Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych sulfonianów S-adenozylo-L-metioniny oraz mieszanych soli S-adenozylo-L-metioniny z organicznymi kwasami sulfonowymi i kwasem siarkowym. Doklad¬ niej, wynalazek dotyczy nowych, wykazujacych znaczna trwalosc soli S-adenozylo-L-metioniny (SAM), ekono¬ micznego sposobu wytwarzania tych soli na skale przemyslowa. Nowe zwiazki stosuje sie jako skladnik aktywny preparatów farmaceutycznych.SAM jest produktem pochodzenia naturalnego, znajdowanym w organizmach zywych od bakterii do roslin, od organizmów jednokomórkowych do wyzszych ssaków, wlacznie z czlowiekiem. Strukture tego zwiazku opisuje przedstawiony na rysunku wzór, w którym X~ oznacza anion.W zywych organizmach SAM powstaje wcytoplazmie w wyniku procesu enzymatycznego z udzialem S-adenozylometloninosyntetazy lub S-adenozylotransferazy, z metioniny i substancji odzywczych lub ATP, który stanowi rezerwe energii w kazdej zywej komórce.SAM odgrywa zasadnicza role w wielu biologicznych reakcjach enzymatycznej transmetylacji. Dzieki tej wlasciwosci jest waznym odczynnikiem biochemicznym. SAM jest jednak nietrwaly w temperaturze pokojowej, a jego wytwarzanie jest pracochlonne i trudne do wykonania na skale przemyslowa.W ostatnich latach prace nad stabilizacja SAM do stopnia umozliwiajacego uzycie tego odczynnika w badaniach biologicznych koncentrowaly sie nad wytwarzaniem soli trwalych w normalnych warunkach temperatury i wilgotnosci. Otrzymano chlorek i siarczan SAM, lecz sole te moga byc stosowane jedynie jako odczynniki biochemiczne i jedynie w ciagu krótkiego czasu po wytworzeniu, poniewaz w stanie suchym ich trwalosc w niskiej temperaturze jest ograniczona. Sposoby wytwarzania tych soli nadaja sie do stosowania na mala skale lecz nie moga byc stosowane na skale przemyslowa.2 94 268 Nieoczekiwanie znaleziono nowe sole SAM o nieograniczonej trwalosci w czasie, w temperaturze do 45°C.Sole te mozna ekonomicznie i z duza. wydajnoscia wytwarzac na skale przemyslowa. Sole te nieoczekiwanie wykazaly silne dzialanie lecznicze w wielu dziedzinach medycyny czlowieka, czesto bez widocznej korelacji.Nowe sole wytwarzane sposobem wedlug wynalazku sa podwójnymi solami SAM z kwasami sulfonowymi, odpowiadajacymi wzorowi SAM*4RS03 H, w którym RS03H oznacza jeden z nastepujacych kwasów: metanosul- fonowy CH3S03H, etanosulfonowy C2H5S03H, n*dodekanosulfonowy C12H25S03H, 1-oktadekanosulfonowy Ci8H37S03H, 2-chJoroetanosulfortowy CIC2H4S03H, 2 notulfonowy HOC2 H4S03 H, 3-hydroksypropanosulfonowy HOC3 HS -S03 H, d,1 -10-kamforosulfonowy Ci0H17OSO3H,d-, !• ld,1-3-bfomokamforo-10-sulfonowy C10H16Br0SO3H i cysternowy C3H6NS03H.Wynalazek dotyczy równiez sposobu wytwarzania soli o ogólnym wzorze SAM-3RS03H, w którym RSO3H oznacza jeden z nastepujacych kwasów: benzenosulfonowy C4H5S03H, p-chlorobenzenosulfonowy CIC*H4S09H, 2-mezytylobenzenosutfonowy (CH3)3C#H2SOaH,4-dwufenylosulfonowy C12H10SO3H, 1-nafta- lenosutfonowy C10H7SO3H, 2-naftalenotulfonowy C1()H7S03H, 5-sulfosalicylowy C7Hs03S03H, p-acetylo- benrenowjlfonowy C, H7OS03 H, soli SAM z kwasem 1,2-etanodwusulfonowym o wzorze SAM*2C2 H4 (S03 H)2, soli SAM i kwasem o-benzenodwusulfonowym o wzorze SAM*1r5C4H4(S03H)2 i soli SAM z kwasem chondro- itinoslarkowym o wzorze SAMl4CMH21 N014S.„ Przedmiotem wynalazku jest równiez sposób wytwarzania podwójnych soli SAM z kwasem siarkowym i jednym z wyzej wymienionych kwasów sulfonowych o wzorze SAtf-HSOJ •H1804'RS03H lub SAM+'HS04*H2S04-2RS03H, w których to wzorach RS03H oznacza jeden z wyzej wymienionych kwasów sulfonowych lub równowaznik kwasu etanodwusulfonowego, o-benzenodwusul- fonowego tub chondroltinosiarkowego.Wysokim osiagnieciem technicznym jest trwalosc powyzszych nowych soli w 45°C, w stanie suchym. We wszystkich solach wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku, w powyzszych warunkach, zawartosc SAM nie ulega zmianie wciagu 360 dni. W dwóch najtrwalszych z dotychczas znanych soli SAM, chlorku i siarczanie, po uplywie 30 dni utrzymywania w temperaturze 45°C wstanie suchym zawartosc SAM wynosi odpowiednio 20 i 50%. Po uplywie 60 dni w chlorku SAM ulega calkowitemu rozkladowi, a w siarczanie pozostaje jedynie 5% ilosci poczatkowej.Sposób wedlug wynalazku obejmuje zasadniczo nastepujace etapy: a) wytwarzanie roztworu o wysokiej zawartosci SAM, b) wytracenie SAM z przesaczonego roztworu wodnego za pomoca nasyconego roztworu wodnego kwasu pikrylonowego lub za pomoca roztworu tego kwasu w rozpuszczalniku organicznym mieszajacym sie z woda, np. w alkoholu metylowym, etylowym, propylowym, izopropylowym, n-butylowym lub izobutylowym, acetonie, lub w ketonie metyloetylowyrn, metyloizobutylowym, octanie etylu, czterowodorofuranie, 2-metoksyetanolu, 2-etyloksyetanolu, dioksanie lub dwumetyloformamidzie, c) rozpuszczenie odsaczonego SAM w roztworze jednego z wyzej wymienionych kwasów w alkoholu, jak metanol, etanol, propanol-1, propanol-, butano 1-1, butanol-, ll.rz.butanol, 2-metoksyetanol lub 2-etoksyetanol; d) dodanie do roztworu organicznego rozpuszczalnika mieszajacego sie z uzytym alkoholem, takiego jak benzen, toluen, eter dwuetyIowy, eter dwuizopropylowy, aceton, keton mety loetyIowy, keton metyfoizobuty Io¬ wy, octan etylu lub metylu, czterowodorofuran lub chloroform, e) oddzielenie organicznej cieczy i rozpuszczenie osadu w roztworze kwasu zastosowanego w etapie c) w Jednym z alkoholi uzytych w etapie c) i zadanie roztworu weglem odbarwiajacym, f) dodanie do roztworu organicznego rozpuszczalnika zdolnego wytracic czysta sól SAM w postaci dobrze wyksztalconych i latwych do odsaczenia krysztalów, wybranego sposród wykazanych w punkcie d).Pierwsze dwa etapy sposobu wytwarzania podwójnych soli z kwasem siarkowym sa identyczne, natomiast nastepne mozna wykonac nastepujaco: c') rozpuscic odsaczony osad w mieszaninie jednakowych czesci objetosciowych rozpuszczalnika czescio¬ wo mieszajacego sie z woda, jak keton metyloetyIowy, keton metyloizobutylowy, n-butanol lub izobutanol i wodnego roztworu równowaznych ilosci jednego z wyzej wymienionych kwasów sulfonowych i kwasu siarkowe¬ go, d') oddzielic warstwe organiczna, a do wodnego roztworu dodac ketonu lub alkoholu calkowicie rozpuszczalnego w wodzie, e') rozpuscic osad w 10-20% roztworze kwasu uzytego w etapie c') w jednym z alkoholi z etapu c')i zadac roztwór weglem odbarwiajacym, f) dodac organicznego rozpuszczalnika zdolnego wytracic czysta sól SAM w postaci dobrze wyksztalco¬ nych i latwych do odsaczenia krysztalów.Ponadto podwójna sól otrzymuje sie z pojedynczej soli otrzymanej w etapie d) w wyniku: c") rozpuszczania osadu w wodnym roztworze równowaznych ilosci kwasu siarkowego i kwasu uzytego94268 3 w operacji c), a nastepnie zadania roztworu weglem odbarwiajacym, f") dodania organicznego rozpuszczalnika zdolnego wytracic czysta sól SAM w postaci dobrze wyksztalco¬ nych i latwych do odsaczenia krysztalów.Otrzymywanie stezonego roztworu SAM mozna przeprowadzic róznymi, jednakowo skutecznymi sposoba¬ mi. Wedlug jednego z nich, drozdze (Saecharomyces cerevisiae, Torulopais utilis, Candida utilis itp) wzbogacone w SAM dodatkiem metioniny w odpowiednich warunkach (Schlenk, Enzymologia 29, 283 /1965/) zadaje sie octanem etylu, a nastepnie 0,1—0,5, korzystnie 0,35 n kwasem siarkowym, w temperaturze pokojowej, w celu wywolania rozpadu komórki i przejscia do roztworu praktycznie 100% obecnego SAM. Korzystna ilosc wody i octanu etylu wynosi 0,05—0,20 wagi wilgotnych komórek i zabieg korzystnie prowadzi sie w czasie 15-45, a zwlaszcza 30 minut.Nastepnie dodaje sie kwasu siarkowego i prowadzi lize wciagu 1—2, korzystnie 1,5 godziny. Nalezy podkreslic, ze liza komórek drozdzowych prowadzona mieszanina organicznego rozpuszczalnika i rozcienczonego kwasu siarkowego jest znacznie korzystniejsza od zwykle prowadzonej za pomoca kwasu nadchlorowego w temperaturze pokojowej lub kwasu mrówkowego lub octowego w60°C i podobnych operacji, poniewaz nie tylko prowadzi sie ja w temperaturze pokojowej, korzystnie wplywajacej na trwalosc SAM, lecz równiez w warunkach zapewniajacych latwe odsaczenie roztworu pd pozostalosci komórek. Roztwór nie zawiera zanieczyszczen, zwykle obecnych w przypadku uzycia innego czynnika rozkladajacego komórke, a trudnych do usuniecia w znanych sposobach wytwarzania czystego SAM.Alternatywnie, etap a) przeprowadza sie wytwarzajac SAM w drodze enzymatycznej syntezy, dzialajac ATP-metionino-adenozylotransferaza (E.C. 2.4.2.12) na mieszanine inkubacyjna zawierajaca adenozylotrójfosfo- ran (ATP) i metionine. Warunkiem zasadniczym przeprowadzania tego etapu na skale przemyslowa jest czystosc enzymu i to, by byl on w postaci latwo dajacej sie wyodrebnic zarówno z poczatkowej mieszaniny inkubacyjnej jak i z mieszaniny zawierajacej wyprodukowany SAM.Oczyszczanie ATP-metioninó-adenozylotransferazy przeprowadza sie korzystnie na drodze chromatografii przez powinowactwo i reakcji kolumnowej. Chromatografia przez powinowactwo polega na przepuszczeniu roztworu zawierajacego enzym, np. surowego ekstraktu drozdzy lub Escherichia coli przez kolumne wypelniona nosnikiem z kowalencyjnie zwiazana grupa dzialajaca jako konkurencyjny inhibitor enzymu. Nieoczekiwanie stwierdzono, ze doskonalym wypelniaczem kolumny oczyszczajacej jest aktywowany zel polisacharydowy z kowalencyjnie zwiazana L-lizyna. Powinowactwo enzymu do L-lizyny zwiazanej ze stala matryca powoduje opóznienie jego elucji i umozliwia oddzielenie go w bardzo czystej postaci od innych bialek.Wydzielenie enzymu z eluatu, w celu zastosowania go w nastepnym etapie enzymatycznej syntezy, nie daj6 zadowalajacych wyników, poniewaz po wydzieleniu enzym jest nietrwaly, a ponadto, jednokrotnie uzyty do syntezy SAM ulega niszczeniu podczas jego wyodrebniania.Doskonale wyniki uzyskano absorbujac enzym z eluatu na odpowiednim stalym nosniku i przeprowadzajac reakcje miedzy metionina a ATP, prowadzaca do wytworzenia SAM, w kolumnie. Odpowiednim nosnikiem jest polisacharyd aktywowany odczynnikiem wiazacym bialka ze stalym nosnikiem, np. bromek cyjanu. Przepusz¬ czajac przez kolumne zbuforowany roztwór ATP i metioniny otrzymuje sie wyciek zawierajacy SAM.W etapie b) otrzymuje sie SAM o wysokim stopniu czystosci. Jak wykazuje chromatografia cienkowarstwo¬ wa wedlug Anal. Biochem. 4, 16—28/1971/, w srodowisku kwasnym jedynym zwiazkiem wytracanym przez kwas pikrolonowy jest SAM. Dzialanie kwasu pikrolonowego jest wyjatkowo selektywne. Inne, stosowane dotychczas czynniki wytracajace, takie jak kwas pikrynowy, sól Reineckego lub kwas borowy daja produkty wymagajace dalszego oczyszczenia w drodze kolumnowej chromatografii jonowymiennej, która jest procesem kosztownym i trudnym do realizacji na skale przemyslowa. Trudno równiez na tej drodze otrzymac produkt o wymaganym stopniu czystosci.Zastosowanie wodnych roztworów kwasu pikrylonowego lub roztworów tego kwasu w wyzej podanych rozpuszczalnikach organicznych nie przedstawia problemu, a operacje przeprowadza sie w temperaturze pokojo¬ wej. Etapc) korzystnie przeprowadza sie z roztworami wyzej wymienionych kwasów sulfonowych w jednym z wyzej wymienionych alkoholi, o stezeniu 0,25—1,5, korzystnie 1 n. Rozklad kompleksu SAM z kwasem pikrolonowym jest calkowity, na co wskazuje calkowite rozpuszczenie osadu.Etapd) przeprowadza sie korzystnie stosujac 4—10 objetosci (w odniesieniu do objetosci alkoholowego roztworu) rozpuszczalnika wybranego z grupy obejmujacej benzen, toluen, eter dwuety Iowy, eter dwuizopropy¬ lowy, aceton, keton metyloizobutyIowy, octan metylu, octan etylu lub czterowodorofuran.Etap e) i f) stanowia koncowe etapy wytwarzania pozadanej soli SAM. W etapie e) produkt z etapu d) rozpuszcza sie w 0,1—0,5, korzystnie 0,2 n roztworze kwasu zastosowanego w etapie c) w rozpuszczalniku wybranym sposród alkoholi o 1—4 atomach wegla, 2-metoksyetanolu i 2-etoksyetanolu.Kolejny etap f) korzystnie przeprowadza sie stosujac 4—8 objetosci (w odniesieniu do objetosci alkoholo-4 94 268 wego roztworu) organicznego rozpuszczalnika wybranego z grupy obejmujacej benzen, toluen, eter dwuetyIowy, eter dwuizopropylowy, aceton, keton metyloetyIowy, keton metyloizobutyIowy, octan metylu, octan etylu, czterowodorofuran i chloroform.Proste sole SAM, otrzymane sposobem wedlug wynalazku, przechowywane w stanie suchym nie ulegaja praktycznie zadnym zmianom. Sposób wedlug wynalazku wyklucza obecnosc wody we wszystkich operacjach po wytraceniu kwasem pikrolonowym, a tym samym wyklucza calkowity brak nawet sladowych zanieczyszczen rozpuszczalnych w wodzie. Podwójne sole SAM z kwasem siarkowym i jednym z kwasów sulfonowych, wybra¬ nych sposród wymienionych w pierwszym wariancie, korzystnie otrzymuje sie stosujac wodne roztwory równowaznych ilosci jednego z wyzej wymienionych kwasów sulfonowych i kwasu siarkowego, oba w stezeniu 0,05-0,2, korzystnie 0,1 n i organiczny rozpuszczalnik czesciowo mieszajacy sie z woda, taki jak keton metyloetylowy lub n-butanol. Zastosowanie organicznego rozpuszczalnika umozliwia znaczne ograniczenie objetosci wodnego roztworu kwasu i praktycznie calkowicie usuwa kwas pikrolenowy. Etapd') korzystnie przeprowadza sie stosujac 4—8 objetosci (w odniesieniu, do objetosci roztworu wodnego) rozpuszczalnika wybranego z grupy obejmujacej aceton, alkohol metylowy, alkohol etylowy i alkohol propylowy.Równiez nieoczekiwanie stwierdzono, ze jezeli w etapie e') zastosuje sie minimalna ilosc alkoholu do rozpuszczenia osadu z etapu d'), to w nastepnym etapie wytracania V) wytraci sie podwójna sól SAM+,HS04"'H2 - S04-2RS03H.Jezeli natomiast w etapie e') zastosuje sie alkokol w ilosci równej co najmniej dwukrotnej objetosci miiimalnej, to w nastepnym etapie wytracania f) wytraci sie podwójna sól SAM+*HS04"H2S04^2RS03H.Zastosowanie posrednich ilosci alkoholu prowadzi do powstania mieszaniny obu soli.RS03H oznacza jeden z wyzej wymienionych kwasów sulfonowych lub równowaznik kwasu, w przypadku kwasu etanodwusulfonowego lub chondroitinosulfonowego.Koncowe wytracanie nowej soli wedlug wynalazku (etapf) wymaga uzycia organicznego rozpuszczalnika wybranego z grupy obejmujacej benzen, toluen, eter dwuetylowy, eter dwuizopropylowy, chloroform, aceton, keton metyloetylowy, keton metyloizobutyIowy, octan metylu, octan etylu, alkohol izoamylowy lub czterowo- dorofuran.Jak stwierdzono, podwójne sole SAM, otrzymane sposobem wedlug wynalazku, w stanie suchym moga byc przechowywane nieograniczenie dlugo, nie ulegajac praktycznie zadnym zmianom.Wytwarzanie podwójnych soli SAM z kwasem siarkowym i jednym z wyzej wymienionych kwasów sulfonowych wedlug wariantu drugiego polega na rozpuszczeniu (etap e") (soli otrzymanej w etapie d) w roztworze równowaznych ilosci kwasu siarkowego i kwasu zastosowanego w etapie c), oba w stezeniu 0,05-0,2, korzystnie 0,1 n, w alkoholu o 1-4 atomach wegla, 2-metoksyetanolu lub 2-etoksyetanolu.Równiez nieoczekiwanie stwierdzono, ze jezeli w etapie e') zastosuje sie minimalna ilosc alkoholu do rozpuszczenia osadu z etapu d), to w nastepnym etapie f") wytraci sie podwójna sól o wzorze SAM*'HS04lH3S04*2R803H, w którym RSO3H oznacza kwas sulfonowy lub w przypadku kwasu etanodwu¬ sulfonowego lub chondroitinosiarkowego, równowaznik tego kwasu.Jezeli jednak w etapie e") stosuje sie metanol w ilosci równej co najmniej dwukrotnej objetosci minimalnej, to w nastepnym etapie f") wytraca sie podwójna sól SAM* •HS04'H2S04*RS03H. Zastosowanie alkoholu w ilosci posredniej prowadzi do mieszaniny obydwu soli.Koncowe wytracanie podwójnej soli (etapf") wymaga uzycia organicznego rozpuszczalnika, wybranego z grupy obejmujacej benzen, toluen, eter dwuetylowy, eter dwuizopropylowy, chloroform, alkohole o 4 lub atomach wegla, octan metylu, octan etylu, czterowodorofuran, aceton, keton metyloetylowy i keton metylo- izobutylowy.Biochemiczne badania ostatnich lat wykazaly, ze SAM jest jedynym specyficznym donorem rodników metylowych w zywych organizmach w biochemicznych reakcjach przenoszenia tych rodników. Reakcje te sa reakcjami podstawowymi w przemianie tluszczów, bialek i cukrów. Przykladowo, w wyniku zaleznej od SAM transmetylacji powstaja nastepujace zwiazki: a) w wyniku IM-transmetylacji: adenina, karnityna, karnozyna, kreatyna, 2,6-dwuaminopuryna, adrenalina, guanina, hordenina, N'-nikotynamid, fosfatodllkolina i rycynina; b) w wyniku O-transmetylacji: N-acetyloserotanina, dopamina, epinina, d-adrenalina, 1 -adrenalina, ergo- rterol, 1-noradrenalina, pektyna, ubichinon; c) w wyniku S-transmetylacji: 2,3-dwumerkaptopropanol, H2S, metionina, metylomerkaptan, kwas S-mer- kaptopropionowy, tiopirymidyna i tiouracyl; d) w wyniku C-transmetylacji:cytozyna i tymina.Oznacza to, zwlaszcza w odniesieniu do organizmu ludzkiego, ze SAM jest czynny w nastepujacych procesach: w biosyntezie choliny, w biosyntezie fosfatydy lokoliny, w czynnosci enzymów wymagajacych94 268 5 grup SH, w metabolizmie katecholamin, biogenicznych centroencefalicznych amin, serotoniny, histaminy, wita¬ miny B12 i kwasu foliowego, kreatyniny, myozyny, histonów, RNA,DNA, substancji bialkowych, niektórych hormonów o rdzeniu cyklopentanoperhydrofenantrenowym, z których najwazniejsze sa estrogeny, jak równiez w metabolizmie trójglicerydów. Wiadomo równiez, ze SAM demetylowany enzymami transmetylujacymi prze¬ ksztalca sie w S-adenozylohomocysteine (SAO), która jest bezposrednim donorem grup wodorosiarczkowych i ma decydujace znaczenie w metabolizmie wszystkich zwiazków, których aktywnosc biologiczna wymaga grupSH. Sposród nfch szczególnie wazne sa pewne tioenzymy i aminokwasy zawierajace w czasteczce atom siarki.SAO ulega 2 kolei w organizmie dekarboksylacja a produkt zdekarboksylowany jest glównym donorem grupy aminopropylowej, nieodzownym, wedlug najnowszej wiedzy biochemicznej, w biosyntezie poliamin.Proces ten jett katalizowany róznymi enzymami, wlaczajac specyficzna aminopropylotransferaze.Podsumowujac mozna stwierdzic, ze SAM jest w organizmie ludzkim scisle zwiazany ze wszystkimi biochemicznymi reakcjami trensmetylacji (specyficzne przekazywanie grupy CH3), transsulfuracji (specyficzne przekazywanie grupy SH) i transaminopropylowania (specyficzne przekazywanie grupy aminopropylowej). Suma powyzszej wiedzy naprowadza na mysl, ze SAM moze miec lecznicza czynnosc w patologicznych stanach zwiazanych zbraklem lub innego typu ograniczeniem dostepnosci w organizmie niektórych z wielu wyzej wymienionych produktów.Nletrwalosc SAM i brak sposobu nadania temu zwiazkowi trwalosci w normalnych warunkach otoczenia w wystarczajaco dlugim czasie spowodowal, ze nie przeprowadzono z nim badan farmakologicznych i klinicz¬ nych i hit wprowadzono go do lecznictwa. Po otrzymaniu nowych soli SAM, sposobem wedlug wynalazku, wykazujacych w temperaturze pokojowej praktycznie nieograniczona trwalosc, stalo sie mozliwe przeprowadze¬ nie systematycznych badan farmakologicznych i klinicznych. W ich wyniku stwierdzono lecznicze wlasciwosci nowych soli zaskakujace jakoscia i intensywnoscia.Sposród ogromnej ilosci zebranych danych farmakologicznych i klinicznych, dotyczacych nowego produk¬ tu, ponizej podano niektóre, ilustrujace zasadnicze wlasciwosci i glówne zastosowania wleczeniu ludzi. Dla uproszczenia, wszystkie nowe sole, otrzymywane sposobem wedlug wynalazku, objeto wspólna nazwa „sól SAM", poniewaz zastosowania tych zwiazków sa absolutnie identyczne. Dane farmakologiczne i kliniczne podano w przeliczeniu na zawarty w soli SAM.Toksyctnosc. Sole SAM, otrzymywane sposobem wedlug wynalazku w ogóle nie wykazuja toksycznosci ostrej i przewleklej, jak równiez nietolerancji miejscowej I efektów wtórnych. LD50 wynosi u myszy ponad 2,5 g/kg przy wprowadzaniu doustnym i ponad 1,00 g/kg przy wprowadzaniu dootrzewnowym.Próby tolerancji i przewleklej toksycznosci przeprowadzono na szczurach rasy Wistar i Sprague-Dowley, podajac im wciagu 12 miesiecy 4—8 mg produktu dziennie. Po zakonczeniu próby nie stwierdzono patologicz¬ nych zmian badanych organów. Badanie teratogennosci przeprowadzono na królikach i szczurach. Stwierdzono, ze wprowadzanie SAM w dawkach mniej wiecej dziesieciokrotnie przekraczajacych najwyzsze dawki lecznicze nie wywoluje czynnosci teratogennej, a zarówno embriony jak i plody nie wykazuja zadnych znieksztalcen.Dodatek produktu do kultur limfocytów ludzkich i komórek watrobowych myszy, w dawkach do 0,06—0,10 mg/ml, nie powoduje zmian wspólczynnika rozpadu elementów komórkowych.Wprowadzenie dozylne w dawkach do 16 mg/kg nie wywoluje w królika objawów pirogennosci. Taka sama dawka wprowadzana dozylnie nie wywoluje u królika i kota zmian cisnienia w tetnicy szyjnej jak równiez zmian czestotliwosci oddechu i pulsu i zapisu elektrokardiograficznego.Miejscowa tolerancja przy injekcjach dozylnych, przy wprowadzaniu powtarzanym wciagu 180 dni, jak równiez przy wprowadzaniu do skrajnych zyl usznych królika, jest doskonala.U ludzi, mlodych, zdrowych ochotników obojga plci o sredniej wadze 70 kg, którym podawano SAM w dawkach 5—150 mg, szybka injekcja lub wlewem dozylnym, nie stwierdzono zmian minimalnego i maksymal¬ nego cisnienia oraz czestotliwosci pulsu i oddechu w 1, 5, 15, 20, 30 i 60 minut oraz 2, 3, 6,8,10,12 i 24 godzin po zakonczeniu zabiegu. Zapis elektrokardiograficzny nie wykazal zmian w interwale PQ, sekcji ST, jak równiez objawów skurczu przedwczesnego lub innych zmian w 30 sekund i 1, 2, 3, 5, 10 i 20 minut po wprowadzeniu zwiazku. W aparacie krwiotwórczym i w pracy watroby i nerek nie stwierdzono statystycznie znaczacych odchylen od normy.Farmakologia. Wyniki uzyskane przy wprowadzaniu prostych lub podwójnych soli SAM przeliczono, jak uprzednio wspomniano, na zawarty w nich SAM.Dla zbadania rozkladu SAM w tkankach sporzadzono S-adenozylometionine z C14 w rodniku metylowym.Rozklad powyzszego produktu w tkankach szczura badano wprowadzajac zwierzeciu dozylnie dawke 4,2 mg/kg, odpowiadajaca okolo 10juci produktu radioaktywnego. Aktywnosc wlasciwa produktu wynosila 58 mCi/milimol. Równolegle przeprowadzono badania autoradiograficzne na myszy. Wyniki obu badan wykazuja6 94 268 bardzo szybkie przejscie SAM do wszystkich tkanek, W ponizszej tablicy przedstawiono niektóre dane dotyczace rozkladu SAM w tkankach szczura.Tablica lc Stezenie SAM w tkankach szczura jug/g Tkanka Watroba Gruczoly nadnercza Sledziona Przysadka Podwigorze Kora Otocze , ' 1,7 1.9 1,3 2,3 0,3 0,25 7,5 1 h 3,0 3,4 1,2 2,5 0,65 0,45 2,1 4h .5 4,8 3,5 8,0 1.0 0,75 2,3 8h ,6 4,5 2,6 4,5 1.3 8,5 2,0 24 h ,7 4,4 2,8 4,2 1.3 9,4 1,1 Z uzyskanych danych wynika, ze nowe sole, wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, przekazuja grupe CH8 wszystkim tkankom posiadajacym aktywnosc metylotransferazowa. Mówiac inaczej, produkty te maja zdolnosc wybiórczego umiejscawiania sie we wszystkich narzadach wyposazonych w uklady metylotransferazo¬ wa.Powyzszy wniosek zostal potwierdzony dalszymi badaniami farmakologicznymi. W serii prób na szczurach wykazano, ze nowe zwiazki wywieraja znaczne dzialanie ochronne i rozpuszczajace przy otluszczeniu watroby wywolanym dieta o nadmiarze tluszczów i bialek wedlug Handlera, jak równiez przy otluszczeniu watroby spowodowanym ostrym zatruciem alkoholem i innymi czynnikami toksycznymi, jak czterochlorek wegla, bromobenzen Itp., przy dootrzewnowym wprowadzaniu w dawce zaledwie 6 mg/kg. Zarówno z punktu widzenia morfohistochemicznego jak i analitycznego, SAM znacznie zmniejsza akumulacje tluszczów w watrobie w przypadkach chorobowych i przyspiesza doprowadzenie ich do normalnego poziomu po obnizeniu wywola¬ nym zatruciem CCI4. W ponizszej tablicy przedstawiono poziom fosfolipidów w watrobie szczura po intoksykacji CCI4 i podaniu SAM, Tab I i ca II Poziom fosfolipidów w watrobie szczura po intoksykacji CCI4 i podaniu SAM Zabieg Sumaryczna zawartosc fosfolipidów (mg/g) Roztwórfizjologiczny 30,57±1,18 CCU 18,87±1,06 CCI4 + SAM 16 mg/kg dootrzewnowo 27,20±1,25 CCI4 + SAM 150 mg/kg dootrzewnowo 20,87±0,42 CCL4 + Ad + Met 15 mg/kg dootrzewnowo 19,9 ±0,92 I II UI I ¦ ¦ ¦ I I II ¦I \ ', i I I III Podane w tablicy wartosci sa srednimi z dziesieciu dla kazdej grupy.W badaniach czynnosci ochrony watroby wywolywano doswiadczalnie u szczurów tzw. cholesterolowa degeneracje watroby (Ridout i inni, Blochem. J, 52,99,1952). W sposobie tym za pomoca specjalnej diety wywoluje sie znaczny wzrost zawartosci w watrobie tluszczów i cholesterolu. Zwiazki czynne w metabolizmie tluszczów obnizaja lub likwiduja ten wzrost.Zwierzeta podzielono na 6 grup. Grupie pierwszej podawano dowolnie zmieniana diete. Grupie drugiej podawano podstawowa diete Ridouta (20 g na szczura dziennie), a pozostalym grupom te sama diete wzbogacona w cholesterol do 0,2 g na szczura dziennie. Diete podawano wciagu trzech tygodni. Zwierzetom w grupach 4, 5 i 6 podawano SAM w dawkach 0,4,0,8 i 2 mg/kg dootrzewnowo.94 268 7 Po uplywie trzech tygodni zwierzeta usmiercono, pobrano z nich watroby i oznaczono sumaryczna zawartosc tluszczów (Best i ColL, Biochem. J. 40,368,1966) i cholesterolu (Sperry i Brand, J. Biol. Chem., 150,315,1943). Wyniki oznaczen wykazaly slaba ochrone zwierzat, którym podawano SAM w dawce 0,4—0,8 mg/kg i pelna ochrone zwierzat otrzymujacych SAM w dawce 2 mg/kg Tablica III Zawartosc cholesterolu i sumy tluszczów w watrobie po zakonczeniu próby (wartosci srednie w grupie) Grupa Waga swiezej Suma tluszczów Cholesterol 1 2 3 4 6 watroby (g) 18 16 17- 16 16 g 1.41 1,93 3,84. 3,70 3,5 2,0 % 9,4 ,6 24,0 21,6 21,9 12,5 g 40 68 92 90 67 61 % 2,6 3,7 ,7 ,2 4,1 3,8 I_i Sposród innych wlasciwosci farmakologicznych SAM zbadano równiez dzialanie przeciwzapalne i usmie¬ rzajace. Ostry stan zapalny z obrzekiem wywolywano karagenem i bialkiem jaja. Dzialanie przy przewleklym stanie zapalnym obserwowano przy zarniniaku wywolanym bawelna i zapaleniu stawów wywolanym adjuwan- tem. We wszystkich przypadkach SAM wykazal aktywnosc, zarówno wprowadzany doustnie (dawki 8^40 mg/kg) jak i pozajelitowo (dawki 4—8 mg/kg), porównywalna z aktywnoscia innych srodków (Ibuprofen — Indometacyna). Wlasciwosci usmierzajace badano w próbach goracej plyty i z kwasem octowym oraz w próbie Randala i Selito na szczurze. Czynnosc usmierzajaca SAM okazala sie porównywalna z czynnoscia znanych srodków.Zbadano równiez oddzialywanie SAM na czas snu wywolanego uzyciem barbituranów. Badania przeprowa¬ dzono sposobem Holtena i Larsena (Acta Pharmacol. Toxicol., 1956,12, 246), na grupie myszy, którym podano heksobarbital w dawce 80 mg/kg, dootrzewnowo, lacznie z SAM w dawce 4 mg/kg, dootrzewnowe Grupie kontrolnej podano jedynie heksobarbital. Wyniki przedstawiono w ponizszej tablicy.Tablica IV Wplyw SAM na czas snu wywolanego heksobarbitalem Czas snu (minut) Kontrola 24,4±2,7 SAM 4 mg/kg dootrzewnowo 41,2±5,8 Jak wynika z powyzszych danych, SAM przedluza sen wywolany heksobarbitalem.Badania kliniczne. Przez wprowadzanie SAM rozumie sie wprowadzanie soli otrzymanej sposobem wedlug wynalazku. Na podstawie informacji uzyskanych w badaniach farmakologicznych, badania kliniczne ukierunko¬ wano na stany chorobowe objawiajace sie pierwotnym lub wtórnym zaklóceniem metabolizmu tluszczów, metabolizmu bialek i cukrów oraz metabolizmu katecholamin i amin biogennych.Z prób przeprowadzonych klinicznie na setkach pacjentów, przy zastosowaniu SAM w mieszczacych sie w szerokim przedziale dawkach wynika, ze nowe zwiazki powoduja szybki spadek poziomu tluszczów przy otluszczeniach watroby wywolanych róznymi czynnikami chorobowymi, wykrywalny badaniami bioptycznymi po zakonczeniu cyklu leczenia i po uplywie dalszych 60 dni.Podawanie produktu powoduje równiez znaczne obnizenie wysokich wartosci calkowitej cholesterolem ii, hipertrójglicerydemii i normalizuje zmieniony stosunek j3/a lipoproteidów u pacjentów z hiperdyslipidemia w sta-6 94 268 nie niezrównowazonym. Czynnosc obnizania poziomu cholesterolu i tluszczów wystepuje równiez przy dawkach 8—1,5 mg wprowadzanych 2—3 razy dziennie i jest proporcjonalna do dawki.W przypadku miazdzycy z klinicznymi objawami w sferze psychiczno-uczuciowej z zaburzeniami pamieci i wtórna centroencefalia (uszkodzenia wskutek arteriosklerotycznej encefalopatii) i objawami niedotlenienia mózgu, wprowadzanie SAM droga domiesniowa lub, w powazniejszych przypadkach, injekcja lub wlewem dozylnym, w dawkach 8—16 mg 3—4 razy dziennie, powodowalo korzystne zmiany objawów. Szczególnie przy niedotlenieniu mózgu obserwowano szybkie i statystycznie znaczace przywracanie czynnosci kojarzenia. W sta¬ nach poapoplektycznych obserwowano zwiekszenie szybkosci poprawy stanów klinicznych.Klinicznemu leczeniu za' pomoca SAM poddano setki pacjentów dotknietych wtórna hipoprotidemia I dysprotklemla, uporczywa i agresywna chroniczna hepatopatia, stanami cyrrotycznymi i przedcyrrotycznymi, zaburzeniami wchlaniania i rozdzialu bialek. Wprowadzanie SAM w dawkach dziennych 20-80 mg, droga domiesniowa, dozylna lub doustna, w zaleznosci od ciezkosci przypadku, powodowalo statystycznie znaczacy wzrost calkowitej prottdemii, wzrost poziomu albumin i tendencje do normalizacji zmienionego procentowego stosunku elektroforetyczrtych frakcji osocza. Powyzszej czynnosci anabolizowania bialek czesto towarzyszyla poprawa symptomologii i kondycji pacjentów oraz normalizacja prób watrobowych.Szczególnie zaskakujace wyniki uzyskano stosujac nowe enzymatyczne sole, wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, w przypadkach chorobowych zwiazanych z zaburzeniami wymiany biogennych amin, jak przyklado¬ wo: a) patologiczne objawy o podlozu neuropsychiatrycznym, b) choroba Parkinsona i parkinsonizm o róznej etiopatogenezle, c) zapalanie kostnostawowe i pewne objawy neurologiczne (czynnosc przeciwzapalna i usmie¬ rzajaca) oraz d) zaburzenia rytmu snu i czuwania.Odnosnie punktu a)( obszerna kazuistyka kliniczna, przeprowadzona przez badanie zachowali klinicznych i prób Hamiltona i Wittenberga wykazaly, ze podawanie SAM w dawkach 8—20 mg 3—4 razy dziennie w ciagu -16 dni powoduje, przy wylaczeniu innych form terapii, znaczne zmniejszenie wartosci glównych parametrów branych pod uwage w diagnozie postaci depresyjnych.Odnosnie punktu b), dotyczacego leczenia choroby Parkinsona i parkinsonizmu, stwierdzono, ze podawanie SAM w dawkach 4—16 mg dziennie, droga injekcji domiesniowych lub dozylnych lub doustnie, zaleznie od ciezkosci przypadku, lacznie ze zwyczajowa terapia Levodopa, daje statystycznie lepsza poprawe w bezruchu i sztywnosci, w porównaniu z obserwowana u pacjentów leczonych jedynie za pomoca Levodopa. Korzystne zmiany obserwuje sie równiez w stopniu drzenia parkinsonistycznego, jakich nie mozna osiagnac stosujac jedynie Levodopa.Wprowadzanie SAM ma wyrazny wplyw na zmniejszenie zaburzen psychicznych zaleznych od Levodopa, szczególnie w odniesieniu do stanów depresyjnych i objawów psychicznych typu podraznienia.Podawanie SAM w wyzej podanych dawkach w znacznym stopniu blokuje ciag ubocznych oddzialywan Levodopa na rózna narzady i funkcje, a zwlaszcza mdlosci, wymioty, brak apetytu, obnizenie cisnienia, astenie, nadpotllwosc, bezsennosc i migrene.Odnosnie punktu c), SAM, który, jak to wykazaly badana farmakologiczne, ma silne wlasciwosci przeciwzapalna i usmierzajace, wykazuje czynnosc we wszelkich postaciach artretyzmu, w dawkach 13 mg dwa razy dziennie przy injekcji domiesniowej lub dozylnej i 13—20 mg cztery razy dziennie przy wprowadzaniu doustnym.W porównaniu ze srodkiem obojetnym, SAM zmniejszal skurcze miesniowe, ograniczenia ruchliwosci, miejscowy ból i sztywnosc, w sposób statystycznie znaczacy, juz po 7 dniach podawania.W 90 obserwowanych przypadkach nie stwierdzono zgagi zoladkowej. Podawanie SAM nie powodowalo pojawiania sie krwi w odchodach.W porównaniu z nlesterokJowymi lekami przeciwzapalnymi, SAM wykazuje skutecznosc równa skutecznos¬ ci indometacyny.Czynnosc antalgiczna SAM badano w przypadkach róznych schorzen neurologicznych: neuritis, polyneuri- tis, anthralgia, sciatica, radiocolitis, torticollis. Efekt leczniczy byl widoczny juz pierwszego dnia podawania SAM w dawce 6 mg dwa razy dziennie w przypadku injekcji domiesniowej lub 13-20 mg 3-4 razy dziennie przy podawaniu doustnym. Analogiczne wyniki uzyskano u pacjentów z cephalalgia nawrotowa i oporna, przy wprowadzaniu leku doustnie w tabletkach.Odnosnie punktu d), tj. zaburzen rytmu snu i czuwania, a zwlaszcza bezsennosci, nowy produkt otrzymy¬ wany sposobem wedlug wynalazku w doustnej dawce 4—13 mg znacznie poprawia stosunek czasu snu do czasu czuwania, wywolujac fizjologiczny sen bez uzycia barbituranów lub innych substancji o dzialaniu depresyjnym na kore i mózg centralny.Z wyzej przedstawionych danych wynikaja liczne i nieoczekiwane perspektywy zastosowan nowego leku w medycynie. Juz obecnie wiadomo, ze moze on byc stosowany w schorzeniach watroby, hiperdyslipidemiach,94 268 9 ogólnej lub miejscowej miazdzycy tetnic, objawach psychiatrycznych typu depresyjnego i neurologicznego, artropatii degeneratywnej.Nowe sole SAM korzystnie podaje sie w drodze injekcji domiesniowej lub dozylnej lub doustnie, w postaci tabletek doustnych lub podjezykowych lub w kapsulkach.Sposród innych form farmaceutycznych mozna wymienic; plyny do zazywania doustnego, ciecze do wkraplan doocznych i krople do nosa, ciecze do rozpylania i aerozole, ciecze i mascie do zastosowan miejsco¬ wych, w których skladnik czynny jest rozcienczony dopuszczalnym w farmacji rozpuszczalnikiem („Tecnologia Farmaceutica", tom II, Silva no Casadio, wydanie drugie, wydawca Cisalpino—Goliardica, Mediolan 1972).W podsumowaniu mozna stwierdzic, ze lecznicze dawki SAM wynosza 2—125 mg dziennie, w zaleznosci od rodzaju i nasilenia schorzenia. Z uwagi na calkowity brak toksycznosci soli otrzymywanych sposobem wedlug wynalazku mozliwe jest stosowanie ich w wiekszych dawkach.Przyklad I. Do 90 kg drozdzy wzbogaconych w SAM (6,88 g/kg) wedlug Schlenka (Enzymologia 29, 283, 1965) dodaje sie, w temperaturze pokojowej, 11 litrów octanu etylu i 11 litrów wody. Po energicznym mieszaniu wciagu 30 minut dodaje sie 50 litrów, 0,35 n kwasu siarkowego i kontynuuje mieszanie wciagu dalszych 1,5 godzin. Po przesaczeniu i przemyciu woda otrzymuje sie 140 litrów roztworu o zawartosci 4,40 g SAM W litrza, co odpowiada 99,5% zawartosci tego zwiazku w materiale wyjsciowym. Do powyzszego roztworu dodaje sie, mieszajac, roztwór 2,3 kg kwasu pikrolonowego w 25 litrach ketonu metyloety Iowego. Po uplywie 16 godzin odwirowuje sie wytracony osad i przemywa go woda.Mieszajac, rozpuszcza sie powyzszy material w temperaturze pokojowej w 6,2 litrach 1 n roztworu kwasu metanosulfonowego w metanolu. Po odsaczeniu sladowych ilosci nierozpuszczalnego materialu do roztworu dodaje sie 50 litrów acetonu. Po opadnieciu osadu zdekantowuje sie roztwór, a sam osad przemywa mala objetoscia acetonu, Osad rozpuszcza sie w 25 litrach 0,25 n roztworu kwasu metanosulfonowego w metanolu, do roztworu dodaje wegla odbarwiajacego i calosc przesacza. Do przesaczu dodaje sie 125 litrów ketonu metyloizobutylo- wego.Wytraca sie 1089 g krystalicznej i latwej do saczenia soli, która rozpuszcza sie w wodzie z utworzeniem bezbarwnego roztworu o stezeniu powyzej 20%. W zwyklych rozpuszczalnikach organicznych sól jest jedynie nieznacznie rozpuszczalna. Chromatografia cienkowarstwowa wedlug Anal. Biochem. 4,16—28 (1971) wykazuje, ze produkt jest wolny od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tablicy V, odpowiadaja zwiazkowi 0 wzorze Ct fiH23N605S* 4 CH403S.Nowy zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, opartym na enzymatycznym metylo- waniu nikotynamidu i kwasu guanidynooctowego, zachodzacym przy udziale SAM (G. L. Cantoni, J. Biol.Chem. 189, 745, 1951 oraz G. De La Hoba, B. A. Jameison, S. H. Mudd i H. H. Richards, J. Am. Chem. Soc. 81, - 3975, 1959).Postepujac w wyzej opisany sposób, z tym, ze kwas metanosulfonowy zastepuje sie kwasem n-dodekano- sulfonowym lub kwasem n-oktadekanosulfonowym, otrzymuje sie odpowiednio zwiazki o wzorze Ci$H23N6OsS#4C14H3603S i Ct 5H23N605S#4C18H3g03S. Dane analityczne tych zwiazków przedstawiono w tablicy V» Przyklad II. Do 70 litrów roztworu powstalego w wyniku lizy komórek drozdzowych, przeprowa¬ dzonej sposobem opisanym w przykladzie I i przy uzyciu tego samego co w przykladzie I surowca, dodaje sie 1,15 kg kwasu pikrolonowego rozpuszczonego w 10 litrach alkoholu izobutylowego. Po uplywie 16 godzin odwirowuje sie wytracony osad, a nastepnie rozpuszcza go, mieszajac, w temperaturze pokojowej, w 3,1 litrach 1 n roztworu kwasu etanosulfo nowego w etanolu. Po odsaczeniu malej ilosci nierozpuszczalnego materialu, do roztworu dodaje sie 25 litrów eteru dwuetylowego. Po pewnym czasie mieszanine przesacza sie, a osad przemywa mala objetoscia eteru. Nastepnie osad rozpuszcza sie w 12,5 litrach 0,25 n roztworu kwasu eta nosulfo nowego w etanolu, dodaje wegla odbarwiajacego i calosc przesacza. Do przesaczu dodaje sie 63 litry benzenu.Wytraca sie 585 g soli, która odsacza sie i suszy. Zwiazek jest rozpuszczalny w wodzie do stezenia ponad %, nieznacznie rozpuszczalny w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych. Chromatografia cienkowarstwowa, przeprowadzona jak w przykladzie I, wykazuje, ze zwiazek jest wolny od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tablicy V, odpowiadaja zwiazkowi o wzorze Cx 5 H2 3 N605 S* 4C2 H6 03 S.Zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, podanym w przykladzie I.Postepujac w wyzej opisany sposób, z tym, ze kwas etanosulfonowy zastepuje sie kwasem 2-bromoetano- sulfonowym lub kwasem 2-chloroetanosulfonowym, otrzymuje sie odpowiednio zwiazku o wzorze Cx 5 H2 3 N605 • 4C2H5S03Br i C! 5H23N605S-4C2H5S03CI. Dane analityczne tych zwiazków przedstawiono w tablicy V.Przyklad III. Do 70 litrów roztworu powstalego w wyniku lizy komórek drozdzowych, przeprowa¬ dzonej sposobem opisanym w przykladzie I i przy uzyciu tego samego co w przykladzie I surowca, dodaje sie10 94 268 1,15 kg kwasu pikrolonowego rozpuszczonego w 12 litrach n-butanolu. Po uplywie 16 godzin odwirowuje sie wytracony osad, a nastepnie rozpuszcza go, mieszajac, w temperaturze pokojowej, w 3,1 litrach 1 n roztworu kwasu d,1-10-kamforosulfonowego w propano Iu-1. Nastepnie dodaje sie 25 litrów benzenu. Wytracony osad rozpuszcza sie w 0,25 n roztworze kwasu kamforosulfonowego w propanolu-1 (12,5 litrów), do roztworu dodaje wegla i przesacza calosc, a do przesaczu dodaje 63 litry acetonu.Otrzymuje sie 928 g soli. Zwiazek jest rozpuszczalny w wodzie do stezenia ponad 20%, nieznacznie rozpuszczalny w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych. Chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, ie zwiazek jest wolny od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tablicy V, odpowiadaja zwiazkowi o wzorze C15H23N6O5S*4C10Hi6O4S.Zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, podanym w przykladzie L Postepujac w wyzej opisany sposób, z tym, ze kwas d,1-10-kamforosulfonowy zastepuje sie kwasem d-3-bromo-10-kamforosulfonowym otrzymuje sie zwiazek o wzorze C15H23N605S'4CioHi504*£fer!'Dane analityczne tego zwiazku przedstawiono w tablicy V.Przyklad IV. Oczyszczanie enzymu.Zawiesine 50 g Sepharose (polisacharyd produkcji Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Szwecja) zadaje sie bromkiem cyjanu, znanym sposobem sporzadzagia polisacharydowego zelu obsadzonego grupami aminowymi.W nastepnym etapie obróbki dodaje sie do zefu nadmiaru L-lizyny. Po zakonczeniu reakcji zel przemywa sie kolejno destylowana woda, mieszanina buforowa o pH 6,6 I mieszanina buforowa o pH 4,5. Tak przygotowanym zelem zaladowuje sie kolumne o srednicy 1,5 cm i wysokosci 30 cm. Przez kolumne przepuszcza sie mieszanine buforowa 0,05 m trójetanoloaminy i 0,01 m H2S04 do calkowitego jej zrównowazenia. Na kolumne naklada sie 2 ml ekstraktu z drozdzy zawierajacego enzym i ewentualnie wzbogaconego w ten enzym, otrzymanego w drodze sonifikacji lub homogenizacji suchym lodem. Kolumne eluuje sie ta sama mieszanina buforowa, która równowazono ja. Rozklad bialek w wycieku bada sie pomiarami spektrofotometrycznymi w nadfiolecie.Równoczesnie oznacza sie aktywnosc syntetazy we frakcjach sposobem J. A. Stekola, Methods In EnzymoJogy, tom 6, strona 566 (1963). Frakcje wykazujace czynnosc *yntet*zowa laczy sie, otriymujao roztwór o aktywnosci wlasciwej co najmniej dwudziestokrotnie wyzszej od aktywnosci wlasciwej surowego ekstraktu. Enzym mozna dalej zatezyc przez wytracenie solami lub rozpuszczalnikami organicznymi lub Innymi znanymi sposobami zatezanla roztworów bialek.Otrzymywanie SAM. 30 ml zelu Sepharose aktywuje sie bromkiem cyjanu tub innym znanym sposobem aktywacji w ceki zwiazania z polisacharydowa matryca bialek. Do aktywowanego zefu dodaje sie 4 ml roztworu enzymu oczyszczonego w wyzej opisany sposób, w których zawarte jest okolo 100 mg bialka. Zawiesine aktywowanego zelu i roztwór enzymu miesza sie wciagu 18godzin w4°C. Zywice przemywa sle woda.Popluczyny zawieraja okolo 70% enzymatycznej aktywnosci zawartej poczatkowo w roztworze enzymu.Inkubacja spreparowanego w wyzej opisany sposób zelu Sepharose, wyzej opisanym sposobem oznaczania aktywnosci syntetazowej, wykazuje, ze z zelem zwiazane jest okolo 20% aktywnosci.Spreparowanym zelem napelnia sie kolumne o srednicy 1,5 om i wysokosci 20 cm. Przez kolumne przepuszcza sie z szybkoscia 5 ml na godzine, w temperaturze 25-27°C, roztwór 0,675 m trójetanoloaminy, 0,160 m siarczanu magnezu, 0,05 ATP, 0,05 m metioniny i 0,01 m KCI.Oznaczenie w wycieku z kolumny SAM wykazuje 30% wydajnosc konwersji.Otrzymywanie p-chiorobenzeno*ulfonianu SAM. 103 ml eluatu o stezeniu SAM 6 g w litrze zakwasza sie kwasem siarkowym do pH 3, a nastepnie mieszajac dodaje do niego roztwór 2-3 g kwasu pikrokmowego w 25, ml ketonu mety loety(owego. Po uplywie 16 godzin odsacza sie osad I przemywa go woda, po czym rozpuszcza w 6,2 ml 1 n roztworu kwasu p-chlorobenzenosulfonowego w 2-metoksyetanolu. Do roztworu dodaje sie 50 ml toluenu. Wytracony osad rozpuszcza sie w 12,5 ml 0,25 n roztworu kwasu p-chlorobenzenosurfonowego w 2-metoksyetanolu, do roztworu dodaje wegla i calosc przesacza, a do przesaczu dodaje 60 ml chloroformu.Otrzymuje sie 1,43 g soli. Zwiazek jest rozpuszczalny w wodzie do steisoi* pttwyzef 20% i jedynie nieznacznie rozpuszczalny w zwyklych rozpuszczalnikach OfganfcziTyttft. Chromatograf!* cfsnfcowarstwowa wykazuje, ze zwiazek wolny jest od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tabttey ¥, odpowiadaja zwiazkowi o wzorze C! 5 H23 N605S*3C«H5CI03S. - & Zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, podanym w przykladzto t.Postepujac w wyzej opisany sposób, z tym, ze kwas p-chforobenzenosulfonowy zastepuje sie kwasem p-acetylobenzenosulfonowym, c benzenodwusulfonowym, 4-dwufenylosulfonowym, 2-mezytylenosulfonowym lub 5-sulfosalicylowym otrzymuje sie odpowiednio zwiazki o wzorze Ci 5 H23N605S,r3C8H804S, %H23N605S-1rDX^ : 3GjtytQ4$. Dane analityczne tych zwiazków przedstawiono w tablicy V.94 268 11 Przyklad V. Osad otrzymany po dodaniu kwasu pikrolonowego do 70 litrów roztworu jak w przykla¬ dzie I rozpuszcza sie w temperaturze pokojowej, mieszajac, w 3,1 litrach 1 n roztworu kwasu 1,2-etanodwusulfo- nowego w metanolu. Do roztworu dodaje sie 25 litrów acetonu, a wytracony osad rozpuszcza w 12,5 litrach 0,25 n roztworu kwasu 1,2-etanodwusulfonowego w metanolu. Roztwór saczy sie z dodatkiem wegla, a do przesaczu dodaje 60 litrów ketonu metyloizobutylowego.Otrzymuje sie 546 g soli. Zwiazek jest rozpuszczalny w wodzie do stezenia powyzej 20% i jedynie nieznacznie rozpuszczalny w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych. Chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, ze zwiazek jest wolny od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tablicy V, odpowiadaja zwiazkowi o wzorze Cx s H2 3 N6 05 S' 2C2 H6 06 S2.Zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, podanym w przykladzie I.Przyklad VI. Osad otrzymany po dodaniu kwasu pikrolonowego do 70 litrów roztworu jak w przykladzie I rozpuszcza sie w temperaturze pokojowej, mieszajac, w3,l litrach 1 n roztworu kwasu 2-hydro- ksyetanosulfonowego w etanolu. Do roztworu dodaje sie 25 litrów ketonu metyloizobutylowego, a wytracony osad rozpuszcza w 12,5 litrach 0,25 n roztworu kwasu 2-hydroksyetanosulfonowego w etanolu, do roztworu dodaje wegla i przesacza go. Do przesaczu dodaje sie 80 litrów czterowodorofuranu.Otrzymuje sie 632 g. soli. Zwiazek jest rozpuszczalny w wodzie do stezenia powyzej 20% i jedynie nieznacznie rozpuszczalny w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych. Chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, ze zwiazek jest wolny od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tablicy V, odpowiadaja zwiazkowio wzorze Ci 5H23N605S#4C2H$04S.Zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, podanym w przykladzie I.Postepujac w wyzej opisany sposób, z tym, ze kwas 2-hydroksyetanosulfonowy zastepuje sie kwasem 3-propanosulfonowym, otrzymuje sie zwiazek o wzorze Cls H23 N<0SS,4C3H804S. Dane analityczne tego zwiazku przedstawiono w tab I icy V.Przyklad VII. Osad otrzymany po dodaniu kwasu pikrolonowego do 70 litrów roztworu jak w przykladzie I rozpuszcza sie w temperaturze pokojowej, mieszajac, w 3,1 litrach 1 n roztworu kwasu 1 -naftale- nosuffonowego w metanolu. Do roztworu dodaje sie 25 litrów ketonu metyioetylowego, a wytracony osad rozpuszcza w 12,5 litrach 0,25 n roztworu kwasu 1-naftalenosulfonowego w metanolu, do roztworu dodaje wegla I przesacza go. Do przesaczu dodaje sie 70 litrów ketonu mety Ioety Iowego.Otrzymuje sie 717 g. soli. Zwiazek jest rozpuszczalny w wodzie do stezenia powyzej 20% i jedynie nieznacznie rozpuszczalny w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych. Chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, ze zwiazek jest wolny od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tablicy V, odpowiadaja zwiazkowi© wzorze Ci 5 H2 3 N605S*3Ci o H803S.Zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, podanym w przykladzie I.Przyklad VIII. Osad otrzymany po dodaniu kwasu pikrolonowego do 70 litrów roztworu jak w przykladzie I rozpuszcza sie w temperaturze pokojowej, mieszajac, w 3,1 litrach 1 n roztworu kwasu 2-naftale- noturfonowego w propanolu-2. Do roztworu dodaje sie 25 litrów eteru dwuizopropylowego, a wytracony osad rozpuszcza w 12,5 litrach 0r25 n roztworu kwasu 2-naftalenosulfonowego w metanolu, do roztworu dodaje wegla i przesacza go. Do przesaczu dodaje sie 70 litrów octanu etylu.Otrzymuje sie 71 Og soli. Zwiazek jest rozpuszczalny w wodzie do stezenia powyzej 20% i jedynie nieznacznie rozpuszczalny w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych. Chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, ze zwiazek jest wolny od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tablicy V, odpowiadaja zwiazkowi o wzorze C! s H2 3 N6OsS-3C! o H803S.Zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, podanym w przykladzie I.Przyklad IX. Osad otrzymany po dodaniu kwasu pikrolonowego do 70 litrów roztworu jak w przykladzie I rozpuszcza sie w temperaturze pokojowej mieszajac, w 3,1 litrach 1 n roztworu kwasu benzeno- sulfonowego wbutanolu-2. Do roztworu dodaje sie 25 litrów eteru dwuizopropylowego, a wytracony osad rozpuszcza w 12,5 litrach 0,25 n roztworu kwasu benzenosulfonowego w metanolu, do roztworu dodaje wegla i przesacza go. Do przesaczu dodaje sie 65 litrów octanu etylu.Otrzymuje sie 612 g soli. Zwiazek jest rozpuszczalny w wodzie do stezenia powyzej 20% i jedynie nieznacznie rozpuszczalny w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych. Chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, ze zwiazek jest wolny od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tablicy V, odpowiadaja zwiazkowi o wzorze Cx 5H23N605S*3C6H603S.Zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, podanym w przykladzie I.Przyklad X. Osad otrzymany po dodaniu kwasu pikrolonowego do 103 ml roztworu jak w przykla¬ dzie IV rozpuszcza sie w temperaturze pokojowej, mieszajac, w 6,2 ml 1 n roztworu kwasu chondroitinosiarko- wego w metanolu. Do roztworu dodaje sie 50 ml acetonu, a wytracony osad rozpuszcza w 25 ml 0,25 n roztworu12 94 268 kwasu chondroitinosiarkowego w metanolu, do roztworu dodaje wegla i przesacza go. Do przesaczu dodaje sie 125 ml ketonu metyloizobutylowego.Otrzymuje sie 3,27 g soli. Zwiazek jest rozpuszczalny w wodzie do stezenia powyzej 20% i jedynie nieznacznie rozpuszczalny w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych. Chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, ze zwiazek jest wolny od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tablicy V, odpowiadaja zwiazkowi o wzorze Ct 5H23N605S»4C14H2i NOi4S<' Zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, podanym w przykladzie I.Przyklad XI. Osad otrzymany po dodaniu kwasu pikrolonowego do 103 ml roztworu jak w przykla¬ dzie IV rozpuszcza sie w temperaturze pokojowej, mieszajac, w 6,2 ml In roztworu kwasu cysteinowego w 2-etoksyetanolu. Do roztworu dodaje sie 50 ml octanu metylu, a wytracony osad rozpuszcza w 25 ml 0,25 n roztworu kwasu cysteinowego w 2-etoksyetanolu, do roztworu dodaje wegla i przesacza go. Do przesaczu dodaje sie 125 ml octanu metylu.Otrzymuje sie 1,53 g soli. Zwiazek jest rozpuszczalny w wodzie do stezenia powyzej 20% i jedynie nieznacznie rozpuszczalny w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych. Chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, ze zwiazek jest wolny od zanieczyszczen. Dane analityczne, przedstawione w tablicy V, odpowiadaja zwiazkowi o wzorze Ci 5 H2 3 N6 05S" 4C3 H7 N05 S.Zwiazek zidentyfikowano równiez sposobem enzymatycznym, podanym w przykladzie I.Przyklad XI I. Wytwarzanie podwójnej soli SAM z kwasem siarkowym i metanosulfonowym. 103 ml eluatu o zawartosci SAM 6g w litrze, otrzymanego jak w przykladzie IV, zakwasza sie H2S04 do pH 3 i mieszajac dodaje do niego 2,3 g kwasu pikrolonowego, rozpuszczonego w 25 ml ketonu metyloetylowego (rozpuszczalnika).Po uplywie 18 godzin osad odsacza sie i przemywa woda, a nastepnie rozpuszcza sie w 18 ml 0,1 n roztworu H2S04iO,1n CH3S03H I 18ml ketonu metyloetylowego (rozpuszczalnika). Calosc miesza sie, a nastepnie pozostawia do opadniecia osadu, po czym oddziela sie warstwe organiczna, a warstwe wodna wytrzasa z mala objetoscia ketonu metyloetylowego, w celu usuniecia sladów kwasu pikrolonowego. Po oddzieleniu warstwy wodnej dodaje sie wegla odbarwiajacego i calosc przesacza. Otrzymuje sie 16,5 ml bezbarwnego wodnego roztworu zawierajacego 33,8 g SAM, czyli 90% SAM zawartego w roztworze wyjsciowym.Analiza metoda chromatografii cienkowarstwowej wykazuje, ze roztwór zawiera jedynie SAM. 16,5 ml roztworu wylewa sie do 100 ml acetonu (rozpuszczalnik b). Calosc miesza sie, a nastepnie odstawia do opadniecia osadu. Ciecz zdekantowuje sie, a osad rozpuszcza w6,6g 15% roztworu kwasu meta nosulfonowego w metanolu (rozpuszczalnik c)< Po dodaniu wegla odbarwiajacego i przesaczeniu, roztwór wylewa sie do 25 ml eteru etylowego (rozpusz¬ czalnik d). Po pewnym czasie odsacza sie krystaliczna sól o skladzie SAM+-HS04#H2S04"2CH3S03H (1,2 g).Analityczna charakterystyke soli przedstawiono w tablicy VI.W identyczny sposób, stosujac kwasy sulfonowe i rozpuszczalniki podane w tablicy VI, otrzymuje sie podwójne sole o analitycznej charakterystyce przedstawionej w tejze tablicy.Stosujac jedynie 3,3 g 16% roztworu kwasu metanosulfonowego w metanolu i wytracajac w nastepnym etapie osad za pomoca 25 ml eteru etylowego (rozpuszczalnik d), otrzymuje sie 1,05 g soli o skladzie SAM*-HS04"*H2SQ4*CH3S03H, Analityczna charakterystyke tej soli przedstawiono w tablicy VII.W identyczny sposób, stosujac kwasy sulfonowe i rozpuszczalniki podane w tablicy VI I, otrzymuje sie podwójne sole o analitycznej charakterystyce przedstawionej w tejze tablicy.Przy k Lad Xlii. Wytwarzanie podwójnej soli SAM z kwasem siarkowym i 2-hydroksyetanosulfdno- wym.Sól otrzymana w pieryvszym wytraceniu SAM kwasem 2-hydroksyetanosulfonowym jak w przykladzie VI rozpuszcza sie w 20 litrach 0,1 n kwasu siarkowego i 0,1 n kwasu 2-hydroksyetanosulfonowego w metanolu (rozpuszczalnika). Po dodaniu wegla odbarwiajacego roztwór przesacza sie, a do przesaczu dodaje 100 litrów ketonu metyloizobutylowego (rozpuszczalnik b). Po pewnym czasie odsacza sie wytracony osad, otrzymujac 587 g soli o skladzie SAM** HS04*H2S04*2C2HÓ04S. Analityczna charakterystyke tej soli przedstawiono w tablicy VIII.W identyczny sposób, lecz stosujac 10 litrów metanolowego (rozpuszczalnika) 0,1 n kwasu siarkowego i 0,1 n kwasu 2-hydroksyetanosulfonowego i przeprowadzajac nastepne wytracanie za pomoca ketonu metyloizo¬ butylowego (rozpuszczalnik b) otrzymuje sie sól o skladzie SAM+*HS04*H2S04'C2H604S (505 g). Analityczna charakterystyke tej soli przedstawiono w tablicy IX.Równiez w identyczny sposób, lecz stosujac 3,3 g 15% roztworu kwasu p-toluenosulfonowego w metanolu i przeprowadzajac nastepne wytracanie za pomoca 25 ml eteru etylowego otrzymuje sie 1,18 g soli o skladzie SAM**HS04*H2S04-2CH3C6H4S03H,otakiej samej charakterystyce, jaka ma produkt z przykladu I.94 268 13 <¦ * <¦ CO CO CO CO CO C/l t- r t» \o »© no dodood « * <* « o • z z z z z z C4 * *4 m e» * rt ro c< X X X X X X r* «q irt w -h io O O iS C? c5* O (0 c c .2 $ c c ^ o 5 S S S Sr 5* ó 2 2 O TB 5 £ £ r) cn ob -ó ^ c .2 E Ifo nso c aft CI ^- c .2 'c ilfo 3 o c enze _Q C O ^ to 3 ¦o O c (U N c (U .a ó94 260 17 X — ~ X \Cf ^ 03 **- £ |E "tu 8 U ^ a N o cc N X CU u _ -O (U ? 1 .2 'E S fc I o er £ 03 CD LO 8- 0 28 1 if o J3 c § a S! — — J2 • J2 — o 8 8£ 2 8 £ tu a o a tu ±* a E a E E cN cN cN E ~ c E -O O N • eton etanol tu c . i loety keton mety izobutanol obutanol N etanol _7 eton opano etanol etanol anol tu S. E £ 03 o o " £• £ 5 £• 2 o 5 2 _Q — — _Q loizoi loety loety loizo keton mety keton mety keton mety keton mety n-butanol etanol E izobutanol t» eton iton m eton y w O tu -^ tu i .•H _Q loizoi ta nol keton mety metanol 2-metoksye c (U L. e = 1 f i o o o -O O § i |.§ I §S c 03 L» k. O L. W j-i £ £! _c .p tu u u 13 ii) ^ ^ _ 8 8 € «u 0^7: &§ g O w tu .W CN E I I f i i.f cp a .Q cu tu c E CN C CU CD CN CD O v mi/)t/istnin*-^^-^-vmi/C/} «n v ^ ^ ^ ^ ^- WWWWWWWWWWWWW <*C/)t/)C/)C/DC/) Noododdooodo°*ddddddd ZZZZZZZZZZZ cZZZZZZZ o o X X o o V© 10 f*« * «n c< «*» en n C .2 'E c o 3 £ XXXXXXXXXXXXXXXXXXX ^^•cstncl^HMn^^c<«o^t*-NMc»r<^ 0000000000000000000 c tu c 'E tu O II C "» O .2 2 *£ .2 r- E t r- c tu oni H- 3 Ul O C tu ¦l-J 8 E O zan 0 JB{ t/l O c O Li "O c 0 .2 'c ifc .2 D C o ° 8 1 S 3 c o 2 .o c O CD L- 4- O 3 &3 c fonia dodekanosul c tu c 0 usulf ( 2-etanodw ,—* fonian VI izeno acetylober CL lan su Ifosalicy LO UBIUO s- D ta nos hydro ksye CN c tu a nosulfoni « c c «J .2 1 i - i 8 8 c-S g .2 ® O £ o o O t^- CN 3 fc o g 2- ó ro 2 O tu » 1 C £ 00 CN &) "Ó c 2 c c c .2 'c o ±= o .2 53 ifc c d D O £ ni I § s iS £ n 1u n <5 5l«94 268 O O O cn • E X Z—D i cvi X O I CN X co O O ! I CN X u I X o I X o I X o I z—o —o Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120+18 Cena 10 zl PLThe present invention relates to a process for the preparation of novel S-adenosyl-L-methionine sulfonates and mixed salts of S-adenosyl-L-methionine with organic sulfonic acids and sulfuric acid. More particularly, the invention relates to a novel, highly stable S-adenosyl-L-methionine (SAM) salt, an economical method of producing these salts on an industrial scale. The new compounds are used as an active ingredient in pharmaceutical preparations. SAM is a product of natural origin, found in living organisms from bacteria to plants, from unicellular organisms to higher mammals, including humans. The structure of this compound is described by the formula in which X ~ stands for anion. In living organisms, SAM is formed in the cytoplasm as a result of an enzymatic process involving S-adenosylmethlonynosynthetase or S-adenosyltransferase, from methionine and nutrients or ATP, which is an energy reserve in each In a living cell ,.SAM plays an essential role in many biological enzymatic transmethylation reactions. Due to this property it is an important biochemical reagent. However, SAM is unstable at room temperature, and its production is labor-intensive and difficult to perform on an industrial scale. In recent years, work on stabilizing SAM to the extent that it could be used in biological research has focused on the production of salts stable under normal temperature and humidity conditions. Chloride and sulphate SAM were obtained, but these salts can only be used as biochemical reagents and only for a short time after production, because in the dry state their stability at low temperature is limited. The methods for the preparation of these salts are suitable for small-scale use but cannot be used on an industrial scale.2 94 268 Surprisingly, new SAM salts have been found with unlimited stability over time, up to 45 ° C. These salts are economical and large-scale. Productivity to produce on an industrial scale. These salts have unexpectedly shown a strong therapeutic effect in many areas of human medicine, often without visible correlation. The new salts prepared according to the invention are SAM double salts with sulfonic acids corresponding to the formula SAM * 4RS03 H, in which RS03H stands for one of the following acids: methanesul- Phonic CH3SO3H, ethanesulfonic C2H5SO3H, n * dodecanesulfonic C12H25SO3H, 1-octadecanesulfonic C18H37SO3H, 2-chJoroethanesulfonic CIC2H4S03H, 2-notulfonic HOC2 H4SO3 H, 3-hydroxypropanesulfonic HOC2 H4SO3 H, 3-hydroxypropanesulfonic HOCO3-HS3-HOCP3-DOS3-dhOCPOS17! Id, 1-3-bfomocamphoro-10-sulfonic C10H16Br0SO3H and cistern C3H6NSO3H. The invention also relates to a method for the preparation of salts of the general formula SAM-3RS03H, in which RSO3H is one of the following acids: benzenesulfonic C4H5SO3H, p-chlorobenzenesulfonic CIC * 2-H4Sulfonic acid CIC * mesitylbenzene sulphonic (CH3) 3C # H2SOaH, 4-diphenylsulphonic C12H10SO3H, 1-naphthalene sulphonic C10H7SO3H, 2-naphthalenesulphonic C1 () H7S03H, 5-sulphos alicylic C7Hs03SO3H, p-acetylbenrene diphonic acid C, H7OS03H, SAM salt with 1,2-ethane disulfonic acid of formula SAM * 2C2 H4 (SO3H) 2, SAM salt and o-benzenedisulfonic acid of formula SAM * 1r5C4H4 (SO3H) 2 and SAM salt with chondrotinnic acid of formula SAMl4CMH21 N014S. "The invention also relates to a method for preparing SAM double salts with sulfuric acid and one of the above-mentioned sulfonic acids of formula SAtf-HSOJ • H1804'RS03H or SAM + 'HS04 * H2S04-2RS03H in which the formulas RSO3H is one of the above-mentioned sulphonic acids or the equivalent of ethane disulphonic acid, o-benzenedisulphonic acid, or chondrolithine sulphide. A high technical achievement is the dry stability of the above new salts at 45 ° C. In all the salts prepared by the method of the invention, under the above conditions, the SAM content does not change over 360 days. In the two most stable SAM salts known to date, chloride and sulphate, after 30 days of holding at 45 ° C in a dry state, the SAM content is 20 and 50%, respectively. After 60 days, the SAM chloride is completely decomposed and only 5% of the initial amount remains in the sulphate. The method of the invention essentially comprises the following steps: a) preparation of a high SAM solution, b) disintegration of SAM from the permeated aqueous solution with a saturated aqueous solution or with a solution of this acid in a water-miscible organic solvent, e.g. methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl or isobutyl alcohol, acetone or methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone, ethyl acetate, tetrahydrofuran, 2- methoxyethanol, 2-ethyloxyethanol, dioxane or dimethylformamide, c) dissolving the desaturated SAM in a solution of one of the above-mentioned acids in alcohol, such as methanol, ethanol, propanol-1, propanol-, butane 1-1, butanol-, 11c, butanol , 2-methoxyethanol or 2-ethoxyethanol; d) adding an organic solvent that is miscible with the alcohol used, such as benzene, toluene, diethyl ether, diisopropyl ether, acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone, ethyl or methyl acetate, tetrahydrofuran or chloroform, e) separation of the organic liquid and dissolving the precipitate in the acid solution used in step c) in One of the alcohols used in step c) and treating the solution with decolorizing carbon, f) adding an organic solvent to the solution capable of recovering pure SAM salt in the form of well-formed and easy-to-drain crystals, selected The first two steps in the preparation of sulfuric acid double salts are identical, but the following can be done as follows: c ') dissolve the drained sediment in a mixture of equal parts by volume of a solvent partially miscible with water, such as methyl ethyl ketone. methyl isobutyl ketone, n-butanol or isobutanol and aqueous ro a solution of equivalent amounts of one of the above-mentioned sulfonic acids and sulfuric acid, d ') separate the organic layer, and add a ketone or alcohol completely soluble in water to the aqueous solution, e') dissolve the precipitate in 10-20% acid solution used in the step c ') in one of the alcohols from step c') and add decolorizing coal to the solution, f) add an organic solvent capable of precipitating pure SAM salt in the form of well-formed and easy-to-drain crystals. In addition, the double salt is obtained from a single salt obtained in step d) as a result of: c ") dissolving the precipitate in an aqueous solution of equivalent amounts of sulfuric acid and acid used in operation c), and then treating the solution with decolorizing carbon, f") adding an organic solvent capable of recovering pure SAM salt in the form of a well-formed and easy to drain crystals. The preparation of the concentrated SAM solution can be carried out by various equally effective methods. According to one of them, yeasts (Saecharomyces cerevisiae, Torulopais utilis, Candida utilis, etc.) enriched with SAM by the addition of methionine under appropriate conditions (Schlenk, Enzymologia 29, 283/1965 /) are treated with ethyl acetate, and then 0.1-0.5 , preferably 0.35 N sulfuric acid, at room temperature, to induce cell lysis and a solution of practically 100% of the SAM present. The preferred amount of water and ethyl acetate is 0.05-0.20 by weight of moist cells and the treatment is preferably carried out for 15-45, especially 30 minutes. Sulfuric acid is then added and the lysis is carried out for 1-2, preferably 1.5 hours. It should be emphasized that yeast cell lysis carried out with a mixture of an organic solvent and dilute sulfuric acid is much more advantageous than usually carried out with perchloric acid at room temperature or formic or acetic acid at 60 ° C and similar operations, because it is not only carried out at room temperature, which is beneficial for the stability of SAM, but also under conditions ensuring easy drainage of the solution and cell debris. The solution does not contain impurities, usually present with other cell decomposing factors, and difficult to remove in known methods of producing pure SAM. Alternatively, step a) is carried out by producing SAM by enzymatic synthesis by the action of ATP-methionine adenosyltransferase (EC 2.4. 2.12) on the incubation mixture containing adenosyl triphosphate (ATP) and methionine. A prerequisite for carrying out this stage on an industrial scale is the purity of the enzyme and that it is in a form that can be easily isolated both from the initial incubation mixture and from the mixture containing the SAM produced. Purification of ATP-methionine-adenosyltransferase is preferably carried out by affinity chromatography and column reaction. Affinity chromatography involves passing an enzyme-containing solution, e.g., a crude extract of yeast or Escherichia coli, through a column packed with a carrier with a covalently bonded group acting as a competing enzyme inhibitor. It has surprisingly been found that an activated polysaccharide gel with covalently linked L-lysine is an excellent purifier column filler. The affinity of the enzyme to L-lysine, related to the solid matrix, delays its elution and allows it to be separated in a very pure form from other proteins. Isolation of the enzyme from the eluate for use in the next step of enzymatic synthesis does not give satisfactory results, because after isolation the enzyme it is unstable and, moreover, once used for the synthesis of SAM, it is destroyed during its isolation. Excellent results have been obtained by absorbing the enzyme from the eluate on a suitable solid support and by carrying out the reactions between methionine and ATP, leading to the production of SAM, in the column. A suitable carrier is a polysaccharide activated by a protein-to-solid carrier binding reagent, e.g. cyanogen bromide. A SAM-bearing effluent is obtained by passing a buffered solution of ATP and methionine through the column. In step b) a high degree of purity of SAM is obtained. As shown by thin layer chromatography according to Anal. Biochem. 4, 16-28 (1971), in an acidic environment the only compound precipitated by picrolonic acid is SAM. The action of picrolonic acid is extremely selective. Other settling agents that have been used so far, such as picric acid, Reinecke's salt or boric acid, give products that require further purification by ion exchange column chromatography, which is an expensive and difficult process to implement on an industrial scale. It is also difficult to obtain a product with the required degree of purity in this way. The use of aqueous solutions of picrylonic acid or solutions of this acid in the above-mentioned organic solvents is not a problem, and the operations are carried out at room temperature. Step c) is preferably carried out with solutions of the abovementioned sulfonic acids in one of the abovementioned alcohols at a concentration of 0.25-1.5, preferably 1N. The decomposition of the SAM complex with picrolonic acid is complete, as indicated by complete dissolution of the precipitate. preferably carried out using 4-10 volumes (based on the volume of the alcoholic solution) of a solvent selected from the group consisting of benzene, toluene, diethyl ether, diisopropyl ether, acetone, methyl isobutyl ketone, methyl acetate, ethyl acetate or tetrahydrofuran. Step e) and f) represent the final steps in the production of a desired SAM salt. In step e), the product from step d) is dissolved in 0.1-0.5, preferably 0.2 N, acid solution used in step c) in a solvent selected from alcohols with 1 to 4 carbon atoms, 2-methoxyethanol and 2-methoxyethanol. ethoxyethanol. The next step f) is preferably carried out using 4-8 volumes (based on the volume of the alcoholic solution) of the organic solvent selected from the group consisting of benzene, toluene, diethyl ether, diisopropyl ether, acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone , methyl acetate, ethyl acetate, tetrahydrofuran and chloroform. The simple SAM salts obtained according to the invention, stored in a dry state, practically do not undergo any changes. The method according to the invention excludes the presence of water in all operations after precipitation with picrolonic acid, and thus excludes the complete absence of even trace water-soluble impurities. SAM double salts with sulfuric acid and one of the sulfonic acids, selected from among those mentioned in the first variant, are preferably prepared by using aqueous solutions of equivalent amounts of one of the sulfonic acids mentioned above and sulfuric acid, both at a concentration of 0.05-0.2, preferably 0.1 N and an organic solvent partially miscible with water such as methyl ethyl ketone or n-butanol. The use of an organic solvent makes it possible to significantly reduce the volume of the aqueous acid solution and virtually completely remove the picrolenic acid. Step d ') is preferably carried out using 4-8 volumes (based on the volume of the aqueous solution) of a solvent selected from the group consisting of acetone, methyl alcohol, ethyl alcohol and propyl alcohol. It has also surprisingly been found that if in step e') a minimum is used the amount of alcohol to dissolve the precipitate from step d '), then the SAM + double salt, HS04 "' H2 - S04-2RS03H, is precipitated in the next precipitation step V). If, on the other hand, in step e '), an amount equal to at least twice the volume is used minimum, then in the next precipitation step f) the double salt of SAM + * HS04 "H2SO4 ^ 2RS03H is precipitated. Using intermediate amounts of alcohol leads to the formation of a mixture of both salts. RS03H means one of the above-mentioned sulfonic acids or an acid equivalent, in the case of ethane disulfonic acid or chondroitinsulfonic acid Final recovery of the new salt according to the invention (step f) requires the use of an organic solvent selected from the group consisting of benzene, toluene, diethyl ether, diisopropyl ether, chloroform, acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone, methyl acetate, ethyl acetate, isoamyl alcohol or tetrahydrofuran. As stated, the SAM double salts obtained according to the invention can be stored in the dry state indefinitely long, practically not changing. The preparation of SAM double salts with sulfuric acid and one of the above-mentioned sulfonic acids according to the second variant consists in dissolving (step e ") (the salt obtained in step d) in a solution of equivalent amounts of sulfuric acid and the acid used in in step c), both at a concentration of 0.05-0.2, preferably 0.1 n, in alcohol with 1 to 4 carbon atoms, 2-methoxyethanol or 2-ethoxyethanol. It was also surprisingly found that in step e ') the minimum amount of alcohol to dissolve the precipitate from step d), the double salt of the formula SAM * 'HS04IH3SO4 * 2R803H in which RSO3H is sulfonic acid or in the case of ethane disulfonic acid or chondroitin sulfuric acid, the equivalent of this acid. However, if in step e ") an amount of methanol equal to at least twice the minimum volume is used, then in the next step f") the double salt SAM * • HSO4'H2SO4 * is eliminated RS03H. The use of alcohol in an intermediate amount results in a mixture of the two salts. Final recovery of the double salt (step f ") requires the use of an organic solvent selected from the group consisting of benzene, toluene, diethyl ether, diisopropyl ether, chloroform, 4 or carbon alcohols, methyl acetate, Ethyl acetate, tetrahydrofuran, acetone, methyl ethyl ketone and methyl isobutyl ketone. Recent biochemical studies have shown that SAM is the only specific donor of methyl radicals in living organisms in biochemical reactions of transferring these radicals. These reactions are the basic reactions in the transformation of fats, proteins and For example, the SAM-dependent transmethylation produces the following compounds: a) IM-transmethylation: adenine, carnitine, carnosine, creatine, 2,6-diaminopurine, adrenaline, guanine, hordenine, N'-nicotinamide, phosphatodllkoline and ricinine b) by O-transmethylation: N-acetylserotanine, dopamine, epinin, d-adrenaline, 1-adrenaline tench, ergo-rterol, 1-noradrenaline, pectin, ubiquinone; c) by S-transmethylation: 2,3-dimercaptopropanol, H 2 S, methionine, methyl mercaptan, S-mercaptopropionic acid, thiopyrimidine and thiouracil; d) by C-transmethylation: cytosine and thymine. This means, especially with regard to the human organism, that SAM is active in the following processes: in choline biosynthesis, in locolin phosphatide biosynthesis, in the activity of enzymes requiring 94 268 5 SH groups, in metabolism catecholamines, biogenic centroencephalic amines, serotonin, histamine, vitamin B12 and folic acid, creatinine, myosin, histones, RNA, DNA, protein substances, some hormones with the cyclopentanoperhydrophenanthrene core, of which estrogens are the most important, as well as in the metabolism of triglycerides. It is also known that SAM demethylated with transmethylating enzymes is transformed into S-adenosylhomocysteine (SAO), which is a direct donor of bisulfide groups and is critical in the metabolism of all compounds whose biological activity requires SH groups. Among these, certain thioenzymes and amino acids containing a sulfur atom in the molecule are particularly important. SAO undergoes decarboxylation in the body, and the decarboxylated product is the main donor of the aminopropyl group, indispensable, according to the latest biochemical knowledge, in the biosynthesis of polyamines. The tenacious process is catalysed by various enzymes including various enzymes. Specific aminopropyltransferase. In summary, it can be concluded that SAM is closely associated in the human body with all biochemical reactions of trensmethylation (specific CH3 donation), transsulfuration (specific SH group donation) and transaminopropylation (specific aminopropyl donation). The sum of the above knowledge leads to the idea that SAM may have a curative activity in pathological conditions associated with deficiency or other types of restriction in the availability of some of the above-mentioned products in the body. The persistence of SAM and the lack of a way to make this compound stable under normal environmental conditions for a long enough time resulted in that no pharmacological and clinical studies were carried out with it and that it was introduced into medicine. After the new SAM salts were obtained, according to the invention, which showed practically unlimited stability at room temperature, it became possible to carry out systematic pharmacological and clinical tests. As a result, the therapeutic properties of the new salts were found to be of surprising quality and intensity. Among the vast amount of pharmacological and clinical data collected on the new product, below are some that illustrate the essential properties and main uses in human treatment. For the sake of simplicity, all new salts obtainable by the process of the invention are collectively referred to as "SAM salt" since the uses of these compounds are absolutely identical. Pharmacological and clinical data are based on the SAM salt content. Toxicity. SAM salts obtainable by the method of the invention. they show no acute and chronic toxicity as well as local intolerance and secondary effects. LD50 in mice is over 2.5 g / kg for oral injection and over 1.00 g / kg for intraperitoneal injection. Tolerance and chronic toxicity tests were performed on In 12 months, Wistar and Sprague-Dowley rats were given 4-8 mg of the product per day. After the end of the trial, no pathological changes were found in the examined organs. The teratogenicity tests were carried out in rabbits and rats. It was found that the introduction of SAM in doses of approximately ten times doses exceeding the highest therapeutic doses do not induce teratogenic activity, and both e The addition of the product to cultures of human lymphocytes and liver cells of mice, in doses up to 0.06-0.10 mg / ml, does not change the factor of cellular disintegration. Intravenous introduction in doses up to 16 mg / ml, does not show any deformities. kg does not cause pyrogenicity in rabbit. The same dose administered intravenously does not cause changes in pressure in the carotid artery in rabbits and cats, as well as changes in the frequency of respiration and pulse and electrocardiographic record. Local tolerance with intravenous injections, with repeated injections within 180 days, as well as with introduction to the extreme ear veins of the rabbit, is excellent. In humans, young, healthy volunteers of both sexes, weighing 70 kg on average, who were administered SAM in doses of 5-150 mg, by rapid injection or intravenous infusion, no changes in the minimum and maximum blood pressure and frequency of pulse and respiration were observed in 1 , 5, 15, 20, 30 and 60 minutes and 2, 3, 6, 8, 10, 12 and 24 hours after the end of the procedure. The electrocardiogram showed no changes in the PQ interval, ST section, as well as signs of premature contraction or other changes at 30 seconds and 1, 2, 3, 5, 10, and 20 minutes after compound introduction. No statistically significant deviations from the norm were found in the hematopoietic apparatus and in the work of the liver and kidneys. Pharmacology. The results obtained with the introduction of simple or double SAM salts were converted, as previously mentioned, to their SAM content. To investigate the distribution of SAM in the tissues, S-adenosylmethionine was prepared with C14 in the methyl radical. The distribution of the above product in the tissues of rats was investigated by introducing intravenous doses of 4 in the animal. 2 mg / kg, corresponding to about 10 the radioactive product. The specific activity of the product was 58 mCi / millimol. In parallel, autoradiographic studies were performed on mice. The results of both studies show a very rapid transition of SAM to all tissues. The table below shows some data on the distribution of SAM in rat tissues. Table 1c. SAM concentration in rat tissues jug / g Tissue Liver Adrenal glands Spleen Pituitary Supporting cortex Cortex, '1, 7 1.9 1.3 2.3 0.3 0.25 7.5 1 h 3.0 3.4 1.2 2.5 0.65 0.45 2.1 4h. 5 4.8 3.5 8 , 0 1.0 0.75 2.3 8h, 6 4.5 2.6 4.5 1.3 8.5 2.0 24 h, 7 4.4 2.8 4.2 1.3 9.4 1.1 From the obtained The data show that the new salts produced by the method of the invention transmit the CH8 group to all tissues having methyltransferase activity. In other words, these products have the ability to selectively locate themselves in all organs equipped with methyltransferase systems. The above conclusion was confirmed by further pharmacological studies. In a series of trials on rats, the new compounds have been shown to have a significant protective and dissolving effect on the hepatic fatness induced by a diet with excess fat and protein, according to Handler, as well as on hepatic fatness caused by acute alcohol intoxication and other toxic factors such as carbon tetrachloride, bromobenzene, etc. , with intraperitoneal injection at a dose of only 6 mg / kg. Both from a morphohistochemical and analytical point of view, SAM significantly reduces the accumulation of fat in the liver in disease cases and accelerates the recovery of fat to a normal level after the reduction in poisoning with CCl 4. The table below shows the level of phospholipids in the rat liver after intoxication with CCI4 and administration of SAM, Tab I and ca II Level of phospholipids in the liver of the rat after intoxication with CCI4 and administration of SAM Treatment Total phospholipid content (mg / g) Physiological solution 30.57 ± 1.18 CCU 18.87 ± 1.06 CCI4 + SAM 16 mg / kg intraperitoneal 27.20 ± 1.25 CCI4 + SAM 150 mg / kg intraperitoneally 20.87 ± 0.42 CCL4 + Ad + Met 15 mg / kg intraperitoneal 19.9 ± 0.92 I II UI I ¦ ¦ ¦ II II ¦I \ ', and II III The values given in the table are the means of ten for each group. In studies of liver protection activity, the so-called cholesterol degeneration of the liver (Ridout et al., Blochem. J, 52, 99, 1952). This method, by means of a special diet, causes a significant increase in the amount of fat and cholesterol in the liver. Compounds active in the metabolism of fat reduce or suppress this growth. The animals were divided into 6 groups. The first group was given a freely changed diet. The second group was given the Ridout basic diet (20 g per rat per day) and the other groups were given the same cholesterol-fortified diet of 0.2 g per rat per day. The diet was administered over the course of three weeks. The animals in groups 4, 5 and 6 were administered SAM in doses of 0.4, 0.8 and 2 mg / kg intraperitoneally.94 268 7 After three weeks, the animals were sacrificed, their livers were collected and their total fat content was determined (Best and ColL, Biochem. J. 40, 368, 1966) and cholesterol (Sperry and Brand, J. Biol. Chem., 150, 315, 1943). The results of the tests showed poor protection of animals given SAM in a dose of 0.4-0.8 mg / kg and full protection of animals receiving SAM in a dose of 2 mg / kg Table III The content of cholesterol and total fat in the liver after the end of the trial (mean values in group) Group Fresh weight Total fat Cholesterol 1 2 3 4 6 liver (g) 18 16 17-16 16 g 1.41 1.93 3.84. 3.70 3.5 2.0% 9.4, 6 24.0 21.6 21.9 12.5 g 40 68 92 90 67 61% 2.6 3.7, 7, 2 4.1 3, 8 I_i Among other pharmacological properties of SAM, anti-inflammatory and calming effects have also been investigated. The acute inflammation with swelling was caused by carrageenan and egg white. Effects in chronic inflammation were observed in cotton-induced hemangioma and adjuvant-induced arthritis. In all cases, SAM showed activity, both administered orally (doses 8 ^ 40 mg / kg) and parenterally (doses 4-8 mg / kg), comparable to the activity of other agents (Ibuprofen - Indomethacin). Calming properties were tested in the hot plate and acetic acid tests and in the rat Randal and Selito tests. The effect of SAM measuring was found to be comparable to that of known agents, and the effect of SAM on barbiturate-induced sleep time was also investigated. The tests were carried out by the method of Holten and Larsen (Acta Pharmacol. Toxicol., 1956, 12, 246) on a group of mice administered hexobarbital at a dose of 80 mg / kg i.p., including SAM 4 mg / kg intraperitoneally. in the control, only hexobarbital was administered. The results are shown in the table below: Table IV Effect of SAM on hexobarbital-induced sleep duration Sleep time (minutes) Control 24.4 ± 2.7 SAM 4 mg / kg i.p. 41.2 ± 5.8 As shown in the above data, SAM prolongs sleep induced by hexobarbital. Clinical trials. By introducing SAM is meant introducing the salt obtained by the method of the invention. Based on the information obtained in pharmacological studies, clinical trials have focused on disease states manifested by primary or secondary disturbances in fat metabolism, protein and sugar metabolism, and the metabolism of catecholamines and biogenic amines. From clinical trials conducted on hundreds of patients using SAM in a housing area in a wide range of doses, it results that the new compounds cause a rapid decrease in fat levels in the case of hepatic fatness caused by various disease factors, detectable by bioptical tests after the end of the treatment cycle and after a further 60 days. Administration of the product also causes a significant reduction in high total cholesterol ii, hypertriglyceridemia and normalizes the altered j3 / a ratio of lipoproteins in patients with unbalanced hyperdyslipidemia. The activity of lowering cholesterol and fat levels also occurs at doses of 8-1.5 mg introduced 2-3 times a day and is proportional to the dose. In the case of atherosclerosis with clinical symptoms in the psycho-emotional sphere, with impaired memory and secondary centroencephaly (damage caused by arteriosclerotic encephalopathy). ) and symptoms of cerebral hypoxia, the introduction of SAM by intramuscular route or, in more serious cases, injection or intravenous infusion in doses of 8-16 mg 3-4 times a day, resulted in favorable changes in symptoms. Especially in the case of cerebral hypoxia, rapid and statistically significant recovery of mating functions was observed. In postapoplectic states, an increase in the rate of improvement in clinical conditions was observed. Clinical treatment with SAM has been applied to hundreds of patients suffering from secondary hypoprotidemia and dysprotklemla, persistent and aggressive chronic hepatopathy, circulatory and pre-circulatory conditions, and disorders of protein absorption and separation. The introduction of SAM in daily doses of 20-80 mg, intramuscularly, intravenously or orally, depending on the severity of the case, caused a statistically significant increase in total prottdemia, an increase in the level of albumin and a tendency to normalize the altered percentage of electrophoretic plasma fractions. The above activity of anabolizing proteins was often accompanied by an improvement in the symptomology and condition of patients as well as the normalization of liver tests. Particularly surprising results were obtained with the use of new enzymatic salts, prepared according to the invention, in disease cases associated with disorders of biogenic amine exchange, such as, for example: a) pathological symptoms of of neuropsychiatric conditions, b) Parkinson's disease and Parkinsonism of various etiopathogenesis, c) osteoarthritis and certain neurological symptoms (anti-inflammatory and calming activity) and d) disturbances in the rhythm of sleep and wakefulness. Regarding point a) (extensive clinical casuistry conducted by the study Observed clinical trials and trials by Hamilton and Wittenberg showed that the administration of SAM in doses of 8-20 mg 3-4 times a day for -16 days, excluding other forms of therapy, significantly reduces the values of the main parameters taken into account in the diagnosis of depressive forms. point b) concerning but For Parkinson's disease and parkinsonism, it has been found that administration of SAM in doses of 4-16 mg daily, by intramuscular or intravenous injection or orally, depending on the severity of the case, including the usual Levodopa therapy, gives statistically better improvements in immobility and stiffness compared to seen in patients treated with Levodopa alone. Beneficial changes are also observed in the degree of parkinsonian tremor, which cannot be achieved with the use of Levodopa alone. The introduction of SAM has a clear effect on the reduction of Levodopa-dependent mental disorders, especially in relation to depression and mental symptoms such as irritation. SAM administration in the above-mentioned doses in It significantly blocks the side effects of Levodopa on various organs and functions, especially nausea, vomiting, anorexia, hypotension, asthenia, hyperhidrosis, insomnia and migraine. Referring to point c), SAM, which has been shown by pharmacological studies to be strong has anti-inflammatory and calming properties, is active in all forms of arthritis, at doses of 13 mg twice a day by intramuscular or intravenous injection and 13-20 mg four times a day by oral administration. Compared to an inert agent, SAM reduced muscle cramps, reduced mobility, local pain and stiffness, on a constant basis statistically significant, already after 7 days of administration. In 90 of the observed cases, there was no gastric heartburn. Administration of SAM did not cause blood to appear in the faeces. Compared to non-radical anti-inflammatory drugs, SAM is as effective as indomethacin. The antalgic activity of SAM has been studied in various neurological conditions: neuritis, polyneuritis, anthralgia, sciatica, radiocolitis, torticollis. The therapeutic effect was already evident on the first day of SAM administration in a dose of 6 mg twice daily for intramuscular injection or 13-20 mg 3-4 times daily for oral administration. Similar results were obtained in patients with recurrent and refractory cephalalgia when the drug was administered orally in tablets. Concerning point d), i.e. disturbances in the rhythm of sleep and wakefulness, especially insomnia, a new product obtained according to the invention in an oral dose of 4-13 mg significantly improves the ratio of sleep time to wakefulness, inducing physiological sleep without the use of barbiturates or other substances depressing the cortex and the central brain. From the data presented above, numerous and unexpected prospects for the application of the new drug in medicine appear. It is already known that it can be used in diseases of the liver, hyperdyslipidemia, general or local arteriosclerosis, psychiatric symptoms of the depressive and neurological type, degenerative arthropathy. The new SAM salts are preferably administered by intramuscular or intravenous injection or orally, in oral or sublingual tablet or capsule form. Other pharmaceutical forms include; oral fluids, ophthalmic and nasal drops, sprays and aerosols, topical liquids and butters in which the active ingredient is diluted with a pharmaceutically acceptable solvent ("Tecnologia Pharmaceutica", Volume II, Silvano Casadio, second edition, publisher Cisalpino-Goliardica, Milan 1972). In summary, it can be stated that the therapeutic doses of SAM are 2-125 mg per day, depending on the type and severity of the disease. Due to the complete absence of toxicity of the salts obtained according to the invention, possible higher doses are used. Example I. Up to 90 kg of yeast enriched with SAM (6.88 g / kg) according to Schlenk (Enzymology 29, 283, 1965), 11 liters of ethyl acetate and 11 liters of water are added at room temperature After vigorous stirring for 30 minutes, 50 liters of 0.35 N sulfuric acid are added and stirring is continued for a further 1.5 hours. After filtering and washing with water, 140 liters of water are obtained. 4.40 g SAM per liter, which corresponds to 99.5% of the content of this compound in the starting material. A solution of 2.3 kg of picrolonic acid in 25 liters of methyl ethyl ketone is added to the above solution with stirring. After 16 hours, the precipitate is centrifuged and washed with water. While stirring, the above material is dissolved at room temperature in 6.2 liters of 1N methanesulfonic acid solution in methanol. After filtering off trace amounts of insoluble material, 50 liters of acetone are added to the solution. After the precipitate has settled, the solution is decanted, and the precipitate itself is washed with a small amount of acetone. The precipitate is dissolved in 25 liters of 0.25 N methanesulfonic acid solution in methanol, decolorizing carbon is added to the solution and the entire filtrate is added. 125 liters of methyl isobutyl ketone are added to the filtrate. 1089 g of crystalline and easy-to-siphon salt are recovered and dissolved in water to form a colorless solution of more than 20%. The salt is only slightly soluble in common organic solvents. Thin layer chromatography according to Anal. Biochem. 4, 16-28 (1971) shows that the product is free of impurities. The analytical data, shown in Table V, corresponds to the compound of formula CtfH23N605S * 4 CH403S. A new compound was also identified by an enzymatic method based on the enzymatic methylation of nicotinamide and guanidinoacetic acid by SAM (GL Cantoni, J. Biol.Chem. 189, 745, 1951 and G. De La Hoba, BA Jameison, SH Mudd and HH Richards, J. Am. Chem. Soc. 81, - 3975, 1959). Proceeding as described above, except that methanesulfonic acid replaces by n-dodecanesulfonic acid or n-octadecanesulfonic acid, the compounds of formula C11H23N6OsS # 4C14H3603S and Ct 5H23N605S # 4C18H3g03S are respectively obtained. The analytical data of these compounds are presented in Table V »Example II. 1.15 kg of picrolonic acid dissolved in 10 liters of isobutyl alcohol are added to 70 liters of the solution resulting from the lysis of yeast cells, carried out as described in Example 1 and using the same raw material as in Example 1. After 16 hours, the precipitate formed is centrifuged and then dissolved under stirring at room temperature in 3.1 liters of a 1N ethanesulfonic acid solution in ethanol. After filtering off a small amount of insoluble material, 25 liters of diethyl ether are added to the solution. After some time, the mixture is filtered and the precipitate is washed with a small amount of ether. Then the precipitate is dissolved in 12.5 liters of 0.25 N ethanosulfonic acid solution in ethanol, added decolorizing carbon and the entire filtration. Add 63 liters of benzene to the filtrate. 585 g of salt is recovered, drained and dried. The compound is soluble in water up to a concentration of more than%, slightly soluble in common organic solvents. Thin layer chromatography, carried out as in example 1, shows that the compound is free of impurities. The analytical data, presented in Table V, corresponds to the compound of formula Cx 5 H2 3 N605 S * 4C2 H6 03 S. The compound was also identified by the enzymatic method given in example I. Following the above-described procedure except that ethanesulfonic acid is replaced with acid With 2-bromoethanesulfonic acid or 2-chloroethanesulfonic acid, the compound of formula C x 5 H 2 3 N 6 O 5 • 4 C 2 H 5 SO 3 Br and C! 5H23N605S-4C2H5SO3CI. The analytical data of these compounds are presented in Table V. Example III. To 70 liters of the solution resulting from the lysis of yeast cells, carried out as described in Example 1 and using the same raw material as in Example 1, 1.15 kg of picrolonic acid dissolved in 12 liters of n-butanol are added. After 16 hours, the precipitate is centrifuged and then dissolved under stirring at room temperature in 3.1 liters of a 1N solution of d, 1-10-camphorsulfonic acid in propane Iu-1. Then 25 liters of benzene are added. The precipitate is dissolved in a 0.25 N solution of camphorsulfonic acid in propanol-1 (12.5 liters), carbon is added to the solution and filtered completely, and 63 liters of acetone are added to the filtrate. 928 g of salt are obtained. The compound is soluble in water up to a concentration of more than 20%, slightly soluble in common organic solvents. Thin layer chromatography shows that the compound is free of impurities. The analytical data, shown in Table V, corresponds to the compound of formula C15H23N6O5S * 4C10Hi6O4S. The compound was also identified by the enzymatic method of Example L. Following the procedure described above except that d, 1-10-camphorsulfonic acid is replaced with d-3 acid. -bromo-10-camphorsulfonic acid, the compound of formula C15H23N605S'4CioHi504 * £ fer! 'is obtained. The analytical data of this compound is shown in Table V. Example IV. Enzyme purification. The 50 g Sepharose suspension (a polysaccharide manufactured by Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden) is mixed with cyanogen bromide, a known method for the preparation of an amino-loaded polysaccharide gel. In the next processing step, excess L-lysine is added to the effluent. After completion of the reaction, the gel is washed successively with distilled water, a buffer mixture of pH 6.6, and a buffer mixture of pH 4.5. The gel prepared in this way is loaded into a column 1.5 cm in diameter and 30 cm high. A buffer mixture of 0.05 m triethanolamine and 0.01 m H 2 SO 4 is passed through the column until it is completely equilibrated. The column is loaded with 2 ml of yeast extract containing the enzyme and possibly enriched in this enzyme, obtained by sonification or homogenization with dry ice. The column is eluted with the same buffer mixture that was equilibrated with it. The protein distribution in the effluent is studied by ultraviolet spectrophotometric measurements. Simultaneously, the synthetase activity in the fractions is determined by the method of J. A. Stekola, Methods In EnzymoJogy, vol. 6, page 566 (1963). The fractions showing the activity of the synthesis are combined to obtain a solution with a specific activity at least twenty times higher than that of the crude extract. The enzyme can be further concentrated by sedimentation with salts or organic solvents or other known methods to concentrate protein solutions. Obtaining SAM. 30 ml of Sepharose gel is activated by cyanogen bromide or by another known method of activating binding to a polysaccharide matrix of proteins. 4 ml of an enzyme solution purified as described above, in which about 100 mg of protein is contained, is added to the activated zef. The activated gel suspension and the enzyme solution are stirred for 18 hours at 4 ° C. The resins are washed with water. The fluids contain about 70% of the enzymatic activity initially contained in the enzyme solution. Incubation of the Sepharose gel prepared in the above-described manner, the above-described method of determining the synthetase activity, shows that about 20% of the activity is related to the gel. column 1.5 ohms in diameter and 20 cm high. A solution of 0.675 m triethanolamine, 0.160 m magnesium sulfate, 0.05 ATP, 0.05 m methionine and 0.01 m KCl is passed through the column at a rate of 5 ml per hour at 25-27 ° C. SAM columns show 30% conversion efficiency. Obtaining p-Chiorobenzene * ulfonate SAM. 103 ml of eluate with a concentration of SAM 6 g per liter is acidified with sulfuric acid to pH 3, and then, while stirring, a solution of 2-3 g of picrocimic acid in 25 ml of methyl ethyl ketone is added to it while stirring. After 16 hours, the precipitate is filtered off and washed with water, then dissolved in 6.2 ml of a 1N solution of p-chlorobenzenesulfonic acid in 2-methoxyethanol. 50 ml of toluene are added to the solution. The resulting precipitate is dissolved in 12.5 ml of 0.25N p-chlorobenzenesurfonic acid solution in 2 -methoxyethanol, carbon and all the filtrate are added to the solution, and 60 ml of chloroform is added to the filtrate. 1.43 g of salt is obtained. The compound is soluble in water to steisol * ptt of 20% and only slightly soluble in common OfganfcziTyttft. Chromatograph solvents! * The cfsnf layer shows that the compound is free of impurities Analytical data, presented in tabttey ¥, corresponds to the compound of formula C! 5 H23 N605S * 3C H5Cl03S. - & The compound was also identified by the enzymatic method given in According to the above-described procedure, p-acetylbenzenesulfonic acid is replaced by p-acetylbenzenesulfonic acid, c-benzenedisulfonic acid, 4-diphenylsulfonic acid, 2-mesitylenesulfonic acid or 5-sulfosalicylic acid, respectively, the compounds of formula C6C8S5, R23N, % H23N605S-1rDX ^: 3GjtytQ4 $. The analytical data of these compounds are presented in Table V.94 268 11. Example 5 The precipitate obtained after adding picrolonic acid to 70 liters of solution as in example I is dissolved at room temperature in 3.1 liters of 1 N acid solution 1 with stirring. 2-ethane disulfonic acid in methanol. 25 liters of acetone are added to the solution, and the precipitate is dissolved in 12.5 liters of a 0.25 N solution of 1,2-ethanedisulfonic acid in methanol. The solution is filtered with charcoal, and 60 liters of methyl isobutyl ketone is added to the filtrate. 546 g of salt is obtained. The compound is soluble in water up to a concentration of more than 20% and only slightly soluble in common organic solvents. Thin layer chromatography shows the compound to be free of impurities. The analytical data, shown in Table V, corresponds to the compound of formula Cx s H2 3 N6 05 S '2C2 H6 06 S2. The compound was also identified by the enzymatic method given in example I. Example VI. The precipitate obtained by adding picrolonic acid to 70 liters of the solution as in Example 1 is dissolved at room temperature in 3.1 liters of a 1N solution of 2-hydroxyethanesulfonic acid in ethanol with stirring. 25 liters of methylisobutyl ketone are added to the solution, and the precipitate is dissolved in 12.5 liters of 0.25 N solution of 2-hydroxyethanesulfonic acid in ethanol, and carbon is added to the solution and filtered. 80 liters of tetrahydrofuran are added to the broth. 632 g of salt is obtained. The compound is soluble in water up to a concentration of more than 20% and only slightly soluble in common organic solvents. Thin layer chromatography shows the compound to be free of impurities. The analytical data, presented in Table V, corresponds comprehensively with the formula C15H23N605S # 4C2H $ 04S. The compound was also identified by the enzymatic method of example I. Following the above-described procedure except that 2-hydroxyethanesulfonic acid is replaced with 3-propanesulfonic acid. a compound of formula Cls H23 N < OSS, 4C3H804S is obtained. The analytical data of this compound are presented in Table I and V. Example VII. The precipitate obtained after adding picrolonic acid to 70 liters of the solution as in Example 1 is dissolved at room temperature, with stirring, in 3.1 liters of 1N 1-naphthalene-naphthalic acid solution in methanol. 25 liters of methyl ethyl ketone are added to the solution and the precipitate is dissolved in 12.5 liters of 0.25 N solution of 1-naphthalenesulfonic acid in methanol, carbon is added to the solution and filtered. Add 70 liters of Ioeta Iowa methyl ketone to the feed. 717 g of salt are obtained. The compound is soluble in water up to a concentration of more than 20% and only slightly soluble in common organic solvents. Thin layer chromatography shows the compound to be free of impurities. The analytical data, shown in Table V, corresponds to the compound © of the formula C15 H2 3 N605S * 3Ci of H803S. The compound was also identified by the enzymatic method given in example I. Example VIII. The precipitate obtained after adding picrolonic acid to 70 liters of the solution as in Example 1 is dissolved at room temperature, while stirring, in 3.1 liters of a 1N solution of 2-naphthalene noturfonic acid in 2-propanol. 25 liters of diisopropyl ether are added to the solution, and the precipitate is dissolved in 12.5 liters of 0.25 N solution of 2-naphthalenesulfonic acid in methanol, carbon is added to the solution and filtered. Add 70 liters of ethyl acetate to the filtrate. 71 g of salt are obtained. The compound is soluble in water up to a concentration of more than 20% and only slightly soluble in common organic solvents. Thin layer chromatography shows the compound to be free of impurities. The analytical data presented in Table V correspond to the compound of formula C! s H2 3 N6OsS-3C! o H803S. The compound was also identified by the enzymatic method of Example I. Example IX. The precipitate obtained after adding picrolonic acid to 70 liters of the solution as in Example 1 is dissolved at room temperature in 3.1 liters of 1N benzenesulfonic acid solution in 2-butanol with stirring. 25 liters of diisopropyl ether are added to the solution, and the precipitate is dissolved in 12.5 liters of 0.25 N benzenesulfonic acid solution in methanol, carbon is added to the solution and filtered. 65 liters of ethyl acetate are added to the filtrate. 612 g of salt are obtained. The compound is soluble in water up to a concentration of more than 20% and only slightly soluble in common organic solvents. Thin layer chromatography shows the compound to be free of impurities. The analytical data presented in Table V corresponds to the compound of formula Cx 5H23N605S * 3C6H603S. The compound was also identified by the enzymatic method given in Example I. The precipitate obtained after adding picrolonic acid to 103 ml of the solution as in Example IV was dissolved in at room temperature, while stirring, in 6.2 ml of a 1N solution of chondroitin sulfuric acid in methanol. 50 ml of acetone are added to the solution and the precipitate is dissolved in 25 ml of 0.25 N chondroitin sulfuric acid solution in methanol, carbon is added to the solution and filtered. 125 ml of methyl isobutyl ketone is added to the filtrate. This gives 3.27 g of salt. The compound is soluble in water up to a concentration of more than 20% and only slightly soluble in common organic solvents. Thin layer chromatography shows the compound to be free of impurities. The analytical data, shown in Table V, corresponds to the compound of formula Ct 5H23N605S »4C14H2i NOi4S < 'The compound was also identified by the enzymatic method shown in Example I. Example XI. The precipitate obtained after adding picrolonic acid to 103 ml of the solution as in Example IV is dissolved at room temperature in 6.2 ml of 1N solution of cysteic acid in 2-ethoxyethanol with stirring. 50 ml of methyl acetate are added to the solution, and the precipitate is dissolved in 25 ml of 0.25 N solution of cysteic acid in 2-ethoxyethanol, carbon is added to the solution and filtered. 125 ml of methyl acetate are added to the filtrate. 1.53 g of salt is obtained. The compound is soluble in water up to a concentration of more than 20% and only slightly soluble in common organic solvents. Thin layer chromatography shows the compound to be free of impurities. The analytical data presented in Table V corresponds to the compound of formula C15 H2 3 N6 05S "4C3 H7 NO05 S. The compound was also identified by the enzymatic method given in Example I. Example XI I. Preparation of SAM double salt with sulfuric acid and methanesulfonic acid. 103 ml of the eluate with a SAM content of 6 g per liter, obtained as in example IV, is acidified with H 2 SO 4 to pH 3 and while stirring 2.3 g of picrolonic acid dissolved in 25 ml of methyl ethyl ketone (solvent) are added to it. After 18 hours, the precipitate is filtered off. and washed with water, then dissolved in 18 ml of 0.1 N H2SO4iO, 1N CH3SO3H, and 18 ml of methyl ethyl ketone (solvent). The whole is mixed, then allowed to settle, then the organic layer is separated and the aqueous layer is shaken with a small volume of methyl ethyl ketone to remove traces of picrolonic acid After separation of the aqueous layer, decolorizing carbon is added and the entire filtration is obtained, 16.5 ml of colorless water is obtained. an aqueous solution containing 33.8 g SAM, or 90% SAM contained in the starting solution. Thin Layer Chromatography analysis shows that the solution contains only SAM. 16.5 ml of the solution is poured into 100 ml of acetone (solvent b). Everything is mixed and then set aside until the sediment is settled. The liquid is decanted and the precipitate is dissolved in 6.6 g of a 15% solution of methanesulfonic acid in methanol (solvent c). After adding decolorizing carbon and filtering, the solution is poured into 25 ml of diethyl ether (solvent d). After some time, the crystalline salt with the composition SAM + -HSO4 # H2SO4 "2CH3SO3H (1.2 g) is filtered off. The analytical characteristics of the salt are shown in Table VI. In an identical manner, using the sulfonic acids and the solvents given in Table VI, double salts with The analytical characteristics are presented in this table. By using only 3.3 g of a 16% solution of methanesulfonic acid in methanol and a precipitate in the next step with 25 ml of diethyl ether (solvent d), 1.05 g of the salt with the composition SAM * -HS04 is obtained "* H 2 SQ 4 * CH 3 SO 3 H. The analytical characteristics of this salt are shown in Table VII. In an identical manner, using the sulfonic acids and solvents listed in Table VI I, double salts are obtained with the analytical characteristics shown in this table. With k Lad Xlii. Preparation of the SAM double salt with sulfuric acid and 2-hydroxyethanesulfonic acid The salt obtained in the primary precipitation of SAM with 2-hydroxyethanesulfonic acid as in example VI is dissolved in 20 liters of 0.1 N sulfuric acid and 0.1 N 2-hydroxyethanesulfonic acid in methanol (solvent). After adding the decolorizing carbon, the solution is filtered and 100 liters of methyl isobutyl ketone (solvent b) is added to the filtrate. After some time, the precipitate is filtered off, obtaining 587 g of salt with the composition SAM ** HSO4 * H2SO4 * 2C2HÓ04S. The analytical characteristics of this salt are shown in Table VIII. In an identical manner, but using 10 liters of methanolic (solvent) 0.1 N sulfuric acid and 0.1 N 2-hydroxyethanesulfonic acid and carrying out a further precipitation with methyl isobutyl ketone (solvent b) a salt with the composition SAM + * HSO4 * H2SO4'C2H604S (505 g) is obtained. The analytical characteristics of this salt are presented in Table IX. Also in the same way, but using 3.3 g of a 15% solution of p-toluenesulfonic acid in methanol and subsequent precipitation with 25 ml of diethyl ether yields 1.18 g of the SAM salt * * HS04 * H2S04-2CH3C6H4S03H, with the same characteristics as the product of Example I.94 268 13 <¦ * <¦ CO CO CO CO CO CO CO C / l t- rt »\ o» © no dodood «* <*« o • zzzzzz C4 * * 4 me »* rt ro c <XXXXXX r *« q irt w -h io OO iS C? c5 * O (0 cc .2 $ cc ^ o 5 SSS Sr 5 * ó 2 2 O TB 5 £ £ r) cn ob-^ c .2 E Ifo nso c aft CI ^ - c .2 'c ilfo 3 oc enze _Q CO ^ to 3 ¦o O c (UN c (U .a ó94 260 17 X - ~ X \ Cf ^ 03 ** - £ | E "tu 8 U ^ a N o cc NX CU u _ -O (U? 1 .2 'ES fc I o er £ 03 CD LO 8- 0 28 1 if o J3 c § a S! - - J2 • J2 - o 8 8 £ 2 8 £ tu aoa tu ± * a E a EE cN cN cN E ~ c E -OON • eton ethanol tu c. And loety methyl ketone isobutanol obutanol N ethanol _7 ethanol ethanol anol tu S. E £ 03 oo "£ • £ 5 £ • 2 o 5 2 _Q - - _Q loizoyletlethyliso ketone Methyl ketone Methyl ketone Methyl ketone n-butanol ethanol E isobutanol t »eton iton m eton y in O tu - ^ tu i. • H _Q loizo nol Methyl ketone methanol 2-methoxye c (U L . e = 1 fiooo -OO § i | .§ I §S c 03 L »k. O L. W ji £ £! _c .p tu uu 13 ii) ^ ^ _ 8 8 €« u 0 ^ 7: & § g O w tu .W CN EII fi if cp a .Q cu tu c E CN C CU CD CN CD O v mi /) t / istnin * - ^^ - ^ - vmi / C /} «nv ^ ^ ^ ^ ^ - WWWWWWWWWWWWW <* C /) t /) C /) C / DC /) Noododdooodo ° * ddddddd ZZZZZZZZZZ cZZZZZZ o o XX oo V © 10 f * «*« nc <«*» en n C .2 'E every 3 £ XXXXXXXXXXXXXXXXXXX ^^ • cstncl ^ HMn ^^ c <«o ^ t * -NMc» r <^ 0000000000000000000 c here c 'E tu O II C "» O .2 2 * £ .2 r- E t r- here they H- 3 Ul OC here ¦lJ 8 EO zan 0 JB {t / l O c O Li "O c 0 .2 'c ifc .2 DC o ° 8 1 S 3 co 2 .oc O CD L- 4- O 3 & 3 c phony dodecanosul c tu c 0 usulf (2-ethanedi, - * phonate VI isene acetylober CL lan su Ifosalicy LO UBIUO s- D ta nose hydroxye CN c tu a nosulfoni «cc« J .2 1 i - i 8 8 cS g .2 ® O £ oo O t ^ - CN 3 fc general 2 O here »1 C £ 00 CN &)" Ó c 2 ccc .2 'co ± = o .2 53 ifc cd DO £ ni I § s iS £ n 1u n <5 5l «94 268 OOO cn • EXZ — D i cvi XOI CN X what OO! I CN X u I X o I X o I X o I z — o —o Work. Typographer. UP PRL, circulation 120 + 18 Price PLN 10 PL