PL90037B1 - - Google Patents

Description

Opis patentowy opublikowano: 30.07.19772 90017 licznym. Tak wiec przy otrzymywaniu insuliny o podwójnym dzialaniu nalezy stosowac polaczenie insuliny z metalem alkalicznym lub amonowe, które czesto zawiera nieinsulinowe skladniki bialkowe, lub dawniej stoso¬ wane mieszaniny, z których uzyciem zwiazane sa wszystkie omówione problemy.Sposób otrzymywania amonowego polaczenia insuliny lub z metalem alkalicznym wedlug wynalazku, polega na wytworzeniu alkalicznego wodnego roztworu, zawierajacego polaczenie insuliny z metalem dwuwartos¬ ciowym, srodek chelatujacy jony metalu dwuwartosciowego i jony metalu alkalicznego lub anionowe, przy czym stezenie polaczenia insuliny z metalem dwuwartosciowym wynosi od okolo 10 do okolo 1000 jednostek/ml, metal dwuwartosciowy jest pierwiastkiem z grupy VII B, VIII, I B lub II B ukladu okresowego'pierwiastków, stezenie jonów metalu alkalicznego lub amonowych wynosi od okolo 0,2 do okolo 1,0 m, pil roztworu wynosi 7,6 do okolo 8,6, stezenie srodka chelatujacego wynosi od okolo 0,0002 do okolo 0,05 m, stosunek molowy srodka chelatujacego do metalu dwuwartosciowego w polaczeniu insuliny z metalem dwuwartosciowym wynosi przynajmniej 3 : I, a srodek chelatujacy ma wzór ogólny, przedstawiony na rysunku, w którym to wzorze R| i R5 oznaczaja niezaleznie od siebie jednowartosciowa grupe organiczna, taka jak karboksymetylowa, karboksy¬ etylowa, alkilowa o I 6 atomach wegla lub hydroksyalkilowa o I 6 atomach wegla, R2 i R6 oznaczaja niezalez¬ nie od siebie jednowartosciowa grupe organiczna, taka jak atom wodoru, grupa hydroksylowa lub alkilowa o I -6 atomach wegla, R4 oznacza grupe jednowartosciowa, taka jak atom wodoru, grupa karboksymetylowa, lub karboksyetylowa, moznacza liczbe calkowita I 6 wlacznie, n oznacza liczbe 0 lub I, poznacza liczbe 0lub 1, r oznacza liczbe calkowita 2 6 wlacznie, a s oznacza liczbe calkowita 0 2 wlacznie, oraz krystalizacji polacze¬ nia insuliny z metalem alkalicznym lub amonowego.Na rysunkach przedstawione sa analizy insuliny sodowej zwiazków wyjsciowych oraz insuliny sodowej — produktów w przykladach II i III metoda elektroforezy na zelu poliakryloamidowym (fig. I -4).Uzywane w niniejszym opisie okreslenie „metal alkaliczny" oznacza pierwiastek z grupy I A, az do okresu 5 wlacznie, okresowego ukladu pierwiastków (wydawca Robert C.Weast „llandbook of Chemistry and Physics", wydanie 53, The Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio, 1-968, strona B 3). Korzystnie stosuje sie lit, sód i potas, przy czym najbardziej korzystne jest zastosowanie sodu.Uzywane w niniejszym opisie okreslenie „metal dwuwartosciowy" oznacza pierwiastek z grupy VII B, VIII, IB lub II B ukladu okresowego pierwiastków. Jako metal dwuwartosciowy korzystnie stosuje sie mangan, zelazo, kobalt, nikiel, miedz, cynk i kadm. Najbardziej korzystne jest zastosowanie cynku z powodu jego znacze¬ nia handlowego.Jak wykazano powyzej, w sposobie wedlug wynalazku stosuje sie alkaliczny roztwór wodny polaczenia insuliny z metalem dwuwartosciowym, zawierajacy równiez srodek chelatujacy oraz jony metalu alkalicznego lub amonowe. Zazwyczaj stosuje sie wartosc pil roztworu okolo 7,6 8,6, korzystnie okolo 8,2.Stezenie polaczenia insuliny z metalem dwuwartosciowym wynosi od okolo 10 do okolo 1000 jednostek miedzynarodowych na mililitr roztworu (jednostek/ml). Korzystne stezenie polaczenia insuliny z metalem dwu¬ wartosciowym wynosi okolo 500 jednostek/ml. Srodek chelatujacy, zastosowany w sposobie wedlug wynalazku, posiada wzór ogólny, przedstawiony na rysunku, w którym R, i R5 oznaczaja niezaleznie od siebie jednowartos¬ ciowa grupe organiczna, taka jak karboksymetylowa, karboksyetylowa, alkilowa o 16 atomach wegla lub hydroksyalkilowa o I 6 atomach wegla, R2 i R<» oznaczaja niezaleznie od siebie jednowartosciowa grupe orga¬ niczna, taka jak karboksymetylowa lub karboksyetylowa, R3 oznacza grupe jednowartosciowa, taka jak atom wodoru, grupa hydroksylowa lub alkilowa o I 6 atomach wegla, R4 oznacza grupe jednowartosciowa, takajak atom wodoru, grupa karboksymetylowa lub karboksyetylowa, m oznacza liczbe I 6 wlacznie, n oznacza liczbe 0 lub I, p oznacza liczbe 0 lub I, r oznacza liczbe calkowita 2 6 wlacznie, a s oznacza liczbe calkowita 0 2 wlacznie.Jako srodki chelatujacc o wzorze ogólnym, przedstawionym na rysunku, stosuje sie miedzy innymi kwas etylenodwuamino-N,N,N,,N,-czterooclowy, kwas l,2-dwuaminopropano-N,N,N'N'- czterooctowy, kwas 1,3-dwu- amino-2-hydroksypro|iano-N,N,N,,N,-cztcrooctowy, kwas dwuctylcnolrójaminoczterooctowy, kwas dwuetyleno- trójaminopieciooctowy, kwas szesciomclylcnodwuamino-N,N,N\Nl- czterooctowy, kwas N-butyloetylenodwu- amino-N,N,,N,-trójoctowy, kwas N^-dwumetyloczterometylenodwuamino- NJ^-dwuoctowy, kwas N-/2-hydro-. ksyety1o/-etylenodwuamino- N,N\NMrójoctowy, kwas etyleno-N^N^-czteropropionowy i tym podobne. Ko¬ rzystnie jako srodki chelatujace stosuje sie kwasy polimetylenodwuaminoczterooctowe, zwlaszcza kwas etyleno- dwuamino- N,N,N\N'-czterooctowy.Na ogól srodek chelatujacy mozna stosowac w postaci wolnego kwasu lub w postaci soli z metalem alka¬ licznym lub amonowej. Jesli stosuje sie sól, to kation tej soli musi byc taki sam, jak kation zadanego polaczenia insuliny z metalem alkalicznym lub amonowego. Poza tym nalezy brac pod uwage ilosc kationu, dodanego w wyniku zastosowania takiej soli, jesli potrzebne jest okreslenie ilosci jonów metalu alkalicznego lub amono¬ wych.90037 3 Dla usuniecia metalu dwuwartosciowego z insuliny i dla umozliwienia szybkiej krystalizacji polaczenia insuliny z metalem alkalicznym lub amonowego stosunek molowy srodka chelatujacego do metalu dwuwartoscio- wego w polaczeniu insuliny z metalem dwuwartosciowym wynosi co najmniej okolo 3:1. Przy mniejszych stosunkach obniza sie szybkosc krystalizacji polaczenia insuliny z metalem alkalicznym lub amonowego z alka¬ licznego roztworu. Poza tym przy niniejszych stosunkach zwiekszone jest prawdopodobienstwo, ze pewna ilosc metalu dwuwartosciowego pozostanie w stanie zwiazanym z insulina.W konsekwencji stezenie srodka chelatujacego powinno wynosic przynajmniej okolo 0,0002 m i moze wynosic az do okolo 0,05.m. Przy stezeniu polaczenia insuliny z metalem dwuwartosciowym, wynoszacym okolo 500 jednostek/ml, korzystne stezenie srodka chelatujacego wynosi okolo 0,01 ni. Alkaliczny wodny roztwór polaczenia insuliny z metalem dwuwartosciowym, zastosowany w sposobie wedlug wynalazku, musi równiez zawierac jony metalu alkalicznego lub amonowe. Stezenie tych jonów moze wynosic od okolo 0,2 m do okolo 1,0 m; Jony metalu alkalicznego lub amonowe moga byc dostarczone przez jakikolwiek rozpuszczalny w wodzie zwiazek, który nie wywiera ujemnego wplywu na insuline w warunkach przeprowadzania sposobu. Poza tym jony metalu alkalicznego lub amonowe moga byc dostarczone przez wiecej, niz jeden zwiazek rozpuszczalny w wodzie. Oczywiscie kation zadanego polaczenia insuliny z metalem alkalicznym lub amonowego okresla, który z tych jonów ma byc zastosowany.Jak ustalono poprzednio, czesc potrzebnych jonów metalu alkalicznego lub amonowych moze byc dostar¬ czona przez zastosowanie srodka chelatujacego w postaci jego soli z metalem alkalicznym lub amonowej. Jony te moga byc równiez dostarczone przez zasadowy zwiazek metalu alkalicznego lub amonowy, uzywany zazwyczaj do doprowadzenia plI roztworu do wymaganej alkalicznosci. Wreszcie jony te moga byc dostarczone przez sól metalu alkalicznego lub amonowa, której anionem moze byc miedzy innymi anion chlorkowy, bronikowy, jodkowy, octanowy, siarczanowy, fosforanowy itp. Korzystnie stosuje sie chlorki i fosforany, zwlaszcza chlorki.Jak wykazano powyzej, zastosowane jony metalu alkalicznego lub amonowe maja byc takie, jak kation pozadane¬ go polaczenia insuliny z metalem alkalicznym lub amonowego. Zazwyczaj potrzebne jony sa dostarczane przez mieszanine wszystkich trzech wymienionych czynników. Na ogól alkaliczny wodny roztwór polaczenia insuliny z metalem dwuwartosciowym, stosowany w sposobie wedlug wynalazku, moze byc otrzymany kazdym znanym sposobem. Poniewaz wszystkie ze skladników tego roztworu sa w warunkach przeprowadzenia sposobu rozpusz¬ czalne, wiec sposób przygotowania roztworu nie jest istotny.Pewna korzystna, znana metoda otrzymywania alkalicznego wodnego roztworu polaczenia insuliny z meta¬ lem dwuwartosciowym obejmuje rozpuszczenie polaczenia insuliny z metalem dwuwartosciowym w kwasnym srodowisku wodnym i doprowadzenie otrzymanego roztworu do odczynu alkalicznego za pomoca odpowiedniej zasady. Na ogól srodek chelatujacy oraz dodatkowe jony metalu alkalicznego lub amonowe mozna dodawac w dowolnym momencie jako ciala stale lub roztwory wodne. Jesli stosuje sie roztwory, nalezy wziac pod uwage wzrost calkowitej objetosci roztworu tak, aby otrzymac zadane koncowe stezenia skladników. Kwasny wodny roztwór polaczenia insuliny z metalem dwuwartosciowym powinien miec wartosc pil od okolo 2,5 do okolo 3,5. Kwasowosc tego roztworu uzyskuje sie za pomoca kazdego kwasu mineralnego, jakkolwiek korzystne jest zastosowanie kwasu solnego. Korzystnie wartosc pi I roztworu wynosi okolo 3. Najbardziej odpowiednim sposo¬ bem otrzymywania roztworu jest rozpuszczenie polaczenia insuliny z metalem dwuwartosciowym w rozcienczo¬ nym kwasie solny ni.- Ewentualnie, kwasny wodny roztwór polaczenia insuliny z metalem dwuwartosciowym moze zawierac srodki konserwujace i/lub inne, takie jak srodki izotoniczne. Jako odpowiednie srodki konserwujace stosuje sie na przyklad fenol, mctyloparaben i tym podobne. Jako odpowiednie srodki izotoniczne stosuje sie na przyklad gliceryne, glikoze i tym podobne.Ilosc srodków konserwujacych, jesli sa one stosowane, moze wynosic 0,4% wagowe objetosciowych, jakkolwiek korzystne stezenie wynosi okolo 0,2%. Zastosowanie srodka konserwujacego jest pozadane, przy czym najbardziej korzystne jest zastosowanie fenolu. Zauwazono, ze fenol zwieksza takze szybkosc krystalizacji zadanego polaczenia insuliny z metalem alkalicznym lub amonowego.Nastepnie kwasny wodny roztwór polaczenia insuliny z metalem dwuwartosciowym doprowadza sie do odczynu alkalicznego za pomoca zasady. Na ogól uzyta zasada powinna byc wodorotlenkiem, weglanem lub innym podobnym zasadowym zwiazkiem metalu alkalicznego lub amonowym. Korzystne jest zastosowanie stezo¬ nego wodnego roztworu odpowiedniego wodorotlenku w celu zapobiezenia zbytniemu rozcienczaniu roztworu polaczenia insuliny z metalem dwuwartosciowym i w celu unikniecia wydzielania sie ciepla, które nastepuje przy zastosowaniu pewnych zwiazków, takich jak stale wodorotlenki metali alkalicznych.Jak wykazano poprzednio, srodek chelatujacy i jony metalu alkalicznego lub amonowe mozna dodawac do roztworu polaczenia insuliny z metalem dwuwartosciowym w dowolnym momencie. Na przyklad polaczenie4 90037 insuliny z metalem dwuwartosciowym mozna rozpuscic w rozcienczonym kwasie solnym* zawierajacym srodek chelatujacy. Alternatywnie, srodek chelatujacy mozna dodac do kwasnego wodnego roztworu polaczenia insuli¬ ny z nielalem dwuwarlosciowym lub tez ten srodek chelutujacy mozna dodac do roztworu polaczenia insuliny z metalem dwuwartosciowym po zalkalizowaniu tego roztworu. Zazwyczaj srodek chelatujacy dodaje sie do roztworów kwasnych w postaci soli z metalem alkalicznym lub amonowej. Dla zwiekszenia rozpuszczalnosci w wodzie pozadane jest calkowite zobojetnienie wszystkich grup karboksylowych w tym srodku chelatujacym.Do roztworów alkalicznych srodek chelatujacy jest dodawany zazwyczaj w postaci wolnego kwasu.W korzystnej metodzie otrzymywania alkalicznego wodnego roztworu polaczenia insuliny z metalem dwu- wartosciowym jony metalu alkalicznego lub amonowe dodaje sie wraz ze srodkiem chelatujacynt. Dodatkowa ilosc jonów dostarcza sie z zasada, uzywana do zalkalizowania kwasnego roztworu. Pozostala potrzebna ilosc jonów dostarcza sie przez dodatek odpowiedniej ilosci soli metalu alkalicznego lub amonowej. Sól te dodaje sie zazwyczaj przed zatkatizowaniem roztworu, lecz mozna ja dodawac w dowolnym momencie, podobnie jak srodek chelatujacy.Inna metoda otrzymywania alkalicznego wodnego roztworu |xlaczenia insuliny z metalem dwu wartoscio¬ wy ni obejmuje rozpuszczenie polaczenia insuliny z metalem dwuwartosciowym w alkalicznym srodowisku wod¬ nym o pfI od okolo 8 do okolo 9,5 i doprowadzenie otrzymanego roztworu do pil od okolo 7,6 do 8,6.Alkalicznosc wyjsciowego roztworu wodnego otrzymuje sie zazwyczaj za pomoca opisanej poprzednio zasady metalu alkalicznego lub amonowej. Nastepnie zmniejszenie alkalicznosci mozna otrzymac przez dodatek rozcien¬ czonego kwas mineralnego, przy czym korzystne jest zastosowanie kwasu solnego i kwasu fosforowego. Nalezy zauwazyc, ze przygotowanie roztworów bardziej stezonych wzgledem polaczenia insuliny z metalem dwuwartoi- ciowym moze byc trudniejsze od przygotowania roztworów rozcienczonych z powodu ograniczonych rozpusz¬ czalnosci polaczen insuliny z metalem dwuwartosciowy m w roztworach zasadowych.Dodawanie srodka chelatujaccgo oraz jonów 'mc ta hi alkalicznego lub amonowych, inozna przeprowadzac w dowolnym momencie. Zazwyczaj srodek chelatujacy wraz zjonami metalu alkalicznego lub amonowymi doda¬ je sie przed koncowym ustaleniem wartosci pil. Zaraz po przygotowaniu alkalicznego wodnego roztworu pola¬ czenia insuliny z metalem dwuwartosciowym nastepuje krystalizacja polaczenia insuliny z metalem alkalicznym lub amonowego z roztworu, zazwyczaj w temperaturze otoczenia, jakkolwiek mozna stosowac temperatury wyzsze lub nizsze. Jednak na ogól temperatura krystalizacji powinna wynosic ponizej 30°C. Otrzymane kryszta¬ ly polaczenia insuliny z metalem alkalicznym lub amonowego oddziela sie nastepnie za pomoca znanych metod.Zazwyczaj krysztaly oddziela sie przez odwirowanie i przemywa kolejne rozcienczonym roztworem soli metalu alkalicznego lub amonowej (zwykle okolo 0,5 m), acetonem, absolutnym alkoholem i eterem, po czym suszy sie je pod zmniejszonym cisnieniem. Ponizsze przyklady ilustruja przedmiot wynalazku.Przyklad I. 8 g insuliny cynkowej, zawierajacej okolo 70% insuliny wolowej i 30% wieprzowej, rozpuszczono w 400 ml kwasnego wodnego roztworu fenolu, otrzymanego przez rozpuszczenie 0,8 g fenolu w 400 ml 0,01 n kwasu solnego. Otrzymany roztwór podzielono na cztery równe porcje i do kazdej z nich dodano 2,0 g chlorku sodowego. Te cztery porcje oznaczono jako próbki I 4 wlacznie. Do trzech z tych próbek dodano czterosodowa sól kwasu etylenodwuaminoczterooclowcgo, jak podano w ponizszej tablicy I.Tablica! Próbka 1 2 3 4 lil)TA Ilosc, g 0 0,416 1,04 2,08 Stezenie molowe 0 1 0,010 0,025 0,050 Nastepnie kazdy roztwór doprowadzono do pil = 8,2 przez dodanie 40% wodnego roztworu wodorotlenku sodowego. W próbkach 2 4 wlacznie natychmiast zaczely powstawac krysztaly insuliny sodowej. W próbce 1 krysztaly nie utworzyly sie nawet po mieszaniu przez 3 godziny.Próbke I miareczkowano OJ m wodnym roztworem kwasu etylenodwuaminoczterooctowego (w postaci soli sodowej); przy stezeniu EDTA okolo 0,0006 m rozpoczela sie krystalizacja insuliny sodowej. Kazda próbke mieszano przez noc. Nastepnie krysztaly insuliny sodowej zebrano przez odwirowanie, przemyto raz acetonem, dwa razy absolutnym alkoholem i raz eterem. Po wysuszeniu pod zmniejszonym cisnieniem otrzymano wydaj¬ nosci insuliny sodowej, przedstawione w tablicy 2.90037 5 Tablica 2 Próbka 1 , 2 3 4 Gramy 1.705 1.842 1.929 i.971 Wydajnosc insuliny sodowej % 85.2 92.1 96.4 98.5 Jednostki/mg .6 .0 . 23.5 23.5 | Moc insuliny sodowej (oraz wszystkich insulin, otrzymanych'w nastepnych przykladach) okreslono za pomoca próby immunologicznej zgodnie z metoda G.W.Probsfa i wspólpracowników, J.Pharm. Sci. 55, 1408 (1966). Nalezy zauwazyc, ze przy tej metodzie odchylenie standartowe wynosi l I 5 25%.Przyklad II. 2 g oczyszczonej insuliny sodowej (z trzustki wolowej o mocy 27,0 jednostek/mg, za¬ wierajacej male ilosci bialkowych zanieczyszczen o mniejszej kwasownosci), rozpuszczono w 400 ml 0,5 n kwasu octowego. Do otrzymanego roztworu dodano okolo 20 ml absolutnego alkoholu i 0,4 ml 20% roztworu chlorku cynkowego, co odpowiada 40 mg chlorku cynkowego na gram insuliny. Nastepnie doprowadzono pil roztworu do wartosci 5,95 przez dodanie 20% wodorotlenku amonowego i roztwór chlodzono w temperaturze, okolo 5° przez okolo 72 godziny. Utworzone krysztaly insuliny cynkowej zebrano przez odwirowanie, przemyto raz woda destylowana i rozpuszczono w 50 ml kwasnego wodnego roztworu fenolu, przygotowanego w sposób, opi¬ sany w przykladzie I. Roztwór rozcienczono do objetosci 100 ml kwasnym wodnym roztworem fenolu. Do otrzymanego roztworu dodano 2,0 g chlorku sodowego (otrzymujac 0,34 m roztwór chlorku sodowego) i, 0,208 g EDTA (w postaci soli czterosodowej, otrzymujac 0,005 m roztwór |{DTA). Nastepnie roztwór dopro¬ wadzano do pil = 8,2 za pomoca 40% wodnego roztworu wodorotlenku sodowego. Rozpoczelo sie tworzenie krysztalów insuliny sodowej. Krystalizacje pozostawiono na noc w temperaturze otoczenia. Krysztaly insuliny sodowej oddzielono przez odwirowanie, przemyto i wysuszono w sposób, opisany w przykladzie I. Otrzymano 1,864g insuliny sodowej, co odpowiada wydajnosci 93,2%. Moc tej insuliny sodowej wynosila 27,0jednos¬ tek/mg.Próbki wyjsciowej i koncowej insuliny sodowej z przykladu II analizowano za pomoca elektroforezy na zelu poliakryloamidowym wedlug metody, stosowanej przez R.LJacksoifa i wspólpracowników, Diabetes, 21, 235(1972).Figura I przedstawia elektroforetyczna analize wyjsciowej insuliny sodowej, a figura 2 koncowej insuliny sodowej. W figurach tych I oznacza zel poliakryloamidowy, 2 i 3 oznaczaja bialka nieinsulinowe, a 4 i 5 oznacza¬ ja insuline i bialka insulinopodobne.Przy k lad III. Powtórzono postepowanie z przykladu II z tym, ze jako material wyjsciowy zastoso¬ wano insuline sodowa, wyizolowana z trzustki wieprzowej o mocy 25,0 jednostek/mg. Otrzymano 1,862 g kon¬ cowej insuliny sodowej, co odpowiada 93,1% wydajnosci; moc produktu wynosila 28,9 jednostek/mg. Material wyjsciowy (figura 3) i produkt koncowy (figura 4) z przykladu III analizowano za pomoca elektroforezy na zelu poliakryloamidowym, opisanej w przykladzie II. W figuracli tych I oznacza zel poliakryloamidowy, 6,7 i 8 ozna¬ czaja bialka nieinsulinowe, a 9 i 10 oznaczaja insuline lub bialka insulinopodobne.Z figur I 4 wlacznie wynika, ze sposób ten usuwa bialka nieinsulinowe. Oprócz tego to gwaltowne polepszenie czystosci koncowego polaczenia insuliny z metalem alkalicznym lub amonowego nie wynika z mocy lub innych danych oddzielnie.Przyklad'IV. 6 g krysztalów insuliny cynkowej (70% z trzustki wolowej, 30% z trzustki wie¬ przowej) rozpuszczono w 300 ml kwasnego, wodnego roztworu fenolu, otrzymanego w sposób, opisany w przykladzie I. Do 100 ml porcji tego roztworu dodano 2,5 g (0,033 m) chlorku potasowego. Wartosc pil tego lekko metnego roztworu doprowadzono do 8,2 przez dodatek 3,5 ml 10% wodnego roztworu wodorotlenku potasowego. Do otrzymanego metnego roztworu dodano 0,3 g (0,001 m) kwasu elylenodwuaminoczteroocto- wego. Nastepnie pil tego roztworu nastawiono powtórnie za pomoca 10% roztworu wodorotlenku potasowego do ustalenia sie wartosci 8,2. Roztwór mieszano przez 48 godzin w temperaturze otoczenia (okolo 25°). Krystali¬ zacja rozpoczela sie podczas pierwszych 12 godzin. Otrzymana insuline potasowa zebrano przez odwirowanie, przemyto dwa razy absolutnym alkoholem i raz eterem i wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymano 1,736g insuliny potasowej (86,8% wydajnosci); moc wynosila 24,9 jednostek/mg, zawartosc potasu 1,48%, a zawartosc wilgoci - 10,1%.Przyklad V. Do 100 ml porcji roztworu insuliny cynkowej, przygotowanego w przykladzie IV, doda¬ no 1,4g (0,033 m) chlorku litowego. Roztwór doprowadzono do pil = 8,2 przez dodatek 6,2 ml 1 n roztworu6 90037 wodorotlenku litowego. Na metny roztwór podzialano kwasem etylenodwuaminoczterooctowym, a wartosc pH ustawiono na 8,2 za pomoca 1 n roztworu wodorotlenku litowego wedlug metody, opisanej w przykladzie IV.Krystalizacje przeprowadzono równiez wedlug metody, opisanej w przykladzie IV, z podobnymi wynikami.Otrzymujac insuline litowa zebrano, w sposób, opisany w przykladzie IV, 1,234 g (61,6%) produktu o mocy 27,8 jednostek/mg, zawartosci litu 2,37% i zawartosci wilgoci 3,6%.Przyklad VI. Powtórzono postepowanie z przykladu V z tym, ze chlorek litowy zastapiono 1,8 g chlorku amonowego, a wodorotlenek litowy 60 ml In roztworu wodortlenku amonowego. Po dodaniu kwasu etylenodwuaminoczterooctowego i ustawieniu pH za pomoca 1 n roztworu wodorotlenku amonowego krystaliza¬ cja nie wystapila po 24 godzinach. Dodano jeszcze 1,8 g chlorku amonowego. Krystalizacja wystapila po miesza¬ niu przez nastepne 24 godziny. Otrzymana insuline amonowa wyizolowano w sposób, opisany w przykladzie IV, otrzymujac 1,018 g (50,9%) produktu o mocy 27,6 jednostek/mg i zawartosci wilgoci 7,3%. Zawartosc popiolu siarczanowego wynosila 0,08%. PL

Claims (7)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania amonowego polaczenia insuliny lub z metalem alkalicznym, znamienny tym, ze w pierwszym etapie przygotowuje sie alkaliczny roztwór wodny, zawierajacy polaczenie insuliny z me¬ talem dwuwartosciowym, srodek chelatujacy jony metalu dwuwartosciowego, oraz jony metalu alkalicznego lub amonowe, przy czym stezenie polaczenia insuliny z metalem dwuwartosciowym wynosi od okolo 10 do okolo 1000 jednostek/ml, a metal dwuwartosciowy jest pierwiastkiem z grupy VII B, VIII, I B lub II B ukladu okreso¬ wego pierwiastków, stezenie jonów metalu alkalicznego lub amonowych wynosi od okolo 0,2 do okolo 1,0 m, pH roztworu wynosi od okolo 7,6 do okolo 8,6, stezenie srodka chelatujacego wynosi od okolo 0,0002 do okolo 0,05 m, stosunek molowy srodka chelatujacego do metalu dwuwartosciowego w polaczeniu insuliny z me¬ talem dwuwartosciowym wynosi przynajmniej 3:1, a srodek chelatujacy ma wzór ogólny przedstawiony na rysunku, w którym to wzorze R, i R< oznaczaja niezaleznie od siebie jednowartosciowa grupe organiczna, taka jak karboksymetylowa, karboksyetylowa, alkilowa o 1-6 atomach wegla lub hydroksyalkilowa o 1--6 atomach wegla, R3 i Re oznaczaja niezaleznie od siebie jednowartosciowa grupe organiczna, taka jak karboksymetylowa lub karboksyetylowa, R3 oznacza grupe jednowartosciowa, taka jak atom wodoru, grupa hydroksylowa, lub alkilowa o 1-6 atomach wegla, R4 oznacza grupe jednowartosciowa, taka jak atom wodoru, grupa karboksyme¬ tylowa lub karboksyetylowa, m oznacza liczbe calkowita 1-6 wlacznie, n oznacza liczbe 0 lub 1, poznacza liczbe calkowita 0 lub 1, r oznacza liczbe calkowita 2-6 wlacznie, a s oznacza liczbe calkowita 0-2 wlacznie a w drugim etapie przeprowadza sie krystalizacje amonowego polaczenia insuliny lub z metalem alkalicznym.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako metal dwuwartosciowy stosuje sie mangan, zela¬ zo, kobalt, nikiel, miedz, lub kadm, korzystnie cynk'.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze przeprowadza sie krystalizacje insuliny sodowej.
4. 4. Sposób wedlug zastrz. I,znamienny ty m,ie jako srodek chelatujacy stosuje sie kwas etyleno- dwuamino-N,N,N\N'-czterooctowy lub jego sól z metalem alkalicznym lub amonowa.
5. 5. Sposób wedlug zastrz. 1 ,z n a m i e n n y t y m,ze do alkalicznego wodnego roztworu polaczenia insu¬ liny z metalem dwuwartosciowym dodaje sie srodek konserwujacy w ilosci 0-0,4% wagowo-objetosciowych.
6. 6. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze jako srodek konserwujacy stosuje sie fenol.
7. 7. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze stosuje sie fenol w ilosci okolo 0,2%.90 037 a Ol Sm &W£i /fe, prasa FIG. I 44 5 KJJ) F/G.2 pil pH e/fesna a 9 K ^S -n FIG.3 9 JEBksJ R Rs i \ Wzór PL