada suavomenle a 25°C durante 30 a 60 minutos. A amostra é removida do suporte e a percentagem de activação da GPb por conversão em GPa é estimada pela determinação da actividade enzimática de GP na presença de AMP 3,3 mM. A percentagem de actividade da GP total devida à actividade da enzima Gpa (AMP-dependente) é então calculada como segue:

actividade de HLGP-AMP % de HLGPa total = —--

actividade de HLGP+AMP

Altemativamente, a conversão de GPb em GPa pode ser monitorizada por focagem isoeléctrica, com base no desvio da mobilidade electroforética que é notado seguindo a conversão de GPb em GPa. As amostras de GP são analisadas por focagem isoeléctrica (IEF) utilizando o Sistema Pharmacia PfastGel (Pharmacia Biotech. Inc., Piscataway, New Jersey) usando geles pré-fundidos (intervalo de pi 4-6,5) e o método recomendado pelo fabricante. As bandas de GPa e GPb resolvidas são então visualizadas nos geles por fixação com prata (2D-silver Stain II "Daiichi Kit", Daiichi Pure Chemicals Co., LTD., Tokyo, Japão). A identificação de GPa e GPb é feita por comparação com os padrões de GPa e GPb derivados de E. coli que são corridos em paralelo nos mesmos geles que as amostras experimentais. B) Ensaio de Actividade de GPa

As actividades de doença/tratamento de condição/prevenção descritas aqui dos compostos inibidores da glicogénio-fosforilase desta invenção podem ser indirectamente determinados pela avaliação do efeito dos compostos desta invenção na actividade da forma activada da glicogénio-fosforilase (GPa) por um de dois métodos, a actividade da glicogénio-fosforilase a c medida no - 110- sentido directo por monitorização da produção de glucose-1-fosfato a partir do glicogénio ou seguindo a reacção inversa, medindo a síntese de glicogénio a partir da glucose-1-fosfato pela libertação de fosfato inorgânico. Todas as reacções podem ser realizadas em triplicado numa placa de microtitulação de 96 poços e a alteração na absorvância devida à formação do produto de reacção é medida ao comprimento de onda especificado abaixo num Leitor de ELISA MCC/340 MKII (Lab Systems, Finland), ligado a um aparelho Titertech Microplate Stacker (ICN Biomedical Co, Huntsville, Alabama).

Para medir a actividade enzimática da GPa no sentido directo, a produção de glucose-1-fosfato a partir de glicogénio é monitorizada pelo método geral de multienzima acoplada de Pesce et al. [Pesce, M.A., Bodourian, S.H., Harris, R.C. e Nicholson, J.F. (1977) Clinicai Chemistry 23, 1711-1717] modificado como segue: 1 a 100 pg GPa, 10 unidades de fosfoglucomutase e 15 unidades de glucose-6-fosfatodesidrogenase (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) são diluídos a 1 mL em Tampão A (aqui descrito a seguir). O Tampão A está a pH 7,2 e contém 50 mM de HEPES, 100 mM de KC1, 2,5 mM de ácido etilenoglicoltetra-acético (EGTA), 2,5 mM de MgCl2, 3,5 mM de KH2PO4 e 0,5 mM de ditiotreitol. 20 μΐ desta mistura de reserva são adicionados a 80 μΐ de tampão A contendo 0,47 mg/mL de glicogénio, 9,4 mM de glucose, 0,63 mM da forma oxidada do nicotina-amida-adeninadinucleo-tidofosfato (NADP+). Os compostos a testar são adicionados em 5 μΐ como soluções a 14% em dimetilsulfóxido (DMSO) antes da adição das enzimas. A razão basal da actividade da enzima GPa na ausência de inibidores é determinada por adição de 5 μΐ de uma solução a 14% em DMSO e a razão da actividade enzimática completamente inibida é obtida por adição de 20 μΐ de substância teste de controlo positivo, cafeína. A reacção é seguida à temperatura ambiente pela medição da conversão do NADP+ oxidado no NADPF1 reduzido a 340 nm. - 111 -

Para medir a actividade enzimática da GPa na direcçao inversa, a conversão de glucose-1-fosfato em glicogcnio mais fosfato inorgânico é medida pelo método geral descrito por Engers at al. [Engers, H.D,. Shechosky, S. e Madsen, N.B. (1970) Can. J. Biochem. 48, 746-754] modificado como segue: 1 a 100 μg de GPa é diluída a 1 mL em Tampão B (aqui descrito a seguir). O Tampão B é a pH 7,2 e contém 50 mM de HEPES, 100 mM de KC1, 2,5 mM EGTA, 2,5 mM de MgCl2 e 0,5 mM de ditiotreitol. 20 μΐ desta mistura de reserva são adicionados a 80 μΐ de Tampão B com 1,25 mg/mL de glicogénio, 9,4 mM de glucose, e 0,63 mM de glucose-1-fosfato. Os compostos a testar são adicionados como 5 μΐ de soluções a 14% em dimctilsulfóxido (DMSO) antes da adição da enzima. A razão basal da actividade enzimática da GPa na ausência de inibidores adicionados é determinada por adição de 5 μΐ de uma solução a 14% em DMSO e a razão da actividade enzimática completamente inibida é obtida por adição de 20 μΐ de da substância teste de controlo positivo, cafeína. Esta mistura é incubada à temperatura ambiente durante 1 hora e o fosfato inorgânico libertado a partir da glucose-1-fosfato é medido pelo método geral de Lanzetta et al. [Lanzetta, P.A., Alvarez, L.J., Reinach, P.S. e Candia, O.A. (1979) Anal. Biochem. 100, 95-97] modificado como segue: 150 μΐ de molibdato de amónio a 10 mg/mL, verde de malaquite a 0,38 mg/mL em HC1 IN, são adicionados a 100 μΐ da mistura de enzima. Após 20 minutos de incubação à temperatura ambiente, a absorvância é medida a 620 nm.

Os testes acima descritos realizados numa gama de concentrações dos compostos teste permite a determinação do valor de IC50 (concentração do composto teste requerida para 50% de inibição) para a inibição in vitro da actividade da enzima GPa por aquele composto teste.

ENSAIOS DE INDICAÇÃO DE RESISTÊNCIA À INSULINA

As combinações desta invenção são prontamente adaptadas ao uso clínico como agentes hipoglicémicos. A actividade hipoglicémica das combinações desta invenção pode ser determinada pela quantidade de composto teste que reduz os níveis de glucose relativamente a um veículo sem composto teste num ratinho macho ob/ob. O teste permite também a determinação do valor da dose eficaz mínima aproximada (MED) para a redução da concentração da glucose plasmática in vivo em tais ratinhos para tais compostos teste.

Uma vez que a concentração de glucose no sangue está intimamente relacionada com o desenvolvimento de desordens diabéticas, estas combinações por virtude da sua acção hipoglicémica, previnem, param e/ou regridem desordens diabéticas.

Ratinhos machos C57BL/6J-ob/ob de cinco a oito semanas de idade (obtidos de Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) são alojados cinco por gaiola de acordo com as práticas de referência de manuseamento de animais. Após um período de aclimatação de uma semana, os animais são pesados e são recolhidos 25 μΐ de sangue do seio retro-orbital antes de qualquer tratamento. A amostra de sangue é imediatamente diluída 1:5 com uma solução salina contendo 0,025% de heparina sódica, e fixada em gelo para análise de metabolitos. Aos animais são atribuídos grupos de tratamento de tal modo que cada grupo tenha uma média semelhante de concentração de glucose plasmática. Após distribuição dos grupos, os animais são doseados oralmente cada dia durante quatro dias com o veículo consistindo quer de:l) 0,25% p/v de metilcelulose em água sem ajustamento de pH; ou 2) 0,1% de Tensioactivo de Copolímero de Bloco PluronicR (BASF Corporation, Parsippany, NJ) em solução salina a 0,1% sem ajustamento de pH. No dia 5, os animais são pesados novamente e então doseados oralmente com o composto teste ou o veículo apenas. Todos os fármacos são administrados em veículo consistindo quer de: 1) 0,25% p/v de metilcelulose em água sem ajustamento de pH; OU 2) 10% DMSO/0,1% de Tensioaclivo de Copolírnero de Bloco PluronicR (BASF Corporation, Parsippany, NJ) em solução salina a 0,1% sem ajustamento de pH. Retira-se então o sangue do seio retro-orbital dos animais três horas depois para determinação dos níveis de metabolitos no sangue. As amostras recolhidas na ocasião são centrifugadas durante dois minutos a 10,000 x g à temperatura ambiente. O sobrenadante é analisado para glucose, por exemplo, por um Autoanalisador Abbott VP™ (Abbott Laboratories, Diagnostics Division, Irving, TX) e VP Super SystemR (Abbott Laboratories, Diagnostics Division, Irving, TX), ou um Autoanalisador Abbott Spectrum CCX™ (Abbott Laboratories, Diagnostics Division, Irving, TX) usando o sistema de reagentes A-Gent™ Teste de Glucose-UV (Abbott Laboratories, Diagnostics Division, Irving, TX)(uma modificação do método de Richterich e Dauwalder, Schweizerische Medizinische Wochenschrift, 101, 860 (1971)) (método da hexoquinase) usando um padrão de 100 mg/dL. A glucose plasmática é então calculada pela equação:

Glucose plasmática (mg/dL)=Valor da amostra x 8,14 em que 8,14 é o factor de diluição, ajustado para o hematócrito plasmático (considerando que o hematócrito é 44%).

Os animais doseados com veículo mantém substancialmente inalterados os níveis de glucose hiperglicémicos (e.g., superior ou igual a 250 mg/dL), e os animais tratados com compostos teste em doses adequadas apresentam níveis de glucose suprimidos significativamente. A actividade hipoglicémica dos compostos teste é determinada por análise estatística (teste "t-student") da concentração média de glucose plasmática entre o grupo tratado com compostos teste e o grupo tratado com veículo no dia 5. O ensaio acima descrito realizado num intervalo de doses dos compostos teste permite a determinação de um valor da dose mínima eficaz aproximada (MED) para a redução in vivo da - 114- conccntração de glucose plasmática.

Os compostos desta invenção são prontamente adaptados para uso clínico como agentes inversores de hiperinsulinemia, agentes de abaixamento de trigliceridos e agentes hipocolesterolemicos. Tal actividade pode ser determinada pela quantidade de composto teste que reduz os níveis de insulina, trigliceridos ou colesterol em relação a um veículo controlo sem composto teste em ratinhos macho ob/ob.

Uma vez que a concentração de colesterol no sangue está intima-mente relacionada com o desenvolvimento de desordens cardiovasculares, cerebrais vasculares ou vasculares periféricas, as combinações desta invenção por virtude da sua acção hipocolesterolemica, previnem, param e/ou regridem a aterosclerose.

Uma vez que a concentração de insulina no sangue está relacionada com a promoção do crescimento celular vascular e acréscimo de retenção renal de sódio, (em adição a outras acções e.g., promoção da utilização de glucose) e estas funções são causas conhecidas de hipertensão, as combinações desta invenção por virtude da sua acção hiperinsulinémica, previnem, param e/ou regridem a hipertensão.

Uma vez que a concentração de trigliceridos e ácidos gordos livres no sangue contribui para os níveis globais dos lipidos sanguíneos, as combinações desta invenção por virtude da sua actividade de abaixamento dos trigliceridos e dos ácidos gordos livres previnem, param e/ou regridem a hiperlípidemia.

Os ácidos gordos livres contribuem para o nível global de lipidos sanguíneos e foram correlacionados independentemente e negalivamenle eom a sensibilidade da insulina numa variedade de estados fisiológicos e patológicos.

Ratinhos machos C57BL/6J-ob/ob de cinco a oito semanas de idade (obtidos de Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) são alojados cinco por gaiola de acordo com as práticas de referência de manuseamento de animais e alimentados com dieta padrão apropriada para roedores ad libitum. Após um período de aclimatação de uma semana, os animais são pesados e são recolhidos 25 microlitros de sangue do seio retro-orbital antes de qualquer tratamento. A amostra de sangue é imediatamente dilui da 1:5 com uma solução salina contendo 0,025% de heparina sódica, e fixada em gelo para análise de metabolitos. Aos animais são atribuídos grupos de tratamento de tal modo que cada grupo tenha uma média semelhante de concentração de glucose plasmática. O composto a ser testado é administrado oralmente (engorda oral) como uma solução de cerca de 0,02% a 2,0% (peso/volume (p/v)) quer em:l) 10% DMSO/0,1% de Tensioactivo de Copolímero de Bloco PluronicR P 105 (BASF Corporation, Parsippany, NJ) em solução salina a 0,1% sem ajustamento de pH ou 2) 0,25% p/v de metilcelulose em água sem ajustamento de pH. Uma dosagem única diária (s.i.d.) ou dosagem dupla diária (b.i.d.) é mantida durante 1 a por exemplo 15 dias. Os ratinhos de controlo recebem 10% DMSO/0,1% de Tensioactivo de Copolímero de Bloco PluronicR em solução salina a 0,1% sem ajustamento de pH ou apenas 0,25% p/v de metilcelulose em água sem ajustamento de pH.

Três horas após a última dose ter sido administrada, os animais são sacrificados por decapitação e o sangue do tronco é recolhido em tudos separadores de soro de 0,5 mL contendo uma mistura 1:1 peso/peso de 3,6 mg de fluoreto de sódio:oxalato de potássio. As amostras de sangue recolhidas na ocasião são centrifugadas durante dois minutos a 10,000 x g à temperatura ambiente, e o sobrenadante de soro é transferido e diluido 1:1 volume/volume com solução de aprotinina lTIU/mL em solução salina a 0,1% sem ajustamento de pH.

As amostras de soro diluido são então armazenadas a -80°C até análise. As amostras de soro diluido descongeladas são analisadas para teores de insulina, trigliceridos, ácidos gordos livres, e colesterol. A concentração de insulina no soro é determinada usando conjuntos ("kits") EquateR RIA INSULIN (método do anticorpo duplo; tal como especificado pelo fabricante) adquiridos a Binax, South Portland, ME. O coeficiente de variação inter-ensaios é </= 10%. Os trigliceridos do soro são determinados usando o Autoanalisador Abbott VP™ e VP Super SystemR (Abbott Laboratories, Diagnostics Division, Irving, TX), ou o Autoanalisador Abbott Spectrum CCX™ (Abbott Laboratories, Diagnostics Division, Irving, TX) usando o sistema de reagentes Teste de Triglycerides A-Gent™ (Abbott Laboratories, Diagnostics Division, Irving, TX) (método de lipase-enzima acoplada; uma modificação do método de Sampson, et al., Clinicai Chemistry 21, 1983 (1975)). Os níveis de colesterol total do soro são detrminados usando Autoanalisador Abbott VP™ e VP Super SystemR (Abbott Laboratories, Diagnostics Division, Irving, TX), ou o Autoanalisador Abbott Spectrum CCX™ (Abbott Laboratories, Diagnostics Division, Irving, TX) usando o sistema de reagentes Teste de Colesterol A-Gent™ (Abbott Laboratories, Diagnostics Division, Irving, TX)(método da colcsterolesterase-enzima acoplada; uma modificação do método de Allain, et al. Clinicai Chemistry 20, 470 (1974)) usando padrões de 100 a 300 mg/dL. A concentração de ácidos gordos livres no soro é determinada utilizando um conjunto ("kit") da Amano International Enzyme Co., Inc., como adaptado para uso com o Autoanalisador Abbott VP™ e VP Super SystemR (Abbott Laboratories, Diagnostics Division, Irving, TX), ou o Autoanalisador Abbott Spectrum CCX™ (Abbott Laboratories, Diagnostics Division, Irving, TX). Os níveis séricos de insulina, trigliceridos, ácidos gordos - 117- livres e colesterol total são então calculados pelas equações, Insulina no soro (pU/mL)= Valor da amostra x 2 Trigliceridos no soro (mg/dL)= Valor da amostra x 2 Colesterol total no soro (mg/dL)= Valor da amostra x 2 Ácidos gordos livres no soro (pEq/L)= Valor da amostra x 2 onde 2 é o factor de diluição.

Os animais doseados com veículo mantêm substancialmente inalterados os níveis elevados de insulina no soro (e.g. 275 μυ/mL), trigliceridos no soro (e.g. 235 mg/dL), ácidos gordos livres no soro (e.g., 1500 pEq/L) e colesterol total no soro (e.g. 190 mg/dL), enquanto os animais tratados com compostos desta invenção geralmente apresentam níveis reduzidos de insulina, trigliceridos, ácidos gordos livres e colesterol total. O efeito de abaixamento da insulina do soro, dos trigliceridos, dos ácidos gordos livres e do colesterol total por actividade dos compostos teste é determinado por análise estatística ("teste-t student unpaired") da concentração média da insulina, trigliceridos, ácidos gordos livres ou colesterol total no soro entre o grupo tratado com composto teste e o grupo tratado com veículo. A actividade de protecção contra isquemia (e.g., lesão do tecido cardíaco) dos compostos desta invenção pode ser demonstrada in vitro ao longo das linhas apresentadas em Butwell et al., Am. J. Physiol., 264, H1884-H1889, 1993 e Allard et al., Am. J. Physio., 1994, 267. H66-H74. As experiências são realizadas usando uma preparação isovolúmica de coração de rato isolado, essencialmente como descrito no artigo acima referido. Ratos normais macho Sprague-Dawley, ratos macho Sprague-Dawley tratados de modo a possuírem hipertrofia cardíaca através de uma operação de ligação da aorta, ratos macho BB/W com diabetes aguda, ou ratos de controlo BB/W não diabéticos de idade semelhante são pré-tratados com heparina (1000 u, i.p.), seguida de pentobarbital (65 mg/kg, i.p.). Após ser atingida anestesia profunda como determinado pela ausência do reflexo do pé, o coração é rapidamente excisado e colocado em solução salina gelada. O coração é retrogradamente sujeito a perfusão através da aorta durante 2 minutos. A velocidade cardíaca e a pressão ventricular são determinadas usando um balão de látex no ventrículo esquerdo com um tubo de alta pressão ligado a um transductor de pressão. O coração é sujeito a perfusão com uma solução consistindo de (mM) NaCl 118, KC1 4,7, CaCl2 1,2, NaHCOj 25, glucose 11. O aparelho de perfusão é sujeito a controlo apertado de temperatura com banhos de aquecimento usados para o perfusado e para a água injectada à volta do tubo de perfusão para manter a temperatura a 37°C. A oxigenação do perfusado é fornecida por um canal dc fibra de oxigenador pediátrico (Capiax, Terumo Corp., Tokyo, Japão) imediatamente proximal ao coração. Os corações são expostos à solução de perfusão +/- composto teste durante cerca de 10 minutos ou mais, seguidos de 20 minutos de isquemia global e 60 minutos de reperfusão na ausência do composto teste. Os batimentos cardíacos do controlo e do composto teste são comparados no período que se segue à isquemia. A pressão ventricular esquerda dos corações do controlo e do composto teste são comparadas no período a seguir à isquemia. No final da experiência são também submetidos a perfusão e fixados para determinar a razão da área de enfarte relativamente à área de risco (%IA/AAR) como descrito abaixo.

Os feitos terapêuticos dos compostos desta invenção na prevenção da lesão do tecido cardíaco de outro modo resultante de um choque isquémico pode também ser demonstrado in vivo ao longo das linhas apresentadas em Liu et al., Circulation, Vol. 84, No. 1, (Julho 1991), como aqui descrito especifica-mente. Os ensaios in vivo testam a cardioprotecção do composto teste relativamente ao grupo de controlo que recebe veículo salino. Como informação de suporte, observa-se que breves períodos de isquemia miocárdica seguidos de reperfUsão arterial coronária protegem o coração de subsequente isquemia miocárdica severa (Murry et al., Circulation 74:1124-1136, 1986). A cardioprotecção, tal como indicada pela redução no enfarte do miocárdio, pode ser induzida farmacologicamente usando receptores agonistas de adenosina administrados intravenosamente em coelhos intactos, anestesiados estudados como modelo in situ de pré-acondicionamento de isquemia miocárdiaca (Lui et al., Circulation 84:350-356, 1991). O ensaio in vivo teste se os compostos podem induzir farmacologicamente cardioprotecção, i.e., tamanho reduzido do enfarte miocárdico, quando administrados parenteralmente a coelhos intactos, anestesiados. Os efeitos dos compostos desta invenção podem ser comparados ao pré-acondicionamento isquémico usando o agonista Al de adenosina, N6-l-(fenil-2R-isopropil)adenosina (PIA) que se demonstrou induzir farmacologicamente cardioprotecção em coelhos anestesiados intactos estudados in situ (Liu et al., Circulation 84:350-356, 1991). A metodologia exacta é descrita abaixo.

Cirurgia: Coelhos brancos macho New Zealand (3-4 kg) são anestesiados com pentobarbital sódico (30 mg/kg, i.v.). Realiza-e uma traqueotomia via incisão cervical mediana ventral e os coelhos são ventilados com oxigénio 100% usando um ventilador de pressão positiva. São colocados catéteres na veia jugular esquerda para administração de fármacos e na artéria carótida esquerda para medições de pressão sanguínea. Os corações são então expostos através de toracotomia e é colocado um laço (00 seda) à volta do ramo proeminente da artéria coronária esquerda. É induzida isquemia puxando o laço com aperto prendendo-o no lugar. A libertação do laço permite que a área afectada seja sujeita a reperfusão. A isquemia miocárdica é evidenciada por cianose regional; a reperfusão é evidenciada por hiperemia reactiva.

Protocolo: A experiência é recomeçada assim que a pressão arterial e a velocidade cardíaca se tomem estáveis durante pelo menos 30 minutos. O pré- acondicionamento ísquémico é induzido por duas oclusões da artéria coronária durante 5 minutos seguidas de uma reperfusão de 10 minutos. O pré-acondicionamento farmacológico é induzido através de uma dupla infusão do composto teste, por exemplo durante 5 minutos antes de posterior intervenção ou por infusão do agonista de adenosina, PIA (0,25 mg/kg). A seguir ao pré-acondicionamento isquémico, o pré-condicionamento farmacológico ou não condicionamento (não condicionado, controlo do veículo) procede-se à oclusão da artéria durante 30 minutos e então faz-se reperfusão durante duas horas para induzir enfarte do miocárdio. O composto teste e PIA são dissolvidos em solução salina ou outro veículo adequado e libertados a 1 a 5 ml/kg, respectivamente.

Fixação (Liu et al., Circulation 84:350-356, 1991): Ao fim do período de duas horas de reperfusão, os corações são rapidamente removidos, suspensos num aparelho Langendorff, e inundados durante 1 minuto com solução salina normal aquecida à temperatura corporal (38°C). A sotura de seda usada como laço é então apertada fortemente para reocludir a artéria e procede-se à infusão com o perfusado de uma suspensão a 0,5% de partículas (1-10 pm) fluorescentes Duke Scientific Corp. (Paio Alto, CA) para fixar todo o miocárdio excepto a área em risco (ventrículo não fluorescente). Os corações são então rapidamente congelados c armazenados durante a noite a -20°C. No dia seguinte, os corações são cortados em fatias de 2 mm e fixados com cloreto de trifeniltetrazólio a 1% (TTC). Uma vez que o TTC reage com tecido vivo, esta fixação permite diferenciar entre tecido vivo (coloração vermelha), e tecido morto (tecido não corado do enfarte). A área de enfarte (sem coloração) e a área em risco (sem partículas fluorescentes) são calculadas para cada fatia do ventrículo esquerdo usando um analisador de imagem pré-calibrado. Para normalizar a lesão isquémica em relação a diferenças na área em risco entre corações, os dados são expressos pela razão de área do enfarte vs. área em risco (%IA/AAR). Todos os dados são expressos pela Média +/- Desvio Padrão de Método e comparados - 121 - estatisticamente usando o factor único ANOVA ou o t-tesle de "siudent". A significância é considerada como p<0,05. A invenção pode ser testada pela sua utilidade em reduzir ou prevenir a lesão isquémica em tecidos não cardíacos, por exemplo, no cérebro, ou no fígado, utilizando procedimentos referidos na literatura científica. Os compostos desta invenção podem ser administrados pela via e veículo de administração preferidos e ao tempo de administração preferido quer antes do episódio isquémico, durante o episódio isquémico, a seguir ao episódio isquémico (período de reperfúsão) se incluído, ou durante qualquer dos estágios experimentais abaixo mencionados. O benefício desta invenção para reduzir a lesão isquémica cerebral pode ser demonstrado, por exemplo, em mamíferos usando o método de Park, et al. (Ann. Neurol. 1988;24:543-551). Em resumo, no procedimento de Park, et al. ratos macho adultos Sprague Dawley são anestesiados inicialmente com halotano 2%, e de seguida por ventilação mecânica com uma mistura de óxido nitroso-oxigénio (70%:30%) contendo 0,5-1% de halotano. É então realizada uma traqueotomia. O volume emanado do ventilador é então ajustado para manter a tensão de dióxido de carbono arterial a aproximadamente 35 mm Hg e uma oxigenação arterial adequada (PaO2>90 mm Hg). A temperatura corporal pode ser monitorizada por um termómetro rectal, e os animais podem ser mantidos monotérmicos, se necessário, por aquecimento externo. A seguir os animais são submetidos a craniotomia subtemporal para expor o tronco principal da artéria cerebral média esquerda (MCA) sob observação microscópica, e a artéria exposta é ocludida com coagulação microbipolar para gerar lesões isquémicas no córtex cerebral e ganglia basal. Após três horas de oclusão da MCA, os ratos são anestesiados profundamente com halotano a 2% e é realizada uma toracotomia para infusão de heparina salina no ventrículo esquerdo. O efluente é recolhido via - 122 - incisão do átrio direito. A lavagem salina é seguida por aproxiniadamente 200 ml de uma solução de formaldeído a 40%, ácido acético glacial e metanol absoluto (FAM; 1:1:8, v/v/v), e depois os animais são decapitados e a cabeça é armazenada no conservante durante 24 horas. O cérebro é então removido, dissecado, processado, embebido em cera parafínica, e seccionado (aproximadamente 100 secções por cérebro). As secções são então fixadas com hematoxilina-eosina ou com uma combinação de violeta de cresilo e azul rápido de Luxor, e examinadas por microscópio óptico para identificar e quantificar a lesão isquémica usando um analisador de imagení (e.g. o Quantimet 720). Os volumes e áreas isquémicos são expressos em unidades absolutas (mm3 e mm2) e como percentagem da região total examinada. O efeito das composições e métodos desta invenção para reduzir a lesão cerebral isquémica induzida por oclusão da MCA é observado com base na redução na área ou volume da lesão isquémica relativa ou absoluta nas secções do cérebro dos ratos no grupo de tratamento comparados com as dos ratos num grupo de controlo tratado com placebo.

Outros métodos que poderiam altemativamente ser utilizados para demonstrar o benefício desta invenção para reduzir a lesão isquémica cerebral são aqueles descritos por Nakayama, et al. em Neurology 1988; 38:1667-1673, Memezawa, et al. em Stroke 1992;23:552-559, Folbergrova, et al. em Proc. Natl. Acad. Sei 1995;92:5057-5059, e Gotti, et al. em Brain Res. 1990;522:290-307. O benefício das composições e métodos desta invenção para reduzir a lesão isquémica no fígado pode ser demonstrada, por exemplo, em mamíferos usando o método de Yokoyama, et al. (Am. J. Physiol. 1990;258:G564-G570). Em resumo, no procedimento de Yokoyama, et al., ratos Sprague Dawley adultos machos jejuados são anestesiados com fenobarbital sódico (40 mg/kg i.p.), e depois os animais são submetidos a traqueotomia e ventilação mecânica numa sala com arejamento. O fígado é extirpado e colocado numa câmara ambiental mantida a temperatura constante (37°C), e entÊto sujeito a perfusao através da veia portal a uma pressão constante de 15 cm H20 com um tampão Krebs-Henseleit modificado, livre de hemoglobina (em mM: 118 NaCl, 4,7 KC1, 27 NaHC03, 2,5 CaCh, 1,2 MgS04, 1,2 KH2P04, 0,05 DTA, e 11 mM de glucose, mais 300 U de heparina). O pH do perfusado é mantido a 7,4 por gaseificação do tampão com uma corrente de 95% 0?-5% C02. Cada fígado é submetido a perfusao a uma velocidade de fluxo de 20 ml/min e lavado numa só passagem com período de equilibração (período pré-isquémico) durante 30 min, seguido de um período de 2 horas de isquemia global, e então um período de duas horas de reperfusão em condições idênticas às do período pré-isquémico. Alíquotas (20 ml) do perfusado são recolhidas durante o período pré-isquémico, imediatamente após o período oclusivo isquémico, e cada 30 min das 2 horas do período de reperfusão. As amostras de perfusado são ensaiadas para detecção de enzimas hepatocelulares, por exemplo, aspartatoaminotransferase (AST), alanina-aminotransferase (ALT), e lactatodesidrogenase (LDH), que se considera reflectirem o grau de lesão isquémica do tecido do fígado durante o procedimento. As actividades de AST, ALT e LDH no perfusado podem ser determinadas por diversos métodos, por exemplo, pelo método reflectométrico usando um analisador automático Kodak Ektachem 500 referido por Nakano, et al. (Hepatology 1995;22:539-545). O efeito das composições e métodos desta invenção na redução da lesão isquémica do fígado induzida por oclusão é observado com base na redução da libertação das enzimas hepatocelulares imediatamente a seguir ao período oclusivo e/ou durante o período de reperfusão pós-isquémico nos fígados sujeitos a perfusão dos ratos no grupo de tratamento comparados com os fígados sujeitos a perfusão nos ratos do grupo de controlo tratados com placebo.

Outros métodos e parâmetros que poderiam altemativamente ser utilizados para demonstrar o benefício das composições e métodos desta invenção na redução da lesão isquémica do fígado incluem aqueles descritos por - 124 -

Nakano, et al. (Hepatology 1995;22:539-545). A administração dos compostos desta invenção pode ser através de qualquer método que liberte um composto desta invenção preferencialmente para o tecido desejado (e.g., fígado e/ou tecidos cardíacos). Estes métodos incluem vias orais, parenterais, vias intraduodenais, etc. Geralmente, os compostos da presente invenção são administrados em dose única (e.g., uma vez por dia) ou doses múltiplas.

As combinações desta invenção são úteis na redução ou minimização da lesão efectuada directamente a qualquer tecido que possa ser susceptível de lesão por isquemia/perfusão (e.g., coração, cérebro, pulmão, rim, parede intestinal, músculo esquelético, retina) como resultado de um acontecimento isquémico (e.g., enfarte do miocárdio). Os compostos activos são por isso útilmente empregues profilacticamente para prevenir, i.e. (prospecti-vamente ou profilacticamente) para retroceder ou suster, lesões de tecido (e.g., tecido miocárdico) em pacientes que estão em risco para isquemia (e.g., isquemia do miocárdio).

Geralmente, os compostos desta invenção são administrados oralmente, mas a administração parenteral (e.g. intravenosa, intramuscular, subcutânea ou intramedular) pode ser utilizada, por exemplo, quando a administração oral não for apropriada para o alvo do instante ou quando a medicação for melhor alicada à superfície de um tecido ou órgão como determinado pelo médico consultado.

Os dois compostos diferentes desta invenção podem ser co-administrados simultaneamente ou sequencialmente em qualquer ordem, ou pode ser administrada uma única composição farmacêutica compreendendo um - 125 - ..... ι inibidor da aldose-redutase como descrito acima e um inibidor da glicogénio-fosforilase como descrito acima num veículo farmaceuticamente aceitável.

Em qualquer caso a quantidade e temporização dos compostos administrados será, certamente, dependente do sujeito a ser tratado, da severidade da aflição, do modo de administração e do julgamento do médico que prescreve. Assim, devido à vulnerabilidade de paciente para paciente, as dosagens dadas abaixo são uma orientação e o médico pode ajustar doses dos compostos até conseguir o tratamento (e.g., abaixamento da actividade da glucose; níveis de insulina) que o médico considera apropriado para o paciente. Considerando o grau de tratamento desejado, o médico deve realizar um balanço de uma variedade de factores tais como idade do paciente, presença de doença pré-existente, bem como presença de outras doenças (e.g., doença cardiovascular).

Assim, por exemplo, num modo de administração a combinação desta invenção pode ser administrada justamente antes de uma cirurgia cardíaca (e.g., dentro de vinte e quatro horas de cirurgia) onde há um risco de isquemia do miocárdio. Num modo exemplar alternativo, os compostos podem ser administrados subsequentemente a uma cirurgia cardíaca (e.g., dentro de vinte e quatro horas após cirurgia) onde há risco de isquemia do miocárdio. Os compostos desta invenção podem também ser administrados de um modo diário crónico.

Em geral uma quantidade de uma combinação desta invenção é usada de tal modo que é suficiente para atingir um efeito sensibilizador de insulina apropriado. E altemativamente estabelecido que uma quantidade de uma combinação desta invenção seja usada de tal modo que é suficiente para - 126- conseguir acções biológicas normais da insulina em "concentração normal" que seriam evidentes através da manutenção de euglicemia, normoglicemia, e lipidemia normal (e.g., trigliceridos, colesterol, ácidos gordos livres) em adição à tolerância normotensiva e normal da glucose.

Uma quantidade da combinação é também usada de modo a ser eficaz para protecção isquémica. É usada uma quantidade do inibidor de aldose-redutase desta invenção que é eficaz para as actividades desta invenção, por exemplo as actividades de abaixamento de trigliceridos e de colesterol, e as actividades de inversão da hiperinsulinemia. Tipicamente, uma dosagem eficaz para os inibidores de aldose-redutase desta invenção está no intervalo de cerca de 0,1 mg/kg/dia a 100 mg/kg/dia em doses únicas ou individuais, preferencialmente 0,1 mg/kg/dia a 20 mg/kg/dia em doses únicas ou divididas.

Em geral uma dosagem eficaz para as actividades desta invenção, por exemplo actividades de abaixamento dos níveis da glucose do sangue, trigliceridos, ácidos gorpos livres e colesterol e actividades de inversão da hiperisulinemia dos compostos inibidores da glicogénio-fosforilase desta invenção está no intervalo de 0,005 a 50 mg/kg/dia, prefercncialmente 0,01 a 25 mg/kg/dia e mais preferencialmente 0,1 a 15 mg/kg/dia.

Os compostos da presente invenção são geralmente administrados na forma de composição farmacêutica compreendendo pelo menos um dos compostos desta invenção em conjunto com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Assim, os compostos desta invenção podem ser administrados individualmente ou em conjunto em qualquer forma de dosagem oral, parenteral, rectal ou transdérmica.

Para administração oral uma composição farmacêutica pode tomar a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, e a gosto. Comprimidos contendo vários excipientes tais como citrato de sódio, carbonato de cálcio e fosfato de cálcio são empregues juntamente com vários desintegrantes tais como amido e preferencialmente amido de batata ou tapioca e certos silicatos complexos, juntamente com agentes aglutinantes tais como polivinilpirrolidona, sacarose, gelatina e acácia. Adiconalmente, agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio, laurilsulfato de sódio e talco são frequentemente úteis para objectivos de compressão. Composições sólidas de tipo semelhante são também empregues como enchimentos em cápsulas de gelatina mole e dura; materiais preferidos nesta ligação incluem também lactose ou açúcar de leite bem como polietilenoglicóis de alto peso molecular. Quando suspensões aquosas e/ou elixires são desejados para administração oral, os compostos desta invenção podem ser combinados com vários agentes adoçantes, agentes aromatizantes, agentes de coloração, agentes emulsificantes e/ou agentes de suspensão, bem como tais diluentes como água, etanol, propilenoglicol, glicerina e várias combinações resultantes a gosto.

Para objectivos de administração parenteral, soluções em óleo de sésamo ou de amendoim ou em propilenoglicol aquoso podem ser empregues, bem como soluções aquosas estéreis dos sais correspondentes solúveis em água. Tais soluções aquosas podem ser adequadamente tamponadas, se necessário, e o liquido diluente tomado primeiro isotónico com solução salina suficiente ou glucose. Estas soluções aquosas são especialmente adequadas para objectivos de injecção intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. Neste âmbito, os meios estéreis aquosos empregues são todos prontamente obtidos por técnicas de referência bem conhecidas dos peritos na técnica.

Para objectivos de administração transdémiiea (e.g., tópica), são preparadas soluções diluídas estéreis, aquosas ou parcialmente aquosas (usualmente em cerca de 0,1% a 5% de concentração), de qualquer modo semelhantes às soluções parenterais acima descritas.

Os métodos de peparação de várias composições farmacêuticas com uma certa quantidade conhecida de ingrediente activo, são conhecidos ou serão aparentes à luz desta descoberta, para os peritos na técnica. Para exemplos de métodos de preparação de composições farmacêuticas, ver Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easter, Pa., 15* Edition (1975).

As composições farmacêuticas de acordo com esta invenção podem conter 0,l%-95% do composto(s) desta invenção, preferencialmente l%-70%. Em qualquer caso, a composição da formulação a ser administrada conterá uma quantidade de composto(s) de acordo com esta invenção numa quantidade eficaz para tratar a doença/condição do sujeito a ser tratado.

Uma vez que a presente invenção tem um aspecto que se relaciona com o tratamento de por exemplo, uma condição insulinoresistente por tratamento com uma combinação de ingredientes activos que podem ser administrados separadamente , a invenção também se relaciona com a possibilidade de combinar composições farmacêuticas separadas na forma de conjunto ("kit"). O conjunto ("kit") compreende duas formas farmacêuticas separadas: um inibidor da aldose-redutase e um inibidor da glicogénio-fosforilase como dscrito acima. O conjunto ("kit") compreende um recipiente para conter as composições separadas tal como um frasco dividido ou uma bolsa de folha dividida. Tipicamente o conjunto ("kit") compreende indicações para a administração dos componentes separados. A forma de conjunto ("kit") é particularmente vantajosa quando os componentes separados são administrados preferencialmente em diferentes formas de dosagem (e.g., oral e parenteral), são administradas a diferentes intervalos de dosagem, ou quando o doseamento dos componentes individuais da combinação é desejado pelo método que prescreve.

Um exemplo de tal conjunto ("kit") é a embalagem "blister". Os pacotes de "blisters" são bem conhecidos na indústria de embalagem e estão a ser largamente usados para a embalagem de formas farmacêuticas de dosagem unitária (comprimidos, cápsulas, e a gosto). Os pacotes de "blisters" consistem geralmente numa folha de um material relativamente rígido coberta com uma lâmina de um material plástico preferencialmente transparente. Durante o processo de empacotamento são formados recessos na lâmina de plástico. Os recessos têm o tamanho e a forma dos comprimidos ou cápsulas a ser embalados. De seguida, os comprimidos ou cápsulas são colocados nos recessos e a folha de material relativamente rígido é selada contra a lâmina de plástico na face da lâmina que está oposta à direcção na qual são formados os recessos. Como resultado, os comprimidos ou cápsulas são selados nos recessos entre a lâmina de plástico e a folha. Preferencialmente a resistência da folha é tal que os comprimidos ou cápsulas podem ser removidos do pacote de "blisters" alicando manualmente pressão nos recessos onde uma abertura se forma na folha no local do recesso. O comprimido ou cápsula pode então ser removido via a referida abertura.

Pode ser desejável fornecer um auxiliar de memória no conjunto ("kit"), e.g., na forma de números próximos dos comprimidos ou cápsulas onde os números correspondem aos dias do regimen ao qual os comprimidos ou cápsulas assim especificados deveriam ser ingeridos. Outro exemplo de tal auxiliar de memória é um calendáro imprimido no cartão e.g., como segue "Primeira Semana, Segunda-feira, Terça-feira, ... etc ... Segunda Semana,

Segunda-feira, Terça-feira, ..." etc. Outras variações de auxiliares de memória serão prontamente aparentes. Uma "dose diária" pode ser um único comprimido ou cápsula ou várias comprimidos ou cápsulas a ser tomados num determinado dia. Também uma dose diária do primeiro composto pode consistir de um comprimido ou cápsula enquanto uma dose diária do segundo composto pode consistir de diversos comprimidos ou cápsulas e vice versa. O auxiliar de memória deverá reflectir isto.

Em outro modelo de realização específico desta invenção é fornecido um dispensador concebido para dispensar as doses diárias uma de cada vez na ordem em que devem ser usadas. Preferencialmente, o dispensador é equipado com um auxiliar de memória, de modo a facilitar posteriormente a sua concordância com o regimen. Um exemplo de tal auxiliar de memória é um contador mecânico que indica o número de doses diárias que tem de ser dispensadas. Outro exemplo de tais auxiliares de memória é uma memória de "micro-chip" com energia de uma bateria acoplada a um leitor de cristal líquido, ou um sinal de aviso audível que, por exemplo, lê por alto a data da última dose diária que foi tomada e/ou recorda quando é que a próxima dose é para ser tomada.

Os compostos desta invenção isolados ou em combinação um com o outro ou com outros compostos serão geralmente administrados numa formulação conveniente. Os exemplos de formulação seguintes são apenas ilustrativos e não têm a intenção de limitar o âmbito da presente invenção.

Nas formulações que se seguem, "ingrediente activo" significa composto(s) desta invenção e assim pode referir-se a um inibidor da aldose-redutase, um inibidor da glicogénio-fosforilase ou uma combinação dos dois. - 131 -

Formulação 1: Cápsulas de Gelatina Cápsulas de gelatina dura são preparadas usando o seguinte:

Ingrediente Quantidade (mg/cápsula) Ingrediente activo 0,25-100 Amido, NF 0-650 Pó de amido deslizante 0-50 Fluido de silicone de 350 centistokes 0-15

Uma formulação de comprimidos é preparada usando os ingredientes seguintes: Formulação 2: Comprimidos Ingrediente Quantidade (mg/comprimido) Ingrediente activo 0,25-100 Celulose, microcrístalina 200-650 Dióxido de silício, micronizado 10-650 Estearato ácido 5-15

Os componentes são misturados e comprimidos para formar comprimidos.

Altemativamente, são feitos comprimidos contendo cada 0,25-100 mg de ingredientes activos como se segue:

Formulação 3: Compnmidos Cápsulas de gelatina dura são preparadas usando o seguinte:

Ingrediente Quantidade (mg/comprimido) Ingrediente activo 0,25-100 Amido 45 Celulose, microcristaíina 35 Polivinilpirrolidona (como solução a 10% em água) 4 Carboximetilcelulose sódica 4,5 Estearato de magnésio 0,5 Talco 1

Os ingredientes activos, amido, e celulose são passados através de um tamiz No. 45 mesh U.S. e completamente misturados. A solução de polivinilpirrolidona é misturada com os pós resultantes que são então passados através de um tamiz No. 45 mesh U.S.. Os grânulos assim produzidos são secos s 50° - 60°C e passados através de um tamiz No. 18 mesh U.S. A carboximetilcelulose sódica, amido, estearato de magnésio, e talco, previamente passados através de um tamiz No. 60 mesh U.S., são então adicionados aos grânulos que, após mistura, são comprimidos numa máquina de comprimidos para produzir comprimidos.

Suspensões contendo cada uma 0,25-100 mg de ingrediente activo per 5 ml de dose são feitas como segue:

Formulação 4: Suspensões

Ingrediente Quantidade (mg/5 ml) Ingrediente activo 0,25-100 mg Carboximetilcelulose sódica 50 mg Xarope 1,25 mg Solução de ácido benzóico 0,10 mL Aroma q.b. Cor q.b. Agua purificada até 5 mL 0 ingrediente activo é passado através de um tamiz No. 45 mesh U.S. e misturado com a carboximetilcelulose de sódio e xarope até uma pastamole. A solução de ácido benzóico, aroma, e cor são diluídos com alguma da água e adicionados, com agitação. Água suficiente é então adicionada para produzir o volume requerido. Uma solução de aerossol é preparada contendo os ingredientes seguintes: Formulação 5: Aerossol Ingrediente Quantidade (% em peso) Ingrediente activo 0,25 Etanol 25,75 Propelante 22 (Clorodifluorometano) 70,00 O ingrediente activo é misturado com etanol e a mistura adicionada - 134 - a uma porção do propelante 22, arrefecida a 30°C, e transferida para um dispositivo de enchimento. A quantidade requerida é então alimentada para um contentor de aço inoxidável e diluida com o propelante remanescente. As unidades de válvula são então ajustadas ao contentor.

Supositórios são preparados como segue:

Formulação 6: Supositórios

Ingrediente Quantidade (mg/ supositório) Ingrediente activo 250 Gliceridos de ácidos gordos saturados 2,000 O ingrediente activo é passado através de um tamiz No. 60 mesh U.S. e suspenso nos gliceridos de ácidos gordos saturados previamente fundidos usando a mínima quantidade de aquecimento necessária. A mistura é então despejada num molde para supositórios de capacidade nominal de 2 g e deixada arrefecer.

Uma preparação intravenosa é preparada como segue:

Formulação 7: Solução Intravenosa

Ingrediente Quantidade Ingrediente activo 20 mg Solução salina isotónica 1 000 mL A solução dos ingrediente acima é administrada intravenosamente a - 135 - um paciente a uma velocidade de 1 mL per minuto. O ingrediente activo acima pode também ser uma combinação de agentes.

Lisboa, 8 de Outubro de 2001 L, U*1

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de: a) um inibidor da aldose-redutase; b) um inibidor da glicogénio-fosforilase; e c) um veículo farmacêutico.
2. 2. Uma composição farmacêutica para conseguir um efeito sensibilizador de insulina num mamífero compreendendo: a) uma quantidade de um primeiro composto, consistindo o referido primeiro composto num inibidor da aldose redutase; e b) uma quantidade de um segundo composto, sendo o referido segundo composto um inibidor da glicogcnio-fosforilase c) um veículo farmacêutico. em que a quantidade do primeiro composto sozinha e a quantidade do segundo composto sozinha é insuficiente para conseguir o efeito sensibilizador de insulina e em que o efeito combinado das quantidades do primeiro e segundo compostos é maior que a soma dos efeitos sensibilizadores de insulina atingíveis com as quantidades individuais do primeiro e segundo compostos.
3. 3. Uma composição farmacêutica como referida na reivindicação 1 ou 2, em que o inibidor da aldose-redutase é ácido 1-ftalazina-acético, 3,4-di-hidro-4-oxo-3-[[5-trifluorometil)-2-benzotiazolil]metil]- ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
4. 4. Uma composição farmacêutica como referida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o inibidor da glicogénio-fosforilase é -2-

   [(lS)-benzil-(2R)-hidroxi-3-((3S)-hidroxipirroIidin-l-il)-3-oxopropil]-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico; [(lS)-benzil-3-((3S,4S)-di-hidroxipirrolidin-l-il)-(2R)-hidroxi-3-oxopropil]-amida do ácido 5-cloro- lH-indole-2-carboxílico; [(lS)-((R)-hidroxi-dimetilcarbamoil-metil)-2-fenil-etil]-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxíl ico; [(lS)-((R)-hidroxi-metoxi-metilcarbamoil]-metil)-2-feniI-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico; [(lS)-((R)-hidroxi-[(2-hidroxi-etil)-metilcarbamoil]-metil)-2-fenil-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico;

   [(lS)-benzil-2-(3-hidroxi-imino-pirrolidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro- 1 H-indole-2-carboxílico; [2-(cis-3,4-di-hidroxi-pirrolidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-1H-indole-2-carboxílico; [2-((3S,4S)-di-hidroxi-pirrolidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro- 1H-indole-2-carboxílico; [(lS)-benzil-3-((cis)-di-hidroxi-pirrolidin-l-il)-(2R)-hidroxi-3-oxopropilJ-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico; [(1 S)-benzil-2-(cis-3,4-di-hidroxí-pirrolidin-1 -il)-(2R)—2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico; [2-(l,l-dioxo-tiazolidin-3-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico; [(lS)-(4-fluoro-benzil)-2-(4-hidroxi-piperidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico; [(lS)-bejizil-2-((3RS)-hidroxi-piperidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico; [2-oxo-2-((lRS)-oxo-tiazolidin-3-il)-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico; [(lS)-benzil-2-(3-hidroxi-azetidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-1H-indole-2-carboxílico.
5. 5. Uma composição farmacêutica tal como referida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a quantidade de inibidor de aldose-redutase é cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg.
6. 6. Uma composição farmacêutica tal como referida em qualquer uma das reivindicações 1 α 5, em que a quantidade de inibidor de glicogénio-fosforilase é cerca de 0,1 mg/kg a cerca dc 15 mg/kg.
7. Utilização de: um inibidor da aldose-redutase; e 7. a. -4- b. um míbidor da glicogénio-fosforilase na preparação de um medicamento para tratamento de um mamífero possuidor de uma condição de resistência à insulina.
8. 8. A utilização tal com referida na reivindicação 7, em que a condição de resistência à insulina é diabetes, hiperinsulinemia, tolerência à glucose alterada, hiperglicemia e/ou hiperlipidemia a seguir às refeições, diabetes tipo II, composição do corpo alterada, redução da massa corporal, obesidade, hipertensão, dislipidemia, aterosclerosc, isquemia de tecido, doenças cardiovasculares, síndroma X, gravidez, condições de infecção, uremia, hiperandrogenismo, hipercortisolemia ou outras condições de excesso de hormona adrenocortical, acromegalia, excesso de hormona de crescimento ou doença policística ovariana.
9. 9. Utilização de: a. um inibidor da aldose-redutase; e b. um inibidor da glicogénio-fosforilase

   na preparação de um medicamento para tratamento de um mamífero possuidor de uma condição de resistência à insulina, em que a quantidade do primeiro composto sozinha e a quantidade do segundo composto sozinha é insuficiente para conseguir o efeito sensibilizador de insulina e em que o efeito combinado das quantidades do primeiro e segundo compostos é maior que a soma dos efeitos sensibilizadores de insulina atingíveis com as quantidades individuais do primeiro e segundo compostos.
10. 10. Utilização de: a. um inibidor da aldose-redutase; e b. um inibidor da glicogénio-fosforilase na preparação de um medicamento para reduzir lesão no tecido resultante de isquemia.
11. 11. A utilização tal como reivindicada na reivindicação 10, em que o tecido é cardíaco, cérebro, fígado, rim, pulmão, intestino, músculo esquelético, baço, pâncreas, nervo, medula espinal, tecido da retina, a vasculatura, ou tecido intestinal.
12. 12. A utilização tal como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 7 a 11, em que o inibidor da aldose-redutase é ácido ftalazina-acético, 3,4-di-hidro-4-oxo-3-[[5-trifluorometil)-2-benzotiazolil]metil]- ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
13. 13. A utilização tal como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 7 a 12, em que o inibidor de glicogénio-fosforilase é [(lS)-benzil-(2R)-hidroxi-3-((3S)-hidroxi-pirrolidin-l-il)-3-oxopropil]-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico, [(lS)-benzil-3-((3S,4S)-di-hidroxi-pirrolidin-l-il)-(2R)-hidroxi-3-oxopropil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(lS)-((R)-hidroxi-dimetilcarbamoil-metil)-2-fenil-etil]-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico, [(lS)-((R)-hidroxi-metoxi-metil-carbamoil)-metil)-2-fenil-etil]-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico, [(IS) ((R)-hidroxi-[(2-hidroxi-etil)-metil-c.arhamoil]-metil)-2-fenil-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(lS)-benzil-2-(3-hidroxi-imino-pirrolidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico, [2-(cis-3,4-di-hidroxi-pirrolidin-l-il)-2-oxO'etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [2-((3S,4S)-di-hidroxi-pirrolidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(1 S)-benzil-3-((cis)-di-hidroxi-pirrolidin-1 -il)-(2R)-hidroxi-3-oxopropil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(lS)-benzil-2-(cis-3,4-di-hidroxi-pirrolidin-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico, [2-(l,l-dioxotiazolidin-3-il)-2-oxo-etiI]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(lS)-(4-fluoro-benzil)-2-(4-hidroxi-piperidm-l-il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico, [(1 S)-benzil-2-((3RS)-hidroxi-piperídin-1 -il)-2-oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-1 H-indole-2-carboxílico, [(2-oxo-2-((lRS)-oxo-tiazolidin-3-il)-etil]-amida do ácido 5-cIoro-lH-indole-2- carboxílico, -7- [(lS)-benzil-2-(3-hidroxi-azctidin-Lil) 2 oxo-etil]-amida do ácido 5-cloro-lH-indole-2-carboxílico.
14. 14. A utilização tal como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 7 a 13, em que a quantidade de inibidor de aldose-redutase é cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg e a quantidade de inibidor de glicogénio-fosforilase é cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 15 mg/kg.
15. 15. A utilização tal como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 7 a 13, em que a dose de inibidor de aldose-redutase é cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg e a dose de inibidor de glicogénio-fosforilase é cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 15 mg/kg.
16. 16. Um conjunto ("kit") compreendendo: a. uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor da aldose-redutase e um veículo farmaceuticamente aceitável numa primeira forma de dosagem unitária; b. uma quantidade terapeuticamente eficaz de inibidor de glicogénio-fosforilase e um veículo farmaceuticamente aceitável numa segunda forma de dosagem unitária; e c. meios contentores para as referidas primeira e segunda formas de dosagem. Lisboa, 8 de Outubro de 2001

    ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA