PT1021552E - Lemnaceae transgénicas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

LEMNACEAE TRANSGÉNICAS DOMÍNIO DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto plantas transformadas de forma estável, a sua descendência genética e produtos obtidos á partir das 'suas.....células""ou dà" sua des cendência. A presente invenção tem ainda por objecto processos para a transformação genética de plantas e, mais especificamente, um processo em que se utiliza Agro-ba.cterium como o vector de transformação.

TÉCNICA ANTERIOR A técnica anterior, que se considera pertinente para a memória descritiva que se segue está listada na secção intitulada '-'Referências", antes das reivindicações.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A transformação genética dé plantas começa a desempenhar, gradualmente, um importante papel na agricultura moderna. Têm-se feito tentativas para introduzir ADN hete-rólogo em plantas de modo a aumentar a sua resistência a infecções virais, a adquirir ou a aumentar a sua resistência a vários herbicidas, regular a maturação ou os tempos de degradação, aumentar o valor nutricional de vários produtos das plantas,, levá-las a produzir produtos farmacêuticos e a produzir várias outras moléculas químicas e biológicas. A produção comercial de compostos transgénicos em sistemas de células bacterianas, de leveduras e de mamí- 1 feros é muitas vezes dificultada por elevados custos de investimento de capital no equipamento de fermentação e pela necessidade de eliminar componentes microplasmáticos ou do prião a partir do produto purificado. Recentemente, tem-se conseguido a produção de proteínas e de péptidos heterólogos (por exemplo, oi-amilase, anticorpos, encefali-nas, albumina do soro humano) em plantas (Pen et al.r 1992, Miele, 1997). As vantagens potenciais dos sistemas de plantas transgénicas são: diminuição dos custos de produção da bíomassa e redução dos impactos negativos dos conta-minantes no ambiente bem como das contaminações em animais, em consequência dos tratamentos, a jusante, dos produtos. As plantas transgénicas podem assim ser bioreactores superiores para produzir enzimas em larga escala na indústria, produtos purificados para a medicina e produtos farmacêuticos actívos sob o ponto de vista oral.

Para transformar plantas .para produzir um produto desejado, o gene relevante, uma vez identificado e clonado, tem de ser introduzido na planta que interessa de modo a que a planta resultante seja capaz de passar o gene para os seus descendentes. Os processos de introdução propostos com este fim incluem electroporação, micro-injecção, bombardeamentos com micro-projécteis, fusão de lipossomas, transferência regulada por Agrobacteríum, e muitos outros.

Um dos vectores de transformação utilizado mais vulgarmente é Agzobacterium, que é um género de bactéria patogénica das plantas da familia das Rhízobiaceae, que não fixa o azoto livre e normalmente produz galhas e raizes pilosas em células infectadas. Introduz-se o ADN heterólogo na Agrobacteríum e, através de um processo de transfecção em que o material genético de Agrobacteríum entra na célula das plantas, tem lugar a transformação genética da planta 2 (Armitage et al., 1992). A Agrobacterium infecta principalmente as plantas dicotiledóneas e infecta as plantas monocotiledóneas apenas num grau muito baixo (Armitage et al., 1992) .

Uma das tentativas para transformar as plantas monocotiledóneas foi feita por meio de um acelerador de partículas em que o ADN heterólogo é fornecido por meio de ar ou de hélio à planta ou à célula da planta a transformar. Esta técnica tem duas desvantagens principais: primeiro, é bastante difícil que as patículas de ADNatinjam a zona meristemática em que, para certas plantas tal como as da família das Lemnaceae, a transformação deve ter lugar, de modo a permitir a regeneração, a partir dela, de uma planta transformada completa; segundo, mesmo se as partículas de ADN entrarem na célula na zona meristemática e atingirem o seu núcleo, o ADN não se integra normalmente nos cromossomas das células e, assim, depois de alguns ciclos de células, o ADN heterólogo não integrado perde-se, de modo que a transformação por meio de um acelerador de partículas é normalmente meramente transitória.

Seria altamente desejável descobrir um processo para a transformação genética de plantas monocotiledóneas que resultasse numa transformação estável com um rendimento satisfatório.

Uma das monocotiledóneas comercialmente mais promissoras é da família das Lemnaceaer uma família de plantas aquáticas pequenas (1-5 mm) amplamente distribuída. As Lemnaceae distinguem-se por duas características potencialmente exploráveis pela indústria biotecnológica: as suas taxas de crescimento vegetativo extraordinárias e uma elevada tolerância a. um largo espectro de nutrientes e de 3 substâncias tóxicas (Landolt e Kandeler, 1987). Nos E.U.A., a comercialização de Lemnaceae centrou-se à volta da gestão de águas residuais e alimentos para animais (Gulley et al. , 1981; Ngo, 1987). Contudo, a utilização conjunta de aquaculturas e tecnologias convencionais tem tido apenas um sucesso moderado. Optou-se por uma abordagem diferente em Israel, utilizando a estirpe Lemna gibba Hurfeish (Porath et al., 1979). Com a sua raiz especialmente curta e um teor elevado de proteína, de carotenóides e de ferro, cultivou-se esta estirpe nas condições das estufas modernas (4 tons colhidas por acre [0,4 ha] por semana; Tzora Biotechnology Inc., Kibbutz Tzora), e comercializou-se com sucesso como um produto vegetal embalado para a indústria alimentar. Não obstante as taxas de crescimento excepcionalmente elevadas e o futuro promissor das Lemnaceae como fonte potencial de alimentos, várias tentativas, até à data, para transformar geneticamente estas plantas, por um processo de transformação estável, provaram ter muito pouco sucesso. A falha na transformação foi devida ao facto de as Lemnaceae se multiplicarem vegetativamente, aparecendo rebentos de folhagens a partir das zonas meristemáticas profundas dentro do rebento-mãe. Assim, é necessário chegar ao meristema inicial para que tenha lugar uma transformação estável. Os requerentes verificaram que o bombardeamento das Lemnaceae com partículas, o processo do estado da técnica actual utilizado por vários grupos para obter eventos de transformação localizados e transitórios, tinha uma aplicação ineficaz na transformação de rebentos de frondes.

Seria altamente desejável obter plantas Lemnaceae que sejam transformadas de forma estável com ADN heterólogo com interesse e que se utilize essas plantas transformadas para a produção de produtos químicos e biológicos. 4

DESCRIÇÃO GERAL DA INVENÇÃO

Na memória descritiva que se segue, o termo "transformação" será utilizado para indicar a introdução de ADN de transformação em células ou tecidos de plantas que leve ao aparecimento nessas células ou tecidos de traços que essas células ou tecidos não tinham antes ou para regular os traços presentes, a priori, nas plantas. A expressão "transformação estável" será utilizada para indicar essa transformação genética que será herdada por gerações futuras de plantas transformadas. A expressão "ADN de transformação" será utilizada aqui para indicar uma molécula estranha de ADN que é introduzida nas células da planta e causa a sua transformação. O ADN detransformação pode ser de qualquer origem, por exemplo pode ter origem em plantas, e pode também ser uma sequência de ADN que está presente naturalmente na planta transformada. 0 AND de transformação pode incluir sequências de codificação e/ou sequências de controlo capazes de regular a quantidade e o tempo de transcrição. A expressão "planta transformada de forma estável" será utilizada a partir daqui para indicar uma planta que compreende um ADN de transformação integrado de forma estável no seu genoma. Uma "Lemnaceae transformada de forma estável" está conforme com a descrição de uma planta transformada de forma estável. \

De acordo com a presente invenção, verificou-se, surpreendentemente, que existem condições que permitem uma transformação estável das plantas Lemnaceae. Assim, através de um dos seus aspectos, a presente invenção tem por objecto uma planta Lemnaceae transformada de forma estável, os seus tecidos, produtos e a sua descendência.

As plantas Lemnaceae são preferencialmente dos géneros: Spirodela, Lemna e Wolffia. A presente invenção tem 5 por objecto, preferencialmente, estirpes de Lemnaceae transformadas capazes de sofrerem uma transformação com uma eficiência excepcionalmente elevada, sendo exemplo de uma dessas estirpes a estirpe 8717 de Spirodela punctata, que é uma estirpe de Spirodela punctata isolada a partir de E,

V

Landolt e erradamente designada por Lemna disperma em Landolt 1986.

As plantas de Lemnaceae transformadas, os seus tecidos e produtos, da presente invenção, podem ser utilizados para a produção de vários produtos químicos e biológicos tal como proteínas e polipéptidos codificados pelo ADN de transformação e podem também ser utilizados para preparar várias enzimas capazes de produzir vários produtos químicos tal como hidratos de carbono, lípidos, alcaloides, pigmentos, vitaminas, etc. A presente invenção também tem por objecto um processo de produção de um produto com interesse, por exemplo, produtos químicos e biológicos tal como, proteínas, polipéptidos, hidratos de carbono, lípidos, alcalóides,. pigmentos, vitaminas e outros, em que uma Lemnaceae, transformada de acordo com a presente invenção, cresce num meio de cultura apropriado, para produzir o produto com interesse. 0 produto com interesse pode ainda ser isolado e purificado, totalmente ou parcialmente, para uma utilização posterior, de modo a servir como um aditivo alimentar, um aditivo para cosmética, uma vacina, um agente terapêutico, um biocatalisador para conversão enzimática de produtos químicos, etc. Alternativamente, o produto com interesse pode ser utilizado ao natural, numa forma não isolada, tal como está presente na planta Lemnaceae crescida, utilizando a planta sem tratamento ou com um tratamento parcial para os fins anteriores. 6 A presente invenção também tem por objecto, por meio de outro dos seus aspectos, um produto com interesse que seja um produto químico ou biológico tal como proteínas, polipéptidos, hidratos de carbono, lípidos, alcaloides, pigmentos, vitaminas e outros, obtidos a partir das anteriores plantas Lemnaceae transformadas de forma estável. A planta ou tecido transformados podem também expressar traços desejados que não estão caracterizados na produção de novos produtos, sendo exemplos desses traços: resistência a antibióticos, por exemplo, resistência a canamicina, conferida pelo gene npt II; ou resistência a herbicidas for exemplo, resistência ao herbicida BASTA 20 (glifosinato de amónio, Hoechst, Alemanha)

As plantas ou tecidos de Lemnaceae transformados podem também expressar mais do que um gene estranho, por exemplo, a planta pode ser transformada para ser resistente, ao mesmo tempo, a vários herbicidas e/ou antibióticos.

De acordo com a presente invenção, verificou-se que as plantas ou tecidos de Lemnaceae transformados de forma estável podem obter-se utilizando células de Agrobacterium portadoras do referido ADN de transformação. Assim, de acordo com um outro dos seus aspectos, a presente invenção tem por objecto um processo para a transformação estável de plantas ou tecidos de Lemnaceae que compreende a incubação de plantas ou tecidos de Lemnaceae com células de Agrobacterium portadoras do referido ADN de transformação, em que as células no referido tecido da planta se tornam transformadas de forma estável por meio do referido ADN de transformação. 7

Verificou-se ainda que existem estirpes de Agrobacterium que podem atingir e transformar especifi-camente o tecido meristemático nas Lemnaceae, por exemplo as estirpes EHA105, EHA101 e GVE3103 de A. tumefaciens, ou as estirpes de Agrobacterium que podem atingir e transformar especificamente a área ferida da planta, tal como as estirpes LBA4404 e C58 de A. tumefaciens. Por isso, o processo da presente invenção diz respeito, preferencialmente, à incubação de plantas Lemnaceae com as estirpes EHA105, EHA101 e GVE3103 de Agrobacterium capazes de transformar o tecido meristemático das estirpes LBA4404 e C58 de Agrobacterium capazes de transformar o tecido ferido.

Verificou-se ainda mais que a utilização da filtração em vácuo durante a incubação das plantas Lemnaceae com as células de Agrobacterium aumenta a eficiência da transformação. Assim, num enquadramento preferido, o processo de transformação inclui a incubação de plantas ou tecidos de Lemnaceae com células de Agrobacterium aplicando-se ao mesmo tempo a infiltração em vácuo.

Um outro enquadramento do processo da presente invenção baseia-se na verificação de que é possível aumentar a eficiência da transformação de Lemnaceae por meio de Agrobacterium, expondo a zona meristemática do rebento-mãe. Essa exposição pode ser realizada fisicamente, isto é, eliminado o rebento filho para expor a zona meristemática, por exemplo, por meio de um movimento de puxão utilizando pinças ou por quaisquer outros meios mecânicos. Alternativamente, a referida exposição pode ser realizada aplicando uma preparação química ou uma preparação de hormona capaz de eliminar especificamente os rebentos filhos sem danificar a zona meristemática subjacente. 8

Ainda noutro aspecto da presente invenção, ela tem por objecto um novo processo para a transformação de plantas utilizando células de transformação de Agrobacterium, que é particularmente adaptado para a transformação em massa de tecidos de plantas. De acordo com este processo, cortam-se as plantas em pequenas partículas que são depois incubadas com as células de transformação de Agrobacterium, preferencialmente na presença do meio de reforço que se irá descrever aqui a seguir. A dimensão das partículas deve ser tal que pelo menos algumas delas irão conter tecido meristemático não danificado que é capaz de se regenerar em plantas completas. Para se conseguir estas características, as partículas terão preferencialmente uma dimensão média de 150 μιη de diâmetro, mais preferencialmente estarão num intervalo de dimensão de cerca de 150 pm - 750 ym. Ao cortar o tecido da planta em partículas tão pequenas maximiza-se a área de contacto entre o tecido meris-temáticoe a Agrobacterium. Além disso, as células de Agrobacterium infectam mais facilmente o tecido da planta danificado quando se corta a planta, sendo as células de Agrobacterium expostas a regiões grandes de tecido danificado da planta. O resultado global destes factores é um aumento significativo do rendimento de transformação.

Um outro processo de transformação que se pode utilizar na realização da presente invenção, é a micro-injecção que é conhecida per se. De acordo com este processo, as células de Agrobacterium, preferencialmente em conjunto com o meio de reforço da presente invenção que serão descritos aqui a seguir, são micro-injectadas numa zona desejada de transformação dentro da planta, normalmente no meristema da planta. Uma das principais vantagens da micro-injecção, é que permite atingir especificamente o tecido desejado com as células de Agrobacterium, por exemplo, apenas o 9 meristema das raízes, apenas o meristema das folhas, etc., de modo que o resultado seja uma planta que tenha o ADN estranho apenas no tecido específico, for exemplo, nas raízes e não noutros tecidos.

Outro enquadramento do processo de transformação das Lemnaceae baseia-se na verificação surpreendente de que a transformação pode ser realizada em plantas, isto é, utilizando a planta completa e sem necessidade de cortar a planta em partículas pequenas ou utilizar cultura de. tecidos e depois regeneração in vitro para a finalidade da transformação. Pode-se utilizar uma planta completa para a transformação desde que as células de. Agrobacterium sejam dirigidas ao meristema quer por micro-inj e-cção directa tal como se descreveu antes ou por utilização de estirpes de Agrobacterium que atingem preferencialmente o meristema tal como as estirpes EHA105, EHA101 e GVE3103 de A. tumefaciens. Assim, a presente invenção tem por objecto um processo para a transformação em planta de Lemnaceae atingindo o meristama da planta a ser transformada com o ADN de transformação comportado pelas células de Agrobacterium.

De acordo, com outro enquadramento da presente invenção, verificou-se que é possível aumentar a eficiência da transformação das plantas por meio de células de Agrobacterium incubando as células de Agrobacterium com o tecido da planta a ser transformada na presence de um meio de reforço que é capaz de aumentar a virulência da Agrobacterium. Este aumento da eficiência devido à utilização de reforço não se limita à transformação das plantas Lemnaceae mas também se aplica a plantas em geral, incluindo plantas monocotiledóneas e plantas dicotiledó-neas. 10 A Agrobacteríum é já utilizada por rotina para a transformação de plantas dicotiledóneas. Contudo, de acordo com este enquadramento da presente invenção, e eficiência da transformação de plantas dicotiledóneas é aumentada pela incubação do meio do reforço da Agrobacteríum. No que respeita a plantas monocotiledóneas plantas, embora tenha havido alguns relatórios de algumas transformações com sucesso dessas plantas por meio de Agrobacteríum, estes relatórios foram esporádicos e normalmente mostraram rendimentos de transformação insatisfatórios. 0 aumento da virulência de Agrobacteríum por meio do meio de reforço, de acordo com o referido enquadramento, permite, pela primeira vez, a transformação de muitas espécies de plantas monocotiledóneas que antes ' não estavam transformadas, incluindo as que pertencem ao género das Lemnaceae, assim como um aumento no rendimento de transformação de plantas já conhecidas por terem sido transformadas, embora com um rendimento baixo, por meio da utilização de Agrobacteríum.

As plantas transformadas de forma estável produzidas por meio da utilização do meio de reforço, tal como descrito antes, também constituem um aspecto da presente invenção. 0 meio de reforço que aumenta a virulência das células de Agrobacteríum, compreende tecido da planta em cultura a um pH abaixo de cerca de 5,2. Por exemplo, o meio de reforço pode compreender uma suspensão de células frescas de plantas dicotiledóneas, a uma concentração de 1-10 % (p/v). A suspensão de células frescas pode ser, por exemplo, de plantas dicotiledóneas da familia das Solanaceae. 11

Preferencialmente, o meio de reforço pode também compreender cafeína numa concentração de 100-500 mg por litro de meio.

Um exemplo específico de um meio de reforço é aquele que compreende meio básico de EM a um pH de cerca de 3,5 -4,2, 1-10 % (p/v) de uma suspensão de células frescas de Nicotiana tabacum, e cerca de 100-500 mg por Litro de cafeína do meio.

Por outra alternativa, o meio de reforço da presente invenção é um meio de crescimento de plantas que compreende extractos de plantas da família das Lemnaceae. Esse meio pode ser produzido por meio da extracção de plantas Lemnaceae num meio apropriado tal como tampão de fosfato.

Ambos os tipos de meios de reforço, com qualquer uma ou com ambas as especificações anteriores para serem utilizados na melhoria da eficiência das células de transformação de Agrobacterium utilizadas como o vector de transformação, constitui também um dos aspectos da presente invenção.

Ainda por meio de outro enquadramento, a presente invenção tem por objecto um processo para a manutenção de células morfogenéticas de Lemnaceae capazes de se regenerarem durante longos períodos de tempo, utilizando baixos níveis de sacarose no meio de crescimento, por exemplo, desde 0,1 a 1,5 % de sacarose. Verificou-se que é possível aumentar significativamente o período num estado viável, por exemplo, desde 2 semanas até mais de 3 meses diminuindo o nível de sacarose no meio de crescimento.

Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um processo para a produção de calli de Lemnaceae altamente 12 regenerativos, e além disso um processo para uma regeneração rápida e eficiente das plantas a partir dos calli, utilizando o efeito combinado de minerais B5, baixos níveis de sacarose (0,1 a 1,5 % de sacarose) e fito-hormonas no meio de crescimento. A presente invenção será agora ilustrada com referência a alguns exemplos não limitativos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 mostra um desenho esquemático do plasmido de Ti pME504.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A seguir, a presente invenção será ilustrada, algumas vezes com referência especifica à transformação das plantas Lemnaceae, tecido ou calos, sendo essa referência feita meramente como um exemplo e deve-se entender que não é limitativa.

As plantas Lemnaceae transformadas de forma estável contêm genes estranhos que conferem características úteis tais como: melhoria da qualidade nutritiva, da planta ou de partes da planta; expressão de novo de produtos químicos e biológicos desejados, por exemplo enzimas; factores de crescimento, hormonas tais como insulina; anticorpos; anti-oxidantes; defensinas; pró-antocianidinas; citocinas e outros polipéptidos e proteínas activos sob o ponto de vista biológico; sobre-expressão de produtos já expressos por estas plantas; etc. Outros produtos que se podem obter a partir de plantas Lemnaceae transformadas são enzimas para aplicações industriais, tal como super-óxido-dismutase 13 (SOD) , q-amilase, invertase, sintase de fosfato de sacarose e similares, e produtos químicos tais como pigmentos alimentares, por exemplo, β-caroteno, antocianina, etc. 0 tipo de produto que se pode obter a partir das plantas transformadas é obviamente contingente em relação à natureza do referido ADN de transformação. Por meio de outras aplicações, os genes podem ser aqueles que conferem resistência à doença.

Os genes que codificam para as proteínas que conferem resistência à doença são conhecidos na técnica, incluindo péptidos de lise, defensinas, genes de oxidade de oxalato para a tolerância a esclerotinia ou quitinases (patentes de invenção norte-americanas US 5.597.946, US 4.940.840, US 5.290.687, US 5.374.540, US 5.670.706, US 5.399.6801, US 5.695.939, incorporando-se aqui todas as publicações como referência). O ADN de transformação que é introduzido nas células de plantas, inclui, como será entendido por um técnico, sequências de codificação que codificam para a caracte-rística desejada, assim como sequências de controlo que controla a expressão da sequência de codificação, por exemplo, promotores, melhoradores, terminadores, intrões e similares, péptidos pré-pró ou péptidos de transição, conduzindo estes últimos a expressão da referida característica desejada numa região-alvo desejada da célula da planta.

Os promotores que controlam a expressão de genes em células de plantas são bem conhecidos no domínio da biotecnologia das plantas, incluindo qualquer sequência promotora de um gene expresso naturalmente em plantas ou células de plantas, com origem em plantas, origem virai ou bacteriana. Os promotores apropriados estão descritos em 14

Weising et al. (1988), Annual Rev. Genet., 22: 241), cuja material, é aqui incorporada como referência. A seguir dá-se uma lista parcialmente representativa de promotores apropriados para serem utilizados no contexto da presente invenção: sequências reguladoras do ADN-T de Ά. turnefaciens, incluindo manopina-sintase, nopalina-sintase e octopina-sintase; sequências reguladoras da origem das plantas, incluindo o promotor de álcool-desidrogenase do milho, promotores indutiveis pela luz tal como promotores de sub-unidades pequenas de ribulose-biscarboxila-se/oxigenase (SUP RuBisCO) de genes de uma variedade de espécies e os promotores principais dos genes de ligação a/b de clorofila, promotores de histona (EP 507 698) , promotores de actina (US 5.641.876), promotores de ubiqui-tina 1 do milho (Christensen et al., (1996)), sequências reguladoras de origem virai, tal como promotores de 19Ξ ou 35S do vírus em mosaico da couve-flor (US 5.352.605; US 5.530.196); promotores regulados de uma forma incremental tal como promotores cerosos, de zeína ou de bronze do milho; assim como outros promotores sintéticos ou naturais que ou são indutiveis ou constitutivos, incluindo os promotores que exibem a expressão específica de órgãos ou a expressão em estados de desenvolvimento específico das plantas, como o promotor de napina (EP 255 378) ou o promotor de alfa-tubulina (US 5,635,618); sendo todas as publicações aqui incorporadas como referência.

Como um enquadramento preferido, selecciona-se o promotor no grupo que consiste em sub-unidades pequenas de ribulose-biscarboxilase/oxigenase (SUP RuBisCO) de genes de uma variedade de espécies, os promotores de histona, os promotores de actina, os promotores de ubiquitina 1 do milho e os. promotores 35S do vírus de mosaico de couve-flor (CaMV 35S). 15

De acordo com a presente invenção, é possível utilizar com o promotor, outros elementos reguladores normalmente localizados entre o promotor e a sequência de codificação do traço desejado, cujos elementos induzem a expressão do referido traço desejado numa região-alvo específico da planta ou da célula da planta, por exemplo, os cloro- plastos- Exemplos são as sequências de codificação de péptidos de transição, sequências simples ou múltiplas combinadas, podendo esta última ser separada por sequências intermédias. Essas sequências de péptidos múltiplos de transição, tal como sequências duplas de péptidos de transição, podem compreender, na direcção da transcrição (5' a 31): um péptido de transição de um gene de planta que codifica uma enzima localizada num plastido, uma sequência parcial de uma parte madura com terminal N de um gene de plantas que codifica uma enzima localizada no plastido e depois um segundo péptido de transição de . um gene de plantas que codifica uma enzima localizada no plastido. Um exemplo é o péptido de transição optimizado descrito nas patentes, de invenção norte-americanas US 5.510.471 ou US .5.633.448 (incorporada aqui . como.·· referência) . As enzimas localizadas nos plastidos podem ser de qualquer origem, por exemplo a sub-unidade pequena do gene de ribulose, 1,5-difosfate-carboxilase-oxigenase (RuBisCO), ou o gene EPSPS (3-fosfociquimato-l-carbosiviniltransferase) de planta. O péptido de sinal do gene PR-la de tabaco descrito em Cornelissen et al. é outro exemplo de um péptido de transição.·

Outra região de controlo pode ser uma região de sinal de poliadenilaçâo de terminação ou não .traduzida na terminação ' 3' da sequência de codificação que pode ser de qualquer origem, por exemplo origem bacteriana, tal como o gene de nopalina-sintase de Agrobacterium tumefaciens, ou 16 ter origem numa planta, tal como o terminador do gene de codificação para a SUP de RuBisCO de milho ou de girassol, ou o terminador de um gene de histona de planta tal como descrito na patente de invenção europeia- EP 633.317, incorporada aqui como referência.

Além disso, o ADN de transformação pode compreender também um gene marcador seleccionável, tal como um gene de codificação para a resistência a herbicidas, resistência a antibióticos, ou similares. Para além de ou em alternativa, o AND de transformação pode ainda compreender um gene relator, tal como um. gene de codificação para um marcador da cor. Um gene marcador seleccionável tal como um gene relator facilitam a identificação e a selecção do tecido transformado e permite a sua separação do tecido não transformado.

Exemplos, específicos de genes marcadores seleccioná-veis são a sequência de codificação de higromicina-fosfotransferase (HPT) , que pode derivar de E. coli e que confere resistência ao antibiótico higrómicina B; o gene de aminoglicósido-fosfo-transferase 'do transposão Tn5 (Aphll) que codifica, a resistência aos 'antibióticos canamicina; neomieina e G418. Os genes, qué codificam para a proteína que confere tolerância a herbicidas são conhecidos na técnica,' incluindo os genes . que confere tolerância a herbicidas de oxinilo (US 4.810.648 e US 5.559.024), genes .que confere tolerância a herbicidas a herbicidas inibidores de glifosato e EPSPS (patentes de invenção norte-americanas US 4.535.060., US 4.769.061, US 5.094.945, US 4.940.835, US 5.188.642, US 4.971.908, US 5.145.783, US 5.312.910, US 5.310.667, US 5.633.435, US 5.627.061, US 5.554.798, US 5.633.448, e patente de invenção WO. 96104103, ' todas, as publicações -aqui incorporadas, como.referência), genes que 17 confere tolerância a glifosinato {patente de invenção europeia EP 242236, aqui incorporada como referência), assim como gen.es que conferem tolerância a inibidores de HPPD (patentes de invenção WO 96/38567 e WO 98102562, ambas as publicações aqui incorporadas como referência). Os genes de marcadores seleccionáveis que confere resistência ou tolerância a estes compostos fitotóxicos têm também utilidade comercial nas plantas transformadas resultantes.

Os genes repórteres podem ser utilizados para identificar células, tecidos ou calos transformados e para a avaliação da funcionalidade das sequências reguladoras. Os genes repórteres que codificam para proteínas marcadoras facilmente analisáveis são bem conhecidos na técnica. Em geral, um gene repórter é um gene que não está presente nem é expresso pelo organismo ou tecido receptor e que codifica uma proteína cuja expressão se manifesta por meio de algumas propriedades facilmente detectáveis, por exemplo, alteração fenotípica ou actividade enzimática. Exemplos desses genes são o gene de cloranfenicol-acetil-transferase {CAT) de Tn9' de E.. coli, o gene de β-glucuronidase (GUS) do lócus' uidà de E. coli, a proteína de fluorescência verde (PFV,· GFP na terminologia inglesa) obtida a partir de A. Victoria e o gene de luciferase a partir do pirilampo Photinus pyralis, A expressão do gene repórter é analisada no período apropriado depois do ADN ter sido introduzido nas células receptoras. Um exemplo desses ensaios engloba a. utilização do gene de β-glucuronidase. (GUS) de E. coli (Jefferson et al., (1987)). As células de plantas transformadas e que expressam este gene ficarão coradas de azul após exposição ao substrato, 5-bromo-4-cloro-3-idolil-β-D-glucurónido (X-GLUC), no meio extra-celular.

De acordo com o processo da presente invenção, a Agrobacterium, por exemplo, Agrobacterium tumefaciens, é 18 tratada por engenharia genética de modo a conter o ADN de transformação a ser inserido na planta-alvo, por exemplo, a planta alvo Lemnaceae, cuja engenharia genética é realizada por meio conhecidos per se. A planta toda ou as células, tecidos ou caules das plantas são então postos em contacto com as células de Agrobacterium e são- incubadas em conjunto. Seleccionam-se então os tecidos da planta que contêm o ADN de transformação, for exemplo, analisando a expressão fenotípica ' do gene marcador, por exemplo, resistência a herbicidas ou a. antibióticos, ou quanto à expressão do gene repórter, por exemplo, com um produto de cor. Também é possível verificar a presença do ADN de transformação introduzido, por meio de um ensaio do ADN tal como por RCP. A presente invenção será agora melhor ilustrada pelos exemplos que se seguem:

PROCESSOS EXPERIMENTAIS I. Cultura e manutenção de Lesma e Spirodela para experiências de micrq-injecção

Para a . micro-injecção na zona do meristema, introduziu-se um inoculo axénico (aprox. 10 plantas) de Spirodela oligorrhiza (aqui designada por Spirodela punctata) Hegelm. ou Lemna gibba Hurfeish num frasco de 250 ml contendo 50 ml de meio de EM com os ingredientes conforme se detalha no quadro 1 que se segue. II. Condições normalizadas de crescimento

As culturas cresceram a 2 6°C em condições de luz fluorescente (30μΕ m2s“1) numa atmosfera enriquecida com C02 a 3-5 %. 19

Quadro 1:

Meio básico de EM modificado (meio de EM) (com base em Murashige £ Skooçr, 1962) Macro Quantidade Micro Quantidade Aditivos Quantidade elementos (mcr/1) elementos (mcr/1) orgânicos íma/ll nh4no3 1650 h3bo3 6,2 Glicina 2 KN03 1900 MnS04 22,3 Meso-inositol 100 CaCl2'2H20 440 ZnSO4’2H20 0,25 Tiamina HC1 10 MgSCy 7H20 370 Kl 0,83 Ácido nico.tínico 0,5 FeEDTA 35 Na2MoO4'2H20 0,25 Piridoxina 0,5 kh2po4 170 CuS04’5H20 CaS04'7H20 0,25 0,03 .Biotina Ácido fólico Caseína Sacarose pH levado a 5,8 com NaOH antes da autoclave . . 0,5 0,5 800 30000 III. Processo normalizado de transformação

Em condições estéreis, colocaram-se 2,5 g de plantas Lemnaceae num prato de Petri vazio de 9 cm.. Preparou-se uma suspensão, de 10 ml de 5-8xlOs/ml de A. tumefadens, em meio básico de EM (quadro 1) tal como se descreve a .seguir em (IV), . e adiciona-se ao prato. As plantas foram co-cultivadas com a suspensão de A. tumefaciens durante 20-40 min. à temperatura ambiente·. Retirou-se a suspensão dò prato e lavaram-se as plantas 3 vezes com meio básico fresco de EM (quadro 1). Transferiram-se as plantas para um recipiente (15x20xl2cm) contendo meio 1,51 SP (Quadro 2) a 26 °C em condições de luz fluorescente ,{30 μΕ m2s_1) numa atmosfera enriquecida com CO2 a 3-5%.

Quadro 2

Meio SP (modificado segundo Butner) (cf., Posner, 1967) Quantidade (mg/1) kno3 300 Ca(N03)2-4H20 72 MgS04'7H20 74 kh2po4 40 NaEDTA 0,003 Citrato férrico 1 20 h3bo3 1 MnS04 0,1 Na2MoOr2H20 0,1 CuS045H20 0,03 ZnS04 · 4H20 1 pH legado a 5,8 com NaOH antes da autoclave XV. Preparação de A. tumefaciens para a -transformação de Lemnaceaè

Manteve-se uma única colónia de Agrobacterium tumefaciens, em placas LB complementadas com antibiótico (complemento de meio LB) , (Quadro 3, a seguir) , seleccio-nou-se e fez-se crescer durante a noite (28 °C, 250 rpm) em 10 ml de caldo 2YT complementado com antibiótico (Compl. Do meio 2YT 1;) (Quadro 4 a seguir). Transferiu-se a cultura crescida para 50 ml de meio 2YT complementado e déixou-se crescer durante mais 12 hr (28°C, 250 rpm) . Antes da transformação, centrifugou-se a cultura de A. tumefaciens (3200 x g, 5'min), eliminou-se o sobrenadante e fez-se uma nova suspensão das bactérias em 10 ml de meio de EM (Quadro .1) · Antes, da co-cultura com plantas Lemnaceae, ajustou-se a' concentração bacteriana para 5-8xl08 células/ml.

Quadro 3

Meio de oaldo liquido complementado e solidificado (Compl. de meio LB) Quantidade Bacto triptona 10 g Extracto de levedura de Bacto ' 5 g NaCl 10 g Rifampicina 25 mg Canamicina 50 mg Carbenicilina 50 mg Agar cifco pH levado a 7,0 com 10 g . NaOH V. Micro-injecção na zona do meris-tema 21 1. Preparação de plantas Lemnaceae - Fez-se a cultura de plantas axénicas de Lemnaceae em recipientes (diâmetro de 8,5 cm por 11 cm de altura) contendo 50 ml de meio de EM (Quadro 1) a 25 °C sob bolhas fluorescentes brancas e frias (60 μΕ m~2s_1) . Todos os tratamentos foram realizados numa cabine esterilizada de fluxo laminar, à temperatura ambiente. 2. Preparação do vector de transformação - Utilizou-se Agrobacterium tumefaciens contendo um plasmido p35S GUS INT (Vancanneyt et al. 1990). Este plasmido comporta o gene NPTII que codifica para a resistência a canamicina e a sequência de codificação do gene repórter β-glucuronidase (GUS) uidA (Jefferson, 1987) interrompido pelo intrão IV2 (Eches et al. 1986). A utilização deste vector permitiu a coloração para a coloração - da expressão de GUS imediatamente após a transformação e, ao mesmo tempo, evitando o derivado de Agrobacterial, antecedente positivo de GUS. Para as experiências de transformação, seleccionou-se uma única colónia e voltou a fazer-se uma suspensão em meio 2YT complementado, cujos ingredientes estão detalhados no Quadrò 4 que se segue:

Quadro 4

Meio 2YT liquido complementado (compl. de meio 2YT) Quantidade/litro Bacto triptona 16 g Extracto de levedura de Bacto 10 g NaCl 5 g Rifampicina 25 mg Canamicina 50 mg Carbenicilina pH levado a 7,0 50 mg com NaOH

Fez-se a cultura de bactérias durante 16 horas num agitador giratório (250 rpm) a 28°C. Antes da co-cultura 22 das bactérias e das plantas, diluiu-se a cultura bacteriana com meio de EM (quadro I) ou meio de reforço (quadro 5, a seguir) até a uma densidade óptica a 550 nm de 0,6 e levou-se a pH 4 com HC1. Originou-se uma preparação de Agrobacterium apropriada para a transformação das Lemnaceae. 3. Micro-injecção - Transferiram-se as plantas Lemnaceae para meio de EM e levou-se o pH a 4, ou para um meio de reforço da. presente invenção com os ingredientes que se explicitam a seguir no quadro'· 5:

Quadro 5

Meio de reforço da virulência dè Agrobacterium da présente invenção Componente Quantidade Cafeína, (Sigma) Suspensão de células frescas de Nlcotiana tabacum (2SH) (preparada como em Aviv e Galun, 1984) Meio, básico de EM (quadro 1) pH levado a 4,0 com HC1 antes da autoclave .150 mg 20 ml 980 ml

As plantas foram micro-injectadas com a ajuda de um microscópio de dissecção utilizando uma seringa descartável, esterilizada, de 1 ml com uma agulha G-21, e encheu-se com uma preparação apropriada de Agrobacterium para a transformação das Lemnaceae. As injecções foram dirigidas para as zonas meristemáticas das plantas de modo a deixar as bactérias em contacto intimo com o meristema em crescimento. Em cada injecção, injectou-se cerca de 20 μΐ dentro, da zona meristemática e injectou-se cada zona três vezes. '4. Co-cultura - As plantas de Lemna ou de Spírodela injectadas foram co-incubadas com a Agrobacterium apropria-, damente preparada em meio de EM (quadro 1) e levou-se a p.H 4, ou no meio de reforço da presente invenção (quadro 5), durante 48 horas a 25°C sob bolhas fluorescentes brancas e 23 frias (30 μΕ m_2s_1) . A seguir, lavaram-se as plantas 3 vezes com água destilada esterilizada, à temperatura ambiente e fez-se a cultura em meio de EM (quadro 1) complementado com 400 mg/1 de claforan. VI. Processo normalizado de coloração com X-Gluc

Num tubo de Eppendorf de 1,8 ml, dissolveu-se 5 mg de x-gluc (Duchefa Biochemie BV) eml50 μΐ de dimetil-formamida. Depois adicionou-se a seguinte solução de coloração: 10 ml de Tris 100 mM a 7,0; 15 μΐ de ferrocianeto 500 mM (stock mantido congelado) ; 15 μΐ de ferricianeto 500 mM (stock mantido congelado) e 100. pl.de Triton x-100 a 10 %. Transferiram-se então as plantas para um prato de Petri de 9 cm e adicionou-se 10 ml.de solução de'coloração. Incubaram-se os tubos durante a noite a 37°C no escuro. Depois eliminou-se a solução de coloração e lavop-se com água destilada. Observaram-se as plantas positivas para GUS com um microscópio binocular. VII. Formação de calli e conservação, a longo prazo, de Spirodela morfogenética

As plantas Spirodela punctata foram transferidas para meio SP (quadro 2) durante 5 dias a 2 6°C em condições de luz fluorescente (30 μΕ rrf2s_1) .. Colocaram-se as plantas num microscópio binocular, iluminaram-se a partir de baixo, e arrancaram-se os rebentos filhos em crescimento, por meio de um movimento de puxão utilizando uma pinça. Para a indução dos calli, fez-se crescer rebentos-mãe em meio B-5 (Quadro 6, a seguir) complementado com sacarose a 1,0 %, 2 mg/1 de BA e 50 mg/1 de Dicamba. Depois de crescerem durante 3 semanas neste meio, transferiram-se os calli para meio B-5 complementado com 2 mg/1 de 2IP e 10 mg/1 de 2,4- 24 D. Conseguiu-se conservar os callí durante prazos longos transferindo-os periodicamente, de 4 em 4 semanas para meio B-5 fresco complementado com sacarose a 1,0 %, 2 mg/1 de 2IP e 10 mg/1 de 2,4-D. VIII. Regeneração rápida das plantas Spírodela a partir dos calli

Mantiveram-se os calos de Spírodela em meio B-5 (quadro 6 a seguir) complementado com sacarose a .1,0 %, 3 mg/1 de 2IP e 10 mg/1 de 2,4-D. Para a regeneração, transferiram-se os calos para meio B-5 complementado com sacarose a 1,0 %., 3 mg/1 de 12XP. As plantas de S. punctata completamente regeneradas foram eficazmente .obtidas nó prazo de 1-2 semanas. Os calos de Spírodela e as plantas regeneradas cresceram a 26 °C sob uma luz fluorescente continua (30 μΕ m'2s'1} .

Quadro 6

Meio B-5 (modificado segundo Gamborg et ai., 1968) Quantidade (mg/1) kno3 2500 MgS04*7H20 250 Na2H2P04*H20 150 CaCl2*2H20 15Q (NH4)2S04 134 FeEDTA 28 h3bo3 3 Μπ304·Η20 10 ZnSO4*7H20 2 Na2Mo04*H20 0,25 CuS04*5H20 0,025 CoC12* 6H20 0,025 0,75 Ácido nicotínico 1 10 Tiamina HC1 1 Piridoxina HC1 m-inositol 100 Gelrite . 3 g/1 pH levado a 5,8 com NaOH antes da autoclave 25 ΣΧ. Isolamento e transformação semi-automática do meristema 1. Sincronização do crescimento de Spirodela e de Lemiia por meio da exposição do meristema - Esterilizaram-se todos os materiais e todos os processos foram realizados em condições assépticas. Colheram-se as plantas (10 g) para uma caixa esterilizada de fluxo laminar yertendo os conteúdos de um recipiente de cultura através de em peneiro esterilizado de aço inoxidável de 10. mesh (dimensão de poros de 1,7 mm). Transferiram-se as plantas'de Spirodela ou de Lemna do topo do peneiro com uma colher esterilizada para um misturador esterilizado com uma capacidade de 1 litro, modificado para conter 6 lâminas de barbear posicionadas em três planos diferentes (Blumenthal et al·.·, ,1993). Encheu-se o misturador com 250 ml de água destilada, esterilizada- em filtro e activada durante 4 seg. a 170Ò0 rpm. As plantas, parcialmente homogeneizadas, foram vertidas, assepticamente do misturador através de um peneiro Nitex esterilizado de 20 mesh (dimensão de poro de 800 μ) e recòlheram-se num peneiro .Nitex esterilizado de 42 mesh (dimensão de poro de 350 μ) . Em seguida, dirigiu-se um jacto de água destilada, esterilizada em filtro (2 atm., 10 litros/min) para o topo do peneiro Nitex de 20 mesh de modo a forçar todas as partículas de explantes inferiores a 800 pm a serem transferidas novamente para o misturador, com uma colher esterilizada, activou-se o misturador durante 3 seg a 17000 rpm, e repetiram-se todas as etapas de peneiramento e lavagem, tal como se fez antes. A população combinada de dimensões de 350-750 pm, recolhida num peneiro Nitex esterilizado de 42 mesh, foi submetida a uma lavagem final com jacto de água esterilizada. As partículas dos explantes de 350-750 pm peneirados (5 g) foram recolhidas com uma colher esterilizada e foram espaçadas num prato de. Petri esterilizado com 14 cm de diâmetro. Ao longo deste 26 processo, todos os resíduos foram dirigidos, por força da gravidade, para um recipiente de plástico de 30 litros situado abaixo do compartimento de fluxo laminar. 2. Co-cultura seguida de um período de recuperação -Esterilizaram-se todos os materiais e todos os processos foram realizados em condições assépticasJ As partículas dos explantes de Spirodela ou Lemna de 350-750 pm, no prato de Petri com 14 cm de diâmetro, foram novamente suspensas em 15 ml. de meio de EM (quadro 1) levou-se a pH 4, e depois misturou-se com 15 ml de Agrobacterium previamente postos em cultura, em meio 2YT complementado (quadro 4), durante 24 hrs. a 25°C num agitador giratório a 250 rpm. Fez-se uma co-cultura de explantes e bactérias durante 1 hr a 25 °C e 10 μΕ m^s"1. Em seguida, transferiu-se a mistura com . a colher para um peneiro Nitex esterilizado de de 100 mesh (dimensão de poro de 150 μια) . Lavaram-se as partículas excluídas pelo peneiro com 5 ml de meio de EM (quadro 1) levou-se a pH 4, e- transferiu-se para um recipiente de cultura de 3 litros, de bucal largo contendo 500 ml do mesmo meio. A co-cultura continuou'durante 48 hr., t'25 °C sob luz fluorescente contínua (30 μ E rrf2s-1) . Ao fim deste· período,· peneirou-se a mistura através de um peneiro Nitex de 100 mesh (dimensão de poro de 150 μπι) , seguido de três lavagens de 200 ml com água destilada. As partículas explantadas, com bactérias associadas foram transferidas com uma colher para um recipiente de cultura de 3 litros, de buçal largo contendo 500 ml do meio de EM (quadro 1) complementado com 400 mg/l.de claforan e fez-se uma cultura durante 5 dias a 25°C e a 30 μΕ irf2s_1 de luz. Os explantes passaram então pelo peneiro tal como antes, seguido da separação do material flutuante (a maior parte do qual era material vivo e em proliferação) a partir das partículas não vitais afundadas. Conseguiu-se isto vertendo o material 27 de explante, em conjunto com água destilada, num cilindro graduado de 200 ml e recolhendo o material flutuante por meio de uma colher de deformação. Fez-se a cultura dos explantes em frascos de Erlenmeyer de 1 litro contendo 300 ml de meio SP (quadro 2) durante 3 dias. X. Selecção e genes repórteres

Utilizou-se a selecção de NPT II e a coloração de GUS para determinar se as células dos tecidos ou calos de plantas tratadas foram transformados, isto é, se continham o ADN de transformação. Utilizou-se um ADN que compreende o promotor de caMV 35s seguida da sequência de codificação de NPT II de í, coli, que confere resistência a canamicina, como um vector de expressão. Avaliou-se a herança estável de traços transgénicos (resistência a canamicina e activi-dade de GUS) num meio permissivo enquanto de analisavam o gene NPT II e os seus produtos por meio de RCP e "immunoblotting" '(transferência de ADN, ARN ou proteína .para uma matriz imobilizada}, respectivamente.

Exemplo 1:

Transformação das plantas Leznna e Spirodela por micro-injecção

Transferiu-se um gene repórter marcador da cor (GUS) e um gene que confere resistência ao antibiótico canamicina (NPTII) para as plantas Lemnaceae (Lemna gibba Hurfeish e Spirodela punctata) por meio da transformação regulada por Agrobacterium tumefaciens. Isto foi conseguido depois da properação apropriadas das plantas e da promoção activa da transferência de ADN para os núcleos das plantas como se especificou antes. 28 0 meio de reforço da presente invenção (quadro 5) aumenta marcadamente a virulência de Agrobacterium contra Lémnaceae. Aplicando Agrobacterium a plantas Lemna ou Spirodela, manteve-se durante -dois meses em meio de EM (quadro 1) , ao mesmo tempo que diminuindo drasticamente o meio de reforço reduz-se' drasticamente as frequências de transformação mediadas por micro-injecção como se mostra nos resultados das seguintes experiências:

Experiência 1.1: 49 das 100 plantas Lemna micro-injectadas, mantidas em meio de EM foram positivas em relação a GUS quando· se' utilizou o meio de reforço da presente invenção, enquanto 3 das 100 foram positivas em relação a GUS quando se omitiu o meio de reforço.

Experiência 1.2: 47 das 100 plantas Spirodela micro-injectadas, mantidas em meio de EM foram positivas em relação a' GUS quando se utilizou o meio de reforço da presente invenção, enquanto 2 das 100 foram positivas em relação a GUS quando se omitiu o meio de reforço.

As experiências 1.1 e 1.2 provam assim que o meio de reforço da presente invenção aumenta significativamente a eficiência.da transformação.

Experiência 1.3: 34 das 100 plantas Lemna micro-inj ectadas , mantidas em meio de EM foram positivas em relação a GUS quando o meio de reforço da presente invenção foi levado a pH 4; 19 das 29 100 foram positivas em relação a GUS quando se levou o pH do meio de reforço para 5,2; e 9 das 100 foram positivas em relação a GUS quando se levou o pH do meio de reforço para 7,5.

Experiência 1.4: 31 das 100 plantas Spirodela micro-injectadas, mantidas em meio de EM foram positivas em relação a GUS positive quando se levou o meio de reforço da presente invenção a pH 4,0; 13 das 100 foram positivas em relação a GUS quando se levou o meio de reforço a pH 5,2; e 5 das 100 foram positivas em relação a GUS quando se levou o pH do meio de reforço para 7,5. ,Estes resultados indicam claramente que um pH abaixo de cerca de 5,2 aumenta a eficiência da transformação.

Verificou-se que a adição de cafeína, um novo agente nos protocolos de transformação, e de células vivas de tabaco (Aviv e Galun, 1984·) , . promove a transformação com Agrobacterium, como se mostra nas experiências que se seguem:

Experiência 1.5: 44 das 100 plantas Lemna micro-injectadas, mantidas em meio de EM foram positivas em relação a GUS quando se realizou a co-cultura ém meio de EM levado a pH 4.0, que continha cafeína e células vivas de tabaco; enquanto apenas 33 em 100 foram positivas em relação a GUS quando se retirou a cafeína e as células vivas de tabaco.

Experiência 1.6: 30 39 das 100 plantas Spirodela micro-injectadas, mantidas em meio de EM foram positivas em relação a GUS quando se realizou a co-cultura em meio de EM levado a pH 4.0, que continha cafeína e células vivas de tabaco; enquanto apenas 31 em 100 foram positivas em relação a GUS quando se retirou a cafeína e as células vivas de tabaco.

As experiências 1.5 e 1.6 indicam assim que a adição de cafeína e células vivas de tabaco ao meio de reforço da presente invenção aumenta a eficiência da transformação.

Exemplo 2: Desenvolvimento de plantas a partir de partículas de explantes O processo semi-automático de mistura de Lemnaceae resultou numa fracção purificada de partículas de explantes com uma dimensão de 350-750 pm, a partir quer de Lemna quer de Spirodelar o que representa aproximadamente 50% do material inicial total. Entre as partículas com a dimensão de 350-750 pm estavam partículas de explantes que se viu que· continham zonas meristemáticas não danificadas, a partir das quais cresceram vigorosamente novas plantas. As partículas de explantes menores do que 150-350 μ deram um número drasticamente reduzido de plantas em crescimento activo. Os explantes contendo meristema permaneceram verdes, flutuaram e cresceram até à maturidade. Todas as outras partículas de explantes tornaram-se rapidamente castanhas amareladas, eventualmente descorando completamente, e a maior parte afundou-se até ao fundo do recipiente de cultura. A morte massiva das secções não meristemáticas dos explantes não inibiu o desenvolvimento normal de novas plantas, que se desenvolveram a partir das secções dos explantes contendo o meristema dando plantas Lemnaceae maduras que não se distinguiam, sob o ponto de 31 vista morfológico, das plantas não misturadas, como se demonstrou nas experiências que se seguem:

Experiência 2.1:

Quarenta oito horas após o processo de mistura, 600— 800 partículas de um total de 80.000 deram origem a plantas verdes Spirodela minúsculas. As colónias incipientes continham, cada uma, 1-2 plantas com comprimentos inferiores a 1 mm. Seis dias após a mistura, estas colónias consistiam em 3 plantas, cada uma delas com 2-3 mm de comprimento, e 2-3 raízes desenvolvidas de novo (com 5-6 mm de comprimento) . Nove dias após a mistura, as plantas atingiram uma dimensão média de cerca de 4-5 mm de comprimento . e ambas com uma forma comparável à das Spirodela de controlo não misturadas. Neste estádio, as colónias continham 5-7 rebentos e 5-6 raízes completamente alongadas. Fez-se ainda uma sub-cultura destas plantas durante pelo menos 5 gerações. O tempo médio de duplicação da biomassa foi de 2 dias e não se distinguiam das plantas de controlo. Não' se observou nenhuma variação somaclonal..

Experiência 2.2:

Quarenta oito. horas após o processo de mistura, 300-500 partículas de um total de 80.000 deram origem a plantas verdes Lemna minúsculas. As colónias incipientes continham, cada' uma, 2 plantas, cada uma delas com um comprimento de 2-3 mm e duas raízes recentemente desenvolvidas (1 mm de comprimento). Nove dias após a mistura, estas novas plantas atingiram uma dimensão média de cerca de 7 mm e tinham uma forma comparável à das Lemna de controlo não misturadas. Neste estádio, as colónias continham 4 plantas e 2-4 raízes. .Fez-se depois uma sub-cultura destas plantas 32 durante pelo menos 5 gerações. 0 tempo médio de duplicação da biomassa foi de 2 dias e não se distinguiam das plantas de controlo. Não se observou nenhuma variação somaclonal.

Exemplo 3:

Análise das plantas de Lezana e Spirodela transformadas pelo processo semi-automático de mistura do meristema de Lemnaceae e pelo processo de transformação A. Coloração positive em relação a GUS nas plantas Lemnaceae transformadas no seguimento de uma exposição semi-automática do meristema e da transformação.

No seguimento da transformação com Agrobacterium portadora do gene repórter de β-glucuronidase (GUS) uidA, fez-se a cultura dos explantes durante 3-7 dias e depois corou-se para avaliar a actividade de GUS. Seguem-se os resultados de duas dessas experiências:

Experiência 3.1:

Dezasseis horas depois da imersão das colónias de Spirodela transformadas por Agrobacterium numa mistura reaccional de GUS (Jefferson, 1987), 120 de 600 colónias numa repetição, e 400 de 800 colónias noutra, exibiram sectores azuis, indicando que 20-50 % dos explantes estavam transformados. A dimensão dos sectores transformados variou de 0,01 ao 1 mm2. As plantas de controlo não transformadas não exibiram qualquer coloração de GUS. Em 2 de 600 e em 16 de 800 colónias (0,3-2 %), as plantas da geração dos filhos estavam coradas sistematicamente de azul, indicando isto que as zonas meristemáticas a partir das quais as plantas filhas regeneraram, tinham sido transformadas. Nalgumas 33 colónias, as plantas da geração mãe permaneceram sem estar coradas enquanto se observou uma coloração sistémica de GUS nalgumas das plantas das gerações filhas. Isto indica que a exposição massiva do meristema das plantas Spirodela pode levar à transformação dirigida do meristema.

Experiência 3.2:

Dezasseis horas depois da imersão das colónias de Lemna transformadas por Agrobacterium numa mistura reaccio-nal de GUS (Jefferson, 1987), 60 de 300 colónias numa repetição, e 250 de 500 colónias noutra, exibiram sectores azuis, indicando que 20-50 % dos explantes estavam transformados. A dimensão dos sectores transformados variou de 0,01 ao 1 mm2. As plantas de controlo não transformadas não exibiram qualquer coloração de GUS. Em 1 de 300 e em 5 de 50Q colónias (0,3-1 %), as plantas da geração dos filhos estavam coradas sistematicamente de azul. B. Integração do gene resistente a canamicina

Para verificar a inserção e a integração do ADN de transferência de Agrobacterium, extraiu-se o ADN das plantas Lemna e Spirodela que tinham sido previamente seleccionadas por terem coloração positiva em .relação a GUS. Ampliou-se o ADN numa reacção de RCP (hibridação a 55 °C) com os iniciadores que se seguem das regiões de codificação NPT II: 1. 5' GCACGAGGTTCTCCGGCCGCTTGGG 3’; 2. 5' GAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGG 3'.

Estes iniciadores produzem um fragmento de 780 pb dentro do gene NPT II. Fez-se uma electroforese dos 34 produtos de reacção de RCP em gel de agarose (0,8 %) e corou-se com brometo de etidio. As plantas Lemna e Spirodela positivas em relação a GUS exibiram a esperada banda com a dimensão esperada para o transgene NPTII. As plantas de controlo de Lemna e Spirodela não transformadas não continham esta banda. A mesma banda na mesma posição de migração também era evidente no AND isolado do plasmido Ti de Agrobacterium, que foi submetida a electroforese no mesmo gel tal como no controlo positivo. Estes resultados verificaram que a Agrobacterium é capaz de transformar geneticamente as plantas Lemna e Spirodela. C. Transformação de orgãos específicos numa planta Lemnaceae Intacta

Em 5 % da população transformada, a expressão do gene de GUS introduzido foi detectado apenas no sistema da raiz. Nestes casos, a expressão de GUS foi deteçtada em todo o sistema da raiz. Isto tem importância em casos em que tem interesse expressar o gene introduzido apenas numa parte definida da planta tal como o tecido da raiz.

Exemplo 4. Identificação de estirpes de 2ígroba.cterium que têm uma especificidade para a transformação de tecido meristémico em iemnaceae

Manteve-se plantas Spirodela punctata e Lemna gibba var Hurfeish em meio SP (quadro 2) em condições de crescimento normalizadas (Processo II) . Utilizando o peocesso de transformação normalizado (Processo III), fez-se uma co-cultura de plantas intactas com 5 estirpes diferentes de A. tumefacíens (EHA 105 [Xiu-Qing Li et al.r 1992]; EHA101 [Hood et al., 1987]; GVE3103 [Deblaere et 35 al., 1985]; LBA4404 [Doms et al.r 1982]; e C58 [Van

Larebeke et al., 1974]) comportando cada uma o plasmido de Ti pME504 (mostrado na fig. 1) . Este plasmido comporta: o gene nptll gene, que confere resistência a antibióticos de canamicina, sob o controlo do promotor de nopalina-sintase; o gene bar, que confere resistência aos herbicidas BASTA {Thompson et al., 1987), sob o controlo do promotor 35S-CaMV; e o gene uidA interrompido por um intrão (Vancanneit et al., 1990), codificando para o repórter de GUS, também sob o controlo do promotor de 35S-CaMV. A expressão de GUS (Processo VI) foi determinada pela pontuação das manchas azuis. A especificidade do tecido das diferentes estirpes de A. tumefaciens foi determinada por meio da pontuação da distribuição das manchas azuis nas plantas Lemnaceae. Os dados estão resumidos no quadro 7, a seguir. 0 processo envolveu o ferimento nas plantas Spirodela punçtata e Lemna gíbba Hurfeish, a co-cultura das plantas com 5xlG8 bactériaa ml-1, a infiltração em vácuo (30 mbar, 5-10 min) e mais uma co-cultura durante 4 hr. Analisaram-se os rebentos quanto à expressão de GUS 10 dias após a co-cultura .

Os resultados indicam que a expressão de GUS nas Ξ. punçtata co-cultivatadas com as estirpes de A. tumefaciens EHA105, EHA101 e GVE3103 restringiu-se principalmente aos rebentos filhos que resultaram do tecido meristemático, enquanto a expressão de GUS nas S. punçtata co-cultivatadas com as estirpes de A. tumefaciens LBA4404 e C58 estava restrita principalmente ás áreas feridas do rebento-mãe.

Quadro 7 A. Plasmido Expressão de GUS (% de rebentos) tumefac. Ti Spirodela | Lemna 36 estirpe tipo Rebento- mâe Rebento- filho Rebento- mãe Rebento- filho ΞΗΑ105 agropína 6 23 1 7 EHA101 agropina 7 22 1 5 CVE3101 octopina 3 18 0 0 LBA4404 octopína 10 3 0 0 C58 nenhum 8 1 0 0

Exemplo 5: Identificação de estirpes de Agrobacterivm que atingem especificamente e transformam o tecido ferido de Lemnaceae

Manteve-se Spírodela punctata e Lemna gibba Hurfeish em meio SP (quadro 2) em condições de crescimento normalizadas (processo II). Utilizando o processo de transformação padrão (processo III), co-cultivaram-se plantas intactas com 5 estirpes diferentes de A. tumefaciens comportando, cada uma delas, o plasmido de Ti pME504 (indicado na fig. 1) . Determinou-se a expressão de GUS pontuando as manchas azuis. A especificidade dos tecidos das diferentes estirpes de A. tumefaciens foi determinada pela distribuição das manchas nas plantas Lemnaceae. A expressão de GUS nas S. punctata co-cultivadas com as estirpes de A. tumefaciens LEA4404 e C58 restringiu-se principalmente às áreas feridas do rebento-mãe, enquanto a expressão de GUS nas S. punctata co-cultivadas com as estirpes de A. tumefaciens EHAI05, EHA101 e GVE3103 restringiu-se principalmente aos rebentos filhos que resultaram do tecido meristemático conforme se mostrou no quadro 7, anterior.

Exemplo 6: Utilização da infiltração em vácuo para aumentar a eficiência da transformação de Lemnaceae por meio de Agrobacteri um

Mantiveram-se as plantas de Spírodela punctata e Lemna gibba Hurfeish em meio SP (quadro 2) em condições de 37 crescimento normalizadas (processo II) . Co-cultivaram-se plantas intactas com a estirpe EHA105 de A. tumefaciens comportando o plasmido de Ti pME504 utilizando o processo de transformação padrão (processo III) com e sem infiltração em vácuo (30 mbar, 5-10 min). Determinou-se a eficiência da transformação pontuando a expressão de GUS (manchas azuis). Os dados estão indicados a seguir, no quadro 8. 0 processo envolveu o ferimento das plantas Spirodela punctata var. Helgm e Lemna gibba var. Hurfeish plants, a sua co-cultura com 5xl08 bactérias ml-1 (estirpe EHA105 de A. tumefaciens comportando o plasmido de Ti pME504) e infiltração em vácuo (30 mbar durante 5-10 min). As plantas de controlo foram feridas e postas em co-cultura, tal como antes, mas sem infiltração em vácuo. Analisaram-se as plantas quanto à expressão de GUS . 10 dias após a co-cultura.

Os dados mostram um aumento na eficiência da transformação de 61 % para as Spirodela e de 400 % para as Lemna no seguimento da infiltração em vácuo.

Quadro 8

Expressão de GUS expression (% de rebentos) Controlo Infiltrado em vácuo % de aumento Spirodela 18 29 61 Lemna 2 8 400

Exemplo 7: Processo para aumentar a eficiência da transformação de Lamaceae por Agrobacteriwa por meio da exposição das zonas meristemáticas do rebento-mãe

Para expor parcialmente as zonas meristemáticas dos rebentos-mãe das Lemnaceae às Agrobacteria, colocaram-se as 38 plantas num microscópio binocular, iluminou-se de baixo para cima, e retiraram-se os rebentos-filhos que cresceram; por exemplo, por meio. de um movimento de puxão utilizando pinças. Este processo não teve efeito na viabilidade dos rebentos tratados. Uma experiência envolvendo 500 plantas Spirodela punctata, metade das quais tinham as suas zonas meristemáticas expostas por causa da retirada do seus rebentos-filhos, resultou num aumento da expressão de GUS nas zonas meristemáticas de 14 % (não tratados) a 23 % (zona meristemática exposta).

Exemplo 8: Processo para aumentar a eficiência da transformação de Lemnaceae por Agrobacterium por dissecção directa e exposição das zonas meristemáticas do rebento-mãe

No seguimento da retirada dos rebentos-filhos das bolsas meristemáticas do rebento-mãe, dissecou-se longitudinalmente o rebento-mãe, com a ajuda de um microscópio binocular de modo a expor completamente as suas zonas meristemáticas. Realizou-se uma experiência em que os rebentos-filhos se retiraram de 500 plantas Spirodela punctata. Depois disto, dissecou-se também, longitudinalmente, 250 destas plantas. Monitorizou-se a expressão de GUS 10 dias após a co-cultura com EHA105 de A. tumefaciens comportando o plasmido de Ti pME504. Observou-se a expressão de GUS em 33 % das plantas dissecadas longitudinalmente, comparada com 25 % nas zonas não dissecadas.

Exemplo 9: Processo para aumentar a estabilidade da transformação de lemnaceae por Agrobacterlwn por dissecção directa e exposição das zonas meristemáticas do rebento-mãe 39 0 processo envolveu o tratamento de quinhentas Spirodela punctata tal como descrito no exemplo 8. Para todas as plantas, retiraram-se primeiro os rebentos-filhos. Além disso, metade dos rebentos-mães foram dissecados longitudinalmente e co-cultivados com 5xl08 bactérias ml-1 da estirpe EHA105 de A. tumefaciens comportando o plasmído de Ti pME5Q4. As plantas foram infiltradas .em vácuo (30 mbar durante 5-10 min). Avaliaram-se as plantas quanto à expressão de GUS 5, 10 e 15 dias depois da co-cultura e registou-se a sua relação filial com o rebento-mãe dissecado. Os resultados estão indicados no quadro 9.

Quadro 9

Expressão de GUS (% de rebentos) Tratamento Rebento-mãe Geração de rebentos-filhos Fi r2 f3 F4 Fs Dissecado 0 19 5 2 1 0,2 longitudinalmente Não dissecado 6 15 3 1 0 0,0

Obteve-se um aumento na estabilidade da expressão de GUS transformado no que respeita ao meristema a partir de uma geração de filhos em relação à seguinte, como é evidente a partir do quadro 9.

Exemplo 10: Utilização de extractos de Xemnaceae para aumentar a eficiência da transformação

Mantiveram-se as plantas de Spirodela punctata em meio SP (quadro 2) em condições de crescimento padronizadas (processo II) . Utilizando um processo-padrão de transformação (processo III), as plantas foram co-cultivadas com a estirpe EHA105 de A. tumefaciens comportando o plasmido de Ti pME504. As plantas foram feridas ou deixaram-se intactas (não feridas). Depois, foram co-cultivadas com A. 40 tumefaciens em meio SP que foi completado em vários períodos de tempo com um extracto de plantas Spirodela. Determinou-se a eficiência da transformação pontuando a expressão de GUS (manchas azuis). 0 processo envolveu a manutenção de 500 plantas de Splrodela punctata tratadas como se descreveu no processo III. Destas 500 plantas, 250 foram feridas. Todas as plantas foram co-cultivadas com 5xl08 bactérias ml”1 (estirpe EHA105 de Â. tumefaciens comportando o plasmido de Ti pME504), e expôs-se a um extracto de Splrodela. The extract foi preparado por homogeneização de 20 g de plantas de Splrodela de uma cultura de uma semana em 50 ml de tampão de fosfato (pH 7,0). Centrifugou-se o homogeneizado (10 min. 10000 rpm) e ,o sobrenadante filtrou-se em meio esterilizado. Aplicou-se o extracto de Spirodela resultante durante 4 hr durante a co-cultura ou durante este período e mais os 10 dias que se seguiram. As plantas de controlo não foram expostas ao extracto. Analisaram-se todas as plantas relativamente à expressão de GUS 10 dias após a co-cultura.

Os dados resumidos no quadro 10 mostram que a presença do extracto de Spirodela aumenta a eficiência da transformação das plantas não feridas.

Quadro 10

Incubação com extracto de Spirodela (h) Expressão de GUS (% de rebentos) Feridas Não—feridas 0 16 8 4 17 10 240 16 14

Exemplo 11: Demonstração da capacidade de transformação de várias espécies a partir de um certo número de géneros de Leznitaceae 41

Mantiveram-se todas as plantas em meio SP (quadro 2) em condições de crescimento padronizadas (processo II). Utilizando um processo-padrão de transformação (processo III), as plantas foram co-cultivadas com a estirpe EHA1Q5 de A. tumefaciens comportando o plasmido de Ti pME504. 0 quadro 11 resume a percentagem de plantas das .diferentes espécies de Lemnaceae que expressam GUS, 10 dias depois da co-cultura. A expressão de Gus nos rebentos-filhos Fi foi determinada para três géneros diferentes de Lemnaceae; (A) Spirodela (B) ; (b) Lemna; e (C) Wolffia, todas inoculadas com a estirpe EHA105 de A. tumefaciens (pME504). O processo envolveu as plantas feridas, fez-se a sua co-cultura com 5xl08 bactérias ml-1 (estirpe EHA105 de A. tumefaciens comportando o plasmido de Ti pME504), infiltração em vácuo (30 mbar durante 5-10 min.) e depois a co-cultura durante 30 min. Analisaram-se as plantas relativamente à expressão de GUS (coloração azul) 10 dias após a co-cultura.

Os resultados demonstram que a capacidade geral de aplicação do processo da presente .invenção- para' a transformação de Lemnaceae.

Quadro 11 Género Espécies Estirpe % de plantas coradas Spirodela intermédia 7757 3 Spirodela punctata 8717 92 Spirodela punctata Hegelm 27 Lemna obscura 7325 12 Lemna obscura 7780 14 Lemna gibba Hurfeish 8 Lemna gibba G-3 5 Wolffia brasílíen 8743 0,1 Wolffia australiana 8730 9

Exemplo 12: lemnaceae transformadas que expressam resistência a antibióticos 42

As plantas de Spirodela punctata obtidas pelo processo padrão de transformação {processo III) foram colocadas em meio SP (quadro 2) contendo 2 pg/ml de canamicina. Nas culturas de controlo não transformadas, as plantas que emergiram de novo cresceram brancas na presença de antibiótico. Contudo, no seguimento da transformação e da cultura, na presença de canamicina (2 pg/ml durante dois meses), três em 500 (Experiência 1), e três em 300 (Experiência 2) das plantas que emergiram de novo cresceram verdes e resistentes aos efeitos de descoloração do antibiótico. Isto indicou que o gene NPTII estava presente e se expressou nas plantas verdes, resistentes. Controlaram-se as seguintes plantas: um clone resistente a canamicina 10 gerações após o inicio da Experiência 2; uma colónia sensível a canamicina (Kn-) com rebentos-filhos descorados, que não se desenvolveu mais na presença de canamicina durante os dois meses da experiência; um controlo não transformado mostrando .uma colónia com rebentos-filhos descorados após 7 dias de exposição a 2 pg/ml de canamicina. A coloração de uma amostra retirada de um clone resistente a canamicina, dois meses após o inicio da Experiência 2 mostrou uma coloração azul de GUS em mais do que 80 % dos rebentos. Os resultados estão indicados no quadro 12. O processo envolveu plantas feridas, fazendo-se a sua co-cultura com 5xl08 bactérias ml-1 (estirpe EHA105 de A. tumefaciens comportando o plasmido de Ti pME504) durante 30 minutos e infiltração em vácuo (30 mbar, durante 5-10 min). As plantas transformadas de Spirodela punctata cresceram em meio SP (quadro 2) complementado com 2pg/ml canamicina durante 2 a 5 semanas. Fez-se a análise de seis plantas verdes resistentes a canamicina, e uma amostragem das descoradas, quanto à expressão de GUS. 43

Os dados resumidos no quadro 12 indicam que as plantas verdes, resistentes a antibióticos, foram na verdade transformadas.

Quadro 12

Suplemento para o meio SP Expressão de GUS expression (% de rebentos) Plantas verdes Plantas descoradas Canamicina (2 pg/ml) BASTA (2 pg/ml) 83 76 0 0

Sxemplo 13: iemnaceae transformadas portadoras de resistência a herbicidas

Fez-se uma co-cultura de quinhentas plantas de

Spirodela punctata 8717 com EHA105 de A. tumefaciens (pME504), comportando: o gene nptll que confere resistência ao . antibiótico canamicina; o gene bar que confere resistência ao herbicida BASTA; e o gene uid A gene (interrompido por um intrão (Vancanneyt et al.f 1990) codificando para o repórter de GUS. As plantas co-cultivadas cresceram em meio SP (Quadro 2) com um suplemento de 2 pg/ml de BASTA durante 5 semanas. As plantas foram transferidas periodicamente para meio fresco com um suplemento de ' BASTA de 2 em 2 semanas. Nestas condições, as plantas de controlo falharam no crescimento e eventualmente ficaram completamente descoradas passados 16 dias. Trinta e quarto das 500 plantas co-cultivadas com EHA105 de A. tumefaciens (pME504) eram resistentes aos efeitos de descoloração do herbicida. Isto indicou que o gene bar estava presente e expressava-se nestas plantas verdes em crescimento. Monitorizaram-se as seguintes plantas: plantas verdes de um clone resistente a herbicida; uma planta sensível a BASTA, planta descorada (BASTA-} que falhou no desenvolvimento de rebentos-filhos Fi; e um 44 controlo (planta descorada mostrada estar controlada e não transformada). As plantas foram monitorizadas 16 dias após a co-cultura. A coloração de uma amostra retirada de um clone resistente a BASTA, 25 dias após o inicio da experiência mostrou uma coloração azul de GUS em mais de 75 % dos rebentos. Os dados estão resumidos no quadro 12. Os resultados indicam que as plantas verdes, resistentes a herbicidas, seleccionadas repetidamente em meio fresco com suplemento de BASTA, estavam na verdade transformadas.

Exemplo 14: Zemnaceae transformadas portadoras de genes repórteres fluorescentes

Mantiveram-se as plantas de Spirodela punctata em meio SP (quadro 2) em condições padrão de crescimento (processo II) . Utilizando o processo padrão de transformação (processo III),. as plantas foram eo-cultivadas com EHA105 de A. tumefaciens (pME506) portadora do gene nptll que confere resistência ao antibiótico de canamicina; o gene bar que confere resistência ao herbicida BASTA; e o géne luc que codifica para o LUC repórter de luciferase de pirilampo. Em paralelo, co-cultivaram-se outras plantas com EHA105 de A. tumefaciens (pME508) portadora do gene nptll que confere resistência ao antibiótico de canamicina; o gene bar que confere resistência ao herbicida BASTA; e um gene que codifica para a proteína fluorescente verde (PFV) de Aequorea victoria. A expressão dos genes repórteres de fluorescência nas plantas de Spirodela foi determinada (Millar et al., 1992; Chiu et al., 1996) 10 dias após a co-cultura. A expressão de GFP foi verificada em todos os rebentos, quando vista com uma ampliação de 200 vezes.

Exemplo 15: Expressão de genes estranhos múltiplos numa planta de Zemnaceae transformada 45

As plantas de S. punctata foram postas em co-cultura com EHA105 de A. tumefaciens (pME504), portadora: do gene nptll que confere resistência ao antibiótico de canamicina; do gene bar que confere resistência ao herbicida BASTA; e do gene uidA (interrompido por um intrão (Vancanneyt et al.r 1990) codificando para o repórter de GUS. As plantas transformadas cresceram em meio SP (quadro 2) na presença quer de 2 pg/ml de canamicina, quer 2 pg/ml de BASTA durante 2-5 semanas. As plantas verdes, resistentes, assim como uma amostra de plantas descoradas, foram avaliadas em relação à expressão de GUS. Os resultados, resumidos no quadro 12 demonstram uma elevada correlação entre as plantas verdes resistentes a antibióticos ou resistentes a herbicidas e as plantas que expressam GUS. Isto demonstra a co-expressão de genes múltiplos nas Lemnaceae transformadas .

Exemplo 16: Identificação de tuna estirpe de Lemnaceae transformação altamente eficiente

As experiências demonstraram uma elevada frequência de coloração de GUS de uma população representativa de Spirodela punctata 8717 transformada quatro dias após a transformação. A taxa de transformação para esta estirpe é > 90 % utilizando o processo padrão de transformação (processo III) .

Exemplo 17: Transformação estável e não quimérica de Lemnaceae

Mantiveram-se as plantas de Spirodela punctata 8717 em meio SP (quadro 2) em condições padrão de crescimento (processo II) . Utilizando o processo padrão de transformação (processo III), as plantas foram co-cultivadas com 46 ΕΗΑ105 de A. tumefaciens (pME506) portadora do gene nptll que confere resistência ao antibiótico de canamicina; o gene bar que confere resistência ao herbicida BASTA; e o gene uidA interrompido por um intrão (Vancanneyt et al.r 1990) codificando para o repórter de GUS (fig. 1) . A expressão do gene repórter de GUS repórter nas plantas transformadas foi determinada periodicamente por amostragem da população aos 4, 10 e 35 dias após a co-cultura. Exemplos representativos mostram mais do que 7 gerações sucessivas (ligadas pelas suas hastes). de ' plantas transformadas que expressão GUS através dos seus tecidos. Isto indica' uma transformação estável, não quimérica de plantas inteiras de Lemnaceae ao longo de várias gerações e num período de tempo longo.

Exemplo 18: Expressão de GUS em plantas de Lemnaceae transformadas com um gene uidA sem promotor, indicando a integração de ADN estranho no cromossoma das Lemnaceae

Fez-se uma co-cultura de plantas de 5. punctata plantas com GV3103 de A. tumefaciens (pVCGUS) (Koncz et al., 1989) que contém uma estrutura de GUS sem promotor (o gene uidA interrompido por um intrão). Monitorizaram-se as plantas transformadas, expressando GUS sete dias após a co-cultura. A expressão de GUS só é possível se o gene uidA foi integrada nos cromossomas de Lemnaceae adjacente à sequências reguladoras endógenas de Lemnaceae. Como resultado da integração aleatória do gene uidA, seria de esperar uma variabilidade no nível de expressão de GUS entre os diferentes eventos de transformação. Os resultados da experiência mostram 3 intensidades diferentes da coloração azul de GUS, sendo que a mais intensa corresponde com as fortes intensidades típicas encontradas nas plantas transformadas sob a acção do promotor 35S-CaMV. 47 0 quadro 13 resume os resultados para mais de 12.000 plantas em 4 experiências diferentes (cada uma com 3 estirpes diferentes de A. tumefaciens) que foram pontuados quanto à coloração de GUS 10 dias após a co-cultura. Fez-se a co-cultura de quatrocentas plantas com GV.3103 de A. tumefaciens a que faltava um vector binário (controlo). Nenhuma coloração azul indicava não haver actividade endógena de GUS. Fez-se a co-cultura de quatrocentas plantas com GV3103 de A. tumefaciens portadora de uma estrutura sem promotor (pVCGUS). Até 1,4 % das plantas coraram-se de azul, indicando um nível altamente significativo (versus o controlo) de integração do gene uidA sem promotor, no cromossoma de Lemnaceae adjacente às sequências reguladoras endógenas das Lemnaceae. Fez-se a co-cultura de quatrocentas plantas com GV3103 de A. tumefaciens (pME504), portadoras do gene uidA sob o controlo do promotor 35S-CaMV. Vinte e oito por cento das plantas ficaram coradas de azul, indicando um nível relativamente elevado de expressão utilizando este promotor heterólogo. O processo envolveu a co-cultura de aproximadamente 3000 plantas de Spirodela punctata (6 gr de peso em fresco) em cada experiência de transformação {1000 plantas para cada 3 estruturas). Pontuaram-se as plantas quanto à expressão de GOS 10 dias após a co-cultura. Os resultados foram categorizados de acordo com a intensidade da cor azul: claro (+}, médio (++) e escuro (+++).

Os dados no quadro 13 mostram que a capacidade de variação na intensidade da coloração de GUS entre as plantas co-cultivadas com GV3103 de A. tumefaciens (pVCGUS) foi consideravelmente mais elevada do que as das co-cultivadas com GV3103 de A. tumefaciens (pME504) . A 48 percentagem relativamente baixa e a variabilidade (versus o controlo) na intensidade de plantas coradas de GUS co- cultivadas com a estrutura de GUS sem promotor são explicadas pela integração aleatória deste gene no cromossoma de S. punctata e pela expressão por meio de vários promotores endógenos de Spirodela.

Quadro 13

Expressão de GUS {No. de rebentos) pvc -GUS ΡΜΞ504 No. de plasmidos de Ti + ++ +++ total + ++ l· ++ total + ++ +++ total I 7 3 2 12 0 14 231 245 0 0 0 .0 II 1 1 3 5 0 10 271 281 0 0 0 0- III 9 5 0 14 0 6 '201 206 0 0 0 0 IV 3 1 2 6 0 21 209 230 0 o. 0 0 Sum 37 962 0 °/o (méd.) 0,9 24 0

Exemplo 19: Desenvolvimento de transformação não quimérica in planta, de Lemnaceae, regulada por uma Agrobacterium, sem regeneração de novo

Demonstrou-se que é possível desenvolver um novo sistema de transformação em Lemnaceae que não requer cultura de tecidos ou processos de regeneração in vitro. Os processos permitem alcançar directamente o meristema in planta, por parte do veículo de transformação. Neste novo sistema, o meristema transforma-se e tem a capacidade de continuar o crescimento e assim formar a geração seguinte. Além disso, não é necessária nenhuma pressão de selecção para evitar o crescimento de tecido não meristemático dentro das mesma planta de Lemnaceae. Exemplos da validade desta abordagem podem ver-se nos resultados dos Exemplos 1, 4, 6 e 10 até 18. 49

Exemplo 20: Processo para a conservação a longo prazo dos calos morfogenéticos de Spirodela A formação temporária de callus e a manutenção por um curto período do calus foi previamente referenciada em 2 espécies de Lemna (Chang e Chiu, 1978a, 1978b). Utilizando um dos meios de formação de calo destes autores (Murashige e Skoog, 1962), complementado com sacarose a 3%, 1 mg/1 de 2IP e 10 mg/1 de 2,4-D), obtiveram-se os calos de Spirodela punctata mas o desenvolvimento dos calos parou no espaço de 14 a 21 dias. Durante este período, observou-se uma acumulação enorme de amido (medida como um aumento do material corado de iodo) dentro do calo. Estes calos ficaram descorados e, eventualmente morreram, aparentemente devido ao envenenamento do amido. A manutenção a longo prazo é um pré-requisito para a transformação ao nível do calo dado que são necessárias etapas de rastreio . e/ou selecção.

Pesquisaram-se as condições para a manutenção a longo prazo de calos de Spirodela.· Estudaram-se vários meios diferentes (meio de EM (quadro 1) , B-5 (quadro 5) , e concentrações de sacarose (3,0, 1,0, 0,5 %) em combinação com um certo número de fito-hormonas (2IP; 2,4-D; Dicamba; BA, Zeatin) . Verificou-se que o meio B-5 com um suplemento de sacarose a baixa concentração (1,0 %) era o melhor para promover a manutenção a longo prazo de calos de Spirodela sob várias combinações hormonais. Os dados nos quadros 14, 15 e 16 resume a percentagem de formação de calos e a conservação a longo prazo em várias combinações hormonais. O último processo para a formação de calos e a conservação a longo prazo de calos morfogenéticos de Spirodela está indicado no processo VII. Exige unicamente uma concentração baixa de sacarose combinada com combinações particulares de 50 hormona. Utilizando este processo, conservaram-se os calos verdes, em crescimento durante mais do que três meses. 0 processo envolveu a. cultura separada de rebentos de Spirodela punctata var. Helgm em meio B-5 com um suplemento de sacarose a 1 % e várias concentrações de 2IP e 2,4-D como indicado. A formação do calo foi monitorizada após 8 semanas utilizando um microscópio de dissecção. Fez-se uma sub-cultura dos calos num meio fresco de 4 em 4 semanas. Os resultados estão ilustrados no quadro 14:

Quadro 14 21P 2,4-D Formação de calo* Conservação a longo (mg/1) (mg/1) No. (%) prazob No. (%) 2 2 5 (10) 0 (0) 2 10 134 (90) 48 (34) 2 50 3 (15) 0(0) 10 2 2 (6) 0 (0) 10 10 4 (10) 0 (0) 10 50 0 (0) 0 (0) ® Dados pontuados passadas 8 semanas de cultura b Dados pontuados passadas 12 semanas de cultura

Noutra experiência fez-se a cultura separada de rebentos de Spirodela punctata em meio B-5 com um suplemento de sacarose a 1 % e várias concentrações de BA e de Dicamba conforme indicado. A formação de calos foi monitorizada após 3 semanas utilizando um microscópio de dissecção. Fez-se uma sub-cultura dos calos em meio fresco de 3 em 3 semanas. Os resultados estão indicados no quadro 15:

Quadro 15 BA (mg/1) Dicamba (mg /1) Formação de calo* No. (%) Conservação a longo prazob No. (S) 2 2 ' 0(0) 0 (0) 2 10 13 (23) 0 (0) 2 30 175(100) 151 (86) 10 2 0(0) 0 (0) 51 10 10 0 (0) 0 (0) 10 50 0 (0) 0 (0) a Dados pontuados passadas 3 semanas de cultura b Dados pontuados passadas 6 semanas de cultura

Noutra experiência fez-se a cultura separada de rebentos de Spirodela punctata em meio B-5 com um suplemento de sacarose a 1 % e várias concentrações de

Zeatina e de Dicamba conforme indicado. A formação de calos foi monitorizada após 3 semanas utilizando um microscópio de dissecção. Fez-se uma sub-cultura dos calos em meio fresco de 3 em 3 semanas. Os resultados estão indicados no quadro 16:

Quadro 16

Zeatina Dicamba Formação de caloa Conservação a longo (mg/1) (mg/1) No. (%) prazob No. (%) 2 2 0 (0) 0 (0 2 10 0(0) 0 (0 2 50 10(80) 7 (70 10 2 0 (0) 0 (0 10 10 0(0) 0 (θ' 10 50 13 (76) . 6(46) s Dados pontuados passadas 3 semanas de cultura b Dados pontuados passadas 6 semanas de cultura

Exemplo 21: Processo para a produção de calos de Spirodela altamente regenerativos 0 único processo para a produção de calos de Spirodela está descrito no processo VII. Utilizando este processo em conjunto com o processo VIII, obtiveram-se, com eficiência plantas regeneradas de S. punctata (quadro 17 a seguir). A combinação dos dois processos representa o processo para a produção altamente regenerativa de calos de Spirodela.

Mantiveram-se os calos de Spirodela punctata var. Helgm, durante 7 a 16 semanas em meio B-5 com um suplemento de sacarose a 1 % sacarose, 2 mg/1 de 2IP e 10 mg/1 de 2,4- 52 D, e transferiram-se para meio B-5 com um suplemento de sacarose a 1 % sacarose e diferentes concentrações de 2IP. As plantas regeneradas foram pontuadas visualmente após 2 semanas.

Quadro 17 2 IP Calos Regeneração de calos (mg/1) No. No. (%) 0 30 26 87 2 30 22 73 10 30 0 0

Exemplo 22: Processo para uma regeneração rápida e altamente eficiente de plantas de lesnaceae a partir de calos A regeneração de estruturas semelhantes a rebentos a partir de calos de Lemna perpusilla já foi referenciada; contudo, os autores dizem que não observaram mais nenhum desenvolvimento destas estruturas semelhantes a rebentos mesmo após 2 meses (Chang e Hsing, 1978). Num outro estudo, relatou-se a regeneração de plantas a partir de calos de Lemna gibba (Chang e Chiu, 1978). Contudo, o processo exigiu 2 meses para se obter uma planta de propagação assexual (Chang e Chiu, 1978) . A regeneração de plantas de Spirodela a partir de calos nunca foi referida. Utilizando a nova metodologia.da presente invenção para a regeneração de plantas, obteve-se, com eficiência, plantas intactas, regeneradas de S. punctata no prazo de 1-2 semanas. 0 processo rápido, especifico para a regeneração de plantas de Lemnaceae é dado no processo VIII.

Exemplo 23: Processo para uma regeneração rápida e altamente eficiente de plantas Spirodel, tipicas do seu tipo, a partir de calos 53

Utilizando a metodologia para a regeneração de plantas (processo VIII), > 90 % das plantas de S. punctata regeneradas pareciam, visualmente, típicas do seu tipo-após 3 semanas de crescimento em meio SP. As plantas de S. punctata, visualizadas após 3 meses de crescimento em condições padrão, continuaram a parecer típicas do seu tipo. Quando comparadas com os sues progenitores no que respeita à taxa de crescimento, dimensão e morfologia dos rebentos, não se notaram diferenças significativas.

Exemplo 24: Processo para aumentar a diversidade genética através dos calos em regeneração de plantas de Spirodela A capacidade para aumentar a diversidade genética nas Spirodela é importante dado que, em várias espécies, a propagação é estritamente vegetativa (Landolt e Kandeler, 1987). Utilizando a metodologia para a regeneração de plantas (processo VIII), várias plantas regeneradas pareciam visualmente aberrantes e, após 3 semanas de crescimento em condições padrão, continuaram a parecer aberrantes. Quando comparadas com os seus progenitores, encontraram-se diferenças significativas na dimensão (mais pequenas), na taxa de crescimento (mais lenta) e na morfologia (forma do rebento).

Exemplo 25: Transformação de calos de lanmaceae por Agrobacterium

Mantiveram-se os calos de Spirodela em meio B-5 (quadro 6) com um suplemento com sacarose a 1,0 %, 2 mg/1 de 2IP e 10 mg/1 de 2,4-D. Fez-se uma co-cultura de quinhentos calos com Agrobacterium comportando o plasmido pME504. Após 2 dias de co-cultura, transferiram-se os calos para meio fresco com um suplemento de 30 mg/1 de canamicina 54 e 300 mg/ml de carbenicilina. Após 15 dias, 488 calos estavam completamente descorados. Os restantes 12 calos verdes foram transferidos para meio fresco com um suplemento de 30 mg/1 de canamicina. Três dos calos permaneceram verdes no seguimento de mais duas sub-culturas (2 meses) em meio fresco com canamicina tal como antes. Monitorizaram-se os calos verdes que se mantiveram mais do que dois meses em meio B-5 com um suplemento de sacarose a 1,0 %, 2 mg/1 de 2IP, 10 mg/1 de 2,4-D e 30 mg/1 de canamicina. Os resultados indicam que os calos persistentes, verdes eram resistentes a canamicina como resultado da expressão dos genes introduzidos.

Exemplo 26: Produção de calos transgénicos a partir de plantas dedLemnaceae intactas, infectadas com Agróbacteríum

Mantiveram~se as plantas de Spirodela punctata em meio SP em condições padrão de crescimento (quadro 2) . Utilizando o processo de transformação padrão (processo III) , as plantas foram co-cultivadas com a estirpe EHA105 de A. tumefaciens portadora do plasmido de Ti pME504. Dois dias após a transformação, fez-se a cultura das plantas intactas em meio B-5 com um suplemento de 10 mg/1 de Dicamba, 2 mg/1 de BA e 30 mg/1 de canamicina (processo VII) . Dois calos verdes, compactos, resistentes a canamicina desenvolveram-se a partir das regiões meristemáticas após 25 dias. Os calos verdes em crescimento foram dissecados a partir do tecido original e depois fez-se uma sub-cultura em meio fresco contendo 30 mg/1 de canamicina durante mais 20 dias. No seguimento desta transferência e do mesmo modo, os 2 calos permaneceram verdes. Os resultados indicam que os calos persistentes, verdes, eram resistentes a canamicina em resultado dos genes introduzidos. 55

Exemplo 27: Regeneração de plantas transgénicas de Lemnaceae a partir de calos transformados com Agrobacterium

Mantiveram-se as plantas de Spirodela punctata 8717 em meio SP em condições padrão de crescimento (quadro 2) . Utilizando o processo de transformação padrão (processo III), as plantas foram co-cultivadas com a estirpe EHA105 de A. tumefacxens portadora do plasmido de Ti pME504. Dois dias após a transformação, fez-se a cultura das plantas intactas em meio B-5 com um suplemento de 10 mg/1 de Dicamba, 2 mg/1 de BA e 30 mg/1 de canamicina (processo VII). Dez calos, resistentes a canamicina desenvolveram-se a partir das regiões meristemáticas após 25 dias. Os calos verdes foram transferidos para meio B-5 com um suplemento de sacarose a 1 %, w mg/1 de 2IP e 30 mg/1 de canamicina. Classificou-se as plantas regeneradas verdes após 2 semanas. Estas plantas forams transferidas para o mesmo meio aproximadamente de 2 em 2 semanas durante um período de 8 meses, dando origem a uma numerosa descendência vegetativa resistente a canamicina, aqui a seguir designada porclone MEll. O clone ME11 tem sido propagado como verde e resistente a canamicina, no meio anterior, durante mais do que 65 gerações. A capacidade de obter calos resistentes a canamicina tem sido demonstrada quer pela. produção de calos transgénicos de plantas de Lemnaceae infectados por Agrobacterium (Exemplo 25), ou pela produção de calos transgénicos de plantas de Lemnaceae infectados por Agrobacterium (Exemploas 26) . Dado que se podem produzir calos resistentes a canamicina e as plantas de Lemnâceae. típicas do seu tipo podem ser regeneradas fácil e eficientemente a partir dos calos (processo VIII), a 56 tecnologia para a produção de plantas Lemnaceae transformadas originadas a partir de calos resistentes a antibióticos tem de ser demonstrada.

Exemplo 28: Verificação da expressão a longo prazo e estabilidade do traço introduzido

Mantiveram-se as plantas de Spirodela punctata 8717 em meio SP em condições padrão de crescimento (quadro 2) . O clone ME11, transformado como no Exemplo 27, propagou-se como verde e resistente a canamicina em meio SP com um suplemento de 2mg/l de canamicina durante aproximadamente 40 gerações. Para verificar a expressão a longo prazo e a estabilidade dos traços introduzidos, fez-se uma sub-cultura do clone MEll no merao meio mas sem canamicina por aproximadamente 60 gerações. O clone MEll foi então avaliado quer quanto à resistência a canamicina ou quanto à resistência a BASTA por meio de uma sub-cultura em meio SP com um suplemento quer de 2mg/l de canamicina ou de 1,5 mg/1 de BASTA com ou sem sacarose a 1 % durante 5-10 gerações.

As plantas de controlo de Spirodela punctata 8717, não transformadas, amareleceram e eventualmente morreram. As plantas do clone MEll continuaram verdes e mantiveram o seu crescimento normal.

Estes resultados demonstram a expressão estável da resistência à canamicina em plantas de MEll apesar da eliminação da pressão de selecção durante mais do que 60 gerações. Também demonstram a expressão estável da resistência a BASTA apesar de uma falta de qualquer pressão de selecção para este traço. 57

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Lisboa, 8 de Abril de 2008 62

Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a transformação genética estável de plan tas completas, tecidos ou calos de plantas Lemnaceae, caracterizado pelo facto de compreender: (i) pôr em contacto plantas completas, tecidos ou calos das plantas Lemnaceae com x células de Agrobacterium contendo uma molécula de ADN de transformação; e (ii) incubar as plantas completas, tecidos ou caules das plantas Lemnaceae com células de Agrobacterium, em que as referidas células nas referidas plantas completas, tecidos ou calos das plantas se transformam de forma estável com o referido ADN, em que se pôe em contacto as células de Agrobacterium, antes ou durante o processo de transformação, com um meio de reforço que aumenta a virulência das células de .Agrobacterium, compreendendo o referido meio de reforço uma' suspensão de células frescas de plantas ' dicotiledóneas ou compreendendo um extracto de plantas Lemnaceae, e ainda compreendendo cafeína numa concentração de 100-500 mg por litro de meio.
2. 2. Processo de acordo com a. reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o meio de reforço compreender uma suspensão de células frescas obtida de uma planta dicotiledónea.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a suspensão de células frescas estar numa concen-tração de 1-10 % (p/v). 1
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo facto de a suspensão de células frescas de uma planta dicotiledónea ser obtida da família das Solanaceae.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o meio de reforço ser um meio de cultura de plantas com um pH de cerca de 3,5 a 4,2, e compreender 1-10 % (p/v) de uma suspensão de células frescas de Nicotiana tabacum e cafeína numa concentração de 100-500 mg por litro de meio.
6. 6. Processo para a transformação genética estável de plantas completas, tecidos ou calos de plantas Lemnaceae caracte-rizado pelo facto de compreender: (i) pôr em contacto plantas completas, tecidos ou calos de plantas Lemnaceae com células de Agrobacterium con-tendo uma molécula de ADN de transformação; e (ii) incubar, as plantas completas, tecidos ou calos das plantas lemnaceae com células de Agrobacteriumr em que as referidas células nas referidas plantas completas, tecidos ou calos das plantas se transformam de forma estável com o referido ADN, em que se põe em contacto as células de Agrobacterium, antes ou durante o processo de transformação, com um meio de reforço que aumenta a virulência das células de Agrobacterium, compreendendo o referido meio de reforço um extracto de plantas Lemnaceae. 2
7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 6, caracterizado pelo facto de o extracto da planta Lemnaceae ser um extracto de Spirodela punctata.
8. 8. Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 7, caracterizado pelo facto de as plantas completas, tecidos ou calos das plantas Lemnaceae serem do género Spirodela, Lemna ou Wolffia.
9. 9. Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 8, caracterizado pelo facto de as células de Agrobacterium atingirem especificamente o tecido meristemático das plantas.
10. 10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de as células de Agrobacterium serem estirpes EHA1Q5, EHA101 ou GVE3103 de A. tumefaciens.
11. 11. Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo facto de as células de Agrobacterium atingirem as regiões feridas na planta.
12. 12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de a Agrobacterium ser das estirpes LBA4404 ou C58 de A. tumefaciens.
13. 13. Processo dé acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo facto de se aplicar a infiltração em vácuo durante a incubação do tecido de plantas Lemnaceae com as células de Agrobacterium.
14. 14. Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo facto de, antes da incubação do tecido de plantas Lemnaceae com as células de 3 Agrobacterium, a zona meristemática da planta estar exposta pela retirada dos rebentos-filhos.
15. 15. Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelò facto de o processo de transformação ter lugar num meio com um pH inferior a cerca de 5,2.
16. 16. Processo para a transformação genética de uma planta Lemnaceae, caracterizado pelo facto de compreender: (i) o corte da planta em partículas de uma dimensão que contenha ainda tecido do meristema não danificado, capaz de se desenvolver em plantas completas; (ii) a incubação das referidas partículas com células de Agrobacterium contendo moléculas de ADN de transfor-mação, em que o referido ADN de transformação é intro-duzido nas células do meristema nas referidas parti-culas; e (iii) a produção das plantas transformadas a partir do tecido do meristema transformado.
17. 17. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de as partículas terem diâmetros cuja dimensão média é superior a 150 μπι.
18. 18. Processo· de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de as partículas terem diâmetros cuja dimensão média é de cerca de 150 pm a 75Ό pm. Lisboa, 8 de Abril de 2008 4